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    公开号:WO1992015705A1
    申请号:PCT/JP1991/001785
    申请日:1991-12-27
    公开日:1992-09-17
    发明作者:Shigeru Ueda；Mamoru Takahashi；Hideo Misaki；Shigeru Ikuta
    申请人:Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] アンモニア、 -ァミノ酸類または -ケト酸の高感度定量法および高感度定量用 組成物
    [0003] 技術分野
    [0004] 本発明は、 臨床検査、 食品検査等の分野において重要なアンモニア、 α-アミ ノ酸類、 該 -アミノ酸類に対応する -ケト酸、 またはこれらのイオン体、 ある いはこれらを反応生成物とする物質の髙感度定量法および定量用組成物に闋する。 背景技術
    [0005] 一般に血液中の -ケト酸を測定することは臨床検査において、 あるいはグル タミン酸等の食品中の α-ァミノ酸類を測定することは食品化学の上で極めて重 要である。 例えば、 血液化学検査における有機モノカルボン酸の定量検査として ピルビン酸、 ケトグルタル酸などが測定されている （検査点数早見表， Ρ289, 社会保険研究所発行， 1990年） 。 特にビルビン酸は多種にわたる代謝 ig路の交差 点に位置し、 種々の病態を反映することが知られており、 一般には乳酸デヒドロ ゲナーゼ （日本臨床， 第 47巻， P496, 1989年） やピルペートォキシダーゼ （米国 特許第 4246342号明細書、 特公昭 61-14794号公報） を用いて測定されている。 ま た、 血中の L-ァラニンは糖尿病のコントロール拔態の把握の一助としての意義 が認められており、 化学的発光法による測定法が報告されている （日本臨床化学 会年会記録 第 27集， P122, 1987年） 。
    [0006] さらに、 特に血中のアンモニアは、 肝機能障害や尿素サイクルの酵素欠損のあ る場合などに上昇することが知られており、 その測定は、 肝硬変、 尿毒症などの 診断に有用である。 また、 その毒性から、 食品や飲料水等においても測定する意 義は大きい。
    [0007] 従来、 アンモニア、 o -ケト酸および -アミノ酸類の測定法としては種々の方 法が知られており、 大別すると、 微量拡散法、 イオン交換法、 直接比色法、 酵素 法等がある。 微量拡散法は、 密閉した容器内で血液にアル力リを加え、 拡散する アンモニアを酸に捕集して測定する方法であり、 イオン交換法は陽イオン交換樹 脂にアンモニゥ厶イオンを吸着し、 了ルカリで溶出し、 比色定量する方法であり、 直接比色法は、 血液を除蛋白後、 了ンモニァをインドフヱノール反応により比色 定量する方法である。 しかし、 これらの方法は、 いずれも試料よりアンモニアを 分雜する操作と、 分離したアンモニアを定量する操作の二工程よりなるために操 作が煩雑であるという欠点を有していた。 その点、 酵素法はその基質特異性を利 用し、生理的な PHと温度条件において反応を行わせるため、従来の化学的方法に 比べてより真の値に近い定量結果が期待されるばかりでなく、分析操作が極めて 簡単であるという特徵を有している。
    [0008] 酵素法によるアンモニア、 "-ケト酸またはな-アミノ酸類の定量は、 例えばグ ルタミン酸デヒド ゲナーゼ （ 1. . 1. 2, BC 1. . 1. 3, BC 1. 4. 1. ) による下記 に示す可逆反応
    [0009] L—グルタミン酸 + NAD (P) + + H20
    [0010] ^ ーケトグルタリレ酸 + NH3 + NAD (P) H + H+
    [0011] により、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド （ホスフェート） に基づ く 340nmの吸光度の変化量として測定されるものである （臨床検査 Vol. 22, No. 11, 1978,臨時増刊；特公昭 57-21995号公報） 。 しかしながらこの方法は、血中 アンモニアのように含量の少なレ、ものの測定には感度が不十分であり、 低值での 精度が悪い等の問題点がある。
    [0012] そこで上記の反応によってアンモニアと等量に生成したグルタミン酸を更にグ ルタミン酸ォキシダ -ゼの作用により等量の過酸化水素に転換し、 その過酸化水 素を検出することにより、 アンモニアを定量する方法も報告されているが （特開 昭 60- 41500号公報） 、 これも本質的な解決にはなっていない。
    [0013] —方、 酵素サイクリング法を用いた髙感度なアンモニアの測定法も報告されて いる （特開昭 62-232397号公報） 。 この方法はグルタミン酸デヒド πゲナーゼぉ よびグルタミン酸ォキシダーゼの 2つの酵素を使用し、 下記反応
    [0014] グルタミ + ーケトクルタル酸 なる酵素サイクリング反応を形成させ、 アンモニアの量に比例して生成する過酸 化水素、 または消費される還元型 NADPの量を検出するものである。 しかしながら、 グルタミン酸ォキシダ -ゼはグルタミン酸以外にもグルタミン、 ァスパラギン酸 をも基質とするため、 生体試量を被検体とする場合にこれらの影響を受けるとい う欠点を有する （分析化学、 Vol. 38, P188-192, 1989) 。
    [0015] また、 他の酵素法として、 力ルバメートキナーゼ (BC 2. 7. 2. 2)を用いるもの (特開昭 59-213399号公報） 、力ルバモイルリン酸合成酵素 (EC 6. 3. 4. 16) を 用いるもの （特開昭 60 - 47698号公報） が報告されており、 これらは高感度測定法 としての応用も可能である。 しかし、 これらはいずれも上記の酵素によって生成 された ADPを更に他の酵素系を連結させて検出しなければならず、 煩雑な系にな るを免れない。 更に、 NAD合成酵素を用いたアンモニアの高感度定量法も報告さ れているが （特開昭 59 - 198995号公報、 特開昭 63- 185378号公報） 、 これも上記 酵素によって生成した NADを更に NADサイクリング反応系と連結する方法であり、 同様に煩雑な系であった。
    [0016] 更に、 特にアンモニアの測定は、 例えばゥレアーゼによる尿素の測定等、 アン モニァを反応生成物とする反応の共役系としても重要であり、 測定対象物が微量 である場合には高感度化が望まれる。
    [0017] このように、 アンモニ了、 α-ケト酸および α-アミノ酸類の測定法は種々報告 されているが、 グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸ォキシダ-ゼ を用いた酵素サイクリング法以外はいずれも高感度測定法とは言い難く、 また酵 素サイクリング法においても共存物質の影響を受けるため、 普及するに至ってい ない。
    [0018] また、 血中アンモニアの正常値は、 微量拡散法では 70- 190 ig/dl、 直接比色法 で 100- 150 xg/dl、 イオン交換法で 20- 70jug/dl、 酵素法で 12-66 g/dl (日本臨 床、 47卷、 P390. 1989年増刊号） と測定法により大きく異なる上、 少量でもあり、 正確で高感度な測定法が望まれていた。
    [0019] かかる実情において、 本発明者らは上記の問題点につき銳意検討した結果、 -了ミノ酸類を基質として α -ケト酸およびアンモニアを生成する酵素反応を実施 するに当り、酵素としてアミノ酸類デヒドロゲナーゼを使用する反応系において、 補酵素として、 一方にチォニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド類 （£ί下チォ f½D類という） およびチォニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフェート 類 （以下チォ NADP類という） からなる群より選ばれた 1つを使用し、 他方に、 二 コチンアミドアデニンジヌクレオチド類 （£1下 NAD類という） およびニコチンァ ミ ドアデニンジヌクレオチドホスフェート類 （JT NADP類という） からなる群よ り選ばれた 1つの補酵素の 2種類を使用するサイクリング反応を見出した。 さら にこの反応において、 チォ NAD類およびチォ NADP類の還元型の吸収波長は 400nra付 近であり、 NAD類および fiADP類の還元型の吸収波長は 340nm付近であることから、 どちらか一方の補酵素の変化量のみを、 いずれか一方の波長における吸光度を測 定することによつて定量することにより、 吸光度の測定に際して他物質の吸収波 長の混雑が回避できる酵素サイクリング反応が実施でき、 髙感度なアンモニア、 な-ケト酸または o -ァミノ酸類の定量が可能であることを確認し、 本発明を完成 するに至った。
