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    公开号:WO1992006382A1
    申请号:PCT/JP1991/001309
    申请日:1991-09-27
    公开日:1992-04-16
    发明作者:Shigenori Tanaka；Hiroshi Tamura
    申请人:Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 エ ン ド ト キ シ ン の 測 定 法 技 術 分 野
    [0002] 本発明は、 血漿又は血清中のエン ドトキシンの測定法に関す るものであり、 殊にェン ド トキシンを高い精度で測定するため の前処理に関するものである。 背 景 技 術
    [0003] カブトガニ ■ ァメボサイ ト · ライセ一 ト成分を用いてェン ド トキシ ン （細菌内毒素） を測定する方法 （以下リ ムルステス ト という） が従来から知られており、 医薬品、 水などの汚染試験、 臨床検査など多方面に汎用されている。 リムルステス トはェン ド トキシンの検出感度が高いため生体試料中の微量検出に適し 一し レヽ o σ
    [0004] ところで、 生体試料のリ厶ルステス トにおいては、 蛋白等に 吸着されたェン ド トキシンが含まれ、 これらからェン ド トキシ ンを効率よく遊離させるための前処理が必要である。 特に血漿、 血清のような蛋白細胞顆粒を含む生体試料については、 従来 25 °Cにおける pKa が 3以下の酸を用いて P H 3以下の条件下で処理 した後に、 変性析出物を遠心分離しで除去し、 その上澄液を採 取し、 アルカ リで中和したものを被検液とする方法 （特公昭 63 - 5 5 6 7 1 号公報） が知られているが、 その分離操作が煩雑 で全操作行程も長く、 汚染の危険性があるなどの問題があった。 発 明 の 開 示
    [0005] 本発明は、 血漿及び血清中のェン ド トキシンを極めて高い検 出率で、 効率よ く 簡便、 迅速に測定する方法を提供するもので あ O o
    [0006] 本発明は、 力ブ トガニ ' ァメボサイ ト ' ライセー ト成分を使 用する血漿又は血清中のェン ド トキシンの測定法において、 a ) ポリオキシエチレ ンエーテル類、 ポリ オキシエチレ ンソ ルビタ ン類、 n —アルキルグルコ ビラノ シ ド類及び ドデシル硫 酸塩からなる群から選択された界面活性剤、
    [0007] b ) イ ミ ダゾリ ル基又はァ ミ ノ基を有する化合物、 及び c ) アルカ リ土類金属塩とアルカ リ金属水酸化物
    [0008] の混合水溶液を血漿又は血清に添加して被検液とするこ とを特 徵とするエン ド トキシンの測定法である。
    [0009] 本発明に用いるこ とができる界面活性剤のうち、 ポリ オキシ エチレ ンエーテル類としては、 ポリ オキジエチレ ン一 p —夕一 シャ リ 一ォクチル （又はイ ソォクチル） フヱニルェ一テ儿 （重 合度 8〜 4 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン一 4 一夕一シャ リ 一ォク チル （又はイ ソォクチル） シクロへキシルエーテル.（重合度 8 〜 4 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン一 p —ノニルフ エニルエーテル (重合度 9〜 1 5 ) 、 ポリオキシエチレ ンヘプタ メチルへキシ ルエーテル （重合度 1 0〜 2 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン ドデシ ルエーテル （重合度 1 0〜 2 9 ) などが挙げられる。 また、 n —アルキルグルコ ビラノ シ ド類としては、 n— (ヘプチ儿、 ォ クチル、 ノニル、 デシル又は ドデシル） （ひ一又は / 3— ) D - グ儿コ ビラノ シ ドなどが挙げられる。 更に、 ポリオキシェチレ ンソルビタ ン類と しては、 ポリ オキシエチレ ンソルビタ ン （重 合度約 2 0 ) のモノ ラウ レー ト、 モノパル ミ テー ト、 モノ ステ ア レー ト、 モノォレエー ト又は ト リオレエ一トなどが挙げられ る。 またアルキル硫酸塩と しては、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 ドデシル硫酸リ チウム、 ドデシル硫酸カルシウムなどが挙げら 才 1 O o
    [0010] イ ミ ダゾリ ル基又はア ミ ノ基を有する化合物と しては、 ヒス 夕 ミ ン二塩酸塩、 L— ヒスチジン二塩酸塩、 ポリ 一 L— ヒスチ ジン塩酸塩 （分子量 1 5， 0 0 0〜 5 0 , 0 0 0 ) 、 ポリ 一 L — リ ジン塩酸塩 （分子量 2 , 0 0 0〜 7 0 , 0 0 0 ) 、 ポリ 一 L—アルギニン塩酸塩 （分子量 5， 0 0 0〜 1 5 0， 0 0 0 ) 、 ポリエチレンィ ミ ン （分子量 1 , 0 0 0〜 7 0， 0 0 0 ) 、 ァ デニン塩酸塩、 シ ト シン塩酸塩などが挙げられる。
    [0011] a ) の界面活性剤の添加量はその種類により異なる力 <、 0.04 〜0. 4 0 % (重量ノ容量） の範囲で使用するこ とが好ま し く 、 b ) のイ ミ ダゾリ ル基又はア ミ ノ基を有する化合物は、 その種 類によ り異なるが、 0. 0 3〜 0· 3 % (重量ノ容量） の範囲で使 用するこ とが好ま しく、 アルカ リ土類金属塩及びアル力 リ金属 水酸化物は混合水溶液中それぞれ 0. 0 0 5〜0. 0 5 モ儿 / ^及 び 0. 0 5〜 0. 5 モル Ζ であるこ とが好ま しい。
    [0012] また、 混合水溶液に Ν, Ν—ビス （ 2 — ヒ ドロキシェチル） グリ シンを、 0. 0 0 5〜 0. 0 5 モル Ζ 好ま し く は 0. 0 2〜
