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    公开号:WO1990011520A1
    申请号:PCT/JP1990/000398
    申请日:1990-03-26
    公开日:1990-10-04
    发明作者:Ryozo Nagai；Makoto Kuroo；Hirohisa Kato
    申请人:Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖に対す る抗体 技術分野
    [0002] 本発明 は 、 平滑筋ミ オ シ ン重鎖の単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ム を 区別 し て 認識す る抗体 ま た はそ の活性フ ラ グ メ ン 卜 そ れ ら の ラ ベル化さ れた標識体な ら び にそ れ ら の製造法 に 関 す る あ ので あ る 。
    [0003] 背景技術
    [0004] 筋肉細胞の太い フ ィ ラ メ ン 卜 を構成す る収縮 タ ンパ ク 質で あ る ミ オ シ ン は ァ ク チン フ ィ ラ メ ン ト と反応 し て A T Pを分解す る （ A T P a s e 活性 ） こ と に よ り 化学 的エネルギ ー を機械的仕事 に 変換す る機能を有 し て い る ミ オ シ ン分子 は重鎖 と軽鎖か ら な るサブユニ ッ ト 構造を と っ て い る 。 ミ オ シ ン望鎖 は単一 の分子で はな く 、 骨格 筋や心筋の重鎖に おいて そ れぞれ数種の ア イ ソ フ ォ ー ム の形で存在 し て い る こ と が知 ら れて い る 。 こ れ ら の ア イ ソ フ ォ ー ム は異なる A T P a s e 活性を持ち 、 発生過程 や ホル モ ン投与、 圧負荷な ど の ス ト レ ス に よ り そ の発現 型を変化さ せ る 。
    [0005] 一方 、 平滑筋 は 、 筋原繊維だけで な く 、 カ ルシ ウ ム調 節機構や持続的収縮様式 の点 に お い て も骨格筋や心筋 と は全 く 異なる生理学的特徴を有す る こ と が知 ら れて い る し か し な が ら 、 平滑筋 ミ オ シ ン の分子構造や分子の多様 性に 関 し て はほ と ん ど研究が行われて いないのが現状で あ る 。
    [0006] 従来、 平滑筋ミ オ シ ン重鎖はゲル電気泳動 に よ り 2本 のパ ン ド に分離さ れ、 そ の一方のみが リ ン酸化さ れる こ とが報告さ れて いる （ Eur. J. Biochem. , 1 5 2 , 2 0 ：/〜 2 Ί 1 ( 1 9 8 5 ) 、 Circulation Res. , 5 9 , 1 Ί 5〜 1 2 3 ( 1 9 8 6 ) 、 Am. J. Physiol . , 9 , C 8 6 1 〜 C 8 7 0 ( 1 9 8 6 ) 、 J. Biol . Chem. , 2 6 2 , 7 2 8 2〜 7 2 8 8 ( 1 9 8 7 ) 、 Biochemistry, 2_7 , 3 8 0 7 〜 3 8 Ί Ί ( 1 9 8 8 ) な ど参照 ） 。 永 井 ら は 、 ゥサギ平滑筋 よ り 調製 し た c D N Aラ イ ブラ リ — よ り ミ オ シ ン重鎖の c D N Aを ク ロ ー ニ ング し 、 そ の 塩基配列を明 ら か に し て いる （ Proc. Nat I . Acad. Scに U . S . A . , 8_5 , 1 0 4 7〜 1 0 5 1 ( 1 9 8 8 ) 参照 ） 。
    [0007] 一般に 、 各種ミ オ シ ン の ァ イ ソ フ ォ ー ム の生理学的意 義 ま た は個体発生 に お け る ミ オ シ ン の ァ イ ソ フ ォ ー ムの 発現調節機能等を解明す る た めの一手法 と し て は 、 ミ 才 シ ン ア イ ソ フ オ ー ム に対す る抗体を使用 す る免疫学的手 法が採用 さ れて い る 。
    [0008] し か し なが ら 、 従来の平滑筋ミ オ シ ン重鎖に対す る抗 体で は 、 最近明 ら か に な っ た 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ムを特異的 に 区別 して認識す る こ と はできない と い う 問題点が あ っ た （ J . Biol . Chem. , 2 6 2 ， 7 2 8 2〜 7 2 8 8 ( 1 9 8 7 ) ) 。 発明の開示
    [0009] 本発明者 ら は 、 従来報告さ れて いる抗体 と は全 く 異な る特異性、 す なわ ち 、 平滑筋の ミ オ シ ン重鎖の単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ムを区別 して認識する抗体を取得すべ く 、 研 究を重ね た結果、 平滑筋 ミ オシ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム に おける ア ミ ノ 酸配列上の相違を明 ら か に するの に成功 する と と も に 、 そ の相違する ア ミ ノ 酸配列 に 特異的な抗 体を取得す るの に成功 し た 。 得 ら れた抗体 は平滑筋ミ オ シ ン重鎖の単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ム を 区別 し て特異的 に 認 識するあので ある 。
    [0010] し た が っ て 、 本発明 は 、
    [0011] 平滑筋ミ オシ ン重鎖の単一の ァイ ソ フ ォ ー ムを区別 し て 認識す る抗体 ま た はその活性フ ラ グメ ン 卜 ；
    [0012] 標識剤でラ ベル化さ れた上記抗体ま た はそ の活性フ ラ グメ ン 卜 ；
    [0013] 上記 ア イ ソ フ オ ー ムの ア ミ ノ 酸配列 を含むオ リ ゴぺプ チ ド ま た はそ の複合体を動物 に免疫 し そ の抗血清を得る こ と を含む上記抗体ま た はその活性フ ラ グメ ン ト の製造 法 ；
    [0014] な らびに上記の ァイ ソ フ ォ ー ム の ア ミ ノ 酸配列 を含む 才 リ ゴペプ チ ド ま た はそ の複合体を動物 に 免疫 し て そ の 抗体産生細胞を得 ；
    [0015] 該抗体産生細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞 と を融合させ て平滑 筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム を 認識す る モ ノ ク ロ 一 ナル抗体を産生するハ イ ブ リ ド ーマ を得 ： 次いで こ のハ イ プ リ ドー マ を培養する こ と に よ り 該モ ノ ク ロ ー ナル抗体を取得する 、
    [0016] こ と を含む、 上記の抗体 ま た はその活性フ ラ グメ ン 卜 ノ 製造法に 関するものである 。
    [0017] 図面の簡単な説明
    [0018] 第 1 図は ゥサギ大動脈の平滑筋ミ オシ ン重鎖の S D S — P A G E お よびィ 厶 ノ ブ ロ ッ テ イ ングの結果を示す 。 ラ イ ン 1 は S D S— P A G E後抗 C 1 抗血清を用 いて ィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ング し た 時の結果、 お よびラ イ ン 2 は S D S— P A G E後抗 G 2抗血清を用 いて ィ ム ノブ ロ ッ テ ィ ング し た 時の結果、 お よ び ラ イ ン 3 は S D S — P A G E後ア ミ ドブラ ッ クで処理 し た時の結果を示 した ち ので あ る 。
    [0019] 第 2図 は ゥサギ子宮の平滑筋 ミ オシ ン重鎖の S D S— P A G E お よびィ 厶 ノ ブ ロ ッ テ イ ングの結果を示す 。 図 中 、 ラ イ ン 1 〜 3 は第 1 図 と同 じ処理を した時の結果を 示 し た も のであ る 。
    [0020] 第 3図抗 C 1 抗血清ま た は抗 C 2抗血清を用 いて染色 し た生後 1 日 目 の ゥサギ動脈管 （ ポ タ 口 管 ） の蛍光顕微 鏡写真を示す 。 写真 Aは抗 C 1 抗血清 、 写真 Bは抗 C 2 抗血清を用 い て 染色 し たあ ので あ る 。
    [0021] 第 4図 は 、 抗 C 1 抗血清ま た は抗 C 2抗血清を用 いて 染色 し た成長期 の ゥ サ ギ大動脈の蛍光顕微鏡写真を示す 写真 Gは抗 G 1 抗血清、 写真 D は抗 C 2抗血清を用 い て 染色 し た も ので あ る 。 第 5 図 は抗 C 1 抗血清ま た は抗 C 2 抗血清を用 いて胎 児期 、 新生児期 （ 生後 Ί ◦ 日 目 ） お よび成長期 （ 生後 3 0 曰 目 ） の ゥサギの大動脈の蛍光顕微鏡写真を示す 。 写 真 E 、 G お よび I は抗 C 1 抗血清 、 写真 F 、 H お よび J は抗 C 2 抗血清を用 いて染色 し た ものである 。 ま た 、 写 真 E お よ び F は胎児期 、 写真 G お よび H は新生児期 、 写 真 I お よび J は成長期を示す 。
    [0022] 第 6 図 は 、 抗 抗血清ま た は抗 C 2 抗血清を用 い て 染色 し た成長期の ゥサギ子宮の蛍光顕微鏡写真を示す 。 写真 K は抗 抗血清、 写真 し は抗 C 2 抗血清を用 いて 染色 し た ものである 。
    [0023] 第 7 図 は 、 抗 C 2 抗血清を用 いて染色 し た ヒ 卜 成人の 正常な 血管の蛍光顕微鏡写真を示す 。
    [0024] 第 8 図 は 、 抗 C 3 抗血清を用 いて染色 し た ゥサギ大動 脈の蛍光顕微鏡写真を示す 。 A は胎児期 、 B は成長期 を 示す 。
    [0025] 第 9 図 は 、 抗 C 3 抗血清を用 いて 染色 し た臍帯動脈の 蛍光顕微鏡写真を示す 。
    [0026] 第 1 0 図 は 、 平滑筋ミ オシ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム の N 端末部分を 除い た ア ミ ノ 酸配列 を示す 。 上段 に ァ イ ソ フ ォ ー ム S M— 3 の ア ミ ノ 酸配列 、 中段 に ァ イ ソ フ ォ ー ム S M — Ί の ア ミ ノ 酸配列 、 下段 に ァ イ ソ フ ォ ー ム S M 一 2 の ア ミ ノ 酸配列が示さ れて い る 。 S M— Ί 及び S M -- 2 の ア ミ ノ 酸配列 に つ い て は 、 S M— 3 の ア ミ ノ 酸配 列 と異な る ア ミ ノ 酸の みを示 し た 。 第 1 0 図 に お ける ( 一 ） は対応する ア ミ ノ 酸がない こ と を表わ し 、 * はそ れぞれの ァイ ソ フ ォ ームの C端末を表わす 。 各ア ミ ノ 酸 は 1 文字記号 [ Lubert Stryer, Biochemi stry, 2nd ed . , p.16 ( 1 9 8 1 ) , W. H. Freeman and Company, San Franci sco] で示 さ れて お り 各記号が表わす L ー ァ ミ ノ 酸は以下の通 り である 。
    [0027] A ： ァ ラニ ン、 R ： アルギニ ン 、 N ： ァ スパラギ ン 、 D : ァ スパラ ギ ン酸、 C : システィ ン 、 Q : グルタ ミ ン E ： グルタ ミ ン酸、 G ： グ リ シ ン 、 H ： ヒ ス チジ ン 、 I ： ィ ソ ロ イ シ ン 、 L : ロ イ シ ン 、 K : リ ジ ン 、
