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    公开号:WO1992016651A1
    申请号:PCT/JP1992/000311
    申请日:1992-03-13
    公开日:1992-10-01
    发明作者:Shigenori Tanaka；Hiroshi Tamura；Makoto Ohki
    申请人:Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] ( 1 - 3 ) 一 ； δ — D — グルカ ン測定剤
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本発明は、 力ブ トガニ ' ァメ ボサイ ト · ラ イセー ト を用いる （ 1
    [0005] → 3 ) 一 一 D — グルカ ンの測定剤および真菌の検出方法に関する
    [0006] 背 景 技 術
    [0007] カブ ト ガニ · ァメ ボサイ ト 《 ラ イ セ一 卜 （以下単にラ イセー 卜 と もいう） を使用して、 エ ン ド トキシ ンを測定する方法 （一般的に リ ムルステス ト と呼ばれてい る ） が知られてい る。 こ の方法は、 微量 のェ ン ド ト キ シンによ り ラ イ セー 卜 が凝固する こ と に基づいてい る が、 その後の生化学的解明によ り、 該反応はい く つかの凝固因子の 段階的活性化より成る こ とが明 らかにされている （中村隆範他、 日 本細菌学雑誌、 3_ _、 7 8 1 - 8 0 3 ( 1983 ) ) 。 こ の反応を、 例 えば曰本産カ ブ 卜ガニ C Tachypleus tridentatus )カヽら得られる ラ イセー ト により、 図 1 を用いて説明する と、 .ライセ一 卜 にエ ン ド ト キシンが加わると、 ラ イセー ト中に存在する C因子 （エ ン ド トキ シ ン感受性因子、 分子量 123 , 000 ) が活性化され、 生成 した活性型 C 因子が B因子 （分子量 64 , 000) の特定箇所を限定水解 して活性型 B 因子を生成し、 活性型 B因子はプロ ク ロ ッ ティ ングェ ンザィ ム （分 子量 54 , 000) を活性化してク ロ ッ ティ ングェンザィ ム に変換 し、 ク ロ ッ テ イ ン グェンザィ ム はコ アギュ ロ ーゲン （凝固タ ンパ ク 、 分子 量 19 , 723) のジスルフ ィ ド結合で架橋されたループ内の特定箇所を 、 すなわち… A r g 1 8— T h r 1 a…の間および… A r g 4 G— G 1 y 4 7…の間を限定水解 して H— T h r , 0 - A r g β— 0 Hで表され るペプチ ド C (ア ミ ノ酸 2 8残基） を遊離しつつ残余の部分がコア ギュ リ ンゲルに変換される、 と いう一連の反応 （カスケー ド反応と も言う） である。
    [0008] —方、 このカ スケー ド反応は、 エ ン ド トキシ ンのみではな く 、 ラ イセ一 卜に （ 1 → 3 ) — ー D— グルカ ンが加わる と図 1 における G因子が活性化され、 生成する活性型 G因子がプロ ク ロ ッティ ング ェ ンザィ ムをク ロ ッ テ ィ ン グェ ンザィ ムに活性化し、 以下エ ン ド 卜 キシ ンの場合と同様に反応してコアギュ リ ンゲルを生成する。
    [0009] また、 上記カスケー ド反応によ り生成する ク ロ ッ ティ ングェンザ ィムは、 反応系に別に添加される、 例えば t 一ブ トキシカルボ二ル 一 口 イ シルー グ リ シノレ一アルギニ ン一パラニ ト ロァニ リ ド （ B 0 c 一 L e u — G l y - A r - p N A ) からパラ二 ト ロア二 リ ンを遊 離させるので、 生成する発色物質パラ二 ト ロアニ リ ンの吸光度を測 定する こ とによりエン ド トキシンまたは （ 1 → 3 ) — ー D—ダル カ ンの定量を行う こ とができ る。 後記する実施例における （ 1 → 3 ) 一 ^ — D—グルカ ンの特異的測定も上記カ スケ一 ド反応を利用 し て行われる。
    [0010] —方、 従来から、 ライセ一 ト中の G因子を用いる こ とによ り （ 1 → 3 ) — )5— D—グルカ ンを測定する方法が報告されている
    [0011] ( Obayashi T. et al . , Clin. Chim. Acta, 1 4 9 , 5 5 - 6 5 (1985)) 。
    [0012] しかし、 この方法は、 ライセ一 トをゲルろ過法によ り あるいはへ パリ ンまたはデキス ト ラ ン硫酸を固定化したァフ ィ 二ティ 一担体を 用いる ク ロマ ト グラ フ ィ 一によ り分画し、 ェ ン ド トキシ ン感受性因 子である C因子を除去して、 G因子とプロ ク ロ ッ ティ ングェンザィ ムとで （ 1 → 3 ) — S — D—グルカ ンを測定する方法であって、 上記の分画には極めて煩雑な操作を必要とする方法である。 発 明 の 開 示
    [0013] 本発明は、 ラ イセー ト を原料と して改良された方法によ り得られ るエ ン ド トキシ ン感受性因子 （ C因子） を実質的に含まないラ イ セ ー ト処理物からなる （ 1 → 3 ) — ^ — D — グルカ ン測定剤を提供す る こ と にある。
    [0014] 本発明は、 カ ブ ト ガニ · ァメ ボサイ ト · ライセ一 卜含有液を、 ェ ン ド トキシ ン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤に接触させて得 られう る、 エ ン ド ト キシ ン感受性因子を実質的に含まず、 少な く と も （ 1 → 3 ) — ； δ — D — グルカ ン と特異的に反応する成分を含む力 ブ ト ガニ · ァメ ボサイ ト · ラ イ セー 卜処理物を主成分とする （ 1 → 3 ) — — D — グルカ ン測定剤である。
    [0015] 上記ェ ン ド ト キシ ン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤と して は、 ポ リ ア ミ ド系不溶性担体またはセルロ ース系不溶性担体である こ とが好ま しい。 また、 該測定剤は、 デキス ト ラ ンを含むものであ る こ とが好ま しい。 また、 該測定剤は、 カスケー ド反応系の活性化 に有効な 2 価金属塩または該 2 価金属塩及びク 口 ッ ティ ングェンザ ィ ムの基質を含むものである こ とが好ま しい。
    [0016] また、 本発明は、 力ブ ト ガニ ' ァメ ボサイ.ト ' ラ イ セ一 ト含有液 を、 ェ ン ド トキシ ン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤に接触さ せ、 エ ン ド トキシ ン感受性因子を実質的に含まず、 少な く と も （ 1 → 3 ) 一 — D — グルカ ンと特異的に反応する成分を含むカ ブ 卜 ガ 二 . ァメ ボサイ ト · ラ イ セー ト処理物を得る こ とを特徵とする （ 1 → 3 ) 一 ー D — グルカ ン測定剤の製造法である。
    [0017] 上記の製造法において、 カブ ト ガニ · ァメ ボサイ ト · ラ イセ一 ト 含有液がデキス ト ラ ンを含むものである こ とが好ま しい。
    [0018] また、 本発明は、 カ ブ 卜 ガニ ' ァメ ボサイ 卜 ' ラ イ セー ト処理物 に、 カスケ一 ド反応系の活性化に有効な 2 価金属塩ま たは該 2 価金 属塩およびク ロ ッ ティ ングェンザィ ムの基質を添加し、 非加熱条件 下で乾燥する こ とを特徵とする （ 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカ ンの製 造法である。
    [0019] また、 本発明は、 真菌感染症患者の体液を上記の （ 1 → 3 ) 一 β — D —グルカ ン測定剤と接触させて反応させ、 （ 1 → 3 ) 一 β - Ό ーグルカ ンによるカスケ一 ド反応系における基質の変化を測定する こ とを特徵とする真菌の検出方法である。
    [0020] ライセ一 ト と しては、 リ ムノレス ' ポ リ フ エムス （ Limulus polyph emus アメ リ カ産） 、 タキプレウス ' 卜 リ デンタ ツス （ Tachypleus tridentatus. 日本、 Φ国産） 、 タキプレウス - ギガス ( Tachyple us gigas. タイ国、 マ レーシア半島産） 、 カルシノ スコゾレピウス ' ロッンディ 力 ウダ ( Carcinoscorpius rotundicauda. タ イ国、 マ レ ーシァ半島産） 等のカブ トガニ血リ ンパ液から、 適常の方法 （例え は'、 J. Biochem. , 80 , 1011-1021 (1976 ) HS ) によ り弱製した血球抽 出液を挙げる こ とができる。