    [0013] 0. 0 5 モル/ " ^を添加するこ とにより、 その濁りの生成が押え られ、 透明な溶液が得られる。
    [0014] 上記混合水溶液を用いて血漿又は血清を処理する際の処理温 度は 2 5〜 7 0 °C、 とく に 3 7〜 5 6 °Cの範囲が好ましく、 処 理時間は 5〜 3 0分、 とく に 5〜 2 0分の範囲が好ましい。
    [0015] このような本発明の a ) 〜 c ) からなる混合水溶液で血漿又 は血清を処理した被検液は、 力ブトガニ · ァメボサイ ト ' ライ セー ト成分と反応させ、 エン ドトキシンを測定することができ る。 発 明 を 実施 す る た め の 最 良 の 形 態
    [0016] 以下に実施例を挙げ、 本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
    [0017] 実施例 1
    [0018] 健常人より血液 1 m£当たりへパリ ンを 5ュニッ ト添加して採 血した血液 2 を、 1 5 0 X g、 1 0分間遠心分離して、 多血 小板血漿 （ P R P) を得た。
    [0019] この P R P試料 1 9 0 / ^に Salmonella abortus equi 由来 のェン ド トキシン調製品（ェン ド トキシンスタ ンダー ド N P 1 水溶液 （ 2 ng/m6) を 1 0 ^加え、 よ く混合した後、 その 5 〃 をエン ドトキシンフ リーのマイクロプレー ト （ トキシぺ ッ トプレー ト 9 6 F、 生化学工業販売、 商品名） にとり、 0. 1 モル Z ^水酸化力 リ ウム （K 0 H) - 0. 0 1 モル Z ^塩化カル シゥ厶 （ C a C 2) — 0. 1 % (重量 Z容量） ト リ ト ン X— 100 (ポリ オキシエチレ ン一 p —夕ーシ、ャ リ ーォクチルフ エ二ル エーテル、 Rohm & Haas Co. 販売の商品名） を含有する水溶液 ならびに、 それにさらに 0. 0 1 6〜 0. 8 0 0 % (重量ノ容量） になるようにポリエチレ ンィ ミ ン （エチレ ンイ ミ ンポリマー、 E I P、 平均分子量 ： 7 0 , 0 0 0 ) を添加した水溶液の混 液 （ 2 0 u £ ) を加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持する。 これを被 検液とした。
    [0020] 被検液に存在するエン ド トキシンの測定は、 0. 1 モル Z の ト リスー塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 4. 4 τη にカブトガニ ' ァメボサ ィ ト ■ ライセ一 ト抽出成分からグルカンに反応する酵素を除去 した調製品であるエン ドスぺシ一 （登録商標、 生化学工業株式 会社製造販売） を溶解して使用し、 被検液 2 5 ^ にエン ドス ぺシー 1 0 0 〃 を加え、 3 7 °Cに 3 0分間加温し、 次いで 0. 0 4 % (重量 容量） の亜硝酸ナ ト リ ウム （ 1 モル Z ^ の塩 酸溶液） 5 0 ^ 、 0. 3 % (重量 _ 容量） スルファ ミ ン酸アン モニゥ厶 5 0 〃 _ίならびに 0. 0 7 % (重量 Ζ容量） Ν— 1 —ナ フチルエチレンジア ミ ンニ塩酸塩 （ 1 4 (容量/容量:） Ν - メチル— 2—ピロ リ ドン溶液） 5 0 〃 ^を順次加えてジァゾ力 ップリ ングし、 この吸光度をマイ クロプレー ト リーダ一により 波長 6 3 0 nmを対照として波長 5 5 0 nmで測定した。
    [0021] 第 1 表に E I P濃度を種々変化させた場合の本実施例による 測定結果をェン ド トキシンが無添加である比較例の測定結果と ともに示す。
    [0022] なお、 第 1表中、 E I P濃度 （％) は処理時の濃度を示し、 測定結果はェン ド トキシンを加えない比較例については波長 5 5 0 - 6 3 0 nmで測定した吸光度を示し、 エン ド トキシンを 添加した実施例については対照例 （ P R P試料の代わりに注射 用生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用 したもの） の測定値を 1 0 0 とした場合の検出率（％) を示した。 1 表 被 検 液 E I P濃度 吸 光 度 ェンドトキシン
    [0023] (¾) (；ェンド卜キシン te添 ¾0 添加検出率（¾
    [0024] 0.000 0.027 52
    [0025] 0.016 0.028 55
    [0026] 0.032 0.028 91
    [0027] PRP 0.048 0.029 100
    [0028] (+ェンドトキシン） 0.064 0.029 100
    [0029] C
    [0030] + ト リ トン X— 1 0 0 0.080 0.029 100
    [0031] + E I P 0.160 0.029 100
    [0032] + KOH 0.240 0.028 92
    [0033] + C a C ' 0.320 0.028 83
    [0034] 0.400 0.027 70
    [0035] 0.600 0.028 70
    [0036] 0.800 0.026 65 対 照 例 0.000 0.025 100
    [0037] 第 1 表によれば、 ト リ ト ン X— 1 0 0 と E I Pとを含まない 0. 0 8モルノ£ K〇 H— 0. 0 0 8モル ^ C a C _^ 2 のみ による処理では、 エン ドトキシンの検出率が非常に悪く （ 5 2 %) 、 0.08% ト リ ト ン X— 1 0 0存在下で E I Pの濃度を増や して行く と検出率が増加することが判る。