    [0020] 発明の開示
    [0021] 本発明は、 アンモニア、 -アミノ酸類、 該 α -アミノ酸類に对応する -ケト 酸、 およびこれらのイオン体からなる群より選ばれた 1種の被検成分を含有する 被検体に、
    [0022] (1) チォ NADP類およびチォ NAD類からなる群より選ばれる 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくともな-了ミノ酸類と 永とを基質としてァンモニァと該 -ァミノ酸類に対応する α -ケト酸を生成する 可逆反応をなすァミノ酸類デヒドロゲナ一ゼ、
    [0023] (2) Αι
    [0024] (3) Β χ
    [0025] (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分 £1外の下記サイクリング反応系を 形成せしめる成分
    [0026] を含有する試薬を作用せしめて、 次の反応式 ( I ) アミノ酸類
    [0027] 'ヒ! ί口ナ- α—アミノ酸類 + Η20
    [0028] Β 2
    [0029] ( I )
    [0030] (式中、 はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A2は の 還元型生成物を示し、 B ,は A ,がチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NADP類または還元型 NAD類を、 A ,が NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP 類または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は B！の酸化型生成物を示す）
    [0031] で表されるサイクリング反応を形成せしめ、 該反応によって変化する A 2または の量を測定することを特徴とするアンモニ了、 α-アミノ酸類、 該 -アミノ 酸類に対応するひ-ケト酸、 またはこれらのイオン体からなる群より選ばれた 1 種の被検成分の高感度定量法に係るものである。
    [0032] また、 本発明は、 前記成分 (1)、 （2)、 （3)および (4)を含有することを特徴とす るアンモニア、 ひ-アミノ酸類、 該 -アミノ酸類に対応するな-ケト酸、 および これらのィォン体からなる群より選ばれた 1種の被検成分の髙感度定量用組成物 に係るものである。
    [0033] 図面の簡単な説明
    [0034] 図 1は、 実施例 1における、 塩化了ンモニゥム量に対する 400πιπにおけるレイ トアツセィの結果を示す図面である。
    [0035] 図 2は、 実施例 2における、 塩化アンモニゥム量に対する 400訓におけるレイ トアツセィの結果を示す図面である。
    [0036] 図 3は、 実施例 3における、 L-グルタミン酸量に対する 400nmにおけるレイ ト アツセィの結果を示す図面である。
    [0037] 図 4は、 実施例 4における、 クレアチニン量に対する 400nmにおけるレイ トァ ッセィの結果を示す図面である。
    [0038] 図 5は、 実施例 5における、 L-ロイシン量に对する 400nmにおけるレイ トアツ セィの結果を示す図面である。 図 6は、実施例 6における、 ピルビン酸量に対する 400nmにおけるレイ トアツ セィの結果を示す図面である。
    [0039] 図 7は、実施例 7における、 塩化アンモニゥム量に対する 400ΠΒΙにおけるレイ トアツセィの結果を示す図面である。
    [0040] 図 8は、実施例 8における、 塩化アンモニゥ厶量に対する 340nmにおけるレイ トアツセィの結果を示す図面である。
    [0041] 発明を実施するための最良の形態
    [0042] 本発明において用いられるアミノ酸類デヒドロゲナーゼとは、 少なくとも次の 口 反
    [0043] な一アミノ酸類 + H20 + NAD (P)
    [0044] ^ な一ケト酸 + アンモニア + NADP(H) + H+
    [0045] なる反応を触媒するものであって、 チォ NADP類およびチォ NAD類からなる群より 選ばれた 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれた 1つとを補酵素とす るものならいずれをも用いることができる。
    [0046] 本酵素は、 動物組織、 植物、 バクテリア等に広く存在する。 その具体的例は (チォ) NAD類を補酵素とするものとしては、 Baci llus subti l is (バチルス ズブ チリス） 、 Baci llus sphaericus (バチルス スファエリカス） などに存在する ァラニンデヒドロゲナ一ゼ (BC 1. 4. 1. 1 )、 エンドゥの根、 トウモロコシの葉、 ダイズの子葉、 Micrococcus aerogenes (ミクロコッカス ァェロゲネス） など から精製されるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（BC 1. 4. 1. 2)、 嫌気性細菌 Clostridium sporogenes (クロストリジゥム スポ ゲネス） 、 Clostridium saccharobutyricum (クロストリジゥム サッカ πブチリカム） などに存在する L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ (BC 1. 4. 1. 5)、 ダイズ子葉、 コムギ、 エンドゥの 芽生えなどに存在するセリンデヒドロゲナーゼ（EC 1. 1. 7)、 Corynebacterium sepedonicura (コりネノヽ *クテリゥム セぺドニ力 、 Bacillus cereus (ノヽ *チリレ ス セレウス） 、 Bacillus subtil is SJ-2 (バチルス ズブチリス SJ- 2) など に存在するロイシンデヒドロゲナーゼ（EC 1. 4. 1. 9)、 Mycobacter i um tuberculosis (マイコノ クテ ゥム トゥぺ Jレク σシス) ヽ Myxococcus xanthus (ミクソコッカス キサンサス） などに存在するグリシンデヒドロゲナーゼ (BC 1. 4. 1. 10)、 Clostridium SB4 (クロスト リジゥム SB4) 、 Clostridium
    [0047] sticklandi i (クロスト リジゥム ステイクランディ） などに存在する L-エリス ロ- 3 , 5 -ジァミノへキサン酸デヒドロゲナーゼ (BC 1. 4. 1. 11)などが挙げられ る。 また、 （チォ） NADP類を補酵素とするものとしては、 酵母、 大腸菌、 クロレラ 等に由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ (BC 1. 4. 1. 4)、 エンドゥの芽生えな に存在するバリンデヒドロゲナーゼ (EC 1. 4. 1. 8)などが挙げられる。 更にまた， (チォ） NAD類および (チォ） NADP類の両者を補酵素とするものとしては、 牛肝や二 ヮトリ肝、 Bacil lus subti l is (バチルス ズブチリス） などに存在するグルタ ミン酸デヒドロゲナーゼ (BC 1. 4. 1. 3)、 その中で牛肝等の動物由来の酵素は GTP で阻害され、 ADPで活性化されるァロステリックな酵素である。
    [0048] これらのうち、 BCナンパ- 1. 4. 1. 3である牛肝由来の酵素は、 例えばぺーリンガ 一マンハイム社、 オリエンタル酵母工業社より市販されており、 補酵素に対する 相対活性は NADを用いた時を 100%とすると、 チォ NADで 40. 0%、 NADPで 38. 9%、 チォ NADPで 14. 8%と報告されている (Biochem. J. , 191, 299-304, 1980) 。 また、 BCナンバー 1. 4. 1. 4である Proteus sp. (プロテウス エスピー） 由来のグルタミ ン酸デヒドロゲナーゼ （東洋紡社製） については、 NADPを用いたときの相対活性 を 100%としたときチォ NADPに対しては約 15%であった。 また、 他の起源の酵素 についても適宜の系に使用可能である。
    [0049] 補酵素 NAD(P)類、 チォ NAD (P)類に対する特異性は、 基質である α—アミノ酸類 に対して反応性を有するものであればよく、 これら補酵素と基質を用いて確認で きる。