    [0021] ポ リ ア ミ ド系またはセルロース系不溶性担体に、 カブ トガニ ' ァ メ ボサイ ト · ライセ一 トを接触させる方法は、 連続法、 バッ チ法の いずれでもよ く 、 膜状の該担体にライセ一 ト.を通過させ、 その通過 液を採取する方法、 粒状の担体を充塡したカ ラ ムにライセー トを通 過させてその素通り液を採取する方法、 適当な大き さの担体 （例え ば、 チ ッ プ状粒状、 粉末状の担体） にラ イセ一 卜を接触させた後に 、 通常の固液分離手段 （例えば、 遠心分離、 ろ過等の手段） によ り 該担体を除去する方法等を挙げる こ とができ る。
    [0022] また、 該担体にラ イセ一 トを接触させる際、 ラ イセー ト にデキス 卜 ラ ンを混合 しておく こ と によ り、 さ らにエン ド トキシ ン感受性因 子の該担体への吸着を増加させる こ とができ、 かつ得られたライセ — ト処理物の （ 1 → 3 ) — ^ — D — グルカ ンに対する測定感度も高 める こ と ができ る。
    [0023] 用いるデキス ト ラ ンと しては平均分子量 5 , 000~ 5 , 000 , 000 、 好 ま し く は 10 , 000~ 100 , 000 の範囲の ものを挙げる こ とができ る。 平均分子量が 5 , 000よ り 下のデキス ト ラ ン はェ ン ド ト キ シ ン感受 性因子の担体への吸着効果が弱 く 使用する こ とができない。 また 5 , 000 , 000よ り上のものは粘性が高すぎて使用する こ とができない。 本発明に使用するポ リ ア ミ ド系不溶性担体と しては、 膜状 （ フ ィ ルター形、 中空糸形、 チューブ形、 平膜形等） 、 粒状、 チ ッ プ状、 粉末状等の形態を有し、 酸ア ミ ド桔合の繰り返 しによ って主鎖を構 成する結晶性の線状高分子物質であ り、 ジァ ミ ンと ジカルボン酸と の重縮合物ない しは、 ω —ア ミ ノ カルボン酸または相当するラ ク タ ムから重縮合によ って合成された化合物 （例えばナイ ロ ン 6 、 ナイ ロ ン 6 6等） 等を主成分とする担体を挙げる こ とができ る。
    [0024] 本発明に使用するセルロ ース系不溶性担体と しては、 上述の如 く 、 膜状 （フ ィ ルタ一形、 中空糸形、 チ ュ ー ブ形、 平膜形等） 、 粒状、 チ ッ プ状、 粉末状等の形態を有するセルロ ースまたはセルロ ース誘 導体を主成分とする担体を挙げる こ とができ る。 セルロ ー ス誘導体 と しては、 セルロ ースエステル （例えば、 セルロー ス アセテー ト 、 セルロ ー スニ ト レー ト等） 、 ア ミ ノ エチル―、 ブロモアセチルー 、 ホスホー、 カルボキシメ チル一等の置換基を有するセルロース誘導 体、 カルボキシメ チルセルロースの ヒ ドラ ジ ド誘導体等を例示する こ と ができ る。
    [0025] 本発明によ り、 （ 1 → 3 ) — /3 — D — グルカ ンを測定する生体試 料と しては、 血液、 血漿、 血清、 脳脊髄液、 腹水、 関節液、 胸水、 乳汁、 尿等の、 体液、 浸出液、 排泄液等を挙げる こ とができ る。
    [0026] 本発明の測定剤を用いて （ 1 → 3 ) — 9 — D — グルカ ンを測定す るには、 図 1 のカスケー ド反応によ って、 活性化されて生成する ク 口 ッティ ングェンザィムの活性を公知の方法で測定すればよい。 ク ロ ッティ ングェンザィムのア ミ ダーゼ活性の測定には、 基質と して、 例えば前記の発色性残基を有するペプチ ド合成基質、 または これと同様の配列のぺプチ ドであって、 C末端のアルギニンのカル ボキシル基に前記発色性残基の代わり に公知の発蛍光性残基、 発光 性残基、 アンモニアなどがア ミ ド結合によ り置換したペプチ ド合成 基質を使用する こ とができる。 ク ロ ッティ ングェンザィムがこれら の合成基質に作用 して生成する反応生成物を測定する こ とによ って 、 ア ミ ダ一ゼ活性の測定を行う こ とができる。 具体的には、 本発明 の測定剤と （ 1 — 3 ) — / S — D—グルカ ンを含む反応系に上記ぺプ チ ド合成基質を共存させ、 反応 （カスケー ド反応および必要に応じ て生成物の他色素等への変換反応） によって生成する色素、 蛍光物 質またはア ンモニアをそれぞれ分光光度計、 蛍光光度計、 化学発光 測定装置、 ア ンモニア検出用電極 （特開昭 6 2 — 1 4 8 8 6 0 ) 等 によって測定する方法を例示する ことができる。
    [0027] ク ロ ッティ ングェンザィムのプロテアーゼ活性の測定には、 本発 明の測定剤中に含まれる （も し く は別途添加した） コアギュ ロ ーゲ ン （基質） にク ロ ッティ ングェンザィムが作用 してコアギュ リ ンゲ ルが生成する際のゲル形成反応を、 例えば適当な機器 （例えば、 濁 度測定装置、 粘度測定装置等） で測定するか、 または肉眼で判定す る方法を採用する こ とができる。
    [0028] カブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ラ イセ一 ト処理物を、 本発明の測定 に使用する際には、 前記カスケ一ド反応系の活性化に有効な 2 価金 属塩を 存させる必要がある。 このよ う な 2 価金属塩と しては、 マ グネ シ ゥ ム、 カルシウム、 ス ト ロ ンチ ウムなどのアルカ リ土類金属 のハロゲン化水素酸塩 （塩化物等） 、 硫酸塩等が例示される。 ま た、 本発明の測定剤は、 カ ブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ライセー ト処 理物に上記 2価金属塩を共存させた状態で、 非加熱条件下での乾燥 処理 （例えば、 凍結乾燥） を行って固体状態に した ものであっても よい。 さ らに、 上記ア ミ ダ一ゼ活性を測定するための測定剤は、 2 価金属塩のほかに前記ペプチ ド合成基質を共存させた ものである こ とが好ま し く 、 これを乾燥処理した ものであ ってもよい。
    [0029] 作用
    [0030] 本発明によれば、 ポ リ ア ミ ド系またはセルロ ー ス系不溶性担体に ライセー トを接触させるだけで （ 1 → 3 〉 一 9 一 D —グルカ ン感受 性因子の活性が損なわれる こ とな く 、 ラ イ セー 卜 中のェン ド トキシ ン感受性因子が吸着除去され、 （ 1 → 3 ) — — D — グルカ ンにの み特異的に反応する ライセー ト処理物が得られる。 また、 該担体に ライセ一 トを接触させる際に、 ライ セー 卜 にデキス 卜 ラ ンを混合 し てライセ一 卜の粘性を上げる こ とによ って、 該吸着除去の効果を高 める こ とができ る。 図 面 の 簡 単 な 説 明
    [0031] 図 1 はカブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ラ イセー 卜 のエ ン ド トキシ ン な らびに （ 1 → 3 ) — yS — D —グルカ ンによる反応機構を示す。 図 2 は I — I 剤の （ 1 → 3 ) — — D — グルカ ンに対する検量線 を示す。
    [0032] 図 3 は II一 H剤の （ 1 → 3 ) — S — D — グルカ ンに対する検量線 を示す。 発明 を 実施す る た め の 最良 の形態
    [0033] 以下に実施例を挙げ、 本発明をさ らに具体的に説明するが、 本発 明はこれらの実施例に限定される ものではない。
    [0034] 実施例 1 カブ 卜ガニ C T. tridentatus ) 血 リ ンパ液 5 0 0 mlを 4 V、 1,500 rpm で 1 0分間遠心し、 その沈殿部分 （ァメ ボサイ ト） 約 i 0 g に 1 0 0 mlの 0. 0 2 M 卜 リ ス—塩酸緩衝液 （ PH8. 0 ) を加え、 ホモゲ ナイザー （ポ リ 卜 ロ ン R P T 1 0 (商品名） 、 Kinematics社製造） にて均一に破砕および抽出 し、 ΙΟ,ΟΟΟΧ Gで 3 0分間冷却遠心し、 上澄液と沈殿物とを採取した。 得られた沈殿物をさ らに 6 0 mlの緩 衝液にて 2回抽出 し、 最終的に 2 0 0 mlのライセー トを得た。
    [0035] 以下の方法で 5種類の試薬を調製 し、 エン ド トキシ ンおよび （ 1 → 3 ) 一 — D—グルカ ンに対する反応性を比較検討した。
    [0036] I 一 A剤は 0. 8 M 塩化マグネシウム 2 0 0 1 と 6 mM B o c — L e u— G l y - A r g - p N A 2 0 0 β 1 の混液 （以下 M S混液） にライセ一 ト 8 8 0 a 1 を添加し、 凍結乾燥する こ と によ り調製し た無処理のライセ一 ト試薬である。