    [0028] M : メ チ才ニ ン 、 F : フ エ 二ル ァ ラ ニ ン 、 P : プ ロ リ ン S : セ リ ン 、 T : ス レ オニ ン 、 W : 卜 リ ブ 卜 フ ァ ン 、 Y ： チ ロ シ ン 、 V ： ゾ リ ン 。
    [0029] 発明を実施するた め の最良の形態
    [0030] 以下、 本発明 を詳細 に説明 す る 。
    [0031] (1) 本発明抗体の特徴
    [0032] 本発明抗体 は 、 平滑 筋 ミ オ シ ン 鎖 の 単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ムを 区別 し て 認識 し 、 更 に は心筋お よ び骨格筋の ミ オ シ ン重鎖 と は交差反応を示さ ない こ と を特徴 と して お り 、 こ の特徴を有す る かぎ り 、 ポ リ ク ロ ー ナル抗体 ( 抗血清 ） 、 モ ノ ク ロ ー ナル抗体のいずれの もので あ つ て も よ い 。 こ こで 、 「 区別 し て 認識する 」 と は 、 平滑筋 ミ オシ ン重鎖の各 ァ イ ソ フ ォ ー ム 間 の交差性が実質的に 全 く ない こ と を 意味す るも ので あ る 。
    [0033] ま た 「単一の アイ ソ フ オ ー ム 」 と は 、 単一 の タ イ プの ア イ ソ フ オ ー ム を意味 し 、 周一 の タ イ プの ァ イ ソ フ ォ ー ムであれぱ後述する よ う に 、 二種以上の動物 に由来する ちの を同様に認識す るもので あ っ て も よ い 。
    [0034] 本発明抗体 の認識す る 平滑 筋 ミ オ シ ン 重鎖 の ア イ ソ フ ォ ー ム と し て は 、 ヒ 卜 、 ゥマ 、 ゥ シ 、 ャ ギ 、 ヒ ッ ジ 、 ブタ 、 サル、 ゥサギ 、 モルモ ッ ト 、 ラ ッ 卜 、 マ ウ ス 、 ハ ムス タ ー 、 ィ ヌ 、 ネ コ な どの哺乳動物 由 来の も の 、 ニ ヮ 卜 リ 、 八 卜 、 ァ ヒ ルな ど の鳥類由来のも のな ど 、 いずれ の 由来のものであ っ て もよ く 、 特 に 限定 さ れるもので は ない 。 本発明抗体は二種以上の動物 に 由来する乎滑筋ミ 才 シ ン重鎖の対応す る ァ イ ソ フ ォ ー ム を重複 し て 認識す るものであ っ て も よ い 。 た と えば 、 後述の実施例で作製 し た抗体は ゥサギお よ び ヒ 卜 の平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の対 応す る ァ イ ソ フ ォ ー ムを重複 して認識す るものであ っ た その 中で も特に ヒ 卜 の平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ 一ムを認識するも の は 、 ヒ 卜 の各種疾病にお ける平滑筋 ミ 才 シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ムの発現状態を組織学的 に 調べる こ と ができ 、 疾病の発生原因や 、 発症後の進行状 況を客観的 に 診断 、 研究する の に 、 極め て有意義なも の で ある 。
    [0035] 本発明者 ら は 、 現在 ま で に平滑筋 ミ シ オ ン重鎖に三種 類の ア イ ソ フ ォ ー ム が存在す る こ と を確認 し 、 それ ら の ア ミ ノ 酸配列を決定 し 、 S M — Ί お よび S M — 2 につ い て は発表 し て い る [ J. Biol . Chem. , 2 6 4 , No. 7 9 7 3 4 一 9 7 3 7 ( 1 9 8 9 年 6 月 Ί 5 日 発行 ） ] 。 三種類の アイ ソ フ ォ ームの N 端末部分を除いた アミ ノ 酸 配列 は第 1 0 図 に 示されて い る 。 三種類の ア イ ソ フ ォ ー ム は以下の と お り 定義される 。
    [0036] (1) 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム Ί ( 以下、 「 S M — 1 」 と いう ） ： 個体発生過程に おいて 、 胎児期 、 新生児期 、 成長期の全期 に おい て発現 し 、 リ ン酸化 さ れ る ァ イ ソ フ ォ ーム ；
    [0037] (2) 平滑筋ミ オシ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム 2 ( 以下 、 「 S M — 2 」 と い う ） ： 個体発生過程の胎児期 に は発現 せず 、 新生児期お よび成長期 に発現する ァイ ソ フ ォ ー ム ；
    [0038] (3) 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム 3 ( 以下、 「 S M — 3 」 と い う ） ： 個体発生過程の胎児期お よび新 生児期 に発現 し 、 成長期 に は発現 し ない ア イ ソ フ ォ ー ム [ 胎児型 （ Fetal ) アイ ソ フ オ ー ム ] 。
    [0039] 本発明抗体の認識部位 は 、 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム に よ っ て ア ミ ノ 酸配列が異な っ て いる ア ミ ノ 酸配列部分で ある 。 すなわ ち 、 第 1 0 図 に 示さ れる ア ミ ノ 酸配列であ っ て各ァイ ソ フ ォ ー ムに特異的に存在する 部分を認識でき る抗体が 、 本発明 の 「 単一 の ア イ ソ フ ォ ー ムを （ 区別 し て ） 認識する抗体」 の一例である 。 本発 明抗体を作製す る た め に使用 でき る各 ァ イ ソ フ ォ ー ム に 特異的 に 存在 す る ア ミ ノ 酸 配 列 部分 と し て は 、 例 え ば S M — 1 に 関 し て は 、 C端末か ら 5 0 〜 6 0 ア ミ ノ 酸残 基中 に存在する任意の配列部分で ある 。 S M — 2 に 関 し て は C端末か ら 1 0〜 2 0 ア ミ ノ 酸残基中 に存在す る任 意の配列である 。
    [0040] S M— 3 に 関 し て は 、 第 Ί 0図 に おいて S M— 1 お よび S M - 2 の ア ミ ノ 酸配列 と 異る部分か ら選ばれる任意の 配列で ある 。
    [0041] た と えば、 ゥサギの平滑筋ミ オシ ン重鎖の S M— 1 と S M - 2 の ア ミ ノ 酸配列 は C端末部付近を除い て は）！一 である 。 し か し 、 S M— Ί 及び S M— 2のそれぞれの C 端末部位付近の ア ミ ノ 酸配列 は 、 式 [ I ] お よ び [ Π ] ( S M - 1 )
    [0042] H 2 N -…… 一 S K L R R G N E T S F V P T
    [0043] R R S G G R R V I E N A D G S E E E V D A R D A D F N G T K S S E - C O O H
    [0044] [ I ]
    [0045] ( S M - 2 )
    [0046] H 2 N…… 一 S K L R G P P P Q E T S Q—
    [0047] C 00 H [ I ] で表さ れ、 「 S K L 」 以降の ア ミ ノ 酸配列 お よ び長さ が 大き く 相違 し て い る 。
    [0048] S M— 3 は 、 S M— 1 お よび S M— 2 と は ア ミ ノ 酸配 列 の多 く の部分 に お い て異る 。 特 に 、 ゥサギ の平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の S M— 3 の C端末部付近の ア ミ ノ 酸配列 は 式 [ H ]
    [0049] ( S M - 3 )
    [0050] H 2 N -…… 一 N R L R R G G P I S F S S S R S G R P Q し H I E G A S L E L S D D D T E S K T S D V N E T Q P P Q S E - C O O H [ I ] で表わさ れ、 S M— Ί お よび S M— 2 の C端末部付近の ア ミ ノ 酸配列 と は配列 が異る 。 本発明抗体 は た と え ば上 記の よ う な平滑筋ミ オシ ン重鎖の C端末部付近の ァ ミ ノ 酸配列上の各ァ イ ソ フ ォ ー ム 間 に お け る相違部分を認識 するものであ り 、 こ の よ う な相違部分を認識する こ と に よ り 初めて 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の単一の ァ イ ソ フ ォ ー ム を区別 して認識できる よ う にな つ た のである 。
    [0051] (2) 免疫抗原
    [0052] 本発明抗体を製造するた め に使用 する抗原 （ 免疫抗原 ） は 、 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の各ァ イ ソ フ ォ ー ム 間で相違す る部分の ァ ミ ノ 配列 と同一も し く は極めて相同性の高い ア ミ ノ 酸配列 を有する 才 リ ゴペプチ ドであ る 。
    [0053] こ の よ う な 才 リ ゴペプチ ドを具体的に例示すれば 、 た と えば S M - 1 を特異的に認識す る抗体を作製す る の に 好適な下記式 [ IV ] で表わさ れる 才 リ ゴペプチ ド 、 S M 一 2 を特異的に認讃す る抗体を作成す る の に 好適な下記 式 [ V ] で表わされる 才 リ ゴペプチ ド 、 な らびに S M— 3 を特異的に認識す る抗体を作成する の に好適な下記式 [ VI ] で表わさ れる オ リ ゴペプチ ドをそれぞれ例示する こ と がで き る 。
    [0054] H 2 N - R R G N E T S F V P T R R S G G R
    [0055] R V I E N A D G S E E E V D A R D A D F N G T K S S E - C O O H [ IV ] H 2 N - R G P P P Q E T S Q - C O O H [ V ] H 2 N - N R L R R G G P I S F S S S R S G R P Q L H I E G A S L E L S D D D T E S K T S D V N E T Q P P Q S E - C O O H [ VI ] 上記式 [ IV ] 、 [ V ] お よび [ VI ] で表さ れる 才 リ ゴ ペプチ ド はそ の 才 リ ゴペプチ ドそのもの全体を免疫抗原 と し て 用 いて も よ く 、 ま た上記配列中の連続 した 3個以 上、 好 ま し く は 6個以上の ペプチ ド断片を免疫抗原 と し て用 いて お よ い 。