    [0050] 'また、 本発明において、 および Β 2の補酵素はチォ NADP類、 チォ NAD類、
    [0051] NADP類、 NAD類を示すが、 このうちチォ NADP類またはチォ NAD類としては、 例えば チォニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフェート （チォ NADP) 、 チォニ コチンアミ ドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフヱート、 およびチォニコチン アミ ドアデニンジヌクレオチド （チォ NAD) 、 チォニコチン了ミ ドヒポキサンチ ンジヌクレオチドが挙げられる。 また、 NADP類または NAD類としては、 例えば二 コチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフェート （NADP) 、 ァセチルビリジン アデニンジヌクレオチドホスフェート （ァセチル NADP) 、 ァセチルビリジンヒポ キサンチンジヌクレオチドホスフ ート、 ニコチン了ミ ドヒポキサンチンジヌク レオチドホスフェート （デァミノ MDP) ；およびニコチンアミ ド了デニンジヌク レオチド （NAD) 、 ァセチルビリジンアデニンジヌクレオチド （ァセチル NAD) 、 ァセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド、 ニコチンアミ ドヒポキサンチ ンジヌクレオチド （デァミノ NAD) が挙げられる。 なおこれら補酵素の還元型は、 各々チォ NADPH類、 チォ NADH類、 NADPH類、 NADH類として表示する。
    [0052] 本発明においては、 および について例えば がチォ NAD(P)類である場 、 は NAD (P) H類であることが必要であり、 A！が NAD (P)類である場合、 B x はチォ NAD (P) H類であることが必要である。
    [0053] また、定量に用いるアミノ酸類デヒドロゲナーゼが (チォ） NAD類のみを補酵素 とする場合は、 上述のチォ NAD類と NAD類より、 また、 用いるアミノ酸類デヒドロ ゲナーゼが (チォ） NADP類のみを補酵素とする場合は、 上述のチォ NADP類および NA DP類より、更に用いるアミノ酸類デヒドロゲナーゼが (チォ） NAD類および (チォ） NADP類を共に補酵素にする場合は上述のチォ NAD類およびチォ NADP類と上述の NAD 類および NADP類より適宜選択し、 それらの酸化型、 還元型を適宜用いればよい。 また、本発明の定量法によれば被検体中の -ァミノ酸類の定量のみならず、 -ァミノ酸類にァミノ酸類デヒドロゲナーゼを反応させた場合の反応生成物で あるアンモニアまたは -ケト酸の定量も可能である。 その場合、 被検成分がァ ンモニァであるか α-ケト酸であるかによって必要に応じ、 被検成分として存在 する成分 外の本発明のサイクリング反 系を形成せしめる成分を反応液中に予 め存在せしめればよい。 すなわち、 被検成分がアンモニアである場合は使用する アミノ酸類デヒドロゲナ一ゼに対応する -ケト酸を添加すればよく、 被検成分 がな-ケト酸である場合はアンモニ了を添加すればよい。
    [0054] 更に、 本発明の定量法によれば被検体中のアンモニア、 な-アミノ酸類、 "-ケ ト酸類のイオン体の定量も行うことができる。
    [0055] また、本発明の高感度定量法を用いれば、 被検液中にもともと舍有されている 了ンモニァや、 L—グルタミン酸、 L— イシン、 L—ァラニン、 L—セリン、 L— バリン、 L-グリシン等の "-アミノ酸類、 あるいはピルビン酸、 α-ケトグルタ ル酸、 ハイ ド口ピルビン酸、 2—ォキソイソ吉草酸、 2—ォキソイソ力プロン酸、 グリオキサル酸等の -ケト酸類を測定することができるが、 これらを遊離、 生 成する酵素系における基質やその酵素活性を測定することもできる。 更に、 本発 明の髙感度定量法を用いれば、 上記のようなアンモニア、 -アミノ酸類、 -ケ ト酸類を遊離、 生成する酵素系と連結し得る単一の、 もしくは複数の工程からな る酵素系における基質やその酵素活性をも測定することができる。 これらの酵素 系は、 特に限定されるものではないが、 例えば以下に示す種々の反応系が挙げら れる。
    [0056] ( 1 ) クレアチニンとクレアチニンディ ミナーゼ (BC 3. 5. 4. 21)の酵素反応系。 クレアチニン + H2D → N -メチルヒダントイン + NH3
    [0057] この系において、 遊雜、 生成するアンモニアを定量することにより、 クレアチ ニンの定量またはクレアチニンディ ミナーゼの活性測定をするとこができる。
    [0058] ( 2 ) 尿素とゥレア-ゼ (BC 3. 5. 1. 5)の酵素反応系。
    [0059] 尿素 + H20 → 2NH3 + CD2
    [0060] この系において、 遊離、 生成するアンモニアを定量することにより、 尿素の定 置またはゥレアーゼの活性測定をすることができる。
    [0061] ( 3 ) グァニンとグァニンデァミナーゼ (BC 3. 5. 4. 3)の酵素反応系。
    [0062] グァニン + H20 → キサンチン + NH3
    [0063] この系において、 遊離、 生成するアンモニアを定量することにより、 グァニン の定量またはグァニンデァミナーゼの活性測定をすることができる。
    [0064] ( 4 ) アデノシンとアデノシンデァミナーゼ (BC 3· 5. 4. 4または BC 3. 5. 4. 17) の酵素反応系。
    [0065] アデノシン + H20 ― イノシン + NH3
    [0066] この系において、 遊雜、 生成するアンモニアを定量することにより、 アデノシ ンの定量またはアデノシンデァミナーゼの活性測定をすることができる。
    [0067] ( 5 ) ァスパラギンとァスパラギナーゼ (BC 3. 5. 1. 1)の酵素反応系。
    [0068] L-ァスパラギン + H20 → L -ァスパラギン酸 + NH3
    [0069] この系において、 遊雜、 生成するアンモニアまたは L-ァスパラギン酸を定量 することにより、 ァスパラギンの定量またはァスパラギナーゼの活性測定をする ことができる。 ( 6 ) 種々キナーゼとその基質と ATPとの前酵素反応によつて生成した ADPとァ ンモニアキナ一ゼ (BC 2. 7. 3. 8)の酵素反応系。
    [0070] ADP + ホスホラミ ド → ATP + NH3
    [0071] この系において、遊離、 生成するアンモニアを定量することにより、 ADPの定 量またはアンモニアキナーゼの活性測定または前酵素反応に係る成分の測定をす ることができる。
    [0072] ( 7 ) エタノールアミンとエタノールアミンデアミナーゼ（BC 3. 1. 7)の酵素 反応系。
    [0073] • エタノールァミン → ァセトアルデヒド + NHs
    [0074] この系において、遊雜、生成するアンモニアを定量することにより、 エタノー ルァミンの定量またはエタノールアミンデァミナーゼの活性測定をすることがで き 。
    [0075] ( 8 ) ホスホェノールピルビン酸、 ADPとピルビン酸キナーゼ (BC 2. 7. 1.40) の酵素反応系。
    [0076] ホスホエノールビルビン酸 + ADP → ピルビン酸 + ATP
    [0077] この系において、遊雜、生成するピルビン酸を定量することにより、 ホスホエノ 一ルビルビン酸または ADPの定量あるいはピルビン酸キナーゼの活性測定をする ことができる。
    [0078] ( 9 ) N-ァセチルノィラミン酸と N -ァセチルノイラミン酸アルドラーゼ (BC 4. 1.3.3)の酵素反応系。
    [0079] N -ァセチルノイラミン酸 → N-ァセチルマンノサミン + ピルビン酸 この系において、 遊雜、生成するピルビン酸を定量することにより、 N-ァセ チルノイラミン酸の定量または N-ァセチルノィラミン酸アルドラーゼの活性測 定をすることができる。
    [0080] (10) イソクェン酸、 NAD(P)とイソクェン酸デヒドロゲナーゼ (BC 1. 1， 1. 41ま たは EC 1. 1. 1. 42)の酵素反応系。
    [0081] イソクェン酸 + NAD(P) → or-ケトグルタル酸 + CQ2 + NAD(P) H この系において、遊離、 生成する or-ケトグルタル酸を定量することにより、 · イソクェン酸の定量またはィソクェン酸デヒドロゲナーゼの活牲測定をすること ができる。