    [0037] I 一 B剤は、 ラ イセ一 ト 1. 2 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのナイ ロ ン膜フ ィ ルタ ー （ナルゲン シ リ ン ジフ ィ ルタ 一 （商品名） 、 直径 2 5 mm, ナルジヱ社製） に通過させた後、 そのろ液 （通過液） 8 8 0 β 1 を M S混液に添加 し、 凍結乾燥する こ と によ り調製した本発明のライ セ一 ト試薬 （ナイ ロ ン膜処理ライセ一 卜） である。
    [0038] I 一 C剤は、 ライセ一 ト 1. 2 mlを孔径 0. 2 2 〃 mのポ リ ビニ リ デ ンフルオラ ィ ド膜フ ィ ルタ ー （マイ レ ク ス G V (商品名） 、 直径 2 5 mm ミ リ ポア社製） に通過させた後、 そのろ液 （通過液） 8 8 0 1 を M S混液に添加し、 凍結乾燥する こ とにより調製した比較の ライセー 卜処理物である。
    [0039] I 一 D剤は、 ライセー ト 1. 2 mlを孔径 0. 2 0 mのポ リ テ ト ラ フ ルォロエチ レ ン膜フ ィ ルタ ー （マ イ レ ク ス F G (商品名） 、 直径 2 5 mmN ミ リ ポア社製） に通過させた後、 そのろ液 （通過液） 8 8 0 1 を M S混液に添加し、 凍結乾燥する こ と によ り調製 した比較の ラ イセー 卜処理物である。
    [0040] I 一 E剤は、 ラ イセー 卜 1. 2 mlを孔径 0. 2 0 mのポ リ スルフ ォ ン膜フ イ ノレター （ァク ロディ ス ク （商品名） 、 直径 2 5 mm, ゲルマ ン社製） に通過させた後、 そのろ液 （通過液） 8 8 0 1 を M S混 液に添加 し、 凍結乾燥する こ と によ り調製 した比絞のラ イセー 卜処 理物である。
    [0041] 上記 5 種類の試薬のそれぞれに 2. 2 mlの 0. 2 M ト リ ス —塩酸緩衝 液 （ PH 8. 0 ) を加えて溶解し、 その溶液 0. 1 mlにエ ン ド トキシ ンま たは （ 1 → 3 ) — S — D —グルカ ン各々 0. 1 mlを添加 して、 3 7 °C で 3 0 分間加温 した。 また、 別にそれぞれ 2 倍濃度の各試料を 0 . 0 5 mlずづ添加 して同様に加温 した。 5種類の試薬に対する試料の 反応性は、 3 0 分後に生じた P N A (パラ二 卜 ロア二 リ ン） を、 0. 5 mlの 0. 0 4 %亜硝酸ナ ト リ ウ ム （ 0. 4 8 M 塩酸溶液） 、 0. 3 %ス ルフ ァ ミ ン酸ア ンモニ ゥ ム、 0. 0 7 % N— （ 1 —ナフチル） ェチ レ ンジア ミ ンニ塩酸塩を順次添加 して発色させ、 5 4 5 nmの吸光度値 を測定する こ と によ り判定した。
    [0042] その結果を表 1 に示 した。 この結果から、 ポ リ ア ミ ド系膜である ナイ 口 ン膜フ ィ ルターを一度通過させたライセー 卜を使用すれば、 エ ン ド ト キ シ ンの影響を受けずに、 （ 1 → 3 ) — ；8 — D —グルカ ン を特異的に定量する こ とができ る。
    [0043] 反応性 （ΔΑΞΑδηπι ^Οπώ ) クノレ力ン 二ノ 卜 卜干ンノ ノレカ ノ +
    [0044] エンドトキシン
    [0045] Ι-Α剤 無処理 0.225 0.420 0.647
    [0046] Ι-Β剤 ナイロン膜 0.342 0.001 0.343 ポリ ビニリデン 0.225 0.417 0.644
    [0047] フルオラィ ド膜 i- i ボリテトラフル 0.106 0.298 Q.408
    [0048] ォロエチレン膜
    [0049] Ι-Ε剤 ポリスルフォン膜 0.218 0.326 0.545
    [0050] *…… ( 1→ 3 ) 一 β— Ό—グルカン （ 3 pg/tube)
    [0051] * *—E. coli G111:B4 由来 （2.5 pg/tube)
    [0052] 大腸
    [0053] *… ( ( 1 → 3 ) 一 ^ 一 D—グルカ ンの調製法）
    [0054] 国際特許公開第 9 0 / 0 2 9 5 1 ( 1 9 9 0 ) に準じ、 カー ドラ ン （和光純薬工業 （株） 販売） の 1 gを約 1 0 0 mlの 5 mM NaOH 水 溶液に懸濁 し、 氷冷下で音波発生機、 ソニケ一タ ー TM (型式 5202P Z T、 大岳製作所、 東京） によ り 2 0 KHz 、 8 0 Wで 1 2 分間音波 処理による低分子化を行った。 処理液を 5 M N a O H水溶液を用い . 最終 0. 3 M 水溶液と し、 ゲルパー ミ エーシ ョ ン ク ロマ 卜 グラ フ ィ一 ( G P C カ ラム ： T S K g e l G 3000P W X L 2本、 G 2500 P X L 1 本、 移動相 ： 0. 3 M N a 0 H水溶液、 流速 0. 5 ml/ min ) によ り分画採取 し、 再ク ロマ ト によ り分子量 216 , 000 の G P C分画 精製標品 （ （ 1 → 3 ) — 9一 D—グルカ ン標品） を得た。 実施例 2
    [0055] 実施例 1 で調製 した原料ラ イ セー 卜 4 0 mlに同量の蒸留水を加え た （以下ライ セー ト + D W) 。 また該ラ イ セー ト 4 0 mlに同量の 15 % (W V ) デキス ト ラ ン （分子量 40 , 000) 水溶液を加え、 3,500 rpm で 〗 0分間遠心 してその上清を得た （以下ラ イ セ一 ト + D X ) 。
    [0056] 以下の方法で 4 種類の試薬を調製 し、 エン ド トキシ ンおよび （ 1 → 3 ) 一 β 一 D— グルカ ンに対する反応性を比較検討 した。
    [0057] I — F剤は M S混液にラ イセー 卜 + D W 1. 7 6 mlを添加 し、 凍結 乾燥する こ と によ り調製 した無処理のラ イ セー 卜試薬 （無処理 + D W ) である。
    [0058] I 一 G剤は、 M S混液にライセ一 ト + D x l. 7 6 mlを添加 し、 凍 結乾燥する こ と によ り調製したデキス ト ラ ンを含む無処理のラ イ セ - 卜試薬 （無処理 + D x ) である。
    [0059] I — H剤は、 ラ イセー 卜 + D W 5. 0 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのナイ ロ ン膜フ イ ノレタ ー （ナルゲ ン シ リ ン ジ フ ィ ルタ 一） に通過さ せた後 、 そのろ液 （通過液） 1. 7 6 παを M S混液に添加 し、 凍結乾燥する こ と によ り調製 した本発明のライセー ト試薬 （ナイ ロ ン膜 + D Wで ある。
    [0060] I — I 剤は、 ラ イ セー ト + D x 5. 0 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのナイ ロ ン膜フ ィ ルタ ー （ナルゲ ン シ リ ン ジ フ イ ノレタ ー） に通過さ せた後 、 そのろ液 （通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加 し、 凍結乾燥する こ と によ り調製 したデキス ト ラ ンを含む本発明のラ イ セ一 ト試薬 （ ナ イ ロ ン膜 + D x ) であ る。
    [0061] 上記 4種類に対する各試料の反応性は実施例 1 と同様に測定 した。 その結果を表 2 に示 した。 この結果から、 あ らか じめラ イ セ一 卜 に デキス ト ラ ンを共存させてお く と、 ェ ン ド ト キ シ ン感受性因子の担 体への吸着効果を高める と と もに、 得られたラ イ セ一 卜処理物の （ 1 → 3 ) 一 ^ 一 D —グルカ ンに対する感度を著し く 高める こ とがで き る こ とがわかる。
    [0062] 反応性 （AA545nmZ30niin)
    [0063] 5H. ¾
    [0064] グルカン * エン ドトキシン" グルカン +
    [0065] エンドトキシン i- i：無処理 + 0.219 0.412 0.634 無処理 + Dx 0.221 0.416 0.639 i-Hfi]：ナイ口ン膜 + DW 0.336 0.046 0.384 エ- 1剤：ナイ口ン膜 + DX 0.510 0.001 0.510
    [0066] * ( 1→ 3 ) 一 — D -グルカン （ 3 pg/tube)
    [0067] * *···Ε· coli 0111 :B4 由来 (2.5 pg/tube)
    [0068] 実施例 3
    [0069] カブ トガニ （L. polyphenms)血リ ンパ液 6 0 0 mlを 4 。C、 1,500 rpm で 1 0 分間遠心し、 その沈澱部分 （ァメ ボサイ 卜） 約 I 2 gに
