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    公开号:WO1990007581A1
    申请号:PCT/JP1989/001330
    申请日:1989-12-28
    公开日:1990-07-12
    发明作者:Ryohei Ogawa；Noboru Yanagida；Sakiko Saeki；Setsuko Ohkawa
    申请人:Nippon Zeon Co., Ltd.；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 プ ロ モ ー タ ー 、 そ れを含むプラ ス ド及び 組み換え ア ビ ボ ッ ク ス ウ ィ ルス 技術分野
    [0002] 本発明 は 、 外来遣伝子 と 機能的 に 結合 する こ と に よ り ボ ッ ク ス ウ ィ ルスゲ ノ ム 中で外来遺伝子を効率的 に 発現 さ せ る こ と を可能 と す る D N A配列 、 そ の D N A配列 の 選択方法 、 ま た そ の D N A 配列 と外来遗伝子が機能的に 結合 し た キ メ ラ遺伝子 、 そ のキメ ラ遺伝子を含 むプラ ス ミ ド 、 及びそ の よ う なキ メ ラ 遺伝子を含む感染性組み換 え ボ ッ ク ス ウ ィ ルス に 関す る 。 背景技術
    [0003] フ ァ ウルボ ッ ク ス ウ ィ ルス （ 以下 、 F P V と い う ） は 近年 、 分子生物学的に 解析さ れつ つ あ る （ フ ィ オ ナ · 卜 ム レ イ ら Fiona Tom I ey et . al,ジ ャ ー ナル ♦ 才ブ ♦ ジ ェ ネ ラル 、 ヴ ア イ ロ ロ ジ ィ J. gen. vi rol .， 6 9 , 1 0 2 5 - 1 0 4 0 ( 1 9 8 8 ) 、 ア ー ル · ド ゥ リ レ ンや R. Dr i I I en et . al,ヴ ア イ ジ ィ Virology"l_§ 0 , 2 0 3 - 2 0 9 ( 1 9 8 7 ) 、 マ シ ュ ウ * ェ ム * ビ ン ズ ら Matthew H. B inns et. a I ,ジ ャ ー ナル ♦ ォ ブ · ヴ ァ イ ロ ロ ジ ィ J . gen. v i ro I . , 6_9 , 1 2 7 5 - 1 2 8 3 ( 1 9 8 8 ) ) が 、 ^体的な遺伝 子 に つ い て は 、 2 、 3 の遗伝子が同定さ れた （ デ ビ ッ ド · ピ ー · ポ イ ラ ら David B. Boy 1 et. a I , ヴ ア イ ロ ロ ジ ィ Virology, 1 5 6 , 3 5 5 - 3 6 5 ( 1 9 8 7 ) 、 デ ビ ッ ド · ビ ー ♦ ポ イ ラ ら Dav i d B. Boy i et. a I , ジ ャ ー ナル · 才ブ ♦ ジ ェ ネラル ♦ ヴ ア イ ロ ロ ジ ィ J. gen. virol. , 6 7 , 1 5 9 1 - 1 6 0 0 ( 1 9 8 8 ) 、 マ シ ュ ウ * ェム ♦ ビ ンズら Hattew H. Binns et. a I , ヌ ク レ イ ッ ク ♦ ァ シ ド ， リ サー チ Nucieic Acid Research, 1 5 , 6 5 6 3 - 6 5 7 3 ( 1 9 8 7 ) ) に すざない 。
    [0004] 先頃 、 組み換え F P Vにつ いて も 、 初 めて報告さ れた ( デ ビ ッ ド ♦ ビー ♦ ポ ィ ル ら Dav i d B . Boy I et. a I , ヴ ア イ ラ ス ♦ リ サー チ V i rus Research, Ί_0 , 3 4 3 - 3 5 6 ( 1 9 8 8 ) ) が、 外来遺伝子を発現さ せる fcめの 転写調節配列 と して は 、 ワ ク チニァ ウ ィ ルスの 7 . 5 K プ ロ モー タ ー 、 及び P L 1 1 プ ロ モー タ ー を使用 し て い る 。
    [0005] 組み換え F P V は 、 組 み換えワ ク チニァ ウ ィ ルス と周 様、 多価生ワ ク チン と し て の効粜が期待さ れて い る 。 し か し 、 三侧以上の生 ワ ク チン と し て 用 い る た め に は 、 2 種以上の外来遺伝子を F P Vゲ ノ ム中で P 時に発現さ せ る こ とが必要であ る 。 複数の外来遗伝子 を同 時 に発現さ せ るため に は 、 基本的に は三つ の方法が考え ら れる 。 第 一の方法は 、 各外来逭伝子を一種類のプ ロ モ ー タ ー活性 を有す る配列の 支配下に そ れぞれ結合 し て 、 そ れぞれ別 の組み換え部位 に挿入す る方 法で 、 こ の場合 、 複数の組 み換え部位が必要で あ る 。 第二 の方法 は 、 一 つ の組み換 え部位 に多数の外来遗伝子を挿入 す る方法で 、 こ の場合 外来遺伝子の数や 長さ 、 連結の仕方な ど に よ っ て は一 つ のプ ロ モ ー タ 一活 ¾ を有 す る配列 が複数の外来遺伝子を 発現 さ せ る こ と も 可能で あ る が 、 発現効率の点で 、 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る配列 を外来遺伝子 と一対一 に対応 さ せ る こ と が好 ま し い 。 最も好 ま し い第 ΖΞ の方法 は 、 複 数 の組み換え部位 に複数 の外来遺伝子をそ れぞれ異 な つ た プ ロ モ ー タ ー 活性 を有 す る塩基配列 の支配 F に連結 し て ii 入す る方法で あ る 。
    [0006] 0 0 b p程度の相同 Bii列で 、 自 然 に D N A の組み換え が起 こ る た め 、 挿入 し た 配列 のゲ ノ ム上での位 置 が 、 そ の配列 中 の Ί 0 0 b p程度の配列 と相 id]性の高い 配列 の近 く に あ る ほ ど 、 そ の配列 と 連結 し て 揷入 し た 外来遗伝子 の脱落 が起 こ り や す い 。 即 ち 、 一種類の プ ロ モ ー タ ー 活 性を 有す る配列を複数用 い た 場合 、 プ ロ モ ー タ ー 活性 を 有す る配列 ΓΗ] t が近接 し て い る と 脱落が起 こ り や す く な る 。 特 に Ί つ の部位 に 複数 の外来遺伝子 を同一 のプ ロ モ 一タ ー 活性を ^す る 配 列 と 共 に 挿入 す る場合 、 そ の傾 向 が強い が 、 多 く の組 み換え部位 に 分散 し て 外来遴伝子 を 挿入 し た 場合 に も そ の 傾向'が認め ら れる 。 そ の た め 、 多 く の外来遗伝子を挿入 T る こ と は 困難で あ っ た 。
    [0007] 卜 ム レ イ （ T o m I e y ) ら は遠近 、 F P V の約 Ί Ί . 2 k b p の B a m H ] 断片の配 列 を 決定 し 、 約 2 0 の オ ー ブ ン リ ー ンデ イ ング フ レ ー ム を同定 し た が 、 そ の 上流配列 のい く つ か に 、 ワ ク ニァ ウ ィ ルスのプ ロ モー タ ー中 に み ら れる コ ン セ ンサス配列 、 あるい は、 それに類似 し た配 列 が認め ら れ、 その配列がプ ロ モー タ ーで ある こ と を示 唆 し て いる （ フ ィ オナ ♦ 卜 ム レイ ら Fiona Ϊ o m I e y et . a I、 ジ ャ ー ナル · 才ブ · ジ ェ ネラル · ノ イ ロ ロ ジ ィ J . gen. viroに 、 0 2 5 - 1 0 4 0 ( 1 9 8 8 ) ) 。
    [0008] しか し 、 こ れ ら の配列 がプ ロ モー タ ー活性を有 し て い るか ど う か は不明で あ り 、 プ ロ モー タ ー 活性が あ る と し て も こ れ ら の配列が組み換え ウ ィ ルス中で外来遺伝子を 十分 に発現す る こ と が 可 能であ るかど う かも不明で あ つ
    [0009] 発明の開示
    [0010] 本発明者 ら は 、 かかる従来技術の下で 、 F P Vゲ ノ ム 中で組み込ん だ外来遺伝子を効率的 に発現す る こ と ので きるプ ロ モー タ ー の開発を 目 指 し て鋭意検討を進めた結 果、 F P V類縁ウ ィ ルス由 来の配列か ら プ ロ モ ー タ ー活 性を有する も の を選択 し 、 こ の配列 を外来遺伝子 と機能 的 に結合す る こ と に よ り 、 個々 にあ るい は組み合わせて 複数の外来遺伝子を組み込ま れた F P Vゲノ ム中で安定 に発現す る こ と を見い出 し 、 本発明 を完成する に 至 っ た 図面の簡単な説明
    [0011] 第 1 図 、 第 2図 、 第 3図 、 第 4 図 は本発明 のプ ロ モ ー タ ー活性を有す る 断片 Ί 4 一 6、 4 9 2 2 4 1 - °- 3 7 — Ί の塩基配列を 、 第 5 図 は Ρ Ν Ζ 1 3 Ί Β由 来約 3 . 1 kbp 断片の B a m Η I 切断部位か ら 約 1 0 0 bpの 塩基配 列 を 、 第 6図 はニ ュ ー カ ッ スル病 ウ ィ ルスの へマ グルチニ ン 、 ノ ィ ラ ミ ニダ ー ゼ遺伝子の塩基配列 を示す 第 7 図 は Ρ Ν Ζ Ί 3 Ί 、 第 8 図 は P N Z 1 1 2 7 Rの制 限酵素地図 を示す 。 第 9図 は Ρ Ν Ζ 7 6 、 第 Ί 0図 は Ρ Ν Ζ 1 2 7 R 、 第 Ί 1 図 は m p 1 0 — H N 1 8 0 、 第 Ί 2 図 は O N Z 1 3 6 S 、 第 1 3 図 は
    [0012] P N Z 1 3 6 S L 、 第 1 4 図 は P N Z 2 4 3 7 R 、 第 1 5 図 は P N Z 2 1 2 7 R Lの構築手順を示す 。 第 Ί 6図 は 合 成 I〕 N Aの配列 を 示 す 。 第 1 7 図 は P N Z 2 5 3 7 L 、 第 1 8 図 は P N Z 2 5 3 7 1 7 L 1 5 、 第 1 9 図 は P N Z 2 6 3 7 の構 築手顒を示す 。 発明 を実施 す る た め の最良の形態
    [0013] 本発明 に よ り 、 ア ビ ボ ッ ク ス ウ ィ ルスゲ ノ ム中で外来 遺伝子 を そ の支配下で発現で き る D N A Sd列 が提供さ れ る 。
    [0014] 本発明 のプ ロ モ ー タ ー 活 性を 有 す る塩基配列 を得る に は 、 プ ロ モ ー タ ー の支配下 に な いマ ー カ 一遺伝子 を含む プ ラ ス ミ ド に お いて 、 該マ ー カ ー 遗伝子 の上流 に 、 シ ョ ッ 卜 ガ ン ク ロ 一 ニ ン グ に よ り D N A断片 を 揷入 し 、 ア ビ ボ ッ ク ス ウ ィ ルス （ 以下 、 A P V と 称 す ） 感染細 胞中で マ ー カ ー遺伝子 が発現す る よ う に な っ た も の を選択 し 、 挿入 さ れた 断片 の配列 を解析 す れば よ い 。 本発明おいてマ ー カ ー遺伝子 と し て 用 い る こ と ができ る遺伝子は 、 発現を確認できるものであ れば特に制 限さ れない が 、 発現の確認が容易 なも の が好 ま し い 。 そ の よ う なマ ー カ ー遺伝子の具体例 と して は I a c Z が遺伝子 が あ る 。 I a c Z遺伝子が発現す る と 、 IS — ガラ ク シダ —ゼ に よ り 、 ク ロ 口 フ エ ノ ー ル レ ツ ド 一 i3 — D — ガ ラ ク 卜 ビラ ノ シ ド （ 以下、 G P R G と い う ） が分解さ れ、 赤 く 発色 し 、 容易 に検出でき る 。 13 — ガラ ク 卜 シダーゼ活 性を実質的に示さ ない A P V 感染細胞にプ ロ モ ー タ ー が 存在 し ない部位の下流 に I a c Z 遺伝子を組み込ん だプ ラ ス ミ ド を移入 して も発色は認め ら れない 。 そ のプラ ス ミ ド の I a c Z遺伝子の上流 に D N A 断片を挿入 し 、 周 じ細胞 に移入 し て赤 く 発色すれば、 そ の揮入さ れた D N A 断片はプ ロ モー タ ー 活性を有す る こ とが明 らか と な り 、 その塩基配列を分析す る こ と に よ り 、 本発明のプ 口 モー タ ー活性有する塩基配列が得 ら れる 。
    [0015] 本発明 に お いて プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る塩基配列 の 由 来 はいかなるも のでも よ い が 、 ポ ッ ク ス ウ ィ ルスが好 ま し く 、 中でも ア ビ ボ ッ ク ス ウ ィ ルス （ 以下、 A P V と 称す ） 、 特 に F P V ま た は F P V 類緣の鶏痘用 生 ワ ク チ ン と し て用 い ら れる ウ ィ ルス が好 ま し い 。 F P V類縁の 鶴痘）！ 生 ワ ク チン と し て II い ら れる ウ ィ ルス と し て は 、 鶏胎化鳩痘毒中野株 （ 曰 本 フ ァ ーマ シ ー 製、 以下、 N P 株 と称す ） な ど が例示さ れる 。
    [0016] ま た 、 最終的 に プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る塩基配列 を 組 み込ん だ組み換 え A P Vを調製 す る場合 は 、 A P Vの 増殖 に 非必須なゲ ノ ム領域を組み込ん だプ ラ ス ミ ド の非 必須 A P V D N A部分 に マ ー カ ー遺伝子を組 み込み 、 そ の上流 に プ ロ モ ー タ ー 活性 を有す る塩基配列 の候補 を 挿 入 す る こ と が推奨さ れる 。
    [0017] プ ロ モ ー タ ー 活性を有 す る塩基配列 の下流 に 外来遺伝 子を連結 し た 本発明の キ メ ラ遗伝子 は 、 ゲ ノ ム 中 に 組 み 込むか 、 ま た はプラ ス ミ ド と し て A P V に感染 し た.細胞 に 導入 す る と 、 外来遺伝子を発現さ せ る こ と がで き る 。 外来遺伝子 は 、 特 に 限定 さ れない が 、 本発明 の特徴を活 か し た も の と し て は 、 病原ウ ィ ルス の抗原 タ ンパ ク 質を コ ー ド す る遺伝子等が挙げ ら れ。 ニ ュ ー カ ッ スル病 ウ イ ルス の抗原 タ ンパ ク 質 、 そ の 中で も へマ グルチニ ン · ノ イ ラ ミ ニダー ゼ がそ の代表例 と し て 挙 げ ら れる 。
    [0018] ニ ュ ー カ ッ スル病 ウ ィ ルス （ 以下 、 N D V と い う ） 由 来の へマ グルチニ ン ♦ ノ イ ラ ミ ニダ ー ゼ （ 以下 、 H N と い う 〉 を コ ー ド す る c N D A は 、 例 え ば N D V の D — 2 6株や 、 Beaudeue C株 を用 い て 調製 す る こ と が で き る 例 え ば 、 D — 2 6株か ら 調製さ れる c D N A は二種類 あ り 、 一つ は第 5 図 に 示 す 塩基配列 中 の第 1 2 番 目 か ら 第 Ί 8 5 7番 目 ま で の Ί 7 4 6塩基対 で 構成さ れ 、 他方 は第 1 1 2 番 目 か ら 第 Ί 9 5 9 番 目 ま で の 1 8 4 8 塩 基 対で 構成さ れて い る 。 両者 の相遠 は第 5 図 中 の 第 Ί 7 4 7 番 目 の塩基 （ 第 6図 中 * を付 し た 塩基 ） に あ り 、 後者 は 図示 し た と お り Cで あ る の に 対 し 、 前者 は T に 置換さ れ、 その結果翻訳停止コ ド ン （ T A A ) を形成 し て いる 後述する実施例 に おいて 用 いて いる G D N Aは前者の短 い方の も のであ る 。
    [0019] ま た B&audette C株か ら調製さ れた c D N A は 1 7 3 1 塩基対か ら構成さ れて お り （ ェヌ . ミ ラ ー N.