    [0082] (11) クレアチニンまたはクレアチンからクレアチニナ一ゼまたはクレアチナ ーゼによる前酵素反応によって生成したザルコシンとザルコシンデヒドロゲナー ゼ (BC 1. 5. 99. 1)またはザルコシンォキシダーゼ (EC 1. 5. 3. 1)の酵素反応系。
    [0083] ザルコシン + 水素受容体 + H20→ダリシン + ホルムアルデヒ ド + H2Q2 又は
    [0084] ザルコシン + 02 + H20→グリシン + ホルムアルデヒド + Ha02
    [0085] この系において、 遊離、 生成するグリシンを定量することにより、 ザルコシン の定量またはザルコシンデヒドロゲナーゼまたはザルコシンォキシダーゼの活性 測定あるいは前酵素反応に関与する成分を定量することができる。
    [0086] 本発明における、 および被検成分以外のサイクリング反応系を形成せ しめる成分の使用量は、 被検体中のアンモニア、 -ケト酸および or-アミノ酸類 からなる群より選ばれた 1種の被検成分に比較して過剰量であること、 かつァミ ノ酸類デヒドロゲナーゼの A ,、 B ,および被検成分以外のサイクリング反応系を 形成せしめる成分に対する Km値に比較して過剰量であることが必要であり、 特に 被検成分の 20〜： 10000倍モルが好ましい。
    [0087] 例えば被検成分がアンモニアまたは α—アミノ酸類である場合、 サイクリング 反応を形成させるための A ,、 および -ケト酸の量は被検体中のアンモニア 量に比較して過剰量であること、 かつアミノ酸類デヒドロゲナーゼの A お よびな-ケト酸それぞれに対する Km値に比較して過剰量であることが必要であり、 特にアンモニア量の 20〜10000倍モルが好ましい。
    [0088] また被検成分がな-ケト酸またはな一アミノ酸類である場合、 サイクリング反 応を形成させるための A i、 およびアンモニアの量は被検体中の or-ケト酸量 に比較して過剰量であること、 かつアミノ酸類デヒド ゲナーゼの A！、 B ,およ び了ンモニァそれぞれに対する KID値に比較して過剰量であることが必要であり、 特に -ケト酸量の 20〜： L0000倍モルが好ましい。
    [0089] 本発明の定量用組成物においては、 Α ,および Β ,の濃度は 0. 02〜： 100ηιΜ、 特に 0. 05~20mMが好ましく、 サイクリング反応を形成せしめるための成分としてのァ ンモニ了または -ケト酸の濃度は 3~100πιΜ、 特に 5〜50mMが好ましく、 アミ ノ酸類デヒドロゲナ一ゼの量は 5〜； I000u/rol、 特に 20〜400u/rolが好ましいが、 そ の量は被検体の種類等により適宜決定することができ、 これ辺上の量を用いるこ ともできる。
    [0090] また、 本発明定量法はアミノ酸類デヒドロゲナーゼが単独でまたは 2種 £1上の 組み合わせによって (チォ） NAD類および (チォ） NADP類を共に裙酵素とする場合に おいて、 2つの補酵素にチォ NAD類と NAD類もしくは NADP類との組合せ、 またはチ ォ NADP類と fiAD類もしくは NADP類との組合せを選んだときには、 更に被検体に成 分 (5)のアミノ酸類に作用せず、 B s—B iの反応を形成する第二のデヒドロゲナ ーゼおよび該第二のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることにより、 後記反 応式 ( H ) のごとく、 と B 2の間に の再生のための反応系を付与せしめる ことにより当該サイクリング反応を形成せしめ得る。
    [0091] この場合、 第二のデヒドロゲナーゼは、 この測定系において実質的に A！に作 用しないものであるか、 あるいは実質的に A！に作用し得な ヽ条件を設定するこ とが好ましく、 例えば を本質的に補酵素として利用しない第二のデヒドロゲ ナーゼを選択する組合せ、 A iと B 2の量的関係により第二のデヒド πゲナーゼが 実質的に に作用しない条件を選択する組合せ等が例示される。 定量の際には 反応により生成した A2の量を測定する。
    [0092] 一アミノ酸類 + H20 酸 + アンモニア
    [0093]
    [0094] 第二のデヒ Fnナ-ゼ
    [0095] (式中、 はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A 2は の 還元型生成物を示し、 B iは がチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NADP類または還元型 NAD類を、 A iが NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP 類または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は の酸化型生成物を示し、
    [0096] は B 2を補酵素として B iを生成する酵素反応を示す） すなわち、 第二のデヒドロゲナーゼは B,の再生のために補助的に添加するも のであり、 これによつて B,の使用量を少なくすることが可能となり、 特に が 髙価な場合は有効である。 また、 B,の代わりに B2あるいは B,と B2の混合物を 用いて反応を行ってもよい。 この場合、 または Zおよび B2の使用量は特に限 定されるものではないが、 一般的には A ,の 1/10モル以下が好ましい。
    [0097] 上記の成分 (5)を用いる定量用組成物において、 八1の濃度は0.02〜1001^、 特 に 0.05〜20mMが好ましく、 82または ぉょび81の濃度は0.05〜5000 特に 5〜500 iMが好ましく、 サイタリング反応を形成せしめるための成分としてのァ ンモニァまたは -ケト酸の濃度は 3〜： 100πιΜ、 特に 5 ~50roMが好ましく、 ァミノ 酸類デヒドロゲナ一ゼの濃度は 5~1000u/ml、 特に 20〜500u/mlが好ましく、 第 二のデヒドロゲナーゼは B2に対する Km値 （mM単位） の 20倍量 （u/ml単位） 以上 になるように調整すればよく、 例えば l〜100u/mlが好ましく、 また第二のデヒ ド αゲナーゼの基質は過剰量、 例えば 0.05〜20raMが好ましい。 これらの量は被検 体の種類等により適宜決定することができ、 これ以上の量を用いることもできる。 第二のデヒドロゲナーゼおよびその基質としては、 例えば、 B2が NAD類または チォ NAD類のときは、 アルコールデヒドロゲナーゼ (EC 1.1.1.1)とエタノール、 グリセロールデヒド σゲナーゼ（BC 1.1.1.6) (E.coli由来） とグリセロール、 グ リセロール- 3-リン酸デヒドロゲナ一ゼ（BC 1.1.1.8) (ゥサギ筋肉由来） と L- グリセロール- 3-リン酸、 リンゴ酸デヒド πゲナーゼ (BC 1.1.1.37) (ブタ心筋、 ゥシ心筋由来） と L-リンゴ酸、 グリセ口アルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ (BC 1.1.1.12) (ゥサギ骨格筋、 肝、 酵母、 B.coli由来） と D-グリセ口アルデヒドリ ン酸とリン酸、 B2が NADP類またはチォ NADP類のときは、 グルコース- 6-リン酸 デヒド ゲナ一ゼ (BC 1.1.1.49) (酵母由来） とグルコース- 6-リン酸、 イソク ェン酸デヒドロゲナーゼ (BC 1.1.1.42) (酵母、 ブタ心筋由来） とイソクェン酸、 グリォキシル酸デヒドロゲナ一ゼ（BC 1.2.1.17) (Pseudomonas oxalaticus由来） と CoAとグリオキシル酸、 ホスホダルコン酸デヒド口ゲナーゼ (BC 1.1.1.44)
    [0098] (ラット肝、 ビール酵母、 B.coli由来） と 6-ホスホ -D -ダルコン酸、 グリセ口 アルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ (EC 1.2.1.13) (植物葉緑体由来） と D-グリ セロアルデヒド- 3-リン酸とリン酸、 ベンズアルデヒドデヒド ゲナーゼ（BC 1. 2. 1. 7) (Pseudoraonas f luorescens由来）とべンズアルデヒ ド等が挙げられる。 更にまた、 本発明定量法はアミノ酸類デヒドロゲナーゼが単独であるいは 2種 J¾上の組み合わせよつて (チォ） NAD類および (チォ） NADP類を共に補酵素とする場 合において、 2つの補酵素にチォ NAD類と NAD類もしくは NADP類との組合せ、 また はチォ NADP類と NAD類もしくは NADP類との組合せを選んだときには、 更に被検体 に成分 (6)の -ァミノ酸類に作用せず、 A 2→A tの反応を形成する第三のデヒド 口ゲナ一ゼおよぴ該第三のデヒドロゲナ一ゼの基質を作用せしめる事により、 後 記反応式 (Π) のごとく、 と A2の間に の再生の為の反応系を付与せしめ ることにより当該サイクリング反応を形成し得る。
