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    公开号:WO1992006107A1
    申请号:PCT/JP1991/001379
    申请日:1991-10-09
    公开日:1992-04-16
    发明作者:Susumu Funakoshi；Hiroyuki Fukuda
    申请人:Nihon Millipore Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 合 成 べ プ チ ド 精 製 方 法 お よ び こ れ に 用 い る リ ン 力 一、 リ ン カ ー 結 合 用 固 相 担 体
    [0003] 発 明 の 背 景
    [0004] ( 産 業 上 の 利 用 分 野 ）
    [0005] 本 発 明 は 合 成 ぺ ブ チ ド 精 製 方 法 お よ び こ れ に 用 い る リ ン カ ー、 リ ン カ 一 結 合 用 固 相 担 体 に 関 す る も の で あ る。 詳 し く 述 べ る と、 本 発 明 は、 固 相 法 に よ り 合 成 さ れ た 合 成 ぺ プ チ ド を 高 精度、 髙 収 率 に て 1 段 階 分 離 を 行 う こ と の で き る 合 成 ペ プ チ ド 精 製 方 法 お よ び こ れ に 用 い る リ ン カ ー、 リ ン 力 一 結 合 用 固 相 担 体 に 関 す る も の で あ る。
    [0006] ( 従 来 の 技 術 ）
    [0007] ペ プ チ ド な い し 蛋 白 質 は、 生 体 に 普 遍 的 に 存 在 す る 生 物 学 的 分 子 で あ り、 そ の 生 理 作 用 の 解 明、 作 用 機 序 の 解 明 等 は、 生 化 学、 生 理 学、 医 学 な ど の 分 野 に お い て 大 き な 関 心 事 と な っ て い る。
    [0008] 近 年、 例 え ば、 ペ プ チ ド シ ン セ サ イ ザ ー な ど を 用 い て、 所 定 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る ペ プ チ ド な い し 蛋 白 質 を 合 成 す る こ と が盛 ん に 行 わ れ る よ う に な っ て き て い る。 こ の よ う に し て 合 成 さ れ た 所 定 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る ペ プ チ ド な い し 蛋 白 質 を 髙 純 度 で 供 給 す る こ と が で き れ ば、 前 記 し た よ う な 各 分 野 に お け る 研 究 に 飛 躍 的 な 進 歩 を も た ら す こ. と 力； で き る と 考 え ら れ る。 し か し な 力； ら、 上 記 し た よ う な ペ プ チ ド 合 成 に お い て は、 目 的 の ペ プ チ ド と 共 に 多 く の 不 純 物 が 生 起 す る。 こ の た め、 こ の よ う な 多 く の 不純 物 の 中 か ら 目 的 の ペ プ チ ド の み を い か に 迅 速 か つ 高 い 収 率 で 取 り 出 す か と い う こ と が、 固 相 ペ プ チ ド 合 成 に お い て 残 さ れ た 最 大 の 課題 で あ る。
    [0009] 現 在、 固 相 法 [R. B. Merrif ield, J. Am. Chem. Soc, , 8 5, 2149 ( 1963 ) 3 に よ り 合 成 さ れ た 合 成 ペ プ チ ド な い し 蛋 白 質 の 精 製 は、 ゲ ル 濾 過 法、 高速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 法、 あ る い は そ れ ら の 組 み 合 わ せ に よ る 方 法 に よ り 行 わ れ て い る。 ま た、 あ る 特 殊 な ベ プ チ 卜 な い し 蛋 白 質 に 限 っ て は、 親 和 性 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 法 が 有 力 な 手 段 と な り 得 る が、 こ の 方 法 で さ え 完 全 と は 言 え な い の が 現 状 で あ る。 そ の 理 由 は、 固 相 法 に よ る ペ プ チ ド の 合 成 で は、 多 数 の ア ミ ノ 酸 欠 落 べ プ チ ド が 多 種 類 同 時 に 合 成 さ れ、 そ の 中 に は 親 和 性 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 法 に お け る 担 体 と 弱 い な が ら も 親 和 性 を 示 す も の が 混 在 す る た め で あ る。
    [0010] ぺ プ チ ド の 固 相 合 成 で は 段 階 的 伸 長 法 を 採 ffl し て お り、 例 え ば 縮 合 反 応 収 率 が 9 9 % あ れ ば、 5 0 残 基 の ぺ プ チ ド で 理 論 上 6 0 % の 合 成 収 率 が 得 ら れ る。 し か し な 力 ί ら、 縮 合 反 応 は べ プ チ ド の シ ー ケ ン ス 依 存 性 で あ る ゆ え 常 に 9 9 % 以 上 の 収 率 が 得 ら れ る と は 限 ら な い。 そ の た め ぺ プ チ ド 鎖 を 構 築 し て 行 く と 不 完 全 縮 合 に よ る 不 純物 は 部 分 的 に ァ ミ ノ 酸 が 欠 落 し た ペ プ チ ド と し て 蓄 積 し て ゆ く。
    [0011] こ の ア ミ ノ 酸 欠 落 べ プ チ ド を 除 く た め 各 縮 合 反 応 の 後 に、 無 水 酢 酸 に よ る キ ヤ ッ ビ ン グ を 施 し、 不 純 物 の そ れ 以上 の ペ プ チ ド 鎖 の 延 長 を 止 め る こ と が 行 わ れ て い る。 こ の 操 作 を 行 う こ と に よ り、 最 終 ア ミ ノ 酸 導 入 後、 目 的 の 配 列 を 宵 す る ペ プ チ ド の み が N 末 端 の ア ミ ノ 基 を 有 す る こ と と な る。
    [0012] ま た、 こ の ア ミ ノ 基 を 利 用 し た 分 離 法 も 幾 つ か 報 告 さ れ て レ、 る [ 例 え ば、 R . Cambl e, R. Garner, and G . T. Young,
    [0013] Nature (London), 217, 247 ( 1968 ) ； K. Suzuki , Y. S a s a k i , and N. Endo, C h e m . P h a r m . Bul l. , 24, 1 ( 1976 ) ； I). S . em and D, G . Roberts, Tetrahedoron Lett. , 4269 ( 1975 ) ； T. Wei land, C. Birr, and H . Wissenbach , A n g e .
    [0014] Chem. , Int. Ed. , Engl . , 8 , 764 ( 1969 ) ； H. Wi ssman a n d R . Geiger, Angew. Chem. , Int. Ed. , Engl. , 9 , 908 (1970) ； R. B. Merrif ield and A. E. Bach, J. Org. Che m. 43 , 4808 ( 1975 ) ； T. J . Lob 1 , R. M. Deibel, and A.
    [0015] . Yen, Anal . Bi ochem. , 170, 502 ( 1988 ) ； H . Bal l, Grecian, S. B . H . Kent, and P. Mascagni, in " Pepti d es ' , J . E. Rivier and G. I! . ars al l , Eds. , ESCOM, L eiden, 1990, pp435な ど ] 。 し 力、 し な が ら、 こ れ ら の い ず れ の 方 法 も、 煩 雑 な 操 作 を 要 し 1 段 階 分 離 法 と は 程 遠 い も の で あ る。
    [0016] ま た、 シ ス テ ィ ン 一 メ チ ォ ニ ン を N 末 端 に 導 入 し、 シ ス テ ィ ン の S H 基 を 利 用 し、 フ ヱ ニ ル 水 銀 カ ラ ム に 目 的 ぺ ブ チ ド の み を 吸 着 さ せ 分 離 し、 後 に B r C N で メ チ ォ ニ ン 一 ぺ プ チ ド 間 の 結 合 を 切 断 し 目 的 べ プ チ ド を 得 る 方 法 も 知 ら れ て い る が [D. E. Kri eger, B. W. Erikson, and H. li . M - errif ield, Proc. Natl. Acad. S c i . U. S. A. , 73， 3160 ( 1976 ) ]、 こ の 方 法 は メ チ ォ ニ ン を 含 有 す る べ プ チ ド に は 利 用 で き な い と 言 う 制 約 が あ る も の で あ つ た。
    [0017] 発 明 の 概 要
    [0018] 従 っ て、 本 発 明 は、 固 相 法 に よ り 合 成 さ れ た 合 成 べ プ チ ド を 髙 精 度、 高 収 率 に て 1 段 階分 離 を 行 う こ と の で き る 合 成 ぺ プ チ ド 精 製 方 法 並 び に こ れ に 用 い る リ ン カ ー お よ び リ ン カ 一 結 合 用 固 相 担 体 を 提 供 す る こ と を 目 的 と す る も の で あ る。
    [0019] 上 記 諸 目 的 は、 固 相 法 に よ る べ プ チ ド 合 成 に お い て 得 ら れ る 末 端 基 に ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 ペ プ チ ド お よ び ェ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ さ れ た 目 的 以 外 の 未 成 熟 べ プ チ ド が 混 在 す る 系 か ら、 末 端 に 官 能基 を 有 す る リ ン カ ー を 用 い て 前 記 成 熟 べ プ チ ド を 化 学 選 択的 に 固 相 担 体 に 固 定 化 · 分 離 す る 合 成 べ プ チ ド の 精 製 法 に よ っ て 達 成 さ れ る。
    [0020] ま た、 上 記 諸 目 的 は、
    [0021] a ) 固 相 法 に よ る ペ プ チ ド 合成 に お け る 最 後 の ア ミ ノ 酸 を 導 入 し た 後、 末 端 に ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 べ プ チ ド、 お よ び 例 え ば、 無 水 酢酸、 無 水 プ ロ ビ オ ン 酸 な ど の ァ シ ル 化 剤 に よ っ て ェ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ さ れ た 目 的 以 外 の 未 成熟 ペ プ チ ド の 双 方 が 結 合 し て い る 固 相 に 対 し、 一 端 部 に、 前 記 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 と、 ペ プ チ ド 合 成 プ p セ ス の 後 処理 工 程 に お い て 酸 性 条 件 下 で 行 わ れ る 脱 保 護 蓰 反 応 に 安 定 で か つ あ る 他 の 条 件 で 特異 的 に 切 断 可 能 な 結 合 を な す 官 能 基 を 有 し、 ま た 他 端 部 に 前 記 脱 保 護 反 応 に よ り 活 性 な 官 能 基 を 生 成 し 得 る リ ン カ ー を 添 加 し て ίί 記 成 熟 べ プ チ ド を 選 択 的 に 修 飾 し、
    [0022] b ) 次 い で ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お け る 最 終 的 な 前 記 脱 保 護 基 反 応 を 行 い、 こ れ に よ り 成 熟 べ プ チ ド お よ び 未 成 熟 べ プ チ ド を 固 相 よ り 解 離 し、
    [0023] c ) 前 記最 終 的 な 脱 保 護 基 反 応 に よ っ て 生 成 し た リ ン カ — の 前 記 他端 部 の 官 能 基 と 反 応 し て 安 定 な 結 合 を 形 成 す る 官 能 基 を 有 す る 化 合 物 を 固 定 化 保 持 す る 別 の 固 相 を、 前 記 b ) 段 階 に お い て 得 ら れ た ぺ ブ チ ド 混 合 物 と 接 触 さ せ て、 該 固 相 に 成熟 べ プ チ ド を リ ン カ ー を 介 し て 選 択 的 に 固 定 し、 d ) さ ら に、 前 記 c ) 段 階 に お い て 得 ら れ た 成熟 ぺ プ チ ド を 固 定 し た 固 相 を、 リ ン カ 一 と 成 熟 ペ プ チ ド と の 結 合 を 特 異 的 に 切 断 す る 前 記 他 の 条 件 に 曝 し、 成 熟 ペ プ チ ド を リ ン カ 一 結 合 固 相 よ り 切 断 す る
    [0024] 操 作 を 含 ん で い る こ と を 特 徴 と す る 合 成 ペ プ チ ド 精 製 方 法 に よ っ て 達 成 さ れ る。
    [0025] ま た、 本 発 明 の 合 成 ペ プ チ ド 精 製 方 法 は、
    [0026] e ) 固 相 法 に よ る ぺ ブ チ ド 合 成 に お け る 最 後 の ア ミ ノ 酸 を 導 入 し た 後、 末 端 に ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 べ プ チ ド お よ び ェ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ さ れ た 目 的 以 外 の 未 成 熟 ペ プ チ ド の 双 方 が 結 合 し て い る 固 相 に 対 し、
    [0027] 一 端 部 に、 前 記 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 と、 ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お い て 酸 性 条 件 下 で 行 わ れ る 脱 保 護 基反 応 に 安 定 で か つ あ る ア ル カ リ 性 条 件 下 で 特 異 的 に 切 断 可能 な 結 合 を な す 官 能基 を 有 し、 ま た 他 端 部 に 前記 脱 保 護 反応 に よ り S H 基 を 生成 し 得 る リ ン カ ー を 添 加 し て 前 記 成 熟 ぺ ブ チ ド を 選 択 的 に 修 飾 し、
    [0028] f ) 次 い で べ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お け る 最 終 的 な 前 記 脱 保 護 基 反 応 を 行 い、 こ れ に よ り 成 熟 ペ プ チ ド お よ び 未 成 熟 べ プ チ ド 耷 固 相 よ り 解 離 し、
    [0029] S ) 前 記最 終 的 な 脱 保護 基 反 応 に よ っ て 生 成 し た リ ン カ 一 の 前 記 他端 部 の S H 基 と 反 応 し て 安 定 な 結 合 を 形 成 す る 化 合 物 を 固 定化 し て な る 固 相 に、 前 記 f ) 段 階 に お い て 得 ら れ た ぺ ブ チ ド 混 合 物 を 接 触 さ せ て、 該 固 相 に 成熟 べ プ チ ド を リ ン カ ー を 介 し て 選 択 的 に 固 定 し、
    [0030] h ) さ ら に、 前 記 g ) 段 階 に お い て 得 ら れ た 成熟 べ プ チ ド を 固 定 し た 固 相 を、 リ ン カ 一 と 成 熟 ペ プ チ ド と の 結 合 を 特 異 的 に 切 断 す る ア ル カ リ 性 の 条 件 下 に 曝 し、 成熟 べ プ チ ド を リ ン カ ー 結 合 固 相 よ り 切 断 す る
    [0031] こ と に よ り 目 的 と す る 成 熟 べ プ チ ド を 単 離 す る こ と が で き る。
    [0032] 本 発 明 の 合 成 ペ プ チ ド の 精製 方 法 は、 さ ら に ま た、 i ) 固 相 法 に よ る ペ プ チ ド 合 成 に お け る 最 後 の ア ミ ノ 酸 を 導 入 し た 後、 末端 に ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 べ プ チ ド お よ び ェ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ さ れ た 目 的 以 外 の 未 成 熟 ぺ ブ チ ド の 双 方 が 結 合 し て い る 固 相 に 対 し、