    [0056] 才 リ ゴペプチ ドの調製 は 、 化学的に合成する方法、 対 応す る D N A配列 を用 い て遣伝子工学的に合成す る方法 ま た は平滑筋ミ オシ ン重鎖か ら酵素的に調製する方法の いずれの手段を用 い て も よ い 。 調製する 才 リ ゴペプチ ド の ア ミ ノ 酸残基数が短い （ た と えば 2 0残基前後 ） 場合 に は 、 と り わけ化学的 に合成する方法が簡便で好適であ る 。 才 リ ゴペプチ ドを化学的に合成する場合、 平滑筋ミ 才 シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ムの ア ミ ノ 酸配列 が判明 し て いる場合に は 、 ア ミ ノ 酸配列上の各ァ イ ソ フ ォ ー ム間で 相違 し て い る部分の連続 し た 3個以上、 好 ま し く は 6個 以上か ら なる任意の ア ミ ノ 酸配列を選択 し て化学的に合 成すれば よ い 。 ま た 、 各 ァ イ ソ フ ォ ー ム の ア ミ ノ 酸配列 が不明な場合であ っ て も 、 た と えば ヒ ドラ ジ ン分解法、 卜 リ チ ウ ム標識法 、 力 ルポキ シぺ プ チダ ーゼ法、 ジニ 卜 口 フ ル 才 ロ ベ ンゼ ン 法 （ D N P法 ） 、 フ エ ニ ル イ ソ チオ シ ア ナ一 卜 法 （ P T C法 ） 、 ダ ン シル ク 口 リ ド法 ( D N S法 ） 、 シ ア ン酸法、 直接エ ドマ ン （ Edman ) 法 . ダ ン シル 一 エ ドマ ン 法 （ 以上 に つ い て 、 タ ン ノヽ' ク 質 の 化学 I ； 生 化学実験講座 Ί , 日 本化学会編 、 1 1 8 — 2 1 1 頁 （ 1 9 7 6年 ） 〕 、 F D お よび F A B —質量分 祈法 〔 タ ンパク 質の化学 （ 上 ） ： 続生化学実験講座 2 , 日 本生化学会編， 3 7 5 頁 （ 1 9 8 7 年 ） 〕 な どの公知 の方法に従っ て各アイ ソ フ オ ー ム の一部の ア ミ ノ 酸配列 を決定 し 、 以下、 ア ミ ノ 酸配列が判明 し て いる場合 と周 様に し て化学的に合成すればよ い 。
    [0057] 才 リ ゴペプチ ド を化学的に合成す る方法 は特 に制限さ れず 、 アジ ド法 、 酸ク ロ ライ ド法、 酸無水物法、 混合酸 無水物法、 D C C ( N , N ' — ジ シ ク ロ へ キシルカ ルボ ジイ ミ ノ ド ） 法 、 活性エステル法 （ p — 二 卜 ロ フ ヱ ニル エステル法、 N — ヒ ド ロ キシ コ ハ ク 酸イ ミ ド エステル法 、 シ ァ ノ メ チルエ ステル法な ど ） 、 ウ ッ ド ワ ー ド試薬 K を 用 い る方法、 力 ルポニルジ イ ミ ダゾ ール法 、 酸化還元法 、 D C C Zアデ ィ テ ィ ブ （ 例 、 H O N B 、 H O B T、
    [0058] H 0 S u ) 法な ど通常用 い ら れて いる方法を適宜選択 し て実施すればよ い 。 こ れ ら の化学的合成法は液相法 、 固 相法の いず れであ っ てち ょ く 、 合成手頭 と し て ア ミ ノ 酸 を Ί 個づっ縮合させて い く ステ ッ プワ イ ズ法、 数個の ァ ミ ノ 酸か ら な るブ ロ ッ ク を縮合さ せて い く ブ ロ ッ ク縮合 法のいずれの方法も適用 する こ とができる 。 こ れ ら の合 成法の具体的な手頭、 手法 に 関 し て は成書を参照する こ とができる [ Γ The PeptidesJ Vol . Ί 、 Academic
    [0059] Press, New York, U S A ( 1 9 6 6 ) , 「 ペプチ ド合 成」 （ 丸善株式会社、 Ί 9 7 5 年 ） ] 。
    [0060] こ の よ う に し て 調製 し た 才 リ ゴペプチ ド はそ の ま ま 免 疫抗原 と し て 使用 し て も よ いが 、 抗原性が低い時に は 、 適当 な担体 に結合 ま た は吸着さ せ て複合体 と し 、 こ れを 免疫抗原 と し て使用 する のが好ま し い 。
    [0061] 才 リ ゴペプチ ド を結合さ せ る た めの担体 と し て は 、 通 常ハプテ ン抗原に対する抗体の作製に あた り 常用 さ れて い る天然も し く は合成の高分子担体を使用 す る こ と がで きる 。 天然の高分子担体 と し て は 、 た と えば 、 ゥ シ血清 アルブ ミ ン 、 ゥサギ血清アルブ ミ ン 、 ヒ 卜 血清 アルブ ミ ンな どの動物血清アルブミ ン類 ； ゥ シ血清グ ロ ブ リ ン 、 ゥサギ血清グ ロ ブ リ ン 、 ヒ 卜 血清グ ロ ブ リ ン 、 ヒ ッ ジ血 清グ ロ ブ リ ンな どの動物血清グ ロ ブ リ ン類 ； ゥシチ ロ グ 口 プ リ ン 、 ゥ サギ チ ロ グ ロ ブ リ ン な どの動物 チ ロ グ ロ ブ リ ン類 ； ゥ シヘモグ ロ ビ ン 、 ヒ ッ ジヘモグ ロ ビ ン 、 ヒ 卜 ヘ モグ ロ ビ ン な ど の動物 ヘ モ グ ロ ビ ン類 ： キ ー ホ ール リ ン ぺ ッ 卜 へモシ ァニ ンな どの へモシァ ニ ン類な どを例示 す る こ と ができ る 。 合成の高分子担体 と し て は 、 た と え ば、 ポ リ リ ジ ン 、 ポ リ グルタ ミ ン酸 、 リ ジ ン 一 グルタ ミ ン酸共重合物 な ど の ア ミ ノ 酸の望合物 ま た は共—€合物 ； スチ レ ン 、 ク ロ ルスチ レ ン 、 ひ 一 メ チルスチ レ ン 、 ジ ビ ニルベ ンゼ ン 、 スチ レ ンスルホ ン酸ナ ト リ ウ ム 、 （ メ タ ） ア ク リ ル酸 、 （ メ タ ） ア ク リ ル酸ェチル、 （ メ タ ） ァ ク リ ル二 卜 リ ル、 （ メ タ ） ァ ク ロ レ イ ン 、 （ メ タ ） ァ ク リ ルア ミ ド 、 ブタ ジエ ン 、 イ ソ プ レ ン 、 齚酸 ピ ニル 、 ビニ ル ビ リ ジ ン 、 N — ビニル ピ ロ リ ド ン 、 塩化 ビニル、 塩化 ビニ リ デンな どの芳香族 ビニル化合物 、 《 , β — 不飽和 カ ルボ ン酸 ま た はそ の エ ス テル ； α , 3 — 不飽和 ニ 卜 リ ル化合物 、 ハ ロ ゲン化 ビニル化合物 、 共役ジェ ン化合物 な ど か ら 調製 し た 重合物 ま た は 共重合物 な ど の 各種 ラ テ ッ ク スな どを例示する こ とができる 。
    [0062] こ の よ う な担体 と 才 リ ゴペプチ ド と の結合 は 、 物理的 吸着法、 共有結合法、 イ オ ン結合法な どいずれの結合法 を採用 し て も よ い 。
    [0063] 物理的吸着法の具体例 と し て は 、 た と えばラテ ッ ク ス 粒子 と 才 リ ゴペプチ ド を室温で -! 〜 3 時間ゆ っ く り 撹拌 する こ と に よ り 実施する こ と ができる （ 詳細 は 、
    [0064] Endocrinology, 9_3 , 1 0 9 2 ( 1 9 7 3 ) 、 特開 昭 6 1 - 4 3 1 2 4号公報な ど参照 ） 。 共有結合法は 、 担体 中 に存在 し て い る ア ミ ノ 基、 力 ルポキ シル基 、 スル フ ィ ド リ ル基な どの各種反応性残基を活性化 し て オ リ ゴぺプ チ ド と担体 と を結合さ せ る こ と のできる結合剤 の過剰 ¾ 存在下、 ホ ウ酸緩衝液 、 リ ン酸緩衝液な どの各種緩衝液 中 、 髙分子担体 Ί モルに対 し て 才 リ ゴペプチ ド 1 〜 5 0 倍モル使用 し て 、 反応温度 0〜 5 CTCで 3 0分〜 3 0時 間反応さ せる こ と に よ り 実施す る こ と がで き る 。
    [0065] オ リ ゴペプチ ド と担体 とを結合させるの に使用す る結 合剤 と し て は 、 ハプテ ン ま た はペプチ ド と担体ま た は酵 素 と の結合の際に常用 さ れて いるものを使用 する こ と が で き る 。 そ の よ う な結合剤 と し て は 、 た と えば 、 チ ロ シ ン 、 ヒ スチジ ン 、 卜 リ プ 卜 フ ァ ンを架橋す る ビスジ ァゾ 化ベ ン チジ ン 、 ビ ス ジ ァゾ化 3 , 3 ' ー ジ ァ ニ シジ ンな どの ビスジ ァゾニ ゥ ム化合物 ； ア ミ ノ 基同士を架橋させ るグ リ 才 キサー ル、 マ ロ ン ジ アルデ ヒ ド 、 グルタ ール ァ ルデ ヒ ド 、 ス ク シ ン アルデ ヒ ド 、 アジポアルデ ヒ ドな ど の ジ アルデ ヒ ド化合物 ； ト ルエ ン 一 2 , 4 — ジ イ ソ シ ァ ネ ー 卜 、 キシ レ ンジイ ソ シ ァネ ー 卜 な ど の ジ イ ソ シァネ 一 卜 化合物 ； 2 , 4 — ジニ 卜 口 — Ί , 5 —ジ フ ル才 口 べ ンゼ ン 、 p , ' ー ジ フ ル才 ロ 一 m , m ' — ジニ ト ロ フ ェ ニルスルホ ン な どのハ ロ ニ 卜 口 ベ ンゼ ン化合物 ； ジェ チルマ ロ ンイ ミ デー ト な どのイ ミ ドエ ステル化合物 ； チ オ ー ル基同士 を架橋さ せ る N , N ' — 0 — フ エ 二 レ ン ジ マ レイ ミ ド 、 N， N ' 一 m — フ エ 二 レ ンジマ レイ ミ ドな どの ジマ レ イ ミ ド化合物 ： ァ ミ ノ 基 と チオ ール基を架檨 させ る N — ( m — マ レイ ミ ドベ ンゾィ ル才キシ ） ー ス ク シ ン イ ミ ド 、 4 — ( マ レ イ ミ ド メ チル ） 安息香酸 一 N — ヒ ド ロ キシス ク シ ンイ ミ ドエ ステル、 m — マ レイ ミ ドべ ンゾィ ル 一 N — ヒ ド ロ キシ ス ク シ ン イ ミ ド エ ス テル、 4 一 （ マ レイ ミ ドメ チル ） 一 シ ク ロ へキサン 一 1 — 力 ルポ キ シル ー N ' — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド エ ス テルな ど のマ レイ ミ ド カ ルボキ シル一 N — ヒ ド ロ キシ ス ク シ ンィ ミ ド化合物 ； ァ ミ ノ 基 と 力 ルポ キ シル基を架樯 す る N ， N — ジシ ク ロ へ キシルカ ルポジイ ミ ド 、 N — ェチルー N ' ー ジ メ チル ァ ミ ノ カ ルポ ジ イ ミ ド 、 1 ー ェ チル ー 3 ー ジイ ソプ ロ ピルア ミ ノ カ ルポジイ ミ ド 、 1 — シ ク ロ へ キシル一 3 — （ 2 — モルホ リ ニルー 4 ー ェチル ） 力 ルポ ジイ ミ ドメ チルー P — 卜ルエ ンスルホネ ー 卜 な どの カ ル ポジ イ ミ ド化合物 ： N — ェチル ー 5 — フ エ 二ルイ ソ 才キ サゾ リ ゥム — 3 ' — スルホネ 一 卜 な どのイ ソ 才キサゾ リ ゥ ム塩化合物 ： ェチルク ロ ロ ホルメ ー 卜 、 イ ソ ブチルク ロ ロ ホルメ ー 卜 な どの アルキルク ロ ロ ホルメ ー 卜 化合物 を例示する こ と ができる 。 こ れ ら の結合剤 の中か ら使用 する 才 リ ゴペプチ ドの結合部位の種類に応 じ て適宜選択 し て使用 すればよ い 。
    [0066] こ の よ う に して調製 し た免疫抗原 （ オ リ ゴペプチ ド と 担体 と の複合体 ） は 、 透析法 、 ゲル濾過法な どの常法 に 従 っ て単離精製 し 、 次の抗体の製造 に使用する 。
    [0067] (3) 抗体の製造
    [0068] 免疫抗原 と して は 才 リ ゴペプチ ド自体、 ま た は上述の よ う に し て 調製 し た 才 リ ゴペプチ ド と担体 と の複合体を 使用 する 。 オ リ ゴペプチ ド と担体 と の複合体は 、 担体 Ί モル当 り 、 2 〜 5 0 倍モルの 才 リ ゴペプチ ドが結合 し た もの 、 特に担体 1 モル当 り 5 〜 2 0 倍モルの 才 リ ゴぺプ チ ド が結合 し た もの を免疫抗原 と し て使用 する の が好 ま し い 。