    [0099] この場合、 第三のデヒド口ゲナーゼには、 この測定系において実質的に に 作用し得ないものであるか、 あるいは実質的に B ,に作用し得な ヽ条件を設定す ることが好ましく、 例えば B，を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択す る組合せ、 B ,と A2の量的蘭係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的に に 作用しない条件を選択する組合せ等が例示される。 定量の際には B ,の消費量を 測定する。
    [0100] 第三のデヒ Fn -ゼ
    [0101] α—アミノ酸類 + Η20 アンモニア
    [0102] (式中、 はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A2は A tの 還元型生成物を示し、 B！は がチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NA DP類または還元型 NAD類を、 A 1が NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP類 または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は の酸化型生成物を示し、 As—A ,は A2 を補酵素として A iを生成する酵素反応を示す)
    [0103] すなわち、第 3のデヒドロゲナーゼは A iの再生の為に補助的に添加するもの であり、 これによつて の使用量を少なくすることが可能となり、 特に が高 価な場合には有効である。 また、 の代わりに A2あるいは と A2の混合物を 用いて反応を行ってもよい。 この場合、 A！または Zおよび A2の使用量は特に限 定されるものではないが、 一般的には B,の 1Z10モル以下が好ましい。
    [0104] この成分 (6)を用いる定量用組成物において、 の濃度は 0.02〜： L00raM、 特に 0.05〜20mMが好ましく、 A2または および A ,の濃度は 0.05〜5000//M、 特に 5 〜500juMが好ましく、 サイクリング反応を形成せしめるための成分としてのアン モニァまたは -ケト酸の濃度は 3〜100mM、 特に 5〜50mMが好ましく、 アミノ酸 類デヒドロゲナーゼの濃度は5〜100011/1111、 特に 20〜500u/inlが好ましく、 第 三のデヒドロゲナーゼは A2に対する Km値 （mM単位） の 20倍量 （u/ml単位) 以上 になるように調整すればよく、 例えば 1〜100u/mlが好ましく、 また第三のデヒ ドロゲナーゼの基質は過剰量、 例えば 0.05〜20raMが好ましい。 これらの量は被検 体の種類等により適宜決定することができ、 これ以上の量を用いることもできる。 第三のデヒドロゲナーゼおよびその基質としては、 例えば、 が NAD類または チォ NAD類のときは、 アルコールデヒド πゲナーゼ（BC 1.1.1.1)とァセトアルデ ヒド、 グリセロールデヒド πゲナーゼ（BC 1.1.1.6) (B. coli由来） とジヒドロ キシアセトン、 グリセロール- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (BC 1.1.1.8) (ゥサギ 筋肉由来） とジヒドロキシアセトンリン酸、 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ (BC 1.1. 1.37) (ブタ心筋、 ゥシ心筋由来） とオギザ口酢酸、 グリセ口アルデヒドリン酸 デヒドロゲナーゼ ( 1.1.1.12) (ゥサギ骨格筋、 肝、 酵母、 B. coli由来） と 1, 3-ジホスホ- D-グリセリン酸、 が NADP類またはチォ NADP類のときは、 ダルコ ース- 6-リン酸デヒドロゲナ一ゼ（BC 1.1.1.49) (酵母由来） とダルコノラクト ン -6-リン酸、 グリセ口アルデヒドリン酸デヒドロゲナ一ゼ (BC 1.2.1.13) (植 物葉緑体由来） と 1,3-ジホスホ- D-グリセリン酸等が挙げられる。
    [0105] かくして調製された本発明の定量用組成物によって被検体中のアンモニア、 α -了ミノ酸類、 該アミノ酸類に対応する -ケト酸、 またはこれらのイオン体を測 定するには、 上記成分 (1)~(4)、 (1)~(5)、 あるいは（1)〜(4)および (6)を含有 する組成物に被検体 0.001〜0.5m£を加え、 約 37での温度にて反応させ、 反応開始 一定時間後の 2点間の数分ないし数十分間、 例えば 3分後と 4分後の 1分間、 ま たは 3分後と 8分後の 5分間における生成された A2の量または消費された の 量を、 それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化によって測定すればよい。 例え ば、 A 2がチォ NADH、 が NADHの場合、 A 2の生成を 400nm付近の吸光度の増加に より測定するか、 あるいは B！の消費を 340nm付近の吸光度の減少により測定し、 既知濃度のアンモニア、 な-アミノ酸類、 該アミノ酸類に对応する"-ケト酸、 ま たはこれらのイオン体を用いて測定したときの値と比較すれば、被検液中のそれ ぞれの量をリアルタィ厶で求めることができる。
    [0106] また、 本発明定量法は、被検液中のァンモユア、 -ァミノ酸類、 該アミノ酸 類に対応する -ケト酸、 またはこれらのイオン体そのものを酵素サイクリング 反応に導くものであり、 被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検液の ブランク測定を省略することができ、 レイ トアツセィによる簡便な測定を成し得 。
    [0107] 尚、 本発明においては A2または の測定に当たり、 吸光度測定の代わりに他 の公知の測定法を使用して定量を行うこともできる。
    [0108] 実施例
    [0109] 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、 本発明はこれによって何等 限定されるものではない。
    [0110] 実施例 1 アンモニアの定量
    [0111] <試薬>
    [0112] 40 m トリス塩酸緩衝液 (PH8. 9)
    [0113] 3 mM ADP (オリエンタル酵母社製）
    [0114] 2 m チォ NAD (シグマ社製）
    [0115] 0. 2 IDM 還元型 NAD (オリエンタル酵母社製）
    [0116] 5 IDM or-ケトグルタル酸 （和光純薬社製）
    [0117] 3 mM BDTA
    [0118] 128 /td グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （ベーリンガ一社製：牛肝臓
    [0119] 由来）
    [0120] <捿作 >
    [0121] 上記試薬 l m£をキュべットにとり、 0、 40、 80、 120、 160、 200 Mの塩化アン モニゥ厶溶液をそれぞれ 50 £添加し、 3 7でにて反応を開始させた。反応開始 後 2分目と 4分目の 400nmにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 濃度 0の 値を試薬ブランクとし、 40〜200juMのそれぞれの塩化アンモニゥムの値からこの 値を引き、 その結果を図 1に示した。 図 1から明らかなように、 塩化アンモニゥ ム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
    [0122] 実施例 2 アンモニアの定量
    [0123] <試薬 >
    [0124] 100 m ト リス塩酸緩衝液 (PH9. 5)
    [0125] 1 m チォ NADP (シグマ社製）
    [0126] 0. 2 mM 還元型 NADP (オリエンタル酵母社製）
    [0127] 10 m -ケトグルタル酸 （和光純薬社製）
    [0128] 5 m 匿 A
    [0129] 250 u/m£ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （東洋紡社製：プロテウス エス ピー由来）
    [0130] <操作>
