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    公开号:WO1992006997A1
    申请号:PCT/JP1991/001424
    申请日:1991-10-17
    公开日:1992-04-30
    发明作者:Yorimasa Suwa；Atsushi Imaizumi；Masahiro Okada；Chieko Azuma；Ichiro Kudo；Keizo Inoue
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 発明の名称
    [0002] 炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害活性を有するぺ プチド 技術分野
    [0003] 本発明は炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害活性を 有するペアチドに鬨する。 背景技術
    [0004] ホスホリパーゼ A 2 はリン脂質の エステル結合を加 水分解し、 脂肪酸と リゾリン脂質とを生じる酵素である。 特に、 ァロスタグランジン、 ロイコトリェン、 トロンボ キサン等の前駆体となるァラキドン酸を膜リン脂質から 遊離されることから、 これらの炎症メデイエ一ターの産 生において重要な役割を果していると考えられる。 近年、 ヒ卜炎症疾患や炎症モデル動物の局所からホスホリバ一 ゼ A 2 (以下、 炎症局所由来ホスホリパ一ゼ A 2 という ） が精製され、 その性状が明かになった。 この酵素は炎症 反応を進展させる働きを有すると考えられ、 したがって この酵素の活性を阻害する薬物は抗炎症的な作用を示す ことが期待される。
    [0005] 補体 C 3は補体活性化経路において中心的機能を果す ことが知られている蛋白である。 C 3は血中の蛋白分解 酵素によって段階的に分解される。 すなわち、 まず C 3 コンベルターゼにより切断されて C 3 aと C 3 bとを生 じる。 C 3 bはチオールエステル部位を介して異物表面 と結合し、 それに引き続いて補体経路が活性化して膜侵 襲複合体の形成に至る。 また、 C 3 aはァナフイラトキ シンとして働く。 この際異物と結合する C 3 bは一部で あり、 大部分は水分子と反応して結合活性を失い、 その 後さらに蛋白分解酵素により切断されて最終的に C 3 d gまたは C 3 dを生じる。
    [0006] 木発明者らはヒトおよびラットの C 3 d gが炎症局所 由来ホスホリパ一ゼ A2 を特異的に阻害する活性を有す ることさらにラット C 3 c D N Aを大腸菌において発 現させ、 ラット C 3 «鎖の一部 （ C 3 d g部分を含む） を組換え蛋白として得ることに成功し、 かっこの組換え 蛋白が炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 を特異的に阻害 する活性を有することを見いだし既に出願している 〈国 際出願番号 PCTZ J P90ノ 00996 号， WO91Z01999 号〉 。
    [0007] しかしながらヒト C 3 d gは分子量約 39 k D aの蛋白 であり、 該蛋白をそのままの形態で抗炎症薬として用い ることは、 薬物の局所への移行性や保存時の安定性、 抗 原性等の点で問題が生じることが予想される。 従って、 そのような問題点がなく抗炎症薬と して用い ることのできる炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻害活 性を有する新規なペプチドの提供が望まれている。
    [0008] そこで上記の問題点を解決すべく銳意検討の結果、 C 3 d gアミノ酸配列の一部分が炎症局所由来ホスホリパ ーゼ A2 阻害活性を有することを知見して本発明に到達 したものである。
    [0009] 発明の開示
    [0010] すなわち本発明は、 配列番号 1で表わされるアミノ酸 配列を有する炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻害活性 ペプチドである。
    [0011] 図面の簡単な説明
    [0012] 第 1図 （Fig. 1 ) は、 実施例 1において合成した本発 明のペアチドを逆相 HP LCで分画した結果を示す。
    [0013] 第 2図 （Fig. 2 ) は、 実施例 2において測定した本発 明のペプチドのホスホリパーゼ A2 阻害活性を示す。
    [0014] 図中、 會―譬はヒト炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 、
    [0015] 〇一〇はラット炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 、 … Xはブタ脾臓由来ホスホリバ一ゼ A2 を用いた場合を示 す。
    [0016] 発明を実施するための最良の形態
    [0017] 木発明のペアチドは配列番号 1で表わされる 21残基の アミノ酸配列を有する。 該ペプチドのアミノ酸配列はヒ ト C 3 a鎖の 612 番目から C末端までのアミノ酸配列と 同一である。 配列番号 1のアミノ酸配列において、 1ま たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、 欠失または挿入が なされているぺプチドも炎症局所由来ホスホリパーゼ阻 害活性を有する限り本発明のぺプチドに舍まれる。
    [0018] かかる本発明のペプチドは、 例えば 「ペプチド合成の 基礎と実験」 （泉屋信夫 · 加藤哲夫 · 青柳 · 脇道典 著： 丸善 （株） 〉 、 あるいは E. Atherton, R. C.