    [0033] 一 端 部 に、 前 記 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 と、 ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お い て 酸 性 条 件 下 で 行 わ れ る 脱 保 護 基 反 応 に 安 定 で か つ あ る ア ル 力 リ 性 条 件 下 で 特 異 的 に 切 断 可 能 な ゥ レ タ ン 結 合 を な す ア ル コ キ シ カ ー ボ ネ ー ト 結 合 を 有 し、 ま た 他 端 部 に 前 記 脱 保 護 反 応 に よ り チ オ ー ル 基 を 生 成 し 得 る リ ン カ ー を 添加 し て 前 記 成 熟 ペ プ チ ド を 選 択 的 に 修 飾 し、
    [0034] j ) 次 い で ぺ ブ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お け る 最 終 的 な 前 記 脱 保 護 基 反 応 を 行 い、 こ れ に よ り 成 熟 ペ プ チ ド お よ び 未 成 熟 ペ プ チ ド を 固 相 よ り 切 断 す る と 共 に、 成 熟 ペ プ チ ド に 結 合 し た リ ン カ 一 の 前 記 他 端 部 側 の チ オ ー ル 基 の 保 護 基 を は ず し て、 該 リ ン カ ー の 前 記 他 端部 に チ オ ー ル 基 を 生 成 さ せ、 k ) 次 に、 ョ ー ド 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 お よ び ブ ロ ム 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 か ら な る 群 か ら 選 ば れ た い ず れ か の も の の 誘 導 体 が 結 合 さ れ て い る 固 相 担 体 に、 前 記 j ) 段 階 に お い て 得 ら れ た べ プ チ ド 混 合 物 を 中 性 条 件 下 で 接 触 さ せ、 脱 ョ ー ド お よ び 脱 ブ ロ ム の い ず れ か の 反 応 を 行 っ て、 安 定 な 共 有 結 合 を 形 成 し て、 該 固 相 担 体 に 成 熟 ペ プ チ ド を リ ン カ 一 を 介 し て 選 択 的 に 固 定 し、
    [0035] 1 ) さ ら に、 前 記 k ) 段 階 に お い て 得 ら れ た 成 熟 べ プ チ ド を 固 定 し た 固 相 担 体 を、 ア ル カ リ 性 の 条 件 下 に 曝 し、 成 熟 ペ プ チ ド と リ ン カ ー と の 結 合 部 に （3 脱 離 反 応 を 行 わ せ、 成 熟 ペ プ チ ド を リ ン カ ー 結 合 固 相 担 体 よ り 切 断 す る
    [0036] こ と に よ り 目 的 と す る 成 熟 ペ プ チ ド を 単 離 す る こ と が で き. る。
    [0037] ま た、 本 発 明 の 合 成 ペ プ チ ド の 精 製 方 法 に お い て は、 次 の 構 造 式 （ ID )
    [0038] 0
    [0039] II
    [0040] X-NH- (CH2 ) n — S— CH2— CH2 -O-C-Y (Π)
    [0041] II II
    [0042] 0 0
    [0043] (ただし、 式中、 nは 1〜4の整数、 Xは
    [0044] CH3— OHQ - CH2 - S - （CH2 ) « - C一 （mは 1〜2)
    [0045] CH2 -S-CII2一 ([ VOCH:
    [0046] CH,一 C一 0— C一 NH— CH— CO— ；および I II CH3 0
    [0047] CH3一 0~ 一 CH2 -O-C-NH-
    [0048] W II
    [0049] o
    [0050] のいずれかであり、 また Yは
    [0051] 一 0 、〉一 Ν02 ；
    [0052] 一
    [0053] ；および
    [0054] F のいずれかである。 ）
    [0055] F F で 表 さ れ る リ ン カ ー が 好 ま し く 用 い ら れ る < ま た こ の リ ン カ 一 は、 次 の 構 造 式 （ I ) O
    [0056] II
    [0057] X-NH- (CH2 ) n -S-CH2 ~CH2 -OH (I)
    [0058] II
    [0059] 0
    [0060] (ただし、式中 nは 1〜4の整数、 Xが Hのもの、 およびその塩酸塩、
    [0061] ならびに
    [0062] cm
    [0063] CH3 -C-0-C- ；および
    [0064] I II CH3 0
    [0065] CH, 0—く z 〉一CH2 -0-C- のいずれかである。 ）
    [0066] II
    [0067] 0 で 表 さ れ る こ と を 特 徴 と す る リ ン カ ー 合 成 中 間 体 な い し は、 次 の 構 造 式 （ π )
    [0068] 0
    [0069] II
    [0070] X-NH- (CH2 ) n -S-CII2 -CII2 -OH (II)
    [0071] II
    [0072] o
    [0073] (ただし、 式中、 n = 1〜 4の整数、 Xは
    [0074] CH3 -0-O-CEi2 -S- (CH2 ) m -C- (mは 1〜2) ；
    [0075] II O
    [0076] CH, CH2 - S - CI" -Q>-OCH, ；
    [0077] CH, -C-O-C-NH-CH-CO- CH, O
    [0078] および
    [0079] CH,一 0 - O - CI -O-C-NH-
    [0080] II
    [0081] 0
    [0082] のいずれかである o ) で 表 さ れ る こ と を 特 徴 と す る リ ン カ 一 合 成 中 間 体 よ り、 易 に 合 成 さ れ 得 る も の で あ る。 さ ら に、 本 発 明 の 合 成 ペ プ チ ド 精 製 方 法 に お い て は、 表 面 に 次 の 構造 式 を 有 す る 分 子 鎖
    [0083]
    [0084] ( た だ し、 式 中 n = 1 〜 2、 m = 2 〜 6、 R は H ま た は 炭 素 数 1 ~ 6 の ア ル キ ル 基 で あ る。 ） を 結 合 さ せ た こ と を 特 徴 と す る リ ン カ ー 結 合 用 固 相 担体 が 好 ま し く 用 い ら れ 得 る。
    [0085] 本 発 明 者 ら は、 固 相 法 に よ る ペ プ チ ド 合 成 に お い て、 多 数 の 未 成 熟ぺ ブ チ ド 混 合 物 中 か ら 目 的 と す る 成 熟 べ プ チ ド の み を 効 率良 く 分 離 す る 方 法 を 得 る た め に、 鋭意検 討 を 行 つ た 結 果、 一 端 部 に お い て、 前 記 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 と、 ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス の 後 処 理工 程 に お い て 酸 性 条 件 下 で 行 わ れ る 脱保 護 基 反 応 に 安 定 で か つ あ る 他 の 条 件 で 特 異 的 に 切 断 可 能 な 結 合 を な す 官 能 基 を 有 し、 ま た 他 端 部 に 前 記 脱 保 護 反 応 に よ り 活 性 な 官 能 基 を 生 成 し 得 る リ ン カ ー を ffl い、 こ の リ ン カ ー に よ っ て 前 記成 熟 ぺ ブ チ ド を 選 択 的 に 修 飾 し れ ば よ い と の 見解 に 到 達 し た。 す な わ ち、 こ の リ ン カ 一を ペ プ チ ド の 合 成 の 最 終 ア ミ ノ 酸 導 入 後 に 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 に 結 合 さ せ れ ば、 最 終 脱 保 護 反 応 後 に お い て、 成 熟 ぺ ブ チ ド お よ び 未 成 熟 ぺ プ チ ド の べ プ チ ド 混 合 物 の 内， 成 熟 ぺ ブ チ ド の み が 結 合 し た リ ン カ 一 に よ り 末 端 に 活 性 な 官 能 基 を 有 す る こ と と な る た め、 こ の 官 能 基 と 反 応 し て 安 定 な 結 合 を 形 成 す る 官 能 基 を 有 す る 化 合 物 を 固 定 化 し て な る 別 の 固 相 を、 前 記 ペ プ チ ド 混 合 物 と 接 触 さ せ れ ば、 該 固 相 に 成 熟 べ プ チ ド の み 選 択 的 に 固 定 で き、 こ れ に よ つ て 成 熟 ペ プ チ ド と 未 成 熟 ペ プ チ ド を 分 離 し、 そ し て、 さ ら に 成 熟 べ プ チ ド を 固 定 し た 固 相 を、 リ ン カ 一 と 成 熟 べ プ チ ド と の 結 合 を 特.異 的 に 切 断 す る 前 記 他 の 条 件 に 曝 せ ば、 成 熟 べ プ チ ド が リ ン カ一結 合 固 相 よ り 切 り 離 さ れ、 成 熟 ペ プ チ ド の み が 取 り 出 さ れ る も の で あ る。
    [0086] 本 発 明 に よ れ ば、 固 相 法 に よ っ て 得 ら れ た 所 望 の 配 列 を 有 す る 合 成 ペ プ チ ド を、 迅 速 か つ 高 収 率 で 精 製 で き る も の で あ り、 ぺ プ チ ド な い し 蛋 白 質 合 成 に 飛 躍 的 な 進 歩 を も た ら し、 ペ プ チ ド な い し 蛋 白 質 の 生 理 作 用 の 解 明、 作 用 機 序 の 解 明 等 に 大 き く 貢 献 す る こ と が で き る も の で あ る。
    [0087] 図 面 の 簡 単 な 説 明
    [0088] 第 1 図 は F m o c 固 相 ペ プ チ ド 合 成 サ イ ク ル 及 び そ の 後 の 成 熟 べ プ チ ド の 精 製 過 程 を 示 す フ ロ ー チ ヤ一 卜、
    [0089] 第 2 図 は ペ プ チ ド 合 成 工 程、 リ ン カ一結 合 工 程、 お よ び リ ン カ 一 結 合 固 相 担 体 を 用 い る 精 製 工 程 を 示 す フ ロ ー チ ヤ 一 ト、
    [0090] 第 3 図 は リ ン カ ー 合 成 の 反 応 系 フ ロ ー チ ヤ 一 卜、
    [0091] 第 4 図 は リ ン カ 一 合 成 の 別 の 反 応 系 フ ロ ー チ ヤ一 ト、 第 5 図 は リ ン カ ー 合 成 の さ ら に 別 の 反 応 系 フ ロ ー チ ヤ 一 卜 で あ る。 発 明 の 詳 細 な 説 明
    [0092] 以 下 本 発 明 を、 実 施 態 様 に 基づ き よ り 詳 細 に 説 明 す る。 第 1 図 は、 F m o c ( 9 -フ ロ ォ レ ニ ル メ チ ル ォ キ シ カ ル ボ ニ ル ） 法 に よ る 固 相 ペ プ チ ド 合 成 に お い て、 本 発 明 の 精 製 方 法 の 一例 を 適 用 し た 場 合 の 概 略 を 示 す も の で あ る。
    [0093] 第 1 図 に 示 す よ う に ペ プ チ ド 合 成 は、 常 法 に 従 い、 ス テ ッ プ 1 〜 ステ ッ プ 3 を 繰 り 返 す こ と に よ っ て 行 わ れ る。 す な わ ち、 ま ず ス テ ッ プ 1 に お い て、 N 末 端 が F m o c 基 に よ り 保 護 さ れ た 第 1 ア ミ ノ 酸 残基
    [0094] ( - N HH —- CC HH —- CC 00 - ) が 多 数 結 合 し て な る 固 相 と し て の 固 相 担 体 ビ ー ズ P を、 ペ プ チ ド シ ン セ サ イ ザ 一 の 反 応 ffl 容 器 に セ ッ ト し、 こ れ に 2 0 % ピ ぺ リ ジ ン / ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド （ D M F ) 混 液 を 添加 す る こ と に よ り 末 端 の F m o c 基 を は ず し、 次 に ス テ ッ プ 2 に お い て こ れ に N 末 端 が F m o c 基 に よ り 保 護 さ れ た 第 2 ア ミ ノ 酸
    [0095] ( F m o c - N HH -- CC HH -- CC 0O 0O HH )
    [0096] を 縮 合 剤 （ 例 え ば、 N , N ' — ジ イ ソ プ ロ ピ ル カ ル ボ ジ ィ ミ ド （DIPCD) + N — ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ア ゾ 一 ル （ΗϋΒΤ)、 ベ ン ゾ ト リ ア ゾ ー ル ー 1 ー ィ ル ー ォ キ シ 一 卜 リ ス （ ジ メ チ ル ァ ミ ノ ） 一 ホ ス フ 才 ニ ゥ ム へ キ サ フ ル ォ ロ ホ ス フ ェ イ ト (Β0Ρ ) + Η 0 Β Τ、 [ と 共 に あ る い は 前 記 ア ミ ノ 酸 の ぺ シ 夕 フ ル オ ロ フ ェ ニ ル エ ス テ ル （ pFp エ ス テ ル ） + Π 0 Β Τ ] と 共 に 添 加 し、 第 2 ア ミ ノ 酸 残基 を 固 相 担 体 ビ ー ズ P 上 の 第 1 ア ミ ノ 酸 残 基 側 方 に 結 合 さ せ る。 こ こ で、 第 2 ァ ミ ノ 酸 が 結 合 し な か っ た 未 反 応 の 鎖 が、 そ の 後 の ア ミ ノ 酸 結 合 反 応 に お い て 成 長 し て い く の を 防 止 す る た め に、 ス テ ッ プ 3 に お い て 無 水 酢 酸 / ビ リ ジ ン 混 液 を 反 応 用 容 器 に 添 加 し、 未 反 応 の 鎖 末 端 に ァ セ チ ル 基 を 結 合 さ せ て ェ ン ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ を 行.う。 こ の キ ヤ ッ ビ ン グ 処 理 に よ り、 固 相 担 体 ビ ー ズ 上 に は、 第 1 ア ミ ノ 酸 残 基 お よ び 第 2 ア ミ ノ 酸 残 基 が 結 合 し た N 末 端 が F m o c 基 に よ り 保 護 さ れ た 鎖 と、 第 1 ア ミ ノ 酸 残 基 の N 末 端 に ァ セ チ ル 基 が 結 合 し た 鎖 が 存 在 す る こ と と な る。
    [0097] 次 い で、 ス テ ッ プ 1 に 戻 り、 第 1 ア ミ ノ 酸 残 基 お よ び 第 2 ア ミ ノ 酸 残 基 が 結 合 し た 鎖 の N 末 端 の F m o c 基 を は ず し、 ス テ ッ プ 2 に お い て 第 3 ア ミ ノ 酸 を 縮 合 剤 と 共 に 添 加 し て、 該 鎖 の 第 2 ア ミ ノ 酸 残 基 側 方 に 第 3 ア ミ ノ 鎖 残 基 を 結 台 さ せ、 そ の 後 ス テ ッ プ 3 に お い て 第 2 ア ミ ノ 酸 が 結 合 し な か っ た 未 反 応 の 鎖 を エ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ す る。 こ の よ う に し て 目 的 の n 個 の ア ミ ノ 酸 が 結 合 す る ま で ス テ ッ プ 1 〜 3 を 繰 り 返 す も の で あ る。
    [0098] 最 終 ア ミ ノ 酸 導 入 後 に お い て、 固 相 担 体 （ 固 相 担 体 ビ ー ズ ） に は、 N 末 端 の ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 ぺ プ チ ド と、 無 水 酢 酸 で の キ ヤ ッ ビ ン グ に よ っ て ァ セ チ ル 基 修 飾 末 端 を 有 す る 未 成 熟 ペ プ チ ド （ 不 純 物 ） と の 双 ：// が 結 し て お り、 目 的 と す る 成 熟 ペ プ チ ド は 多 数 の 不 純 物 中 に 混 在 し た 状態 に あ る。
    [0099] な お、 第 1 図 に お い て は、 未成 熟 ペ プ チ ド の 末端 を ァ セ チ ル 基 に よ っ て エ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ す る 例 を 示 し た 力;、 未 成 熟 ペ プ チ ド の 末 端 を 有 効 に キ ヤ ッ ビ ン グ で き る 限 り に お い て、 こ の よ う な キ ヤ 、ジ ビ ン グ は い か な る キ ヤ ッ ビ ン グ 試 薬 を 用 い て 行 う こ と も で き、 こ れ 以 外 に も 例 え ば、 プ ロ ビ ォ ニ ル 基、 ^ る い は 4 一 二 ト ロ フ エ ニ ル 基、 2, 4— ジ ニ ト ロ フ ヱ ニ ル基、 2, 6— ジ ニ ト ロ フ エ ニ ル 基 な ど に よ る キ ヤ ッ ビ ン グ が 可 能 で あ る。