    [0131] 上記試薬 をキュぺットにとり、 0、 50、 100、 150、 200、 250JUMの塩ィ匕ァ ンモニゥ厶溶液をそれぞれ 50 1 ·β添加し、 3 7 にて反応を開始させた。 反応開 始後 3分目と 4分目の 400nmにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 実施例 1と同様試薬ブランクとの差を求め、 その結果を図 2に示した。 図 2から明らか なように、 塩化ァンモニゥム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。 実施例 3 L -グルタミン酸の定量
    [0132] 〈試薬〉
    [0133] 100 mM トリス塩酸緩衝液 (PH9. 5)
    [0134] 1 mM チォ NADP (シグマ社製）
    [0135] 0. 2 mM 還元型 NADP (オリエンタル酵母社製）
    [0136] 5 mM 塩化アンモニゥム （和光純薬社製）
    [0137] 5 mM EDTA
    [0138] 250 u/m£ グルタミン酸デヒド ゲナーゼ （東洋紡社製：プロテウス エス ピー由来）
    [0139] ぐ操作 > 上記試薬 I mgをキュぺッ トにとり、 0、 40、 80、 120、 160、 200juMの L-グル タミン酸ナトリウム （和光純薬社製） 溶液をそれぞれ 50 ^添加し、 3 7 にて 反応を開始させた。 反応開始後 3分目と 4分目の 400nmにおける吸光度を読み取 りその差を求めた。 実施例 2と同様試薬ブランクとの差を求め、 その結果を図 3 に示した。 図 3から明らかなように、 L-グルタミン酸ナトリゥム量に対する吸 光度変化量は良好な直線性を示した。
    [0140] 実施例 4 クレアチニンの定量
    [0141] 〈試薬〉
    [0142] 250 ηι トリス塩酸緩衝液 (PH9. 5)
    [0143] 2 mM チォ NADP (シグマ社製）
    [0144] 0. 2 mM 還元型 NADP (オリエンタル酵母社製）
    [0145] 10 mM -ケトグルタル酸 （和光純薬社製）
    [0146] 5 mM BDTA
    [0147] 20 /rd クレアチュンディミナーゼ （東洋紡社製：微生物由来）
    [0148] ' 250 u/mi グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （東洋紡社製：プロテウス エス
    [0149] ピー由来）
    [0150] <操作 >
    [0151] 上記試薬 I m^をキュべッ卜にとり、 0、 20、 40、 60、 80、 100 juiiのクレアチニ ン （和光純薬社製） 溶液をそれぞれ 50 添加し、 3 7でにて反応を開始させた。 反応開始後 3分目と 8分目の 400nmにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 実施例 3と同様試薬ブランクとの差を求め、 その結果を図 4に示した。 図 4から 明らかなように、 クレアチニン量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。 実施例 5 L-ロイシンの定量
    [0152] 40 m トリス塩酸緩衝液 (PH8. 9)
    [0153] 2 mM チォ NAD (シグマ社製）
    [0154] 0. 25 m 還元型 NAD (オリエンタル酵母社製）
    [0155] 100 mM 塩化アンモニゥム （和光純薬社製）
    [0156] 100 u/rd Dイシンデヒド IDゲナ一ゼ （BC 1. 4. 1. 9, バチルス エスピ' (Bacillus SP. ) 由来， 東洋紡社製）
    [0157] <操作 >
    [0158] 上記試薬 l fflfをキュぺッ トにとり、 0、 4、 8、 12、 16、 20JUMの L-ロイシン 溶液をそれぞれ ^添加し、 3 7 tにて反応を開始させた。 反応開始後 3分目 と 5分目の 400nmにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 濃度 0の値を試薬 ブランクとし、 4〜20JUMのそれぞれの L-ロイシンの値からこの値を引き、 その 結果を図 5に示した。 図 5から明らかなように、 L-ロイシン量に対する吸光度 変化量は良好な直線性を示した。
    [0159] 実施例 6 ピルビン酸の定量
    [0160] 〈試薬〉
    [0161] 40 mM トリエタノールァミン塩酸 - NaOH緩衝液 (PH8. 5)
    [0162] 4 m チォ NAD (シグマ社製）
    [0163] 0. 1 m 還元型 NAD (ォリェンタル酵母社製）
    [0164] 50 ra 塩化アンモニゥム （和光純薬社製）
    [0165] 1250 M ァラニンデヒ ドロゲナーゼ （ 1. 4. 1. 1, スポロラク トバチルス エスピー （Sporolactobaci l lus sp. ) 由来， 東洋醸造社製）
    [0166] <操作 >
    [0167] 上記試薬 l m£を試験管にとり、 0、 50、 100、 150、 200、 のピルビン酸 溶液をそれぞれ 20 / 添加し、 3 7 :にて反応を開始させた。 反応開始後 10分目 後に 2 %ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)溶液 1 を加え反応を停止させた。 400nm における吸光度を読み取り、 その結果を図 6に示した。 図 6から明らかなように、 ピルビン酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
    [0168] 実施例 7 アンモニアの定量
    [0169] <試薬〉
    [0170] 40 mM グリシン- NaOH緩衝液 (PHIO. O)
    [0171] 3 mM チォ NAD (シグマ社製）
    [0172] 50 juM NADP (オリエンタル酵母社製）
    [0173] 8 - mM L一リ ンゴ酸
    [0174] 30 u/ml リンゴ酸デヒドロゲナーゼ （EC 1. 1. 1. 37, ブタ心臓由来， ベー リンガ一社製）
    [0175] 3 ADP (オリエンタル酵母社製）
    [0176] 5 mM o -ケトグルタル酸 （和光純薬社製）
    [0177] 3 mM BDTA
    [0178] 160 u/rd グルタミン酸デヒドロゲナ一ゼ （ベーリンガ一社製：牛肝臓 由来）
    [0179] <操作 >
    [0180] 上記試薬 l m£をキュべッ卜にとり、 0、 20、 40、 60、 80、 の塩化アンモ ニゥム溶液をそれぞれ 50 i _g添加し、 3 7 ΐ:にて反応を開始させた。 反応開始後 3分目と 8分目の 400nmにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 濃度 0の值 を試薬ブランクとし、 20〜： L00 uMのそれぞれの塩化アンモニゥ厶の値からこの值 を引き、 その結果を図 7に示した。 図 7から明らかなように、塩化アンモニゥム 量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
    [0181] 実施例 8 アンモニアの定量
    [0182] <試薬 >
    [0183] 40 mM トリス塩酸緩衝液 (PH8. 0)
    [0184] 0. 25 mM 還元型 NADP (ォリェンタル酵母社製）
    [0185] 50 ULV チォ NAD (シグマ社製）
    [0186] 5 οιΜ ジヒド αキシアセトンリン酸
    [0187] 10 u/id グリセロール— 3 -リン酸デヒドロゲナーゼ （BC 1. 1. 1. 8， ベーリ ンガ一社製；ゥサギ筋肉由来）
    [0188] 3 mM ADP (オリエンタル酵母社製）
    [0189] 5 mM びーケトグルタル酸 （Si光純薬社製）
    [0190] 3 mM EDTA
    [0191] 200 u/rd グルタミン酸デヒド inゲナーゼ （ベーリンガ一社製：牛肝臟
    [0192] 由来）
    [0193] ぐ操作 >