    [0020] Mi l ler 、 ジャ ー ナル · 才プ * ジ ェ ネラル * ヴ ア イ ロ ロ ジ ィ J. gen. Virol.6 7 , 1 9 1 7 - 1 9 2 7 ( 1 9 8 6 ) ) 、 D — 2 6株よ り調製さ れた C D N A と 比較する と 、 1 7 0ケ所 にも及ぶ塩基が置換さ れた構造を有 し て い る 。 こ の様に N D V由 来の H N遺伝子を コ ー ドする G D N Aの配列 は必ず し も一様ではないが 、 本発明 にお い て は上記三種類の G D N Aと実質的 に 同一 の機能を有 す る 範 囲 に お い て 、 塩基配 列 が 置換 、 挿 入 、 欠 失 し た G D N Aであ れば支障な く 使用 できる 。 も ち ろ ん 、 実質 的 に同一 の機能を有するかぎ り 、 ア ミ ノ 酸配列が異なる 程度に修飾さ れたも ので あ っ て も よ い 。
    [0021] プ ロ モ ー タ ー活性 を有す る塩基配列 とその支配下 に外 来還伝子を連結 し fcキ メ ラ遺伝子を含 む本発明 のプラ ス ミ ド は 、 A P Vで感染さ れた細胞中 に 移入すれば、 外来 遺伝子を発現す る こ と がで き る 。
    [0022] ま た 、 こ のプラ スミ ド にお いて キ メ ラ遺伝子が 、 A P Vの 増殖 に 非必須なゲ ノ ム領域 Iお 来の塩基配列中 に 挿入さ れて いる場合 、 A P V に感染 し た動物培養細胞中 に こ のプラ ス ミ ド を導入す る と 、 ウ ィ ル スゲ ノ ム D N A とプラ ス ミ ド中 の A P V由 来 D N Aの 問 に相同組 み換 え が起 こ り 、 組み換え A P Vが構築さ れる 。 増殖 に 非必須 なゲ ノ ム領域の具体例 と し て は 、 例 え ば第 7 図中 に示す ご と き制 限酵素地図 を示す N P株 D N Aの E c o R I 断 片 （ 約 7 . 3 kbp ) な ど と相同耝 み換えを起 こ す領域が ¾ 例 示 さ れ る 。 ま た 、 こ こ で 用 い ら れ る 動 物 培 養 細 胞 は A P Vが感染 、 増殖可能な も ので あれば よ く 、 そ の具体 例 と し て 、 例 え ぱ鶏胚繊維芽細胞な ど の鶏由 来培養細胞、 発育鶏卵漿尿膜な ど が挙げ られる 。
    [0023] 組み換 え A P V の構築 に 当 た っ て は常法 に 従え ば よ く 、 例えば 、 D N A ク ロ ー ニ ング 、 第 2巻 、 実際的 ア ブ ロ ー チ （ D N A cloning , Vol. H , a ractical approach , PP. 1 9 Ί - 2 1 1 D. H. グ ロ バ ー D. H. Glover編 、 I R Lプ レ ス.、 オ ッ ク ス フ ォ ー ド 、 ワ シ ン ト ン ） の 記述 に 準 じ て A P Vで感染さ せ た 宿主細胞 に リ ン酸 力 ルシ ュ ゥ ム共沈法 、 ま た は エ レ ク ト 口 ポ レ ー シ ヨ ン 法 に よ り 耝 み換え ベ ク タ ー を移入 さ せ 、 得 ら れる組 み換え ウ ィ ルス を 含む ウ ィ ルス集団 を イ ー グル M E M培地で培養 し た宿 主細胞 に 感染 さ せ 、 出現 し て く るプラ ー ク を組 み換 え ゥ ィ ルス候補株 と す れば よ い 。 例 え ば 、 こ れ ら候補株の 内 か ら N D Vの H N を コ ー ド す る D N A断 片が組み込 ま れ た ウ ィ ルス を選択 す る方法 に つ い て は 、 該 D N Aをプ ロ ー ブ と す る ハ イ ブ リ ダイ ゼ ー シ ヨ ン法で候補株を 選択 、 .純化 し た 後 、. N D V抗体を用 い る ィ ム ノ ア ッ セ ィ に よ り 確認す れば良 い 。
    [0024] 外来 伝子の 発現量を 高 め る た め 、 転写終 結 因子を外 来遺伝子の下流 に導入 し て も よ い 。 導入す る転写終結因 子、 導入方法 は 、 宿主に対 して用 いる こ とのできる因子 方法であ る 限 り 、 限定さ れない 。
    [0025] プ ロ モ ー タ ー活性を有す る塩基配列 を選択 し た ウ ィ ル ス と同 じ ま た は類縁の ウ ィ ルス を組み換え に用 いた場合 組み換え部位に近接してプ ロ モー タ ー活性を有す る塩基 配列 と相周性の高い部位が存在 し 、 脱落の原因 と な り 、 安定な組み換え A P V を -調製できない こ と がある 。 その た め に 、 組み込んだ外来遺伝子の発現！ [が低下 して 問题 と なる場合 は 、 他の組み換え部位の利用 、 他のプ ロ モー タ ー活性を有す る塩基配列の利用 、 あ るいはプ ロ モー タ 一活性を有する塩基配列 と発現さ せた い外来還伝子を組 み換え部位に近接するプ ロ モー タ — 活性を有する塩基配 列 と相周性 の高い部位 と逆の方向へ の組み込みな どの方 法に よ り 解決さ れる こ と も あ る 。 ま た 、 プ ロ モー タ 一 活 性を有す る塩基配列か らプ ロ モ ー タ ー活性への影響の小 さ い部分 を 除 く 等、 必要な強さ のプ ロ モ ー タ ー 活性を有 する 範酣で短く する こ と に よ り 、 相同組み換えが起こ ら ない長さ に でき る場合もあ る 。
    [0026] 短く す る た め に除かれるプ ロ モー タ ー 活性へ の影響の 小さ い部分 と し て は 、 その配列 のプ ロ モー タ ー 活性に 支 配さ れた オ ープン リ ーデ ィ ング フ レ ー ムな ど がある 。 し か し 、 現在の遺伝子暗号解読の技術で はプ ロ モー タ ー 活 性に必要部分で あ るか ど う か は判断できない場合が多 く 最終的に は一つ 一 つ の塩基を除い て 、 必要な強さ のプ ロ モ ー タ ー 活性を有す るか ど う かを確認 し な が ら 短 く し て い く 必要が あ る 。 な お 、 こ こ で い う 必要な強 さ のプ ロ モ 一タ ー 活性 と は 、 外来遺伝子を発現 さ せ よ う と す る細胞 で必要 と す る発現璗が認め ら れる だけ のプ ロ モ ー タ ー 活 性を い う 。
    [0027] プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る塩基配列の中 に 、 上記の よ う なプ ロ モ ー タ ー 活性を有す る た め に少な く と も必要な 部分の ほ か 、 取 り 除 く と プ ロ モ ー タ ー 活性が高 く な る部 分 、 取 り 除い て もプ ロ モ ー タ ー 活性が低下 し な い部分 が 含 ま れて い る場合が ある 。 相同組み換 え に よ る脱落や外 来遺伝子の発現璗な ど を確認 し な が ら 、 こ れ ら の付加 的 部分を 除き 、 又 は必要 に 応 じ て 加 え る こ と に よ り 、 目 的 に 応 じ て 、 最も好 ま し いプ ロ モ ー タ ー 活性を有す る 塩基 配列 を得 る こ と ができ る 。
    [0028] か く し て 本発明 に よ れば 、 組み換え ウ ィ ルス 中で 、 ポ リ ペプチ ド を発現 さ せ る こ と がで き る新規な ア ビ ポ ッ ク ス ウ ィ ルスプ ロ モ ー タ ー が複数提供さ れ 、 よ り 多種の外 来遺伝子を安定 に発現さ せ る こ とのでき る三 価以上の多 価 ワ ク チ ン と し て の感染性組み換え ボ ッ ク ス ウ ィ ルス の 構築 が可 能 と な る 。
    [0029] ( 実施例 ）
    [0030] 以下 に 実施例 を挙げて 本発 明 を さ ら に 具体 的 に 説 明 す る 。
    [0031] 実施例 1 プ ロ モ ー タ ー活性を有す る N P株 D N A断片の同定 (1) N P株ゲ ノ ムか ら の D N A調製
    [0032] 約 3 . 0 X 1 07 プラ ー ク フ ォ ー ミ ングユニ ッ ト （ P F U ) の N P株を 1 5 0 cm2 の培養甩 フ ラ スコで培養 し た約 3 . 0 x 1 07 個の鶏胚鐵雜芽細胞に感染 し 、 3 7 V、 5 % C 0 イ ンキ ュベ ー タ ーで 7 2時間培養後、 3 回凍結融解を お こ ない ス ト ッ ク 液 と し た 。 こ の ス ト ッ ク 液を 3 0 0 0 r pm で 1 0分藺遠心し 、 細胞片を除い た 。 こ の上清液をさ ら に 、 2 5 0 0 0 rpm ので 6 0分間遠心 し 、 沈穀 し た ウ ィ ルスパ ー テ ィ ク ルを得た 。 こ の ウ ィ ル スパ一テ ィ ク ルを D N a s e ( 宝酒造株式会社製 ） 1 5 3 を含ん だ緩衝液 （ 5 0 mH T r i s — H C ·δ , 1 mH M g C J2 , pll7 . 5 ) 8 0 0 5 に懸濁 し 3 7 °Gで Ί 時 P イ ンキ ュ ベ ー ト し 、 こ れに 2 5 0 mHの E D T A溶液を Ί 0 0 _g 加 え室温で 3 0分放置 し た後、 Ί 0 % S D S 溶液 Ί 0 0 ^ と 0 . 1 %プ ロ テ ィ ナ 一ゼ K ( ベ ー リ ン ガ ーマ ンハ イ ム製 ） 溶液 5 0 ^ を加 え 、 5 0 Cで 1 時 間反応さ せ た 。 次いで 、 フ τ· ノ ー ル と ク ロ 口 ホルムの等 量混合液に 、 T E ( 1 mH E D T A、 1 0 mH T r i s 一 H C J8 水溶液、 l)H 8 . 0 ) を 、 水層 と有機溶媒層が分 離す る ま で加え 、 その有機溶媒層 1 を上 記反応混液 に 加 え 、 静 か に 懸濁 し 、 Ί 0分間放置 し た後 、 3 5 0 0 rpm Ί 0分悶遠心 し 、 2層 に分 かれた内の上層 に な る水 層 を取 り 、 タ ンパ ク を除い た 。 さ ら に 、 エ タ ノ ー ル 2 ^ を加 えて エ タ ノ ー ル沈澱を行い 、 沈澱 した D N Aを 7 0 % エ タ ノ ー ルで 洗淨 し 、 乾燥す る こ と に よ っ て 、 約 5 0 O n gf の N P株 D N Aを得た 。
    [0033] (2) プラ ス ミ ド P N Z 7 6の構築 （ 第 8図参照 ）
    [0034] ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス W R株の 7 . 5 Kダル 卜 ン ぺプチ ド を コ ー ド す る D N Aのプ ロ モ ー タ ー （ 以下、 7 . 5 K プ ロ モ ー タ と 称 す 〉 を 含 む S a I I 〜 R s a I 断 片約 0 , 2 6 kbp ( セル Celし 1 2 5 , 8 0 5〜 8 Ί 3 ( 1 9 8 1 ) ) を P U C 9の S a l l 〜
    [0035] S m a I 部分 に 組 み込んだプラ ス ミ ド を p U W P— Ί と 命名 し た 。
    [0036] 1 の ρ Μ Α Ο Ο Ί ( シ ラ カ ヮ Shirakawa ら ， ジ - ン Gene, 2_8 , 1 2 7 — ( Ί 9 8 4 ) ) を B a m H I で消化後 、 ー ガ ラ ク 卜 シ ダ ーゼ遺伝子 （ 約 3 . 3 kbp ) を回収 し た 。 一方 、 0 . 3 3 の P U C 1 9 を
    [0037] B a m H I で 消化後 、 フ ： n ノ ー ル · ク ロ ロ ホルム （ Ί ： 1 ) 油 出 し 、 エ タ ノ ー ル沈澱 に よ り 回収 し 、 調製 し た /3 一 ガ ラ ク 卜 シ ダ ー ゼ遛伝子 と ラ イ ゲ ー シ ヨ ン し 、 ハ イ ブ リ ツ ド プ ラ ス ミ ド P N Z 6 6を 構築 し た 。
    [0038] 一 方 、 の P U W P — Ί を 、 H p a n と
    [0039] E c 0 R I で 消化 し 、 Ί 5 %低融点 ァ ガ ロ ー ス電気泳動 ( 7 0 V、 6時 間 ） に よ り 7 . 5 Kプ ロ モ ー タ ー を含 む 約 0. 2 6 kbp の 断片 を分離 し 、 D N Aポ リ メ レ ー ス に よ り 平滑末端 と し た 。 0. 3 / 3 の P N Z 6 6を
    [0040] H i n c ]1で 消化 し 、 フ エ ノ ー ル ♦ ク □ 口 ホル ム （ 1 ： ) 抽 出 し 、 上記約 0. 2 6 k b【） の 7 . 5 Kプ ロ モ ー タ 一遺伝子をラ イ ゲ ー シ ヨ ン し 、 得 ら れた八 イ ブ リ ツ ドプ ラ ス ミ ドを P N Z 7 6 と命名 し た 。
    [0041] P N Z 7 6はワ ク チニ ァ ウ ィ ルスの 7 , 5 Kプ ロ モー タ ー と ί a c Z遺伝子の結合 し た D N A靳片を含むプラ ス ミ ドであ る 。
    [0042] (3) プ ロ モー タ ープ ロ ーブベ ク タ ー P N Z 1 1 2 7 R の構築 （ 第 1 0図参照 ）
    [0043] (1) で調製 し た N P株 D N A I j^ gを E c o R Iで消 化 し た 。 こ れを E c o R Iで消化 し た 5 0 0 n gの P U C 1 8 (フ ア ルマ シ ア製 ） と混合 し 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼで連結 し 、 多 く の ク ロ ー ンを得た 。
