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    公开号:WO1990015133A1
    申请号:PCT/JP1990/000689
    申请日:1990-05-29
    公开日:1990-12-13
    发明作者:Hiroshi Shibuta；Tatsuo Shioda
    申请人:Nippon Zeon Co., Ltd.；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 レ ト ロ ウ イ ルス · コ ア構造物 の製造方法及び そ れに よ つ て 製造さ れた粒子
    [0002] < 技術分野 >
    [0003] 本発明 は レ -卜 ロ ウ ィ ルス科に 属す る ウ ィ ルス の 開裂型 gagタ ンパク 質か ら成る粒子 の製造法 、 及びその製造法 に よ り 製造さ れる粒子 、 そ の粒子を有効成分 と す る ワ ク チン に 関 し 、 さ ら に 詳 し く は 、 レ ト ロ ウ イ ルス科 に属す る ウ ィ ルスの et 逍伝子を含 ま ず少な く と も gag遺伝子 及び pol遺伝子を組み込ん だ ウ ィ ルスベ ク タ 一 を感染さ せた 、 ま た は レ ト ロ ウ イ ルス科 に 属す る ウ ィ ルス の env 遺伝子を含 ま ず少な く と も gag逍伝子を組み込ん だ ウ イ ルス ♦ ベ ク タ ー と レ ト ロ ウ イ ルス科 に 属す る ウ ィ ルス の env遺伝子を含 ま ず少な く と も ί>οに遺伝子を組み込ん だ ウ ィ ルスベ ク タ ー を感染さ せ た動物培養細胞を培養 し 、 発現さ せ 、 gagタ ンパク 質前駆休を開裂さ せ る こ と に よ り 得 ら れる開裂 し た gagタ ンパ ク 質に よ っ て構成さ れる 粒子を製造す る方法、 そ の よ う に し て 製造さ れる粒子、 及びそ の粒子を有効成分 と す る ワ ク チ ン に 関 す る 。
    [0004] ぐ 背摄技術 >
    [0005] 最近 、 後天性免疫不全症候群 （ エイ ズ ） の発症、 蔓延 が世界的 に玆慮さ れて お り 、 そ の予防 、 治療対策が緊急 課题 と な っ て い る 。 数年前 よ り 、 エ イ ズや 成人 T細 胞 白 血病 な ど の 原 因 ウ ィ ルス と 考え ら れる種々 の レ ト ロ ウ イ ルス が単離、 周 定され、 その逍伝子の塩基配列が決定さ れた 。 そ の結果 こ れ ら は周類ま た は周一 で あ る と報告さ れる よ う に な つ た 。 特に エイ ズの病原ウ ィ ルス と さ れた H T L V— 1Π、 L A V、 A R Vは同 じ ウ ィ ルスであ り 、 H I V ( human immunodeficiency virus) と統一 し て 命名さ れた 。
    [0006] レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子 は 、 多 く の タ ンパク質で構成さ れ て お り 、 外皮糖 タ ンパ ク 質 （ envタ ンパ ク 質 と称 し 、 Ή I V— ェ の場合、 前駆体で あ る env-gp 1 6 0が 開裂 して gpl 2 0、 及ぴ gp4 1 の 2種の envタ ンパ ク 質 と な る ） 、 逆耘写酵素 （ H I V— Iの場合、 t) 6 5 、 及び p 5 1 がある ） 、 核タ ンパ ク 質 （ gagタ ンパ ク 質 と 称 し H I V— Iの場合、 前駆体で ある gag-p5 5が 開裂 し て p 1 7 、 p 2 4 、 及び P 1 5の 3種の gagタ ンパ ク 質 と なる 。 なお 、 gag-p5 5の ア ミ ノ 酸配列で は 、 P "1 7相 当 の ア ミ ノ 酸配列 、 P 2 4相当 の ア ミ ノ 酸配列 、 P 1 5 相当の ア ミ ノ 酸配列 が こ の順番で連続 し て い る ） な ど と 命名さ れて いる 。 ま た 、 H I Vに独特なもの と言われる tat, vif、 rev, ne な ど の調節逍伝子産物 が知 ら れ て いるが 、 Vけ産物以外 は H I V粒子中 に は存在 し な い envタ ンパク 質であ る gp 1 2 0は感染の際 に ウ ィ ルス 粒子を細胞膜に 固定化す る機能を有 し 、 gp4 1 は ウ ィ ル ス遺伝子を細胞内 へ侵入さ せ る機能を有す る 。 gagタ ン ノ ク 質で ある p 2 4 はコ ア タ ンパ ク 質の主成分で あ り 、 p 1 7 はマ 卜 リ ッ ク ス タ ンパク 質で あ る と 考え ら れて い る 。 逆転写酵素 は pol逭伝子 に コ ー ド さ れて いる 。 pol 遺伝子 は他 に も P 1 0 ( プ ロ テ ア ー ゼ タ ンパ ク質 ） 、 P 3 1 ( エ ン ド ヌ ク レ ア ーゼで あ り 、 イ ンテ グラ ーゼ活 性を有す る と も言わ れる ） を コ ー ド し 、 こ れ ら polに コ ー ドさ れて いる ウ ィ ルス酵素群を polタ ンパ ク質 と 呼 ぷ。 V i f は p 2 3 ( ウ ィ ルス粒子の構築 に 関与 し て い る と考え ら れて い る ） を コ ー ド して い る 。