    [0070] 1 2 0 mlの 0. 0 2 M ト リ ス ー塩酸緩衝液 （ PH8. 0 ) を加え、 ホモゲ ナイザー （ポ リ ト ロ ン R P T 1 0 ) にて均一に破碎および抽出 し、 10 , OOOx Gで 3 0 分間冷却遠心し、 上澄液と沈殿物とを採取 した。 得られた沈殿物をさ らに 6 5 mlの緩衝液にて 2 回抽出 し、 最終的に 2 2 0 mlのライセー 卜を得た。 同ラ イセ一 卜 2 0 mlに同量の 1 5 %
    [0071] ( W / V ) デキス ト ラ ン （分子量 70 , 000) を加え、 3 ,500rpmで 1 0 分間遠心後、 その上清を D —ライセー ト と した。 これを用いて、 以 下の方法で 2種類の試薬を調製 し、 エ ン ド トキシ ンおよび （ 1 → 3 ) 一 β — D— グルカ ンに対する反応性を比較検討 した。
    [0072] I 一 J剤は M S混液に D— ラ イセー ト 1. 7 6 mlを添加 し、 凍結乾 燥する こ と によ り調製 したデキス ト ラ ンを含む無処理のライセ一 ト 試薬 （無処理 + D x ) である。
    [0073] I 一 K剤は、 D— ラ イセー ト 1 0 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのナイ ロ ン 膜フ イ ノレタ ー （ナルゲ ン メ デ ィ ア プラ ス フ イ ノレ タ ーュニ ッ 卜 （商品 名） 、 直径 9 0 mm、 ナルジヱ社製） に通過させた後、 そのろ液 （通 過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加 し、 凍結乾燥 して調製 したデキス ト ラ ンを含む本発明のラ イセー ト試薬 （ナ イ ロ ン膜 + D x ) である。 上記 2種類の試薬に対する各試料の反応性は実施例 1 と同様に測 定した。 その結果を表 3 に示 した。 ポ リ ア ミ ド系膜であるナイ ロ ン 膜を通過 したラ イセー ト処理物はェン ド トキシ ンと は反応せず、 （ 1 → 3 ) 一 ^ 一 D— グルカ ンとのみ反応する こ とが明らかである。 ま た、 ラ イセ一 ト にデキ ス ト ラ ンを共存させてから処理する と、 （ 1 → 3 ) 一 ； S— D— グルカ ンに対する感度を著 し く 高める こ とがわ力、 る o
    [0074] 3
    [0075] 反応性 （AA545nm/30min) グルカン * エン ド トキシン ** グルカ ン +
    [0076] ェン ドトキシン
    [0077] I-J¾1J：無処理 + Dx 0.192 0.383 0.578
    [0078] I-K¾IJ ： ナイロン膜 + DX 0.423 0.000 0.423
    [0079] * ( 1→ 3 ) 一 ^一 D—グルカン （ 3 pg/tube)
    [0080] * *— E. coli 0111 :B4 由来 ( 2.5 pg/tube) 実施例 4
    [0081] 市販ゲル化法リ ムルステス ト試薬を使用する （ 1 → 3 ) - β - Ό ーグルカ ン測定剤の調製
    [0082] 市販のライセー 卜製品すなわちゲル化法リ ムルステス ト試薬を使 用 して、 目的とする （ 1 → 3 ) — ； S — D—グルカ ン測定剤を以下の よ う に簡単に調製した。
    [0083] I 一 L剤はリ ムルステス ト試薬 （生化学工業 （株） 販壳プレゲル Μ (商品名） 、 Lot. AB-01) を 2. 6 mlの注射用蒸留水に溶解した後, 孔径 0. 2 0 〃 mのナイ ロ ン膜フ ィ ルタ一 （組織培養フィ ルタ一ュニ ッ ト T C (商品名） 、 直径 4 7 mm、 ナルジヱ社） に通過させ、 その ろ液 （通過液） を使用 した本発明のライセ一 ト試薬 （ナイ ロ ン膜 + D W ) である。
    [0084] I 一 M剤は無処理のプレゲル一 M (無処理 + D W ) である。
    [0085] I — N剤は リ ムルステス ト試薬 （和光純薬工業 （株） 販売リ ムル ス H S II-テス ト ヮ コ 一 （商品名） 、 Lot. EMM090 )を 5. 0 mlの注射 用蒸留水に溶解した後、 同様にナイ ロ ン膜フ ィ ルタ ー （組織培養フ ィ ルタ ーユニッ ト T C ) に通過させ、 そのろ液 （通過液） 2. 6 π を 凍結乾燥する こ とによ り調製した本発明のラ イセー ト試薬 （ナイ 口 ン膜処理 + D W) である。
    [0086] I — 0剤は無処理の リ ムルス H S II—テス ト ヮ コ一 （無処理 + D W ) である。
    [0087] 注射用蒸留水を用い、 I 一 Μ剤および I 一 Ν剤は 2 . 6 ml, I - 0剤は 5. 0 mlで溶解した。 I 一 L〜 I 一 0剤の 0. 1 mlに注射用蒸留 水 （ブラ ンク ） 、 エ ン ド トキシ ン （ E. coli 0111 :B4 由来） および ( 1 → 3 ) — 6 — D—グルカ ンを別々 に 0. 1 ml加え、 3 7 °Cで 6 0 分間静置加温し、 ゲル形成の有無を調べた。 その結果を表 4 に示 し た。 表中、 +はゲルを形成したこ とを、 一はゲルを形成しなかった こ とを表す。 表 4 力、ら明らかなよ う に、 I 一 Lおよび I 一 N剤は ( 1 → 3 ) — /5 — D — グルカ ンとのみ反応する 目的に適 したライセー ト であ る こ と 力 わ力、る。
    [0088] 4
    [0089] (1—3)— β -D-グルカン 0 0.1 1 10 100 l,000ng/ml
    [0090] 1 1
    [0091] I一 L剤：ナイロ ノ + EW 一 十 十 十
    [0092] i- ：無処理 +D 一 一 一 + + + エンドトキシン 0 0.001 0.01 0.1 10 l,000ng/ml ェ- ： ナイロン膜 + EW
    [0093] Ι- §1]：無処理 + DW 一 + + +
    [0094] (1→3)- β-Ό-グルカン 0 0.1 1 10 100 l,000ng/ml
    [0095] I- i：ナイロン膜 + EW 一 + + +
    [0096] 1-0剤：無処理 + EW 一 + + + エンドトキシン 0 0.001 0.01 0.1 10 l,000ng/ml
    [0097] I-N剤：ナイロン膜 + EW
    [0098] τ- ：無処理 + EW + + + +
    [0099] 、 丄 → 3 ) — ^ 一 D— グルカ ンは、 真菌細胞壁の構成多糖体と し ても知られ、 （ 1 → 3 ) — ー D— グルカ ンを測定する こ と によ り 、 体内における真菌の存在を'検知する こ とができ る。 以下、 実施例 5 〜 7 において、 本発明の方法によ る真菌の検出例をあげる。
    [0100] 実施例 5 (血漿検体の測定）
    [0101] 真菌による敗血症を疑った入院中の重症血液疾患 （急性 リ ンパ性 白血病、 急性骨髄性白血病、 多発性骨髄腫等） を有する患者 1 〗 例 を対象に、 それぞれ無菌的に採血 したへパ リ ン加血漿を試料と して 4 でで 1 5 0 X G、 1 0分間遠心 して多血小板血漿を得た。 その 0. 1 mlに 0. 3 2 の過塩素酸 0. 2 mlを加え、 3 7 °Cで 2 0 分間加温 し、 析出物を遠心 （3 , 000rpm、 1 0 分間） 除去し、 その上清 0. 0 5 mlに 0. 1 8 M N a ◦ Hを 0. 0 5 ml加えて中和 し、 被検液と した。
    [0102] ひきつづき実施例 2 に記載の方法で調製した本発明の （ 1 → 3 ) — /3 — D —グルカ ン測定剤 （ I 一 I 剤） 0· 1 mlを加え、 3 7 °Cで 30 分間加温 して反応させた。 その反応液に 0. 0 4 %亜硝酸ナ ト リ ゥム ( 0. 4 8 M 塩酸溶液） 、 0. 3 %スルフ ァ ミ ン酸ア ンモニ ゥ ム、 0. 0 7 % N - 1 一ナフチルエチ レンジア ミ ンニ塩酸塩を各 0. 5 mlずつ順 次加えてジァゾカ ツ プリ ング反応を行い、 5 4 5 nroでその吸光度を 測定して、 別に作成した検量線 （図 2 ) によ り （ 1 → 3 ) — β — Ό ー グルカ ン換算値と して表した。 表 5 に示すよ う に全例 （NO. 1 〜 NO. 1 1 ) において高濃度の （ 1 → 3 ) — — D —グルカ ンが検出さ れ （健常人 ： 0. 2 ± 0. 3 pg/ ml) 、 その う ちの 5例 （No. 1 — No. 5 ) {ま、 血培 ίこて、 カ ン ジタ ァノレ ビ、カ ンス C Candida albicans) ヽ カ ン ジダ ' グ リ エノレモ ンディ （ Candida guilliermondii) 、 カ ン ジ ダ - 卜 ロ ピカ リ ス ( Candida tropicalis) 、 カ ン ジ夕" ' ク ノレセィ （ Candida krusei) およびク リ プ ト コ ッ カス · ネオフ ォ ノレマ ンス （ Cr yptococcus neoformans)をそれぞれ検出 し、 2 例 ( No. 6 、 No. 7 ) は血培では陰性であつたが、 死亡後の解剖による組織病理学的検 査によ り ァスペルギルス ' フ ミ ガッス （ Aspergillus fumigatus)を 検出 した。 残り 4 例 （No. 8〜 No. 1 1 ) については、 臨床症状、 経過、 薬剤感受性等から真菌感染を強く 疑ったにもかかわらず血培 では陰性であ った症例である力 抗真菌剤 （ア ンホテ リ シ ン