    [0069] こ の よ う な免疫抗原を用 いて 、 抗血清を製造する場合 に は 、 免疫抗原が由来する動物 と は異な る異種動物 に免 疫抗原を投与 し て生体内 に平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ム を 区別 し て認識す る抗体を生産させ 、 こ れを取得する と い う 常法に従 っ て実施する こ と ができる 。 すなわ ち 、 免疫抗原を投与す る異種動物 と し て 、 ゥ シ 、 ゥマ 、 ヒ ッ ジ 、 ャ ギ 、 ラ ッ 卜 、 マ ウ ス 、 モルモ ッ ト 、 ハ ム ス タ ー 、 ィ ヌ 、 ネ コ 、 プ タ 、 ゥサギ 、 サル、 ハ 卜 、 二 ヮ 卜 リ 、 ァ ヒ ルな どいず れで あ っ て も よ く 、 特にマ ウ ス 、 ラ ッ 卜 、 モルモ ッ ト 、 ゥサギ が好都合で あ る 。
    [0070] こ の よ う な異種動物へ の抗原の投与は常法 に従 っ て行 え ばよ く 、 た と え ば、 完全 フ 口 イ ン 卜 ア ジ ュ バ ン ド 、 不 完全フ ロ イ ン 卜 ア ジ ュ バ ン ド 、 ミ ヨ ウバ ン ア ジ ュ パ ン ド 、 水酸化 アル ミ ニ ウ ム ア ジ ュ パ ン ド 、 百 日 咳菌 ア ジ ュ パ ン ドな ど の各種ア ジ ュ パ ン ド 、 好ま し く は完全フ ロ イ ン 卜 ア ジ ュ バ ン ド と 上述の免疫抗原 と の懸濁液を調製 し 、 こ れを上記動物の静脈内 、 腹腔内 、 皮下ま た は皮内 に投与 すれば よ い 。
    [0071] 投与量は 、 動物 と し て ゥサギ 、 モルモ ッ 卜 を使用 す る 場合 に は免疫抗原 （ オ リ ゴペプチ ド ま た は オ リ ゴぺプチ ド と担体 と の複合体 ） 量 と し て 0 . Ο Ί 〜 Ί Ο «¾ /匹 、 ま たマ ウ ス 、 ラ ッ 卜 を使用 す る場合 に は 、 0 . 0 0 Ί 〜 1 ^ /匹が好適である 。
    [0072] 初回投与後、 1 〜 4 週間 お き に 1 〜 5 回程度の上記 と 同様の追加免疫を行う こ とで 、 平滑筋 ミ オシ ン重鎖の単 一 の ア イ ソ フ ォ ー ム を 区別 し て 認識す る抗体を得る こ と がでぎる 。
    [0073] こ の よ う に し て 得 ら れた抗体は 、 最終免疫の Ί 〜 2 週 間後 に 採血 し 、 こ れを遠心分離す る こ と に よ り 抗血清 と し て 取得す る こ と ができ る 。 抗体の精製を必要 とする場 合 に は 、 さ ら に 、 溶解度差を利用 し た選択的分別法 （ た と えば、 塩析、 アルコ ール沈 な ど ） 、 電荷の差を利用 し た分別法 （ た と えばイ オ ン交換ク ロ マ ト グラ フ ィ ー 、 電気泳動な ど ） 、 分子量の差を利用 し た分別法 （ た とえ ば超遠心法、 ゲル濾過法な ど ） 、 リ ガ ン ド と の特異的な 結合を利用 する分別法 [ た と えば、 ァ フ ィ 二テ ィ ー ク 口 マ 卜 グラ フ ィ ー （ プ ロ テ イ ン A カ ラ ムな ど に よ る ） ] な どの常法を適宜組み合わせて抗血清中 に存在する抗体を 抗体の ク ラ ス ご と に分別精製 し て も よ く 、 ま た 前記免疫 抗原を固定化 し て得た 固定化抗原を利用 し て平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の単一の ァ イ ソ フ ォ ー ム を 区別 し て認識す る抗 体のみを分別精製 して も よ い 。
    [0074] 次 に 、 モ ノ ク ロ ー ナル抗体の調製 につ い て 説明す る 。 該モ ノ ク ロ ー ナル抗体は公知の細胞融合法、 E B ウィ ル ス な ど に よ る 卜 ラ ンス フ ォ ー メ ー シ ョ ン法な ど を適宜応 用 する こ と に よ り 調製す る こ とができる 。
    [0075] モ ノ ク ロ ー ナル抗体の大量生産に好適な細胞融合法を 例 に挙げ説明する 。 た と えば以下の手順で平滑筋 ミ 才シ ン重鎖の単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ム を区別 し て認識す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を大量に 取得する こ と ができる 。
    [0076] a ) 抗体産生細胞の調製
    [0077] 前記免疫抗原を異種動物 、 好ま し く はマ ウ ス 、 ラ ッ 卜 、 ゥサ ギ 、 ハム ス タ ー 、 二 ヮ 卜 リ な ど に 抗血清の調製の場 合 と同様 に免疫 し 、 抗体産生能を獲得 し た動物か ら の脾 細胞 、 リ ンパ節細胞 、 末梢血細胞な ど の抗体産生細胞を 常法に よ り 取得する 。
    [0078] b) ミ エ ロ ーマ細胞の調製
    [0079] ミ エ ロ ーマ細胞 と して は 、 マ ウ ス 、 ラ ッ 卜 、 ニ ヮ 卜 リ 、 ヒ 卜 な ど の種々 の動物 に 由来 し 、 当業者が一般 に入手可 能な株化細胞を使用 する 。 使用 する細胞株 と し て は 、 薬 剤抵抗性を有 し 、 未融合の状態で は選択培地で生存でき ず 、 抗体産生細胞 と融合 し た状態でのみ生存できる性質 を有す る もの が好 ま し い 。 通常 、 8 — ァ ザグァ ニ ン耐性 株が用 い ら れ、 こ の細胞株は ヒ ポキサ ンチン 一 ホスホ リ ボ シ レ 卜 ラ ンス フ エ ラ ー ゼ ( Hypoxanth i ne phospho- r i bosy I transferase ) を欠損 し 、 ヒ ポキサンチン ♦ ァ ミ ノ プテ リ ン · チ ミ ジ ン （ H A T ) 培地 に 生育できない 。 ま た細胞の性質 と し て免疫グ ロ ブ リ ンを分泌 し ない 、 い わ ゆ る非分泌型の細胞株で あ る こ と が好 ま し い 。
    [0080] ミ エ ロ ーマ細胞株の具体例 と し て は 、 P 3 X 6 3 Ag8 ( Λ T C C T I B - 9 ) ( Nature, 2 5 6 . 4 9 5 - 4 9 7 ( 1 9 7 5 ) ) , P 3 X 6 3 Ag8 U . 1
    [0081] ( P 3 U 1 ) ( A T C C C R L - 1 5 9 7 ) (Current To ics in Microbiology and Immunology, 8 Ί ， 1 - 7 ( 1 9 7 8 ) ) , P 3 X 6 3 Ag8 . 6 5 3 ( A T C C C R L - 1 5 8 0 ) ( J. Immunology, 2 3 , 1 5 4 8 - 1 5 5 0 ( 1 9 7 9 ) ) 、 P 2 / N S 1 / 1 - Ag4 - 1 ( A T C C T I B - 1 8 ) ( European J.
    [0082] Immunology, 6. , 5 1 Ί - 5 1 9 ( 1 9 7 6 ) ) ,
    [0083] S p 2 / 0 - Ag1 4 ( A T C C C R L - 5 8 ) ( ature, 2 7 6 , 2 6 9 — 2 7 0 ( 1 9 7 8 ) ) な ど のマ ウ スミ エ ロ ーマ細胞株 ； 2 1 0 . R C Y . Ag . 2 . 3 ( Y 3 - Ag . 2 . 3 ) ( A T C C C R L - 6 3 1 ) ( Nature, 2 7 7 , 1 3 1 - 1 3 3 ( 1 9 7 9 ) ) な どのラ ッ 卜 ミ エ ロ ーマ細胞株 ： U — 2 6 6 — A R
    [0084] ( Proc. Natl . Acad. Sci. U . S . A . , 1_J_ , 5 4 2 9 ( 1 9 8 0 ) ) ^ G M 1 5 0 0 ( Nature, 2 8 8 , 4 8 8 ( 1 9 8 0 ) 、 K R - 4 ( Proc. Natl . Acad. Scに U . S . A . , 7_9 , 6 6 5 1 ( 1 9 8 2 〉 ） な ど の ヒ 卜 ミ エ ロ ーマ細胞株を例示する こ と ができる 。
    [0085] C) 細胞融合
    [0086] 細胞融合 に あた っ て は 、 抗体産生細胞 に適合 し た ミ エ ロ ーマ細胞を選定する 。 細胞融合 は 、 イ ー グル最少基本 培地 （ M E M ) 、 ダルベ ッ コ 変法イ ー グル培地
    [0087] ( D M E ) R P M I Ί 6 4 0培地な どの動物細胞 培養用培地中で 1 0 ' 〜 Ί 08 Ζ/βδの ミ エ ロ ー マ細胞 と 抗体産生細胞を混合比 Ί : 4〜 1 0 に混合 し 、 3 7 で 1 〜 1 0分間細胞同士 を接触さ せ る こ と に よ り 効率 よ く 融合を行う こ と ができる 。 細胞融合を促進させるた め に 、 平均分子量 1 0 0 0〜 6 0 0 0の ポ リ エ チ レ ング リ コ ー ル （ P E G ) 、 ポ リ ビニ ー ルア ルコ ール 、 セ ンダイ ウ イ ルス な ど の融合促進剤 を使用 す る こ と がで き る 。
    [0088] 電気パルスを利用 し た市販の細胞融合装置を用 いて抗 体産生細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞を融合さ せ る こ と もで き る d ) 選択培地に おける八イ ブ リ ド ーマ の選別 細胞融合処理後の細胞か ら 目 的 と するハ イ ブ リ ド ー マ を選別する手段 と し て は 、 選択的培地に おける細胞の選 択的増殖を利用 す る方法を用 い る こ と ができ る 。 た と え ば 、 細胞懸濁液を 1 0〜 Ί 5 %ゥ シ胎児血清 （ F G S ) 含有 R P M I 1 6 4 0培地な どで適当 に希釈後、 マ イ ク ロ プ レ ー 卜 上に 1 05 〜 1 0 σ ゥ エル程度ま き 、 各 ゥエルに選択培地 （ た と えば 、 H A T培地な ど ） を加え 、 以後適当 に選択培地を交換 し て培養を行う 。 ミ エ ロ ー マ 細胞 と し て 8— ァザグァ ニ ン耐性株 、 選択培地 と し て H A T培地を用 い た場合 は 、 未融合の ミ エ ロ ーマ細胞 は 培養 Ί Ο 曰 目 ぐ ら い ま で に死滅 し 、 正常細胞であ る抗体 産生細胞も イ ン ビ 卜 ロ （ in vitro) で は長期間生育で き な いので 、 培養 1 0〜 1 4 曰 目 か ら生育 し て く る細胞を ハ イ プ リ ド ー マ と し て 得る こ と ができ る 。
    [0089] e) 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の単一の ァ イ ソ フ ォ ー ムを 区別 し て 認識す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を産生 するハ イ プ リ ド ーマ の検索
