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    公开号:WO1991001376A1
    申请号:PCT/JP1990/000906
    申请日:1990-07-13
    公开日:1991-02-07
    发明作者:Terukatsu Arima；Osami Yamamoto；Masayuki Tsuchiya；Masanobu Oshima
    申请人:Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋白質及び それをコー ドする D N A並びに該蛋白質の製造方法
    [0002] 技術分野
    [0003] 本発明は新規な蛋白質及び D N A断片に関する。 詳し く は 血液伝播性非 A非 B型肝炎発症時に特異的に出現する血液伝 播性非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋白質及びそれをコードする D N A断片並びにこの D N A断片を使用する該蛋白質の製造 方法に関する。 閲連技術の記載
    [0004] ウィルス性肝炎のうち A型及び B型についてはすでにその ゥィルスが発見され免疫学的な方法による診断も可能となつ ており、 これらのウィ ルスに対するワクチンも開発されてい る。 しかしながら A型でもなく B型でもないいわゆる非 A非 B型といわれる肝炎に閔しては病因ウィ ルス量が生体内で極 めて微量であるため実体が明らかにされていないのが現状で ある。 血液伝播性非 A非 B型肝炎は輸血後肝炎の 90 %以上を 占め、 輸血をうけた人の 10— 20 %にこの肝炎が発症する 〔実 験医学 7巻、 196- 201 (1989 ) 〕 。
    [0005] 血液伝播性非 A非 B型肝炎に関連した抗原蛋白質の検索は いくつかの研究者により患者の血液を材料として展開されて いる。 例えば Chooら（Sc i ence , 244卷、 359 - 362 (1989) )及びョ 一口 ツバ出願公開 0318 216 A1 により血液伝播性非 A非 B型 肝炎患者の血液をチ ンパンジーに移入して感染させた後その 血清から R N Aを抽出し、 この R N Aから調製される cDNAラ イブラリーより非 A非 B型肝炎ゥィルス遺伝子の一部を単離 した旨の報告がなされている。 このウ ィ ルス遺伝子断片を基 にして作られた免疫学的手法による診断試薬を用いて我国の 血液サンプル試験の結果非 A非 B型肝炎ゥィルスに感染した 血液を 60〜70 %の確率で診断できるとの報告もなされている (厚生省肝炎研究連絡協議会報告 1989 , 3. 13) 。
    [0006] 一方、 特開昭 64— 2576には、 非 A非 B型肝炎患者血液をチ ンパンジーに移入して感染させた後、 その肝細胞から R N A を抽出し、 この R N Aを用いて非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋 白質遺伝子をクローン化した旨述べられている。
    [0007] 前者においては診断試薬の非 A非 B型肝炎ゥィルス感染血 液に対する診断確率が低いこと、 又該報告者がその論文中で も述べている如く クローン化された遺伝子が血液伝播性非 A 非 B型肝炎ウイルス遺伝子の想定塩基数に比べ充分な数でな いこと、 血液伝播性非 A非 B型肝炎ウ ィ ルスは 2種以上存在 する可能性のあることなどを考え合せると得られた知見はき わめて不十分なものである。
    [0008] 後者においてはクローン化された遣伝子がヒ ト非 A非 B型 肝炎特異的である直接的証拠が示されていない。
    [0009] 上記のいずれの場合にもチンパンジーを介して得られた R N Aが使用されており、 ヒ ト血液伝播性非 A非 B型肝炎ヒ ト患者から直接的に R N Aを抽出したものではないため、 ク ローン化された D N Aがヒ ト非 A非 B型肝炎ウィ ルスの遺伝 子を忠実に反映しているか否か明らかでなく、 確度の高い診 断試薬さらにはヮクチン開発が要望されていることを考える と新たなアプローチが必須である。
    [0010] そのひとつとして本発明者の 1人はすでに非 A非 B型肝炎 患者血液より直接 R N Aを抽出し、 本発明人が後述する方法 を用いてその成果を報告している 〔実験医学 7巻、 196 - 201 (1989)〕 。 明の概要
    [0011] 本発明者は上記の種々の問題点を解決するため、 鋭意研究 を行った結果、 非 A非 B型肝炎のヒ ト患者の肝細胞又は血液 から直接 R N Aを抽出し、 この R N Aに基いて血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋白質をコー ドする D N Aのクロー ニングに成功し、 本発明を完成した。
    [0012] 従って、 本発明は、 血液伝播性非 A非 B型肝炎の発症時に ヒ ト肝細胞内及びノ又は血液内に出現する血液伝播性非 A非 B型肝炎特異抗原蛋白質をコー ドしている D N Aを提供する。 本発明はさらに、 該 D N Aを舍む発現ベクターにより形質 転換された宿主を培養することを特徴とする血液伝播性非 A 非 B型肝炎特異抗原蛋白質の製造方法を提供する。
    [0013] 本発明はさらに、 前記の方法により製造される蛋白質を提 供する。 面面の箇単な説明
    [0014] 第 1図はファージクローン A HC2211中の挿入部の塩基配列 を示す。
    [0015] 第 2図はファージクローンス HC2246中の揷入部の塩基配列 を示す。
    [0016] 第 3図はファージク ローンス HC512 中の揷入部の塩基配列 及び対応するァ ミノ酸配列を示す。
    [0017] 第 4図はファージクローン λ HC2206中の揷入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0018] 第 5図はファージクローンス HC2207中の揷入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0019] 第 6図はファージクローンス HC2216中の挿入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0020] 第 7図はファージクローンス HC2220中の揷入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0021] 第 8図はファージクローン λ HC2230中の揷入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0022] 第 9図はファージクローンス HC2232中の揷入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0023] 第 10図はファージクローンス HC2244中の揷入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0024] 第 11図はファージクローンえ HC2248中の揷入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0025] 第 12図はファージクローン Λ HC2256中の揷入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。 第 13図はファ ージクロー ン λ HC2258中の挿入部の塩基配列 及び対 するァ ミノ酸配列を示す。
    [0026] 第 14図はファージクロー ン HC2270中の挿入部の塩基配列 及び対応するァ ミノ酸配列を示す。
    [0027] 第 15図はファージクロー ン ス HC2410C 中の挿入部の塩基配 列及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0028] 第 16図はファージク ロー ン HC2533中の挿入部の塩基配列 及び対応するァ ミノ酸配列を示す。
    [0029] 第 17図はファージベクター λ HC2607中の挿入部の塩基配列 及び対応するァミノ酸配列を示す。