    [0019] S eppar d Sol id phase peptide synthesis, a ractical approach" ( L R L press) 等に記載の通常のペア チド合成法によって合成後、 精製することによって得る ことができる。 あるいは、 ヒト C 3 α鎖等を原料として、 これらの蛋白を例えば ーキモトリアシン等の酵素で酵 素分解することによって得ることもできる。
    [0020] 以下、 本発明で用いたペプチド合成法等及びホスホリ パーゼ Α2 阻害活性の測定法について説明する。
    [0021] ① ペプチドの合成および精製
    [0022] Appl ied B systems社の 431 A型ペプチド合成機を 用い、 Fmoc法にて合成を行った。
    [0023] サンアルの脱保護は Appl ied B 1 ci systems社のプロト コールに従い、 TM S B rクリーべッジ法で行った。
    [0024] サンアルの精製は逆相 H P L Cカラム （Vydac
    [0025] Protein C 1S、 2.2cm I D X 25cm) を用い、 0.1 %ト リフルォロ酢酸存在下、 0〜δΟ%ァセトニトリルの濃 度勾配により溶出を行った。
    [0026] ② ホスホリパーゼ Α2 阻害活性の測定 活性測定系は lOOtnM トリス塩酸 （PH9. G ) 、 4 mM塩 化カルシウム、 O. lmM [ 14C ] ホスファチジルェタノ —ルァミン （ 2, OOOdpm/nmoI〉 、 および 10 1のサン アルに蒸留水を加えて全量 240 ju 1 にして混合し、 最 後に 10 1の 0. Ing ノ 1ホスホリパーゼ A 2 を加え た。 なお、 ホスホリパーゼ A 2 はヒト炎症局所 （慢性 鬨節リウマチ患者鬨節液〉 由来の酵素 （Hara et al, J. Bioc em, 104, 326-328, 1988 ) 、 ラット炎症局所 由来の酵素 （ Chang et al, J. Biochem. 102, 147- 154, 1007 ) 、 およびブタ脾臓由来の酵素 （Boehringer
    [0027] Manheim 社製〉 を用いた。 ホスファチジルエタノール アミンは [ 14C ] 酢酸を加えた培地中で培養した大腸 菌から精製した。
    [0028] 反応は 3 7でで 1 0分間振盪しながら行った。 反応 停止および脂肪酸の抽出は Doleの方法 （Dole et al, J. Biol. Chern. 235, 2595-2599, 1960 ) にしたがつ て行い、 抽出した [ 14C ] 脂肪酸を液体シンチレ一シ ョンカウンターで測定した。
    [0029] 以下、 実施例により本発明を更に詳細に説明する。 実施例 1 (炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻害活性を 有するペアチドの合成と精製〉
    [0030] 配列番号 1で表わされるアミノ酸配列に徙つてペアチ ド合成機 （Appl ied Biosystems社 431A型〉 を用いてぺ ァチドを合成した。 反応収率は約 77· 9%であった。 脱保護後、 得られた粗生成物 140.7mg を逆相 H P LC にて分画した （第 1図 （Fig. 1 〉 ) 。 ァセトニトリル 35 %付近で溶出するメイ ンピーク部分を分取し、 凍結乾燥 した。 最終精製サンアルの収量は 21.8mgであった。 また、 Applied Biosystems社の気相ァロティンシークェンサ一 477 Aにより配列番号 1のアミノ酸配列を有しているこ とを確認した。
    [0031] 実施例 2 (ホスホリパーゼ A 2 阻害活性〉
    [0032] 実施例 1で得られた凍結乾燥後のサンアルを 50%ァセ トニトリル— 0.1 %トリフルォロ酢酸に再び溶解して 10 mgZmlとした。 さらに同じバッファ一で段階稀釈を行い、 各濃度での炎症局所由来ホスホリパ一ゼ A2 阻害活性を 測定した。
    [0033] 結果を第 2図 （Fig. 2 ) に示した。 本発明のペプチド はヒト炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 (會ー秦〉 、 お よびラット炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 (〇一〇） を用量依存的に阻害した。 どちらの酵素の場合にも 1 ng の酵素活性を 50%阻害するのに必要な蛋白量は約 300ng であり、 I C5。値は約 5 X 1 0—7Mであった。 一方、 ブ タ脾臓由来ホスホリパーゼ A2 〈 …ズ〉 に対しては有 為な阻害活性を示さなかった。
    [0034] 産業上の利用分野