    [0044] この う ち 、 第 7図 に示す約 7 . 3 kbp の N P株 D N A 断片を連結 し た ク ロ ー ンを Ρ Ν Ζ Ί 3 1 と命名 し た 。
    [0045] 1 の P N Z 1 3 1 を B a m H Iで消化後 、 ク レノ 一フ ラ グメ ン ト に よ り 平滑末端 と し 、 さ ら に T 4 D N A リ ガ ーゼで再び連結 し 、 B a m H I認識部位の配列を変 える こ とで B a m H I に 認識さ れない よ う に し 、
    [0046] Ρ Ν Ζ Ί 3 Ί Β と命名 し た 。
    [0047] ま た 、 P N Z 7 6を B a m H Iで部分切断 し 平滑末端 と し た後再度連結 し 、 2つ あ る B a m H I切断部位の う ち I a c Z遺伝子下流側の B a m H I切断部位の配列 が 変わ り 、 B a m H I に認識さ れな く な っ たプラ ス ミ ド を E c o R I と B a m H Iで 2重切断 し 、 こ れを 0 . 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気 ¾動 に か け て選択 し 、 p N Z 7 6 B と命名 し た 。 P N Z 7 6 Bを X b a l と S m a lで消化 後 、 I a c Z遗伝子を 含 む約 3 . 2 kbp の D N A断片を 抽 出 し 、 ク レ ノ ウ フ ラ グメ ン 卜 に よ り 、 平滑末端 と し た 。
    [0048] P N 2 1 3 1 Bを E c o R Vで消化 し た も の と 上記約 3 . 2 kbp の 断片を混合 し 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼで連結 b し 、 プラ ス ミ ド P N Z 1 1 2 7及び P N Z 1 1 2 7 R
    [0049] ( 第 8図 ） を構築 し た 。
    [0050] (4) 組み換え ウ ィ ルス の構築 （ 卜 ラ ンス フ I ク シ ヨ ン ）
    [0051] 3 7 °C、 5 % C 02 イ ン キ ュ ベ ー タ ー で 、 7 5 OT 2 培 養用 ポ 卜 ル に Ί 晩培養 し た約 Ί . 5 X Ί 07 個 の鶏胎児0 繊維芽細胞 （ 以下 、 C E F と い う ） に 、 m · 0. i · 0 . 0 5 で N P株を感染さ せ た 。 2時間後 C E F生育培地 （ 5 % 牛胎児血清 、 0. 0 3 % L — グル タ ミ ン 、 1 0 % 卜 リ ブ 卜 一ス フ ォ ス フ エ 一 卜 ブ ロ ー ス を 含む イ ー グル M E M ) Ί 5 添加 し 、 さ ら に 2時 間培整 し た 。 そ の後培地を捨b て 、 3 7 °Cに イ ン キ ュ ベ ー ト し た Ί 0 /^ダルベ ッ コ 一 P B S ( — ） （ 曰 水製薬製 ） で 2回細胞 を 洗 い 、 4 0 0 ^ ^ の 0. Ί % 卜 リ プ シ ン （ デ ィ フ コ 社製 ） を加 え て 細胞 を 回収 し た 。
    [0052] 細胞を 2 /^ダルベ ッ コ 一 P B S ( ― 〉 に 懸濁 し た 後 、0 Ί 5 0 0 rpm 5分 ！ ¾3遠心 し 、 ダルベ ッ コ 一 P B S ( — ） を 除い た 。 さ ら に 、 2 0 の Sa I i G ( 0 . 8 %
    [0053] N a C 、 0 . 0 4 % K C , 0 . 0 3 9 5 %
    [0054] N a 2 H 2 P 04 · 1 2 H 2 0 , 0 . 0 2 %
    [0055] K H 2 P 04 0 . 0 1 % M (J 2 C ^ ♦ 6 H 2 0、 0. 0 1 % C a C 2 、 0. 1 % グル コ ー ス 、 H 7 . ) に懸濁 し た後、 Ί 5 0 0 rpm 5 分間遠心 し 、 Sal i ne Gを除いた 。 その後、 沈殺 し た細胞を 7 0 0 ^ © Sal ine Gに懸濁 し こ れをエ レ ク 卜 口 ポ レ ー シ ヨ ン用 キ ュ べ ッ 卜 に移 し た 。
    [0056] また 、 P N Z 1 1 2 7 1 0 ί 3 を含む溶液を分取 し、 こ れをエタ ノ ール沈澱、 洗浄を行っ た後乾固 さ せた もの を Ί 0 0 ^ の Sa I i ne Gに溶解させた 。
    [0057] Ν Ρ株感染細胞懸濁液の入 っ た エ レ ク 卜 口 ポ レ ー シ ョ ン用 キ ュ べ ッ 卜 に 、 1 0 0 2 Ζ /πβの Ρ Ν Ζ Ί 1 2 7 の
    [0058] Sal ine G溶液 1 0 0 ^ を加えた後、 ジー ンパルサー ( パイ 才 ラ ッ ド社 ） で 、 3 kVZ cmのパルスをかけた 。 そ の後、 室温で 1 0 分間静置 し 、 細胞懸濁液を 5 の C E
    [0059] F 生育培地の入 っ た 2 5 cm 2 培養用 フ ラ ス コ に移 し 、 3 7 C、 5 % C 02 イ ンキ ュ ベ ー タ ーで 、 7 2 時間培養 し た 後 、 3 回凍結融解 し た ものを組み換え ウ ィ ルス ス 卜 ッ ク と し た 。 O N Z 1 1 2 7 R につ い て も周様の操作に よ り 、 組み換え ウ ィ ルスス ト ッ ク を得た 。
    [0060] (5) プラ ー ク ア ツ セ ィ
    [0061] 1 0 aaの培養皿で Ί 晚培養 し た 0 1 0 * 個の C E F を イ ー グル M E M培地で 2 回洗 っ た 後、 Ί 0 0 0 倍 に 希釈 した組み換え ウ ィ ルス ス ト ッ ク を 5 0 0 ^ ^ 接種 し た 。 3 7 °C、 5 % C 0 2 イ ンキ ュ ベ ー タ ーで 2 時間培 養 し た後 ウ ィ ルス液を 除き 、 フ ヱ ノ ール レ ッ ド不含 Ί % ァ ガ ー G E F 生育培地を Ί Ο βώ重履 し た 。 こ れを 3 7 °C 5 % C 02 イ ンキ ュ ベ ー タ ーで約 7 日 培養 し 、 組み換 え ウ ィ ルス ス ト ッ ク 中の ウ ィ ルス に よ るプラ ー ク の形成 を確認 し 、 フ ヱ ノ ー ル レ ッ ド ♦ F C S不含 C P R G 2 0 O ^ Sf Z 含有 1 % ァ ガ ー C E F生育培地を 1 重層 し 、 周 じ 条件で Ί 0時間培養 し た 。
    [0062] p N Z 1 1 2 7を組み込ん だ ウ ィ ルス ス ト ッ ク 由 来の プラ ー ク で は赤 く 発色す る も の が 認め ら れた が 、 P N Z 1 2 7 Rを組み込ん だ ウ ィ ルス ス ト ッ ク 由来のブラ ー ク で はそ の よ う な発色 は認め ら れな か っ た 。
    [0063] そ の結果 、 Ρ Ν Ζ Ί 1 2 7で は I a c Z遣伝子 は発現 し 、 l a c Z遺伝子の上流 に プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る 塩基配列 が存在する こ と が確認さ れた。 一方 、 P N Z 1 1 2 7 Rで は l a c Z遺伝子 は発現せず 、 l a c Z遺伝 子の上流 に はプ ロ モ ー タ ー 活性 を持 っ た 塩基配列 が存在 し ない こ と が確認さ れた 。
    [0064] (6) シ ョ ッ ト ガ ン ク ロ ー ニ ング
    [0065] (1) で得 た N P株 D N A 1 3 ず つ を S a u 3 A I ま た は E G 0 R Vで 完全 に 消化 し た 。 E c 0 R Vで 消化 し た も の に つ いて は 、 Ί 0 n 3 の B a m H I リ ン カ 一 （ 宝 酒造株式会社製 ） を T 4 D N A リ ガ ーゼ連結後 、
    [0066] B a m H I で再'消化 し 、 0 . 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳 動で 回収 し た 。 こ う し て 得 ら れた S a u 3 A I 断片 、 E c o R V断片 を 13 3 171 |"| ェ で 消化 し た 3 0 0 1! 3の D N Z 1 1 2 7 R と 混合 し 、 T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し た 。 こ の D N Aを塩化 カ ル シ ウ ム処理 に よ り コ ン ビ一 テ ン 卜 に し た （ 以下 、 コ ン ビ一テ ン 卜 な 、 と い う ） 大腸 菌 " T G 1 に 卜 ラ ンス フ ォ ー メ ー シ ョ ンを行い （ モ レキ ュ ラ ー ♦ ク ロ ー ニ ング Ho I ecu I I ar Cloning2 4 9 - 2 5 , コ ール ド ♦ スプ リ ング · ハーバ一研究所 Co I d Spring H o r b o r Laboratory ， 1 9 8 2 ) 、 ア ン ピシ リ ン 5 0
    [0067] 3 / 添加 L B寒天培地 （ 1 当 り 、 N a C 5 3 , ィ 一 ス 卜 * ェク ス 卜 ラ ク 卜 5 2 , ノ ク 卜 ♦ 卜 リ プ ト ン 1 0 g , ノ ク 卜 · ァ ガー 1 8 3 ) で培養 し 、 シ ングル ♦ セ ル ♦ コ ロ ニ ー を得た 。
    [0068] (7) プラス ミ ドブールの大量調製
    [0069] (6) で得た コ ロ ニ ーの 内 S a u 3 A I 断片由来の も の 、 Ei C o R V 断片 ώ来のも の 、 各 1 0個 を ま とめ て 、 各々 ア ン ピシ リ ン 5 0 Ζ 添加滅菌 し β液休培地 （ し Β 寒天培地か らバク 卜 * ァ ガ ー を除いた も の 〉 2 0 0 の 入 っ た 5 0 0 ^坂口 フ ラス コ に植菌 し 、 3 7 °Gで振盪 し な が ら Ί 晚培養 した 。 こ の大腸菌か ら改変さ れた ビ ルン ポ ィ ム と ド ー リ ー （ B i r n bo i m & Do I y )の方法 （ ^述モ レ キ ュ ラ ー ♦ ク π — ニ ング Ho I ecu Π ar Cloning 8 6 - 9 4 ) で プラ ス ミ ド D N Aを調製 し 、. プ ラ ス ミ ドプ ー ル と し た 。 こ の操作を繰 り 返 し 、 S a u 3 A I 断片由来のプ ラ ス ミ ドプ ールを 5 3 、 E c o R V断片由来のプラ ス ミ ドプールを 1 3 、 それぞれ調製 し た 。
    [0070] (8) プラ ス ミ ドプ ー ル D N A組み換え ウ ィ ルス の構築 とプラ ー ク ア ツ セ ィ
    [0071] P N Z Ί 1 2 7又は P N Z 1 T 2 7 Rを用 いる代わ り に （ 7 ) で得た プラ ス ミ ドプ ール D N Aそれぞれを） Ήい る 以外 は （ 4 ) 、 (5) と 同様 の操作を行 な っ た 。
    [0072] そ の結果、 l a c Z遺伝子 に よ り 3 — ガ ラ ク 卜 シダ ー ゼ を発現 し 、 C P R Gを 分解 し て赤 く 発色す る ウ ィ ルス が形成 さ れた 。 赤 く 発色 し た プラ ー ク 中 の ウ ィ ル ス を作 製す る た め に導入 さ れた プラ ス ミ ドを
    [0073] P N Z 1 1 2 7 R / 1 4 - 6. P N Z 1 1 2 7 R / 4 1 一 3 、 P N Z 1 2 7 R / 4 9 - 2 2 ,
    [0074] P N Z 1 1 2 7 R Z 3 7 — 1 等 と 命名 し た 。 こ'れ ら のプ ラ ス ミ ド の内 、 P N Z 1 1 2 7 R Z 1 4 — 6 、
    [0075] P Z 1 1 2 7 R / 4 1 - 3 , P N Z 1 1 2 7 R / 4 9 一 2 2 は （6) に お い て N P株 D N Aを S a u 3 A Iで消 化 し た 断片由 来で あ り 、 D N Z 1 1 2 7 R Z 3 7 — 1 は 同 じ く E c 0 R Vで消化 し た 断片 由 来で あ る 。
    [0076] ま た 、 こ れ ら の組 み換 え ウ ィ ルス に よ り 形成さ れるプ ラ ー ク サイ ズ及び増殖性 は親株であ る N P株 と 差が認め ら れず 、 I a c Z遺伝子 を組み込ん だ E c 0 R V部位が 感染增殖 に非必須で あ る こ と が示さ れた 。
    [0077] こ れ ら の プ ラ ス ミ ド は .、 本発明 の プ ロ モ ー タ ー 活性を 有す る塩基配列 を含 んで い る 。
    [0078] (9) 配列分析