    [0103] B、 ミ コナゾール、 フルコナゾール） 投与によ り、 全例臨床的に顕著 な改善を見た。 従って、 本発明の測定剤は真菌感染症と りわけ通常 の検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断に 適切に用い られる こ とが理解できょ う。 表 5 日和見の深在性真菌症の血漿中 ( 1→ 3 ) 一 8— D—グルカン濃度
    [0104] 血漿（1→3)— β
    [0105] No. 住合/ ¾p串 顆粒球数 rfn +Λ.
    [0106] 1111 ·*·口 Gufem * I zjlrt. j Ί-Λfr. !Hs sk Τα 一 D—グルカン
    [0107] 1 53/ F ALL 0 1 309.0 pg/ml (+) Candida albicans分離 死亡
    [0108] 2 72/ F MM 960 420.3 (+) Candida guilliennondii分離 生存
    [0109] 3 61/ AML 0 (+) Candida tropicalis分離 死亡
    [0110] 4 45/ M APML 0 (+) Candida krusei分離 生存
    [0111] 5 59/ M AIHA 2560 521.7 (+) Cryptococcus neoformans 分離 生存
    [0112] 6 48/ F ALL 0 48.5 (-） 全身性ァスペルギルス症 （死体解剖） 死亡
    [0113] 7 65/ F APML 0 139.4 (-) 全身性ァスペルギルス症 （死体解剖） 死亡
    [0114] 8 45/ F AML 6278 663. t卜
    [0115] 8 (-） フルコナゾ一ルにより改善 生存
    [0116] 9 52/ M ALL 6 76.5 (-) ミ コナゾールにより改善 生存
    [0117] 10 32/M AML 1 (-) ミ コナゾールにより改善 生存
    [0118] 11 29/ F ALL 0 286.1 (-) アンホテリ シン Bにより改善 生存
    [0119] A L L :急性リ ンパ性白血病、 AML ： 急性骨髄性白血病、 A PML ：急性前骨髄球性白血病、
    [0120] MM：多発性骨髄腫、 A I HA ： 自己免疫性溶血性貧血
    [0121] 実施例 6 (尿検体の測定）
    [0122] 入院中に尿路感染症を併発した症例で、 尿培養でカ ンジダ ' アル ビカ ンス ( Candida albicans) ヽ カ ン ジダ · グラ ブ レイ タ ( Candida glabrata) を検出 した 3症例につき、 本発明の測定剤によ り尿中の ( 1 → 3 ) 一 ^ 一 D —グルカ ンを定量した。 尿は中間尿を無菌的に 滅菌採尿コ ッ プに採取し、 その 0 · 005ιη1に注射用蒸留水 0. 1 mlを加 えた後、 実施例 1 に記載の本発明の （ 1 → 3 ) — — D —グルカ ン 測定剤 （ I 一 B剤） 0. 1 mlを加え、 3 7 °Cで 3 0 分間加温した。 実 施例 5 と同様にジァゾカ ツ プリ ング反応を行った後、 5 4 5 nmでそ の溶液の吸光度を測定し、 別に作成した検量線よ り （ 1 → 3 ) 一 β 一 D —グルカ ン換算値と して表した。 表 6 に示すよ う に 3 例中全例 において高濃度の （ 1 → 3 ) — ー D —グルカ ンが検出され （健常 人 ： 1 0 pgZ ml以下） 、 本発明の測定剤は真菌性尿路感染症の迅速 診断に適切に用いられる こ とが理解できょ う。
    [0123] 表 6 真菌感染尿の尿中 （ 1→ 3 ) — ー D—グルカン濃
    [0124] NO, 15¾ tLl S CFU/ml (1→ 3 )— 3— D—グルカン（nq/ml )
    [0125] 1 Candida albicans >10< 28.5
    [0126] 2 Candida albicans >10« 12.5
    [0127] 3 Candida glabrata >104 18.0
    [0128] 実施例 7 (脳脊髄液検体の測定）
    [0129] 入院中に髄膜炎を疑われ、 髄液中にク リ プ ト コ ッ カ ス ' ネオフ ォ ルマ ンス （ Cryptococcus neof ormans )を検出 した真菌性髄膜炎の 3 症例につき、 腰椎穿刺にて無菌的に採取 した髄液 0. 0 5 mlに注射用 蒸留水 0. 0 5 π を加え、 さ らに実施例 3 に記載の本発明の （ 1 → 3 ) 一 ； S — D —グルカ ン測定剤 （ I 一 Κ剤〉 0. 1 mlを加え、 3 7 °Cで 30 分間加温 した。 実施例 5 と同様に ジァゾカ ツ プ リ ング反応させた後 、 5 4 5 nmでその溶液の吸光度を測定 し、 別に作成 した検量線よ り ( 1 → 3 ) 一 ；3 — D — グルカ ン換算値と して表 した。 表 7 に示すよ う に、 3 例中全例において高濃度の （ 1 → 3 ) — β — Ό — グルカ ン が検出され （健常人 ： 1 pg/" ml以下） 、 本発明の測定剤は真菌性髄 膜炎の早期迅速診断に適切に用い られる こ とが理解でき ょ う。
    [0130] 表 7 真菌感染髄液の髄液中 （ 1→ 3 ) — /3— D—グルカン濃度
    [0131] No. TK fcH ¾ ( 1→3 ) - β— Ό—グルカン（pg/ml )
    [0132] Crvptococcus neoformans 136.2
    [0133] Crvptococcus neoformans 58.7
    [0134] Cryptococcus neoformans 105.1
    [0135] 実施例 8
    [0136] 実施例 1 の方法で調製 したラ イセー ト を用い、 以下の方法で 4 種 類の試薬を調製 し、 エン ド キシ ンおよび （ 1 → 3 ) — β - Ό ー ゲ ルカ ンに対する反応性を比較検討 した。
    [0137] I I一 Α剤は、 M S混液にラ イ セー ト 8 8 0 a 1 を添加 し、 凍結乾 燥する こ と によ り調製 した無処理のラ イ セ一 ト試薬 （無処理） であ る。
    [0138] I I— B剤は、 ラ イ セー 卜 1 . 5 mlを孑し径 0. 2 2 mのセルロ ー ス エステル膜フ ィ ルタ ー （ステ リ フ ィ ノレ D— G S (商品名） 、 酢酸セ ルロースと硝酸セルロ ース と の混合物、 直径 4 7 mm、 ミ リ ポア社製 ) に通過させた後、 そのろ液 （通過液） 8 8 0 1 を M S混液に添 加し、 凍結乾燥する こ とにより調製した本発明のライセ一 ト試薬 （ セルロースエステル膜） であ る。
    [0139] II一 C剤は、 ラ イセ一 ト 1 . 5 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのセルロ ース アセテー ト膜フ ィ ルタ 一 （ナルゲン フ イ ノレタ ー ウ ェ ア （商品名） 、 直径 4 7 mm. ナルジヱ社製） に通過させた後、 そのろ液 （通過液） 8 8 0 a I を M S混液に添加 し、 凍結乾燥する こ と によ り調製した 本発明のライセ一 ト試薬 （セルロースアセテー ト膜） である。
    [0140] II一 D剤は、 ラ イ セー ト 1 . 5 mlを孔径 0. 2 0 mのセルロース 二 卜 レー ト膜フ ィ ルタ — （ナルゲンフ イ ノレタ ー ウ ェ ア （商品名） 、 直径 4 7 mm. ナルジェ社製） に通過させた後、 そのろ液 （通過液） 8 8 0 u 1 を M S混液に添加し、 凍結乾燥する こ と によ り調製した 本発明のライセ一 ト試薬 （セルロース二 卜 レー 卜膜） である。
    [0141] 上記 4 種類の試薬に対する各試料の反応性は実施例 1 と同様に測
    [0142] ¾ した。