    [0194] 上記試薬 をキュべットにとり、 0、 50、 100、 150、 200、 250 Μの塩化ァ ンモニゥム溶液をそれぞれ 50 ί ·δ添加し、 3 7 にて反応を開始させた。 反応開 始後 3分目と 8分目の 340ππιにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 実施例 †と同様試薬ブランクとの差を求め、 その結果を図 8に示した。 図 8から明らか なように、 塩化了ンモニゥム量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した 産業上の利用可能性
    [0195] 本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、 ま た、 酵素サイクリング反応を組み合わせることによって感度を増大させることが できる。 このため、 少量の検体で迅速かつ正確に被検体中のアンモニア、 at-了 ミノ酸類、 該アミノ酸類に対応する -ケト酸、 またはこれらのイオン体を髙感 度に定量することができ、 臨床検査、 食品検査等の分野において有用である。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. アンモニア、 —アミノ酸類、該な-アミノ酸類に対応する α—ケト酸、 およ びこれらのィォン体からなる群より選ばれた 1種の被検成分を舍有する被検体に，
    (1) チォニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフェート類 （以下チォ NADP 類という） およびチォニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類 （以下チォ fiAD 類という） からなる群より選ばれる 1つと、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオ チドホスフェート類 （以下 NADP類という） およびニコチンアミ ドアデニンジヌク レオチド類 （以下 NAD類という） からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくとも ァミノ酸類と氷とを基質としてァンモニァと該 α-ァミノ酸類に対 応する -ケト酸を生成する可逆反応をなすァミノ酸類デヒドロゲナーゼ、
    (2) Α ,
    (3) Β ,
    (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下記サイクリング反応系を 形成せしめる成分
    を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式 ( I )
    な一アミノ酸類 + H2Q Of —ケト酸 + アンモニア
    ( I )
    (式中、 A iはチォ NADP類、 チォ NAD類、 MDP類または NAD類を示し、 A2は A ,の 還元型生成物を示し、 B iは A iがチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型
    NADP類または還元型 NAD類を、 A iが NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP 類または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は B！の酸化型生成物を示す）
    で表されるサイクリング反応を形成せしめ、 該反応によって変化する A2または の量を測定することを特徵とするアンモニア、 -ァミノ漏、 該な-アミノ 酸類に对応する -ケト酸、 およびこれらのイオン体からなる群より選ばれた 1 種の被検成分の高感度定量法。
    2. な-アミノ酸類が L -ダルタミン酸であり、 該 -アミノ酸類に対応する - ケト酸が -ケトグルタル酸であり、 アミノ酸類デヒドロゲナーゼがグルタミン 酸デヒドロゲナ一ゼである請求項 1記載の高感度定量法。
    3. α-アミノ酸類がァラニンであり、 該 α -アミノ酸類に対応する α -ケト酸が ピルビン酸であり、 アミノ酸類デヒドロゲナーゼがァラニンデヒドロゲナーゼで あり、 A tがチォ NAD類または NAD類であり、 が がチォ NAD類であるときは 還元型 NAD類であり、 A ,が NAD類であるときは還元型チォ NAD類である請求項 1記 載の高感度定量法。
    4. α-アミノ酸類がロイシンであり、 該 α-アミノ酸類に対応する α-ケト酸が 2 -ォキソイソ力プロン酸であり、 アミノ酸類デヒドロゲナーゼが σイシンデヒ ドロゲナーゼであり、 A ,がチォ NAD類または NAD類であり、 B ,が がチォ NAD類 であるときは還元型 NAD類であり、 A ,が NAD類であるときは還元型チォ NAD類であ る請求項 1記載の高感度定量法。
    5. 被検成分がアンモニアまたはそのイオン体であり、 了ミノ酸類デヒドロゲナ ーゼがグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、 ァラニンデヒド πゲナーゼ、 ロイシンデ ヒドロゲナーゼ、 セリンデヒド πゲナーゼ、 ノヽ'リンデヒドロゲナーゼ、 グリシン デヒドロゲナーゼまたはアミノ酸デヒドロゲナーゼであり、被検成分として存在 する成分以外のサイクリング反応系を形成せしめる成分が各酵素の基質となる当 該ァミノ酸類に対応する -ケト酸類である請求項 1記載の髙感度定量法。
    6. アンモニア、 な-アミノ酸類、 該 α—アミノ酸類に対応するな-ケト酸、 およ びこれらのィォン体からなる群より選ばれた 1種の被検成分を含有する被検体に、
    (1) チォ NADP類およびチォ NAD類からなる群より選ばれる 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくとも α-アミノ酸類と 水とを基質としてアンモニアと該な-アミノ酸類に対応する ケト酸を生成する 可逆反応をなす了ミノ酸類デヒドロゲナーゼ、
    (2) Α ι
    (3) B ,または/および B 2
    (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下記サイクリング反 系を 形成せしめる成分
    (5) α -アミノ酸類に作用せず、 Β 2から Β ,への反応を形成する第二のデヒドロ ゲナーゼおよび第二のデヒドロゲナ一ゼの基質
    を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応 ( Π )
    一アミノ酸類 + H2D 酸 + アンモニア
    第二のデヒド α行-セ'
    (式中、 はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A 2は A tの 還元型生成物を示し、 は A tがチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NADP類または還元型 NAD類を、 A！が NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP 類または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は の酸化型生成物を示し、
    は B 2を補酵素として B！を生成する酵素反応を示す）
    で表されるサイクリング反応を形成せしめ、 該反応によって変化する A 2の量を 測定することを特徵とするアンモニア、 -アミノ酸類、 該 α-アミノ酸類に对応 する -ケト酸、 およびこれらのィォン体からなる群より選ばれた 1種の被検成 分の高感度定量法。
    7. α—アミノ酸類が L—グルタミン酸であり、 該な-アミノ酸類に对応する "- ケト酸が -ケトグルタル酸であり、 アミノ酸類デヒド ηゲナーゼがグルタミン 酸デヒドロゲナーゼである請求項 6記載の高感度定量法。
    8. "-アミノ酸類がァラニンであり、 該 -アミノ酸類に対応する" -ケト酸が ピルビン酸であり、 アミノ酸類デヒド πゲナーゼがァラニンデヒドロゲナ一ゼで あり、 A iがチォ NAD類または NAD類であり、 が がチォ NAD類であるときは還 元型 NAD類であり、 A tが NAD類であるときは還元型チォ NAD類である請求項 6記載
    9. α-アミノ酸類がロイシンであり、該 アミノ酸類に対応する -ケト酸が 2 -ォキソイソカブロン酸であり、 アミノ酸類デヒドロゲナーゼがロイシンデヒ ドロゲナーゼであり、 A ,がチォ NAD類または NAD類であり、 B iが がチォ NAD 類であるときは還元型 NAD類であり、 A ,が NAD類であるときは還元型チォ NAD類で ある請求項 6記載の高感度定量法。