    [0079] を B a m H I 、 E c o R I で 消 化後 、 ァ ガ ロ ー スゲル電気泳 勅で 、 約 3 . Ί k b p の 断片 を単離 し た 。 こ の 断片を B a m H I 、 E c o R I で 消化 し た P U G Ί 8 と 混合 し 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼで 連結 し た 。 こ れを コ ン ビ一テ ン 卜 な大腸菌 T G 1 株 に 卜 ラ ン ス フ ォ ー ム し 、 5 —ブ ロ モ ー 4 — ク ロ □ — 3 — イ ン ド リ ル 一 13 — D — ガラ ク 卜 ビラ ノ シ ド （ 以下、 X— g a I と称す ） 5 0 g Z 含 ¾— L 13培地プ レー 卜 に 卜 ラ ン ス フ ォ ーム し た T G Ί を ま き 、 β — ガラ ク 卜 シダーゼ を発現 し て い 5 ない コ ロ ニー を選択 し た 。 この コ ロ ニーか ら D Ν Αを 調製 し 、 ダイ デォキシ法 （ エ フ · サンガ ー ら F. Sanger et. aし プ πシーデ イ ングス ♦ 才ブ * ザ ♦ ナ シ ョ ナル ♦ ア カ デ ミ ー * 才ブ * サイ エ ン ス ♦ 才ブ ♦ ザ * U S A Proに H a 11. Acad. Sci. USA, 7 4 , 5 4 6 3 -0 5 4 6 7 ( Ί 9 8 了 ） ） で約 3 . Ί kbp の断片の
    [0080] B a m H I 側約 1 ϋ 0 bpの 塩 基 配 列 を 決 定 し た （ 第 5 図 ） 。
    [0081] こ の配列 を参考に し て 2 0塩基のプラ イ マ ー F P— Ί
    [0082] 3 '- AAGGCTGCCACACGCTCTTA - 5 '
    [0083] b を 、 ま た文献 （ シ ラ カ ヮ ら H. Si rakawa et. al ,ジ ー ン G E E , 2_8 Ί 2 7 — Ί 3 2 ( Ί 9 8 4 ) ) を参考 に し 飞 I a c Ζ側 の B a m Η I近接領域を も と に 2 0塩 基のプラ イ マ 一 L P— Ί
    [0084] 3' -CCT'fGTT6CGrATTGGGACT-5 '
    [0085] 0 を D N A合成機 G e n e t A H ( 曰 本ゼ 才 ン株式会社 - で合成 し た 。
    [0086] こ れ ら のプラ イ マ ー を使 っ て 、 Ρ Ν Ζ Ί Ί 2 7 Κ / Ί . 4 一 6 、 Ρ Ν Ζ 1 1 2 7 R / 4 9 - 2 2 , Ρ Ν Ζ 1 Ί 2 7 R / 4 1 - 3 ^ P N Z 1 1 2 7 R / 3 7 — Ί か ら 直接5 挿入断片 1 4 一 6、 4 9 — 2 2 、 4 Ί 一 3 、 3 7 — Ί の 配列 を ダ イ デ才 キ シ法で 決定 し た （ そ れぞれ第 1 図 、 第 2図 、 第 3図及び第 4図 に 示 す 〉 。
    [0087] こ れ ら の配列 は 、 本発明 のプ ロ モ ー タ ー 活性を有 す る 配列で あ る 。
    [0088] 実施例 2
    [0089] N D V由来 H N遺伝子 と N P株由来プ ロ モ ー タ ー が作 用 で きる よう に 結合 し て 組み込 ま れた組み換え N P株 の構 築
    [0090] (1 ) ノヽイ ブ リ ツ ド フ ァ 一 ジ m p Ί 0— m p aの作製 （ 第 1 Ί 図参照 ）
    [0091] 0. の Μ Ί 3 — m p l O R F D N A ( アマ シ ャ ム社製 ） を B a m H I 、 X b a I で 消化 し た 後 、 フ エ ノ ー ル ' ク ロ 口 ホルム （ 1 ： 1 〉 で抽出 し 、 エ タ ノ ー ル沈 澱 に よ り 、 開裂さ れた M 1 3 — m p l O R F D N Aを 回 収 し た 。
    [0092] 一方 、
    [0093] C GATnAAGGAGG/ AAAA TATGGTACClCGAGCTCG
    [0094] TAGATTCCTCCTTTTrTAATACCATGGAGCTCGAGCCTAG
    [0095] の塩基配列 を有 す る 4 0 b I)の オ リ ゴデ 才キシ リ ポ ヌ ク レ 才 チ ド か ら な る ア ダプ タ ー を G e n e t A ΠΙ ( 日 本ゼ 才 ン株式会社製 ） を用 い て 化学合成 し た 。 こ の ア ダプ タ ー と 、 上記 、 開裂 さ れた M 1 3 — m p 1 0 R F D N Aを 混 合 し 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼで連結 し 、 常法 （ メ ソ ッ ド ♦ イ ン ♦ ェ ン ザ ィ モ ロ ジ ィ 第 1 0 Ί 巻 Methods i n
    [0096] E nzymo I ogy VOL . 0 1 ) に 従 っ て 、 コ ン ビ一テ ン 卜 な 大腸菌 T G 1 株 に形質導入 し 、 X — g a l 0 . 0 0 3 % イ ソプ ロ ピル一 β — D — チォガラ ク 卜 ビラ ノ シ ド （ 以下 I P T G と称す ） 0 . 0 3 mH添加 の
    [0097] 2 X Y T寒天培地で 1 2 時間 3 7 °Cで培養 し た 。 形成さ れたプラ ー ク の内 、 白 いプラ ー ク か ら フ ァ ー ジ R F D N Aを回収 した 。 これを B Q I E で切断 し 、 0 . 8 %ァ ガ ロ ー ス電気泳動 に よ り 、 アダプタ ー D N A が挿入さ れた ハイ ブ リ ッ ド フ ァ ー ジを選択 し 、 これを m p 1 0 — m p a と命名 し た 。
    [0098] (2) ノヽ イ ブ リ ツ ド フ ァ ー ジ mp1 0 — H N 1 Ί 5 の作製 ( 第 Ί 1 図参照 ）
    [0099] N D V の H N 遺伝子を含むプラ ス ミ ド X L BI — Ί 0 H ( パイ ラ ス ♦ リ サー チ Vi rus Research, ェ， - 2 5 5 ( 1 9 8 7 ) ) を東京大学教養学部、 川喜田正夫 U力 教授 よ り 入手 した 。 このプラ ス ミ ドの塩基配列 を Μ Ί 3 フ ァ ー ジ を甩 い た ダイ デ才 キ シ法で分析 し 、 既知の Η Ν 遺伝子の配列 （ ジ ャ ー ナル ♦ 才ブ ♦ ジ ェ ネラ ル * バ イ 口 ロ ジ ィ J. gon. Vi rol . , 6_7 , 9 1 7 - 1- 9 2 7 ( 1 9 8 6 ) ) と の対比か ら H N M伝子の c D N A は第 6 図 に示す第 Ί Ί 2 番 目 か ら第 Ί 8 5 7 番目 ま で の 1 7 4 6 塩基対であ る こ と を解明 し た 。 こ の解明 は川喜田助教授 に よ っ て 行わ れた 。
    [0100] こ こで得 ら れた G D N A がコ ー ドする ア ミ ノ 酸 は Beaudette C株及ぴ 8 1 株 （ ィ 一 . ジ ヨ ーゲン セ ン E. Jorgensen, ノ イ ロ ロ ジ ィ Vi rology, 5 6 , 1 ？ - 2 4 ( 1 9 8 7 ) ) の H Nの ア ミ ノ 酸 と 9 0 %以上の ホ モ ロ ジ一を有す る もので あ っ た 。 プラ ス ミ ド X L DI — Ί 0 H 4 3 を A v a ilで 消化 し 、 こ れを Ί . 5 %ァ ガ ロ ー ス電気泳動 に 供 し た 。 約 Ί . 1 5 kDp の D N A断片 を ァ ガ ロ ー ス ゲル よ り 抽 出 し 、 エ タ ノ ー ル 沈 殿 に よ り H N遺伝子 D N Aの A v a il 断片を 回収 し た 。
    [0101] (1 ) で作製 し た ハ イ ブ リ ッ ド フ ァ ー ジ m p 1 0 — m p aを K P n Iで 消化 し た 後 、 フ エ ノ ー ル · ク ロ ロ ホ ル ム （ Ί ： 1 ) で油出 し 、 エ タ ノ ー ル沈殿 に よ り 開裂さ れた m p 1 0 — m p aを 回収 し た 。
    [0102] 開裂さ れ た m o 1 0— m p a O . Ί 9t 、 上記 H N遣 伝子 D N Aの A v a II断片 （ 約 1 . 1 5 kbp ) 0. 2
    [0103] を混合 し 、 D N Aポ リ メ レ ー ス で 接着末端を平滑末 端 と し 、 フ エ ノ ー ルノ ク ロ ロ ホルム （ Ί ： 1 ) で抽 出後 、 エ タ ノ ー ル 沈 澱 に よ り 回 収 し た 。 回 収 さ れ た D N A を T 4 D N A リ ガ ーゼ に よ り 連結 し 、 コ ン ビ一テ ン 卜 な大 腸菌 T G Ί 株 に 形質導入 し 、 2 X Y T寒天培地で 3 7 °C、 1 2時問生 育さ せ た 。 形成さ れた プラ ー ク か ら フ ァ ー ジ R F D N Aを 回 収 し 、 X b a l と X h o l で 切 断 し 、 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス電気泳動で H N遺伝子 D N Aの
    [0104] A V a Π 断片を含むハ イ ブ リ ッ ド フ ァ ー ジ を選択 し 、 こ れを m p 1 0 - H N 1 5 と 命名 し た 。
    [0105] (3) ゾヽ イ ブ リ.ッ ド フ ァ ー ジ m p 1 0 - H N 1 8 0の作 製 （ 第 Ί Ί 図参照 ） - プ ラ ス ミ ド X L III — 1 0 H 4 3 を A a t !I と X h ο Iで消化 し 、 （2) と周様の操作に よ り約 1 . 4 kbp の H N遺伝子 D N Aの A a t H — Χ Π ο Ι断片を回 収 した 。
    [0106] 一方 、 （2) 'で作製 し たハ イ ブ リ ッ ド フ ァ ー ジ m ρ Ί 0 — Η Ν 1 Ί 5を A a t ll と X h o lで消化 し た後、 0. 6 %ァ ガ ロ ー ス電気泳動 に供 し 、 約 7 . 7 kbp の A a t I ~ X h o I断片を回収 し た 。
    [0107] H N遺伝子 D N Aの約 7. 7 kbp の A a t Π — X h o I断片 と m p 1 0— Ή Ν 1 1 5の約 1 . 4 kbp の A a t H— X h o l断片を T 4 D N Aリ ガーゼで連結 し 、 コ ン ピー テ ン 卜 な大腸菌 T G 1 株に形質導入 し 、 2 X Y T寒 天培地で 3 7 G、 Ί 2時間生育さ せた 。 形成さ れたブラ 一 夕 か ら フ ァ ー ジ R F D N Aを回収 し 、 X h o l と B Q に IIで 切 断 し 、 0 . 8 %ァ ガ ロ ー ス電 気 ¾ 勁 で 、 H N遺伝子 D N A断片約 Ί . 8 kbp を含む八 ィ プ リ ッ ド • フ ァ ー ジ R F D N Aを選択 し 、 これを m p 1 0 — H N 8 0 と命名 し た 。
    [0108] (4) ハ イ ブ リ ッ ドプラス ミ ド Ρ Ν Ζ Ί 3 6 Sの構築 ( 第 Ί 2図参照 ）
    [0109] 2 の P U C 1 8 (フ ア ルマ シ ア社製 ） を
    [0110] E c 0 R I及び H i n d HIで消化 し た後、 フ エ ノ ー ル ♦ ク ロ 口 ホルム （ Ί ： ) で抽出 し 、 エ タ ノ ー ル沈殿 に よ り 開裂 し た 8を回収 し た 。 5 ' 末端 リ ン酸を ァ ルカ リ フ ォ ス フ ァ タ 一ゼ処理 に よ り 除去 し 、 D N Aを再 ぴフ エ ノ ール * ク ロ 口 ホル ム油 出後、 エ タ ノ ール沈澱に よ っ て 回収 し た 。 開裂 し た 0 . 2 JW 3 の P U C 1 8 と精 製 N P株 D N Aの E c o R I 消化物 Ί 3 を
    [0111] T 4 D N A リ ガ ーゼ に よ り 連結 し 、 コ ン ビ一テ ン 卜 な大 腸菌 J M 1 0 3 を形質転換 し 、 X — g a I 0 . 0 3 % I P T G O . 0 3 mH、 ア ン ピシ リ ン 4 0 ズ 3 ノ ^添加 L B寒天培地で Ί 5 時間 、 3 7 Gで培養 し た 。 寒天培地 上に生育 し た形質転換大腸菌の 内 、 白 い コ ロ ニ ー を ア ン ピシ リ ン 4 0 ^ 3 添加 L B 液体培地で 3 7 eC、 1 5 時 P 培養 し 、 ビル ン ポ ィ ム と ド ー リ ー の方法 （ ヌ ク レ イ ッ ク ♦ ァ シ ド ♦ リ サー チ Nucleic Acid Rese re h , 7.. 1 5 1 3 ( 1 9 7 9 ) ) でプラ スミ ド を 油 出 し 、 E c o R I で消化後 、 0 . 6 % ァ ガ ロ ー ス電気泳動 に よ っ て も と の N P株 D N A E c o R I 断片 （ 約 7 . 3 kbp ) を 含 む ノヽ イ ブ リ ツ ドプラ ス ミ ド を検出 し 、 こ れを 0 N Z Ί 3 6 と命名 し た 。 な お 、 約 7 . 3 kbp の E c 0 R I 断片の制 限酵素地図 は第 6 図中 に 示す通 り で あ る 。
    [0112] P N Z 1 3 6 を H i n d ΠΙ で 消化 し た 後、 E c o R V で部分消化 し 、 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス電気泳動 し 、 隣接 し た 約 0 . 6 kbp の E c o R V — E c o R V 断片 と 約 1 . 2 kl)p の E c o R V — H i n d ffl 断片 よ り な る約 . 8 kb の E c o R V — H i n d fll 断片 を 回収 し た 。 —方 、 0 リ 〇 1 8 を ト1 1 门 01 111 、 E c o R I で消化 し た 後 .、 フ エ ノ ー ル ♦ ク ロ 口 ホル ム （ Ί ： Ί ) で抽 出 し 、 ェ タ ノ ー ル沈澱 に よ り 開裂 し た P U C 1 8 を 0 . 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動 し 、 約 2 . 7 kbp の 断片を 回収 し た そ れぞれ D N Aポ リ メ ラ 一ゼで平滑末端 に し た約 2 . 7 kb の断片 と約 1 , 8 kbp の 断片を T 4 D N Aリ ガ 一ゼ に よ り 連結 し 、 コ ン ビ一テ ン 卜 な大腸菌 J M 1 0 3を形 質転換 し 、 ア ン ピシ リ ン添加 L B寒天培地で選択 し 、 約 1 . 8 kpb の N P株 D N A断片を含むプラ ス ミ ドを回収 し 、 P N Z 1 3 6 S と命名 し た 。