    [0143] その結果を表 8 に示した。 この結果からセルロース系膜を一度通 過させたライセー 卜を使用すれば、 ェ ン ド トキシ ンの影響を受けず に、 （ 1 → 3 ) — 一 D—グルカ ンを特異的に定量できる こ とがわ かる。 反 応 性 （AA545nm 30min) 試 薬 孔径
    [0144] ( m) グルカン * エン ドトキシン" グルカン +
    [0145] エン ド 卜キシ ン-
    [0146] II - A剤 無処理 0.226 0.409 0.638 ェ I-B剤 セルロース 0.22 0.349 0.004 0.354
    [0147] エステル膜 ττ- セルロース 0.20 0.345 0.002 0.348
    [0148] ァセテ一 ト膜
    [0149] II-E¾IJ セルロース 0.20 0.343 0.001 0.345
    [0150] 二トレ一 ト膜
    [0151] * ( 1→ 3 ) - β -Ό-グルカン （ 3 pg/tube)
    [0152] * *···Ε. coli 0111 :B4 由来 ( 2.5 Pa/tube)
    [0153] 実施例 9
    [0154] 実施例 2で調製 した ラ イ セー ト + D Wを用 い、 以下の方法で 6種 類の試薬を調製 し、 エ ン ド ト キ シ ンおよ び （ 1 → 3 ) — β - Όー グ ルカ ン に対する反応性を比較検討 した。
    [0155] II- Ε剤は、 M S混液に ラ イ セー ト + D W 1. 7 6 mlを添加 し、 凍 結乾燥する こ と によ り 調製 した無処理のラ イ セ ー ト 試薬 （ラ イ セ一 ト + D W ) であ る。
    [0156] II一 F剤は、 M S混液に ラ イ セ一 卜 + D X 1. 7 6 mlを添加 し、 凍 結乾燥する こ と によ り 調製 したデキス ト ラ ンを含む無処理のラ イ セ 一 卜 試薬 （ラ イ セ一 ト + D x ) であ る。
    [0157] II一 G剤は、 ラ イ セ 一 卜 + D W 5 mlを孔径 0. 2 2 mのセルロ ー スエステル膜フ ィ ルタ 一 （マイ レ ク ス G S (商品名） 、 酢酸セル口 ース と硝酸セルロース と の混合物、 直径 2 5 nim、 ミ リ ポア社製） に 通過させた後、 そのろ液 （通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、 凍 結乾燥する こ とによ り調製した本発明のライセー ト試薬 （セル口一 スエステル膜 + D W) であ る。
    [0158] II- H剤は、 ラ イ セ一 ト + D x 5 mlを孔径 0. 2 2 mのセル口 一 スエステル膜フ ィ ルタ一 （マイ レ ク ス G S ) に通過させた後、 その ろ液 （通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、 凍結乾燥する こ とに よ り調製したデキス ト ラ ンを含む本発明のラ イセ一 ト試薬 （セル口 ースエステル膜 + D x ) である。
    [0159] II一 I 剤は、 ラ イセー ト + D W 5 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのセルロー スアセテー ト膜フ イ ノレタ ー （ナルゲン シ リ ン ジフ イ ノレタ ー （商品名 ) 、 直径 2 5 mm ナルジェ社製） に通過させた後、 そのろ液 （通過 液） L 7 6 mlを M S混液に添加し、 凍結乾燥する こ と によ り調製し た本発明のライセー ト試薬 （セルロースアセテー ト膜 + D W) であ る。
    [0160] II— J剤は、 ラ イ セー ト + D x 5 mlを孔径 0. 2 0 のセルロ ー スアセテー ト膜フ イ ノレタ ー （ナルゲン シ リ ン ジフ イ ノレタ ー） に通過 させた後、 そのろ液 （通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、 凍結 乾燥する こ と によ り調製レたデキス ト ラ ンを含む本発明のライセー ト試薬 （セルロースアセテー ト膜 + D x ) である。
    [0161] 上記 6種類の試薬それぞれに対する試料の反応性は、 実施例 1 と 同様に測定した。 その結果を表 9 に示 した。 この結果から、 あ ら力、 じめラ イセー 卜にデキス ト ラ ンを共存させて処理する と、 ェン ド ト キシ ン感受性因子の担体への吸着効果を高める と と もに、 得られた ライセー ト処理物の （ 1 → 3 ) — ^ — D — グルカ ンに対する感度を 著し く 高められる こ とがわかる。 表 9 反 応 性 （AA545nmZ30min)
    [0162] 5¾ ¾ 孔径 ；
    [0163] (i fi m) グルカン * エン ドトキシン" グルカン +
    [0164] エン ドトキシ
    [0165] II-E剤 無処理 +DW 0.226 0.411 0.640 剤 無処理 +Dx 0.227 0.417 0.646
    [0166] II-G剤 セルロース 0.22 0.347 0.046 0.396
    [0167] エステル膜 +DW
    [0168] II-H^ij セルロース 0.22 0.500 0.001 0.501
    [0169] エステル膜 +Dx
    [0170] II-I剤 セルロース 0.20 0.351 0.050 0.403
    [0171] ァセテ一卜膜 +D
    [0172] II-J¾IJ セルロース 0.20 0.490 0.002 0.491
    [0173] アセテー ト膜 +DX
    [0174] *…… （ 1 ~* 3 ) - β - Ό -グルカン （ 3 pg/tube)
    [0175] *氺… E. coli 0111:B4.由来 ( 2. 5 m/tube)
    [0176] 実施例 1 0
    [0177] 実施例 3 と同様の D —ラ イセ一 ト を用いて以下の方法で 8 種類の 試薬を調製 し、 エン ド トキシ ンおよび （ 1 → 3 ) 一 0 — Ό ー グルカ ンに対する反応性を比絞検討 した。
    [0178] II— K剤は、 M S混液に D —ラ イ セー ト 1. 7 6 mlを添加 し、 凍結 乾燥 して調製 した無処理のラ イ セー 卜試薬である。
    [0179] II一 L剤は、 D—ラ イ セー ト 2. 6 mlを同量の多孔性セルロ ー スゲ ル （セル口 フ ァ イ ン G C — 2 0 0 m (商品名） 、 生化学工業 （株） 販売） と混合後、 ガラ スフ ィ ルタ ー （ G 3 ) でろ過 し、 そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加 し、 凍結乾燥して調製した本発明のラ イ セ ー ト試薬 （セルロ ー スゲル） である。
    [0180] II一 M剤は、 D—ライセー 卜 2. 6 mlを同量のジェチルア ミ ノ エチ ノレセノレ ロ ー スゲノレ ( D E A Eセノレ 口 —ス、 Serva Feinbiochemica GmbH製） と混合後、 ガラスフイ ノレター （ G 3 ) でろ過 し、 そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、 凍結乾燥して調製した本発明のライ セ一 ト試薬 （ジェチルア ミ ノ エチルセルロースゲル） である。
    [0181] II— N剤は、 D—ライセ一 ト 2. 6 mlを同量のカルボキシメ チルセ ノレ口 一スゲノレ （ Serva Feinbiochemica GmbH 製） と混合後、 ガラス フ ィ ルター （ G 3 ) でろ過し、 そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加 し、 凍結乾燥して調製した本発明のライセ一 ト試薬 （カルボキシメ チルセルロースゲル） である。
    [0182] 1ェ— 0剤は、 D—ライセー ト 2. 6 mlを同量のホスホセルロースゲ ノレ （； Serva Feinbiochemica GmbH 製） と混合後、 ガラ ス フ イ ノレタ ー ( G 3 ) でろ過し、 そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、 凍結乾 燥して調製した本発明のラ イセー 卜試薬 （ホスホセルロースゲル） である。
    [0183] II一 P剤は、 D—ライセー ト 2. 6 mlを同量のァガロースゲル （セ フ ァ ロ ース C L一 6 B ' (商品名） 、 Pharmacia 社製） と混合後、 ガ ラスフ ィ ルター （ G 3 ) でろ過 し、 そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に 添加し、 凍結乾燥して調製した比較のラ イセー ト試薬 （ァガロ ー ス ゲル） である。