    [0100] し か し て、 本 発 明 の 合 成 べ プチ ド 精 製 方 法 に お い て は、 こ の 最 終 ア ミ ノ 酸 導 入 直 後 に、 固 相 に 対 し、 前 記成 熟 ぺ プ チ ド の N 末端 と、 酸 性 条 件 下 で 行 わ れ る 固 相 法 に お け る 最 終 脱 保 護 基反 応 に 安 定 で か つ あ る 他 の 条 件、 例 え ば ア ル 力 リ 性 条 件下で 特 異 的 に 切 断 可 能 な 結 合 （ 例 え ば ウ レ 夕 ン 結 合 ） を な す 官 能 基 を 有 し、 か つ 他 端 部 に 前 記 脱 保 護 基 反 応 に よ り 活 性 な 官 能 基 を 生 成 し 得 る リ ン カ ー を 添 加 す る。
    [0101] 酸 性 条 件下 で 行 わ れ る 最 終 脱保 護 基 反 応 に 安 定 で か つ ァ ル カ リ 性 条件 下 で 除 去 可 能 な ァ ミ ノ 保 護 基 と し て、 カ ル ピ ノ ら の F m o c 基 （ 9 -フ ル ォ レ ニ ル メ チ ル ォ キ シ カ ル ボ 二 メレ _) L L . A . Ca r 1 n 0 and G . Y , Han, J . Am. Chem. S o c . , 92, 5478 (1970) ； J. Org. Chem. , 37, 3404 (1972)] 、 テ ッ サ ァ ら の M s c 基 （ メ チ ノレ ス ル ホ ニ ル ェ チ ル ォ キ シ カ ル ボ ニ ル ） [G. I. Tesser and I . C. alvert-Geers, Inし J. Peptide Protein Res. , 7, 295 (1975) ]力 ί あ る 0 F m o c 基
    [0102] M s c 基 ：
    [0103] O °
    [0104] II II
    [0105] CH, S-CH2 CH2一 O - C一
    [0106] II
    [0107] o
    [0108] い ず れ の 保 護 基 も ア ル カ リ 処 理 に よ り 13 脱 離 反 応 を 起 こ し 短 時 間 に 除去 可 能 な ァ ミ ノ 保 護基 で あ る。 従 っ て、 本 発 明 に お い て 用 い ら れ る リ ン カ — は、 こ の よ う な ァ ミ ノ 保 護 基 を ベ ー ス と し て 好 適 に 構 成 さ れ 得 る 力 特 に、 リ ン カ 一合 成 の 容 易 さ、 さ ら に 分 子 鎖 の 長 さ か ら 考 え て、 テ ッ サ ァ ら の M s c 基 を 用 い た ほ う が 有 利 で あ る。 本 発 明 に お い て 用 い ら れ る リ ン カ — と し て、 具 体 的 に は、 例 え ば、 次 の 構 造 式 （ ΠΙ )
    [0109] 0
    [0110] II
    [0111] X-NH- (CH2 ) -S-CH2 -CH2 -O-C-Y (III)
    [0112] II II
    [0113] 0 o
    [0114] (ただし、式中、 nは 1〜4の整数、 Xは
    [0115] CII3— 0— <T CH2— S—（CH2 ) — C— （mは 1〜2) ；
    [0116] W II
    [0117] 0
    [0118] CH, ；および CH2 -S-CH2 - <Q> - OCH:
    [0119] CH, -0→Q-CH2 -O-C-NH-CH-CO
    [0120] のいずれかであり、 また Yは
    [0121]
    [0122] o
    [0123] II
    [0124] c、
    [0125] ；および
    [0126]
    [0127] ■o—_ -F のいずれかである。 ）
    [0128] で 表 さ れ る も の な ど が 好 適 に 例 示 さ れ る。 こ の リ ン カ 一 は、 M s c 基 を 基 本 骨 格 と し て 有 し、 か つ 一 端 に ペ プ チ ド の N 末 端 の ア ミ ノ 基 に 導 入 可 能 な 活性 ァ ル コ キ シ カ ル ボ ネ ー 卜 な い し は ァ リ ー ル ォ キ シ カ ノレ ポ ネ ー 卜 を 有 し、 さ ら に 他 端 に 活 性 な 官能 基 と し て チ オ ー ル基 （ S H 基 ） を 有 し て い る ( 但 し、 こ の S H 基 は 保護基 に よ り 保護 さ れた 形態 に あ る。 ） も の で あ る。 こ の リ ン カ 一 の 上 記 一 端 部 は、 固 相 法 べ プ チ ド 合 成 の 最終 脱 保 護 基 工 程 に お け る 反 応 条 件下、 ぺ ブ チ ド 合 成 の 最 終 脱 保 護 基 用 試 薬 と し て 用 い ら れ る あ ら ゆ る 酸 に は 安 定 で あ る が、 ア ル カ リ （ 例 え ば、 0. 2 N N a 0 H ( 5 0 w/w % メ タ ノ ー ノレ 中 ） 5 秒、 5 w/w % N H40 H ( 5 0 w/w % メ タ ノ ー ル 中 ） 5 分 ） に よ っ て 3 脱 離 反 応 を 起 こ し 容 易 に 解 離 す る 結 合 を べ プ チ ド の N 末 端 と な す も の で あ る。 ま た こ の リ ン カ 一 の 上 記 他 端 部 の S H 基 は、 ョ 一 ド 酢 酸 誘 ¾ 体 と 反 応 し、 中 性 お よ び ア ル 力 リ 性下 に お い て 安 定 な チ ォ エ ス テ ル 型 の 共 有結 合 を 形 成 す る も の で あ る。 こ の 構 造 式 （ m ) で 表 さ れ る リ ン カ 一 の 合 成 経 路 と し て は 特 に 限 定 さ れ る も の で は な い 力 例 え ば、 構 造 式 （ I ) で 表 さ れ る M s c 基 を 骨 格 と し て 有 す る 中 間 体 よ り 好 適 に 導 き 出 さ れ る。
    [0129] 0
    [0130] II
    [0131] X-NH- (CH2 ) n -S-CH2 -CH2 -OH CI)
    [0132] II
    [0133] 0
    [0134] (ただし、式中 nは 1~4の整数、 Xが Hのもの、 およびその塩酸塩、
    [0135] ならびに
    [0136] CH,
    [0137] i
    [0138] CH, -C-O-C- ；および
    [0139] I II CH, 0
    [0140] CH, O—〈Z》一 CH2 -O-C- のいずれかである。 ）
    [0141] II
    [0142] 0
    [0143] す な わ ち、 構 造 式 （ I ) で 表 さ れ る 中 間 体 の 一 方 の 末 端 で あ る 水 酸 基 は、 ペ プ チ ド な い し は 蛋 白 質 の ァ ミ ノ 基 に 導 入 可 能 な 活 性 ア ル コ キ シ カ ル ボ ネ ー 卜 に 容 易 に み ち び く こ と が で き、 一 方、 他 方 の 末 端 で あ る ア ミ ノ 基 な い し 適 当 な 保 護 基 に よ っ て 保 護 さ れ た ァ ミ ノ 基 は、 活 性 な 官能 基 を 有 す る 化 合 物、 例 え ば S H 基 を 有 す る 化 合 物 を 容 易 に 導 入 す る こ と が で き る も の で あ る。
    [0144] ま た、 構 造 式 （ Π ) で 表 さ れ る 中 間 体 は、 こ の 構 造 式 ( I ) で 表 さ れ る 中 間 体 の 前 記他 方 の 末 端 で あ る ア ミ ノ 基 末 端 に 保 護 基 に よ り 保護 さ れ た チ オ ー ル 基 を 有 す る 化 合 物 を 導 入 し た も の で あ る。
    [0145] 0
    [0146] II
    [0147] X-NII- (CH2 ) -S-CH2 -CH2 -OH (Π)
    [0148] II
    [0149] o
    [0150] (ただし、式中、 n=l〜4の整数、 Xは
    [0151] CH3 -O- 〉— CH2一 S— (CH2 ) 雕一 C— (mは 1〜2) ；
    [0152] II
    [0153] 0
    [0154] CH3 CH2一 S— CH2 - — 0CH3 ；
    [0155] CH3一 C一 O— C一 NH— CH— CO—
    [0156] I II CH, 0
    [0157] および
    [0158] CH2 -S-CH2 - <Q> - OCH3
    [0159] CH3 -0- -CH2 -0-C-NH-CH-CO- W II
    [0160] o
    [0161] のいずれかである。） こ の よ う な リ ン カ 一 が 添 加 さ れ る と、 リ ン カ 一 は、 第 1 図 に 示 す よ う に 目 的 と す る 成 熟べ プ チ ド の み が N 末 端 の ァ ミ ノ 基 を 有 す る ゆ え に、 こ の 成熟 ペ プ チ ド の み に 結 合 す る。 従 っ て、 リ ン カ 一 に 含 ま れ る 例 え ば S H 基 な ど の よ う な 活 性 基 は 成 熟 ぺ ブ チ ド 鎖 末 端 の み に 導 入 さ れ る。
    [0162] 次 い で、 常 法 に 基 づ き 酸 性 条 件 下 で 最 終 脱 保 護 基 反 応 を お こ な い、 固 相 よ り、 リ ン カ 一 の 結 合 し た 成 熟 ペ プ チ ド 鎖 お よ び ァ セ チ ル 基 な ど に よ り ェ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ さ れ た 未 成 熟 ペ プ チ ド 鎖 を 切 断 す る。 上記 し た よ う に こ の 最 終 脱 保 護 基 反 応 に お い て は、 上 記 リ ン カ 一 は 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 に 安 定 し て 結 合 し て い る。 な お、 リ ン カ 一 と し て 構 造 式
    [0163] ( m ) で 表 さ れ る 化 合 物 を 用 い た 場 合、 こ の リ ン カ 一 の s
    [0164] H 基 の 保 護基 で あ る P — メ ト キ シ ベ ン ジ ル 基 は、 脱 保 護 基 試 薬 に よ り 除 去 さ れ、 ペ プ チ ド 鎖 末 端 に S H 基 が 露 出 す る こ と と な る。
    [0165] 次 に、 こ う し て 得 ら れ た 成 熟 べ プ チ ド 鎖 お よ び 未 成 熟 ぺ プ チ ド 鎖 を 含 む ペ プ チ ド 混 合 物 に 対 し、 リ ン カ 一 の 前 記 他 端 部 の 官 能 基 と 反 応 し て 安 定 な 結 合 を 形 成 す る 官 能 S を 有 す る 化 合 物 を 固 定 化 し て な る 固 相 を 接 触 さ せ る。 例 え ば、 該 官 能 基 が S H 基 で あ る 場 合、 表 面 に ョ ー ド 脂 肪族 力 ル ボ ン 酸 誘 導 体 あ る い は ブ ロ ム 脂 肪族 カ ル ボ ン 酸 誘 導 体、 特 に 次 の 一 般 式
    [0166] R
    [0167] ( た だ し、 式 中 R は H ま た は 炭 素 数 1 ~ 6 の ア ル キ ル 基、 n は 1 ~ 6 の 整 数 で あ る。 ）
    [0168] で 表 さ れ る ョ 一 ド 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 誘 導 体、 あ る い は 次 の 一 般 式
    [0169] ( た だ し、 式中 R は H ま た は炭素数 1 ~ 6 の ア ルキ ル基、 n は 1 〜 6 の 整数で あ る。 ） で 表 さ れ る ブ ロ ム 脂肪族 カ ル ボ ン 酸誘導体 が 固定化 さ れて い る 固相、 特 に 好 ま し く は ョ 一 ド 酢酸誘導体
    [0170] I -CH 2C00H
    [0171] あ る い は ブ ロ ム 酢酸誘導体
    [0172] BrCH 2C00H が 固定化 さ れて い る 固 相 を 用 い る。
    [0173] 具体 的 に は 例 え ば、 次 の構造式 を 有す る 分子鎖
    [0174] B r-(CH^C-NH-(CH2 ---NH-
    [0175] I II
    [0176] R O
    [0177] ( た だ し、 式中 R は H ま た は炭素数 1 ~ 6 の ア ル キ ル基、 n = l 〜 2、 m = 2 〜 6 で あ る。 ） を 結合 さ せ た 固 相 を 用 い、 中性付近 の 条件下 に 接触 さ せ れば 良 い。 好 ま し く は p H = 7 〜 9 の範囲 に お い て、 かつ 目 的 と す る 反応を 阻害 し な い 不活性の 緩衝液中 で 行わ れる。 ま た 更 に 好 ま し く は、 ぺ ブチ ド の溶解性 を 向上 さ せ る た め に、 例 え ば塩酸 グ ァ ； ジ ン、 尿素な ど の 変性剤が添加さ れ る。 一例 と し て は、 緩 衝 液 と し て、 0. 4 M リ ン 酸 緩 衝 液 や、 0. 4 M 卜 リ ス ( ヒ ド ロ キ シ メ チ ル ） ァ ミ ノ メ タ ン 塩 酸 緩 衝 液 （ 以 下、 ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 と 略 す ） が 用 い ら れ、 変 性 剤 と し て、 4 〜 7 M o l、 好 ま し く は 約 6 M o l 塩 酸 グ ァ ニ ジ ン や、 4 〜 8 Μ ο 1、 好 ま し く は 約 6 Μ ο 1 尿 素 が 用 い ら れ る。 勿 論、 こ れ ら 以 外 の 緩 衝 液 や、 変 性 剤 も 適 宜 使 用 可 能 で あ る。
    [0178] ま た、 こ の よ う な 官 能 基 を 有 す る 化 合 物 が 固 定 化 さ れ る 固 相 と し て は、 固 相 担 体 が 好 ま し く、 特 に 親 水 性 固 相 担 体 が 好 ま し い。 一 例 と し て、 水 系 で 使 用 可 能 な よ う に 適 当 な 親 水 性 固 相 担 体 を 含 浸 さ せ た キ ー ゼ ル グ ー ル 支 持 担 体 （ 固 相 担 体 ビ ー ズ ） が 挙 げ ら れ る。
    [0179] こ の 操 作 に よ り、 該 固 相 に 成 熟 べ プ チ ド の み 選 択 的 に 固 定 で き る。 一 方、 固 相 に 結 合 し な つ か っ た 未 成 熟 ペ プ チ ド や 脱 保 護 基 に 用 い た ス カ ベ ン ジ ャ ー 等 は 次 に 固 相 （ 固 相 担 体 ） の 洗 浄操 作 を 行 う こ と に よ り 簡 単 に 除 去 す る こ と が で き る。 最 後 に、 リ ン カ 一 と 成熟 ペ プ チ ド と の 結 合 を 特 異 的 に 切 断 す る 条 件、 例 え ば リ ン カ ー が 構 造 式 （ III ) で 表 さ れ る 化 合 物 で あ る よ う な 場 合 に は、 ア ル 力 リ 条 件 に 曝 せ ば、 成 熟 ペ プ チ ド が リ ン カ ー 結 合 固 相 よ り 切 断 さ れ る。 な お、 こ の ア ル カ リ 処 理 を 5 % ア ン モ ニ ア 溶 液 を 用 い て 行 っ た 場 合 に、 5 % ア ン モ ニ ア 溶 液 に 溶 け な い ペ プ チ ド は 固 相 よ り 切 断 さ れ た と き に 沈 殿 物 と し て 反 応 用 容 器 内 に 残 る も の も あ る。 こ の ア ル 力 リ 処 理 の 後 に 5 0 % 酢 酸 溶 液 で 洗 净 す る と 沈 殿 物 は 溶 出 し 効 率 よ く 回 収 で き る。 ま た こ の よ う に、 ア ル 力 リ 処 理 の 後 の 固 相 洗 浄 操 作 に 酢 酸 を ； 1 い る と ア ン モ ニ ァ が 中 和 さ れ、 凍 結 乾 燥 で 昇華 さ せ る こ と が で き る た め に、 最 終 的 に 得 ら れ る も の は 成熟 ペ プ チ ド の み と な り、 好 ま し い。