    [0030] 第 18図はファージベクター λ HC2610中の挿入部の塩基配列 及び対応するァ ミノ酸配列を示す。
    [0031] 第 19図は、 第 1図に示すファージべクター / H C221 1中の挿 入部の塩基配列、 及び該配列に対応するァ ミノ酸配列を示す。 第 20図は、 第 2図に示すファージベクタース H C2246中の挿 入部の塩基配列、 及びそれに対応するァ ミノ酸配列を示す。 第 21図は発現用ブラスミ ド PFETR3の作製の系統を示す図で ある。
    [0032] 第 22図は、 ファージクローン 2207の cDNAが組み込まれてい るプラス ミ ド PTBC24の構造を示す図である。
    [0033] 第 23図はファージクローン 2246の cDNAが組み込まれている プラスミ ド PFET42の構造を示す図である。 発明を寞施するための好ましい形態
    [0034] 本発明の、 血液伝播性非 A非 B型肝炎特異抗原蛋白質をコ —ドする D NAは次の様にしてクローン化される。
    [0035] すなわち Chomczynskiらの方法 (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 162卷、 156-159(1987) 〕 に従って肝組織をチオシア ン酸グ ァニジ ン溶液に溶解せしめ、 フユノールークロロホルム抽出、 イ ソプロパノール沈殿により全 R N Aを調製するか、 血液よ り超遠心分離して全 R NAを調製する。 得られた全 R NAの —部をオ リ ゴ （dT) セルロースカ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ーに かけ精製し、 ポリ （A) 舍有 R NA (poly A+ BNA)を単離す る。
    [0036] この全 R N Aあるいは poly A+ RNA を原料として Ebinaら が Cell 40巻 P747-758(1980) に記載しているランダムブラ イマ一法に準じて cDNAライブラ リーを得る。 ランダムプライ マ一法による cDNAライブラリ一の構築は市販のキ 'ン ト （アマ シャム社製 cDNA合成システムプラス、 cDNAク ローニングシス テム一 ス gt 11)で実現される。 このキッ トは発現クローニン グベクタ—である ス gt 11 を利用しており、 gt 11 ファー ジ内に組み込まれた cDNAは / 1 gt 11 ファージ上の /S— gal 遣 伝子の中に組み込まれるので、 該ファージの大腸菌への感染 後 IPTG (イ ソプロピル |9一 D -ガラク トビラノ シド） 等での ラク トースォペロンプロモーターの誘導により ーガラク ト シダーゼとの融合蛋白質として容易に発現される。
    [0037] 発現の確認は免疫スク リ ーニングにより達成される。 すな わち血液伝播性非 A非 B型肝炎患者血清及びそれより調製さ れた IgG分画を一次抗体として酵素標識した二次抗体を結合 させ発色させることによるものである 〔その原理については 実験医学 6巻 958-964(1988) を参照のこ と〕 。
    [0038] この様にして得られた陽性クロー ンに関しさらに B型肝炎 患者血清及び正常人血清を用いて選別を進め、 非 A非 B型肝 炎患者血清と特異的に反応するク ロー ンを選別する。
    [0039] 上記の様にして得られる cDNAは血液伝播性非 A非 B型肝炎 特異抗原のネィティ ブな蛋白質の全部又は一部分をコー ドし ており、 本発明の D N Aは該 cDNAに限定されるものではな く - 該蛋白質のァ ミノ酸配列を異るコ ド ンにより コー ド している D N Aをも包舍する。 本発明の D N Aはさ に、 前記 cDNA塩 基配列と完全には同一ではないが、 ウ ィ ルスの同定に用いら れる通常の条件下で該 cDNAとハイブリダィズする程度に相同 であり、 なお前記の抗原性を有する蛋白質をコー ドしている D N Aをも包舍する。
    [0040] 本発明の上記 D N Aは、 細菌、 酵母又は動物細胞等の宿主 において血液伝播性非 A非 B型肝炎特異抗原を産生せしめる ための遺伝子系を構成するための素材として有用である。 細 菌性宿主としては例えば大腸菌を挙げることができる。 目的 とする抗原蛋白質の製造は、 本発明においてクローユ ングさ れた cDNAを用い、 遺伝子工学的常法に従って行う ことができ る。 例えば、 本発明の cDNAのコード領域の上流及び下流にそ れぞれ翻訳開始コ ド ン及び翻訳終止コ ド ンを付加し、 これを、 選択された宿主中で機能し得るプロモーター、 ターミネータ 一等の発現制御系を有するベクター、 例えばプラス ミ ドに揷 入することにより発現ベクター、 例えば発現プラス ミ ドを構 築することができる。 使用し得るプロモーター、 ターミネータ一系としては、 例 えば、 大腸菌ではも r pプロセーモー、 £ a 。プロモーター、 T 7プロモーター、 及び rrnBターミネ一ター等を用いること ができ、 酵母、 例えばサッカロ ミセス ' セレビシエー
    [0041] ( Saccharomyces serevi c i ae ) で P G kプロモ一ター、 ADH 1 プロモータ一、 GAL 10プロモーター、 及び A D Hター ミネーター等を用いることができる。 さらに、 動物細胞、 例 えば C H 0細胞、 CV— 1細胞、 NIH3T3細胞等においては SV40 初期プロモーター、 アデノ ウ イルス主後期プロモータ一、 ラ ウス肉腫ウ ィルス L T R、 及び SV40ポリ Aシグナル等を用い ることができる。 発現ベクターの構築方法、 形質転換方法、 宿主の培養方法、 発現の誘導方法、 産生した蛋白質の回収 · 精製方法等はすべて常法に従って行う ことができる。 例えば、 大腸菌を用いて産生した蛋白質の回収 · 精製は、 大腸菌を破 碎後、 目的の蛋白質を舍む不溶性の顆粒を 8 M尿素等で溶解 させ、 イオン交換樹脂等を用いたカラムクロマ トグラフィー により行う ことができる。 本発明の抗原蛋白質の産生の例を 実施例 7に具体的に示す。
    [0042] 本発明の D N Aはさらに、 例えばワクチニァウィ ルス等の ベクターに組み込んで生ワクチンを作製するための遺伝子源 としても有用である。 本発明の D N Aはまた、 非 A非 B型肝 炎ウィルスの検出 · 診断のため、 又は該ウイルスの遣伝子を 新たにクローユングするためのプローブとしても使用できる 本発明の非 A非 B型肝炎特異抗原蛋白質は、 血液試料を用 いて非 A非 B型肝炎を診断する場合の試薬として有用である 例えば、 本発明の方法により得られた抗原蛋白質を検出試薬 として用いて、 例えばウェスタ ンプロ ッ ト法、 ェンザィ ムィ ムノ ア ッセィ法、 ラテッ クス凝集法、 ラジオィ ムノ ア ッセィ 法等により、 被検患者の血清中の非 A非 B型肝炎の一次抗体 を検出することができ、 これにより血液伝播性非 A非 B型肝 炎の感染を診断することができる。 このこ とは、 実施例 7 に より調製した抗原蛋白質を用いて非 A非 B患者由来の血清中 の一次抗体をウェスタ ンブロ ッ ト法により実験的に検出する こ とができたことにより確認された。
    [0043] 次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
    [0044] 実施例 1. cDNAライブラ リ一の構築
    [0045] (1) R N Aの調製
    [0046] 肝癌を合併した慢性血液伝播性非 A非 B型肝炎患者より、 肝癌切除の際、 非瘙部肝組織約 1 gを得た。 この組織より
    [0047] Chomczynskiらの方法 [ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 162巻、 156-159 (1987 ) 〕 に従い全 R N Aを下記の如く調製した。