    [0007] 効 果的 な エ イ ズ ワ ク チ ン を 得 よ う と す る 場合 に は 、 ウ ィ ルスを中和 し 得る抗体を誘導する の に適当な抗原を 含 ん で い る こ と が必要で あ る 。 そ の よ う な 抗 原 と し て envタ ンパ ク 質 、 特に感染能力 に 関係す る と さ れる gpl 2 0 ( セ ル （ Cel I ) 、 5_3 、 4 8 3 、 （ 1 9 8 8 ) ) が そ の最有力 候補 と し て 選 ば れ 、 こ の 抗 原 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る遺伝子を大腸菌 に組み換える逍伝子操作技術 に よ り 産生 す る研究 （ 例 え ば、 サイ エ ン ス （ Science ) 2 2 8 、 9 3 — 9 6 、 （ 1 9 8 5 ) ) な ど が既 に行われ て いる 。
    [0008] しか し 、 種々 の患者や感染者か ら 分離さ れた H I Vの ゲ ノ ム塩基配列 の解析結果よ り 、 H ί Vの env遺伝子は 極 め て 変異 が 激 し い こ と が 明 か と な り （ サ イ ェ ン テ ィ フ ィ ッ ク ♦ ア メ リ カ ン （ Scientif ic American ) 、 2 5. 3 、 8 4 — 9 3 、 （ 1 9 8 5 ) ) 、 こ の部位を利用 す る 手法で は全て の H 1 V に対応できな い可 能性が あ る 。
    [0009] こ れ に対 し 、 ウ ィ ルス粒子の ^組み と な る gagタ ンパ ク質を コ ー ドす る逭伝子や逆転写酵素等を コ ー ド し て い る pol遺伝子 は変異の起こ る確率が低い 可能性が あ り 、 それ ら の逍伝子産物を抗原 と す る ワ ク チン は有利であ る と考え ら れ、 逆転写酵素を大腸菌 に耝み換える遺伝子操 作に よ っ て産生する研究 （ 例えば、 サイ ェ ンス
    [0010] ( Science ) 、 2 3 6. 3 0 5 - 3 0 8 . ( 1 9 8 7 ))、 gag - p 5 5 や P 2 4 な どを組み換え多核体ウ ィ ルス の系 で産生す る研究 （ 例 えば、 ヴ イ ロ ロ ジ 一 ( Virology) 、 5 8 、 2 4 8 - 2 5 0 、 ( 1 9 8 7 ) ) 、 P Ί 7 の抗 原決定部位に特異的に結合す る抗体 と結合す るボ リ ぺプ チ ド を合成する研究 ( 特開昭 6 3 — 2 7 4 9 8号 ） 、
    [0011] 1 7 の単ク ロ ー ン抗体がエ イ ズの 中和活性を有す る と い う 報告 （ ジ ャ ー ナル ♦ 才ブ ♦ ヴ イ ロ ロ ジ
    [0012] ( J. Vi rol . ) 6_ 3. 2 6 7 - 2 7 2 、 ( 1 9 8 9 ) ) な ども行われて いる 。 ま た 、 本発明者 ら も、 Ί 9 8 7年 1 2 月 、 エ イ ズ研究会学術集会で gag遣伝子及び pol遺 伝子を組 み込んだヮ ク チニ ァ ウ ィ ルス につ いて発表 し た 。
    [0013] し か し 、 レ 卜ロ ウ ィ ルスの gag遣伝子全体の組み換え に よ っ て 、 gag-p5 5 等の非開裂型 gagタ ンパ ク 質の発 現 は確認さ れて いた が 、 そ の場合、 pol逍伝子の組み換 えの有無に よ らず 、 開裂型 gagタ ンパ ク 質の発現 は確認 さ れて いなか っ た 。
    [0014] ま た 、 g P 1 6 0及び Ί 2 0を有す る非感染性 レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子が知 ら れて い た （ W 0 8 8 / 0 9 6 7 0 ) が 、 そ れは レ 卜 ロ ウ ィ ルスを処理 し て 得 ら れるも のであ つ て 、 遺伝子組み換え を利用 し て 、 レ十 ロ ウ ィ ルス を形 成す る こ と な く envタ ンパ ク 質を含 ま な い レ ト ロ ウ ィ ル ス ♦ コ ア構造物 が製造で き る こ と は知 ら れて いなか っ た ぐ 発明 の開示 >
    [0015] 本発明者 ら は 、 鋭意研究の結果 、 ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー を感染さ せ た細胞中で 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルスの envタ ンパ ク 質を発現さ せず に 、 gagタ ンパ ク 質 、 及び polタ ンパ ク 質を発現さ せ る こ と に よ っ て 、 開裂型の gagタ ンパ ク 質 が発現 し 、 そ の開裂型 gagタ ンパ ク 質 に よ り 構成さ れる 感染性を持た ない 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子の構造の一部 と 同一 の抗原性を有す る レ ト ロ ウ イ ルスの コ ア構造物粒子 が得 ら れる こ と を見い だ し 、 本発明 を完成す る に 到 っ た ぐ 図面の簡単な説明 >
    [0016] 第 1 図 はプ ラ ス ミ ド P U H K , 第 2 図 はプ ラ ス ミ ド P N Z 6 8 K 2 , 第 3 図 はプラ ス ミ ド W — gag の構築手 頫を示す 。