    10. 被検成分がアンモニアまたはそのイオン体であり、 アミノ酸類デヒドロゲナ ーゼがグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、 ァラニンデヒドロゲナーゼ、 ロイシンデ tドロゲナーゼ、 セリンデヒドロゲナーゼ、 ノヽ 'リンデヒドロゲナーゼ、 グリシン デヒドロゲナーゼまたはアミノ酸デヒドロゲナーゼであり、 被検成分として存在 する成分以外のサイクリング反応系を形成せしめる成分が各酵素の基質となる当 該ァミノ酸類に対応する ケト酸類である請求項 6記載の高感度定量法。
    11. アンモニア、 -アミノ酸類、 該 α-アミノ酸類に射応する -ケト酸、 およ びこれらのイオン体からなる群より選ばれた 1種の被検成分を含有する被検体に、
    (1) チォ NADP類およびチォ NAD類からなる群より選ばれる 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくとも -了ミノ酸類と 水とを基質として了ンモニァと該 -ァミノ酸類に対応する -ケト酸を生成する 可逆反応をなすァミノ酸類デヒド ゲナーゼ、
    (2) A ,または/および Α2
    (3) Β ,
    (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分 £1外の下記サイクリング反応、系を 形成せしめる成分
    (6) α -アミノ酸類に作用せず、 Α 2から A ,への反応を形成する第三のデヒドロ ゲナーゼおよび第三のデヒドロゲナーゼの基質
    を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式 ( I )
    第三のデヒ! ¾タナ
    —アミノ酸類 + Η20 アンモニア
    (式中、 A ,はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A 2は の 還元型生成物を示し、 B ,は A tがチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NADP類または還元型 NAD類を、 A iが NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP 類または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は の酸化型生成物を示し、 As—A ,は A2を補酵素として A！を生成する酵素反応を示す）
    で表されるサイクリング反応を形成せしめ、 該反応によって変ィ匕する の量を 測定することを特徵とするアンモニア、 アミノ酸類、 該 -アミノ酸類に対応 する -ケト酸、 およびこれらのイオン体からなる群より選ばれた 1種の被検成 分の髙感度定量法。
    12. -ァミノ酸類が L-グルタミン酸であり、 該 or-ァミノ酸類に对応する - ケト酸が -ケトグルタル酸であり、 アミノ酸類デヒドロゲナーゼがグルタミン 酸デヒドロゲナーゼである請求項 1 1記載の髙感度定量法。
    13. -了ミノ酸類がァラ二ンであり、該 -了ミノ酸類に対応する "-ケト酸が ビルビン酸であり、 アミノ酸類デヒドロゲナーゼがァラニンデヒドロゲナーゼで あり、 A tがチォ NAD類または NAD類であり、 B！が A tがチォ NAD類であるときは還 元型 NAD類であり、 が NAD類であるときは還元型チォ NAD類である請求項 1 1記 載の高感度定量法。
    14. -アミノ酸類がロイシンであり、 該 -アミノ酸類に対応する α -ケト酸が 2 -ォキソィソカプロン酸であり、 アミノ酸類デヒドロゲナーゼがロイシンデヒ ドロゲナ一ゼであり、 A tがチォ NAD類または NAD類であり、 が がチォ NAD 類であるときは還元型 NAD類であり、 A：が NAD類であるときは還元型チォ NAD類 である請求項 1 1記載の高感度定量法。
    15. 被検成分がアンモニアまたはそのイオン体であり、 アミノ酸類デヒドロゲナ ーゼがグルタミン酸デヒドロゲナ一ゼ、 ァラニンデヒドロゲナーゼ、 ロイシンデ ヒドロゲナーゼ、 セリンデヒド πゲナーゼ、 ノ リンデヒドロゲナーゼ、 グリシン デヒドロゲナーゼまたはァミノ酸デヒド πゲナーゼであり、 被検成分として存在 する成分以外の下記サイクリング反応系を形成せしめる成分が各酵素の基質とな る当該ァミノ酸類に対応する -ケト酸類である請求項 1 1記載の髙感度定量法。
    16. 次の成分 (1)〜(
    (1) チォ NADP類およびチォ NAD類からなる群より選ばれる 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくとも -アミノ酸類と 水とを基質としてアンモニ了と該 α -了ミノ酸類に対応する "-ケト酸を生成する 可逆反応をなす了ミノ酸類デヒド πゲナーゼ、
    (2) Α ,
    (3) Β ,
    (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下記サイクリング反応系を 形成せしめる成分
    (Α ,はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 B ,は がチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NADP類または還元型 NAD類を、 A ,が NADP 類または NAD類のときは還元型チォ NADP類または還元型チォ NAD類を示す） を含有することを特徴とするアンモニア、 -アミノ酸類、 該な-了ミノ酸類に対 応する -ケト酸、 およびこれらのイオン体からなる群より選ばれた 1種の被検 成分の髙感度定量用組成物。
    17. 次の成分 (1)〜(5)
    (1) チォ NADP類およびチォ NAD類からなる群より選ばれる 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくとも -アミノ酸類と 水とを基質としてアンモニアと該な-ァミノ酸類に対応する or-ケト酸を生成する 可逆反応をなすァミノ酸類デヒドロゲナーゼ、
    (2) A ,
    (3) または および B 2
    (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下記サイクリング反応系を 形成せしめる成分
    (5) α-アミノ酸類に作用せず、 Β 2から への反応を形成する第二のデヒドロ ゲナーゼおよび第二のデヒドロゲナーゼの基質
    (Α !はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 は がチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NADP類または還元型 NAD類を、 A ,が NADP 類または NAD類のときは還元型チォ NADP類または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は B ,の酸化型生成物を示す）
    を含有することを特徵とするアンモニア、 "-アミノ酸類、 該"-アミノ酸類に対 応する -ケト酸、 およびこれらのイオン体からなる群より選ばれた 1種の被検 成分の髙感度定量用組成物。
    18. 次の成分 ω〜ωおよび (6)
    (1) チォ NADP類およびチォ NAD類からなる群より選ばれる 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、少なくとも a-了ミノ酸類と 永とを基質としてァンモニァと該 ァミノ酸類に对応する -ケト酸を生成する 可逆反応をなすァミノ酸類デヒドロゲナーゼ、
    (2) または Zおよび A2
    (3) B i
    (4) 必要に応じて被検成分として存在する成分以外の下記サイクリング反応系を 形成せしめる成分
    (5) な-アミノ酸類に作用せず、 A 2から A！への反応を形成する第三のデヒドロ ゲナーゼおよび第三のデヒドロゲナーゼの基質
    (A iはチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A2は の還元型 生成物を示し、 B ,は A ,がチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NADP類ま たは還元型 NAD類を、 A 1が NADP類または NAD類のときは還元型チォ MDP類または 還元型チォ NAD類を示す）
    を舍有することを特徴とするアンモニア、 "-アミノ酸類、 該 アミノ酸類に対 応する α -ケト酸、 およびこれらのイオン体からなる群より選ばれた 1種の被検 成分の髙感度定量用組成物。
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