    [0184] II一 Q剤は、 D—ライセー ト 2. 6 mlを同量のデキス ト ラ ンゲル (セ フ ア デ ッ ク ス G— 1 5 0 (商品名） 、 Pharmacia 社製） と混合 後、 ガラスフィ ルタ 一 （ G 3 ) でろ過 し、 そのろ液 1. 7 6 mlを M S 混液に添加し、 凍結乾燥して調製 した比較のラ イセー 卜試薬 （デキ ス トラ ンゲル） である。 II一 R剤は、 D —ラ イ セ ー ト 2. 6 mlを同量のポ リ ア ク リ ノレア ミ ド ゲノレ （ノくィォゲノレ P — 300 (商品名） 、 Bio-Rad Laboratories製） と混合後、 ガラスフ イ ノレター （ G 3 ) でろ過 し、 そのろ液 1. 7 6 ml を M S混液に添加 し、 凍結乾燥 して調製 した比較のラ イセー 卜試薬 (ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル） である。
    [0185] 8種類の試薬に対する各試料の反応性は、 実施例 1 と 同様に測定 した。 その結果を表 1 0 に示 した。 この結果から、 セルロ ー ス系担 体を通過させたラ イセ ー ト を使用すれば、 ェ ン ド 卜キ シ ンの影響を 受けずに、 （ 1 → 3 ) — ^ — D —グルカ ンを特異的に定量する こ と ができ る こ と は明らかである。
    [0186] 1 0
    [0187] 反応性 （AA545mv 30min) グルカン * エン ドトキシン ** グルカン +
    [0188] エン ド卜キシ
    [0189] Ιΐ-ΐφ 無処理 0.197 0.379 0.580
    [0190] Il-I^fJ セルロースゲル 0.438 0.000 0.438
    [0191] II-M¾I] ジェチルァミノ 0.431 0.004 0.436
    [0192] ェチルセルロースゲル
    [0193] II-N^IJ カルボキシメチル 0.428 0.002 0.431
    [0194] セルロースゲル
    [0195] II - 0剤 ホスホセルロースゲル 0.426 0.001 0.427
    [0196] II- P剤 了ガロースゲル 0.186 0.201 0.390
    [0197] II-Q剤 デキス トランゲル 0.181 0.214 0.399
    [0198] II-R剤 ポリアクリルアミ ド 0.188 0.368 0.559
    [0199] ゲル
    [0200] * ( 1→ 3 ) - ^ - D -グルカン （ 3 pg/tube)
    [0201] * * --·Ε. coli 0111 :B4 由来 ( 2.5 ρα/tube) 実施例 I 1
    [0202] 市販ゲル化法リ ムルステス ト試薬を使用する （ 1 → 3 ) — — D ーグルカ ン測定剤の調製
    [0203] 市販のライセ一 ト試薬すなわちゲル化法 リ ムルステス ト試薬を使 用 して、 目的とする （ 1 — 3 ) — ^ — D—グルカ ン測定剤を以下の よう に して調製した。
    [0204] Iエー L一 1 剤は、 リ ムルステス ト試薬 （生化学工業 （株） 販売プ レゲルー Μ (商品名） 、 Lot AB-01 ) を 2. 6 παの注射用蒸留水に溶 解した後、 孔径 0. 2 2 mのセルロースアセテー ト膜フ イ ノレター （ ナルゲンフイ ノレターゥ ヱァ） に通過させ、 そのろ液 （通過液） 1. 4 mlを凍結乾燥する こ と によ り調製した本発明のライセー ト試薬であ
    [0205] -5 o
    [0206] II一 L一 2剤は、 無処理のプレゲル一 Mである。
    [0207] II一 L一 3剤は、 リ ムルステス ト試薬 （和光純薬工業 （株） 販売 リ ムルス H S II-テス ト ヮ コー （商品名） ヽ Lot. EMM090 )を 5. 0 ml の注射用蒸留水に溶解した後、 0. 2 2 jci mのセルロ ースエステル膜 フィ ルター （ステ リ フ ィ ル D — G S ) に通過させ、 そのろ液を使用 した本発明のライセ一 ト試薬である。 .
    [0208] II一 L - 4剤は無処理の リ ムルス H S II—テス ト ヮコ一である。 注射用蒸留水を用い、 Iエー L一 1 剤は 1. 4 ml、 II一 L一 2剤は
    [0209] 2. 6 ml、 II— L一 4 剤は 5. 0 π で溶解し、 実施例 4 と同 じ試料を添 加して同様に反応させ、 ゲル形成の有無を調べた。 その結果を表 1
    [0210] 1 に示した。 表中 +はゲル化したこ とを、 一はゲル化しな力、つたこ とを表す。 表 1 1 力、ら明らかなよう にェエー L一 1 およびェ1一 L — 3 は （ 1 → 3 ) — ^一 D—グルカ ンとのみ反応する 目的に適 したライ セー トである こ とがわかる。 表 1 1
    [0211] (1→3)- β -D-グルカン 0 0.1 1 10 100 l,000ng/ml
    [0212] II - L - 1剤 ― ― ― + + +
    [0213] II - Ιι - 2剤 — + + + エン ドトキシン 0 0.001 0.01 0.1 10 l,000ng/ml
    [0214] II- 1 1剤 一 ― ― ― ― ―
    [0215] II-L - 2剤 + + +
    [0216] (1→3) - β-Ό—グルカン 0 0.1 1 10 100 l,000ng/ml ェェ -L - 3剤 + + +
    [0217] II- L-4剤 + + +
    [0218] エン ドトキシン 0 0.001 0.01 0.1 10 l,000ng/ml
    [0219] Iエ- L-3剤
    [0220] II - Ii - 4剤 + + + +
    [0221] 実施例 1 2 (血漿検体の測定）
    [0222] 実施例 5 と同様の方法で被検液を調製 し、 ひき つづき実施例 9 に 記載の方法で調製 した本発明の （ 1 → 3 ) — — D — グルカ ン測定 剤 （ II一 H剤） 0· 1 mlを加え、 3 7 °Cで 3 0 分間加温 して反応させ た。 その反応液を実施例 5 と同様に処理 して吸光度を測定 して、 別 に作成 した検量線 （図 3 ) よ り （ 1 → 3 ) — ^ 一 D — グルカ ン換算 値と して表 した。 表 1 2 に示すよ う に全例 （NO. 1 〜 No. 1 1 ) に おいて ¾濃度の （ 1 — 3 ) — ^ 一 D — グルカ ンが検出され （健常人
    [0223] ： 0. 2 ± 0. 3 pg/ ml) 、 その う ちの 5 例 （ No. 1 〜No. 5 ) は、 血 +立 にて カ ン ジダ ' ァノレ ビカ ン ス （ Candida— albicans) ヽ カ ン シタ
    [0224] • ク ' リ エノレモ ンディ （ Candida _guilliermondii) 、 カ ン シ タ · ト ロ ピカ リ ス ( Candida tropicalis ) 、 カ ン ジタ " · ク ノレセ ィ （ Candida krusei) およびク リ プ ト コ ッ カス ' ネオフ ォ ルマ ンス （ Cryptococc us neoforraans) をそれぞれ検出 し、 2 例 ( o. 6 、 No. 7 ) は血 培では陰性であつたが、 死亡後の解剖による組織病理学的検査によ り ァ スぺノレギノレス · フ ミ ガッ ス ( Aspergillus f umigatus )を検出 し た。 残り 4例 （No. 8〜！ Jo. 1 1 ) については、 臨床症状、 経過、 薬剤感受性等から真菌感染を強く 疑ったにもかかわらず血培では陰 性であ った症例であるが、 抗真菌剤 （ア ンホテ リ シ ン B、 ミ コナゾ —ル、 フルコナゾール） 投与によ り、 全例臨床的に顕著な改善を見 た。 従って、 本発明の測定剤は真菌感染症、 と りわけ通常の検査法 では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断に適切に用 いられる こ とが理解できょ う。
    [0225] 表 1 2 日和見の深在性真菌症の血漿中 ( 1→ 3 ) 一 _ D—グルカン澳度
    [0226] 血漿（1→3)— β
    [0227] NO. 年令 Z性 疾患 顆粒球数 血培 臨 床 症 状 感染結果 — D—グルカン
    [0228] 1 3/ F ALL 0/ w 1 325.2 pg/ml (+ ) Candida albicans分離 死亡