    [0038] また、 E I Pの濃度が 0. 3 2 %を超えるとェン ド トキシンの 検出率が低下するが、 例えば処理に使用する E I P として 0.032 〜0. 2 4 0 %程度の濃度のものを使用すれば、 リムルステス 卜 偽陽性因子ならびに阻害因子も完全になく した場合と同等な条 件下で P R P中のエン ド トキシンの真の値を正確且つ高い信頼 度を以て再現性よ く検出することが可能であるこ とが明らかで あ <t> 0
    [0039] 即ち、 エン ド トキシンを添加しない比較例の吸光度が対照例 のそれと同値であるという こ とは、 P R P中のリムルステス ト 偽陽性因子が完全に変性されたこ とを示すものであり、 また、 ェン ド トキシンを添加して測定した実施例におけるェン ド トキ シンの検出率が 1 0 0 %であるとレ、う ことは P R P中のリ厶ル ステス ト反応阻害因子 （偽陰性因子） が完全に変性されている ことを意味しているのであり、 これらの妨害因子を同時に変性 することができる条件、 つま り、 比較例の測定値が対照例とほ ぼ同値で且つ実施例の測定値がほぼ 1 0 0 % (すなわち、 実施 例において添加したェン ドトキシンの量がほとんど全て検出回 収することができるこ とを意味している） となる条件が理想的 であり、 第 1 表で示すように 0. 0 8 % ト リ ト ン X— 1 0 0存在 下で、 0. 0 3 2〜 0. 2 4 0 %の濃度の E I Pを用いたときがこ れに当たる。
    [0040] 実施例 2
    [0041] 実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 ^ に 4 0 pgのェン ド トキシン調製品 E. co l i 0111： B4を含有する 水溶液 1 0 〃 ^を添加した後、 その 5 Z をトキシペッ トプレ ー ト 9 6 Fにとり、 0〜0. 5 %の範囲内で選択された所定量の ト リ ト ン X— 1 0 0を含有する 0. 1 モル £ K 0 H - 0. 0 7 % E I P— 0. 0 1 モル Z ^ C a C ^ 2 水溶液の混液 2 0 〃 ^ を加え、 3 7でに 1 0分間保持した。 これを被検液とした。
    [0042] そして、 上記被検液を実施例 1 の場合と同様の手段によりェ ン ドトキシンを測定した。
    [0043] 実施例 2において ト リ トン X— 1 0 0の濃度を種々変化させ た場合の測定結果を、 実施例 1 の場合と同様にエン ドトキシン を添加しない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水 を用い、 前処理液の代りに注射用蒸留水を使用した対照例とと もに第 2表に示す。
    [0044] なお、 測定結果は実施例 1 と同様にエン ド トキシンを加えな い比較例については波長 5 5 0 - 6 3 0 nmで測定した吸光度を 示し、 エン ドトキシンを添加した実施例については対照例の測 定値を 1 0 0 とした場合の検出率 （％) を示した。
    [0045] 第 2 表 J
    [0046] 傲 卜* l卜干 -t.ノノ
    [0047] (¾) (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (.%)
    [0048] 0.00 0.025 19
    [0049] 0.04 0.026 85
    [0050] PR P 0.06 0.028 100
    [0051] (+ェン ドトキシン） 0.08 0.029 100
    [0052] + ト リ 卜ン X— 1 0 0 0.10 0.028 100
    [0053] + E I P 0.12 0.029 100
    [0054] O
    [0055] + KOH 0.16 0.026 64
    [0056] + C a C 0.24 0.026 41
    [0057] 0.32 0.026 25
    [0058] 0.40 0.025 8 対 照 例 0.00 0.025 100
    [0059] '第 2表によれば、 ト リ トン X— 1 0 0力 0、 即ち ト リ トン X - 1 0 0を加えない場合はェン ドトキシン検出率が非常に低い c これに対して例えば 0. 0 6〜0. 1 2 %程度の濃度を有する ト リ ト ン X— 1 0 0を含む混液を用いて P R P試料を処理したもの はエン ドトキシン添加検出率も 1 0 0 %であった。
    [0060] 従って、 予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤 （ ト リ ト ン X— 1 0 0 ) と 0. 0 8モル K O H - 0. 0 5 6 % E I P 一 0. 0 0 8モル/ C a C ^ 2 水溶液の混液 （ P R P処理時 の濃度） を用いるこ とによって、 リムルステス ト偽陽性因子な らびに測定阻害因子が完全に変性された条件下で、 P R P試料 中のエン ドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼性を以て検出 測定することが可能であることが判る。
    [0061] 実施例 3
    [0062] 実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 / ^ に 1 O pgのエン ドトキシン調製品 E. coli UKT- B を含有する水 溶液 1 0 / を添加した後、 その 5 ^をトキシぺッ トプレー ト 9 6 Fにとり、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 — 0. 1 モル/ ^ K O H- 0. 0 7 M E I P - 0. 0 1 モル Z C a C 2 混液 20 〃 を加え、 3 7 °Cにおいて所定の時間だけ保持し、 被検液と した。