    [0048] 6名の患者由来の肝組織約 1 gにそれぞれ溶液 D 〔 4 Mチ オシア ン酸グァニジン、 25mMクェン酸ナ ト リ ウム （pH 7 ) 、 0. 5 %ザルコ シル、 0. 1 M 2—メ ルカプ トエタノ ール〕 10 jag を加え、 ホモゲナイ ズし、 可溶化した。 この可溶物に 2 M酢 酸ナ ト リ ウム (PH 4 ) 1 、 水飽和フユノ 一ル 10«ώ、 及びク 口 口ホルムノィ ソア ミ ルアルコ一ル （49 ： 1 ) 2 ^を順次撹 拌しながら加え、 氷中に 15分間放置した。 Sorvall SS-34口 一ターで、 4 てにて 12000rpm、 20分間遠心して水層を回収し、 ィ ソブロバノ ール ΙΟίώを加えて撹拌後一 20てにて 1時間放置 した。 Sorvall SS-34ローターを用いて 4 *Cにて 12000rpm、 20分間遠心して沈殿を回収し、 溶液 D 3 fflUこ再溶解後、 イ ソ プロバノール 3 ^を加えて再度一 20'Cにて 1時間静置した。 遠心により沈殿を面収し、 75%エタノ ールで洗浄後、 得られ た 0. 5 ig〜 1. 5 mgの全 R N Aの沈殿を蒸留水に溶解させた。
    [0049] また、 血液からの全 R N Aの調製は次の様にして行った。
    [0050] A L T値が異常高値で HBsAgおよび HBV- DNAが陰性を示す血 漿 70 £に等量の希釈液 （50mMト リ ス— HC1, ImM EDTA,PH8.0) を加え、 ショ糖密度勾配遠心法で 90, 000 X gで遠心し、 比重 1.12〜 1.29の分画を得た。 希釈液に対して透折したのち凍結 乾燥し、 チォシア ン酸グァニジンを舍む溶液 Dに溶解したの ち、 キャ リ アのポリ Cを加え、 フエノール · クロ口ホルム ' イ ソアミルアルコール混合液で抽出した。 この水層に等量の ィ ソプロバノ一ルを加え核酸を沈殿させた。 この操作をさら に一度操り返したのち、 75%エタノール中に保存した。 さら に、 この分画に混入している D N Aを除去する目的で、 市販 の BNaseフ リーの DNaseをァガロース一 5 ' ( 4 —ア ミノ フ ェニルホスホリ ル） ーゥ リ ジン一 2 ' ( 3 ' ) 一リ ン酸でァ フィニテイ ク口マ トを行い、 この中に含まれる可能性のある 微量の RNaseを除いた DNase分画で処理した。 さらに、 残つ た R N A中のキャ リ アのボリ Cをオリ ゴ （ dG) セルロース力 ラムで除き NENS0RB(DuPont社） で精製した。
    [0051] ポリ A舍有 R N Aの調製は次の様にして行った。 約 500 の全 R N Aを舍む溶液に 20%ラゥ リル硫酸ナ トリ ウムを加え て 0. 5 %とし、 65てにて 10分間の加熱の後、 10mMト リスー HC1 (pH 8 ) 、 0. 5 M NaCK 1 mM EDTA に調整し、 オリ ゴ（dT) セルロース （フアルマシア社） カラムク ロマ トグラフ ィーに かけて行つた。 10mM ト リ ス— HC1 (pH7. 5 ) 、 1 mM EDTA から なる溶液でポリ A含有 R N Aをカラムから溶出し、 10〜15w のポリ A舍有 R N Aを得た。
    [0052] (2) cDNAの合成
    [0053] 市販の cDNA合成キッ ト 〔アマシャム cDNA合成システムプラ ス（code RP 1256) 〕 を用い cDNA合成を行った。
    [0054] 上記で調製した RNA 5 に cDNA合成システムプラス （アマ シャム code RPN 1256)に含まれる 5 Xファース トス ト ラ ン ド 合成反応用バッファー 10 、 ピロ リ ン酸ナ ト リ ウム溶液 2. 5 ヽ ヒ ト胎盤リ ボヌク レアーゼイ ンヒビター 2. 5 、 デォキ シヌク レオシ ド三リ ン酸混液 5 W、 プライマ一 5 、 ( oc- 32P〕 dCTP (アマシャム PB 10205) 2 id、 水及び逆転写酵素 溶液 100ュニッ トを加えて 50^£とした。 プライ マーは铸型と して No. 及び Nc 5の R N Aを用いる場合はォリ ゴ（dT)プライ マー、 他の R N Aを用いる場合はラ ンダムへキサヌク レオチ ドプライマ一を用いた。 42 · (：、 40分のイ ンキュベーショ ンの 後、 第一鎖 cDNA合成反応液に、 第二鎖合成反応用バッ ファー 93.5 、 大腸菌リ ボヌク レアーゼ H 4ュニッ ト、 大腸菌 D N Aボリメ ラーゼ I 115ユニッ ト及び水を加え 250 Wと した。 12Ϊ 60分、 22て60分の反応後、 70 で 10分間ィ ンキュベ一 ト した。 T4 DNAポリ メ ラーゼ 10ュ二ッ トを加えて 37てで 10分間 反応させた後 0.25M EDTA (pH8. 0 ) を加えた。 この反応 物をフヱノール クロ口ホルム抽出し、 反応液の等量の 4 M 齚酸ァンモユウム溶液を加えてヱタノール沈殿を行つた。 以 上の操作を操返すことにより第 1表に示す cDNAを得た。 尚 R N Aサンプル No.4 , 5 , 22 , 24及び 25は肝細胞由来であり、 No,26は血液由来のものである。
    [0055] R N Aサンブル R N A量 二本鎖 cDNA
    [0056] ( PS ) (ng)
    [0057] Να 4 (ポリ Α舍有 R N A ) 15 1260
    [0058] 5 (ポリ A含有 R N A ) 10.5 4500
    [0059] 22 (全 R N A ) 8 260
    [0060] 24 (全 R N A ) 20 1400
    [0061] 25 (全 R N A ) 22 260
    [0062] 26 (全 R N A ) 5 5200
    [0063] (3) cDNAライブラ リ 一の構築
    [0064] cDNAライ ブラ リ一の構築は cDNAク ローニングシステム一 λ gt 11 (アマシャム code RP 1280) を用いて行った。
    [0065] 上記で得られた cDNA (〜： I ） に Mバッファー 4 /rf、 I X SAM 镕液 2 fi£、 水、 及び EcoR I メチラーゼ 20ュニッ トを加え て 20 とした。 37 にて 60分の反応の後、 70 で 10分間加熱 した。 次にこの反応液に Lノ、'ッファー 3 、 EcoR I リ ンカ一 2 id, 水、 及び T4 DNAリガーゼ 5ュニッ トを加えて 30 Wとし 15てで一晩反応させた。 70·" 10分間の加熱で反応を停止さ せた後、 Eバッファー 10 、 水、 EcoB I 100ュニッ ト ^加え て 100 とし、 37'C、 5時間反応させた。 70'C、 10分間の加 熱で反応を停止させた後、 cDNAクローニ ングシステムに添付 されているカラムで遊離のリ ンカ一を除去し、 エタノール沈 殿により次の第 2表に示す量の EcoR I リ ンカー付加 cDNAを得 た。 第 2
    [0066] R N Aサ ンプル EcoR I リ ンカ一付加 cDNA
    [0067] (ng)
    [0068] Να 4 (ボリ Α舍有 R N A ) 460
    [0069] 5 (ポリ A舍有 R N A ) 1470
    [0070] 22 (全 R N A ) 27
    [0071] 24 (全 R N A ) 100
    [0072] 25 (全 R N A ) 24
    [0073] 26 (全 R N A ) 2200 この cDNAlO〜： lOOng に ス gt 11 アーム 1 、 Lノ 'ン フ ァ ー 1 ^、 水、 及び T4 DNAリガーゼ 2.5ュニッ トを加えて 10 Wと し、 15 ·( で一晩反応させた。 この反応液にェクス トラク ト A 及びェク ス トラク ト B 15 を加えて、 20てで 2時間保つ ことにより in vi troパッケージングを行い、 S Mノ、' ッ フ ァ ー (50mM Tris-HCl pH 7. 5、 lOOraM NaCl, lOmM MgS04 0.01% ゼラチン） 0. 5 s£、 及びクロ口ホルム数滴を加えてファージ 液とした。 ファージ液のタイ ト レーシヨ ンを行ったところ、 cDNAライブラ リーとして下記の第 3表に示す結果を得た。 第 3 表
    [0074] R N Aサンプル 組換体ファージ数 組換率
    [0075] (PFU) (%)
