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    公开号:WO1991016916A1
    申请号:PCT/JP1991/000601
    申请日:1991-05-02
    公开日:1991-11-14
    发明作者:Kazuyoshi Kawai；Yasue Konishi；Satoru Nakai；Yoshikatsu Hirai
    申请人:Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.；
    IPC主号:A61K38-00
    专利说明:
    [0001] 明 钿
    [0002] 抗腫瘍剤
    [0003] 技術分野
    [0004] 本発明は、 医薬上有用なガンマ一 ·インターフヱロンと インターロイキン一 1との配合剤に関する。
    [0005] 背景技術
    [0006] ガンマ一 · インターフェロンは、 1 9 6 5年にィー * ェ フ · ウイ 一ロック （E. F Wheel ock ; Science, 149, 310-311, 1965) が、 ヒ ト白血球に誘導剤として P H A (フィ トヘム ァグルチニン） を加えて培養すると、 p H 2で失活するゥ ィルス抑制因子が産生されることを見出し、 得られたもの である。 次いでアール * フアルコフ （R. FalcoH； J. Gen. Vi rol. , ， 251〜 253, 1972) は ρ Η 2で失活するウィルス抑 制因子の分子量が 5 0 0 0 0であると報告したが、 その後 ワイ ·ケ一 · イッブら （Υ. Κ. Yip, et ai ;Science, 215, 411 〜413, 1982) は S D S—ポリアク リルァミ ドゲル電気泳動 法 （S D S — P A G E ) で処理するとガンマ一 ' インター フエ口 ンが分子量 2 5 0 0 0の画分と 2 0 0 0 0の画分に 分離し得ることを報告した。 一方、 ガンマ一 · インターフ ュロンが抗ウイルス活性のみならず抗腫瘍活性を有するこ とは公知であり、 ジヱイ ·エル · クレインら （ J. L. Crane, L. A. Gi as gow, £. . Kern, and J. S. Younger； J. Na 11. Cancer Inst. , 61, 871〜 874, 1978) 、 ジエイ · ィ一 ♦ ブラロック ζ, (J. E. Blaiock, J. A. Georgiades, M. P. Lmgford, and H. U. J ohnson;Cell Immunol. , ， 390〜 394, 1980) は、 アルファ • ィ ンターフェロンやベータ一 · インターフェロンに比較 して、 ガンマ一 · イ ンターフ エ uンの抗腫疡活性は 20〜 1 00倍強いことを報告している。
    [0007] 他方、 イ ンターロイキン— 1は特異抗原、 リボポリサッ 力ライ ドなどにより活性化された単球あるいはマクロファ ージなどから産生される分子量 1 20 00〜 180 00程 度のポリペプチ ドである [エス ♦ ビー · ミゼル（S. B. Mizel ), Immunol. ReT. , 63, 51〜Π, 1982 ] 。 イ ンターロイキン 一 1は Τ細胞の活性化に関与するのみならず、 生体内では きわめて多彩な作用を発揮している [シー ·エー · ディ ナ レロ （C. A. Dii rello) ;Ne* Eng. J, UH. , 311, 1413〜 1418 , 1984 ] 。 たとえば、 イ ンターロイキン一 1は B細胞活性 化因子 （B cell activating f ctor) とも呼ばれていたよ うに、 B細胞に作用し、 B細胞分化因子 （B cell dif fere ntiation factor; BCDF ) と共同して免疫グロプリ ン産生 を誘導する [アール · ジエイ · フアルコフら （R. J. Fa of , A. Muraguchi, J. X. Hong, et 1. ) ； J. Inmnnol. , 131, 801— 805, 1983] 。 その他イ ンターロイキン一 1は種々の細胞に 勸き、 さまざまな生物活性を示し免疫、 炎症、 造血、 内分 泌、 脳神経など、 ほとんどすべての生体反応に重要な役割 をはたしている。 さらにインターロイキン一 1は種々の腫 瘍細胞に対し直接的な増殖抑制や、 細胞致死活性を示す
    [0008] [ケー ·オノザキら （K. Onozaki, K. Ma tsu ina, B. B. Anar wal, et al. ) ； J. Immunol, , 135^3962, 1985 ] ことから抗腫 瘍剤としての用途も考えられている。
    [0009] ガンマ一 · インターフェロン及びインターロイキン一 1 は両者ともに腫瘍細胞に対して增殖抑制効果を有している 力 これらのいずれか一方を有効成分とする抗腫瘍剤を投 与した臨床治験では、 発熱、 胃腸症状、 全身倦怠、 低血圧、 筋肉痛などの副作用を示すことが報告されている。 [エイ チ ·エー ·ハーヴエイら （H. A. Harvey, A. Lip ton, D. S. ffli t e, et at. ) ； Proc. ASCO. 24, 46, 1983] 。 このため、 ガンマ 一 · イ ンターフェロン及びイ ンターロイキン一 1はいずれ も、 癌の治療に対して期待されていたもののこのような副 作用を有するために大量投与などの試みを断念せざるを得 ないのが現状である。