    [0113] (5) プラ スミ ド P N Z 1 3 6 S Lの溝築 （ 第 Ί 3図参 照 ）
    [0114] P N Z 1 3 6 Sを E c o R Vで消化後、 E G O I U ン カ ー （ 宝酒造株式会社製 ） を T 4 D N A リ ガ一 tf に よ り 連結 し 、 フ エ ノ一ル · ク ロ ロ ホルム （ Ί ： 1 ) で抽出 し 、 ェ タ ノ ール沈殺に よ り D N Aを回収 し た 。 回収 し た D N Aを E c 0 R I 、 X b a Iで切断 し て約 0 . 2 kbp の E c o R I - X b a I断片を回収 し た 。 ま すこ 、 P N Z 1 3 6 Sを E c o R Vで消化後 、 H i n d IB リ ン力一 ( 宝酒造株式会社製） を リ ガ一ゼ に よ り 連結 し 、 フ エ ノ ール ♦ ク ロ 口 ホルム （ Ί ： Ί ) で抽出 し 、 ェ タ ノ ール沈 に よ り D N Aを回収 し た 。 回収 し た D N 八 を H i n d I X b a Iで消化 し た後、 0. 8 % ァ ガ ロ ース電気泳 動 に よ り 約 4. 3 kbp の H i n d I - X b a I断片を回 収 し た 。 さ ら に P U C 1 8を H i n d HI、 E c o R Iで 消化後、 2. 0 %ァ 力、 口 ー スゲル電気泳動 に よ り 、 ポ リ リ ン カ 一部分の 5 1 bpの断片を 回収 し た 。 こ こで得 ら れ た約 0 . 2 kbp の断片、 約 4 . 3 kbp の 断片、 5 1 bpの 断片を リ ガ一ゼで連結 し て 3断片が連結 し たプラ ス ミ ド を 抽出 し 、 P N Z 1 3 6 S L と命名 し た 。
    [0115] (6) プラ ス ミ ド O N Z 2 4 3 7 Rの構築 （ 第 Ί 4 図参 照 ）
    [0116] (3) で構築 し た m p 1 0 — H N Ί 8 0 Ί 0 ^を 8 & 171 |"1 1 と 8 9 1 11 で 完全消化後、 0 . 8 %ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動 を行い 、 約 Ί . 8 kbp のバ ン ドか ら H N 遺伝子を回収 し た 。
    [0117] P N Z 1 3 6 S L を B a m H I で消化 し 、 ク レ ノ ウ フ ラ グ メ ン 卜 で 平滑末端 と し た後 、 B g ！ II リ ン カ ー を 0 . Ί 3 加 え T 4 D N A リ ガ ー ゼで連結 し た 。 こ れを B g I II で 消化後 、 上記 H N遺伝子断片約 0 . 5 ^ 3 を加 え 、 T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し た 。 そ の後 、 H N遺伝子が 1 コ ピ ー 、 第 Ί 4 図 の よ う に 挿入さ れた プ ラ ス ミ ド を選択 し 、 P N Z 2 1 3 7 R と命名 し た 。
    [0118] ま た 、 1 0 ^ 3 のプ ロ モ ー タ ー プ ロ ー ブベ ク タ ー
    [0119] P N Z 1 1 2 7 R に ク ロ ー ニ ン グさ れて い る ク ロ ー ン 1 4 一 6断片を B a m H I で 切 り 出 し て 、 回収 し た 。
    [0120] Ί 3 の P N Z 2 1 3 7 R を B g I I [ で消化後 、 切 り 出 し て き た ク ロ ー ン Ί 4 — 6 断片を 0 . 5 3 加 え 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼで連結 し た 。 こ の う ち 、 1 4 一 6が Ί コ ピ ー 挿入さ れた も の を そ の分子量で選択 し 、 S s p I と E c 0 R I で の 消 化 に よ り プ ロ モ ー タ ー が H N遺伝子 に 、 作用 で き る よ う な方向 に つ な が つ た も の を選択 し 、 組 み換え用プラ ス ミ ド P N Z 2 4 3 7 R と し た 。
    [0121] (7) p N Z 2 4 3 7 R を 用 い た組み換 え N P株 の構築 2 &
    [0122] P N Z 1 1 2 7 、 ま た は Ρ Ν Ζ Ί 1 2 7 Rの代わ り に P N Z 2 4 3 7 Rを用 いる以外は実施例 Ί の ) と同様 に し て 、 H N遺伝子を持つ組 み換え N P株を含む組み換 え ウ ィ ルスス ト ッ ク を得た 。
    [0123] (8) プラ ー ク ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン及び組み換え
    [0124] N P株の選択
    [0125] 3 7 °G 5 % G 02 イ ンキ ュ ベ ー タ ーで 、 1 0 培養皿 に 一晚培養 し た Ί . 0 X 1 07 個の C E Fに 1 0倍に希 釈 し た組み換えウ ィ ルスス ト ッ ク を 5 0 0 J2 接種 し 、 再び 3 7で 5 % C 02 イ ンキ ュ ベ ー タ ー に 置いた 。 2 時 間後、 ウ ィ ルス液を除い た後ィ ー グル M E M培養液で C E Fを 2回洗い 、 1 %ァガ ー を 含む C E F生育培地を 1 重層 し た 。 これを 、 3 7 G、 5 % C 02 イ ンキ ュ べ 一タ ーで約 7 曰 間培養す る とプラ ー ク が 出現 した 。 プラ ー ク が確認でき た ら 0 . 0 2 %ニ ュ ー 卜 ラル レ ッ ド · Ί % ァ ガ ー 含有 F C S不含 C E F生育培地を 1 O 重層 し 1" 3 7 Gで 4〜 5時間培養 し た後 、 赤 く 染ま ら な い細 胞群を確認 、 プ レ ー 卜 上に チ ： π ッ ク し た後、 重層 し た ァ ガ ー培地を形を壊さない よ う に し て別の皿の上に移 し た ， ナイ ロ ン メ ンブ レン （ ポー ル社製 ） を培養皿の底に残 つ た細胞層 に 押 し付け て ウ ィ ルスをう つ し た 。 風乾後、 変成液 （ 0 . 5 M N a 0 H , 1 . 5 M N a C j^ ) で 1 0分間処迎 し た 後中和液 （ 3 M齚餒ナ ト リ ウ ム ，
    [0126] PH5 . 5 ) で Ί 0分間 処 理 を し た 。 風 乾後 、 8 0 で 2 時間焼き付けた 。 4倍 S T E ( 0 . 6 M N a C i , 0 . 0 8 M T r i s - H C i . 4 mH E D T A , PH7 . 8 ) — 1 0倍 Denhardt ( Ί % ポ リ ビ ニル ピ ロ リ ド ン 、 Ί % フ ィ コ ール ） 一 0 . 1 % S D Sで 6 8 C、 2 時 処理 を し た 。 4 倍 S T E — 1 0倍 Denhardt— 0 . 1 % 3 0 3 — 0 . 1 % 3 ;1 2 07 — 5 0 3 ノ ^変成サ ケ精子 D N A と ニ ッ ク 卜 ラ ン ス レ ー シ ヨ ン に よ り 標識 し た N D Vの H N を コ ー ド す る c D N Aを加 えて 6 8で 、 1 4 時閻ハ イ ブ リ ダィ ゼ ー シ ヨ ン し た 。 洗净後 、 ナ イ 口 ン メ ンプ レ ン と X線 フ イ ルム を重ね 、 才 ー 卜 ラ ジ オ ダラ フ ィ ー を行い 、 ス ポ ッ 卜 の存在 を確認 し 、 4 °Cに 保持 し て あ つ た寒天 に X線フ ィ ルムを重ね スポ ッ 卜 と合致 す る プ ラー ク が H N遺伝子 を含 む組 み換え休 と 同定 し 、 滅菌 パス ツ ー ル ピぺ ッ 卜 で単離 し 、 得 ら れた 組 み換 え ウ ィ ル ス を f N Z 2 4 3 7 R と 命名 し た 。
    [0127] (9) N D Vの H N遺伝子を持つ 組 み換え N P株 の純化 1 0倍 に 希轵 し た 組 み 換 え ウ ィ ル ス ス 卜 ッ ク 5 0 0 / の代わ り に 、 単龃 し た ΐ Ν Ζ 2 4 3 7 R を含 むブラ ー ク を イ ー グル Μ Ε Μ 1 に 懸濁 し た も の 2 0 0 / J2 を 用 い る ほ か は （ 8 ) と 同様 の操作を繰 り 返 し 、 組 み換え体 の純化を行 っ た 。
    [0128] f N Z 2 4 3 7 R に つ い て は 、 4 回 の繰 り 返 し で全 て のプラ ー ク が X線 フ イ ルム 上で ス ポ ッ 卜 と な り 純化 を 完 了 し た 。
    [0129] (10) 組み換 え N P株 に よ る H N遺伝子 の細胞で の 発現 ( 蛍光抗体法 ） 組織培養用 チャ ンバ ー スラ イ ド に培養 し た G E Fに 、 m.o. i.1 . 0で上記の組み換え ウ ィ ルス
    [0130] T N Z 2 4 3 7 Rを接種 し 、 3 7 * 、 5 % C 02 イ ンキ ュ ベ ー タ 一 で培養後に 、 F C S不含 C E F生育培地を加 えた 。 2 日 間 、 3 7 ^、 5 % C 02 イ ンキ ュ ベ ー ト で培 養後、 培地を除きダルベ ッ コ一 P B S (― ) で洗い 、 風 乾 し た後、 泠ア セ ト ンで 2 0分間処理 し細胞 を固定 し た c 一次抗体 と し て 、 抗 N D V二ヮ 卜 リ 抗体、 二次抗体 と し て イ ソ チ才 シ ア ン酸フ ルォ レ セ イ ン結合抗ニ ヮ 卜 リ
    [0131] I g G抗体を使用 する蛍光抗体でチ ヱ ッ ク し 、 組み換え N P株が N D Vの H N蛋 白産生能を持つ 事を確認 した 。 (11) 組み換え N P株 に よる H N遺伝子の細胞での発現 ( 酵素抗体法 ）
    [0132] 1 0 CTI培養皿 に 培養さ れた 1 X 1 0 7 個の C E Fに (9) で得 ら れた組み換え ウ ィ ルス液を 1 X 1 0 2 P U F Z の濃度で 、 5 0 0 接種 し 、 2時間後 Ί % ァ ガ ー を含んだ C E F生育培地を Ί Ο βώ積層 し 、 3 7 eC、 5 % C 02 イ ンキ ュ ベ ー タ ーで 7 日 間培養 し 、 プラ ー ク を形 成させた 。
    [0133] 培養皿か ら寒天培地を除去 し 、 培地皿の底に残っ た細 胞表面に 滅菌 し た ナ イ ロ ンメ ンプ レ ン を押さ れ付けて ゥ ィ ルスプラ ー ク 及び細胞を移 し た 。 スキム ミ ル ク 2 %添 加ダルベ ッ コ 一 P B S ( — ） で 3 0分間処理 し た後、 一 次抗体 と し て抗 N D Vニ ヮ 卜 リ 抗体を室温で 1 時間反応 さ せた 。 反応後、 ダルベ ッ コ 一 P B S ( — ） で洗淨 し 、 二次抗体 と し て ビ 才 チン化抗ニ ヮ 卜 リ I g G抗体を室温 で Ί 時悶反応さ せ た 。 反応後 、 ダルベ ッ コ 一 P B S ( — ） で洗浄 し 、 ホ ー ス ラデ イ シ ュ パー 才キ シダ ーゼ結合 ア ビ ジ ン ♦ ビ 才 チ ン複合物 を室温で 3 0分 間反応さ せ た 。 反 応後 、 0 . 0 5 % 4 — ク ロ 口 ^ 1 —ナ フ ト ー ル 、 0 . 3 % H。 02 を 含む 8 mH卜 リ ス塩酸緩衝液 （ PH 8 . 0 ) で 発色さ せ た 。 以上の酵素抗体法で チ ： t ッ ク し 、 組み換え N P株が 、 N D Vの H N蛋 白 産生 能を持つ事を確認 し た 。 突施例 3
    [0134] ニ ュ ー カ ッ スル病 ウ ィ ルス表面抗原 H N と 、 大腸菌の I a c Z遺伝子 を別別 の N P株プ ロ モ ー タ ー で Ί 度 に 発現す る組 み換え N P株の構築
    [0135] (1) 組み換 え用 プラ ス ミ ド Ρ Ν Ζ 2 Ί 2 7 R Lの構築
    [0136] ( 第 1 5 図 ）
    [0137] 実施例 2 の （ 6 ) で構築 し た プ ラ ス ミ ド
    [0138] P N Z 2 4 3 7 R 、 1 0 χ ^ を E c o R I と H i n d in で消化後 、 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳勁 を行い 、 約 2 . 3 kbp のパ ン ド を 回収 し た 。 こ の う ち 、 3 〃 9=
    [0139] D N A断片 に E c o R I — B a m H I ア ダプ タ ー 0 . Ί g と H i n d ID — B a m H I ア ダプ タ ー 0 . Ί 〃 2 を 加 え 、 T 4 D N A リ ガ一ゼで連結 し た 。 こ れを