    [0063] そして、 上記被検液を実施例 1 の場合と同様の手段によりェ ン ドトキシンを測定した。 - 実施例 3の各加温時間についての測定結果を実施例 1 の場合 と同様にェン ド トキシンを添加しない比較例ならびに P R P試 料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸 留水を使用した対照例とともに第 3表に示す。 第 3 表 被 検 液 加温時間 吸 光 度 エン ドトキシン
    [0064] (分） (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
    [0065] PRP 0 0.025 12
    [0066] (十ェン ドトキシン） 5 0.026 94
    [0067] + ト リ トン X— 1 0 0 10 0.028 100
    [0068] + E I P 15 0.029 100
    [0069] + KOH 20 0.028 100
    [0070] + C a C 2 30 0.029 71 対 照 例 0.025 100
    [0071] 第 3表によると、 加温時間 0即ち、 該前処理用混液で処理し た後、 直ちに被検液とした場合にはエン ドトキシンの検出率は 非常に低い。 これに対して例えば 5分以上の加温時間を経たも のを使用すればリムルステス ト偽陽性因子ならびに阻害因子も 完全に変性した条件下で P R P中のェン ドトキシンの真の値を 正確且つ高い信頼度を以て再現性よく検出することが可能であ ることが明らかである。
    [0072] 実施例 4
    [0073] 実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 PL £ に 4 0 pgのエン ド トキシン調製品 E. coli 0111: B4を含有する 水溶液 1 0 ^を添加した後、 その 5 をトキシペッ トプレ ー ト 9 6 Fにとり、 0. 1 %ト リ ト ン X— 1 0 0— 0. 1モル KOH- 0.0 7 %E I P - 0.0 1モル/^ C a C 2 水溶液 の混液 2 0 ^を加え、 所定の温度において 1 0分間保持し、 被検液とした。
    [0074] そして、 上記被検液を実施例 1 の場合と同様の手段によりェ ン ドトキシンを測定した。
    [0075] 実施例 4の各加温温度についての測定結果を実施例 1 の場合 と同様にェン ドトキシンを無添加とした比較例ならびに PR P 試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用 蒸留水を使用した対照例とともに第 4表に示す。 第 4 表 被 検 液 処理温度 吸 光 度 ェンドトキ、 、 ,
    [0076] (で） (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
    [0077] PRP 4 0.026 22
    [0078] (+ェン ドトキシン） 20 0, 029 85
    [0079] + 卜リ 卜ン X— 1 0 0 25 0.029 91
    [0080] C
    [0081] + E I P 37 0.030 100
    [0082] + KOH 45 0.031 100
    [0083] + C a C 2 56 0.031 100
    [0084] 70 0.027 82 対 照 例 0.025 100
    [0085] 第 4表によれば、 処理温度が 4 °Cの場合にはェン ドトキシン の検出率が低かったが、 3 7 °C以上になるとリムルステス ト偽 陽性因子ならびに反応阻害因子も完全に変性した条件下で P R P中のェン'ドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼度を以て再 現性よく検出することが可能であることが明らかである。
    [0086] 実施例 5
    [0087] 健常人より血液 1 当たりへパリ ンを 5ュニッ ト添加して採 血した血液 を 1 , 0 0 0 x g、 1 0分間遠心分離して、 貧 血小板血漿 （ P P P ) を得た。
    [0088] この P P P試料 1 9 0 ^に 4 0 pgの E. co l i 01 1 1 : B4ェン ドトキシンを含有する水溶液 10〃 を添加した後、 その 5 ^ を トキシペッ トプレー ト 9 6 Fにとり、 0〜1. 0 % (重量/容 量） の範囲内で選択された所定量のポリオキシエチレンソルビ タンモノラウレー トからなるツイ ーン 2 0 (商品名、 和光純薬 工業株式会社販売） を含有する 0· 1 モル K 0 H - 0. 1 %
    [0089] (重量ノ容量） ヒスタ ミ ン二塩酸塩— 0. 0 1 モル Z _β CaC 2 水溶液の混液 2 0 ^を加え、 3 7 に 1 0分間保持し、 被検 液とした。
    [0090] そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
    [0091] 実施例 5 におけるツイ一ン 2 0 の各濃度についての測定結果 を実施例 1 の場合と同様にェン ドトキシンを添加しない比較例 ならびに P P P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の 代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 5表に示す, 第 5 表 被 検 液 ツイ一ン 2 0 吸 光 度 エン ドトキシン
    [0092] 濃度 （%) (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
    [0093] P P P 0.00 0.025 19
    [0094] (+ェン ドトキシン） 0.08 0.026 57
    [0095] +ツイーン 2 0 0.16 0.028 84
    [0096] +ヒスタミンニ塩酸塩 0.24 0.029 95
    [0097] CJ1
    [0098] + KOH 0.32 0.028 100
    [0099] + C a C 0.40 0.029 100