    [0010] 従って、 本発明は、 ガンマ一 · インターフヱロン又はィ ンターロイキン一 1の抗腫瘍活性を増強し、 これによりし れらの投与量を低減させ、 上記副作用の軽減が可能な抗 瘍剤を提供することを目的とする。
    [0011] 発明の開示 本発明者らは、 上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねる 過程で、 ガンマ一 · イ ンターフェロン又はインターロイキ ンー 1のいずれかの抗腫瘍活性を増強する物質の検索を行 つたが、 良好な結果を得るには至らなかった。 ところが、 ガンマ一 · イ ンターフヱロンおよびイ ンターロイキン一 1 を併用すると、 予想外にも、 それぞれの抗腫瘍活性が相互 に著しく増強され、 それぞれ単独では抗腫瘍効果が発揮さ れないような低い投与量においても腫癍細胞の增殖抑制効 果が得られ、 その結果、 両者の投与量を大幅に低滅するこ とが可能となることを見出した。 本発明は、 この新知見に 基づき完成されたものである。
    [0012] すなわち、 本発明は、 ガンマ一 · インターフヱロンとィ ンターロイキン一 1とを有効成分とする抗腫瘍剤を提供す るものである。
    [0013] 更に、 本発明は、 ガンマ一 ♦インターフェロンとイン ターロイキン一 1とを、 腫瘍を有する患者に、 抗腫瘼に有 効な量で投与する腫瘍の治療方法を提供するものでもある。
    [0014] 本発明の抗腫瘍剤に用いるガンマ一 · イ ンターフ ロン は、 ガンマ一 ，インターフヱロン活性、 特にヒ トガンマー ♦ インターフエ口ン活性を有するものであれば、 天然、 あ るいは組換えのガンマ一 · ィンターフェロン及びその誘導 体のいずれでもよい。 一般にガンマ一 ' インターフヱロン の製造は、 天然型の場合はヒ ト白血球を採取するか、 また は、 通常のヒ ト細胞を培養する方法によって株化 T細胞を 培養し、 これに誘導剤として P HA, C o n A等を用いて 誘導産生する方法が取られている 〔イラナ ナサン （llau a Nathan) ら、 Nature, 292, 8.4 2, 1 98 1 マサ コ マツヤマ (Uasako Ua t suyaoa) ら、 The Jouri i of I nimunology , 1 29, 4 50, 1 982〕 。 この方法によ つて細胞を大量に得るには技術面、 コス ト面で困難な点が 多く、 より安価に細胞を増殖させる方法として、 ハムスタ 一法が開発されている （特公昭 63— 1 296号及び特公 昭 56— 54 1 58号） 。 該方法の概要は次の通りである。 即ち、 あらかじめ免疫抑制剤を投与した幼若ハムスターの 背部皮下に株化 T細胞を移植することによって T細胞を增 殖せしめると、 ハムスターの背部に腫瘍塊が出来る。 これ が一定の大きさになつたところでこの腫瘍塊を取り出し、 裁断後、 破砕して細胞を分散させて細胞浮遊液を調製する。 このようにして調製された T細胞に P H Aを用いてガンマ 一 · イ ンターフヱロンを誘導産生する方法である。 本方法 によって得られるガンマ一 · ィンターフヱロンは天然型と 同一の糖鎖を有していることを特徴とする。 この他、 ガン マー · インターフユ口ンを安定に、 安価に製造するために 遣伝子組換え技術によって作成されたヒ トのガンマ一 · ィ ンターフェ口ン遣伝子を組み込まれた微生物を培養するこ とにより、 産生することもできる 〔パト リ ック ダブリ ュ 一 グレイ （Patrik W. Gray ) ら、 f ture, 29 5, 50 1 , 1 982〕 。 但し、 該方法によって得られるガンマ一 · イ ンターフェロンは糖鎮を有していない 〔エルンス ト リ ンデルクネヒ ト （Ernst Rinderknecht) ら、 The Journa 1 of Biological Chemistry 2 59 , 67 9 0, 1 984 ]
    [0015] O
    [0016] これらガンマ一 · インターフェロンのうちでも、 特に、 上記ハムスター法により製造されるもの等が好ま しく使用 できる。
    [0017] 一方、 本発明で使用されるインターロイキン一 1 として は、 イ ンターロイキン一 1活性、 特にヒ トイ ンターロイキ ンー 1活性を有するかぎりにおいて、 天然型あるいは遣伝 子組換えにより産生されたィ ンターロイキン一 1及びその 誘導体が包含される。 天然型のィ ンターロイキン一 1の製 造法は特開昭 62 - 1 74022号に詳述されている方法 によって得ることが可能である。 さらに遣伝子の組換えに よって得られるィ ンターロイキン一 1は特開昭 63 - 1 5 23 98号や欧州特許公開 E P 0 2 37 967 A 2に詳述 されている方法によって種々のィ ンターロイキン一 1誘導 体を得ることが可能である。 これらイ ンターロイキン— 1のうちでも、 本発明では、 特に、 I L一 1 そのもの又は上記特開昭 63— 1 523 8号や欧州特許公開 E P 0237967 A 2に記載され ているイ ンターロイキン一 1 誘導体、 例えば、 下記に記 載のものを例示できる。
    [0018] o I L— 1 )5自体
    [0019] [G ！ y 4 I L一 1 （4位 A r gを G 1 yに置換し ナ： i - 1 β )
    [0020] o 〔S e r 71〕 I - 1 β (7 1位 C y sを S e rに置換 した I L一 1 )
    [0021] o CA 1 a 8 ) I L一 1 /5 (8位 C y sを A l aに置換し た I L一 1 ）