    [0017] < 発明を実施するた め の最良の形態 >
    [0018] 本発明 に おいて 「 e n Vタ ンノ ク 質 」 と は 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルス の感染、 病原性を司 る envタ ンパ ク 質及びそ の変異 物や改変物 をいい 、 感染へ の影饔力 、 病原性を失 っ た envタ ンパク 質の改変物等を意味 し な い 。 本発明 に おい て 「 env遣伝子を含 ま な い 」 と は 、 envタ ン ノ ク 質 を コ ー ド し て い る遺伝子を発現 し得る形で含 ま な い こ と を 意味 し 、 レ 卜 ロ ウ ィ ル ス の感染、 病原性に 関係の な い env遺伝子由 来の遗伝子 （ env遺伝子の一部や env遺伝 子の改変物等 ） を含んでい て も構わ ない 。 W 08 8 Z 0 9 6 7 0で開示さ れた gp1 6 0及び 9ΡΊ 2 0を含 ま ない レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子は 9P1 2 0がないた め 内包 す る遺伝 子が細胞内 に取 り 込 ま れる可能性が少ない が 、 万が一、 内 包 す る遺伝子が細胞 内 に 取 り 込 ま れ た 場 合 、 レ ト ロ ウ ィ ルス の全遺伝子を有 し ている た め； レ 卜 ロ ウ ィ ルス を構築 し て し ま う 危険性が あ るが、 本発明 の粒子 は env 遺伝子を含んでいない ので 、 そ の よ う な危険性 は な い 。 し か し 、 本発明 に おい て も 、 env遣伝子の改変物 を含ん でいる場合、 変異な ど に よ り 病原性を回復する可 能性が あ る こ と か ら 、 env遛伝子の改変物 も含ん で い ない こ と が好 ま し い 。
    [0019] 本発 明 に 用 い る レ ト ロ ウ イ ル ス は 、 ウ ィ ル ス ♦ べ ク タ ー を感染さ せ る動物培養細胞 に おい て 、 gagタ ンパク 質 、 及び 又 は polタ ンパク質が発現で き 、 env遗伝子 を含 ま な いもので あれば特に 限定 さ れない 。 例 え ば、 才 ン コ ウ ィ ルス亜科ま た は 、 レ ンチウ ィ ルス亜科 に 属す る もの ウ ィ ルス、 特に 、 H I V— I 、 H I V— I、
    [0020] H T L V— I 、 H T L V— Iが挙げ ら れる 。
    [0021] 本発明 に おい て 、 ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー に 組み込 ま れる レ ト ロ ウ イ ルス の c D N Aは 、 ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー を感 染さ せ る動物培養細胞 に おいて 、 gagタ ンパ ク 質、 及び ま た は polタ ンパ ク 質が発現でき 、 env遺伝子を含 ま な い も の で あ れ ば 、 特 に 限定 さ れ な い 。 例 え ば 、 ト1 1 ー 1 の gag遺伝子及び pol遺伝子を コ ー ド し 、 env遺伝子を 含 ま ない c D N Aは 、 P N し 4 3 ( ジ ャ ー ナル ♦ 才ブ ♦ ヴ ィ □ □ ジ — （ Vi rol . ) 、 5_ £、 2、 2 8 4、 （ 1 9 8 6 ) 〉 な ど の よ う に 、 エ イ ズ患者の染 色体 に プ ロ ウ イ ルスの形で組み込 ま れた H I V一 Iを一 旦 ；（ フ ァ ー ジな ど を用 い て ク ロ 一 二 ング し 、 そ れを用 い て H I V— Iの全 c D N Aを含むプラ ス ミ ド を構築する か 、 あ るい は-、 患者 よ り 分離 し た H I V一 I の R N Aゲ ノ ムを逆転写 し て c D N Aに変換 し 、 そ の 後プラ ス ミ ド に 移 し て H I V - I の全 c D N Αを含むプ ラ ス ミ ド を構 築 し 、 得 ら れたプラ ス ミ ド を適当 な制 限酵素で切断 し 、 gagタ ンパ ク賀、 pol遺伝子の両方の コ一 ド頜域を含む D N A断片を調製する こ と に よ つ て 得 ら れ る 。
    [0022] 本発明 に 用 い る ウ イ ルス · ベ ク タ 一 ち動物細胞に 感染 し 、 gag遗伝子 、 及び po I遺伝子 を発現で き る ち のであ れば、 特 に 限定 さ れない 。 例 え ぱ、 ワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ル ス 、 ア ビボ ッ ク ス ♦ ゥ イ ノレス 、 バキ ュ 口 ， ゥ ィ ルス な ど が あ げ ら れる 。