    [0140] B a m H I で 消 化後 、 再び 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲル電気 泳動で約 2 . 3 k b p のパ ン ド を 回収 し た 。
    [0141] i a c Z の前 に 4 Ί 一 3 断片 が連結 し た 組 み換 え用 プ ラ ス ミ ド P N Z 1 1 2 7 R / 4 1 — 3 0 . Ί /ノ 3 を B a m H Iで消化後 、 上記の P N Z 2 4 3 7 Rよ り 回収 し た約 2 , 3 kbp 断片を Ί 2加え T 4 D N Aリ ガ ーゼ で結合 し た 。 E c o R Iで消化 し 、 0. 8 %ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動パ タ ー ン か ら第 Ί 4図 に示 し たプラ ス ミ ド を選択 し 、 P N Z 2 1 2 7 R し と命名 した 。
    [0142] (2) p N Z 2 1 2 7 R Lを用 いた組み換え N P株の構
    [0143] D Ν Ζ 1 1 2 7 ま た は Ρ Ν Ζ Ί 1 2 7 R の 代わ り に Ρ Ν Ζ 2 1 2 7 R Lを用 い る ほかは実施例 1 の ) に記 した方法で 、 Η Ν遺伝子及び I a c Ζ遺伝子を持つ組み 換え N P株を含む組み換え ウ ィ ルスス ト ッ ク を得た 。
    [0144] (3) 組み換え N P株の選択 と純化
    [0145] (2) で得た組み換え ウ ィ ルスス ト ッ ク を用 い て 、 実施 例 Ί の （5) と同様の操作を行 っ た 。 赤 く 発色 し たプラ ー ク を減菌パスツ ー ル ピぺ ッ 卜 で回収 し 、 こ れを イ ー グル M E ^ に懸濁 して組み換え ウ ィ ルスス 卜 ッ ク と し て 実施例 Ί の （5) と同様の操作を 、 出現す る全て のプラ ー ク が赤 く 発色す る ま で繰 り 返 し 、 純化を行な っ た 。
    [0146] 組み換え ウ ィ ルスス 卜 、グ ク 5 0 0 ^ j の代わ り に純化 さ れた ウ ィ ルスのプラ ー ク の一つ を滅菌パス ツ ール ピぺ ッ 卜 で回収 し イ ー グル Μ Ε Μ Ί ^に 懸濁 し た も の 2 0 0 / を ¾ い る ほか は実施例 2の （ 8 ) と同様の操作を行 つ た結果、 全て のプラ ー ク の ウ ィ ルス が H N遺伝子を組み 込んで いる こ とが確認さ れた 。
    [0147] こ の純化 し たウ ィ ル ス は 、 実施例 2の （8) に記 し た の と 同様な方法でプラ ー ク ハ イ ブ リ ダィ ゼ ー シ ョ ンを行 つ た と こ ろ 、 純化さ れた ウ ィ ルス が形成す る 全て のプラ ー ク で X線 フ ィ ルム上 に ス ポ ッ ト が見 ら れ 、 H NI遺伝子も 組み込んで い る こ と が示さ れた 。
    [0148] (4) 組み換え N P株 に よ る H N遺伝子の細胞で の発現 ( 蛍光抗体法 、 酵素抗体法 ）
    [0149] f N Z 2 4 3 7の代わ り に （ 3 ) で得た 組み換え ウ ィ ル ス を用 い る ほ か は実施例 2の （ 10 )及び （ 11 )に 記 し た と 同 様 に し て 組み換え N P株 に よ る H N蛋 白 の発現 を確認 し た 。
    [0150] 実施例 4 D N A断片 3 7 — 1 のプ ロ モ ー タ ー 活性 に 必 要な部分 の取得
    [0151] (1) N P株ゲ ノ ム D N Aのプラ ス ミ ドラ イ ブラ リ ー と のサザ ンブ ロ ッ 卜 ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ヨ ン 実施例 1 の （1) で抽 出 し た N P株 D N Aを E c o R I で 消化 し た も の と P U C Ί 8を E c o R I で 消化 し た も のを T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し 、 塩 化 カ ル シ ウ ム処理 を し た コ ン ビ一テ ン 卜 な大腸菌 T G 1 株 に 卜 ラ ン ス フ ォ — メ ー シ ヨ ン を 行 い （ モ レ キ ュ ラ ー · ク ロ 一 ニ ン グ
    [0152] Holecu l lar Cloning 2 4 9 — 2 5 Ί , コ ー ル ド · ス プ リ ン グ ♦ ノヽ ー ノ ー 研 所 Cold Spri ng H o r b o r Laboratory , 1 9 8 2 ) 、 X — g a l 0 . Q A / id , ア ン ピ シ リ ン 5 0 3 ノ 添加 L B 寒天 培地で培養 し 、 白 い シ ン グ ル ♦ セル ' コ ロ ニ ー を選択 し た 。 ア ン ピ シ リ ン 5 0 3 添加滅菌 L B 液体培地 2 0 0 の入 っ た 5 0 0 ^坂 口 フ ラ ス コ に植菌 し 、 3 7 eCで振盪 しなが ら 1 晚培養 し た 。 こ れ ら の大腸菌か ら改変さ れた ビルンポ ィ ム と ド ー リ ー の方法でプラ ス ミ ド D N Aを調製 し 、 E c o R I 、 H i n d Ifl , B a m H Iで挿入断片の制限酵素地図を作 成 し 、 公知 の A P Vゲ ノ ム の情報 （ シ一 . シ ー . ラ ンダール C. C. Randal I ら 、 ヴ イ ロ ロ ジ ー Vi ro I ogy、 8. 9. , 2 2 9 - 2 3 9 ( 1 9 7 8 ) な ど ） と の比較か ら 、 ク ロ ー ニ ングさ れた Ν Ρ株 D M Aの E c o R I断片が 、 N P株ゲ ノ ムの約 8 0 % の塩基配列 を有 し て い る こ と を 確認 し た 。
    [0153] Ρ Ν Ζ Ί 1 2 7 R Z 3 7— Ί を B a m H lで消化 し 、 1 . 5 % ァ ガ 口 一スゲルで電気泳動 を行い 、 分離さ れた 約 6 0 0 bpの D N A断片を調製 し 、 これを篛型 D N Aと し て 、 マルチプラ イ ム D N Aラ ベ リ ングシステム （ アマ シ ャ ム製 ） で 、 32 P標識のプ ロ ーブ D N Aを作製 し た 。 前記 N P株ゲノ ムの約 8 0 % の塩基配列 を有 し て い るプ ラ ス ミ ド D N Aを E c 0 R Iで消化 し 、 0. 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動 し 、 こ のプ ロ ーブ D N Aを用 い て サザ ンブ ロ ッ 卜 ハイ プ リ ダイ ゼー シ ヨ ン 、 才 ー 卜 ラ ジ オグラ フ ィ を行 っ た結果、 プ ロ ー ブ D N Aと招同 の塩基配列 が P N Z 1 3 6に ク ロ ーニ ングさ れた約 8 kbp の N P株由 来 D N A中 に存在する こ と が判明 し た 。
    [0154] P N Z 3 6を E c o R I と H i n d fflで消化 し 、 〇 . 5 % ァ ガ ロ ー スゲルで電気泳動 を行い 、 前記のプ ロ ープ D N Aを甩 いたサザンブ ロ ッ 卜 ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン 、 オ ー ト ラ ジ オ グラ フ ィ を行 っ た 結果 、 プ ロ ー ブ D N A と 相同 の塩基配列 が前記約 8 kbp の N P株由 来 D N Aか ら 切 り 出 さ れた 約 4 kbp の H i n d HI断片中 に 存在 す る こ と が判 明 し た 。
    [0155] (2) 約 4 kbp の H i n d ffl断片の M 1 3 フ ァ ー ジ D N Aへの ク ロ ー ニ ング と D N Aの削 り 込み
    [0156] P N Z 1 3 6を H i n d mで 消化 し 、 0. 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲルで ^気泳動 し 、 約 4 kbp の D N A断片を 回収 し た 。 こ の 断片を M 1 3 mm 9 R F D N Aの H i n d HI部 位 に T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し 、 コ ン ビ一テ ン 卜 な大 腸菌 T G 1 株 に導入 し た 。 こ の大腸菌 を 固化す る前 の X - g a I 0. 0 0 3 %、 I P T G 0. 0 3 mHを 含む L B 钦寒天 培地 （ L B寒天培地のパ ク 卜 ♦ ァ ガ ー の量を 8 3 に し た も の 〉 と 混合 し 、 L B寒天培地 に 重層 し 3 7 Cで Ί 晚培養 し 、 出現 し た 青色を呈さ な いプラ ー ク を Ί 2 個 採取 し た 。
    [0157] そ れぞれア ン ピ シ リ ン 5 0 2ノ 添加滅菌 L B液休 培地 2 0 0 Λΐδの入 っ た 5 0 0 坂口 フ ラ ス コ に植菌 し 、 3 7 Cで振盪 し な が ら Ί 晚培 養 し 、 M Ί 3の R F D N A を 調 製 し た 。
    [0158] こ れ ら の R F D N Aを H p a l と P s t l で 消 化 し 、
    [0159] 0 . 8 % ァ ガ ロ ー スゲル ¾1気泳動 を行い 、 そ のパ タ ー ン か ら 約 4 kbp の H i n d ΙΠ 断 片 が互 い に 異 な る 方 向 に ク ロ ー ニ ング さ れ た R F D N Aを一 つ ずつ選択 し た 。 こ の 2種 の 1^ 1 3 1^ 0 を 1"1 1 と 已 3 111 ト"1 1 で消 化 し 、 キ ロ シー ク ェンスデ レ ー シ ヨ ンキ ッ ト （ 宝酒造製） で処理 し 、 コ ン ビ一テ ン 卜 な大腸菌 T G 1 株に導入 し 、 固化す る前の し B欧寒天培地 と混合し 、 L B寒天培地に 重履 し 3 7でで Ί 晩培養 し 、 出現 し たプラ ー ク を採取 し た 。
    [0160] それぞれ滅菌 L B液体培地 2 00 ^の入 っ た 5 00 δώ 坂口 フ ラ ス コ に植菌 し 、 3 7 で振盪し なが ら 1 晩培養 し 、 M 1 3 R F D N Aを調製 した 。
    [0161] こ れ ら の R F D N Aを H i n d DIと E G O R I で消化 し 、 0. 8 %ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動を行い 、 挿入され た約 4 kbp の H i n d Dl断片から 、 約 3 . 7 kbp 、 約 3 . 4 kbp 、 約 3 . 1 kbp とい う よ う に 、 約 3 00 bp ずつ欠失 し て い る Μ Ί 3 R F D N Aを選択 し た 。
    [0162] (3) N P株 D N A由 来の約 4 kbp の H i n d !H断片の 配列分析
    [0163] (2) で謂製 し た種々 の M 1 3 R F D N Aをコ ン ビーテ ン 卜 な大腸菌 T G 1 株に導入 し 、 2 の L B液休培地で 8時藺振盪培養 し 、 微量遠心チ ュ ブに移 し 、 冷 ΪΠ遠心 器 （ M R 1 5 A、 卜 ミ ー精ェ社製 ） で 1 5 , 0 0 0 rpm で 3 0秒間遠心 し 、 上清 Ί を採取 し た 。 こ れに P E G ノ N a C 水溶液 （ 2 0 %ポ リ エ チ レ ング リ コ ール 6 0 0 0、 2. 5 M塩化ナ ト リ ウ ム ） を 20 0 Ad 加え、 再 ぴ冷 ίΠ遠心器で Ί 5 , 0 0 0 rpm で 5分間遠心 し た 。 残 渣 と して得 ら れた組み換え M 1 3フ ァ ー ジ に 5 0 Αί _β の Τ Ε と 5 0 W J2 の フ エ ノ ール ♦ ク ロ 口 ホルム （ Ί : Ί ) で抽 出 し エ タ ノ ー ル沈殿 に よ り 回収 し た D N Aを 7 0 % エ タ ノ ー ルで 洗淨 し 、 風乾さ せる こ と に よ っ て 、 Ί 本鎖 D N Aを調製 し た 。 そ れぞれの 1 本鎖 D N Aを M 2ブラ イ マ一 （ 宝酒造製 ） を使用 し て ダイ デ 才 キ シ法で配列 を 決定 し た 。 そ の結果、 D N A断片 3 7 — Ί の全塩基配列 は 、 こ の約 4 kbp の H i n d IE断片の塩基配列 の一部で あ る こ と がわ か っ た 。 ま た 、 第 4 図の 5 1 6番目 の塩基 か ら 始 ま る 開始 コ ド ン 以下 7 0 8塩基か ら な る オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ムが存在 する こ と がわか つ た 。
    [0164] 0 (4) D N A断片厶 1 4、 厶 2 6、 厶 3 6の調製
    [0165] 配列分析の結果 、 プラ ス ミ ド P N Z 1 3 6 S L は第 4 図 に示す D N A断片 3 7 - 1 の 4番 目 の塩基か ら 下流の 全塩基配列 を含む約 1 . 8 kbp の N P株 D N Aが ク ロ ー ニ ングさ れて お り 、 さ ら に 5 9 0番 目 の塩基か ら 始 ま る E c o R V部位 に P U C 1 8のマルチ ク ロ ー ニ ング部位 を組み込ん だプラ ス ミ ドで あ る こ と が判 明 し た 。