    [0076] No. 4 (ポリ A舍有 R N A ) 1. 2 X106 75
    [0077] 5 (ボリ A舍有 R N A ) 3.2 X 106 82
    [0078] 22 (全 R N A ) 3.0 X105 48
    [0079] 24 (全 R N A) 1. 3 X106 48
    [0080] 25 (全 R N A) 2. 0 X105 53
    [0081] 26 (全 R N A) 5. 1 X107 89 組換率 （％) = 100X組換体ファージ数ノ総ファージ数 実施例 2. cDNAライブラリ一スク リーニング用一次抗体の調- 大腸菌 Y 1090株を 0.4 %マル トース、 50 / ァ ンビシ リ ンを舍む L一ブロース （10gZ バク ト ト リブトン、 5 g / £ ノ ク ト イ ース トエキス ト ラ ク ト及び 10gZ£ NaCl)で 37*C 一晩振とう培養した。 この培養液 1 flifiを 0.4 %マル トース、 50/«Ζ»βァンビシリ ンを舍む L—ブロース 50«Uこ加え、 37'C で OD60。 が 0.5 ( 2.5 X108 細胞ノ/ afi) になるまで振とう培 養を行った。 大腸菌を遠心によって集め、 P B S (Phosphate buffered- saline) 5 こ懸濁した。 0.5 M EDTA ( pH 8 ) 6 id リゾチーム （最終濃度 0. 1 mgZ^) を加え、 氷中に 30分保つ た。 凍結溶解を 3回操返し、 大腸菌細胞破碎物 （E.coli lysate) ¾■得た 0
    [0082] 一次抗体を血清から下記の如く調製した。 血液伝播性非 A 非 B型肝炎患者由来血清は急性非 A非 B型肝炎回復期の患者 5名分、 及び慢性非 A非 B型肝炎患者 5名分の血清を一つに まとめて用いた。 硫酸ァンモニゥム 33%飽和にて血清 ΙΟκβを 処理し、 免疫グロブリ ンを舍む沈殿を得た。 この沈殿を T B S ClOmM Tris-HCl (pH7.5)、 150mM NaCl 〕 10«£に懸濁し、 前記大腸菌細胞破砕物 10/κβを加えて、 4 'C一晩もしく は 37て 1時間振とう した。 3000rpm 、 10分間の遠心（HITACHI 05PR- 22) により沈殿物を除去後、 1 %ゲラチンを含む TBS 180 を加えてマイ レクス H A ( 0.45卿、 ミ リポア社） でろ過し、 一次抗体とした。
    [0083] 正常人由来血清、 及び B型肝炎患者由来血清に閩しては、 それぞれの血清 1 fflfiに大腸菌細胞破砕物 1 を加え、 4 'C一 晩振とう した。 3000rpm、 10分間の遠心（HITACHI 05PR-22) により沈殿物を除丟後、 1 %ゲラチンを舍む TBS 18 ^を加え てマイ レクス H A ( 0.45wi！、 ミ リ ボア社） でろ過し、 一次抗 体とした。
    [0084] 実施例 3. cDNAライブラリーのスク リーニング
    [0085] 大腸菌 Y 1090株を 0. 4 %マル トース及び ァンビシ リ ンを舍む L一ブロース 10 « 中で 37 'Cにて一晩培養し、 遠 心により集菌後 lOraM MgS044 こ懸濁し、 プレーティ ング用 細胞とした。
    [0086] ファージ液を S Μバッファーで希釈し、 約 6000PFUZ100 とした。 プレーティ ング用細胞 200 W及びファージ液 100 を混合し、 37てで 15〜20分保った。 この溶液を溶解した L 一 ト ップアガー （ 7 g /H ァガロースを舍む L一ブロース） ΙΟδζΠこ加え、 Lーァガー （15gZ バク ト―ァガーを舍む L 一ブロース） の入ったプレー ト （栄研化学、 2号角シャーレ） に流し込んだ。 43てで 3〜 4時間培養後、 10mM IPTG (イ ソプ 口ビル^— D—チォガラク トビラノ シ ド） に浸した後に風乾 した二 ト ロセルロースフ ィ レタ一（Schleicher & Schnell, BA85) をプレー トに重層し、 さらに 37てで 3〜 4時間培養し た。 フ ィ ルターをはがし、 T B S (lOmM Tris-HCl pH 7.5、 150mM NaCl)で洗浄後、 5 %脱脂乳 （雪印乳業） を舍む T B S中で室温 1〜 2時間振とう した。 T B S中での 1〜 2分間 振とう し、 フ ィ ルターを洗淨した。 これを 3回繰返した後、 フィルターを前記の一次抗体に浸し、 4てで一晩反応させた。 フ ィ ルターを TBST(0.05% Tween 20 を舍む TBS)中で 5分簡、 5回洗浄後、 パーォキシダーゼ接合抗-ヒ ト IgG (ャギ）（Cappel 社 code 3201-0081) 溶液 （ 1 %ゲラチンを舍む TBSでの 500 倍希釈液） に浸し、 室温で 1.5時間反応させ、 上記と同様に TBSTで洗浄した。 フ ィ ルターを HRP—力ラー溶液 〔 120mg HRP-color(Bio-RAD 社） 、 40ffi£メタノースレ、 200¾£ TBS、
    [0087] 過酸化水素〕 中で反応させ発色したクローンを陽性と した。 その結果次の第 4表に示す陽性クローンが得られた。
    [0088] 第 4 表
    [0089] R N Aサ ンプル 処理ク ローン数 陽性ク ローン数
    [0090] No. 4 340,000 5
    [0091] 5 270,000 8
    [0092] 22 150,000 45 24 300,000 14 25 200,000 18 26 260,000 9 得られた陽性ク ローンについてシ ングルプラーク ア イ ソ レ ーシ ョ ンを行った後、 前記の正常人由来血清、 及び B型肝炎 患者由来血清との反応性を調べた。
    [0093] 上記と同様の方法により、 5名の健常人及び 5名の B型肝 炎患者由来の一次抗体と反応させた結果血液伝播性非 A非 B 型肝炎患者由来血清とのみ特異的に反応する 61ク ローンを得 た。 これらのクローン （フ ァージ） を次の第 5表に示す。 なお、 これらのクローンを舍有する大腸菌 Y 1090は、 工業 技術院微生物工業技術研究所 （住所 ： 日本国茨城県筑波市東 1丁目 1番 3号） に寄託されており、 その内の若干の株につ いてはブタぺス ト条約に基づく国際寄託に、 1990年 6月 14日 に移管された。 第 5 表 フ ァ ージ 国内寄託番号 国際寄託番号 寄託日 ク ローン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄）
    [0094] λ HC 432 10897 1989 7 26 λ HC 436 10898 1989 7 26 λ HC 512 10841 2951 1989 7 13 λ HC 522 10842 1989 7 13 λ HC 524 10843 1989 7 13 λ HC 526 10844 1989 7 13 λ HC 2206 10845 2952 1989 7 13 λ HC 2207 10846 2953 1989 7 13 え HC 2211 10876 2956 1989 7 21 λ HC 2216 10877 2957 1989 7 21 λ HC 2217 10852 1989 7 18 λ HC 2220 10853 2954 1989 7 18 λ HC 2225 10854 1989 7 18 ス HC 2230 10916 2966 1989 8 2 λ HC 2232 10930 2968 1989 8 9 A HC 2239 10931 1989 8 9 λ HC 2240 10855 1989 7 18 λ HC 2241 10856 1989 7 18 A HC 2242 10857 1989 7 18 λ HC 2243 10878 1989 7 21 Λ HC 2244 10879 2958 1989 7 21 λ HC 2246 10858 2955 1989 7 18 フ ァ ー ジ 国内寄託番号 国際寄託番号 寄託日 ク ロ ー ン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄）