    [0023] 本発明 に用 いる gag遗伝子、 及び ま た は pol遺伝子 を組み込ん だゥ ィ ルス ♦ ベ ク タ 一 の構築方 法も 、 特に 限 定さ れない 。 例 えば 、 ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー と し て ワ ク チ 二 ァ · ウ ィ ルス を用 い る場合、 組み込む遺伝子を ョ 本脳 炎ウ ィ ルス の表面抗原蛋 白質を コ ー ド する 遺伝子か ら レ 卜 ロ ウ ィ ルス の gag遺伝子、 及び zま た は pol遺伝子 に 代え る こ と 、 用 いる ワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ルス が必ず し も好 ま し い条件を 篛た す必要の無い こ と 以外 は特開平 1 一 7 4 9 8 2 号 に 記載さ れた 方法 に よ り 構築する こ と がで き る 。
    [0024] 次いで 、 構築さ れた gag遺伝子及び pol遺伝子を コ ー ドす る c D N A断片が組み込 ま れた ウ ィ ルス · ベ ク タ ー を 、 ま た は gag遺伝子を コ ー ド する c D N A 断片が組 み 込 ま れ た ウ ィ ルス ' ベ ク タ ー と po I遺伝子を コ ー ド する c D N A 断片が耝み込 ま れた ゥ ィ ルス ♦ ベク タ ー を 、 動 物培養細胞 に 感染さ せ 、 そ の培養上清中 に 開裂型の gag タ ンパ ク 質 、 及び polタ ンノ ク 質を発現させる 。
    [0025] 本発明で用 い る動物培養細胞 は ウ ィ ルス · ベ ク タ ー が 増殖可能なも ので あれば よ く 、 そ の具体例 と し て 、 ウ イ ルス · ベ ク タ ー が ワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ルスで あ る場合は 、 例 え ば T K - 4 3 ( ヒ 卜 骨肉腫由 来 ） 、 F L ( ヒ 卜 羊 膜由 来 ) 、 Hela ( ヒ 卜 子宮頸部癌由 来 ） 、 K B ' ( ヒ 卜 ^ 咽喉癌由 来 ） 、 R K 1 3 ( ゥサ ギ腎由 来 ） 、 C V — 1 ( サル腎由 来 ） 、 B S C — 1 ( サル腎由 来 ） 、 L 9 2 9 ( マ ゥ ス 結合組織由 来 ） 、 C ： ( ニ ヮ 卜 リ 胚 ） 細 胞 、 D E F ( 二 ヮ 卜 リ 胎児繊維芽細胞 ） 、 S W 4 8 0 ( ヒ 卜 結腸ガ ン由来 ） な どが例示さ れる 。 ウ ィ ルス ， ベ ク タ ー が ア ビボ ッ ク ス · ウ ィ ルス で あ る場合 は、 本発明で用 い る勤物培養細胞 と し て は鶏胚用 繊雜芽細胞な ど の鶏由 来 細胞な ど が例示さ れる が 、 発育鶏卵漿屎膜な ど も含む。 ウ ィ ルス · ベ ク タ 一 がバキ ュ 口 • ウ ィ ルス の場合 は 、 例 え ばス ポ ドプテ ラ ♦ フ ルギぺルダ ( Spodoptera f u rug i erda ) 由 来の S f 9 株な ど が例示さ れる 。 し か し 、 一般的な培養条件 に お い て は 、 用 い る細胞 に よ っ て は 開裂型 gagタ ンパ ク 質の発現量が低く 、 例 えば C V - 1 に H I V— Iの遣伝子を組み込ん だ ワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ルス を感染さ せ た 場合 に は 、 開裂型 gagタ ンパ ク 質 は ほ と ん ど発現が認め ら れな い 。 開裂型 gagタ ンパ ク 質の発現量が多い ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー と動物培養細胞の 組み合せが好 ま し く 、 その よ う な例 と し て は H I V - I の遺伝子を組み込ん だ ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス を S W 4 8 0 に感染 さ せ も の が あ る 。
    [0026] こ こ で発現さ れる g a gタ ンパ ク 質の 開裂 は p 1 0な ど プ ロ テ ア ーゼ活性を有する polタ ンパ ク 質 に よ る も の と 考え ら れる 。
    [0027] 培養上清か ら の開裂型 gagタ ンパ ク 質の精製 は特 に 限 定 さ れない 。 例 えば、 常法 （ サイ エ ン ス （ Science ) 、 2 2 4 、 4 9 7 — 5 0 0、 （ 1 9 8 4 ) ) に従 っ て 、 上 清を シ ョ 糖 、 あ る い は酒石酸 カ リ ウ ム密度勾配遠心を行 い 、 更 に セ シ ウ ム ク ロ ラ イ ド沈降平衡遠心を行え ば よ い 開裂型 gagタ ンパ ク 質 は粒子を形成 し て 、 回収さ れる 。
    [0028] 本発明 の 開裂型 gagタ ンパ ク 質に よ り 構成さ れる粒子 は 、 例 え ば、 レ ト ロ ウ イ ルス が H I V— Iで 、 比重 よ り 分画 し た 場合 、 比重が H I V— I粒子 と 周 じ 約
    [0029] 1 . 1 5の フ ラ ク シ ョ ン に 認 め ら れる 。
    [0030] 精製の各段階 に おい て ど の フ ラ ク シ ョ ン 中 に 粒 " f が存 在 す る か の確認の方法 は特 に 限定 さ れな い 。 例 え ば 、 gagタ ンパ ク 質に対す る 抗体を使 う 方法や逆転写 酵素活 性を測定 す る方法がある 。 本発明 の 開裂型 gagタ ンパ ク 質に よ り 構成さ れる粒子 は逆転写酵素を 内包 し て い て も 内包 し て いな く て も か ま わないが 、 通常、 少な く と も一 部 は逆転写酵素を内包する 。 従 っ て 、 逆転写酵素活性を 測定すれば、 本発明 の粒子を含む フ ラ ク シ ョ ン は判別で ぎる。