    [0090] 平滑筋ミ オ シ ン重鎖の単一の ァ イ ソ フ ォ ー ム を 区別 し て 認識す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を産生す るハ イ プ リ ド ー マ の検索 は 、 酵素標識免疫定量法 （ E L I S A ) 、 放射 性同位元素免疫定璗法 （ R I A ) な ど に よ っ て行 う こ と がで き る 。 た と えば、 前述の免疫抗原を吸着させ た 9 6 ゥ エル E L I S A用マ イ ク ロ プ レ ー 卜 に モ ノ ク ロ ー ナル 抗体を含む培養上清を添加 し て免疫抗原 と反応させ 、 次 いで結合 し た特異抗体 に 酵素標識抗免疫グ ロ ブ リ ン抗体 を反応させるか 、 ビ 才チン標識抗免疫グ ロブ リ ン抗体を 反応させた の ち ア ビジ ン D— 酵素標識体を反応さ せ 、 各 ゥエルに酵素基質を加えて発色させる 。 発色の有無に よ り 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム と結合能力 を有 する抗体を産生するハイ ブ リ ド ーマ を含む培養上清を添 加 し た ゥエルを判別で き 、 目 的 と するハ イ プ リ ド ー マを 検索する こ とができる 。
    [0091] f ) ク ロ ー ニ ング
    [0092] ハイ プ リ ド ーマの ク ロ ー ニ ングは、 限界希釈法、 軟寒 天法、 フ イ ブ リ ンゲル法 、 蛍光励起セルソ ー タ ー 法な ど に よ り 行う こ と ができる 。
    [0093] g) モ ノ ク ロ ー ナル抗体の生産
    [0094] こ の よ う に し て 取得 し た ハ イ ブ リ ド ー マ か ら モ ノ ク ロ ー ナル抗体を生産す る方法 と し て は 、 通常の細胞培養 法や腹水形成法な どが採用 さ れう る 。
    [0095] 細胞培養法に お いて は 、 ハ イ プ リ ドーマを 1 0〜 1 5 % F C S含有 R P M I 1 6 4 0培地 、 無血清培地な ど の動物細胞培養用 培地中で培養 し 、 その培養上清液か ら 抗体を取得する こ とができる 。
    [0096] 腹水形成法で は 、 ハ イ ブ リ ド ーマ と 主要耝耩適合性が 一致する動物 に 、 プ リ ス タ ン （ 2 , 6 , Ί Ο， Ί 4 ー テ 卜 ラ メ チルペ ン タ デカ ン ） な ど の鉱物油 を腹腔内 に 投与 し た後、 た と えばマ ウ ス の場合 に はハイ ブ リ ド ーマ を約 1 00 〜 1 07 /匹腹腔内投与する 。 ハイ プ リ ドーマ は 1 0〜 1 8 日 ほ どで腹水腫瘍を形成 し 、 血清お よび腹水 中に髙濂度に抗体を産生するので得 ら れる腹水か ら抗体 を取得す る こ と がで き る 。
    [0097] 抗体の精製が必要 と さ れる場合 に は 、 硫安塩析法 、 D E A E セル ロ ー ス な どの陰イ オ ン交換体を利用 する ィ オ ン交換 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー ； プ ロ テ イ ン A — セ フ ァ ロ ー スな ど を用 い る ァ フ ィ 二 テ ィ ー ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー 、 分子ふる い ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー （ ゲル濾過 ） な ど の公知 の方法を適宜 に選択 し 、 組合せ る こ と に よ り 精製す る こ と がでぎる 。
    [0098] (4) 抗体 フ ラグメ ン 卜
    [0099] 抗体の活性フ ラ グメ ン ト は 、 本発明抗体の特徴を保持 するも の （ た と え ば 、 F ( a b ' ) 2 , F a b ' 、
    [0100] F a t>な ど の各種 フ ラグメ ン ト 〕 で あ ればいず れの も の であ っ て も よ い 。 こ れ ら 活性フ ラ グメ ン 卜 の調製 は 、 精 製抗体 に対 し て パパ イ ン 、 ペプシ ン 、 卜 リ プシ ン な ど の プ ロ テ ア ーゼ に よ り 限定分解する方法な ど公知の方法を 適用 し て 行う こ と が で きる （ た と え ば免疫生化学研究法 ： 続生化学実験講座 5 、 日 本生化学会編、 8 9 頁 （ 1 9 8 6年 ） 参照 〕 。
    [0101] (5) 標識さ れた抗体ま た は活性フ ラ グメ ン ト
    [0102] 抗体 ま た は 活性 フ ラ グメ ン ト を標識 （ ラ ベル化 ） す る た めの標識剤 と し て は 、 酵素 （ た と えば、 jS — ガラ ク 卜 シダー ゼ 、 ペル 才 キ シダ ー ゼ 、 ア ル 力 リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 、 グルコ ー ス 一 6 — リ ン酸デ ヒ ド ロ ゲナ ー ゼ な ど ） ： 補酵 素 * 補欠分子族 （ た と ぇば 、 0 、 （/1 、 八 丁 、 ヘムなど 〉 ： 生体内 リ ガ ン ド * レセプタ ー （ た と えば、 ピオ チン 、 ア ビ ジ ン 、 ス 卜 レブ 卜 ア ビ ジ ンな ど ） ； フ ル ォ レセ イ ン誘導体 〔 た とえば、 フ ルォ レセイ ンイ ソ チ才 シ ァ ネ ー 卜 （ F I T〇 ） 、 フ ル才 レ セ イ ン チオ フルバ ミ ルな ど 〕 、 ロ ー ダミ ン誘導体 （ た と えば 、 テ 卜 ラメ チル ロ ー ダ ミ ン Bイ ソ チ才シ ァネ ー 卜 な ど ） 、 ゥ ンベ リ フ エ ロ ン 、 1 ー ァニ リ ノ 一 8— ナ フ タ レ ンスルホ ン酸な どの 蛍光物質 ； ル ミ ノ ー ル誘導体 （ た と えば、 ル ミ ノ ー ル、 イ ソ ルミ ノ ール、 N— （ 6— ァ ミ ノ へキシル ） 一 N— ェ チルイ ソ ル ミ ノ ールな ど 〕 な どの化学発光物質 ； 放射性 同位元素 （ 125 I 、 131 I 、 3H、 n、 99mT c ) な どを用 いる こ と ができる 。 これ ら を 、 抗体ま た は活性 フ ラグメ ン ト に直接結合さ せて も よ く 、 他の物質 （ 抗免 疫グ ロブ リ ン抗体、 ビ 才チン 一 ア ビジ ン系な ど ） を介 し て 関接的 に結合さ せ て も よ い 。 抗体 ま た はその活性 フ ラ グメ ン 卜 と 標識剤 と の結合 は 、 た と え ば 、 「 続生 化 学 実験講座 5免疫生化学研究 法 」 （ 株 ） 東京化 学同 人 、 1 9 8 6年発行 ） 第 1 0 2〜 1 1 2頁 ； 「続ラ ジオィ ム ノ ア ッ セ ィ 」 （ 前記 ） 、 E P , B 1 , 0 Ί 6 3 0 4 Ί な ど に記載されて いる よ う な公知の方法か ら適宜選択 し て 実施すればよ い 。
    [0103] (6) 本発明抗体の有用性
    [0104] 本発 明抗体 は 、 平滑筋 ミ オ シ ン 重鎖 の 単一 の ァ イ ソ フ ォ ームを区別 し て認識す る た め 、 た と えば個体発生 に お け る平滑筋 ミ オ シ ン重鎖 ァ イ ソ フ ォ ー ム の発現調節機 構を解明するた めの生化学試薬 ま た は診断用試薬 、 具体 的 に は組織染色用 試薬 な ど と し て 有用 で あ る 。
    [0105] そ の中でも特に ヒ 卜 の平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ オ ー ム を認識す る も の は 、 ヒ 卜 の各種疾病に お け る平滑 筋 ミ オシ ン重鎖の ア イ ソ フ オ ー ムの発現状態を組耩学的 に調べ る こ と ができ 、 疾病の発生原因や 、 発症後の進行 状況を客観的に診断、 研究するの に 、 極めて有用 なもの で あ る 。
    [0106] ま た 、 こ れ ら の抗体ま た はその活性フ ラ グメ ン ト を放 射性周位元素な どの標識剤で標識 （ ラ ベル化 ） し た も の は 、 ヒ 卜 を含む動物の体内 に投与 し 、 画像診断を行う こ と に よ っ て 血管障害の部位や程度を 診断す る た め の体内 診断薬 と して有用である 。
    [0107] さ ら に本発明抗体も し く はそ の活性フ ラ グメ ン 卜 、 ま た は こ れ ら に標識剤を結合さ せた も の は 、 体液 （ 血液 、 尿 な ど ） 中 の平滑筋 ミ オ シ ン重鎖を定量的ま た は定性的 に測定す るた めのィ ム ノ ア ッ セ ィ 用 の試薬 と し て も有用 で あ る 。 ィ ム ノ ア ツ セ ィ は公知 の方法 [ 入江 寛編 、 続 ラ ジ オィ ム ノ ア ツ セィ 、 ㈱講談社 、 昭和 5 4年 5 月 1 日 発行 ） ； 石川 栄治 ら 編 、 酵素免疫測定 法、 第 2版 、 ㈱医 学書院 、 Ί 9 8 2年 Ί 2 月 1 5 日 発行 ； Methods i n E N Z Y H 0 L 0 G Y , Vol.92, Immunochemical techniques, Part E : Monoclonal Antibodies and Genera I
    [0108] immunoassay Methods, 7 力 デ ミ ッ ク プ レ ス 社 発 '行参 照 ] 、 た と え ばサン ドイ ッ チ法に よ っ て 行う こ と ができ る 。 こ の よ う な ィ ム ノ ア ッ セ ィ に よ っ て血管障害、 動脈 硬化、 ガ ンな どの各種疾患の診断が可能 と なる 。
    [0109] 実施例
    [0110] 以下 、 実施例を示 し 、 本発明を具体的に説明する 。 実施例 1. 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ア イ ソ フ オ ー ム に対す るラ ッ 卜 抗血清
    [0111] ゥサギ平滑筋 ミ オシ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム 1 ( S M - 1 ) の C端末部か ら 1 3 ア ミ ノ 酸残基に相当する合成 ペプチ ド C 1 ( H 2 N - A R D A D F N G T K S S E - C 0 0 H ) と ゥサギ平滑筋ミ オシ ン重鎮の ア イ ソ フ ォ ー ム 2 ( S - 2 ) の C端末部か ら 1 0 ア ミ ノ 酸残基 に相 当 する合成ペプチ ド G 2
    [0112] ( H 2 N - R G P P P Q E T S Q - C O O H ) と ゥサギ 平滑筋 ミ オシ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム 3 ( 胎児型 ： S M 一 3 ) の C端末部か ら 1 3 ア ミ ノ 酸残基 に相当 す る合成 ペプチ ド C 3 ( H 0 N - T S D V N E T Q P P Q S E - C 0 0 H ) と を抗原 と し て 用 い 、 こ れ ら の抗原 と ゥ シ血 清アルブ ミ ン （ B S A ) を通常のマ レ イ ミ ド 法 [ 免疫実 験操作法 XI、 （ 日 本免疫学会 、 昭和 5 7 年発行 ） 第 3 5 2 9 〜 3 5 3 4 頁 ] と周様 に 反応さ せ て合成ペプチ ド と B S A の複合体 （ C 1 一 B S A 、 C 2 - B S A , C 3 - B S A ) を調製 し た 。 こ の よ う に し て得 ら れ た複合体は B S A分子当 り 合成ペプチ ドが平均 Ί 0 分子結合 し た も のであ っ た 。
    [0113] 次 に C 1 一 B S A を生理食塩水 に Ί ^ / δώの濃度 にな る よ う 溶解させ 、 こ れを完全 フ ロ イ ン 卜 ア ジ ュ パ ン 卜 と 1 ： Ί の割合で混合 し て懸濁液を調製 し 、 こ の懸濁液 2 0 0 ^ を ウ ィ ス タ ー ラ ッ 卜 （ 雌、 6週令 ） の背中 に皮 内投与 し た 。
    [0114] さ ら に 2週間おき に同量の上記懸濁液を 4回投与 し て 追加免疫 と し た 。