    [0180] な お、 第 2 図 は、 本 発 明 の こ の よ う な 合 成 ペ プ チ ド 精 製 法 の 一 実 施態 様 に よ る 具 体 的 な 模 式 で あ り、 こ の 図 に お い て 目 的 と さ れ る 成 熟 ペ プ チ ド は、 A — B — C — D — E — F 一 G で 表 わ さ れ る も の で あ り、 こ れ よ り 短 い A — B — C、 A — B — C 一 D、 A — B — C 一 D — E、 A - B - C - D - E 一 F は い ず れ も 未 成 熟 ぺ プ チ ド を 表 わ す も の で あ る。
    [0181] 第 2 図 の ス テ ッ プ 1 は、 固 相 法 ペ プ チ ド 合 成 の 最 終 ア ミ ノ 酸 導 入 後 に お い て、 固 相 （ 固 相 担 体 ビ ー ズ ） に は、 N 末 端 の ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 ペ プ チ ド と、 無 水 酢 酸 で の キ ヤ ッ ビ ン グ に よ っ て ァ セ チ ル 基 修 飾 末 端 を 有 す る 未 成 熟 ペ プ チ ド （ 不 純 物 ） と の 双 方 が 結 合 し て お り、 目 的 と す る 成 熟ペ プ チ ド は 多 数 の 不純 物 中 に 混 在 し た 状 態 に あ る。 こ の 固 相 に 上 記 し た よ う な 本 発 明 の リ ン カ ー を 添 加 す る と、 リ ン カ 一 は 成 熟 ペ プ チ ド A — B — C 一 D — E — F — G の み の 末 端 に 選 択 的 に 結 合 し、 そ の 後 べ プ チ ド 合 成 法 の 最 終 脱 保 護基 処 理 を 行 う と、 ス テ ッ プ 2 に 示 さ れ る よ う に， 成 熟 ペ プ チ ド と 未 成 熟 ペ プ チ ド と が 固 相 よ り 切 断 さ れ、 合 わ せ て 成 熟 べ プ チ ド に 結 合 し た リ ン カ ー の 他 末 端 に 活 性 な 官 能 基 （ S H 基 ） が 形 成 さ れ る。 次 に、 ス テ ッ プ 3 に 示.さ れ る よ う に こ う し て 得 ら れ た 成熟 べ プ チ ド 鎖 お よ び 未 成 熟 ペ プ チ ド 鎖 を 含 む ペ プ チ ド 混 合 物 に 対 し、 反 応 ffl 容 器 に 収 容 さ れ た 本 発 明 の リ ン カ 一 結 合 用 固 相 担 体 を 接 触 さ せ る。 こ の 操 作 に お い て、 リ ン カ ー 結 合 用 固 相 担 体 に は 成 熟 ぺ ブ チ ド の み が リ ン カ ー に よ っ て 結 合 さ れ、 未 成 熟 べ プ チ ド ゃ そ の 他 の 試 薬 は 系 外 に 排 出 さ れ る。 次 い で、 ス テ ッ プ 4 に お い て、 リ ン カ 一 と 成 熟 ペ プ チ ド と の 結 合 を 特 異 的 に 切 断 す る ア ル カ リ 条 件 に 反 応 用 容 器 を 曝 し、 成 熟 ペ プ チ ド を リ ン カ ー 結 合 固 相 よ り 切 断 し、 反応 用 容 器 よ り 流 出 さ せ る も の で あ る。
    [0182] ( 実 施 例 ）
    [0183] 以 下本 発 明 を 実 施 例 に よ り さ ら に 具 体 的 に 説 明 す る が、 以 下 に 示 さ れ る 実 施 例 は あ く ま で 本 発 明 の 説 明 の た め に 例 示 さ れ た も の に す ぎ な い の で あ っ て、 本 発 明 は こ れ ら の 実 施 例 に よ っ て 何 ら 限 定 さ れ る も の で は な い。
    [0184] m 1 リ ン カ ー の ( A )
    [0185] 第 3 図 に 従 い、 リ ン カ 一 を 合成 し た。
    [0186] 1 - 1—： _ t合 物 I の 合 成
    [0187] CH2 -CH2一 S— CH2 -CH2 -OH
    [0188] 化 合 物 I ： 2— N—ェチルフタルイミト * ， 2' —ハイト ' 口キシェチルスルフイ ト'
    [0189] N — 2 — ブ ロ モ ェ チ ル フ タ ル イ ミ ド （ 50. 8 g、 0.
    [0190] 2 m o 1 ) と、 3 — メ ル カ ブ ト エ タ ノ ー ノレ （ 14. 3 m l、 0. 2 m o 1 ) を、 ジ メ チ ル フ オ ル ム ア ミ ド （ 4 0 0 m l ) に 溶 か し、 氷 冷 下 に ジ シ ク ロ へ キ シ ル ァ ミ ン （ 39. 9 m 1、 0. 2 m o 1 ) を 加 え、 室温 に て 4 時 間 撹 拌 し た。 生 成 す る 塩 （ ジ シ ク ロ へ キ シ ル ァ ミ ン の 臭 化 水 素塩 ） を 逋 去 し た。 塩 を 小 量 の ジ メ チ ル フ 才 ル ム ア ミ ド で 洗 浄 し 逋 液 と 合 せ た。 ジ メ チ ル フ オ ル ム ア ミ ド を 滅 圧 留 去 し た。 残 渣 を 酢 酸 ェ チ ル に 溶 か し、 分 液 ロ ー ト に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 層 を 飽 和 食 塩水で 3 度 洗 っ た。 さ ら に 酢 酸 ェ チ ル 層 を マ イ ヤ ー フ ラ ス コ に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム で 乾 燥 し た。 無 水 琉 酸 ナ ト リ ウ ム を 逋 去 し、 酢 酸 ェ チ ル を 減 圧 留 去 し た。 そ し て 白 色 の 油 状物 45. 9 g ( 収率 9 1 % ) を 得 た。
    [0191] 1 - 2 ： 化 合 物 Π の 合 成
    [0192] CH3 一 CH2 -0-C-NH-CH2 - CH2 - S - CH2一 Ci 一 OH
    [0193] O
    [0194] 化 合 物 II ： 2N—（P -メトキシへ， ンシ' ルォキシカル *' ニル）アミノエチル， 2' -ハイト' Dキ シェチ スルフ ト ·
    [0195] 上 記 で 得 た 化 合 物 I ( 43. 5 g、 0. 17 m o 1 ) を メ タ ノ ー ル （ 2 5 0 m l ) に 溶 か し、 飽 水 ヒ ド ラ ジ ン （ 9. 3 m 1、 0. 18 m o 1 ) を 加 え 1 6 時 間 撹 拌 し た。 生 成 す る 結 晶 を 逋 去 し、 メ タ ノ ー ル を 滅 圧 留 去 し た。 残 渣 に ァ セ ト ニ ト リ ル を 加 え 結 晶 化 し た。 メ タ ノ ー ル Z ァ セ 卜 ニ ト リ ル よ り 再 結 晶 し 白 色 結 晶 45. 9 g ( 収 率 8 6 % ) を 得 た。 次 い で、 こ れ を 水 （ 1 0 0 m 1 ) と 卜 リ エ チ ル ァ ミ ン ( 23. 6 m 1 ) の 混 液 に 溶 か し、 氷 冷 下 ノ ラ メ ト キ シ べ ン ジ ル ア ジ ド ホ ル メ ー ト （ 渡 辺 化 学 工 業 株 式 会 社 製 ） （ 3 4. 7 g、 0. 16 m o 1 ) の ァ セ ト ニ ト リ ル （ 1 0 0 m
    [0196] 1 ) 溶 液 を 加 え、 1 0 時 間 撹 拌 し た。 水 ー ァ セ ト ニ ト リ ル を 滅 圧 留 去 し た。 油 状 残 渣 を 酢 酸 ェ チ ル に 溶 か し、 分 液 口 一 卜 に 移 し、. 詐 酸 ェ チ ル を 5 % ク ェ ン 酸 で 3 度、 飽 和 食 塩 水 で 3 度 洗 浄 し た。 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を マ イ ヤ ー フ ラ ス コ に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を 無 水 硫 酸 ナ ト リ ゥ ム で 乾燥 し た。 無 水 硫 酸 ナ ト リ ゥ ム を 據 去 し、 酢 酸 ェ チ ル を 滅 圧 留 去 し た。 残 渣 に n — へ キ サ ン を 加 え て、 結 晶 化 し た。 酢 酸 ェ チ ル n — へ キ サ ン で 再 結 晶 化 し、 白 色 結 晶 37. 12 g ( 収 率
    [0197] 9 3 % ) を 得 た。
    [0198] な お、 得 ら れ た 化 合 物 Π の 分 析 値 は 以 下 の 通 り で あ つ た。
    [0199] R f , = 0. 74
    [0200] 融 点 4 1 〜 41. 5 eC
    [0201] C13H19N04Sに 関 す る 理 論 値 ：
    [0202] C = 54. 72 ； II = 6. 71 ； N = 4. 91
    [0203] 実 測 値 ：
    [0204] C = 54. 79 ； H = 6. 88 ； N = 4. 98
    [0205] NMR (CDC 13 ) ： 52.08(br.s,lH),
    [0206] 2.73-2.76 ( 4H), 3.39 (q, J=6.1Hz, 2H),
    [0207] 3.73 (t, J=5.7Hz, 211), 3.80 (s, 3H),
    [0208] 5.04(s, 2H), 5.12(br.s,lH), 6.88, 7.30(ΑΑ' HB' pattern, Jortho =8.8).
    [0209] F A B 質量 分 析 ： 286. 1 ( M + H+ ) ( C13Hi9N0 S ： 285. 1 に 関 し て 算 出 ）
    [0210] 1 - 3 ： 化 合 物 ΠΙ の 合 成
    [0211] 0
    [0212] II
    [0213] CH, 0~<Ζ—》一 CH2 -0-C-NH-CH2 一 CH: S- CH2 -CH2一 Oil
    [0214] II
    [0215] o 0
    [0216] ί匕 合 ¾5 m ： N (p— [トキシへ * ンシ' ル才キシカルホ' ニル）アミノエチルスルフォ二ルェ夕ノール 上 記 で 得 た 化 合 物 II ( 18. 2 g、 6 5 m m o 1 ) を 水
    [0217] ( 1 0 0 m l ) と メ タ ノ ー ル （ 1 0 0 m l ) に 溶 か し、 夕 ン グ ス テ ン 酸 ナ ト リ ウ ム （ 6 5 m g ) を 加 え、 撹 拌 し な が ら、 過 酸 化 水 素 水 （ 16. 3m l、 1 1 4 m 1 / m o 1 ) を 滴 下 し た。 な お、 反 応 は 発 熱反応 で あ る の で、 反 応 温 度 を 6 0 と な る よ う に 制 御 し た。 2 時 間 撹 拌 の 後、 過 剰 の 過 酸 化 水 素 水 を 分 解 す る た め、 5 % パ ラ ジ ウ ム 炭 素 （ 0. 5 g ) を 加 え 発 泡 が 終 了 す る ま で 撹 拌 し た。 5 % パ ラ ジ ゥ ム / 炭 素 を 逋去 し、 溶 媒 を 滅 圧留 去 し、 油 状 残 渣 を 酢 酸 ェ チ ル に 溶 か し、 分 液 ロ ー ト に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を 5 % ク ェ ン 酸 で 3 度、 5 % 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム 溶 液 で 1 度、 さ ら に 飽 和 食 塩 水 で 3 度 洗 浄 し た。 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を マ イ ヤ 一 フ ラ ス コ に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を、 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム で 乾 燥 し た。 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を 濾去 し、 酢 酸 ェ チ ル を 滅 圧 留 去 し た。 そ し て 油 状 残渣 に ジ ェ チ ル エ ー テ ル を 加 ·Π 4""α , -Ν -" ， ,v""-d)-s ： ΛΙ ii¾
    [0218] m ^ ο> Μ ^ ^ : - τ
    [0219] ( Ff 3¾ - η Μ Γί I '0Ρ£ ： BNS90 6iHeID )
    [0220] '(8 ·8= 0""0Γ 'ma ked gg ,w)6Z 'L '88 '9
    [0221] '(HI 'a¾TT q)9 S '(HZ *s)W 'S'(HZ 'S=fW
    [0222] ' (Ηε ) 08 ·ε ' (HZ ¾H6 '9=Γ ¾) ZL ·ε
    [0223] '(ΗΖ ¾H6 's=r ·ε '(HZ -s=r ¾oz ¾
    [0224] '(HT*s'jq)60'zs · '{ ε οαο) ΗΙΛΙΝ if = N ·' Z6 '2 = H ·' εθ '62 = 0
    [0225] - m m
    [0226] I = N ； SO *9 = H ' OZ '62 = 0
    [0227] ： S> «I IE 5· 4- K S90N6lH"0
    [0228] 9 9 〜 S 9 ？ 賴
    [0229] z 2 *o = ιί a
    [0230] 。 c* 靳 土 :i f J 1} ½ © ni ^ q> ¾ -i^ 9 ¾ 、i
    [0231] °^ M ¾ ( % r 8 * Kir ) s A -9 r w ^ ¾a ¾ M a. ^ - x -ir ^ x j / ^ x ¾| 48 。 つ ：^晋 ^ L€lO/l6df/IDd .0I90/Z6 OM S — （ p — メ ト キ シ ベ ン ジ ル ） チ ォ グ リ コ ー ル 酸 （ 1. 4 9 g、 7 m m o 1 ) と 1 ー ヒ ド ロ キ シ ス ク シ イ ミ ド （ 0. 8 1 g、 7 m m o 1 ) を テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン （ 1 0 m l ) に 溶 か し、 氷 冷 下 に N, N ' — ジ シ ク ロ へ キ シ ル カ ノレ ポ ジ イ ミ ド （ 1. 59 g、 7. 7 m m o 1 ) を 加 え 5 時 間 撹 拌
    [0232] し た。 生 成 す る N, N'— ジ シ ク ロ へ キ シ ル ウ レ ァ を 滹 取 し、 テ ト ラ -ヒ ド ロ フ ラ ン を 滅 圧留 去 し た。 残 渣 に イ ソ プ ロ ビ ル ア ル コ ー ル を 加 え て 結 晶 化 し、 さ ら に テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン Zイ ソ プ ロ ビ ル ア ル コ ー ル で再結晶 し、 白 色結晶 1. 2 5 g ( 収率 5 8 % ) を 得 た。
    [0233] な お、 得 ら れ た 化 合 物 IV の 分 析 値 は 以 下 の 通 り で あ っ た。
    [0234] R f 2 = 0. 8 6
    [0235] 融点 8 8 〜 8 9 で
    [0236] CMHi5N05Sに 関す る 理 論 値 ：
    [0237] C = 54. 36 ； H = 4. 88 ； N = 4. 53 実 測 値 ：
    [0238] C = 54. 07 ； H = 4. 85 ； N = 4. 48
    [0239] F A B 質量 分 析 ： 332. 1 ( M + Na"1 ) ( Ci4Hi5N05SNa ： 332. 1 に 関 し て 算 出 ）
    [0240] 1 一 5 ： 化 合 物 V の 合 成
    [0241] 0
    [0242] II
    [0243] CH3 0- -CH2 -S-CH2 -C-NH-CH2 - CH2 -S-CH2 - CH2 - OH
    [0244] ヽ - i| II
    [0245] 0 0 t 合 ¾ V ： N[S—（p—；（トキシへ' ンシ' ル）チ才ク' リコリル]アミノエチルスルフォニルェ夕ノ -ル
    [0246] 上 記 化 合 物 ΠΙ ( 5. 0 g、 15. 8 m m o 1 ) を ァ ニ ソ
    [0247] ー ル （ 5 m l ) 存在 下 に、 ト リ フ ル ォ ロ 酢 酸 （ 2 0 m l ) で 氷 冷 下 6 0 分 処 理 し た。 ト リ フ ル ォ ロ 酢 酸 を 滅 圧 留 去 し、 残 渣 に ジ ェ チ ル エ ー テ ル を 加 え 油 状 残 渣 を 得 た。 こ れ を 氷 冷 下 に ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド （ 5 0 m l ) に 溶 か し、 ト リ ェ チ ル ァ ミ ン （ 4. 5 m l ) 、 N — ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ァ ゾ ー ル （ 2. 42 g ) と 化 合 物 IV ( 5. 86 g、 19.