    [0031] 逆転写酵素活性の測定 は常法 に従え ば よ い 。 例 え ば 、 微生物学実習提要 （ 東京大学医科学研究所学友会編 ） の 記述 に準 じ て組み換え ウ ィ ルス感染細胞上清を Po l y-Aを 鍩型、 ol igo-dTをプラ イ マ 一 と し て 、 "2 P — d T T P の 酸不溶性画分への取 り 込みを測定すれば よ い 。
    [0032] 本発 明 の粒子は 、 ウ ィ ルス ' ベ ク タ ー を感染さ せ た 動 物培養細胞の生体膜由 来の脂質二重膜 と考 え ら れる ェ ン ベ ロ ープ様のもの を伴 っ て いる 。 こ の粒子 は 、 脂質二重 膜を有 し た ま ま でも抗原 と し て 機能するが 、 脂質二重膜 がある こ と が好 ま し く な い場合は 、 タ ンパク 質が失活 し ない条件下でのエ ー テル等の有機溶媒処理や 、 凍結融解 処理に よ り 破碎 し 、 除去す る こ と がで きる 。
    [0033] こ の粒子 は細胞への感染を司 る envタ ンパク 質及びそ の遣伝子も含 ま ないので、 病原性を示さ ない 。 そ の他の 遺伝子 は含んで い て も含んで いな く て も構わな い 。 周様 に 、 開裂型 gagタ ンパ ク 質に よ り そ の構造が形成さ れて いれば、 envタ ンパ ク 質以外の タ ンパ ク 質 を含んで い て も 含んで いな く て も構わ ない 。 ま た 、 エ ンベ ロ ー プ様の 脂質二重膜の有無を 問わ な い 。 こ の粒子 は抗原性を有 し さ ら に そ の抗原性 は envタ ンパク 質 に 比べ て 変異が少な い と 考え ら れる gagタ ンパ ク 質 、 ま た は内包さ れて いる 場合 に は po Iタ ンパク質お よ び gagタ ンパ ク 質に 由 来す るも のであ る 。 さ ら に 、 自然界の ウ ィ ルス粒子の一部 と 周一ま た は類似の構造を有 し て い る こ と か ら 、 gagタ ン パク 質、 po Iタ ンパ ク 質 、 あ る い はそ の単な る混合物以 上の抗原性も期待で き る 。
    [0034] レ 卜 □ ウ ィ ル ス は エ イ ズ 、 成 人 T 細 胞 白 血病 、 癌 、 リ ュ ー マ チ等の 多 く の難病の病原 ウ ィ ルス で あ る と 確認 ま た は推定 さ れて お り 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルス が原因で起 こ る 病気の多 く は効 果の あ る ワ ク チン は知 ら れて い な か っ た が 、 本発明 の レ ト ロ ウ イ ルス の コ ア と 同一 ま た は類似の 構造を有 し て い る粒子 は優れ た 効 果が期待で き る 。
    [0035] か く し て 本発明 に よ れば 、 レ ト ロ ウ イ ルス 由 来の gag タ ンパ ク 質を コ ー ド す る c D N A 及び po Iタ ンパ ク 質を コ ー ドす る c D N A を ウ ィ ルスの増殖 に非必須なゲノ ム 領域に 組み込ん だウ ィ ルス · ベ ク タ 一 を感染さ せ た 細胞 を培養 し 、 開裂型の gagタ ンパ ク 質 に よ り 構成さ れ 、 envタ ンパ ク 質及び env遺伝子を含 ま ない レ ト ロ ウ ィ ル スの コ ア構造物 が得 ら れる 。 こ の構造物 は 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子の構造の一部 と 同一 の構造を持つ が感染性を持 た な い こ と か ら 、 こ れを有効成分 と す る こ と に よ り 、 有 効な レ 卜 ロ ウ ィ ルス · ワ ク チ ン が得 ら れる こ と が期待で ぎる 。
    [0036] ( 実施例 以下実施例を挙げて本発明 を更 に 具体的 に説明 する 。 実施例 1
    [0037] (1) 組み換えベ ク タ ー P U H Kの作製 （ 第 1 図参照 ） p U C 9 ( フ ア ルマ シ ア社製 〉 を E c o R I 、 及び P s t Iで消化後 、 ポ リ メ ラ ーゼで処理 し 、 切 断端を平 滑末端 と し 、 連結 し 、 E c o R I部位-の欠損 し た
    [0038] P U C 9を作製 し た 。 E c o R I部位欠損 P U C 9を H i n d IEで 切 断後、 ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス T K遺伝子を 含むワ ク チニ ァ ウ ィ ルス W R株 の H i n d DI J 断片 に連 結 し 、 組み換え べ ク タ一 p U Η Kを得 た 。
    [0039] (2) 組み換え ベ ク タ ー Ρ Ν Ζ 6 8 Κ 2の作製 （ 第 2 図参照 ）