    [0100] 0.60 0.026 55
    [0101] 0.80 0.026 0 対 照 例 0.00 0.025 100
    [0102] 第 5表によれば、 予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤 (ツイ 一ン 2 0 ) を用いるこ とによって、 リ ムルステス ト偽陽 性因子ならびに反応阻害因子が完全に変性した条件下で、 PPP 試料中のェン ドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼性を以て 検出測定することが可能であることが判る。 一方、 ツイーン 20 を全く添加しない 0. 0 8モル/^ K〇 H— 0. 0 8 %ヒスタ ミ ンニ塩酸塩— 0. 0 0 8モル C a C £ 2 混液による処理を 行なつただけのものは明らかにェン ドトキシンの検出率が低い ことが判る。
    [0103] 実施例 6
    [0104] 実施例 5 と同様の手段により調製した P P P試料 1 9 0 ^ に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. coli 0111: B4を含有する 水溶液 1 0 / ^を添加した後、 その 5 をトキシペッ トプレ ー ト 9 6 Fにとり、 0〜1. 0 % (重量 Z容量） の範囲内で選択 された所定量の ドデシル硫酸ナ ト リ ウム （ S D S ) を含有する 0. 1 モル K O H - 0. 0 5 % (重量/容量） ε —ポリ 一 L — リ ジン塩酸塩 （分子量 2， 0 0 0〜4 , 0 0 0、 和光純薬ェ 業㈱販売） - 0. 0 1 モルハ C a C £ 2 水溶液の混液 2 0 〃 を加え、 3 7でに 1 0分間保持し、 被検液とした。
    [0105] そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
    [0106] 実施例 6における S D Sの各濃度に、ついての測定結果を実施 例 1 の場合と同様にェン ドトキシンを添加しない比較例ならび に P P P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わり に注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 6表に示す。 第 6 表 被 検 液 SDS濃度 吸 光 度 エン ドトキシン
    [0107] (%) (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (%)
    [0108] 0.00 0.025 20
    [0109] PP P 0.08 0.025 45
    [0110] (+エン ドトキシン） 0.16 0.027 87
    [0111] + SDS 0.24 0.030 100
    [0112] +ポリ— L—リジン塩酸塩 0.32 0.030 100
    [0113] + KOH 0.40 0.030 90
    [0114] + C a C 0.60 0.027 22
    [0115] 0.80 0.026 0 対 照 例 0.00 0.025 100
    [0116] 第 6表によれば、 予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤 ( S D S ) を用いることによって、 リムルステス ト偽陽性因子 ならびに反応阻害因子が完全に変性した条件下で、 P P P試料 中のエン ドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼性を以て検出 測定することが可能であることが判る。
    [0117] 実施例 7
    [0118] 健常人より抗凝固剤を入れないで採血した血液 3 τηβを 4でに 1 時間静置した後、 1， 0 0 0 x g、 1 0分間遠心分離して血 清を得た。
    [0119] この血清試料 1 9 0 / に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. coli 0111： B4 を含有する水溶液 1 0 // ^を添加した後、 その 5 〃 ^を トキシペッ トプレー ト 9 6 Fにとり、 0〜1. 0 % (重 量 Z容量） の範囲内で選択された所定量の n—ォクチル— 3— D—グルコビラノ シドを含有する 0. 1 モル/^ K O H-0.07 % E I P— 0. 0 1 モル Z ^ C a C 2 水溶液の混液 20 を 加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持し、 被検液とした。
    [0120] そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ド トキシン を測定した。
    [0121] 実施例 7における n—ォクチルグルコシドの各濃度について の測定結果を実施例 1 の場合と同様にェン ドトキシンを添加し ない比較例ならびに血清試料の代わりに生理食塩水を用い、 前 処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 7 表に示す。
    [0122] 被 検 液 n—ォクチルグルコシド 吸 光 度 エンドトキシン
    [0123] 濃度 ) (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (%)
    [0124] 0.00 0.026 20
    [0125] 血清 0.08 0.026 65
    [0126] (+エンドトキシン） 0.16 0.029 82
    [0127] + η—ォクチルグルコシド 0.24 0.029 100
    [0128] CO
    [0129] + Ε I Ρ 0.32 0.029 100
    [0130] + ΚΟΗ 0.40 0.029 84