    [0248] 0 m m o 1 ) を 加 え、 室 温 で 1 2 時 間 撹 拌 し た。 ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド を 滅 圧 留 去 し、 油 状 残 渣 を 得 た。 こ の 油 状 残 渣 を 酢 酸 ェ チ ル に 溶 か し、 分 液 ロ ー ト に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を 5 % ク ェ ン 酸 で 3 度、 5 % 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム 溶 液 で 3 度、 更 に 飽 和 食 塩 水 で 洗 浄 し、 次 い で 舴 酸 ェ チ ル 溶 液 を マ イ ヤ ー フ ラ ス コ に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム で 乾 燥 し た。 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を 濾 去 し、 酢 酸 ェ チ ル を 減圧 留 去 し た。 油 状 残 渣 に ジ ェ チ ル エ ー テ ル を 加 え、 結 晶 化 し、 酢 酸 ェ チ ル ノ ジ ェ チ ル エ ー テ ル で 再 結 晶 し、 白 色 結 晶 4. 31 g ( 収 率 7 8 % ) を 得 た。
    [0249] な お、 得 ら れ た 化 合 物 V の 分 析 値 は 以 下 の 通 り で あ つ た。
    [0250] R f！ = 0. 6 1
    [0251] 融 点 7 3 〜 7 5
    [0252] Ci4H2iN05S2 に 関 す る 理 論 値 ：
    [0253] C = 48. 40 ； H = 6. 09 ； N = 4. 03 C = 48. 40 ； H = 6. 09 ; N = 4. 03 実 測 値 ：
    [0254] C = 48. 60 ； H = 6. 29 ; N = 4. 11 NMR (CDC 13 )： 62.29(br.¾lH),
    [0255] a 13 (s, 2H), 3.31 -3.23 (m, 4H), 3.71 (s, 2H),
    [0256] 3.72 (q, J=6. OHz, 2H)， 3, 80 (s, 3H),
    [0257] 413(t, J=5.2Hz, 2H), a 86, 7.22(AA' BB' pattern, Jort o =8.7) 7.31(br. t like, 1H).
    [0258] F A B 質量 分 析 ： 348. 1 ( M + H+ ) ( C4H21NO5S2 ： 34Ί 1 に 関 し て 算 出 ）
    [0259] 1 - 6 ： 化 合 物 VI ( リ ン カ 一 ） の 合 成
    [0260] 0
    [0261] ハ II ハ
    [0262] CH, 0-^ -CH2 -S-CH2 -C-NH-CH2 -CII2 -S-CH2 -CH2 一 O - C— 0 - 、〉一 NO:
    [0263] 0 0
    [0264] ί匕 ¾J VI ： N_[S—（p—メ [·キシへ * ンシ ' ル）チォク * リコリル]アミノエチルスルフォ二ルェチ ル p—二ト ϋフエニルカル *♦ ネート 化 合 物 V ( 4. 00 g、 11. 5 m in o 1 ) を 無 水 ピ リ
    [0265] ジ ン （ 3 0 m l ) に 溶 か し、 氷 冷 下 に ノ、' ラ ニ ト ロ フ エ ニ ル
    [0266] ク ロ ロ フ オ ル メ ー ト （ 2. 32 g、 11. 5 m m 0 1 ) を
    [0267] 加 え 4 時 問撹拌 し た。 ピ リ ジ ン を 滅 圧 留 去 し、 油 状 残 渣 に 1 規 定 塩 酸 （ 5 0 m l ) と ジ ェ チ ル ェ 一 テ ル を 加 え て 結 晶 チ ル Z ジ ェ チ ル エ ー テ ル で 再 結 晶 し、 白 色 結 晶 4. 07 g ( 収 率 6 9 % ) を 得 た。
    [0268] な お、 得 ら れ た 化 合 物 VI ( リ ン カ 一 ） の 分 析 値 は 以 下 の 通 り で あ っ た。
    [0269] R f2 = 0. 3 7
    [0270] 融 点 8 1 〜 8 2
    [0271] C21H24 2O9S2 に 関 す る 理 論 値 ：
    [0272] C = 49. 21 ； H = 4. 72 ； N = 5. 47
    [0273] 実 測 値 ：
    [0274] C = 49. 30 ； H = 4. 72 ； N = 5. 25
    [0275] NMR (CDC 13 )： 53.13 (s, 2H),
    [0276] 3.28 (t, J=6. OHz, 2H)， 3.47 (t, J=5.7Hz, 2H),
    [0277] 3.75 (q, J=6. OHz, 2H), 3.79 (s, 3H),
    [0278] 4.74(t,J=5.7Hz,2H),
    [0279] 6.84, 7.20 (ΑΑ' BB" pattern, Jortno =8.7)
    [0280] 7.25(111, 111),
    [0281] 7.40, 8.28 (ΑΑ' BB' pattern, Jortho =9.3).
    [0282] F A B 質量 分 析 ： 513. 2 ( M + H+ )
    [0283] ( C21H24N209S2 ： 5 12. 1 に 関 し て 算 出 ）
    [0284] 実 施 例 2 リ ン カ 一 の 合 成 （ B )
    [0285] 第 4 図 に 従 い、 別 法 に よ り リ ン カ 一を 合 成 し た。
    [0286] 2 - 1 ： 化 合 物 VII の 合 成 0
    [0287] ^ II
    [0288] CH, 0-Q>-CH2 O-C-NHCHa CH2 B r ί匕 ^ VII ： N—（p—；！トキシへ♦ ンシ * ル才キシカルホ * ニル） アミノエチルフ * ロマイ Γ
    [0289] 2 — ブ ロ モ ェ チ ル ア ミ ン 臭 化水 素塩 （ 100. O g、 0. 4 9 m 0 1 ) を テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン （ T H F ) 5 0 0 m l に 溶 解 し、 こ れ に 氷 冷 下 ノヽ' ラ メ ト キ シ ベ ン ジ ル ア ジ ド ホ ル メ ー ト （ 111. 2 g、 0. 54 m 0 1 ) と ト リ エ チ ル ァ
    [0290] ミ ン （ 148. 9 m l、 1. 07 m o l ) を 加 え、 1 0 時 間 撹 拌 し た。 生 成 す る 塩 （ ト リ ヱ チ ル ァ ミ ン の 臭化 水 素 塩 ） を 逋 去 し た。 更 に、 こ の 塩 を 少量 の T H F で 洗 浄 し、 涵 液 と 合 わ せ た。 T H F を 滅 圧 留 去 し た。 残 渣 を 醉 酸 ェ チ ル に 溶 か し、 分 液 ロ ー ト に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 層 を 5 % ク ェ ン 酸 で 3 度 洗 い、 更 に 飽 和 食 塩 水 で 3 度 洗 っ た。 酢 酸 ェ チ ル 層 を マ イ ヤ ー フ ラ ス コ に 移 し、 酢酸 ェ チ ル 溶 液 を 無水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム で 乾 燥 し た。 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を 濾 去 し， 酢 酸 ェ チ ル を 滅圧 留 去 し た。 残 渣 に n — へ キ サ ン を 加 え、 結 晶 化 し た。 酢酸 ェ チ ル / n — へ キ サ ン よ り 再 結晶 し、 白 色 結 晶 102. 5 g ( 収 率 7 3 % ) を 得 た。 な お、 得 ら れ た 化 合 物 VB の 分 析 値 は 以 下 の 通 り で あ っ た。
    [0291] R f4 = 0. 3
    [0292] 融 点 44. 5 ~ 45. 5
    [0293] CnHi4N03Br に 関 す る 理 論 値 ：
    [0294] C = 45. 85 ； II = 4. 90 ； N = 4. 86 実 測 値 ： C = 45. 59 ； H = 4. 84 ; N = 4. 80
    [0295] 2 - 2 ： 化 合 物 Π の 合 成
    [0296] 上 記 で 得 た 化 合 物 VII ( 1 0 0 g, 0. 35 m o 1 ) と |3 — メ ル カ ブ ト エ タ ノ ー ル （ 25. 0 m 1、 0. 35 m o 1 ) を ジ メ チ ル フ オ ル ム ア ミ ド （ D M F ) 7 0 0 m 1 に 溶 か し、 氷 冷 下 に ジ シ ク ロ へ キ シ ル ァ ミ ン （ 7 0 m l、 0. 35 m o 1 ) を く .わ え、 室 温 に て 4 時 間 撹 拌 し た。 生 成 す る 塩 ( ジ シ ク ロ へ キ シ ル ァ ミ ン の 臭 化 水 素 塩 ） を 據 去 し た。 こ の 塩 を 少量 の D M F で 洗 浄 し 據 液 と 合 わ せ た。 D M F を 減 圧 留 去 し た。 残 渣 を 酢 酸 ェ チ ル に 溶 か し、 分 液 ロ ー ト に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 層 を 5 % ク ェ ン 酸 で 3 度 洗 い、 さ ら に 飽 和 食 塩 水 で 3 度 洗 っ た。 酢 酸 ェ チ ル 層 を マ イ ヤ ー フ ラ ス コ に 移 し、 舴酸ェ チ ル 溶 液 を 無 水 硫酸 ナ ト リ ゥ ム で 乾燥 し た。 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を ¾ 去 し、 酢 酸 ェ チ ル を 滅圧 留 去 し た。 残 渣 に n —へ キ サ ン を 加 え て、 結 晶 化 し た。 さ ら に 酢 酸 ェ チ ル Z n — へ キ サ ン で 再 結 晶 化 し、 白 色 結 晶 90. 5 g
    [0297] ( 収 率 9 1 % ) を 得 た。 な お、 得 ら れ た 化 合 物 II の 融 点 は 4 1 ~ 41. 5で で あ っ た。
    [0298] 2 - 3 ： 化 合 物 VI ( リ ン カ 一 ） の 合 成
    [0299] 上 記 で 得 た 化 合 物 Π を 用 い て、 上 記 1 一 3 と 同 様 に し て、 化 合 物 m を 合 成 し、 次 い で 上 記 1 一 5 と 同 様 に し て、 化 合 物 V を 合 成 し、 さ ら に 上 記 1 一 6 と 同 様 に し て 化 合 物 V】
    [0300] ( リ ン カ 一 ） を 合 成 し た。
    [0301] 実 施 ¾ 3 リ ン カ 一 の 合 成 （ C ) 第 5 図 に 従 い、 リ ン カ 一 を 合成 し た。
    [0302] 3 — 1 ： 化 合 物 VM の 合 成
    [0303] CH,
    [0304] CHョ一 C一 0— C一 NHCH2 CH2 Br
    [0305] I II CH3 0 ί匕 合 物 VI ： Ν—（tーフ♦ チルォキシカルホ， ニル）アミノエチルフ ' 口マイ Γ
    [0306] ブ ロ モ ェ チ ル ア ミ ン 臭 化 水 素塩 （ 1 O g、 4 9 m m o 1 ) を D M F l O O m l に 溶 か し、 氷 冷 下、 ジ 一 t ー ブ チ ル ジ カ ル ボ ネ ー ト （ （ B o c ) 20 ) ( 11. 8 g、 5 4 m m o 1、 1. 1当 量 ） と ト リ エ チ ル ァ ミ ン （ 10. 3 m l、 7
    [0307] 4 m m o 1、 1. 5当 量 ） を 加 え 室 温 に て 2 時 間 撹拌 し た。 生 成 す る 塩 （ ト リ ェ チ ル ァ ミ ン の 臭 化 水 素 塩 ） を 逋 去 し、 こ の 塩 を D M F で 洗 浄 し 逋 液 と 合 わ せ た。 R f 2 = 0. 9 0
    [0308] 3 — 2 : 化 合 物 K の 合 成
    [0309] CH,
    [0310] CH3 -C-O-C-NHCH2 CH2 SCH2 CH2 OH
    [0311] I II CH, 0 ィ匕 ^ !! ¾ Di ： 2N_ (t-フ* チルォキシカルホ * ニル）アミノエチル， 2' -Λイト * 口キシェチルスル フ '
    [0312] 3 — 1 で 得 た 化 合 物 VI ( 4 9 m m o l ) の D M F 溶 液 ( 逋 液 + 洗 浄 液 ） に 0 — メ ル カ ブ 卜 エ タ ノ ー ル （ 3. 5 m . 1 ) を 加 え、 氷 冷 下 に ジ シ ク ロ へ キ シ ル ァ ミ ン （ 9. 8 in 1、 4 9 m m o l ) を 加 え 室 温 に て 2 0 時 間 撹 拌 し た。 生 成 す る 塩 （ ジ シ ク ロ へ キ シ ル ァ ミ ン の 臭 化 水 素 塩 ） を 濾 去 し、 こ の 塩 を D M F で 洗 浄 し 逋 液 と 合 わ せ た。 D M F を 減 圧 留 ま し た。 残 渣 を 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 と し、 5 % ク ェ ン 酸 で 3 度 洗 い、 さ ら に 飽 和 食 塩 水 で 3 度 洗 浄 し た。 酢酸 ェ チ ル 溶 液 を 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム で 乾燥 し、 さ ら に 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を 據 去 し た 後、 舴 酸 ェ チ ル を 減 圧 留 去 し、 無 色 油 状 物 と し て 化 合 物 K を 得 た。
    [0313] 3 — 3 ： 化 物 X の 合 成
    [0314] CH, 0
    [0315] I II CH3 -C-O-C-NH-CH2 CH2 SCH2 CH2 OH
    [0316] I II II CH3 o 0
    [0317] 化 合 物 X ： fi (t-7*チル才キシカルホ'ニル）アミノエチルスルフ ίニルエタノール （ ¾J状 物 ）
    [0318] 3 — 2 で 得 た 化 合 物 K ( 4 9 m m o 1 ) を そ の ま ま メ タ ノ ー ル （ 8 5 m 1 ) に 溶 か し、 水 （ 4 0 m 1 ) を 加 え、 夕 ン グ ス テ ン 酸 ナ ト リ ウ ム （ 4 9 m g ) を 加 え、 撹 拌 し な 力； ら、 過 酸 化 水 素 水 （ 11. 3 πι 1 ) を 滴 下 し た。 反 応 は 発 熱 反 応 な の で 温 度 を 6 0 で 以 下 に 制 御 し た。 1. 5時 間 攛 拌 後 過 剰 の 過 酸 化 水 素 水 を 分 解 す る た め に、 5 % パ ラ ジ ゥ ム Z炭 素 （ 0. 38 g ) を 加 え 発 泡 が 終 了 す る ま で 撹 拌 し た。 5 % パ ラ ジ ウ ム / 炭 素 を 濾去 後 溶 媒 を 滅 圧 留 去 し、 汕 状 残 渣 を 酢酸 ェ チ ル 溶 液 と し、 5 % ク ェ ン 酸 で 3 回、 5 % 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム で 1 回、 さ ら に 飽 和 食 塩 水 で 3 回 洗 つ た。 次 い で 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を マ イ ヤ ー フ ラ ス コ に 移 し、 酢 酸 ェ チ ル 溶 液 を 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム で 乾 燥 し た。 無 水 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を 據去 し た 後、 酢酸ェ チ ル を 滅圧留去 し、 無色 油状物 と し て 化合物 X 11. 79 g を 得 た b
    [0319] 3 — 4 : 化合物 XIの 合成