    [0040] ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス W R株の 7 . 5 Κプ ロ モ ー タ ー ( モス ら （ Hoss et. al ) 、 セル （ Cel l ) 、 1 2 5、 8 0 5 — 8 1 3、 （ Ί 9 8 1 ) ) を P U C 1 9 ( フ ア ルマ シ ァ社製 ） の H i n c 部位に挿入 し た 後 、 H i n d I と E c o R I で頫次 ¾ 断 し て 、 7 . 5 Kプ ロ モ ー タ 一 の 前後 に ポ リ リ ン カ 一部位を有す る D N A断片 （ 約 3 5 0 bp) を得た 。
    [0041] こ の D N A断片の ヌ ク レ ア ーゼ処理 し た も の 、 及 び （ 1 )で得たプラ ス ミ ド P U H Kの E c 0 R I消化物 を ポ リ メ ラ 一ゼ処理 し た も の を連結 し 、 得 ら れた組み換え プラ ス ミ ド を 0 N Z 6 8 K 2 と 命名 し た 。
    [0042] (3) 組 み換えプラ ス ミ ド gag の作製 （ 第 3図参 照 ） H I V - I の全 c D N Aを含 む P N L 4 3 を B g ^ I と E c o R ェ で 消化後、 低融点 ァ ガ ロ ー ス電気泳動で約 5 . Ί kbp の断片を分離 し 、 フ エ ノ ール抽 出 に よ り そ の 断片を 回収 し た
    [0043] こ の 断片中 に は 、 第 3 図 に 示す よ う に 、 gag遺伝子 、 及び pol遺伝子領域が含 ま れて い る 。
    [0044] 次 に 、 （2-)で得た 0 N Z 6 8 K 2を B a m H I と E c 0 R ェ で 消化 し 、 先 に 調製 し た gag遺伝 子； 及び pol遺伝子を含む D N A断片 と ラ イ ゲー シ ヨ ン し て 組み 換えプラ ス ミ ド W- gag を得た 。
    [0045] (4) 組み換え ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス の作出 （ 第 3 図参 照 〉
    [0046] 2 5 cfli 2 の 力 ルチ ヤ 一 ポ ト ル に培養さ れた C V— Ί 細 胞 に ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス W R株を 0. 1 p . f . u . Z細胞接 種 し 、 4 5分後 m pd耝み換えプラ ス ミ ド W- gag を 2 . 2 の 滅菌水で溶か し 、 樋髙 ら （ 蛋 白 質 ♦ 核酸 · 酵 素 、 2 L、 3 4 0、 ( 1 9 8 5 ) ) の方法 に よ っ て 、 D N A — リ ン酸カ ルシ ゥ ム共沈物 をつ く り 、 そ の 0 . 5 /^を感染 C V— 1 細胞上 に 滴下 し た 。 3 0分 II3、 3 7で 5 % C 02 イ ンキ ュ べ 一 タ ー に静置 し 、 5 %牛胎児血清 を含 む Eag I e M E M培地 4 . 5 idを加 え た 。 そ の 3 時間 後培養液を交換 し 、 4 8 時 間後 、 培養細胞 ご と 3 度凍結 融解 し 、 3 0秒間超音波処理 し た
    [0047] 組み換え休の gag遺伝子 、 及び pol遺伝子の揷入を確 認す る た め 、 6 cmの ぺ 卜 リ 皿 に 培養さ れた T K陰性 ( T K " ) "1 4 3細胞 に上記プラ ー ク 形成 ウ ィ ルス を接 種 し 、 4 5分後、 1 %寒天 · 1 2 %牛胎児血清 ♦ 2 5 ^ 2 ^ B U d R加 Engle M E M培地を積層 し 、 3 日 間 培養後、 感染細胞を 0 . 0 1 %ニ ュ ー 卜 ラル ♦ レ ッ ドで 染色 し た 。 形成さ れた プラ ー ク をパスツ ール ピぺ ッ 卜 で 単離 し 、 Eagle M E M培地 中 に希釈す る 。 単離 し た ブラ ー ク にっ き 、 再度同様の操作を緩 り 返 し 、 プラ ー ク を純 化 し た 。 純化 し た プラ ー ク よ り 得 ら れた ウ ィ ルス を増殖 させ 、 増殖 ウ ィ ルス よ り D N Aを調製 し 、 gag遺伝子 、 及び pol遺伝子を コ ー ド す る c D N Aをプ ロ ブ と す る ド ッ 卜 プ ロ ッ ト ハイ プ リ ダイ ゼ ー シ ヨ ン に よ り 、 得 ら れ た組み換え ワ ク チニ ァ ウ ィ ルスが H I V— I 由 来の gag 遺伝子 、 及び pol遺伝子を コ ー ドす る D N Aをゲノ ム内 に持つ組み換え ウ ィ ルスで あ る こ と を確認 し 、 V — 2 0 一 1 — 8 と命名 し た 。
    [0048] (6) 組み換え体の細胞上清で の発現
    [0049] 耝耩培養用 9 cnデ ィ ッ シ ュ に培養 し た S W 4 8 0細胞 に Bi.o. i. 1 0〜 2 0の V— 2 0 — 1 — 8 を接種 し 、 3 7 で 、 1 時簡感染させた後 、 ウ ィ ルス液を抜取 り 、 細胞を Eagle M E Mで洗净 し 、 5 %牛胎児血清加 Eag I e M E M を加えた 。 1 6時間後 、 細胞上清を回収 し 、 1 0 IDH卜 リ ス ♦ 塩歷 （ PH7 . 4 ) - 0 . 1 M N a C - 1 ηιΗ