    [0115] 最終免疫の Ί 0 日 轻過後 に採血 し 、 4 eCで "！ 6時間放 置後、 3 0 0 0 rpm で Ί 0分間遠心 し て 上清を得、 こ れ をラ ッ 卜 抗 C 1 抗血清 と し た 。
    [0116] C 2 - B S Aを C 1 一 B S A と同様 に処理 し て ラ ッ 卜 抗 C 2抗血清を得た 。
    [0117] ま た 、 C 3 — B S Aは生理食塩水に Ί の濃度に な る よ う に 溶解さ せ 、 こ れを完全 フ ロ イ ン ド ア ジ ュ バ ン ド と Ί ： Ί の割合で混合 し て懸濁液を調製 し 、 こ の懸濁 液 5 0 ^ を B A L B / cマ ウ ス （ 雌 、 6週令 ） の背中 に 皮内投与 し た 。 以下 C Ί お よび C 2 と同様 に抗血清を 得、 こ れをマ ウ ス抗 C 3抗血清 と し た 。
    [0118] 実施例 2 ラ ッ 卜 抗 C Ί お よび抗 C 2抗血清の特異性 ラ ッ 卜 抗 C Ί 抗血清お よびラ ッ 卜 抗 C 2抗血清の特異 性はィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ング法に よ り 確認 し た 。
    [0119] ① 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の 調製
    [0120] ゥサギ大動脈お よび ゥサギ子宮の組織を Ί 0倍量 の抽 出用 溶液 （ 5 0 リ ン 酸二水素ナ 卜 リ ウ 厶 、 1 m Hェチ レ ン グ リ コ ール ビ ス （ 2 — ァ ミ ノ ェチルエ ー テル ） 四酢酸 ( E G T A ) , 0 . 1 2 5 πιΗフ ： π ニル メ タ ン スルホ 二ル フ ル才 リ ド （ P M S F ) 、 PH 7 . 0 ) と と も に ホモジナ ィ ズ し 、 4 で 1 0 0 0 rpm 、 1 0分間遠心 し て沈 ¾を 得た 。 得 ら れた沈 全量を Guba-Straub 溶液 （ 1 5 0 mM リ ン酸二水素ナ 卜 リ ウ 厶 、 3 0 0 mH塩化ナ 卜 リ ウ ム 、 1 0 mH A T P ^ 1 mH E G T A 0 . 1 2 5 iH
    [0121] P M S F 、 1 mH 2 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ル、 pH
    [0122] 6 . 7 ) に懸濁させ 、 4 °Cで 1 時間ゆ る く 撹拌 し た後 、
    [0123] 4 °Cで Ί 0 0 0 0 rpm 、 1 0分問遠心 し て 平滑筋 ミ 才 シ ン重鎖を含む上清を得た 。 得 ら れた上清 は等容量のグ リ セ リ ン を 添加後、 使用 時 ま で一 2 0 °C下で保存 し た 。 ② 電気泳動
    [0124] ①で得 ら れた抽出液に含 ま れる平滑筋ミ オシ ン重鎖を
    [0125] 5 D S—ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （ S D S— P A G E ) を行う こ どに よ り 各 ァ イ ソ フ ォ ー ム に分離 し た 。
    [0126] S D S - P A G E は 3 %の濃縮ゲルお よび 4 % の分離 ゲルを重層 し た ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲルを使用 し 、 6 0 Vで 1 2 時間泳動させ た 。
    [0127] ま た 、 泳勦 さ せ る fc め の試料 と し て は 、 ①の抽出液に 同量の遝元処理液 （ 2 % S D S 、 5 % 2—メ ル カプ 卜 ェ タ ノ ー ル 、 2 0 %グ リ セ ロ ー ル 、 0 . 〇 Ί %ブ ロ モ フ エ ノ ールブルー （ B P B ) を含有す る Ί 0 0 mH卜 リ ス 一 塩 酸緩衝液 （ tH 6 . 8 ) ) を加 え て 1 0 0 °Cで 2分間加熱 反応さ せ た ものを用 いた 。
    [0128] ③ ィ 厶 ノ 7ロ ッ テ イ ン グ ②の S D S— P A G E に よ っ て 得 ら れた分離用ゲル に 二 卜 ロ セル ロ ー ス膜を のせ 、 6 0 V、 1 2 時間通電 し て 二 卜 ロ セ ル ロ ー ス膜 に タ ンパ ク 質を転写させた 。 こ の よ う に し て 得 ら れた ニ ト ロ セ ル ロ ー ス膜を試料の 泳動 ラ イ ン にそ っ て短冊状 に切断 し、 一部は ア ミ ドブラ ッ ク を用 い て タ ンパ ク 質を染色 し た 。 残 り の膜 は 3 %ゼラ チ ン溶 液 に ひた して 3 7 eC、 Ί 時間反応させてブ ロ ッ キ ン グ処 理を行 っ た後 、 リ ン酸緩衝生理的食塩水 （ P B S ) を用 いて 1 ノ 5 0濃度に希釈 し た ラ ッ 卜 抗 抗血清お よび ラ ッ 卜 抗 C 2抗血清を 3 7 °C、 1 時間反応さ せ た 。 反応 後 、 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス膜を P B S ( 0 . 0 5 % Tween 2 0含有 ） に 5分間浸 た す こ と に よ り 洗净 し 、 さ ら に 3 回 同様の洗浄 を繰返 し行 っ た後 、 P B Sを用 いて Ί Ζ 2 0 0濃度に 希釈 し たパー 才 キ シダ ー ゼ標識抗ラ ッ 卜 I g G 抗体 （ E Yラ ポラ ト リ 一社製 ） と 3 7 C、 Ί 時間反応さ せ た 。 反応後 、 二 卜 ロ セル ロ ー ス膜を P B S 0 . 0 5 % Tween 2 0含有 ） で 3 回洗浄後 、 基質溶液 （ カ ラ ーデ ィ ベ ロ 一 ィ ォ ラ ッ ド 社製 ） 3 0 m3、 メ タ ノ ー ル 0 P B S 5 0 、 過酸化水素水 3 0 Ai jg 含有 ） と 反応さ せ て 発色さ せ 、 適当 に発色 し た 時点で水洗い を し て 反応を停止させ た 。
    [0129] S D S — P A G E お よびィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ン グの結果 を第 1 図 お よ び第 2 図 に 示す 。
    [0130] 第 Ί 図 は ゥサギ大動脈の平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の S D S 一 P A G E お よび ィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ングの結果を示 し た ものであ り 、 ライ ン Ί は S D S— P A G E後抗 抗血 清を用 い て ィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ング し た 時の結果、 お よび ラ イ ン 2 は S D S— P A G E後抗 C 2抗血清を用 いて ィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ング し た 時の結果 、 お よびラ イ ン 3 は S D S — P A G E後ア ミ ドブラ ッ クで処理 し た時の結果 を示 し た もので あ る 。
    [0131] 第 2図 は ゥサギ子宮の平滑筋ミ オシ ン重鎖の S D S — P A G E お よ ぴィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ングの結果を示 し た も のである 。 図中ラ イ ン 1 〜 3 は第 1 図 と同 じ処理を し た 時の結果を示 し た も の で あ る 。
    [0132] 第 1 図お よび第 2図か ら抗 C 1 抗血清は S M— Ί のみ に 、 抗 C 2抗血清 は S M — 2 のみ に特異的 に 反応するも のである こ とが確認さ れた 。
    [0133] 実施例 3 免疫蛍光組織染色
    [0134] ゥサギの耝耩 （ ゥサギ の胎児期 、 新生児期 お よび成長 期 の大動脈、 ゥ サギの ポ タ ロ 管、 成長期 の ゥ サギ子宮 ） お よび ヒ 卜 の組織 （ ヒ 卜 の成人の正常な血管 、 ヒ 卜 臍帯 動脈 ） を ク リ オ ス タ ツ 卜 を用 い て 凍結切片 と し 、 P B S に 5分間浸す こ とで洗浄 し 、 さ ら に こ の洗浄を 3 回繰 り 返 し て 行 っ た 。 次 に P B Sで Ί Ί 0〜 Ί / 5 0濺度 に 希釈 し た ラ ッ 卜 抗血清 （ 抗 C 1 抗血清 、 抗 C 2抗血清 ） ま た はマ ウ ス 抗血清 （ 抗 C 3 抗 血 清 ） と 組 織 切 片 と を 3 7 、 1 時間反応させた後 、 P B S に 5分間浸す こ と で 洗浄 し 、 さ ら に こ の 洗净を 3 回繰 り 返 し て行 っ た 。 洗 浄 し た組織切片 は P B Sで Ί / Ί 〇 〜 1 / 5 0濃度 に希 釈 し た フ ル 才 レ セ イ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー 卜 （ F I T C ) 標識抗ラ ッ 卜 I g G抗体ま た は F I T C標識抗マ ウス I g G抗体 （ そ れぞれ E Yラ ポ ラ 卜 リ ー 社製 ） と 3 7 1 時間反応させた後、 P B Sを用 い て の洗浄 お よびグ リ セ ロ ール処理を行 っ た 。 こ の よ う に し て得 ら れた組織切 断を蛍光顕微鏡下で観察 し た結果 、 以下の①〜⑦の こ と が確認さ れた 。
    [0135] ① 生後 Ί 曰 目 の ゥサギ動脈管 （ ポ タ 口 管 ） は抗 C 1 お よ び抗 C 2抗血清 に よ り 認識 （ 染色 ） さ れた 。 S M— 2 は生後 Ί 曰 目 の一般の血管平滑筋に はほ と ん ど存在 し て い ない が 、 出生直後 に 閉鎖す る特徴を持つ 血管で あ る ボ タ ロ 管 に豊富に存在する こ と が明 ら か と な っ た （ 第 3図 参照 ） 。
    [0136] ② 抗 C 1 抗血清お ょぴ抗 C 2抗血清のいずれも成長期 の ゥサギ 血管平滑筋 を認識 （ 染色 ） し た （ 第 4図参照 ）
    [0137] ③ 抗 C 1 抗血清は胎児期 、 新生児期 （ 生後 1 0 日 目 ） お よび成長期 （ 生後 3 0 日 目 ） の ゥ サギ 血管平滑筋を認 識 （ 染色 ） し た 。 抗 C 2抗血清 は新生児期 お よび成長期 の血管平滑筋を認識 し た が 、 胎児期 血管平滑筋は認識 ( 染色 ） しなか っ た 。 すなわち 、 抗 と抗 C 2の両抗 血清を闭 い た組織染色 に よ り 、 血管 に お け る平滑筋 ミ オ シ ン重鎖ァ イ ソ フ ォ ー ムの発現の変化を明 ら か にす る こ と ができ た （ 第 5図参照 ） 。
    [0138] ④ 抗 C Ί 抗血清お よび抗 C 2抗血清の いずれも成長期 の ゥ サギ子宮平滑筋 を 認識 （ 染色 ） し た 。 ②の結果も考 盧すれば 、 成長期の平滑筋細胞 に は S M— Ί と S M— 2 が共存 し て いる こ と が示さ れた （ 第 6図参照 ） 。
    [0139] ⑤ 成人の ヒ 卜 の正常な血管平滑筋細胞は.抗 C 2抗血清 に よ り 認識さ れた （ 第 7 図参照 ） 。