    [0095] λ HC 2248 10880 2959 1989 7 21 λ HC 2249 10917 1989 8 2 λ HC 2250 10904 1989 7 28 λ HC 2252 10881 1989 7 21 λ HC 2255 10889 1989 7 26 λ HC 2256 10890 2960 1989 7 26 λ HC 2258 10891 2961 1989 7 26 λ HC 2259 10892 1989 7 26 λ HC 2263 10893 1989 7 26 λ HC 2264 10932 1989 8 9 λ HC 2265 10933 1989 8 9 ス HC 2268 10894 1989 7 26 λ HC 2270 10895 2962 1989 7 26 λ HC 2271 10896 1989 7 26 λ HC 2404C 10899 1989 7 26 λ HC 2405Β 10900 1989 7 26 λ HC 2410A 10905 1989 7 28 λ HC 2410C 10918 2967 1989 8 2 ス HC 2410D 10934 1989 8 9 ス HC 2413 10919 1989 8 2 λ HC 2414A 10906 1989 7 28 ス HC 2424 A 10911 1989 7 28 ス HC 2501 10920 1989 8 2 ファージ 国内寄託番号 国際寄託番号 寄託曰 ク ローン No. (微ェ研菌寄） （微ェ研条寄）
    [0096] λ HC 2502 10847 1989 7 13 λ HC 2505 10921 1989 8 2 λ HC 2507 10935 1989 8 9 λ HC 2508 10859 1989 7 18 λ HC 2509 10936 1989 8 9 λ HC 2512 10882 1989 7 21 λ HC 2514 10860 1989 7 18 λ HC 2516 10861 1989 7 18 λ HC 2533 10907 2963 1989 7 28 λ HC 2534 10937 1989 8 9 λ HC 2535 10883 1989 7 21 λ HC 2602 10908 1989 7 28 λ HC 2603Β 10922 1989 8 2 A HC 2607 10909 2964 1989 7 28 λ HC 2608 10923 1989 8 2 A HC 2610 10910 2965 1989 7 28 実施例 4. ファージク ローン え HC2211に揷入されている cDNA の塩基配列
    [0097] 組換えファージ I HC2211を大腸菌 Y 1090株を用いて増殖さ せた。 常法 （実験医学、 5卷 994- 998頁、 1987年） に従って ファージを精製し、 ラウ リル硫酸ナ ト リ ウム処理、 フヱノー ル処理によってファージ D N Aを調製した。 ファージ D N A 約 lOOwを EcoR I で処理し、 1 %低融点ァガロース（Biolad 社） ゲル電気泳動により cDNAである約 700塩基対 （bp) の D N A断片約 0. 6 wを回収した。 この D N A断片をファージ ベクター M13mpl8(宝酒造） の EcoR I部位に組み込んだ。 更に プラス ミ ド PUC19(宝酒造） の EcoR I 部位にも挿入し、 pMC26 を得た。 次に PMC26より EcoR I末端 cDNA断片を調製し、 Bal
    [0098] I で処理した ¾、 M13mpl8 の Hinc 1部位及び Hinc II — EcoR I 部位に揷入した。 また EcoR I末端 cDNA断片を Sau3A I で処理 した後、 M13mpl8 の BamH I — EcoB l部位に挿入した。 得られ た M13mpl8をベクターとする組換えファージを用いて、 ジデ ォキシ (dideoxy) ¾ (J. Messing, Methods in Enzymology 101 卷、 20-78頁、 1983年） により cDNAの塩基配列を決定した。 得られた塩基配列を第 1図に示す。
    [0099] 血液伝播性非 A非 B型ゥィルスはその性質より フラビウイ ルスであると考えられている （Qui-Lin Choo等、 Science,
    [0100] 244巻、 359頁（1989)) 。 フラビウィ ルス由来の蛋白質はひ と続きの長いオープンリ一ディ ングフ レームより一つのプリ カーサ一ポリプロティ ンとして合成される（E.G.Westaway, Advances in virus research, 33卷、 45頁（1987)) 0 —方第 1図に示す塩基配列の 5 ' 端から合成されると類推される蛋 白質は終止コ ドンの存在により合成が cDNAの途中で終止する β このことより、 λ HC2211に挿入されている cDNAはフラビウイ ルスである血液伝播性非 A非 B型肝炎ウイルス由来であると 考えると、 cDNAライブラ リー構築時の不可避の可能性として、 2つの D N A断片が同時に組込まれたとの想定もできる。 し たがって HC2211における非 A非 B型肝炎に特異的な領域は、 少なく とも終止コ ドン以前の蛋白質部分の一部であることも 考えられる。
    [0101] 実施例 5. ファージク ローン ス HC2246に揷入されている cDNA の塩基配列
    [0102] 組換えファージス HC2246から実施例 4 と同様にしてファー ジ D NAを調製した。 ファージ D NA約 10 を Kpn I及び
    [0103] Sac I で処理し、 大腸菌 D N Aボリ メ ラーゼ I ク レノ ー断片 で平滑末端化した。 1 %低融点ァガロース （Biolad社） ゲル 電気泳動により cDHAを舍む約 2.5キロ塩基対 （kb) の D N A 断片 0.3 を回収し、 ファージベクター M13mpl8(宝酒造） の
    [0104] Sma I部位に組込んだ。 更にこの D N A断片をブラスミ ド pUC18(宝酒造） の Sma I部位に組込み、 プラスミ ド PMC42 を 得た。 次に PMC42約 20 を EcoR I及び PvuEで処理し、 1 % 低融点ァガロース （Biolad社） ゲル電気泳動により cDNAを舍 む約 0.5 kbの D N A断片約 2 を回収した。 この EcoR I 一
    [0105] Pvu II DNA 断片を Bal lで処理した後、 ファージベクター M13mpl8 の EcoR I — Hinc II部位、 及び Hinc II部位にそれぞれ 揷入した。 得られた M13mP18をベクターとする組換えファー シを用いて Lambda gtl 1 Primer (New England Biolabs社 _) も しく は M13 Primer (東洋紡績） を用いたジデォキシ（dideoxy) 法 U,Hessing, Methods in Enzymology 101卷、 20-78 頁、 1983年） により cDNAの塩基配列を決定した。 得られた塩基配 列を第 2図に示す。 実施例 6. ージ I HC512 、 λ HC2206. λ HC2207v λ HC 2216 λ HC2220. ス HC2230 λ HC2232 λ HC2244. λ HC2248. ス HC2256 λ HC2258 λ HC2270. λ HC 2410C λ HC2533s ス HC2607及び / HC2610に されている cDNAの'
    [0106] 組換ファージ 1 HC512 λ HC2206. λ HC2207. λ HC2216. ス HC2220 λ HC2230. λ HC2232. λ HC2244. λ HC2248. λ HC 2256 λ HC2258. λ HC2270. λ HC2410C λ HC2533. λ HC 2607及びス HC2610から、 実施例 4に記載したのと同様にして ファージ D Ν Αを調製した。
    [0107] λ HC2206及び λ HC2232の cDNAを舍む EcoRJ断片を実施例 4 と同様にして調製し、 それぞれ M13mpl8及び PUC19の EcoB I 部位に挿入した。 他方、 A HC512 I HC2207. λ HC2216.