    [0131] + C a C 0.60 0.026 36
    [0132] 0.80 0.026 2 対 照 例 0.00 0.025 100
    [0133] 第 7表によれば、 予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤 ( n—ォクチルグルコシ ド） を用いることによって、 リ ムルス テス ト偽陽性因子ならびに反応阻害因子が完全に変性した条件 下で、 血清試料中のェン ドトキシンの真の値を正確且つ高い信 頼性を以て検出測定することが可能であることが判る。
    [0134] 実施例 8
    [0135] 種々 の実験動物 [マウス （ICR, male), ラ ッ ト （Wistar, male) 、 モルモッ ト （Hartley, male). ゥサギ （JW， male) 、 ィ ヌ （Beagle, male) ] より実施例 1 と同様に抗凝固剤 （へパ リ ン） を添加して採血して得た PR Pを試料とする。
    [0136] この P R P試料 1 9 0 / に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. coli 0111: B4を含有する水溶液 1 0 を添加した後、 そ の 5 ^を トキシぺッ トプレー ト 9 6 Fにとり、 0. 1 %ト リ ト ン X— 1 0 0— 0. 1モル Z £ KOH- 0.0 7 %E I P -0.01 モル/^ C a C ^ 2 水溶液の混液 2 0 _gを加え、 3 7でに 1 0分間保持し、 被検液とした。
    [0137] そして、 実施例 1の場合と同様の手段によりエン ド トキシン を測定した。
    [0138] 測定結果を実施例 1の場合と同様にェン ドトキシンを添加し ない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 8表に示す。 第 8 表 被 検 液 吸 光 度 検 出 率 )
    [0139] (PRP) (ェンドトキシン無添加） (ェンドトキシン添加）
    [0140] PRP マウス 0.029 100
    [0141] (+ェン ドトキシン） ラッ 卜 0.028 99
    [0142] + トリ トン X— 1 0 0 モルモッ ト 0.029 100
    [0143] + Ε I Ρ ゥサギ 0.031 99
    [0144] + ΚΟΗ ィヌ 0.031 99
    [0145] + C a C 対 照 例 - 0.025 100
    [0146] 第 8表によれば、 いずれの動物もほぼ 1 0 0 %の検出率を示 した。
    [0147] このように検体量に制限のある各種小動物を含めた実験動物 においても良好な成績が得られたことは迅速性、 簡便性に加え て検体処理の特殊性においても顕著な改善点であることが理解 できる。
    [0148] 実施例 9
    [0149] ト リ ト ン X— 1 0 0、 K〇 H、 E I P及び C a C ^ 2 をそれ ぞれ 0. 1 %、 0. 1 モル £、 0. 0 7 %、 0. 0 1 モル の水溶 液となるように混合した。 また、 0〜 0 6モル ^の範囲内 で選択された所定量の N， N—ビス （ 2 —ヒ ドロキシェチル） グリ シン （ビシン ； ド—タイ ト試薬の 1種の商品名 ； 和光純薬 工業販売） をも含有する混合水溶液を調製した。 以上の混合水 溶液を氷冷下に所定時間保持した。 第 9表にビジンの濃度を種 々変化させた場合の本実施例による観察結果をビシンが無添加 である比較例の観察結果とともに示す。
    [0150] 第 9 表 被 検 液 ビシン濃度 2時間後の濁りの有無
    [0151] (モル z^)
    [0152] + 卜リ 卜ン X— 1 0 0 0.000 + +
    [0153] + E I P 0.005 + CO
    [0154] + KOH 0.010 + GO
    [0155] + C a C 0.020
    [0156] +ビシン 0.048 変化なし + ：やや白濁 + + ：白濁
    [0157] 第 9表によれば、 ト リ ト ン X— 1 0 0、 K〇 H、 E I Pおよ び C a C _g 2 を所定量混合した水溶液を氷冷下で 2時間放置し ておく と、 ビシンの添加なしでは白濁して均一な採取が不可能 となる。 これに対してビシンを添加しておく とその濁りの生成 が抑えられるようになり、 特に 0. 0 2 モル/ 以上では 2時間 後でも透明なままであり、 均一な採取が可能であることが判る c 実施例 1 0
    [0158] 実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 £ に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. co l i 0111： B4を含有する 水溶液 1 0 ^ を添加した後、 その 5 〃 _gをトキシペッ トプレ — ト 9 6 Fにと り、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0— 0. 1 モル/ K〇 H — 0. 0 3 モル Z ビシン一 0. 0 7 % E I P — 0. 0 1 モル / £ C a C 2 水溶液の混液 （あらかじめ混合し、 氷冷下に 2時間放置しておいたもの） 2 0 を加え、 3 7。Cに 1 0分 間保持し、 被検液とした。
    [0159] そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
    [0160] 測定結果を実施例 1 の場合と同様にェン ドトキシ ンを添加し ない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 1 0表に示す。 第 1 0 表 被 検 液 放置時間 吸 光 度 ェンドトキシン