    [0022] o 〔A l a 71〕 I L - 1 β (7 1位 C y sを A l aに置換 した I L一 1 yS)
    [0023] o 〔L e u 93〕 I L - 1 β (93位 L y sを L e uに置換 した I L一 1 3 )
    [0024] o [A r g 120 ] I L一 l iS ( 1 20位 T r pを A r gに 置換した I L一 1 /S)
    [0025] o 〔T y r 30〕 I L一 1 ;S (30位 H i sを T y rに置換 した I L一 1 ）
    [0026] o 〔A l a 8 A l a 71〕 I L一 l S (8位 C y s及び 7 1 位 C y sを 8位 A l a及び 7 1位 A l aに g換した I L一 1 β)
    [0027] o I L— 1 — (4 - 1 53) ポリペプチ ド （ 1位 A l a から 3位 V a 1 に至るアミ ノ酸 列を欠失させた I L一 1 o l L— 1 ^一 （ 1一 1 50) ポリベプチド （1 5 1位以 降を欠失させた I L一 1 /S)
    [0028] なお、 上記に例示した I L一 1 3自体及びインターロイ キン— 1 iS誘導体は、 上記特開昭 63— 1 52398号公 報や欧州特許公開 E P 0237967 A 2に記載されるィ ンターロイキン一 l iSのアミノ酸 κ列を参照して表される ものである。
    [0029] 本発明の抗腫癟剤は、 ガンマ一 ·インターフヱロンとィ ン夕ーロイキン一 1とが単一の製剤中に含まれるように調 製して投与してもよく、 或いは、 ガンマ一 ·インターフエ ロンとインターロイキン一 1とのそれぞれを別個の製剤と して調製し、 これら 2つの製剤を投与しても良い。 いずれ の場合も、 ガンマ一 ♦ インターフェロンとインターロイキ ンー 1とは、 相互に一方が他方の腫瘍細胞増殖抑制作用を 増強するため、 両者の使用割合は、 極めて広い範囲から適 宜選択できる。
    [0030] 本発明の抗腫瘍剤を臨床上使用するに際し、 成人に対す る一日当たりの有効量に関しては、 広い範囲から選択でき、 ガンマ一 · インターフェロンは、 通常一日当たり 4. 2 β £ 1)() 〜4. 2 mgZbody程度の範囲で使用すれば良く、 —方、 イ ンターロイキン一 1は、 一般に一日当たり 0* 0 8〜8 ^ gZbo 程度の範囲で使用するのが望ましい。 本 発明では、 既述のごとく、 ガンマ一 · インターフェロンと インターロイキン一 1とは、 相互に一方が他方の腫瘍細胞 增殖抑制作用を増強するため、 たとえば、 ガンマ一 · ィン ターフェロンをこの分野で通常採用されている臨床投与量 で使用する場合は、 イ ンターロイキン一 1の通常採用され ている臨床投与量を 1 / 1 00倍〜 9ノ 1 0倍程度に減少 させることができる。 同様に、 インターロイキン一 1を一 般にこの分野で採用されている臨床投与量で使用する場合 は、 ガンマ一 · イ ンターフェロンの通常採用されている臨 床投与量を 1ノ 1 00倍〜 9/ 1 0倍程度に減少させるこ とができる。 前記副作用を回避する観点から、 本発明では、 ガンマ一 · イ ンターフヱロンとイ ンターロイキン一 1のい ずれか一方を上記有効量範囲内の低い目の投与量で使用す るのが望ま しい。
    [0031] 本発明の抗腫瘼剤は、 その使用目的に応じ、 この分野で 慣用されている各種の投与形態で使用される。 特に、 本発 明では、 上記製剤を製造する際に、 ヒ ト血清アルブミ ン、 糖類及び界面活性剤より選ばれた少なく とも 1種を使用す ることにより有効成分、 就中イ ンターロイキン一 1の安定 性を向上させることもできる。
    [0032] 上記において糖としては特に限定はなく、 例えばダルコ ース、 マンノース、 ガラク トース、 果糖等の単糖類、 マン 二 トール、 イノ シ トール、 キシリ トール等の糖アルコール 類、 ショ糖、 マルトース、 ¾糖等の二糖類、 デキス トラン、 ヒ ドロキシプロピルスターチ等の多糖類等を使用でき、 之 等は一種単独でも二種以上混合しても用い得る。 之等の中 で特にショ糖、 マルトース、 マンニトール、 イノ シ トール、 デキス トラン等が好ましい。
    [0033] 界面活性剤としても特に限定はなく、 イオン性及び非ィ オン性界面活性剤のいずれも使用でき、 就中、 ポリオキシ エチレングリ コールソルビタンアルキルエステル系、 ポリ ォキシェチレンアルキルエーテル系、 ソルビ夕ンモノァシ ルエステル系、 脂肪酸グリセリ ド系等の界面活性剤を好ま しく利用できる。
    [0034] 上記糖類の添加量は、 インターロイキン— 1そのもの又 はその前記誘導体 （以下 Γ I L一 1活性物」 という） 1 ^ g当たり約 0 . l ag程度以上、 好ま しくは約 1〜 1 0 O rog 程度の範囲とするのが適当であり、 界面活性剤の添加量は、 I L一 1活性物 1 ^ g当たり約 0 . O O O l mg程度以上、 好ましく は約 0 . 0 0 1〜 0 . 1 程度の範囲とするのが 適当である。 またヒ ト血清アルブミ ンの添加量は I L一 1 活性物 l ^ g当たり約 0 . 0 0 1 程度以上、 好ま しく は 約 0 . 0 1〜 1 O mg程度の範囲とするのが適当である。
    [0035] 本発明の抗腫瘍剤は、 通常のこの種医薬組成物と同様の ものとすることができ、 他の薬理的有効成分や製剤上の慣 用成分等を任意に配合してもよい。