    [0320] 0
    [0321] HC 1 ·ΝΗ2 CH2 CH2 S— CH2 CH2 OH
    [0322] II
    [0323] 0 ί匕 ^ 1^ X1 = .ァミノェチルスルフォニルエタノール ' ]^ ¾
    [0324] 3 — 3 で 得 た 化 合物 X ( 4 9 m m o 1 ) に 4 N — H C 1 Z ジ ォ キ サ ン （ 4 0 m l ) を 加え 3 0 分間攪拌処理 し た。 生ず る 結晶 を ¾取 し、 エ ー テ ルで 洗浄 し た。 そ の後結晶 を 真空下乾燥 し た。 な お得 ら れ る 結晶 （ 化合物 XI ) は 6. 6 g ( 3 5 m m o l ) 、 収率 は 7 1 % で あ っ た。
    [0325] R f 5 = 0. 45
    [0326] 融点 2 5 5 で
    [0327] C4Hi2N03SCli2 に 関 す る 理論値 ：
    [0328] C = 25. 33 ； H = 6. 38 ； N = 7. 39 実測値 ：
    [0329] C = 25. 24 ； H = 6. 50 ； N = 7. 43
    [0330] 3 — 5 : 化合物 V の 合 成 上記工程で 得 ら れ た 化合物 XIを 用 い て、 前述 の 1 一 5 と 同 様 の反応操作 を 行 い 化合物 V を 合成 し た。
    [0331] 3 - 6 ： 化合物 VI ( リ ン カ 一 ） の 合 成 上記 で 得 た ί匕合物 V を 用 い て、 上記 1 一 6 と 同様 に し て 化 合物 VI ( リ ン .カ ー ） を 合成 し た。 窭 旆 例 4 リ ン カ 一結 合 用 樹 脂 の 合 成
    [0332] ョ ー ト' 酢 酸 樹 脂 の 合 成
    [0333] ョ ー ド 酔酸 （ 7. 4 g, 4 0 m m o 1 ) の 塩 化 メ チ レ ン 溶 液 （ 5 0 m l ) に ジ シ ク ロ へ キ シ ル カ ル ポ ジ ィ ミ ド （ 5 S, 0. 6eq) を 加 え 氷 冷 下 3 0 分 攪 拌 し た。 生 ず る 沈 濺
    [0334] ( ジ シ ク ロ へ キ シ ル ゥ レ ア ） を 濾 去 し、 逋 液 を エ チ レ ン ジ ア ミ ン で 処理 を 行 い、 末 端 に ア ミ ノ エ チ ル 基 が 導 入 さ れ た PepSyn K resin ( ミ リ ポ ア 社 製 キ ー ゼ ル グ ー ル 系 樹 脂 ： ジ メ チ ル ア ク リ ル ア ミ ド ー ビ ス ァ ク ロ イ ル エ チ レ ン ジ ア ミ ン ー ァ ク リ ロ イ ル ザ ル コ シ ン メ チ ル エ ス テ ル 共 重 合 体 が キ ー ゼ ル グ ー ル 支 持 担 体 に 保 持 さ れ た も の ） （ 2 0 g， ア ミ ノ 基 含 量 0. 2 m m o l Z g ) に 加 え、 カ イ ザ ー [ Kaiser
    [0335] ] 試 験 が 陰 性 に な る ま で 緩 や か に 振 盪 し た （ 2 時 間 ） 。 次 い で、 樹 脂 を ジ メ チ ル フ オ ル ム ア ミ ド と 塩 化 メ チ レ ン で よ く 洗 浄 し、 真 空 乾 燥 し た。
    [0336] 実 施 例 5 合 成 ペ プ チ ド の 精 製 （ 1 )
    [0337] 本 発 明 に 関 わ る 合 成 ペ プ チ ド の 精 製 法 の 有 用 性 を 検 討 す る た め に、 ペ プ チ ド と し て ポ リ フ エ ム シ ン Π を 合 成 し、 こ の 精 製 を 試 み た。
    [0338] ま ず、 第 1 図 に 従 い F m o c 固 相 合 成 法 に よ り ポ リ フ エ ム シ ン Π を 樹 脂 上 に て 合 成 し、 さ ら に そ の 精 製 を お こ な つ た。 ポ リ フ エ ム シ ン II は 分 子 内 に 2 個 の ジ ス ノレ フ ィ ド 結 合 を 有 す る C 末 端 が ア ミ ド 化 さ れ た ア ミ ノ 酸 1 8 残 基 力 ら な る ペ プ チ ド で あ る。 な お、 合 成 に は 分 子 内 に 存在 す る シ ス テ ィ ン 残 基 の チ オ ー ル 基 は ァ セ ト ア ミ ド メ チ ル （ A cm ) で 保 護 し た ア ミ ノ 酸 誘 導 体 を 用 い た。
    [0339] H - Arg- Arg -Trp - Cys ( Acm) -Phe- Ar g- Va l -
    [0340] Cys ( Acm -Ty r - Ly s -G l y -Phe -Cy s ( Acm) -
    [0341] Ty r- Arg -Lys -Cys k Acm) - Arg - N H 2
    [0342] 合 成 の 最終 段 階 で、 固 相 樹 脂 （ 0. 2 m m o l ) に、 上 記 実 施 例 1 に お い て 調 製 し た リ ン カ 一 （ 5 1 2 m g、 5 当 量 ） と N — ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ア ゾ 一 ル （ 1 5 2 m g、 5 当 量 ） を 加 え、 ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド （ 1 0 m l ) 中 に て 2 時 間 撹拌 し、 樹 脂 上 に 合 成 さ れ た ポ リ フ ヱ ム シ ン の N 末 端 側 に リ ン カ 一 を 導 入 し た。 次 い で、 固 相 樹脂 （ 1 0 0 m g ) を エ タ ン ジ チ オ ー ル （ 0. 2 m l ) 、 m — ク レ ゾ — ル （ 0. 5 m 1 ) 存 在 下、 1 M 卜 リ メ チ ル シ リ ル プ ロ ミ ド （ T M S B r ) — チ オ ア 二 ソ 一 ル / ト リ フ ル ォ ロ 酢 酸 ( T F A ) 系 [ N. F u j i i , A . Otaka, N. Sug i yama, M . Ha t a n 0 , and H . Y a j i m a , Ch em, Pharm . Bu l l . , 35 , 3880〗（ 1 0 m 1 ) に て、 0 で 2 時 間 脱保 護 基 処 理 を 行 っ た。 脱 保 護 基 反 応 後、 T M S B r お よ び T F A を 蒸 発 さ せ、 そ し て ジ ェ チ ル エ ー テ ル を 加 え て ペ プ チ ド を 粉 末 状 と し た。 得 ら れ た 粉 末 を 6 M 塩 酸 グ ァ ニ ジ ン 含 有 0. 4 M ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 （ P H 7. 5 ) に 溶 解 し、 上 記 実 施 例 4 に お い て 得 ら れ た ョ 一 ド 酢 酸 樹 脂 1 当 量 を 充填 し た 反 応 用 容 器 に 導 入 し、 2 時 間 循 環 さ せ た。 次 い で、 樹脂 に 対 し 1 当 量 の 2 — メ ル 力 ブ ト エ タ ノ ー ル を 加 え て 2 時間 処 理 し、 過 剰 の ョ ー ド 酢 樹 脂 を 6 M塩 酸 グ ァ ニ ジ ン 含 有 0. 4 M ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 ( P H 7. 5 ) 、 5, 0 % 酢 酸、 お よ び 水 で よ く 洗 浄 し た。 以 上 の よ う に し て 得 ら れ た ペ プ チ ド 結 合 樹 脂 を、 5 % ア ン モ ニ ァ 溶 液 で 3 0 分 間 処 理 す る こ と に よ り、 ぺ プ チ ド を 樹 脂 よ り 切 断 し、 さ ら に 5 0 % 酢 酸 に て 樹 脂 を 洗 浄 し、 洗 液 を 切 断 す る た め の 試 薬 液 に 合 わ せ た。 得 ら れ た 液 体 を 凍 結 乾 燥 し て、 .ペ プ チ ド 粉 末 14. 2 m g を 得 た。 こ の べ プ チ ド 粉 末 を 高速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ H P L C ) を 用 レ、 て 分 析 し た と こ ろ、 単 一 ビ ー ク を 示 す も の で あ っ た （ 純 度 ： > 9 9 % ) 。
    [0343] 固 相 法 に よ る 合 成 直 後 の 粗 べ プ チ ド の II P L C に お け る ポ リ フ エ ム シ ン Π の 純 度 は 約 6 9 % で あ り、 メ イ ン ピ ー ク の 前 に は シ ョ ル ダ ー ピ ー ク も 認 め ら れ る。 し か し な が ら、 本 発 明 に 関 わ る 精 製 法 に よ っ て 得 ら れ た 精 製 ペ プ チ ド は 単 一ピ ー ク を 有 す る も の で あ っ た。 ま た 精 製 ペ プ チ ド は ア ミ ノ 酸 配 列 分 析 お よ び 質 量 分 析 [ A c m -ボ リ フ ユ ム シ ン H ： 2 714. 1 ( M + H+ ) ] の 結 果， 理 論 値 と 一 致 す る 値 を
    [0344] 7J し /こ。 ( し 120 H, 85 N4！ 024 S4 に 関 し て 算 出 し た。 ） 卖 施 例 6 合 成 べ プ チ 卜' の 精 製 （ 2 )
    [0345] 次 い で、 本 発 明 に 関 わ る 合 成 ぺ ブ チ ド の 精 製 法 の 有 用 性 を、 中 程 度 の 長 さ を 有 す る ペ プ チ ド で あ る ヒ ト コ レ シ ス ト キ ニ ン の 合 成 に お い て 試 み た。
    [0346] ま ず、 実施 例 5 の 場 合 と 同 様 に ^ 〗 「 1 に 従 レ、 I'' in υ c [A] 相 合 成 法 に よ り 3 3 残 基 の ペ プ チ ド ア ミ ド で あ る ヒ 卜 コ レ 相 合 成 法 に よ り 3 3 残 基 の ペ プ チ ド ア ミ ド で あ る ヒ ト コ レ シ ス ト キ ニ ン を 合 成 し た。
    [0347] H-Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg- et-Ser- Ile— Val一 Lys一 Λ-sn一 teu一 G上 n_Asn一 Leu一 Asp一
    [0348] Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp- Tyr-Met-Gly-Trp- et-Asp-Phe-NH2
    [0349] 合 成 の 最終 段 階 で、 固 相 樹 脂 （ 0. 2 m m 0 l ) に、 上 記 実 施 例 1 に お い て 調 製 し た リ ン カ 一 （ 5 1 2 m g、 5 当 量 ） と N — ヒ ド ロ キ シ ベ ン ゾ ト リ ア ゾ ー ル （ 1 5 2 m g、 5 当 量 ） を 加 え、 ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド （ 1 O m l ) 中 に て 2 時 間 撹拌 し、 樹 脂 上 に 合 成 さ れ た ヒ ト コ レ シ ス ト キ ニ ン の N 末 端 に リ ン カ 一 を 導 入 し た。 次 い で、 固 相 樹 脂 （ 1 O O m g ) を エ タ ン ジ チ オ ー ル （ 0. 2 m l ) 、 m — ク レ ゾ ー ノレ （ 0. 5m l ) 存 在 下、 1 M T M S B r — チ オ ア 二 ソ ー ル Z ト リ フ ル ォ ロ 酢 酸 （ T F A ) 系 （ 1 0 m l ) に て、 0 で 2 時 間 脱 保 護 基 処 理 を 行 っ た。 脱 保 護基 反 応 後、 T M S B r お よ び T F A を 蒸 発 さ せ、 そ し て ジ ェ チ ル エ ー テ ル を 加 え て べ ブ チ ド を 粉 末 状 と し た。 得 ら れ た 粉 末 を 6 M 塩 酸 グ ァ ニ ジ ン 含 有 0. 4 M ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 （ p II 7. 5 ) に 溶 解 し、 上 記 実 施 例 4 に お い て 得 ら れ た ョ ー ド 酢 酸 樹 脂 1 当 量 を 充 填 し た 反 応 用 容 器 に 導 入 し、 2 間 循 環 さ せ た。 次 い で、 樹 脂 に 対 し 1 当 量 の 2 — メ ル カ プ 卜 ェ タ ノ. ー ル を 加 え て 2 時 間 処 理 し、 過剰 の ョ ー ド 酢 酸 を 不 活 性 化 し た。 2 時間 後 反 応 用 容 器 よ り 溶 液 を 滹 去 し、 樹 脂 を 6 M 5 ) 、 5. 0 % 舴 酸、 お よ び 水 で よ く 洗 浄 し た。 以上 の よ う に し て 得 ら れ た ペ プ チ ド 結 合 樹 脂 を、 5 % ア ン モ ニ ア 溶 液 で 3 0 分 間 処 理 す る こ と に よ り、 樹 脂 よ り ペ プ チ ド を 切 断 し、 さ ら に 5 0 % 酢 酸 に て 樹 脂 を 洗 浄 し、 洗 液 を 切 断 す る た め の 試 薬 液 に 合 わ せ た。 得 ら れ た 液 体 を 凍 結乾 燥 し て、 ぺ ブ チ ド 粉 末 7. 9 m g を 得 た。 こ の べ プ チ ド 粉 末 を 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ H P L C ) を 用 い て 分 析 し た と こ ろ、 ほ ぼ単 一 ピ ー ク を 示 す も の で あ っ た （ 純 度 ： 9 0 % 以 上 ） 。 尚、 固 相 法 に よ る 合 成 直 後 の 粗 ペ プ チ ド の H P L C に お け る ビ ー ク よ り 算 出 し た 非 硫 酸 型 コ レ シ ス ト キ ニ ン の 純 度 は 2 9 % で あ っ た。 本 法 に よ っ て 精 製 さ れ た 非 硫 酸 型 ヒ ト コ レ シ ス ト キ ニ ン の H P L C 保 持 時 間 は、 H P L C 精 製 法 に よ る も の と 一 致 し た。 さ ら に 得 ら れ た 精 製 べ プ チ ド は ア ミ ノ 酸 配 列 分 析 お よ び 質 量 分 析 [ 3865. 2 ( M
    [0350] + H+ ) ] の 結 果、 理 論 値 と 一 致 す る 値 を 示 し た。 （ d 6 7H263N51049S3 に 関 し て 算 出 し た。 ）
    [0351] 荬 旆 例 7 合 成 ペ プ チ ド の 精 製 （ 3 )
    [0352] さ ら に、 本 発 明 に 関 わ る 合 成 ペ プ チ ド の 精 製 法 の 有 用 性 を、 中 程 度 の 長 さ を 有 す る 別 の ペ プ チ ド で あ る ヒ 卜 成 長 ホ ル モ ン 分 泌 因 子 の 合 成 に お い て 試 み た。
    [0353] ま ず、 実 施 例 5 の 場 合 と 同 様 に 第 1 図 に 従 い F m o c 固 相 合 成 法 に よ り 4 4 残 基 の ペ プ チ ド ア ミ ド で あ る ヒ ト 成 長 ホ ル モ ン 分 泌 因 子 を 合 成 し た。
    [0354] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- Ser - Tyr - Arg - tys - Val -し eu - Gly uln-Leu- Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln Asp-Ile-
    [0355] Met- Ser-Arg- Gin - Gin - G 1 y - G 1 u - aer-Asn- Gl n- Glu-Arg- Gly-Ala- Ar g - A 1 a - Arg-Leu- NH2