    [0166] 第 1 6図 に配列 を示す合成 D N A と 、
    [0167] P N Z 1 3 6 S しの H p a l と P s t I の 消化物 か ら 0. 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動 に よ り 回収 し た 4 . 5 kbp の D N A断片を T 4 D N A リ ガ ー ゼ で連結 し 、 得 ら れた プラ ス ミ ド P N Z Ί 3 6 S Pと 命名 し た 。
    [0168] P N Z 1 3 6 S Pを N c 0 I で 消化 し キ ロ シ ー ク ェ ン • スデ レ ー シ ヨ ン キ ッ 卜 で処理 し た もの と 合成 D N A
    [0169] 5 ' -AAGCTl'AGATCTAAGCTT-3 '
    [0170] 3* -TTCGAATCTAGATTCGAA-5' を T 4 D N A リ ガ ー ゼで連結 し た 。 こ う し て得 ら れたプ ラ ス ミ ドを コ ン ビ一テ ン 卜 な大腸菌 T G 1 株に導入 し 、 ア ン ビシ リ ン 5 0 ^ 2 Z を含む し B寒天培地上でコ ロ ニー を形成させた 。
    [0171] 2種の コ ロ ニー を各 1 0個 ま と める代わ り に こ こで得 ら れた コ ロ ニー Ί 0個を 1 個ずつ 別々 に用いたほかは実 施例 Ί の （7) と同様に操作 し 、 各 コ ロ ニーか らプラ スミ ド D N Aを調製 し た 。
    [0172] こ のプラ スミ ド D N Aから N c o Iで切断されないも の を選択 し 、 B a m H I と B g I I [ で消化 し 、 6 %ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲルで電気泳動 し 、 約 3 0 0 bpの D N A 断片、 約 2 0 0 bpの D N A断片、 約 の D N A断 片 を回収 し 、 それぞれ 4 、 厶 2 6、 厶 3 6 と命名 し た 。
    [0173] (5) D N A断片厶 Nの調製
    [0174] P N Z 1 3 6 S Pを N c o l で消化 し 、 ク レ ノ ウ フ ラ グメ ン 卜 で処理 した ものを 、 合成 D N A
    [0175] 5 ' -AAGCTTAGATCTAAGCTT-3'
    [0176] 3' -TTCGAATCTAGATTCGAA-5' と T 4 D N A リ ガ一ゼで連結 し た 。 こ う し て得 ら れたプ ラ ス ミ ドをコ ン ビ一テン 卜 な大腸菌 T G 1 株に導入 し 、 ア ン ピシ リ ン 5 0 / 3 Z を含 む し B寒天培地上で コ ロ ニ ー を形成させ た 。 2種の コ ロ ニー を各 Ί 0個 ま と め る 代わ り に こ こで得 ら れた コ ロ ニー Ί 0個を 1 個ずつ 別々 に 用 い た ほかは実施例 Ί の （ 7 ) と 同様に操作 し 、 各コ ロ ニ ー か ら プラ ス ミ ド D N Aを 調製 し た 。
    [0177] 調製 し たプラ ス ミ ド D N Aか ら H i n d ΙΠで切 断さ れ るも の を選択 し 、 B a m H I と B g i nで消化 し て 得 ら れる約 3 0 0 bpの D N A断片 を 回収 し 、 Δ Ν と 命名 し た c (6) D N A断片厶 H p a l の 調製
    [0178] N c o l の代わ り に H p a l を用 い る以外 は （5) と 同 様 に し て 、 約 5 0 bpの D N A断片を 回収 し 、
    [0179] 厶 H p a l と命名 し た 。
    [0180] (7) D N A断片の配列分析
    [0181] (4) 、 (5) 、 (6) で得 た 5種類の D N A断片をそ れぞ れを 、 B a m H Iで 消化 し た P N Z 1 1 2 7 R に T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し た 。 こ う し て 得 ら れた プ ラ ス ミ ド を コ ン ビ一テ ン 卜 な 大腸菌 T G Ί 株 に 導入 し 、 ア ン ピ シ リ ン 5 0 / / を 含む L B寒天培地上で コ ロ ニ ー を形 成 さ せ た 。 2種の コ ロ ニ ー を各 Ί 0個 ま と め る代わ り に こ こ で得 ら れた コ ロ ニ ー を各 D N A断片 につ き各 Ί 0個 ず つ （ 計 5 0個 ） を Ί 個 ず つ 別 々 に 用 い た ほ か は 実 施 例 1 の （ 7 ) と 同様 に 操作 し 、 各 コ ロ ニ ー か ら プ ラ ス ミ ド D N Aを 調製 し た 。
    [0182] 得 ら れたプラ ス ミ ド を プラ イ マ ー F P— 1 、 L P— 1 を用 い て ダ イ デ 才 キ シ 法 に よ り 配列分析 し た 。 そ の 結果 D N A断片△ Ί 4 は第 4 図 の 2 2 5番 目 の塩基か ら 5 Ί 5番 目 の塩基 ま で 、 厶 2 6 は 3 0 1 番 目 の塩基か ら 5 1 5番 目 の塩基 ま で 、 Δ 3 6 は 4 0 4番 目 の塩基か ら 5 1 5番 目 の 塩基 ま で 、 Δ Ν は 3番 目 の塩基か ら 5 1 5番 目 の塩基まで 、 A H p a l は 4 7 5番目 の塩基か ら 5 Ί 5 番目 の塩基ま での塩基配列か ら なる こ とが判 っ た 。
    [0183] ま た 、 5種の D N A断片がそれぞれ P N Z 1 1 2 7 R / 3 7 - 1 中 の同一の塩基配列 と同一方向 に 1 断片ずつ 挿入さ れたも のを選択 し 、 それぞれ
    [0184] P N Z 1 1 2 7 R ZA 1 4、 P N Z 1 1 2 7 R /A 2 6 P Z 1 2 7 R /A 3 6 , P N Z 1 1 2 7 R /A N , Ρ Ν Ζ Ί 1 2 7 R ZA H p a I と命名 し た 。
    [0185] (8) 0 !^八断片 3 7 — 1 由 来の 0 八 断片のプ ロ モ ー タ ー 活性の測定
    [0186] P N Z 1 Ί 2 7 、 P N Z 1 1 2 7 Rの代わ り に （7) で得 た 5種のプラ ス ミ ドを用 いるほかは実施例 1 の （4) と周 様の操作に よ り 、 組み換え ウ ィ ルスス ト ッ ク を得た 。
    [0187] こ の組み換え ウ ィ ルス ス ト ッ ク に実施例 Ί の （5) と同 様 にプラ ー ク ア ツ セ ィ を行 っ た と ころ 、 どの組み換え ゥ ィ ルス が感染 し た細胞に おいて も 、 赤いプラ ー ク の 出現 が認め ら れ、 D N A靳片 Δ Ί 4 、 厶 2 6、 Δ 3 6、 A N A H p a I はいす れもプ ロ モ ー タ ー 活性を有す る こ と が mつ た 。
    [0188] 赤いプラ ー ク を採取 し 、 こ れを ウ ィ ルス ス ト ッ ク と し て 、 出現す る全て のプラ ー ク が赤 く 染色 さ せ る まで組み 換え ウ ィ ルス を純化 した 。
    [0189] P N Z 1 1 2 7 R / A 1 4 ,
    [0190] P N Z 1 1 2 7 R /A 2 6 厶 3 6 P N Z 1 1 2 7 R /A N , D N Z 1 1 2 7 R / △ H p a l か ら得 ら れた 組み換え ウ ィ ルス をそ れぞれ f N Z 1 1 2 7 Rノ厶 1 4 、 f N Z I 1 2 7 R / A 2 6 Ϊ Ν Ζ 1 1 2 7 R /A 3 6 Ϊ Ν Ζ 1 1 2 7 R /A N ^ f N Z 1 1 2 7 R Z厶 H p a l と 命名 し た 。
    [0191] 純化 し た 各 ウ ィ ルス を 一 晚培養 し た 3 X 1 06 個 の C E F に 6 X 1 05 P F Uの割合で感染させ 、 C 02 ィ ン キ ュ ベ ー タ 一 で 3 7 eGで 1 5 時間培養 し 、 3回凍結融 解 し た も の を使い 、 ミ ラ ー の方法 （ ジ エ イ . ェ イ チ . ミ ラ ー 」. H. H i I I e r、 分子遺伝学実験 E X p e r i m e n t of Molecular Genet i cs, 3 5 2 — 3 5 5 、 コ ー ル ド スプ リ ングノ、 ー ゾ 一 研究） Cold S ring Har or Laboratory ( 1 9 7 2 ) ) に 従 い 、 3 — ガ ラ ク 卜 シダ ーゼ活性 を測 定 し た 。 そ の結果を第 Ί 表 に 示す 。
    [0192] 第 1 表 ウ ィ ルス 招対活性 ΐ Z 1 1 2 7 R / 3 7 - 1 1 . 0
    [0193] f N Z 1 1 2 7 R / / Δ N 1 . 1
    [0194] ΐ N Z 1 1 2 7 R / / Δ 1 4 1 . 2
    [0195] ΐ N Z 1 1 2 7 R / / Δ 2 6 1 . 1
    [0196] f N Z Ί 1 2 7 Rノ z Δ 3 6 1 . 2
    [0197] f N Z 1 2 7 R z△ H a l 0 . Ί 相対活性 は f Ν Ζ Ί 1 2 7 R 3 7 - Ί の 3 — ガ ラ ク タ ー ゼ 活性 に 対す る値で示 し た 。 実施例 5 D N A 靳片 3 7 — Ί 由来の D N A 断片 に よ る 一 力 一遺伝子発現用 プ ロ モ ー タ ー の検討
    [0198] (1) D A 靳片 3 7 — 1 由来合成 D N A断片のプ ロ モ — タ ー 活性の検討
    [0199] 第 4 図の 4 8 9 番目 の塩基か ら 5 0 5 番 目 の塩基まで の塩基配列 を含む P S — Ί 7
    [0200] 5' -GATCGTTGAAAAAATAATATA -3'
    [0201] 3' - CA/VCTTTTTTATTATATCTAG-5 '
    [0202] と、 第 4 図の 4 9 7 番 目 の塩基か ら 5 0 5 番 目 の塩基ま での塩基配列 を含む P S — 9
    [0203] 5， -6ΛΤ0ΑΑΤΑΑΤΑΤΑ -3'
    [0204] 3' - TTATTATATCTAG-51
    [0205] を合成 し た 。
    [0206] Ρ Ν 2 7 R を B a m H I で消化 し 、 P S - 1 7 P S - 9 をそ れぞれ加え、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ で連結 し た 。 こ う し て得 ら れたプラ ス ミ ドを コ ン ビ一テ ン 卜 な大 腸菌 Τ G 1 株に導入 し 、 アン ピシ リ ン 5 0 / g Z ra£を含 む L Β 寒天培地上でコ ロ ニーを形成させ た。 2 種の コ 口 ニ ー を各 1 0個 ま と め る代わ り に こ こで得 ら れた コ ロ ニ 一を Ί 個ずつ 別々 に 用 い た ほか は実施例 Ί の （ 7 ) と同様 に操作 し 、 各 コ ロ ニ ー か ら プラ ス ミ ド D N A を 調製 し た こ のプラ ス ミ ド D N A か ら B a m H I で 切 断 さ れない も の を選択 し 、 プラ イ マ ー L P — 1 、 F P 一 Ί を用 い て ダィ デ才キシ法で配列分析を行 い 、 そ れぞれ P N Z Ί 1 2 7 R / 3 7 一 1 中 の周一の塩基配列 と 同一方向 に Ί 断 片ずつ 挿入さ れも の を選択 し た 。
    [0207] p N Z 1 2 7 ま た は Ρ Ν Ζ Ί 1 2 7 Rの代 り に こ の 2種類のプラ ス ミ ドをそ れぞれ用 い る以外 は実施例 1 の
    [0208] (4) と 同様 に して 、 組み換え ウ ィ ル ス ス 卜 ッ ク を得た 。
    [0209] こ の 組 み換え ウ ィ ル ス ス ト ッ ク を 用 い て 実施 例 1 の
    [0210] (5) と 同様にプラ ー ク ア ツ セ ィ を行 っ た と こ ろ 、
    [0211] I a c Z遺伝子の上流 に P S — 1 7 の塩 S配列 を含 む組 . み換え ウ ィ ル ス に よ り 形成さ れるプラ ー ク の みが赤 く 染 色さ れた 。 こ れに よ り P S— 1 7 はプ ロ モ ー タ ー 活性を 有 す る こ と がわ か っ た 。
    [0212] (2) プラ ス ミ ド P N Z 2 6 3 7 の構築 （ 第 Ί 7図 、 第
    [0213] 8図 、 第 Ί 9図参照 ）
    [0214] ワ ク シ ニ ア ウ ィ ルス の 7 . 5 K プ ロ -ヒ ー タ ー の 支 配 下 に N D V ♦ D — 2 6株 の H N 遺 伝 子 が 連 結 さ れ て い る D N A断片 が P U C Ί 8 に ク ロ ー ニ ン グ さ れ て い る P N Z 8 7 - 3 7 ( 特開 平 1 - - Ί 5 7 3 8 Ί 号 ） を