    [0036] 特に、 本発明抗腫瘍剤に配合できる他の成分としては、 I L - 1活性物の安定化を更に増加させる面より、 通常の 含硫還元剤が好ましい。 該含硫還元剤としては、 具体的に はシスティ ン、 N—ァセチルホモシスティン、 チォク ト酸、 チォグリ コール酸及び之等の塩類、 チォエタノールァミ ン、 チォグリセロール、 チォ硫酸ナト リウム、 チォ乳酸、 ジチ オスレィ トール、 グルタチオン等の比絞的温和な還元剤等 を好ま しく例示でき、 之等は一種単独でも利用でき、 2種 以上併用することもできる。 之等の添加量は特に制限され ないが、 I L一 1 3活性物 1 g当たり約 0 . O O l mg程 度以上、 好ま しくは 0 . 0 1〜 1 O ng程度 （2種以上を併 用する場合はそれらの合計量） とするのが適当である。
    [0037] 本発明の抗腫痛剤は、 また、 锾街液で等張化して安定な 等張化製剤とされるのが適当である。 ここで用いられる緩 衝液と しては、 例えば代表的には、 クェン酸ークェン酸ナ トリウム、 クェン酸一リ ン酸ナト リウム、 酢酸一酢酸ナト リ ウム、 クェン酸一ホウ砂等の p H 4〜8程度、 好ま しく は p H 5〜 6程度の各種锾銜液を例示できる。
    [0038] 本発明抗腫瘍剤は、 例えば通常薬理有効量のガンマ一 ， イ ンターフヱロン、 I L一 1活性物及び前記特定の配合成 分と共に、 適当な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形 態に調製される。 該製剤担体としては使用形態に応じた製 剤の調製に通常惧用される充填剤、 增量剤、 結合剤、 付湿 剤、 崩壊剤等の賦形剤乃至稀釈剤をいずれも使用できる。 製剤組成物の形態は、 これが有効成分を効果的に含有する 状態であれば特に限定はなく、 錠剤、 粉末剤、 顆粒剤、 丸 剤等の固剤であってもよく、 液剤、 懸濁剤、 乳剤等の注射 剤形態であってもよい。 またこれは使用前に適当な担体の 添加により液状となし得る乾燥品とすることもできる。 之 等の製剤組成物はいずれも常法に従い調製され得る。
    [0039] 得られる医薬製剤は、 該製剤組成物の形態に応じた適当 な投与経路、 例えば、 注射剤形態の医薬製剤は、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内、 腹腔内投与等により投与され、 固剤 形態の医薬製剤は、 経口乃至は経腸投与され得る。 該投与 は、 一日 1回であってもよく、 また一日 3〜4回に分ける
    [0040] »~とち" さる o
    [0041] 本発明によれば、 ガンマ一 · ィ ンターフェ口ンとィ ンタ 一ロイキン一 1とを併用することにより、 それぞれの抗腫 瘍活性が相互に著しく增強され、 それぞれ単独では抗腫瘍 効果が発揮されないような低い投与量においても腫瘍細胞 の増殖抑制効果が得られる。 その結果、 両者の投与量の大 幅な低減および前記副作用の軽減が可能となる。
    [0042] 実 施 例
    [0043] 参考例 1. ガンマ一 · イ ンターフェ口ンの調製
    [0044] ガンマ一 · インターフエ口ンは特公昭 63— 1 296号 ( 1 988, 1 , 1 2) に従って以下の方法により篛製さ れた。
    [0045] (1) 細胞の増殖
    [0046] B A L L— 1細胞を F C S (ゥシ胎児血清） 20 %を含 む R PM I - 1 64 0培地 （p H 7. 2) 中、 37でで培 養した。 得られた細胞を血清無添加の R PM 1 - 1 64 0 培地 （p H 7. 2) で洗浄し、 次いで、 同培地に約 I X 1 06 個 m l になるように懸濁した。
    [0047] あらかじめ、 ゥサギ抗血清を投与して免疫反応を抑制し た新生児ハムスターの皮下に、 上記で調製した B A L L— 1細胞を移植し、 約 3週間通常の飼育を行った。 次いで皮 下に増殖した B A L L— 1細胞の腫癀塊を摘出し細切した 後、 トリプシン含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散さ せた。
    [0048] 得られた細胞を血清無添加の R P M I - 1 64 0培地で 洗浄し、 1 0%F C Sを含む同培地に約 1 x 106 個ノ m 1になるように懸濁し、 以降のガンマ一 · インターフエ口 ンの産生に供した。
    [0049] (2) ガンマ一 · イ ンターフェロンの産生
    [0050] 上記（1) の方法で得られた 10% F C Sを含有する R P
    [0051] M I — 1640培地に懸濁した B A L L— 1細胞に、 誘導 剤としてリポポリサッカライ ド （L P S) を l O O n g添 加して 37でで 3日間培養し、 ガンマ一 · イ ンターフエ口 ンを誘導産生させた。
    [0052] 培養後、 遠心分離を行って細胞を除去し、 限外濾遏によ り濃縮した。 澳縮液をモノ ク ローナル抗体カラムを用いて 精製を行った。 本標品の比活性は 7. 35 X 106 I U/ mg rot e in であった。
    [0053] 参考例 2. イ ンターロイキン一 1の調製
    [0054] 特開昭 63 - 152398号の実施例 1に記載の方法に 従い、 71位 C y sを S e rに置換したイ ンターロイキン 一 1 ^を調製し、 単雜、 精製した。
    [0055] 以下、 上記参考例 1で得たガンマ一 · インタ一フヱロン 及び上記参考例 2で得たィンターロイキン一 1を種々の使 用割合で使用し、 腫瘍細胞の増殖抑制効果を測定した。 そ の結果を、 下記の実施例 1 (1) 〜（3) に示す。