    [0140] ⑥ 抗 C 3抗血清は胎児期の ゥサギ血管平滑筋を認讜 ( 染色 ） し た が 、 成長期 の血管平滑筋を認識 （ 染色 ） し なか っ た （ 第 8 図参照 ） 。
    [0141] ⑦ ヒ 卜 臍帯動脈 は抗 C 3抗血清 に よ り 認識 （ 染色 ） さ れ、 抗 C 3抗血清はゥサギのみな ら ず 、 ヒ 卜 の胎児型平 滑筋 ミ オ シ ン重鎖ァ イ ソ フ ォ ー ム （ S M— 3 〉 をも認識 する こ とが確認さ れた （ 第 9 図参照 ） 。
    [0142] 以上の結果か ら 、 本発明抗体 は組織染色 に使用 す る生 化学用 ある いは診断用試薬 と して有用であ り 、 かつ 、 実 施例 Ί で作製 し た抗血清は ヒ 卜 の平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ァ イ ソ フ ォ ー ムも区別 し て認識するものである こ とが判 明 し た 。
    [0143] 上述 と同様の方法に よ り ゥサギの心筋お よび骨格筋の 組織標本を作製 し 、 抗 C 1 抗血清、 抗 C 2抗血清お よび 抗 C 3抗血清を用 いて 上述 と同様の方法に よ り 染色操作 を行 っ た が 、 こ れ ら の組織は抗 C 1 抗血清、 抗 C 2抗血 清ま た は抗 C 3抗血清で は ま っ た く 染色さ れなか っ た 。 実施例 4 平滑筋 ミ オ シ ン靈鎖ァ イ ソ フ ォ ー ム に対する モ ノ ク ロ ー ナル抗体
    [0144] ① モ ノ ク ロ ー ナル抗体の作製
    [0145] 実施例 Ί で調製 し た C 1 — B S Aを Ί ^/ の濃度に なる よ う に 生理食塩水 に 溶解さ せ 、 こ の溶液 と 完全 フ 口 イ ン 卜 ア ジ ュ パ ン ド を Ί ： 1 の容量で混合 し て 懸濁液を 調製 し た 。 こ の懸濁液を B A L B Z cマ ウ ス （ 雌、 6週 令 ） の腹腔内 に 5 0 ^投与 し 、 さ ら に同量の懸濁液を 2週間 お き に 同様 に 3回投与 し て追加免疫を行 っ た後 、 C 1 - B S A ( 1 0 0 U ^ / mi ) Ί Ο Ο / jg を静注 し て 最終免疫 と し た 。
    [0146] 最終免疫か ら 3 曰 後にマ ウ ス の脾細胞を摘出 し 、 ィ ー グル最少基本培地 （ M E M ) で 洗 净 し た 。 マ ウ ス ミ エ ロ ーマ P 3 x 6 3 Ag8 U . 1 ( P 3 U -, ) ( A T C C C R L - 1 5 9 7 ) を M E Mで洗净 し 、 上記脾細胞 と P 3 U 1 を Ί Ο ： Ί で 混 合 し た 後遠心分 離 し て 得た ぺ レ ツ 卜 に 5 0 % ポ リ エチ レ ン グ リ コ ー ル （ P E G 〉 1 0 0 0含有 M E M溶液 を 徐 々 に 加 え て 、 細 胞融合 を 行 っ た 。 さ ら に 、 M E M溶液を加えて Ί 0 roeと し 、 遠心 分離 し て得た ペ レ ツ 卜 を 1 0 % ゥ シ胎児血清 （ F C S ) 含有 R P M I 1 6 4 0培地 に P 3 U ·, と し て
    [0147] 3 Χ Ί 04 個 Z 0. と な る よ う に懸濁させ 、 9 6ゥ エルマ イ ク ロ プ レ ー 卜 に 各ゥ エル 0 . Ί ずつ 分注 し た 。
    [0148] 曰 後 、 H A T培地を 添加 し 、 そ の後 3〜 4 曰 ご と に 培地の半分量を新 し い H A T培地で交換 し た 。
    [0149] 融合か ら Ί 0 日 目 に あ ら か じ め合成ペプチ ド C 1 ( 1 U ^ / ! ) を コ 一 卜 し 、 3 %ゼ ラ チ ンでブ ロ ッ キ ン グ処 理を施 し て ある 9 6ゥ エルポ リ 塩化 ビ ニル （ P V C ) プ レ ー 卜 に 培養上清 5 0 ^ を添加 し た後、 ビ 才 チ ン化 ゥ マ抗マ ウ ス I g G ( ベ ク タ 一社製 ） 溶液 5 0 ^ を加 え て室温で Ί 時間反応さ せ た 。 反応後 、 P B S で各ゥエルを よ く 洗浄 し 、 ア ビジ ン D 一 ペル才キ シダ ーゼ （ ベ ク タ ー社製 ） 溶液 5 0 ^ を加 えて室温で 3 0 分 P 反応させた後、 P B S で 3 回洗浄 し 基質溶液 （ 4 - ァ ミ ノ ア ン チ ピ リ ン （ 0 . 2 / mS> ) フ エ ノ ール （ 0 . 2 5 / id ) 、 0 . 4 2 5 M過酸化水 素含有 ) 2 0 0 ^ ^ を加え 、 室温で反応さ せ た後、 9 6 ゥ エルマイ ク ロ ブ レー 卜 フ ォ 卜 メ ー タ ー を用 いて各 ゥェ ルの 5 5 0 nmに お け る 吸 光度 を 測 定 し 、 合 成 ペ プ チ ド C 1 に特異的に反応する モ ノ ク ロ ーナル抗体を産生す る ハ イ ブ リ ド ーマ を得た （ 第 1 表 ） 。 上記 と周様の方法に よ り 合成ペプチ ド C 2 ま た は合成 ぺプチ ド C 3 に特異的 に反応す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を 産生するハイ ブ リ ド ーマ をそれぞれ得た ( 第 1 表 ） 。 第 1 表
    [0150] 合成ぺ 特異抗体陽 細胞増殖
    [0151] プチ ド 性ゥ エル数 / ゥ エル数 / ' 全ゥエル数
    [0152] C 1 4 4 / 2 0 2 / 4 7 0
    [0153] C 2 8 / 1 8 3 / ' 4 7 0
    [0154] C 3 3 7 / 4 7 0 / ' 4 7 0 し の よ う に し て得た各ハイ ブ リ ド ーマ は限界希釈法 に よ り ク ロ ー ニ ング を行い合成ペプチ ド C I に対 する抗体 を産生するハイ ブ リ ド ーマ Ί 0株 （ Ί Β 4、 1 C 8、 1 C 1 0、 1 H 9 、 2 G 1 0、 3 C 8 、 4 C 6、 4 E 1 0、 5 C 4 、 5 D 5、 5 D 1 0 ) 、 合成ペプチ ド G 2に 対す る抗体を産生 す るハ イ ブ リ ド ーマ 2株 （ Ί Α 1 0、 2 Β 8 ) お よび合成ペプチ ド C 3 に対する抗体を産出す る八 イ ブ リ ド ーマ 9株 （ 1 G 5、 2 A 6、 2 C 5、 2 D 7 、 2 G 1 、 3 A 4 、 3 H 2 、 4 H 3 、 5 F 6 ) を樹立 し た 。
    [0155] 次に 、 樹立 し たハ イ ブ リ ド ー マ Ί B 4を培養 して数を 増や し 、 あ ら か じ め プ リ ス タ ン を腹腔内 に投与 し て 1 ケ 月 位た つ た マ ウ ス の腹腔内 へ一匹当 り 3 X 1 06 細胞を 投与 し
    [0156] 2週間後マ ウス Ί 匹当 り 約 1 0 の腹水を採取 し た 。 腹水約 4 0 ( 2匹分 ) と 同量の P B Sを加 え て希釈 し た後 、 飽和硫酸ア ンモニ ゥ ム溶液 8 0 Αΐβを加え 、 5 0 %硫酸 ア ン モニ ゥ ム飽和条件下 に て 沈殿す る画分を遠心 する こ と に よ り 採取 し た 。 こ の沈殺画分 に約 Ί Q i の 0 . 1 M 卜 リ ス ー 塩酸緩衝液 （ PH 7 . 2 ) を加 え て 溶解 させ 、 こ れを同緩衝液に対 し て 2 曰 間透析 し た
    [0157] 次 に 抗休溶液を D E A E - セル ロ ー ス D Ε 5 2 ( ヮ ッ 卜 マ ン社製 ） を充隳 し た カ ラ ム ( 2 2廳 X 6 3 cm ) に添 加 し 、 素通 り 画分 を集め 、 次 に こ の素通 り 画分 を ウル 卜 口 ゲル A c A 4 4 ( し K B社製 ) を充填 し た 力 ラ ム （ 2 2續 X o 5 c/n ) に 添加 し ゲル濾過 す る こ と に よ り 、 合成 ペプチ ド 〇 Ί に対 し て特異的に 反応する精製抗体を得た 。 ハ イ プ リ ド ーマ 1 Α 1 0を用 い て 、 上述 と周様の方法 に よ り 合成ペプチ ド C 2 に対 し て特異的に反応する精製 抗体を得た 。
    [0158] ハイ プ リ ド ーマ 2 D 7 を用 いて 、 上述 と同様の方法に よ り合成ペプチ ド C 3 に対 し て特異的 に反応す る精製抗 体を得た 。
    [0159] ② 平滑筋ミ オシ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム に対するモ ノ ク ロ ー ナル抗体の性質
    [0160] 1 ) ク ラ ス 、 タ イ プ
    [0161] 合成ペプチ ド C 1 、 合成ペプチ ド C 2 ま た は合成ぺプ チ ド C 3 を コ ー 卜 し 、 3 %ゼラ チ ンでブ ロ ッ キ ング処理 を施 し て ある 9 6ゥエル P V Cプ レ ー 卜 に前記各ハイ ブ リ ド ーマ の培養上清を添加後、 HonoA b - I D E I A キ ッ ト （ Zyroed 社製 ） を用 いて抗体の ク ラ ス 、 タ イ プの 検索を行 っ た （ 第 2表、 第 3表 お よび第 4表 ） 。
    [0162] 第 2表 合成ペプチド C1に反応するモノクローナル抗体のクラス、 タイプ ハイプリドーマ 1B4 1C8 1C10 1H9 2G10 3C8 クラス、 タイプ IgG2b, f IgG1, / lgG2b, κ IgG1, κ IgG1, ic IgG2b, κ ハイブリド-マ 4C6 4E10 5C4 5D5 5D10
    [0163] クラス、 タイプ
    [0164] 第 3表 合成ペプチド C2に反応するモノクロ一ナル抗体のクラス、 タイプ ハイブリドーマ 1A10 2B8
    [0165] クラス、 タイプ I gG1 , f I gG1 , it 第 4表 合成ペプチド C3に反応するモノクロ一ナル抗体のクラス、 タイプ
    [0166] ハイプリドーマ 165 2A6 2C5 2D7 2611 クラス、 タイプ IgG1, λ, IgG1, λ, IgG1, / IgG2b, Λ: IgG3, c ハイプリドーマ 3A4 3H2 4H3 5F6
    [0167] クラス、 タイプ IgG1, fc, IgG2b, IgG1, κ, IgG1,
    [0168] 2 ) 特異性
    [0169] ハ イ プ リ ド ーマ の産生する モ ノ ク ロ ーナル抗体の特異 性 の確認 は ィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ング法お よ び免疫蛍光組織 染色法 に よ り 行 っ た 。
    [0170] ィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ングは合成ペプチ ド C Ί お よび C 2 に 反応す る モ ノ ク ロ 一 ナル抗体 に つ い て 行い 、 実施例 2 の抗血清の代わ り にハイ ブ リ ド ーマ の培養上清を使用 し 、 第二抗体 と し てパ ー 才キ シダー ゼ標識抗マ ウ ス I Q G抗 体 （ E Yラボラ ト リ ー社製 ） を使用 する以外 は実施例 2 と同様に行 っ た 。
    [0171] ま た 、 免疫蛍光組織染色は実施例 3の抗血清の代 り に ハ イ プ リ ド ー マ の培養上 清 を 使 用 し 、 第 二 抗体 と し て F I T C標識抗マ ウ ス I Q G抗体を使用 する以外は実施 例 3 と同様の方法 に よ っ て行 っ た 。 な お 、 耝耩染色 に供 し た試料は ゥサギの胎児期お よび成長期の大動脈の耝縝 切片であ る 。