    [0229] 2 72/ F MM 960 415.0 (+ ) Candida guilliermondii分離 生存
    [0230] 3 61/ M AML 0 (+ ) Candida tropicalis分離 死亡
    [0231] 4 45/ M APML o 86.8 (+ ) Candida kmsei分離 生存
    [0232] 5 59/M AIHA 2560 540.2 (+ ) Cryptococcus neoformans 分離 生存
    [0233] 6 48/ F ALL 0 50.5 (-） 全身性ァスヘルキルス症 （死体解剖） 死亡
    [0234] 7 65/ F APML 0 138.7 (-） 全身性ァスペルギルス症 （死体解剖） 死亡 卜
    [0235] 8 45/ F AML 6278 669.9卜
    [0236] (-） フルコナゾールにより改善 生存
    [0237] 9 52/ M ALL 6 76.8 (-） ミ コナゾ一ルにより改善 生存
    [0238] 10 32/M AML 1 ミ コナゾ一ルにより改善 生存
    [0239] 11 29/ F ALL 0 275.1 (-) アンホテリ シン Bにより改善 生存
    [0240] A L L :急性リ ンパ性白血病、 AML ：急性骨髄性白血病、 A PML :急性前骨髄球性白血病、
    [0241] MM ： 多発性骨髄腫、 A I H A ： 自己免疫性溶血性貧血
    [0242] 実施例 1 3 (尿検体の測定）
    [0243] 実施例 6 と同様の方法で尿路感染症患者の尿から被検液を調製し ひきつづき、 実施例 8 に記載の本発明方法による （ 1 → 3 ) — β — D—グルカ ン測定剤 （ェ I一 C剤） 0. 1 mlを加え 3 7 °Cで 3 0分間加 温した。 実施例 5 と同様にジァゾカ ッ プ リ ング反応させた後、 5 4 5 nmでその溶液の吸光度を測定し、 別に作成した検量線より （ 1 — 3 ) 一 ー D—グルカ ン換算値と して表した。 表 1 3 に示すよ う に 3例中全例において高濃度の （ 1 → 3 ) — 3 — D—グルカ ンが検出 され （健常人 ： 1 O pgZml以下） 、 本発明測定剤を用いる測定方法 は真菌性尿路感染症の迅速診断法と して、 有力な手法である こ とが 理解できょ う。
    [0244] 1 3 真菌感染尿の尿中 （ 1→ 3 ) -/3-D-グルカン濃度
    [0245] NO. 検 出 菌 CFU/ml (ι→ 3 )— 一 D—グルカン（ng/ml )
    [0246] 1 Canaxda albicans >104 27.5
    [0247] 2 Candida albicans >104 12.9
    [0248] 3 Candida glabrata >104 17.8
    [0249] 実施例 1 4 (脳脊髄液検体の測定）
    [0250] 実施例 7 と同様の方法で髄膜炎患者の髄液から被検液を調製 し、 ひきつづき実施例 1 0 に記載の本発明方法による （ 1 → 3 ) — β — D— グルカ ン測定剤 （ II一 L剤） 0. 1 mlを加えて、 3 7 °Cで 3 0分 間加温した。 実施例 5 と同様にジァゾカ ッ プリ ング反応させた後、 5 4 5 nmでその溶液の吸光度を測定し、 別に作成した検量線よ り （ 1 → 3 ) 一 yS — D — グルカ ン換算値と して表 した。 表 1 4 に示すよ う に、 3 例中全例において高濃度の （ 1 3 ) 一 J3 — Ό ー グル カ ン が検出され （健常人 ： 1 pgZ ml以下） 、 本発明の測定剤を使用する 測定方法は真菌性髄膜炎の早期迅速診断法と して有力な手法である こ とが理解でき ょ う。
    [0251] 表 1 4 真菌感染髄液の髄液中 （ 1→ 3 ) — ^一 D—グルカン濃度
    [0252] No. 検 出 菌 (1→3)— β — Ό—グルカン（pg/ml)
    [0253] Crvntococcus neoformans 138.5
    [0254] Crvptococcus neoformans 60.8
    [0255] Cryptococcus neoformans 105.5
    [0256] 産 業 上 の 利 用 可 能 性
    [0257] 本発明はライ セー トを用いて （ 1 — 3 ) — 5 — D —グルカ ンを特 異的に測定するための、 ェ ン ド トキシ ン感受性因子を含まない測定 剤およびそれを使用する測定法を提供する ものであ り 、 血液や尿を は じめと した生体試料中に存在する真菌由来の （ 1 → 3 ) — β - Ό ー グルカ ンを迅速簡便かつ高い精度で測定する こ とが可能である。 菌培養法等に代表される通常の検査法では診断困難な深在性真菌感 染症の迅速診断な らびに適切な治療法および治療効果の判定に利用 する こ と がで き る。
    [0258] さ らに本発明の測定剤は、 注射用蒸留水、 注射薬および医療用具 に混入する真菌由来の （ 1 — 3 ) — ； S — D — グルカ ンを迅速かつ正 確に測定する こ と を可能と し、 ま た抗腫瘍活性を有する （ 1 → 3 ) 一 3 — D — グルカ ンのス ク リ ーニ ン グに も利用する こ と がで き る。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1 . カブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ライセ一 ト含有液を、 エ ン ド ト キシ ン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤に接触させて得られう る、 エ ン ド トキシ ン感受性因子を実質的に含まず、 少な く と も （ 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカ ンと特異的に反応する成分を含むカ ブ トガ 二 · ァメボサイ ト · ライ セ一 ト処理物を主成分とする （ 1 → 3 ) — — D—グルカ ン測定剤。
    2 . ェン ド トキシ ン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤がポ リ ア ミ ド系不溶性担体またはセルロ ース系不溶性担体である請求項 1 の測定剤。
    3. デキス ト ラ ンを含む請求項 1 の測定剤。
    4. カスケ一 ド反応系の活性化に有効な 2価金属塩を含む請求項 1 または 2 の測定剤。
    5 . カスケ一ド反応系の活性化に有効な 2 ffi金属塩と ク ロ ッティ ングェンザィムの基質を含む請求項 1 または 2 の測定剤。
    6 . 力ブ トガニ ' ァメ ボサイ ト ' ライセー ト含有液を、 エ ン ド トキ シン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤に f妾触させ、 ェン ド 卜キ シ ン感受性因子を実質的に含まず、 少な く と も （ 1 → 3 ) 一 β - Ό —グルカ ンと特異的に反応する成分を含むカブ トガニ · ァメ ボサイ ト . ライセー ト処理物を得る こ とを特徵とする （ 1 → 3 ) 一 β - D -グルカ ン測定剤の製造法。
    7. カブ ト ガニ · ァメ ボサイ 卜 · ライセー ト含有液がデキス ト ラ ンを含むものであ る請求項 6 の製造法。
    8. カブ 卜ガニ ' ァメ ボサイ 卜 · ラ イセ一 卜処理物に、 カスケ一 ド反応系の活性化に有効な 2 価金属または該 2 価金属塩およびク 口 ッ ティ ングェンザィムの基質を添加し、 非加熱条件下で乾燥する こ とを特徵とする請求項 6 の製造法。
    9 . 真菌感染症患者の体液を請求項 1 〜 5 のいずれかに記載の （ 1 → 3 ) 一 ^ — D — グルカ ン測定剤と接触させて反応させ、 （ 1 — 3 ) 一 β — Ό—グルカ ン に よ る カ ス ケ一 ド反応系における基質の変 化を測定する こ とを特徴とする真菌の検出方法。
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    FI925149A0|1992-11-12|
    AT157403T|1997-09-15|
    EP0598903A4|1993-02-05|
    DE69221879T2|1998-01-29|
    DK598903T3||
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    EP0598903A1|1994-06-01|
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
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