    [0035] 本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻害活性を 有するペプチドは、 炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 の 阻害活性を有することから、 例えばアレルギー反応抑制 作用を有すると期待され、 哺乳動物、 特にヒトの抗炎症 薬、 アレルギー疾患の治療薬として利用することができ る。 また局所への移行性や保存時の安定性に優れ、 抗原 性等の点での問題が少ないと期待される。
    [0036] 〔配列表〕
    [0037] 配列番号： 1
    [0038] 配列の長さ ： 21
    [0039] 配列の型： アミノ酸
    [0040] トポロジー： 直鎖状
    [0041] 配列の種類： タンパク質
    [0042] フラグメント型： 中間部フラグメント
    [0043] 配列：
    [0044] Gin L s Asp Ala Pro Asp His Gin Glu Leu Asn Leu ] 5 10
    [0045] Asp Va 1 Ser Leu Gin Leu Pro Ser Ar g
    [0046] 15 20
    权利要求:
    Claims

    請求の範囲 配列番号 1で表わされるアミノ酸配列を有する炎症 局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害活性ペプチド。
    ) 該アミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミ ノ酸残基の置換、 欠失または挿入がなされていること を特徴とする請求の範囲第 1項記載のペアチド。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE69119747T2|1996-12-05|
    EP0506971A1|1992-10-07|
    KR960004772B1|1996-04-13|
    AU8716491A|1992-05-20|
    EP0506971A4|1994-08-17|
    US5374713A|1994-12-20|
    DE69119747D1|1996-06-27|
    EP0506971B1|1996-05-22|
    AU635669B2|1993-03-25|
    AT138387T|1996-06-15|
    CA2071910A1|1992-04-19|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1992-04-30| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU CA JP KR US |
    1992-04-30| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
    1992-06-16| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 2071910 Country of ref document: CA |
    1992-06-18| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1991917809 Country of ref document: EP |
    1992-10-07| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1991917809 Country of ref document: EP |
    1996-05-22| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1991917809 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2/277842||1990-10-18||
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    EP19910917809| EP0506971B1|1990-10-18|1991-10-17|Peptide with activity of inhibiting phospholipase a2 originating in inflamed part|
    DE1991619747| DE69119747T2|1990-10-18|1991-10-17|In entzündungsherden auftretende peptide mit phopholipase a2 hemmaktivität|
    KR92701448A| KR960004772B1|1990-10-18|1991-10-17|염증 부위로 부터 정제된 포스포리파제 a_2의 펩타이드 저해제|
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