    [0056] 実施例 1. ヒ ト腫瘍細胞株の増殖に対する併用効果 (1) C o l o 20 5細胞に対する効果
    [0057] C o l o 20 5細胞 （ヒ ト結腸腺癌細胞、 Cancer Res . , 38» 13 5, 1978) をムーア （Moore ) らの方法 （J. Am. M . Assoc., 1_9^51 , 1967) に従って培養し、 得られた細胞を、 P B S (-） 溶液 （日水製薬社製、 リ ン酸緩銜生理食塩水） で 2回洗浄し、 0. 05%ト リプシン （フロー · ラボラ ト リース社製） で細胞をはがした後、 ピぺッテングにより R PM I — 1 640培地 （ギブコ社製） に細胞を懸濁した。
    [0058] 2 5で、 1 200 r p mで 5分間逮心洗浄 （日立製作所製、 05 P R— 22型） した細胞を再び同培地に懸濁し、 最終 濃度が 1 0%となるように F B S (ゥシ胎児血清、 ギブコ 社製） を加えた。 生細胞数はト リパンブルー溶液 （和光純 薬社製） にて染色して、 光学顕微鏡下で計測した。
    [0059] 即ち、 1 2穴のマイクロプレー ト （コースター社製） の 各穴に、 6. 3 X 1 02 個/ m 1から 2 X 1 04 個 1 の希釈系列にした細胞溶液を 0. 5m lずつ加えて 5 % C 02 下、 37でで 9日間培養 （ナブコ社製 C 02 イ ンキ ュベータ一） し、 細胞濃度と培養時間の予備検討を行った。 ついでマイクロプレー トの各穴に最終濃度が 0、 0. 0 1 4、 0. 14、 1. 4、 14、 140 n g /m 1 (即ち、 0、 0. 1、 1、 1 0、 1 00及び l O O O uZm l ) の 参考例 1のガンマ一 ' イ ンターフェロン （以下、 「 I F N 一 7」 という） または 0、 0. 01、 0. 1、 1、 10、 100 n g /m 1の参考例 2のィ ンターロイキン一 1
    [0060] (以下 「 I L一 1 SJ という） をそれぞれ組み合わせて 0. 025m lずつ添加し、 さらに予備検討の結果に合わせて 钿胞港度を 1. 3 X 103 個/ m 1に希釈調整した钿胞溶 液を 0. 5m lずつ加えて 5% C 02 下、 37でで 8日 間培養した。 培養後、 各穴の細胞は P B S ( + ) 溶液 （日 水製薬社製） で洗浄し、 メ タノール （和光純薬社製） 固定 した。 風乾後、 ギムザ染色 （メルク社製） を行い、 オー ト マティ ックパーティ クルカウンター （C P— 2000、 白 井松器械社製） または実体顕微鏡 （S Z H、 ォリ ンパス社 製） 下でコロニー数を計測した。 各群の細胞増殖率を、 ガ ンマー · イ ンターフェロンおよびイ ンターロイキン一 1 β の代わりに培養液のみを添加した群を対照として算出した。 結果を第 1表に示す。
    [0061] この結果、 第 1表に示すように、 C ο 1 ο 205細胞 に対してインターロイキン一 1 ^は該細胞に対する単独の 増殖抑制効果は弱く、 I n gZm lから l O O n gZm l までの添加で、 増殖抑制効果は弱く、 100 n g/m lで 35%前後の増殖抑制効果しか示さなかった。 またガンマ 一 · イ ンターフヱロンのみでは 0. 14 n g/m l添加群 で 65%の増殖抑制効果を示した。 これに対して、 1 F N— 7単独処置群では、 1 F N— の E D 50値 （Pf obi t法による、 以下同じ） が 0 , 1 8 n g /m 1であるのに比較して、 0. 0 1 n g Ζπι 1の I L一 1 /5を併用した群では、 1 F N—ァの E D 5()値が 0* 04 2 n g / 1 . 0. 1 n g / m 1の I L一 1 S併用群では、 0. 0 0 7 n g Zm l となり、 実に 4. 3〜2 5. 7倍も の増殖抑制活性の増強が認められた。
    [0062] Co l o 205細胞の増殖率 (%)
    [0063] 1い liS I FN- - r
    [0064] 0 0.014 0.14 1.4 14 140
    [0065] 0 100.0土 2. 90.6土 0.9 34.2± 0.9 19.は 2.0 18.0± 1.1 17.2土 1.7
    [0066] 0.01 86.7士 3.3 74.9土 2, 7 28.6土 1.4 16.4± 1.7 13.6土 1.3 18.6± 2.1
    [0067] 0.1 78.0± 4.2 62.0土 1.1 17.8± 1.2 10.8土 0.6 11.4土 0.4 12, 7± 0.2
    [0068] 1 68.7土 3.4 32.5士 1.7 10.8土 0.5 5.3土 0.5 5.3± 0.2 6.9土 0.8
    [0069] 10 63.5土 4.2 23.6土 2.1 9.0士 0.8 5.4土 0.4 4.5± 0.5 7.0± 0.7
    [0070] 100 64.5± 2.7 27, 8士 0, 9 8.5± 0.9 5.9± 0.4 4.1± 0.5 7.2± 1.0
    [0071] (2) K P K- 1細胞に対する効果
    [0072] Κ Ρ Κ— 1細胞 （ヒ ト腎癌細胞） をムーア （Moore ) ら の方法 （J. Am.Med. Assoc. ,1^519, 1967) に従って培養し、 得られた細胞を、 P B S (-） 溶液 （日水製薬社製） で 2 回洗浄し、 0. 05%ト リプシン （フロー · ラボラ ト リー ス社製） で細胞をはがした後、 ピぺッテングにより R PM I 一 1640培地 （ギブコ社製） に細胞を懸濁した。 25 で、 1200 r pmで 5分間遠心洗浄 （日立製作所製、 0 5 P R— 22型） した細胞を再び同培地に懸濁し、 最終濃 度が 10%となるように F B S (ゥシ胎児血清、 ギブコ社 製） を加えた。 生細胞数はトリバンプルー溶液 （和光純薬 社製） にて染色して、 光学顕微鏡下で計測した。