    [0356] 合 成 の 最終 段 階 で、 固 相 樹 脂 （ 0. 2 m m o 1 ) に、 上 記 実 施 例 1 に お い て 調 製 し た リ ン カ ー （ 5 1 2 m g, 5 当 量 ） と 一.ヒ ド 口 キ シ べ ン ゾ ト リ ァ ゾ ー ル ( 1 5 2 m g、 5 当 量 ) を 加 え、 ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド （ 1 0 m l ) 中 に て 2 時 間 撹拌 し、 樹 脂 上 に 合 成 さ れ た ヒ ト 成 長 ホ ル モ ン 分 泌 因 子 の N 末 端 に リ ン カ一を 導入 し た。 次 い で、 固 相 樹 脂 ( 1 0 0 m g ) を ェ タ ン ジ チ ォ一ル （ 0. 2 m l ) , πι ― ク レ ゾ ー ル （ 0. 5 m l ) 存在下、 1 M T M S B r - チ オ ア 二 ソ 一 ル T F A 系 ( 1 0 m 1 ) に て， 0 で で 2 時 間 脱 保 n 基 処理 を 行 つ た。 脱 保 護基 反 応 後、 T M S B r お よ び T F A を 蒸 発 さ せ、 そ し て ジ ェ チ ル エ ー テ ル を 加 え て べ プ チ ド を 粉 末 状 と し た。 得 ら れ た 粉 末 を 6 M 塩 酸 グ ァ ニ ジ ン 含 有 0. 4 M ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 （ P H 7. 5 ) に 溶 解 し， 上 記 実 施 例 4 に お い て 得 ら れ た ョ 一 ド 酢 酸 樹 脂 1 当 量 を 充 填 し た 反 応 用 容 器 に 導 入 し、 2 時 間 循 環 さ せ た。 次 い で、 樹 脂 に 対 し 1 当 量 の 2 — メ ル カ プ ト ェ タ ノ 一ル を 加 え て 2 時 閭 処 理 し、 過 剰 の ョ 一 ド 酢 酸 を キ ヤ ツ ビ ン グ し た < 2 時 間 後 反 応 用 容 器 よ り 溶 液 を 據 去 し 樹 脂 を 6 M 塩酸 グ ァ ニ ジ ン 含 有 0. 4 M ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 ( Π 7. 5 )、 5.
    [0357] 0 % 酢 酸、 お よ び 水 で よ く 洗 浄 し た。 以 上 の よ う に し て 得 ら れ た ペ プ チ ド 結 合 樹 脂 を、 5 % ア ン モ ニ ア 溶 液 で 3 0 分 間 処 理 す る こ と に よ り、 ペ プ チ ド を 樹 脂 よ り 切 断 し、 さ ら に 5 0 % 酢 酸 に て 樹 脂 を 洗 浄 し、 洗 液 を 切 り 出 し 液 に 合 わ せ た。 得 ら れ た 液 体 を 凍 結 乾 燥 し て、 ペ プ チ ド 粉 末 12. 6 m g を 得 た。 こ の ペ プ チ ド 粉 末 を 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ H P L C ) を 用 い て 分 析 し た と こ ろ、 ほ ぼ 単 一 ピ ー ク を 示 す も の で あ っ た （ 純 度 ： 8 0 % 以 上 ） 。 固 相 法 に よ る 合 成 直 後 の 粗 ペ プ チ ド の H P L C に お け る ピ ー ク よ り 算 出 し た ヒ ト 成 長 ホ ル モ ン 分 泌因 子 の 純 度 は 5 1 % で あ つ た。 本 法 に よ っ て 精 製 さ れ た ヒ ト 成 長 ホ ル モ ン 分 泌 因 子 の H P L C 保持 時 間 は、 H P L C 精 製 法 に よ る も の と 一 致 し た。 さ ら に 得 ら れ た 精 製 ペ プ チ ド は ア ミ ノ 酸 配 列 分 析 お よ び 質量 分 析 [ 5037. 8 ( M + H+ ) ] の 結 果、 理 論 値 と 一 致 す る 値 を 示 し た。 （ C215H358N72066Sに 関 し て
    [0358] 算 出 し た。 ）
    [0359] な お、 上 記 の 実 施 例 に お け る 分 析 に 使 用 し た 機 器、 試 薬 等 は 以 下 の と お り で あ る。
    [0360] 蒲 相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
    [0361] 担 体 ： シ リ カ ゲ ル G ( Kiesel -gel G, 西 独 メ ル ク 社 製 ） 溶 媒 系 ：
    [0362] R f 1 ： CHC13 - eOH- H20 ( 8 : 3 : 1 ) の 下 層
    [0363] R f2 ： CHCl 3 -MeOH ( 10 : 0. 5 )
    [0364] R f 3 ： CHC13 - AcOH ( 19 : 1 )
    [0365] R f 4 ： CHC 13 -Cyc 1 ohexan e ( 2 : 1 ) R f 5 ： n - BuOH - AcOH - Pyridine - H 2O ( 4 : 1 : 1 : 2)
    [0366] 核 磁 気 共 鳴 ス ぺ ク ト ル
    [0367] テ ト ラ メ チ ル シ ラ ン を 内 部 標 準 と し、 Bruker AC- 300 ス ぺ ク ト ル メ ー タ 一 （ ブ ル 力 一 社 製 ） を 用 い た。
    [0368] F A B 質 量分 析
    [0369] Z A B S E マ ス ス ペ ク ト ル メ ー タ ー （ ユ ー ジ ー ア ナ リ テ イ カ ル 社 製 ） を 用 い た。
    [0370] ぺ プ チ ト' の 純 度 検 定
    [0371] 1 ) 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ （ H P L C )
    [0372] 高 速液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一モ デ ル 6 0 0 E
    [0373] ( ミ リ ボ ア 社 製 ） を 用 い た。
    [0374] 分 析 は w Bondasphere 5 C 1 8 カ ラ ム （ ミ リ ポ ア 社 製 ） を 用 い、 0. 1 % ト リ フ ル ォ ロ 酢酸 を 含 む 水一 ァ セ ト ニ ト リ ル 系 に よ り 行 な っ た。
    [0375] 2 ) ペ プ チ ド の ア ミ ノ 酸 S列 分 析
    [0376] ペ プ チ ド シ ー ケ ン サ 一 モ デ ル 4 3 1 A ( ア プ ラ イ ド ノ イ ォ シ ス テ ム ズ 社 製 ） 及 び プ ロ テ イ ン シ ー ケ ン サ 一モ デ ル 6 6 0 0 ( ミ リ ポ ア 社 製 ） を 用 い た。 モ デ ル べ プ チ ド の 合 成
    [0377] 自 動 ペ プ チ ド 合 成 機 モ デ ル 9 0 5 0 ( ミ リ ポ ア 社製 ） を ffl レゝ、 F m o c 固 相 合 成 法 に よ り 合 成 し た。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1 . 固 相 法 に よ る ぺ ブ チ ド 合 成 に お い て 得 ら れ る 末 端 基 に ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成熟 ぺ ブ チ ド お よ び ェ ン ド キ ャ ッ ビ ン グ さ れ た 目 的 以 外 の 未 成 熟 べ プ チ ド が 混 在 す る 系 か ら、 末 端 に 官 能 基 を 有 す る リ ン カ ー を 用 い て 前 記 成 熟 べ プ チ ド を 化学 選 択 的 に 固 相 担 体 に 固 定 化 · 分 離 す る こ と を 特 徴 と す る 合 成 べ プ チ ド の 精 製 法。
    2 . a ) 固 相 法 に よ る ペ プ チ ド 合 成 に お け る 最 後 の ア ミ ノ 酸 を 導 入 し た 後、 末 端 に ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 べ プ チ ド お よ び ェ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ さ れ た 目 的 以 外 の 未 成 熟 ぺ ブ チ ド の 双 方 が 結 合 し て い る 固 相 に 対 し、
    一 端 部 に、 前 記 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 と、 ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス の 後 処 理 工 程 に お い て 酸 性 条 件 下 で 行 わ れ る 脱 保 護 基 反 応 に 安 定 で か つ あ る 他 の 条 件 で 特 異 的 に 切 断 可 能 な 結 合 を な す 官 能 基 を 有 し、 さ ら に 他 端 部 に 前 記 脱 保 護 反 応 に よ り 活 性 な 官 能 基 を 生 成 し 得 る リ ン カ 一 を 添 加 し て 前 記 成 熟 べ プ チ ド を 選 択 的 に 修 飾 し、
    b ) 次 い で べ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お け る 最 終 的 な 前 記 脱 保 護 基 反 応 を 行 い、 こ れ に よ り 成 熟 ペ プ チ ド お よ び 未 成 熟 ペ プ チ ド を 固 相 よ り 解 離 し、
    c ) 前 記最 終 的 な 脱 保 護 基 反 応 に よ っ て 生 成 し た リ ン カ 一 の 前 記 他 端 部 の 官 能 基 と 反 応 し て 安 定 な 結 合 を 形 成 す る 官 能 基 を 有 す る 化 合 物 を 固 定 化保 持 す る 別 の 固 相 を、 前 記 b ) 段 階 に お い て 得 ら れ た ペ プ チ ド 混 合 物 と 接 触 さ せ て、 該 固 相 に 成熟 べ プ チ ド を リ ン カ ー を 介 し て 選 択 的 に 固 定 し、 d ) さ ら に、 前 記 c ) 段 階 に お い て 得 ら れ た 成熟 ぺ ブ チ ド を 固 定 し た 固 相 を、 リ ン カ 一 と 成 熟 ペ プ チ ド と の 結 合 を 特 異 的 に 切 断 す る 前 記 他 の 条 件 に 曝 し、 成 熟 べ プ チ ド を リ ン カ ー 結 合 固 相 よ り 切 断 す る
    操 作 を 含 ん で い る こ と を 特 徴 と す る 請 求 の 範 囲 第 1 項 に 記 載 の 合 成 べ プ チ ド 精 製 方 法。
    3 . a ) 固 相 法 に よ る ペ プ チ ド 合 成 に お け る 最後 の ア ミ ノ 酸 を 導入 し た 後、 末端 に ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 べ プ チ ド お よ び ェ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ さ れ た 目 的 以 外 の 未 成 熟 ぺ ブ チ ド の 双 方 が 結 合 し て い る 固 相 に 対 し、
    一 端 部 に、 前 記 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 と、 ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お い て 酸 性 条 件下 で 行 わ れ る 脱 保 護基 反 応 に 安 定 で か つ あ る ア ル カ リ 性 条 件 下 で 特 異 的 に 切 断 可能 な 結 合 を な す 官 能基 を 有 し、 さ ら に 他端 部 に 前 記 脱 保 護 反 応 に よ り S H 基 を 生 成 し 得 る リ ン カ 一 を 添 加 し て 前 記 成熟 べ プ チ ド を 選 択 的 に 修 飾 し、
    b ) 次 い で べ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お け る 最 終 的 な 前 記 脱 保 護 基 反 応 を 行 い、 こ れ に よ り 成熟 ペ プ チ ド お よ び 未 成 熟 ペ プ チ ド を 固 相 よ り 解 離 し、
    c ) 前 記 最 終 的 な 脱 保 護 基 反応 に よ っ て 生 成 し た リ ン カ — の 前 記 他端 部 の S H 基 と 反 応 し て 安 定 な 結 合 を 形 成 す.る 化 合 物 を 固 定 化 し て な る 固 相 に、 前 記 ） 段 階 に お い て 得 ら れ た ぺ ブ チ ド 混 合 物 を 接 触 さ せ て、 該 固 相 に 成熟 べ プ チ ド を リ ン カ 一 を 介 し て 選 択 的 に 固 定 し、
    d ) さ ら に、 前 記 c ) 段 階 に お い て 得 ら れ た 成熟 べ プ チ ド を 固 定 し た 固 相 を、 リ ン カ 一 と 成 熟 ペ プ チ ド と の 結 合 を 特 異 的 に 切断 す る ア ル 力 リ 性 の 条 件 下 に 曝 し、 成熟 べ プ チ ド を リ ン カ 一 結 合 固 相 よ り 切 断 す る
    操 作 を 含 ん で い る こ と を 特 徴 と す る 請 求 の 範 囲 第 1 項 に 記 載 の 合 成 ぺ ブ チ ド 精 製 方 法。
    4. a ) 固 相 法 に よ る ペ プ チ ド 合 成 に お け る 最 後 の ア ミ ノ 酸 を 導 入 し た 後、 末 端 に ア ミ ノ 基 を 有 す る 目 的 と す る 成 熟 ぺ ブ チ ド お よ び ェ ン ド キ ヤ ッ ビ ン グ さ れ た 目 的 以 外 の 未 成 熟 ぺ ブ チ ド の 双 方 が 結 合 し て い る 固 相 に 対 し、
    一 端 部 に、 前 記 成 熟 ペ プ チ ド の N 末 端 と、 ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お い て 酸 性 条 件 下 で 行 わ れ る 脱 保 護 基反 応 に 安 定 で か つ あ る ア ル 力 リ 性 条 件 下 で 特 異 的 に 切 断 可 能 な ゥ レ タ ン 結 合 を な す ア ル コ キ シ カ ル ボ ネ ー ト 結 合 を 有 し、 さ ら に 他 端 部 に 前 記 脱 保 護 反 応 に よ り チ オ ー ル 基 を 生 成 し 得 る リ ン カ ー を 添 加 し て 前 記 成 熟 べ プ チ ド を 選 択 的 に 修 飾 し、 b ) 次 い で べ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に お け る 最 終 的 な 前 記 脱 保 護 基 反 応 を 行 い、 こ れ に よ り 成 熟 ペ プ チ ド お よ び 未 成 熟 べ プ チ ド を 固 相 よ り 切 断 す る と 共 に、 成 熟 べ プ チ ド に 結 合 し た リ ン カ ー の 前 記 他 端 部 側 の チ オ ー ル 基 の 保 護 基 を は ず し て， 該 リ ン カ ー の 前 記 他 端 部 に チ オ ー ル 基 を 生 成 さ.せ、 c ) 次 に、 ョ ー ド 脂 肪 族 力 ル ボ ン 酸 お よ び プ ロ ム 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 か ら な る 群 か ら 選 ば れ た い ず れ か の も の の 誘 導 体が 固 定化さ れて い る 固相担体に、 前記 b ) 段階 に お い て 得 ら れ た ペプチ ド 混 合物 を 中性条件下で 接触 さ せ、 脱 ョ ー ド お よ び脱ブ ロ ム の い ず れ か の反応 を 行 っ て、 安定 な 共有 結 合 を 形成 し て、 該 固相担体 に 成熟ペ プ チ ド を リ ン カ 一 を 介 し て 選択的 に 固定 し、
    d ) さ ら に、 前記 c ) 段 階 に お い て 得 ら れ た 成熟ぺブ チ ド を 固 定 し-た 固相担体 を、 ア ルカ リ 性 の 条件下 に曝 し、 成 熟 べプチ ド と リ ン カ ー と の 結合部 に 3 脱離反応 を 行わ せ、 成熟べ プ チ ド を リ ン カ ー結合固相担体 よ り 切断す る こ と に よ り 目 的 と す る 成熟ぺ ブチ ド .を単離 す る こ と を 特徴 と す る 請求 の範囲第 1 項 に 記載の 合成ぺ ブチ ド 精製方法。
    5. リ ン カ 一 が 次 の 構造式 （ ID )
    0
    II
    X-NH- (CH2 ) »一 S— CH2— CH2— 0— C一 Y (m)
    II II
    0 0
    (ただし、式中、 nは 1〜 4の整数、 Xは
    CH, -O- -CHa一 S— (CH2 )„一 C一 Onは 1〜2)
    II
    0
    CH CH2 -S-CH2—({ OCH.