    [0108] λ HC2220. λ HC2230. λ HC2244. λ HC2248. λ HC2256. λ HC 2258 λ HC2270 λ HC2410C . λ HC2533. /I HC2607及び / I HC 2610の cDNAを舍む Kpn I — Sac I 断片を実施例 5 と同様にし て調製し、 そして A HC2230 λ HC2256. λ HC2270. λ HC2410C. λ HC2533. ス HC2607及びス HC2610からの D Ν Α断片は pUC18 の Sma l部位に、 A HC512 λ HC2207. 1 HC2216 λ HC2220 及び λ HC2244からの D Ν Α断片は pUC19の Hinc II部位に、 そ してス HC2248及びス HC2258からの D N A断片は pUC19の Kpn I 一 Sac I部位にそれぞれ挿入した。 さらに ス HC2244の D N A断片が挿入されたプラス ミ ドより cDNAを舍む Hinc Π — Cla I断片を回収し、 M13mpl8の Hinc H — Cla I部位に挿入した。 得られたプラスミ ド及びファージを用い、 Lambda gtll Primer (New England Biolabs社） 、 M13Primer (東洋紡） を用いた ジデォキシ法 U · Mess ing, Methods in Enzyraology 101卷、 20 -78 頁、 1983年） により cDNAの塩基配列を決定した。 さらに 得られた cDNAの塩基配列の一部に対応する配列のォリ ゴヌク レオチ ドを自動 D N A合成機 （アプライ ドバイオシステムズ 社） により合成した。 cDNAの塩基配列は合成されたオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーとしたジデォキシ法によっても決定 された。
    [0109] これらの cDNAの決定された塩基配列をそれぞれ第 3図〜第 18図に示す。
    [0110] 実施例 7. 血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋白晳をコ
    [0111] 一ドする cDNAの大腸菌での発現
    [0112] (1) 発現ベクター pFETR3の構築 （第 21図）
    [0113] ト リ プ トファ ン（trP) 形質導入ファージ λ c I 857 trpBDIO F-Miozzariら、 J. Bacteriology, 133¾. 1457 (1978)) より調製される大腸菌 trp オペ口ンの転写開始点上流 310bp の Hpa ll部位より転写開始点下流 21bpの Taq l部位までの trpプロモーターを舍む 331bpの D N A断片が pBR322の Cla I部位に揷入されているプラスミ ド pTMlを EcoB I及び HindBI で消化し、 trpプロモータ一を舍む約 0. 4 kbの D N A断片を 低融点ァガロースゲル電気泳勖法にて回収した。 PKK223-3 (フアルマシア社） を EcoR I及び Hind Π [で消化して約 4. 5 kb の D N A断片を得、 これに上記の約 0. 4 kbの D N A断片を T4 DNAリガーゼを用いて連結した。 こう して得られたブラスミ ドを EcoR I で消化し、 大腸菌 D N Aポリメ ラーゼ I (ク レノ ゥ断片） により平滑末端とした後、 Pvu IIで消化した。 得ら れた約 3 kbの D N A断片を T4 DNAリガーゼを用いて環化し、 プラス ミ ド pFETRlを得た。
    [0114] プラスミ ド pFETRlを EcoR I で消化し、 生じた D N A断片の 末端を大腸菌 D N Aボリ メ ラーゼ 〖 （ク レノ ウ断片） にて平 滑末端とし、 次に T4 DNAリガ一ゼを用いて環化することによ り、 EcoR I部位の欠失した Trpプロモーターを有するプラス ミ ド PFETR12 を得た。
    [0115] このプラス ミ ド PFETR12 の trpプロモーターの下流に翻訳 開始コ ド ン（ATG) 及び終止コ ド ン（TGA) 並びにク ローニ ング 部位を付与するため、 D N A自動合成機 （アプライ ドバイオ システムズ社、 380A型） により 36mer及び 38merのオリ ゴヌ ク レオチ ドを合成し、 これらをアニーリ ングすることにより 下記の D N Aリ ンカ一を得た。
    [0116] HindDIMet EcoR I stop stop stop
    [0117] 38raer 5' CGATAAGCTTATGGAATTCAGCTGflCTGACTGAGCA 3' 36mer 3' TATTCGAATACCTTAAGTCGACTGACTGACTCGTTCGA 5'
    [0118] Pvu H 前記のプラスミ ド PFETB12 を Cla I及び Hind で消化して 得た D N A断片に、 上記の合成 D N Aリ ンカーを、 T4 DNAリ ガーゼを用いて連結し、 trpプロモーターを有する発現べク タ一 PFETB3を得た。
    [0119] (2) 組換えファージ λ HC2207中の cDNAの大腸菌での発現 実施例 6に記載したようにして ； I HC2207の cDNA (第 5図） を pUC19の Hinc Π部位に挿入することにより得られたプラス ミ ド （これを PMC24と称する） を Pst I及び EcoB I で消化し. 低融点ァガロースゲル電気泳劻法により cDNAを舍む約 0. 6 kb の D N A断片を得た。 この D N A断片は、 cDNAの 5 ' 側端の 一部を欠いているため、 この欠落部位に相当する cDNA部分に よりコー ドされるァミノ酸配列に基づき、 D N A合成機 （ァ プライ ドバイオシステムズ社、 380 A型） により 79mer及び
    [0120] 73merのォリ ゴヌク レオチ ドを合成し、 これらを T 4 ポリ ヌ ク レオチ ドキナーゼにより リ ン酸化した後、 ァニーリ ングに より下記の D N Aリ ンカーを得た。
    [0121] 10 20 30 40
    [0122] 79mer 5' CGATAAGCTTATGATAGCATTTGCAAGTAGAGGAAATCAC 73ieer 3' TATTCGAATACTATCGTAAACGTTCATCTCCTTTAGTG
    [0123] ■ ,！ ιΜ I A F A S R G N H
    [0124] Cla I Hindi
    [0125] 50 60 70
    [0126] GTGTCCCCCACGCACTATGTGCCTGAAfiGCGACGCTGCA 3' CACAGGGGGTGCGTCATACACGGACTTTCGCTGCG 5' V S P T H Y V P E S D A A
    [0127] Pst I 前記プラス ミ ド を Cla I及び EcoR I で消化し、 得ら れた D N A断片に、 上記の合成リ ンカー及び前記の 0. 6 の D N A断片を連結し、 trpプロモーター及びその制御下にあ る ス HC2207 cDNA を舍む発現ベクター pTRC24を得た。 このブ ラスミ ドの構造を第 22図に示す。
    [0128] PTRC24を用いて大腸菌 W3110株を常法により形質転換した, 得られた形質転換株を 100 ノ トリブ トフ ァ ン、 50 ノ^ アンビシリ ンを舍む 2 X ΤΥ培地 （ 1. 6 %バク ト ト リプ ト ン、 1 %イース トエキス トラク ト、 0. 5 % NaCl)に接種し、 37 ΐ で 12— 18時間振盪培養した。 培養液 40¾2を 0. 8 %グルコース 0. 5 %カザミ ノ酸、 10 ノ szfi塩酸チア ミ ン、 50 ^ァンピ シリ ンを舍む M 9培地 （ 0.6 % Na2HP04、 0.3 %KH2P04、 0. 1 % NH4CK 0.05% NaCl 、 1 raM MgClz、 0. 1 mM CaClz) 1 £に接種し、 3TCで約 6時間振盪培養を行った。
    [0129] 培養液を遠心して集菌し、 2 % ドデシル硫酸ナ ト リ ウム (SDS)、 500mM 2 —メルカプ トエタノールを舍む緩衝液に懸 濁後煮沸により可溶化し、 常法に従って S D S—ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動を行つた。 セ ミ ドライ ブロ ッテイ ング 装置 （ア ト一社） を用いて蛋白質をニ ト ロセルロースフ ィ ル ターにプロ ッ ト し、 実施例 3 で示したごと く非 A非 B型肝炎 患者血清より調製した抗体との反応性を調べた。 その結果、 発現産物が抗体と反応することを確認した。
    [0130] (3) 組換えファ ージス HC2246中の cDNAの大腸菌における 実施例 5に記載したように ス HC2246の cDNA (第 2図） を PUC18の Sma I部位に挿入することにより得られたプラス ミ ド （これを PMC42と称する） を EcoR I及び Pvu IIで消化し、 低融点ァガロースゲル電気泳動法により cDNAを舍む約 0. 5 kb の D N A断片を得た。 この D N A断片を、 T4 DNAリガーゼを 用いて pFETR3の EcoR I / Pvu Π部位に連結して pFETB342を得 た。
    [0131] T 7プロモーターを有するプラス ミ ド pGEMEXTM— 1 (プロ メガ社） を Xba I及び Hindi!で消化し、 低融点ァガロースゲ ル電気泳動法により約 3. l kbの T 7プロモーターを舍む D N A断片を得た。 この T 7 プロモーターの下流にク ローユング 部位を付与するため、 D N A自動合成機 （アプライ ドバイオ システムズ社、 380 A型） を用いて 2種の 57merのオリ ゴヌ ク レオチ ドを合成し、 ァニーリ ングを行って下記の D NAリ ンカーを得た。
    [0132] 0 I er 5 CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAG
    [0133] 0 inter ύ TTTATTAAAACAAATTGAAATTCTTCCTC