    [0161] (時） (ェンドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
    [0162] PRP 0 0.029 100
    [0163] (+エン ドトキシン） 2 0.029 100
    [0164] + ト リ トン X— 1 0 0
    [0165] CJ1
    [0166] + Ε I Ρ
    [0167] + ΚΟΗ
    [0168] + C a C
    [0169] +ビシン ' 対 照 例 0.025 100
    [0170] 第 1 0表によれば、 ト リ トン X— 1 0 0、 K 0 H、 E I P、 C a C 2 およびビシ ンを所定量混合した水溶液を直ちに使用 した場合でも、 氷冷下に 2時間放置後使用した場合でも、 ほぼ 1 0 0 %のエン ドトキシ ンの検出率を示した。 したがって、 ビ シンの適当量の添加は処理液の濁りを抑え、 安定性を高めるこ とが判る。
    [0171] 実施例 1 1
    [0172] 実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 u £ に 4 0 pgのェン ドトキシ ン調製品 E. co l i 01 1 1： B4を含有する 水溶液 1 0 を添加した後、 その 5 ^を トキシぺッ トプレ — ト 9 6 Fにと り、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 — 0. 1 モル/ 水酸化ナ ト リ ウム （ N a 〇 H ) — 0. 0 3 モル Z ビシン 一 0. 0 7 % E I P - 0. 0 1 モル Z C a C 2 水溶液の混液お よびあらかじめ混合し、 氷冷下に 2時間放置しておいた混液の 各 2 0 ^を加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持し、 被検液とした。
    [0173] そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によ りェン ドトキシン を測定した。
    [0174] 測定結果を実施例 1 の場合と同様にェン ド トキシンを添加し ない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 1 1表に示す。 1 1 表 被 検 液 放置時間 吸 光 度 ェンド卜キ 'ソ、ノ
    [0175] (時） (ェン ドトキシン無添加） 添加検出率 (％)
    [0176] PRP 0 0.028 92
    [0177] (+エン ドトキシン） 0.028 91
    [0178] +トリ 卜ン X— 1 0 0
    [0179] + E I P
    [0180] + N a OH
    [0181] + C a C 2
    [0182] +ビシン ' 対 照 例 0.025 100
    [0183] 実施例 1 2
    [0184] 実施例 1 と同様の手段により調製した P R P試料 1 9 0 _ί に 4 0 pgのェン ドトキシン調製品 E. coli 0111： B4を含有する 水溶液 1 0 〃 ^を添加した後、 その 5 〃 ^をトキシペッ トプレ — ト 9 6 Fにとり、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 — 0. 1 モルノ K 0 H - 0. 0 3モル ビシン 一 0. 0 7 % E I P - 0. 0 2モル / H 塩化マグネシウム （M g C ^ 2 ) 水溶液の混液およびあ らかじめ混合し、 氷冷下に 2時間放置しておいた混液の各 2 0 ^を加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持し、 被検液とした。
    [0185] そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
    [0186] 測定結果を実施例 1 の場合と同様にエン ドトキシンを添加し ない比較例ならびに P R P試料の代わりに生理食塩水を用い、 前処理液の代わりに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第 1 2表に示す。
    [0187] 1 2 表 被 検 液 放置時間 吸 光 度 ェンド卜キシン
    [0188] (時） (ェン ドトキシン無添加） 添加検出率（％)
    [0189] PRP 0 0.027 90
    [0190] (+ェン ドトキシン） 2 0.027 91
    [0191] + 卜リ トン X— 1 0 0
    [0192] CO
    [0193] + E I P
    [0194] + KOH
    [0195] +MgC i 2
    [0196] +ビシン ' 対 照 例 0.025 100
    [0197] 実施例 1 3
    [0198] 血漿検体の測定
    [0199] 対象は、 健常人 3 0例およびグラム陰性菌による敗血症を疑 つた白血病等の重症血液疾患および感染を合併した肝、 胆道疾 患を有する患者の 1 0例で、 それぞれへパリ ン添加で無菌的に 採血した血液を試料として、 4でで 1 5 0 £、 1 0分間遠心 して P R Pを得た。 その 5 / / ^をトキシペッ トプレー ト 9 6 F にと り、 0. 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 — 0. 1 モル Z K 0 H - 0.03モルノ ^ ビシン 一 0.07% E I P— 0.01モル C a C £ 2 水溶液混液 2 0 2 を加え、 3 7 °Cに 1 0分間保持し、 被検液 とした。
    [0200] そして、 実施例 1 の場合と同様の手段によりエン ドトキシン を測定した。
    [0201] 第 1 3表に本実施例の結果を、 別に作成した検量線より E. col i 0111: B4 ェン ドトキシン換算量として表わした。