    CH3一 C一 0— C一 NH— CH— CO— および I II CH3 0
    CH2 - S - CH2 -^-0CH,
    CH, -0-O-CH2 -O-C-NH-CH-CO-
    II
    0
    のいずれかであり、 また Yは
    -0- ~Ν0: -0
    OH ；および
    F F 、
    一 ο-^Λ- F のいずれかである。）
    F =^F で 表 さ れ る リ ン カ 一 を 用 い る こ と を 特 徴 と す る 請 求 の 第 1 項 な い し 第 4 項 の い ず れ か に 記載 の 合 成 ペ プ チ ド 精 製 方 法。
    6. 前 記 c ) 段 階 に お い て、 一般 式
    I-(CH>-TrCOOH
    R
    ( た だ し、 式 中 R は H ま た は 炭 素 数 1 〜 6 の ア ル キ ル 基、 n は 1 〜 6 の 整 数 で あ る。 ） で 表 さ れ る ョ 一 ド 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 お よ び 一 般 式
    B r-^CH - COOH
    I
    R
    ( た だ し、 式 中 R は H ま た は 炭 素 数 1 〜 6 の ア ル キ ル 基、 n は 1 〜 6 の 整 数 で あ る。 ） で 表 さ れ る ブ ロ ム 脂肪 族 カ ル ボ ン 酸 か ら な る 群 か ら 選 ば れ た い ず れ か の も の の 誘 導 体 が 固 定 化 さ れ て い る 固 相 担 体 を 用 い る も の で あ る 請求 の 範 囲 第 4 項 に 記 載 の 合 成 べ プ チ ド 精製 方 法。
    7. 前 記 c ) 段 階 に お い て、 一般 式 I-(CH2 -irCOOH
    ( た だ し、 式中、 n = 1 〜 6 で あ る。 ） で 表 さ れ る ω — ョ - ド 脂肪族 カ ル ボ ン 酸 お よ び一般式
    Br-(CH2 COOH
    ( た だ し、 -式中、 n = 1 〜 6 で あ る。 ） で 表 さ れる ω —ブ ロ ム 脂肪族カ ル ボ ン 酸 か ら な る 群 か ら 選 ば れ た いず れか の も の の誘導体が 固定化 さ れて い る 固 相担体 を 用 い る も の で あ る 請求 の範 囲第 4 項 に 記載 の合成べプチ ド 精製方法。
    8. 前 記 c ) 段階 に お い て、 I 一 C H2C 0 0 H お よ び B r 一 C H2C 0 0 H の い ず れ か の も の の誘導体 が 固 定化 さ れ て い る 固相担体 を 用 い る も の で あ る 請求の範囲第 4 項 に 記載 の 合成ペ プチ ド 精製方法。
    9. 前 記 c ) 段階 に お い て 用 い ら れ る 固相担体がそ の 表面 に 次 の 構造式 を 有 す る 分子鎖 を結合 さ せ て い る こ と を 特徴 と す る 請求 の 範囲第 4 項 に 記載の 合成べ プチ ド 精製方法。
    I- CH)-5-C-NH- CH2 ^s-NH-
    I II
    R 0
    ( た だ し、 式中 n は 1 ~ 6、 m は 2 ~ 6、 R は H 及 び炭素 数 1 〜 6 の ア ルキ ル基 の い ず れか で あ る。 ）
    1 0. 前記 c ) 段 階 に お い て 用 い ら れ る 固 相担体が そ の 表 面 に 次 の 構造 式 を 有す る 分子鏆を 結 合 さ せて い る こ と を特 徴 と す る 請 求 の 範 囲 第 4 項 に 記載 の 合 成 ペ プ チ ド 精 製 方 法 c
    B r-(CH)-0-C-NH-<CH2 -ΗΓ-ΝΗ- I II
    R 0
    ( た だ し、 式 中 n は 1 ~ 6、 m は 2 〜 6、 R は H ま た は 炭 素 数 1 ~ 6 の ア ル キ ル 基 で あ る。 ）
    1 1. 前 記. c ) 段 階 に お い て 用 い ら れ る 固 相 担 体 が ョ ー ド 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 お よ び ブ ロ ム 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 か ら な る 群 か ら 選 ば れ た い ず れ か の も の の 誘 導 体 が 固 定 化 さ れ て い る 親 水 性 表面 を 有 す る 固 相 担 体 で あ る 請 求 の 範 囲 第 4 項 に 記 載 の 合 成 べ プ チ ド 精 製 方 法。
    1 2. 前 記 c ) 段 階 に お い て 用 い ら れ る 固 相 担 体 が ョ ー ド 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 お よ び ブ ロ ム 脂 肪 族 カ ル ボ ン 酸 か ら な る 群 か ら 選 ば れ た い ず れ か の も の の 誘 導 体 が 固 定 化 さ れ て い る 親 水 性 樹 脂 を 含 浸 さ せ た 水 系 で 使 用 可 能 な キ ー ゼ ル グ ー ル 支 持 担 体 で あ る 請 求 の 範 囲 第 4 項 に 記 載 の 合 成 ペ プ チ ド 精 製 方 法。
    1 3. 次 の 構 造 式 （ III )
    0
    X-NH- (CH2 ) „一 S— CH2 — CH2— 0— C一 Y (Π)
    II II
    0 0
    (ただし、式中、 nは 1〜4の整数、 Xは
    CH, -O- -CH2 -S- (CH2 ) n一 C一 (mは;!〜 2) ；
    0
    CH, CH2 -S-CH2 -<Q>-OCH,
    CH。一 C— O— C一 NH— CH— CO— ；および
    I II CH, 0 CH3 -0-Q>-CH: 0-C-NH-
    II
    0
    のいずれかであり、 また Yは
    -0- X>-N02 ；
    ；および
    のいずれかである。）
    で表 さ れる こ と を 特徴 と す る リ ン カ
    1 4. 次 の構造式 （ I )
    0
    II
    X-NH- (CH2 ) n一 S— CH2 -CH2一 OH (I)
    II
    O
    (ただし、式中 nは 1〜4の整数、 Xが Hのもの、およびその塩^、 ならびに
    CH3
    CH, -C-0-C- ；および
    I II CH, 0
    CII, 0- -CH2 -0-C- のいずれかである。）
    II
    0 で 表 さ れ る こ と を 特 徴 と す る リ ン カ一合 成 中 間 体。
    1 5. 次 の 構 造 式 （ Π )
    0
    X-NH- (CH2 ) o -S-CH2 -CH2 -OH (Π)
    II
    0
    (ただし、式中、 η = 1〜4の整数、 Xは
    CH, -0-{~-CE2 -S- (CH2 ) m -C- (mは 1〜2) ；
    W II
    0
    CH, CH2 -S-CH2 -^-OCH, ；
    CH,一 C一 0— C一 NH— CH— CO—
    I II
    CH, O
    および
    CH2 -S-CH2 -(~ -OCE- I CH, -O- -CH2 -O-C-NH-CH-CO- W II
    o
    のいずれかである。 ）
    で 表 さ れ る こ と を 特 徴 と す る リ ン カ 一合 成 中 間 体《
    1 6. 次 の 構 造 式
    0 0 0
    fr^ II I III I III ^
    CH, O-^-CHz SCH2 C-NHCH2 CH2 SCH2 CH2 0 - C - 0 - - -NO;
    O
    で 表 さ れ る N - [ S - ( p -メ ト キ シ ベ ン ジ ル ） チ ォ グ リ コ リ ル ] ア ミ ノ エ チ ル ス ル フ ォ ニ ル ェ チ ル P —二 ト ロ フ エ 二 ル カ ル ボ ネ ー 卜 か ら な る 請 求 の 範 囲 第 1 3 項 に 記載 の リ ン 力 一。
    1 7. 次 の 構 造 式 で 表 さ れ る 新規 化 合 物 N — （ p — メ ト キ シ ベ ン ジ ル ォ キ シ カ ル ボ ニ ル ） ア ミ ノ エ チ ル ブ 口 マ イ ド。
    0
    CH, 0-ζ -ΟΗ2 0-C-NHCH2 CH2 Br
    1 8. 次 の 構 造 式 で 表 さ れ る 新規 化 合 物 N — （ t 一 ブ チ ル ォ キ シ カ ル ボ ニ ル ） ア ミ ノ エ チ ル ブ 口 マ イ ド。
    CH,
    CH3 -C-0-C-NHCH2 CH2 Br
    I II CH, 0
    1 9. 次 の 構 造 式 で 表 さ れ る 新規 化 合 物 2 — （ ア ミ ノ エ チ ル ス ル フ ォ ニ ル ） エ タ ノ ー ル （ 塩 酸 塩 と し て 確 認 ） 。
    0
    II
    NH2 CH2 CH2 S-CH2 CH2 OH
    II
    o
    2 0. 次 の 構 造 式 で 表 さ れ る 新規 化 合 物 2 — （ ア ミ ノ エ チ ル ス ル フ ォ ニ ル ） エ タ ノ ー ル · 塩 酸 塩。
    0
    II
    HC 1 · NH2 CH2 CH2 S-CH2 CH2 OH
    II
    0
    2 1. 表 面 に 次 の 構 造 式 を 有 す る 分 子 鎖 を 結 合 さ せ た こ と を 特 徴 と す る リ ン カ ー 結 合 用 固 相 拒 体。
    I- CH)-^-C-NH-{CH2 nr-NH- R 0 ( た だ し、 式 中 n は ；！ 〜 6、 m は 2 〜 6、 R は H ま た は 炭 素 数 1 〜 6 の ア ル キ ル 基 で あ る。 ）
    2 2 . 表 面 に 次 の 構 造 式 を 有 す る 分 子 鎖 を 結 合 さ せ た こ と を 特 徴 と す る リ ン カ ー 結 合 用 固 相 担 体。
    ( た だ し、 式 中 n は 1 ~ 6、 m は 2 ~ 6、 R は H ま た は 炭 素 数 1 〜 6 の ア ル キ ル 基 で あ る。 ）
    2 3 . 前 記 分 子 鎖 を 結 合 さ せ る 固 相 担 体 が 親 水 性 を 有 す る 樹 脂 で あ る 請 求 の 範 囲 第 2 1 項 ま た は 第 2 2 項 に 記 載 の リ ン カ ー 結 合 用 固 相 担 体。
    2 4 . 前 記 分 子 鎖 を 結 合 さ せ る 固 相 担 体 が 親 水 性 樹 脂 を 含 浸 さ れ た 水 系 で 使 用 可 能 な も の で あ る 請 求 の 範 囲 第 2 1 項 ま た は 第 2 2 項 に 記 載 の リ ン カ 一 結 合 用 固 相 担 体。
    2 5 . 前 記 分 子 鎖 を 結 合 さ せ る 固 相 担 体 が 親 水 性 樹 脂 を 含 浸 さ れ た 水 系 で 使 用 可 能 な キ ー ゼ ル グ ー ル 支 持 担 体 で あ る 請 求 の 範 囲 第 2 4 項 に 記 載 の リ ン カ ー 結 合 用 固 相 担 体。
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    1992-04-16| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
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