    [0073] 即ち、 12穴のマイクロプレー ト （コースター社製） の 各穴に 6. 3 X 102 個 Zm lから 2 X 104 個ノ m lの 希釈系列にした細胞溶液を 0. 5m lずつ加えて 5% C 02 下、 37でで 6日間培養 （ナブコ社製 C 02 イ ンキュ ベータ一） し、 細胞濃度と培養時間の予備検討を行った。 ついでマイクロプレー トの各穴に、 最終濃度が 0、 0. 0 14、 0. 14、 1. 4、 14、 140 n g/m 1 (即ち、 0、 0. 1、 1、 10、 100、 1000 u /m 1 ) の参 考例 1のガンマ一 ♦ イ ンターフェロンまたは 0、 0. 01、 0. 1、 1、 10、 100 n gZm 1の参考例 2のイ ンタ 一ロイキン一 1 ;3をそれぞれ組み合わせて 0. 0 2 5 m l ずつ添加し、 さらに予備検討の結果に合わせて細胞濃度を 2 X 1 04 個 Zm 1 に希釈調整した細胞溶液を 0. 5 m l ずつ加えて 5 % C O 下、 3 7でで 7日間培養した。 培養 後、 各穴の細胞は P B S ( + ) 溶液 （日水製薬社製） で洗 浄し、 メ タノール （和光純薬社製） 固定した。 風乾後、 ギ ムザ染色 （メルク社製） を行い、 オー トマティ ックパーテ ィ クルカウンター （C P — 2 0 0 0、 白井松器械社製） ま たは実体顕微鏡 （S Z H、 オリ ンパス社製） 下でコロニー 数を計測した。 各群の細胞増殖率を、 ガンマ一 ·ィンター フエロンおよびイ ンターロイキン一 1 Sの代わりに培養液 のみを添加した群を対照として算出した。 結果を第 2表に 示す。
    [0074] 第 2表から明らかなように、 K P K— 1細胞に対してィ ンターロイキン一 1 は非常に弱い増殖抑制効果しか示さ ず、 l O O n g Zm lでも 1 5 %程度の抑制であった。 ガ ンマー · ィ ンターフェロンは 1 4 n s /m 1で 5 7 %の增 殖抑制効果を示した。 これに対して、 1 F N— ァ単独処置 群では、 1 F N—ァの E D K()値が 1 1. S O l n g Zm l であるのに比較して、 0. 1 n g Zm 1の I L一 1 ;3を併 用した群では、 1 F N—ァの E D 5()値が 1. 86 2 n g Z m l、 1 n g m 1の I L一 1 ;3併用群では、 0. 2 5 5 n gZm 1 となり、 実に 6. 1〜44. 3倍もの増殖抑制 活性の増強が認められた。
    [0075] 第 2表： KPK - 1細胞の増殖率 (%)
    [0076] I FN-r
    [0077] 0 0.014 0.14 1.4 14 140
    [0078] 0 100.0士 2.7 108.8± 5.3 99.9± 7.2 84.4土 5.0 43.0土 1.2 12.0士 0.9
    [0079] 0.01 119.2± 3.3 118.3土 2.1 106.1士 2.6 87.3士 0.7 39, 2土 3.3 19.4± 2.3
    [0080] 0.1 110.は 3.1 112.2± 3.4 64.4 ± 2.1 50.4土 4.5 22.3土 2.3 6.5± 1.2
    [0081] 1 88.2± 3.5 84.4土 2.1 57.3± 3.】 30.5± 2.6 5.9土 0.9 2.3± 0.4
    [0082] 10 89.7士 4.4 84.0± 3.2 58.1土 4.4 26.6士 2.2 5.6土 1.6 1.7± 0.4
    [0083] 100 85.3士 4.7 77.9土 1.2 57.8± 4.7 30.6± 1.8 8.3土 0.6 2.4± 0.8
    [0084] (3) 各種細胞に対する効果
    [0085] S W48細胞 （ヒ ト結腸腺癌細胞、 Cancer Res. , 36, 4 562, 1976) を、 レイボヴィ ッッ （Liibovitz ) らの方法
    [0086] (Am. J. Hyg. , 78, 173, 1963 ) に従って培養し、 得られた钿 胞を、 P B S (-） 溶液 （日水製薬社製） で 2回洗浄し、 0. 05% トリプシン （フロー · ラボラ トリース社製） で 細胞をはがした後、 ビぺッテングにより L— 1 5培地 （フ ロー · ラボラ ト リーズ社製） に細胞を懸濁した。 2 5で、 1 200 r p mで 5分間遠心洗浄 （日立製作所製、 0 5 P R— 22型） した細胞を再び同培地に懸濁し、 最終港度が 1 0%となるように F B S (ゥシ胎児血清、 ギブコ社製） を加えた。 生細胞数はト リパンブルー溶液 （和光純薬社製） にて染色して、 光学顕微鏡下で計測した。