    [0050] E D T A溶液で作製 し た 2 0〜 6 0 % の酒石酸 カ リ ウ ム の密度勾 配上 に 重層 し 、 ロ ー タ ー S W 4 7 ( ベ ッ クマ ン 製 ） で 3 5 , 0 0 0 rpm 、 1 6時間遠心 し た 。 遠心後 、 各 フ ラ ク シ ョ ン に 分け た 。
    [0051] 5 0 mH Tr i s - H C ( PH8 . 0 ) 、 Ί 0 mHジ チ 才ス レ イ 卜 一ル、 7 5 mH K 〇 ^ 、 5 mH M g C ^ 2 、 1 0 μ. ^ / id o I y-A 、 9 / id o I i go-dT 、 0 . 0 5 % N P 4 0 を含む反応液 5 raUこ [ ひ 一 32 P 】 一 d T T P ( 4 0 0 CiZ mmoし 1 0 fflC iノ ) を 5 〜 1 0 〃 ·β 加 え た 。 こ の 反応 液 を 、 9 6 穴 U 字型 プ レ ー 卜 に フ ラ ク シ ヨ ン と 対照 の 数 だけ 分 注 し て お き 、 そ こ へ 各 フ ラ ク シ ヨ ンあ る い.は対照用 1 0 ηιΗ卜 リ ス ♦ 塩酸 （ ρΗ 7 . 4 ) 一 0. I M N a C ^ — I mHE D T A溶液 加 え 、 3 7 °Cで 1 時間反応さ せ た 。 反応中 に 、 二 卜 ロ セル ロ ー ス フ ィ ル タ ー に鉛筆で 2 間 隔の碁盤の 目 を書い て お き 、 反応終了後、 各 フ ラ ク シ ョ ン及び対照の反応液 1 0 ^ _£ を二 卜 ロ セル ロ ー ス フ ィ ル タ ー上の各区画 に スポ ッ 卜 し た 。 こ の フ ィ ル タ ー を l乾に よ り 完全 に 乾燥さ せ た後、 5 % 卜 リ ク ロ ロ 酢酸 一 5 %ピ ロ リ ン酸ナ ト リ ウ ム液 中で 1 5分間振盪 し な が ら 洗净 し 、 未反応の放射性前駆休を 除去 し た 。 続い て 5 % 卜 リ ク ロ ロ 醉酸 中で 5分、 そ し て 5 0 %エ タ ノ ー ル中で 5分洗净 し た 。 乾燥後、 碁盤の 目 にそ っ て各 区画 を切 り 放 し 、 シ ン チ レ ー シ ヨ ンバイ アル に入れて 、 ト ルエ ンシ ン チ レ ー タ ー 中 で 液休シ ンチ レ一 シ ヨ ン カ ウ ン タ 一 に よ り 取 り 込みを測定 し た 。 対照 の 3 倍以上の 取 り 込みを 陽性 と し 、 逆転写 酵素活性が あ る と 判断 し た 。
    [0052] 次いで 、 逆転写酵素活性が認め ら れ た フ ラ ク シ ョ ン を S D S — ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動で分画 し 、 二 卜 ロ セル ロ ー ス フ ィ ルタ ー にブ ロ ッ テ イ ングす る （ アナ リ テ ィ カ ル ' パ イ オケ ミ ス 卜 リ イ （ Anaに B i ochem. ) 、 1 2 、 1 9 5 — 2 0 3 、 （ 1 9 8 1 〉 ） 。 検出法 と し て 1251 ラ ベルプ ロ テ イ ン A 、 抗 p> 2 4 モ ノ ク ロ ー ナル 抗体 ( Japanese Journal of Cancer Reserch、 7 8 、 2 3 5 - 2 4 1 , ( 1 9 8 7 ) 〉 を利用 す るいわ ゆ る ゥ ェ ス タ ンブ ロ ッ テ イ ング法 に よ っ て 、 開裂型 gagタ ンパ ク 質の発現 が確認さ れ、 V — 2 0 — 1 — 8 感染 S W 4 8 0細胞 はそ の上清 に分子量 2 4 , 0 0 0 ダル ト ンの 開裂 型 g agタ ンパク 質 p 2 4 を産生 し て い る こ と が判 明 し た gag-p5 5 の構造か ら判 断する に 、 gag-p5 5 の 中央部 分の ア ミ ノ 酸配 列 に 相 当 す る P 2 4 が 産生 さ れ て い る こ と か ら 、 gag-p5 5 の両端の ア ミ ノ 酸配列 に相当 す る p l 7 、 P 1 5 も産生さ れて い る と 考 え ら れる 。
    [0053] 逆転写酵素活性の検出 さ れる比重約 1 . 1 5 の分画を さ ら に セ シ ウ ム ク ロ ラ イ ド沈降平衡遠心 に よ り 精製 し 、 逆転写酵素活性の検出 さ れる比重約 1 . 1 5 の分画 に P 2 4 が確認さ れた 。
    [0054] いわ ゆ るネガテ ィ ブ染色法 に よ り 、 上記の p 2 4 が確 認さ れた 分画を電子顕微鏡 に よ り 観察す る と ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス と は異 なる直径約 1 1 0〜 Ί 5 0 nmの球形 の粒 子が認め ら れた 。
    [0055] ぐ 産業上の利用 可能性 >