    [0134] Met EcoR I Hpa I
    [0135] ATATACATATGGAATTCGTTAACA 3'
    [0136] TATATGTATACCTTAAGCAATTGTTCGA 5' 前記の約 3. 1 kbの D N A断片及び上記の D N Aリ ンカ一を、 T4 DNiiリガーゼを用いて結合させ、 T 7プロモータ一の下流 に翻訳開始コ ドン UTG) 及びクローニング部位を有するブラ ス ミ ド PFET710 を得た。
    [0137] PFETR342を EcoB I及び Hind IKで消化し、 低融点ァガロース ゲル電気泳動法により、 cDNA及び翻訳終止コ ド ンを舍む約
    [0138] 0. 5 kbの D N A断片を得た。 他方、 PFET710を EcoR I及び
    [0139] Hind DIを用いて消化して D N A断片を得た。 この D N A断片 と前記の約 0. 5 kbの D N A断片とを T4 DNAリガーゼにより連 結し、 T 7プロモータ一及び該プロモーターの制御下にある λ HC2246 cDNA を舍有する発現ベクター pFET42を得た。 この べクターの構造を第 23図に示す。
    [0140] IPTGにより T7 RNAボリメ ラーゼの発現が誘導可能な大腸菌 JM109(DE3)株 （プロメガ社） を PFET42を用いて形質転換した , 得られた形質転換株を 50 /¾£ァンビシリ ンを舍む L培地 ( 1 %バク ト ト リ プ ト ン、 0· 5 %イ ース トエキス ト ラ ク ト、 0. 5 % NaCl)に接種し 30'Cで 12— 18時間振盪培養した。 培養 液 1 « を 50 ノ^ァンビシ リ ンを舍む培地 lOOffiUこ接種し、 30 'Cで振盪培養を行い、 A 6 6。 が約 0. 3で I PTGを 0. 5 mM添加 し、 さらに 3 _ 5時間培養を繞けた。 得られた菌体を上記 (2)で述べたごと く処理し、 発現産物が非 A非 B型肝炎患者 血清より調製した抗体と反応することを確認した。
    [0141] (4) 上記 （2)及び （3)において、 ス H C2207中の c D NA及び λ HC2246中の cDN Aについて、 それらの大腸菌中での発現が確 認されたが、 同様にして、 他のすべての / 1 HC組換ベクタ一中 の cDN Aを発現させて、 その発現生成物を得ることができるこ とが明らかである。
    [0142] また、 上記 （2)及び （3 )で例示したごと く、 実施例 3にお いて得られた ス HC2207及び λ HC2246クローン中の cDN Aの発現 生成物は、 実施例 3の組換ファージを用いた場合と同様に、 非 A非 B型肝炎患者の血清と反応した。 従って、 本発明の非 A非 B型肝炎特異抗原蛋白質をコー ドする D N Aの発現生成 物は非 A非 B型肝炎特異抗原に対する抗体の検出に利用可能 であることが確認された。 産業上の利用可能性
    [0143] 本発明の血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的抗原をコー ドす る D N Aは該抗原を製造するための遺伝子として有用である。 また、 その発現生成物である抗原蛋白質は肝炎特異的抗原に 対する血清中の抗体と反応するので、 該抗原蛋白質は、 対象 者の血清中の抗体の存在を診断するための試薬として有用で ある。 規則第 13規則の 2の寄託された微生物への言及
    [0144] 寄託機関 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 受託番号及び寄託した日付： フ ァ ージ 国内寄託番号 国際寄託番号 寄託日 ク ローン No. (微ェ研菌寄） （微ェ研条寄）
    [0145] λ HC 432 10897 1989 7 26 λ HC 436 10898 1989 7 26 λ HC 512 (10841) 2951 1989 7 13 λ HC 522 10842 1989 7 13 λ HC 524 10843 1989 7 13 λ HC 526 10844 1989 7 13 λ HC 2206 (10845) 2952 1989 7 13 λ HC 2207 (10846) 2953 1989 7 13 λ HC 2211 ( 10876) 2956 1989 7 21 λ HC 2216 (10877) 2957 1989 7 21 λ HC 2217 10852 1989 7 18 λ HC 2220 (10853) 2954 1989 7 18 Λ HC 2225 10854 1989 7 18 λ HC 2230 (10916) 2966 1989 8 2 λ HC 2232 (10930) 2968 1989 8 9 λ HC 2239 10931 1989 8 9 λ HC 2240 10855 1989 7 18 λ HC 2241 10856 1989 7 18 λ HC 2242 10857 1989 7 18 フ ァ ージ 国内寄託番号 国際寄託番号 寄託日 ク ロー ン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄）
    [0146] λ HC 2243 10878 1989 7 21 λ HC 2244 (10879) 2958 1989 7 21 λ HC 2246 ( 10858) 2955 1989 7 18 λ HC 2248 ( 10880) 2959 1989 7 21 λ HC 2249 10917 1989 8 2 λ HC 2250 10904 1989 7 28 λ HC 2252 10881 1989 7 21 λ HC 2255 10889 1989 7 26 λ HC 2256 (10890) 2960 1989 7 26 λ HC 2258 (10891 ) 2961 1989 7 26 λ HC 2259 10892 1989 7 26 λ HC 2263 10893 1989 7 26 λ HC 2264 10932 1989 8 9 λ HC 2265 10933 1989 8 9 Λ HC 2268 10894 1989 7 26 λ HC 2270 ( 10895) 2962 1989 7 26 λ HC 2271 10896 1989 7 26 ス HC 2404C 10899 1989 7 26 λ HC 2405Β 10900 1989 7 26 ス HC 2410A 10905 1989 7 28 λ HC 2410C (10918) 2967 1989 8 2 λ HC 2410D 10934 1989 8 9 ス HC 2413 10919 1989 8 2 ファ ージ 国内寄託番号 国際寄託番号 寄託日 ク ローン No. (微ェ研菌寄） （微ェ研条寄）
    [0147] λ HC 2414A 10906 1989 7 28 A HC 2424A 10911 1989 7 28 λ HC 2501 10920 1989 8 2 λ HC 2502 10847 1989 7 13 λ HC 2505 10921 1989 8 2 λ HC 2507 10935 1989 8 9 λ HC 2508 10859 1989 7 18 λ HC 2509 10936 1989 8 9 λ HC 2512 10882 1989 7 21 A HC 2514 10860 1989 7 18 λ HC 2516 10861 1989 7 18 λ HC 2533 ( 10907) 2963 1989 7 28 Λ HC 2534 10937 1989 8 9 λ HC 2535 10883 1989 7 21 λ HC 2602 10908 1989 7 28 A HC 2603B 10922 1989 8 2 λ HC 2607 (10909) 2964 1989 7 28 Λ HC 2608 10923 1989 8 2 λ HC 2610 (10910) 2965 1989 7 28
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲 クフ ァ D
    1. 血液伝播性非 A非 B型肝炎の発症時にヒ ト肝細胞内及 び Z又は血液内に出現する血液伝播性非 A非 B型肝炎特異抗 原蛋白質をコー ドする D N A。
    2. 血液伝播性非 A非 B型肝炎ヒ ト患者の肝細胞から抽出 した R N Aに 応する cDNAである請求項 1 に記載の D N A。
    3. 血液伝播性非 A非 B型肝炎ヒ ト患者の血液から抽出し た R N Aに対応する cDNAである請求項 1 に記載の D N A。
    4. 下記のフ ァ ージク ローン ： 一ジ 国内寄託番号 国際寄託番号 一ン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄）
    Λ HC 432 10897
    λ HC 436 10898
    λ HC 512 10841 2951
    λ HC 522 10842
    λ HC 524 10843
    λ HC 526 10844
    λ HC 2206 10845 2952
    λ HC 2207 10846 2953
    λ HC 2211 10876 2956
    λ HC 2216 10877 2957
    λ HC 2217 10852
    λ HC 2220 10853 2954
    λ HC 2225 10854 フ ァ ージ 国内寄託番号 国際寄託番号 ク ロー ン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄） ス HC 2230 10916 2966 λ HC 2232 10930 2968 λ HC 2239 10931
    λ HC 2240 10855
    λ HC 2241 10856
    λ HC 2242 10857
    λ HC 2243 10878
    λ HC 2244 10879 2958 λ HC 2246 10858 2955 λ HC 2248 10880 2959 λ HC 2249 10917
    λ HC 2250 10904
    λ HC 2252 10881
    λ HC 2255 10889