    [0087] 即ち、 1 2穴のマイクロプレー ト （コースター社製） の 各穴に、 6. 3 x 1 0 個 Zm lから 個 Zm l の希釈系列にした細胞溶液を 0, 5 m 1ずつ加えて 5% C 02 下、 37でで 8日間培養 （ナブコ社製 C 02 インキ ュベータ一） し、 細胞濃度と培養時間の予備検討を行った。 ついでマイクロブレー トの各穴に、 最終濃度が 0もしく は 1. 4 n g Zm 1の参考例 1のガンマ一 · イ ンターフエ口 ンまたは 0もしく は 1. 0 n g/m 1の参考例 2のインタ 一ロイキン一 1 ;3をそれぞれ単独、 又は組み合わせて 0. 0 2 5 m lずつ添加し、 さらに予備検討の結果に合わせて 細胞濃度を 2. 5 X 1 03 個ノ m 1 に希釈調整した細胞溶 液を 0. 5 m 1ずつ加えて 5 % C 02 下、 37でで 1 2日 間培養した。 培養後、 各穴の細胞は、 P B S ( + ) (日水 製薬社製） で洗浄し、 メ タノール （和光钝薬社製） 固定し
    [0088] C a 1 u - 3細胞 （ヒ 卜肺癌細胞、 J. Nat. Cancer Inst. , 58, 209, 1977) を、 イーグル《 ェイチ （Eagle, Η. ) らの方 法（Science^, 432， 1959)に従って培養し、 得られた钿胞 を P B S (-） 溶液 （日水製薬社製） で 2回洗浄し、 0. 0 5%ト リプシン （フロー · ラボラ ト リーズ社製） + 10 % N E A A (Non essential amino acid, フロー · ラボラ ト リーズ社製） に 1 のビルビン酸ナ ト リ ゥムを含む培地 に細胞を懸濁した。 25で、 1 200 r p mで 5分間遠心 洗浄 （日立製作所製、 0 5 P R - 22型） した細胞を再び 同培地に懸濁し、 最終濃度が 1 0%となるように F C S
    [0089] (ゥシ胎児血清、 ギブコ社製） を加えた。 生細胞数はト リ パンブルー溶液 （和光純薬社製） にて染色して、 光学顕微 鏡下で計測した。
    [0090] これを 1 2穴のマイクロブレー ト （コースター社製） の 各穴に、 6. 3 Χ 10 Δ 個 Zm lから 2 x l 04 個 m l の希釈系列にした細胞溶液を 0. 5 m lずつ加えて 5% C 02 下、 37°Cで 9日間培養 （ナブコ社製、 C 02 イ ン キュベータ一） し、 細胞濃度と培養時間の予備検討を行つ た。 次いでマイクロプレー トの各穴に、 最終濃度が 0もし く は 1. 4 n g/m 1の参考例 1のガンマ一 · イ ンターフ ヱロン、 または 0もしく は 1. O n gZm lの参考例 2の インターロイキン一 1；8をそれぞれ単独、 または組み合わ せて 0. 025m〗ずつ添加し、 さらに予備検討の結果に 合わせて細胞濃度を 2. 0 X 104 個/ m 1 に希釈調整し た細胞溶液を 0. 5m lずつ加えて 5% C 02 下、 37 でで 12日間培養した。 培養後、 各穴の細胞は P B S ( + ) 溶液 （日水製薬社製） で洗浄し、 メタノール （和光純薬社 製） 固定した。
    [0091] C o l o 205細胞は実施例 1 (1) に示した方法によ り、 K P K— 1細胞は実施例 1 (2) に示した方法により、 それぞれ準備して参考例 1のガンマ一 ♦ イ ンターフヱロン 0もしく は 1. 4 n gZm 1、 あるいは参考例 2のインタ 一ロイキン一 1 を 0もしく は 1. O n gZm lの単独、 あるいは両者を併用して各細胞に対する増殖抑制効果を調 ベた。
    [0092] この結果、 第 3表に示すように SW 48細胞に対して イ ンターロイキン一 l Sもガンマ一 · イ ンターフェロンも 夫々単独では増殖抑制効果を示さないが、 両者を併用する ことにより、 その増殖を実に 9 0 %以上抑制した。 C a 1 u一 3細胞に対してはィンターロイキン一 1 ;5もガンマ一 • インターフヱロンも夫々単独では使用した瀵度では完全 に抑制しなかった。 しかし、 両者を併用することにより C a 1 u - 3細胞の増殖を実質上完全に抑制した。 K P K - 1及び C o 1 o 2 0 5細胞に対しても、 第 1表及び第 2 表に示した結果と同様に、 これらの細胞の増殖抑制効果は ィ ンターロイキン一 1 iSとガンマ一 · イ ンターフェロンの 併用により著しく上昇した。
    [0093] 第 3表：ヒト f w麟の増殖率 {%)
    [0094]
    [0095] 製剤例 1
    [0096] イ ンターロイキン一 l iS 0. S g /m ガンマ一 · イ ンターフェロン A 2 μ z /m ッウィ ーン 80 0. 0 1 m g /m 1 デキス トラ ン 4 0 1 5 m g /m 1 システィ ン 0. 1 m g / m 1
    [0097] H S A (ヒ ト血清アルブミ ン） 1. 0 m g / m 1 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 0 1 Mク ェン酸ークェン酸ナト リゥム緩銜液 （p H 6. 0 ) に加え て混合し、 混合物を漶過 （0. 2 2 # mメ ンプラ ンフィ ル ター使用） 後、 ¾液を無菌的に 1 m 1ずつバイアル瓶に分 注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明抗腫瘍剤を 調製した
    [0098] 該製剤は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1 に溶解して利 用される。
    [0099] 製剤例 2