    [0056] 本発 明 に よ れば、 開 裂型の gagタ ンパク質 よ り 構成さ れる レ ト ロ ウ イ ルスの コ ア構造物 が感染性をもつ 又は感 染性を発現さ せる envタ ンパ ク 質も env遺伝子を も 含 ま ず に 製造 さ れる こ と と な る ので 、 安全性の点で 問題が よ り 少 く な い レ ト ロ ウ イ ルス ♦ ワ ク チン が提供さ れる可 能 性が髙 く 、 産業上の利用 可 能性が高い 。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. レ ト ロ ウ イ ルス に属 す る ウ ィ ルス の env遣伝子 を含 まず レ ト ロ ウ イ ルス に属する ウ ィ ルス の少な く と も gag遺伝子及び pol遺伝子を組み込ん だ ワ ク チニ ァ * ゥ ィ ルスを細胞 に感染させ、 ま た は レ ド ロ ウ ィ ルス に属す る ウ ィ ルス の env遣伝子を含 ま ず レ ト ロ—ウ ィ ルスに 属す る ウ ィ ルスの少な く と も gag遗伝子を組み込ん だ ヮ ク チ ニ ァ · ウ ィ ルス と レ 卜 ロ ウ ィ ル ス に 属 す る ウ ィ ル ス の envl伝子 を含 まず レ ト ロ ウ イ ルス に属する ウ ィ ルスの 少な く と も po I遺伝子を組み込ん だワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ル スを周一の細胞 に感染させ 、 感染させた 細胞を培養する こ と に よ る 、 envタ ンパク 質を含 ま ない レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ァ構造物粒子の製造方法 。
    2. レ ト ロ ウ イ ルス に 属する ウ ィ ルス が オ ン コ ウ イ ルス亜科、 ま た は レ ン チ ウ ィ ルス亜科に属す る ウ ィ ルス で あ る請求項 Ί 記載の レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ア構造物粒子 の製造方法 。
    3. レ 卜 ロ ウ ィ ルス に 厲する ウ ィ ルス が H I V— I H I V— E、 H T L V— ェ 、 ま た は H T L V— 1で ある 請求項 2記載の レ ト ロ ウ イ ルス * コ ア構造物粒子 の製造 方法。
    4. 細胞が ヒ 卜 結腸ガ ン由来で あ る S W 4 8 0細胞 で あ る 請求項 3 記載の レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ア構造物粒子 の製造方法。
    5 . 請求項 1 、 2 、 3 、 ま た は 4 記載の レ ト ロ ウ イ ルス ♦ コ ア構造物粒子の製造方法 に よ り 製造さ れた レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ア構造物粒子 。
    6 . 請求項 5 記載の レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ア 構造物粒 子を有効成分 と する抗 レ 卜 ロ ウ ィ ルス ， ワ ク チ ン 。
    类似技术:
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    JPH0372874A|1991-03-28|
    EP0474868B1|1996-11-13|
    DE69029135D1|1996-12-19|
    EP0474868A4|1992-09-09|
    EP0474868A1|1992-03-18|
    DE69029135T2|1997-05-28|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1990-12-13| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1990-12-13| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB IT LU NL SE |
    1991-12-02| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1990907471 Country of ref document: EP |
    1992-03-18| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1990907471 Country of ref document: EP |
    1996-11-13| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1990907471 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP1/136862||1989-05-30||
    JP13686289||1989-05-30||EP90907471A| EP0474868B1|1989-05-30|1990-05-29|Method of producing core structure of retro virus and particle produced thereby|
    DE1990629135| DE69029135T2|1989-05-30|1990-05-29|Verfahren zur herstellung von kernstrukturen von retroviren und dadurch hergestellte partikel|
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