    λ HC 2256 10890 2960 λ HC 2258 10891 2961 ス HC 2259 10892
    λ HC 2263 10893
    Λ HC 2264 10932
    λ HC 2265 10933
    Λ HC 2268 10894
    λ HC 2270 10895 2962 λ HC 2271 10896 フ ァ ー ジ 国内寄託番号 国際寄託番号 ク α—ン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄） λ HC 2404C 10899
    λ H C 2405B 10900
    λ H C 2410A 10905
    λ HC 2410 C 10918 2967 λ HC 2410D 10934
    λ HC 2413 10919
    λ HC 2414A 10906
    λ HC 2424 Α 10911
    λ HC 2501 10920
    λ HC 2502 10847
    λ HC 2505 10921
    ス H C 2507 10935
    λ H C 2508 10859
    ス HC 2509 10936
    λ HC 2512 10882
    λ HC 2514 10860
    ス HC 2516 10861
    λ HC 2533 10907 2963 ス HC 2534 10937
    λ HC 2535 10883
    λ HC 2602 10908
    ス H C 2603B 10922
    λ H C 2607 10909 2964 ファ―ジ 国内寄託番号 国際寄託番号 ク α一ン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄） λ HC 2608 10923
    λ HC 2610 10910 2965 中に挿入されている cDNAであるか又は該 cDNAを舍有する請求 項 2又は 3に記載の D N A。
    5. 請求項 2又は 3に記載の D N Aによりコー ドされてい るアミノ酸配列を異るコ ドンによりコードしている D N A。
    6. 第 1図〜第 18図のいずれかに記載のヌク レオチ ド配列 を有する D N A。
    7. 第 3図〜第 20図に記載のァミノ酸配列をコードしてい る D N A。
    8. 血液伝播性非 A非 B型肝炎の発症時にヒ ト肝細胞内及 びノ又は血液内に出現する血液伝播性非 A非 B型肝炎特異抗 原蛋白質であって、 該蛋白質をコードする D N Aを用いて遺 伝子組換技術により生産される蛋白質。
    9. 第 3図〜第 20図のいずれかに記載のァミノ酸配列を有 する、 請求項 8に記載の蛋白質。
    10 . 血液伝播性非 A非 B型肝炎の発症時にヒ ト肝細胞内及 びノ又は血液内に出現する血液非伝播性非 A非 B型肝炎特異 抗原蛋白質の製造方法において、 該蛋白質をコードする D N Aを舍む発現ベクターにより形質転換された宿主を培養する ことを特徴とする方法。
    11 . 前記発現ベクターがプラスミ ドであり、 そして前記宿 主が大释菌である、 請求項 10に記載の方法。
    12. 細菌、 酵母又は動物細胞中での D N Aのク ローニング において使用するための組換 D N A分子であって、
    (a) 下記のファージクローン ： ファージ 国内寄託番号 国際寄託番号 ク ローン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄） λ HC 432 10897
    λ HC 436 10898
    λ HC 512 10841 2951 λ HC 522 10842
    λ HC 524 10843
    λ HC 526 10844
    λ HC 2206 10845 2952 λ HC 2207 10846 2953 λ HC 2211 10876 2956 λ HC 2216 10877 2957 λ HC 2217 10852
    λ HC 2220 10853 2954 λ HC 2225 10854
    λ HC 2230 10916 2966 λ HC 2232 10930 2968 λ HC 2239 10931
    ス HC 2240 10855
    λ HC 2241 10856
    λ HC 2242 10857 フ ァ ージ 国内寄託番号 国際寄託番号 ク ロ一 ン Να (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄） λ HC 2243 10878
    え HC 2244 10879 2958 λ HC 2246 10858 2955 λ HC 2248 10880 2959 λ HC 2249 10917
    λ HC 2250 10904
    λ HC 2252 10881
    λ HC 2255 10889
    λ HC 2256 10890 2960 λ HC 2258 10891 2961 λ HC 2259 10892
    ス HC 2263 10893
    λ HC 2264 10932
    λ HC 2265 10933
    λ HC 2268 10894
    λ HC 2270 10895 2962 λ HC 2271 10896
    λ HC 2404C 10899
    Λ HC 2405B 10900
    λ HC 2410A 10905
    Λ HC 2410C 10918 2967 λ HC 2410D 10934
    λ HC 2413 10919 フ ァ ー ジ 国内寄託番号 国際寄託番号 ク ロ ー ン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄） ス HC 2414 A 10906
    λ HC 2424A 10911
    λ HC 2501 10920
    λ HC 2502 10847
    λ HC 2505 10921
    λ HC 2507 10935
    λ HC 2508 10859
    λ HC 2509 10936
    λ HC 2512 10882
    λ HC 2514 10860
    λ HC 2516 10861
    λ HC 2533 10907 2963 λ HC 2534 10937
    ス HC 2535 10883
    ス HC 2602 10908
    λ HC 2603B 10922
    λ HC 2607 10909 2964 λ HC 2608 10923
    λ HC 2610 10910 2965 中に挿入されている cDNA ；
    (b) 前記 cDNAとハィ ブリダイ ズすることができ且つ血液伝 播性非 A非 B型肝炎特異抗原蛋白質をコ一 ドしている D N A 又は
    (c) 前記（a) 又は （b)に記載した D N Aによりコードされ ているァミノ酸配列を異るコ ドンによりコードしている D N A ；
    である組換 D N A。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0416725A2|1991-03-13|
    AU6030290A|1991-02-22|
    EP0416725A3|1991-03-20|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    EP0318216A1|1987-11-18|1989-05-31|Chiron Corporation|NANBV diagnostics and vaccines|EP0506977A1|1990-10-24|1992-10-07|Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.|Method of detecting non-a non-b hepatitis specific gene and reagent composition used therefor|
    US6150087A|1991-06-24|2000-11-21|Chiron Corporation|NANBV diagnostics and vaccines|KR0185373B1|1989-03-17|1999-05-01|로버트 피. 블랙버언|Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용|US5372928A|1989-09-15|1994-12-13|Chiron Corporation|Hepatitis C virus isolates|
    WO1991004262A1|1989-09-15|1991-04-04|National Institute Of Health Of Japan|New hcv isolates|
    HUT56883A|1989-12-18|1991-10-28|Wellcome Found|Process for producing virus polypeptides|
    US5747339A|1990-06-25|1998-05-05|Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka|Non-A, non-B hepatitis virus genomic CDNA and antigen polypeptide|
    EP0516859A4|1990-11-29|1995-03-15|Toray Industries||
    US5574132A|1991-04-05|1996-11-12|Biochem Immunosystems Inc.|Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus |
    法律状态:
    1991-02-07| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU BB BG BR CA FI HU JP KR LK MC MG MW NO RO SD SU US |
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