    [0100] イ ンターロイキン一 1 S 0. 0 8 g /m 1 ガンマ一 · イ ンターフェロン 4 2 0 2 111 1 ッウィ ーン 8 0 0. 0 1 m g / m 1 デキス トラ ン 4 0 1 5 m g /m 1 システィ ン O. l m g Zm l H S A (ヒ ト血清アルブミ ン） 1. O m g Zm l 上記各成分を、 上記の濃度となるように、 0. 01Mク ェン酸一クェン酸ナトリウム锾街液 （p H6, 0) に加え て混合し、 混合物を濾遏 （0. 22 mメ ンブラ ンフィ ル ター使用） 後、 «液を無菌的に 1 m 1ずつバイアル瓶に分 注し、 凍結乾燥して、 注射用製剤形態の本発明抗腫瘍剤を 調製した。
    [0101] 該製剤は、 これを用時、 生理食塩水 1 m 1に溶解して利 用される。
    权利要求:
    Claims

    請求の範囲
    ガンマ一 · イ ンターフェロ ンとイ ンターロイキン一 1 とを有効成分として含有する抗腫疡剤。
    ガンマ一 · インターフェロンが、 天然型のガンマ一 ♦ インターフヱロンまたは遣伝子組換え法により産生され たガンマ一 ♦ イ ンターフェロ ンもしく はガンマ一 · イ ン ターフェ口 ン活性を有するガンマ一♦ イ ンターフェロ ン 誘導体である請求の範囲第 1項に記載の抗腫瘍剤。
    ガンマ一 · インターフヱロンが、 天然型のガンマ一 · インターフヱロンである請求の範囲第 1項に記載の抗腫 瘍剤。
    イ ンターロイキン一 1が、 天然型のィ ンターロイキン 一 1または遣伝子組換え法により産生されたィンタ一口 ィキン— 1もしく はイ ンターロイキン一 1活性を有する イ ンターロイキン一 1誘導体である請求の範囲第 1項に 記載の抗腫瘍剤。
    イ ンターロイキン一 1力 <、 天然型のィ ンターロイキン 一 1 ^または遗伝子組換え法により産生されたィンター ロイキン一 1 /S も しく はイ ンターロイキン一 1 ^活性を 有するイ ンターロイキン— 1 ^誘導体である請求の範囲 第 1項に記載の抗腫瘍剤。
    インターロイキン一 1が、 遣伝子組換え法により産生 されたィ ンターロイキン一 1 も しく はィ ンターロイキ ンー 1 活性を有するィンターロイキン一 1 誘導体で ある請求の範囲第 1項に記載の抗腫瘍剤。
    7 ヒ ト血清アルブミ ン、 糖類及び界面活性剤の少なく と も 1種を、 更に含有する請求の範囲第 1項に記載の抗腫瘍 剤。
    8 含硫還元剤を更に含有する請求の範囲第 1項に記載の 抗腫瘍剤。
    ガンマ一 ♦ イ ンターフェロ ンとイ ンターロイキン一 1 とを腫癀を有する患者に、 抗腫瘙に有効な量で、 投与す ることを特徴とする腫瘍の治療方法。
    10 ガンマ一 · イ ンターフヱロ ンが、 天然型のガンマ一 · インターフヱロンまたは遺伝子組換え法により産生され たガンマ一 · ィ ンターフェ口ンも しく はガンマ一 · ィ ン ターフェ口ン活性を有するガンマ一 ♦ イ ンターフェロ ン 誘導体である請求の範囲第 項に記載の方法。
    1 ガンマ一 · イ ンターフェロ ンが、 天然型のガンマ一 · イ ンターフヱロンである請求の範囲第 9項に記載の方法。
    2 イ ンターロイキン一 1力 、 天然型のィ ンターロイキン 一 1または遺伝子組換え法により産生されたィンタ一口 ィキン一 1 もしくはイ ンターロイキン一 1活性を有する インターロイキン一 1誘導体である請求の範囲第 9項に 記載の方法 o
    イ ンターロイキン一 1が、 天然型のィ ンターロイキン 一 1 5または遣伝子組換え法により産生されたィ ンター ロイキン一 1 もしく はインターロイキン一 1 活性を 有するイ ンターロイキン一 1 ^誘導体である請求の範囲 第 9項に記載の方法。
    インターロイキン一 1が、 遺伝子組換え法により産生 されたィ ンターロイキン一 l jSもしく はイ ンターロイキ ンー 1 活性を有するィ ンターロイキン一 1 ^誘導体で ある請求の範囲第 9項に記載の方法。
    ガンマ一 · イ ンターフェロンとイ ンターロイキン一 1 とを、 腫瘍の治療剤の製造に使用する用途。
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    EP0482213A1|1992-04-29|
    EP0482213B1|1998-09-02|
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    DK0482213T3|1999-02-08|
    ES2121782T3|1998-12-16|
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    DE69130099D1|1998-10-08|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1991-11-14| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU KR US |
    1991-11-14| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
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    优先权:
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    JP2120557A|JP2587711B2|1990-05-09|1990-05-09|抗腫瘍剤|
    JP2/120557||1990-05-09||DK91908798T| DK0482213T3|1990-05-09|1991-05-02|Antineoplastisk middel|
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