    [0202] 第 1 3表
    [0203]
    [0204] 第 1 3表の患者 1 〜 1 0 は、 血培、 白血球数その他の検査成 績および発熱等の臨床症状からグラム陰性菌敗血症の疑いあり と診断された症例であり、 本発明方法においては、 全例高濃度 のェン ド トキシンが検出された （健常人 3 0例 ： 2. 2 ± 1. 6 p g / ηβ ) 。 従って、 本発明方法は通常の検査法では確定診断がき わめて困難なグラム陰性菌敗血症の迅速診断法としてきわめて 有力な手法として評価されるものであるこ とが理解できょう。 産 業 上 の 利 用 可 能 性
    [0205] 本発明の混合水溶液で血漿又は血清を処理するこ とによ り、 蛋白、 脂質、 糖蛋白、 糖脂質、 血小板等に吸着したエン ド トキ シンが効率よく遊離され、 血漿および血清中のェン ド トキシン をきわめて高い検出率で効率よく測定するこ とができる。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1 . カブトガニ · ァメボサイ ト · ライセ一 ト成分を使用する血 漿又は血清中のェン ドトキシンの測定法において、
    a ) ポリオキシエチレンエーテル類、 ポリオキシエチレンソ ルビタン類、 n—アルキルグルコビラノ シ ド類及びドデシル硫 酸塩からなる群から選択された界面活性剤、
    b ) イ ミ ダゾリル基又はァ ミ ノ基を有する化合物、 及び c ) アルカ リ土類金属塩とアルカ リ金属水酸化物
    の混合水溶液を血漿又は血清に添加して被検液とするこ とを特 徵とするエン ドトキシンの測定法。
    2 . アルカ リ土類金属塩が、 アルカ リ土類金属と無機酸又は有 機酸との水溶性塩である請求項 1記載の測定法。
    3 . アルカ リ土類金属が、 カルシウム、 マグネシウム及びス ト ロンチウムからなる群から選択された金属である請求項 2記載 の測定法。
    4 . 無機酸又は有機酸が、 塩酸、 硝酸、 硫酸、 酢酸及びクェン 酸からなる群から選択された酸である請求項 2記載の測定法。
    5 . 混合水溶液が N， N—ビス （ 2—ヒ ドロキシェチル） グリ シンを含有する請求項 1記載の灘定法。
    6 . 前記ポリオキシエチレンエーテル類は、 ポリオキシェチレ ン一 p —夕一シャ リ一ォクチル （又はイソォクチル） フヱニル エーテル （重合度 8〜4 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン一 4 —夕一 シャ リ ーォクチル （又はイソォクチル） シクロへキシルエーテ ル （重合度 8〜4 0 ) 、 ポリオキシエチレ ン一 p —ノニルフ エ ニルエーテル （重合度 9〜 1 5 ) 、 ポリオキシエチレンヘプ夕 メチルへキシルエーテル （重合度 1 0〜 2 0 ) 、 およびポリ オ キシエチレ ン ドデシルエーテル （重合度 1 0〜 2 9 ) からなる 群から選択され、 前記 n —アルキルグルコ ビラノ シ ド類は、 n 一 （ヘプチル、 ォクチル、 ノニル、 デシル及び ドデシ几） a - D—グルコ ビラノ シ ド及び n — (ヘプチル、 ォクチル、 ノニル、 デシル及び ドデシル） /3 _ D—グルコ ピラノ シ ドからなる群か ら選択され、 前記ポリオキシエチレンソルビタ ン類は、 ポリ オ キシエチレンソルビ夕 ン （重合度約 2 0 ) のモノ ラウ レー ト、 モノパルミ テー ト、 モノ ステアレー ト、 モノォレエー ト及び ト リオレエー トからなる群から選択され、 前記 ドデシル硫酸塩は、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 ドデシル硫酸リ チウム、 及び ドデシ ル硫酸力ルシゥ厶からなる群から選択され、 前記イ ミ ダゾリ ル 基又はアミ ノ基を有する化合物は、 ヒスタ ミ ン二塩酸塩、 L— ヒスチジン二塩酸塩、 ポ リ 一 L 一 ヒスチジン塩酸塩 （分子量 1 5 , 0 0 0〜 5 0， 0 0 0 ) 、 ポリ — L— リ ジン塩酸塩 （分 子量 2， 0 0 0〜 7 0 , 0 0 0 ) 、 ポリ 一 L—ァルギニン塩酸 塩 （分子量 5， 0 0 0〜 1 5 0 , 0 0 0 ) 、 ポリエチレ ン イ ミ ン （分子量 1， 0 0 0〜 7 0， 0 0 0 ) 、 アデニン塩酸塩、 及 びシ ト シン塩酸塩からなる群から選択されるこ とを特徴とする 請求項 1 記載の測定法。
    7. 前記混合水溶液は、 前記界面活性.剤が、 0. 0 4〜 0. 4 0 % (重量 Z容量） 、 前記ィ ミ ダゾリ ル基又はァ ミ ノ基を有す る化合物が、 0. 0 3〜 0. 3 % (重量 Z容量） 、 アルカ リ土 類金属塩が 0. 0 0 5〜 0. 0 5 モル リ ッ トル及びアルカ リ 金属水酸化物が 0. 0 5〜 0. 5 モル Zリ ッ トルであるこ とを 特徴とする請求項 1記載の測定法。
    8 . 前記 N , N - ビス （ 2 — ヒ ドロキシェチル） グリ シンは、 前記混合水溶液に 0 . 0 0 5〜 0 . 0 5 モル Zリ ッ トル添加さ れるこ とを特徴とする請求項 5記載の測定法。
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    JP2/257415||1990-09-28||
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    US07/859,398| US5378610A|1990-09-28|1991-09-27|Method for assaying endotoxin in serum or plasma using limulus amoebocyte lysate|
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