    [0172] その結果、 抗血清の時 に得 ら れた結果 （ 実施例 2お よ び 3参照 ） と ま っ た く 周一の結果が得 ら れ、 本発明 の モ ノ ク ロ ー ナル抗体は平滑筋ミ オシ ン重鎖の単一のァ イ ソ フ ォ ームを区別 し て 認識す る も のであ る こ と が確認さ れ た 。
    [0173] 実施例 5 131 I 標識抗平滑筋ミ オシ ン重鎖 S M— Ί 特異 的モ ノ ク ロ ー ナル抗体の調製
    [0174] ハ イ ブ リ ドー マ Ί 〇 Ί 0株を 5 x 1 06 細胞ノ匹の投 与量で 、 予めプ リ ス タ ンを投与 し たマ ウ ス に投与 し 、 腹 水腫瘼 と し た 。 周マ ウ ス よ り Ί 0〜 2 0 日 後 に得 ら れた 腹水をプール し 、 こ の腹水か ら 5 0 %硫酸ア ンモニ ゥム 飽和条件下 に て 沈殿 す る 画分 を 得 た 。 こ の 沈 澱 画分 を D E A E— セル ロ ー ス D E 5 2カ ラム ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一 に よ り 精製 し て 精製 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 （ Μ Η Μ — 1 C 1 0 ) を得た 。 131 I 3 m C i に 、 こ の精製抗体 （ 8 . Ί / wi ) 2 0 0 《2 、 グ ロ ラ ミ ン T ( Ί ^ Z i ) 1 5 0 £ , 重 メ タ 硫酸ナ ト リ ウ ム ( Ί Z i ) 6 0 0 J , ヨ ウ化 力 リ ウ 厶 （ 5 0 ΛΙ3ノ ^ ) Ί 5 0 ^ お よび 0 . 5 Μ リ ン酸 緩衝液 （ ΡΗ 7 . 5 ) 1 5 0 《2 を加え 、 室温で Ί 分間反 応さ せ た 後、 予め 0 . 5 % ゥ シ血清 アルブ ミ ン含有 リ ン 酸緩衝液で平衡化 し た セ フ アデ ッ ク ス G — 5 0 ( フ マル マ シ ア社製 ） カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に付 し 、 遊離の 131 I を分離 し 、 131 I — モ ノ ク ロ ー ナル抗休 （ Μ Η Μ 一 1 C 1 0 ) を得る 。
    [0175] 実施例 6 111 l n 標識抗平滑筋ミ オシ ン重鎖 S M — 1 特 異的モ ノ ク ロ ー ナル抗休 F a b フ ラ グメ ン 卜 の 調製
    [0176] モ ノ ク ロ ー ナル抗体 （ M H M — Ί C 1 0 ) を実施倒 5 と同様の方法で精製 し 、 凍結乾燥 し た 。 こ の精製抗体 3 〇 《¾を リ ン酸緩衝液 （ PH 7 . 0 ) 2 . 5 K こ 加え 、 ぺプ シ ン （ シグマ社製 ） 0 . 3 /«3を加 え 、 3 7 °C、 2 時間反 応させる 。
    [0177] 反応液を 、 予め リ ン酸緩衝液 （ PH 7 . 4 ) で平衡化 し た プ ロ テ イ ン A — セ フ ァ ロ ー ス （ フ マ ルマ シ ア社製 ） 力 ラ ム に よ るゲル鱸過カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に付 し 、 F c フ ラグメ ン 卜 お よ び ま だ未分解の抗体を吸着さ せ る 非吸着画分を集め 、 ア ミ コ ン Β Ί 5 ( ア ミ コ ン社製 ） に て ま で 濃縮 し 、 こ れ と ク レ ジ カ レ ク
    [0178] ( rejcarek ) ら の方法 ( B i o c h e m . B i op y s . Res . Coinmun. 7 7 、 5 8 1 — 5 8 7 ( 1 9 7 7 ) ) に よ り ジ エチ レ ン 卜 リ ア ミ ンペ ン タ 齚酸 （ D T P A ) の混合 カ ル ポ キ シ炭酸無水物 と を徐々 に 混合 し 、 4 °Cに て一晚反応 させる 。
    [0179] 次に反応液を 0 . Ί M酢酸緩衝液 （ PH5 .. 0 ) に対 し て透析 し 、 さ ら に セ フ ア デ ッ ク ス G— 2 5 に て F a b — D T P A分画を集め 、 0. 1 Mグ リ シン塩酸緩衝液 （ PH 3 . 5 ) に対 し て透析する 。 か く し て得 ら れる M H M— 1 C 1 0 F a b— D T P Aを周緩衝液中で塩化イ ンジ ゥム π と混合 し 、 3 0分反応させる 。 この結果、
    [0180] M H M - 1 〇 1 0 F a b — D T P A— 111 I π が得 ら れる 。
    [0181] 産業上の利用 可能性
    [0182] 本発明 の抗体は 、 平滑筋ミ オシ ン重鎖の単一の ァイ ソ フ ォ ー ム を 区別 し て 認識する た め 、 た と え ば個体発生 に お ける平滑筋ミ 才シ ン重鎖ァ イ ソ フ ォ ー ムの発現調節機 構を解明 する た め の生化学試薬 ま た は診断用試 ¾ 、 具体 的に は耝耩染色用試薬な ど と し て有用である 。 特に 、 ヒ 卜 の平滑筋 ミ 才 シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー 厶を認識する抗 体ま た はそ の活性フ ラ グメ ン 卜 は 、 ヒ 卜 の各種疾病に お け る平滑筋 S 才 シ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー 厶 を組織学的 に 調 べる こ と がでぎ 、 疾病の発生原因 、 発症後の進行状況 を診浙す る の に有用 で あ る 。
    [0183] ま た 、 こ れ ら抗体ま た はそ の活性フ ラ グメ ン 卜 を放射 性 J5]位兀素な どで ラベル化 し た も の は 、 休内診断薬 と し て有用で あ り 、 更に ィ ム ノ ア ッ セ ィ 用 の試薬 と し て も有 用 で あ る 。
    权利要求:
    Claims

    請 求 の 範 囲
    1. 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ム を 認識する抗体ま た はそ の活性 フ ラ グメ ン 卜 。
    2. 平滑筋 ミ オシ ン重鎖の単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ムを 認識 し 、 心 sSお よび骨格筋の ミ 才シ ン重鎖 と は交差反応 性を有さ ない請求の範囲第 1 項の抗体 ま た はそ の活性 フ ラ グメ ン 卜 。
    3. 平滑筋 ミ オシ ン重鎖の各アイ ソ フ ォ ー ム に特異 的 に存在 する部分 ア ミ ノ 酸配列 を認識す る請求の範囲第 1 項の抗体ま たそ の活性フ ラ グメ ン 卜 。
    4. 平滑筋 ミ オ シ ン重鎖の ァ イ ソ フ ォ ー ム S M - Ί S - 2 ま た は S M— 3 を認識する請求の範囲第 1 項の 抗体ま た はその活性 フ ラ グメ ン 卜 0
    5. 平滑筋ミ 才シ ン重鎖の ァ イ ソ フ ォ ー ムの C端末 部分の ァ ミ ノ 酸配列 を認識す る請求の範囲第 1 項の抗体 ま た はその活性フ ラ グメ ン ト 。
    6. ヒ 卜 の 平 滑 筋 ミ 才 シ ン 重 鎖 の 単 - - の ア イ ソ フ ォ ー ムを認識する請求の範囲第 Ί 項の抗体ま た はその 活性 フ ラ グメ ン 卜 。
    下記のいずれかの ア ミ ノ 酸配列 の全部ある い は そ の連 i し た 3 個以上の ァ ミ ノ 酸残基を含むオ リ ゴぺプ チ ドを認識する請求の範囲第 Ί 項の抗体ま た はそ の活性 フ ラグメ ン 卜
    H N - R R G N E T S F V P T R R S G G R R V I E N A D G S E E E V D A R D A D F N
    G T K S S E - C O O H ；
    H 2 N - R G P P P Q E T S Q - C O O H ；
    H 2 N - N R L R R G G P I S F S S S R S G
    R P Q L H I E G A S L E L S D D D T E S K T S D V N E T Q P P Q S E - C O O H 。
    8. 標識剤でラ ベル化さ れた請求の範囲第 Ί 項の抗 体 ま た はその フ ラ グメ ン ト 。
    9. 抗体がモ ノ ク ロ ー ナル抗体である請求の範囲第 1 項〜第 8項の いず れかの抗体 ま た はその活性フ ラ グメ ン 卜 。
    10. 平滑筋ミ オシ ン重鎖の各ァ イ ソ フ ォ ー ム に特異 的に存在 す る部分 ア ミ ノ 酸配列を含む才 リ ゴペプチ ド ま た はその複合体を動物 に免疫 しその抗血清を得る こ とを 含む請求の範囲第 1 項の抗体 ま た はそ の活性 フ ラ グメ ン 卜 の製造法 。
    11. 平滑筋 ミ オシ ン重鎖の ア イ ソ フ ォ ー ム S M— Ί , S - 2 あ る い は S M— 3 の C端末部分の ア ミ ノ 酸配列 を含む才 リ ゴペプチ ド ま た はそ の複合体を用 いる請求の 範囲第 8項の製造法 。
    12. 平滑筋ミ オシ ン重鎖の各ァ イ ソ フ ォ ー ム に特異 的 に存在 す る部分 ア ミ ノ 酸配列 を含む 才 リ ゴペプチ ド ま た はそ の複合体を動物 に免疫 して その抗体産生細胞を得 ； 該抗体産生細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞 と を融合 さ せ て平滑 筋ミ オシ ン重鎖の単一 の ァ イ ソ フ ォ ー ムを認識するモ ノ ク ロ ー ナル抗体を産生す るハ イ ブ リ ド ーマ を得 ； 次いで こ のハイ プ リ ド ーマ を培養する こ と に よ り該モ ノ ク ロ ー ナル抗体を取得する 、
    こ と を含む、 請求の範囲第 1 項記載の抗体ま た はその 活性フ ラグメ ン 卜 の製造法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0465652A1|1992-01-15|
    DE69019968D1|1995-07-13|
    CA2050941C|1999-02-23|
    DE69019968T2|1995-10-12|
    EP0465652A4|1992-03-25|
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
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    1991-09-26| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1990904942 Country of ref document: EP |
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    1995-06-07| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1990904942 Country of ref document: EP |
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    优先权:
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