    [0215] B a m H I と K p n I で消化 し 、 0 . 8 % ァ ガ 口 一 スゲ ル電気泳勁 を行い 、 約 4 , 5 kb め D N A断片を 回収 し た 。 ま た 、 P N Z 7 6 Bを 8 8 171 |~1 1 と [ 0 11 1 で 消 化 し 、 〇 . 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳 動 を行い 、 約 3 . 2 kb の I a c Z選伝子を含 む D N A断片 を 回収 し た 。 こ の 2つ の D N A断片を T 4 D N A リ ガ 一.ゼ で連結 し 、 P N Z 8 7 — 3 7 L A Pを構築 し た 。
    [0216] P N Z 8 7 — 3 7 Ι_ Δ Ρを S p h l で 消化 し 、 ク レ ノ ゥ フ ラ グ メ ン 卜 で処理 し た 後 、 K P n Iで消化 し 、 0. 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動 を行い 、 約 5 k b p の D N A断片を回収 し た 。 ま た 、 P N Z 1 3 6 S Pを
    [0217] S P h Iで消化 し 、 ク レ ノ ウ フ ラグメ ン ト で処理 し た後 . K p n Iで消化 し た もの と前記約 5 kb の D N A断片を T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し 、 P N Z 2 5 3 7 し を構築 し た 。
    [0218] P C 1 8 7 1 ( フ ア ルマ シ ア社製 ） を B a m H I と C I a Iで 消化 し 、 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲ ル電気 泳 勁 を行い 、 約 8 0 0 bpの D N A断片 を回収 した 。 ま た 、 p N 2 5 3 7 Lを B a m H I と C l a Iで消化 し 、
    [0219] 0. 8 % ァガ ロ ー スゲル電気泳動を行い 、 約 9 kb の D N A断片を 回収 し た 。 こ の 2つ の D N A断 片 と 合成 D N A · A S - K
    [0220] 5 ' - GATCCT/ AATGGAA -3'
    [0221] 3' - GATTTTACCTTCTAG-5 '
    [0222] を T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し た 。 こ う し て得 ら れたプ ラ ス ミ ド を コ ン ビ一テ ン 卜 な大腸菌 T G 1 株に導入 し 、 ア ン ピシ リ ン 5 0 3 ノ / ^を含 む L B寒天培地上で コ ロ ニ ー を形成さ せ た 。 2種の コ ロ ニー を各 1 0個 ま と め る 代わ り に こ こで得 ら れた コ ロ ニーを 1 個ずつ 別 々 に用 い る ほかに実施例 1 の （ 7 ) と同様 に操作 し 、 各 コ ロ ニー か らプラ ス ミ ド D N Aを調製 し た 。 こ れ ら のプラ ス ミ ド D N Aか ら I a c Z遺伝子 と H N遺伝子の間 に A S— K が挿入さ れ、 A S — K中 の塩基配列 A T Gが I a G Z遺 伝子の 開始コ ド ン と なる よ う に連結さ れた も の を配列分 4 b 析 に よ り 選択 し 、 P N Z 2 5 3 7 L 1 5 と 命名 し た 。
    [0223] P N Z 2 5 3 7 L 1 5を B a m H Iで 消化 し 、 P S— Ί 7 と T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し た 。 こ う し て得 ら れた プラ ス ミ ド を コ ン ビ一テ ン 卜 な大腸菌 T G Ί 株 に ' 入 し ， ア ン ピシ リ ン 5 0 g / を含 む L B寒天培地上で コ ロ ニ ー を形成さ せ た 。 2種の コ ロ ニ ー を各 1 0個 ま と め る 代わ り に こ こ で得 ら れた コ ロ ニ ー を Ί 個ずつ 別々 に 用 い た ほ か は実施例 1 の （ 7 ) と周様 に 操作 し 、 各 コ ロ ニ ー か ら プラ ス ミ ド D Ν Αを調製 し た 。 こ れ ら の プラ ス ミ ド D N Aか ら B a m H I で切断 さ れな い も の を選択 し 、 P S - 1 7 がプ ロ モ ー タ ー と し て I a c Z遺伝子を支配 す る と 考え ら れる方向 に 1 断片だけ 挿入 さ れ た も の を選 択 し 、 P N Z 2 5 3 7 1 7 し 1 5 と命名 し た 。
    [0224] P N Z 2 5 3 7 1 7 L 1 5を S a c l で 部分 分解 し 、 0. 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳勅 を行い 、 P S — 1 7 と I a c Z遺伝子全長を 含 む約 3 . 2 kbp の D N A断片を 回収 し た 。 ま た 、 p N Z 2 5 3 7 1 7 L Ί 5を S a c I で 完全分解 し 、 〇 . 8 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動 を行い 、 約 6 . 5 kb の D N A断片を 回収 し た 。 こ の 2つ の D N A断片 を T 4 D N A リ ガ 一 ゼ で連結 し 、 得 ら れ た プラ ス ミ ド を コ ン ビ一テ ン 卜 な 大腸菌 T G Ί 株 に 導入 し 、 ア ン ピ シ リ ン 5 0 2 を含 む L B寒天 培 地上で コ ロ ニ ー を形成 さ せ た 。 2種 の コ ロ ニ ー を各 Ί 0個 ま と め る 代わ り に こ こ で得 ら れ た コ ロ ニ ー を 「個ず つ 別 々 に 用 い た ほ か は実施例 Ί の （ 7 ) と 同様 に 操作 し 、 各 コ ロ ニ ー か ら プ ラ ス ミ ド D N Aを調製 し た 。 こ の プ ラ ス ミ ド D N A を C ！ a I と P s ΐ Iで消化 し 、 0 . 8 %ァ ガ ロ ー スゲル 電気泳動 を行い 、 そのパ タ ー ン か ら 、 I a c Ζ遺伝子が P N Z 2 5 3 7 1 7 L 1 5 と は逆向き に 1 断片の み挿入 さ れたもの を選択 し 、 Ρ Ν Ζ 2 6 3 7 Δ Τ と命名 した 。
    [0225] p N Z 1 1 2 7 ま た は P N Z 1 1 2 7 R の 代わ り に P N Z 2 6 3 7厶 Tを用 い る以外は実施例 1 の （4) と同 様 に し て 、 組み換え ウ ィ ルスス ト ッ ク を得た 。
    [0226] この組み換え ウ ィ ルス ス ト ッ ク に実施例 Ί の （ 5 ) と周 様 にプラ ー ク ア ツ セ ィ を行 っ た と ころ 、 赤 く 染色さ せた プラ ー ク が認め ら れた 。
    [0227] 赤 いプラ ー ク を採取 し 、 これを ウ ィ ルスス ト ッ ク と し て 、 出現する全て のプラ ー ク が赤 く 染色さ れる ま で組み 換え ウ ィ ルスを純化 し た 。
    [0228] こ う し て得 ら れた 3 —ガ ラ ク 卜 シダ一ゼ を発現す る組 み換えウ ィ ルスを "Γ Ν Ζ 2 6 3 7厶 T と命名 し た 。
    [0229] Ρ Ν Ζ 2 6 3 7 Δ Τの H N遺伝子 と I a c Z遺伝子の Plを K p n I で切 断 し 、 ワ ク シニ ア ウィ ルスの初期遺伝 子の 転写終結因子 と祖周 な 配列 を含む合成 D N A ♦ D S - J
    [0230] 5 ' - ATTTTTATAAAAA'fCl AG-3' 3 ' -GATCTAAAAATATTTTTA - 5' と T 4 D N A リ ガ ーゼで連結 し 、 挿入 した 。 こ う し て 得 ら れたプ ラ ス ミ ド を コ ン ビ一テ ン 卜 な大腸菌 T G Ί 株 に 導入 し 、 ア ン ピシ リ ン 5 0 g Z を含む丄 B寒天培地 上で コ ロ ニ ー を形成さ せ た 。 2種の コ ロ ニ ー を各 Ί 0個 ま と め る代わ り に こ こ で得 ら れた コ ロ ニ ー を Ί 0個をそ れぞれ Ί 個ずつ 別々 に 用 い た ほ か は実施例 1 の （ 7 ) と周 様 に 操作 し各 コ ロ ニ ー か ら プラ ス ミ ド D N Aを調製 し た 。 こ う し て 得 ら れた プラ ス ミ ド D N Aの配列 を分析 し 、 K p n I 部位 に D S — Tが Ί 斷片だけ挿入さ れ た ものを 選択 し 、 P N Z 2 6 3 7 と 命名 し た 。
    [0231] (3) Ϊ Ν Ζ 2 6 3 7 に よ る I a c Z遺伝子の発現 と 安 定性
    [0232] P N Z 1 1 2 7 ま た は P N Z 1 1 2 7 R の 代 わ り に P N Z 2 6 3 7 を用 い る以外 は実施例 Ί の （4) と 周様 に し て 、 組 み換え ウ ィ ルス ス ト ッ ク を得 た 。
    [0233] こ の組 み換え ウ ィ ルス ス 卜 ッ ク に 実施例 1 の （ 5 ) と 同 様 に プラ ー ク ア ツ セ ィ を行 っ た と こ ろ 、 赤 く 染色さ れた プ ラ ー ク が認め ら れた 。
    [0234] 赤 いプラ ー ク を採取 し 、 こ れを ウ ィ ルス ス ト ッ ク と し て 、 出現す る全て のプラ ー ク が赤 く 染色 さ れる ま で組み 換 え ウ ィ ルス を純化 し た u
    [0235] こ う し て 得 ら れ た β — ガ ラ 卜 シ ダ ー ゼ を発現す る組換 え ウ ィ ル ス ΐ Ν Ζ 2 6 3 7 と命名 し た 。
    [0236] ΐ Ν Ζ 2 6 3 7 を 2 5∞ 2 培養用 ポ 卜 ルで培養 し た 5 X 1 ϋ 6 個 の C Ε ト_ に 感染さ せ 、 3 7 C 、 C 02 イ ンキ ュ ベ ー タ 一 で 3 日 間培養 し た 後 、 3 回凍 結融解 し た も の を 、 再び 2 5 2 培 養用 ポ 卜 ル で培缝 し た 5 X Ί 06 個 の C E F に 感染 さ せ た 。 こ の操作を Ί 0 回操 り 返 し 、 み換え ウ ィ ルスス ト ッ ク と し た 。
    [0237] この組み換えウ ィ ルスス ト ッ ク を用 いて実施例 Ί の (5) と周様にプラー ク ア ツ セ ィ を行 っ た と ころ 、 全て の プラ ー ク が赤 く 染色され 、 1 a G Z遛伝子が安定保持 さ れ、 発現 し ている こ と が確認さ れた 。
    [0238] (5) Ϊ Ν Ζ 2 6 3 7 Δ Τと " Γ Ν Ζ 2 6 3 7 と の H N遺 伝子発現比較
    [0239] Ϊ Ν Ζ 2 6 3 7 Δ Τと N Z 2 6 3 7を 1 晩培養 した 4 Ί 0 個 の C E Fに 4 x 1 0 P F Uでそ れぞれ感 染さ せ た 。 感染 6時間後、 冷アセ ト ンで 5分問固定 し 、 Ί 次抗体に抗 N D V鶏血清を 、 2次抗体 にイ ソ チオシ ァ ン 酸フ ル 才 レセ イ ン洁合抗鶏 I g G ( キ ヤ ペル社製 ） を 用 いて処理 し 、 蛍光顕微鏡で観察 し た と こ ろ 、 ΐ N Z 2 6 3 7感染細胞で の蛍光が明 ら かに 強い こ と が判明 し た ， そ の結果 、 遺伝子の下流 に存在 す る転写終結因子が 、 そ の遺伝子の発現増強に 関与 し て い る こ と が明 か とな っ た ， 産業上の利用可 能性
    [0240] か く し て 、 本発明 に よ れば 、 組 み換え ウ ィ ルス中で ポ リ ペプチ ド を発現 さ せる こ と がで き る ウ ィ ルスブ ロ モー タ ー の提供及び同プ ロ モ ー タ ー の選択が可能 となる こ と に よ り ワ ク チ ン の製造分野に お いて の多大の進歩が期待 できる 。 ま た これ ら のプ ロ モ ー タ 一 を用 い る と外来遗伝 子を安定 し て発現させ る こ と がで き るボ ッ ク ス ウ ィ ルス の構築ができ 、 こ れ に よ り 安定 的 に ワ ク チ ンを製造する し と がで き る ち の と 期待 さ れる
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1 . プ ロ モ ー タ 一活性を有す る第 1 図 、 第 2 図 、 第
    3 図 、 ま た は第 4 図 に示さ れる塩基配列 の一部 ま た は全 部を含む塩基配列 。
    2. 箏基配列が第 4 図 に示される塩基配列 の第 4 0 4 番目 の塩基か ら第 5 1 5 番目 の塩基ま での 塩基配列の 一部 ま た は全部を含 む塩基 S列である請求項 Ί 記載の塩 基配列
    3 . 塩基配列 が第 4 図に示される塩基配列 の第 4 8 9 番目 の塩基か ら 第 5 0 5 番目 の塩基ま での塩基配列の —部ま た は全部を含 む塩基配列である請求項 2 記載の塩 基配列
    4 . 請求項 Ί 、 2 、 ま た は 3 記載の塩基配列 と ポ リ ぺプチ ド を コ ー ド す る外来遺伝子か ら な り 、 該外来遺伝 子が該塩基配列の支配下 に あるキメ ラ遺伝子 。
    0 . 外来遺伝子がニ ュ 一 力 ッ スル病ウ ィ ルス抗原を コ する還伝子であ る請求項 4 記載の キメ ラ遺伝子。
    ニ ュ ー カ ッ スル病ウ ィ ルス抗原がへマグルチ二 ン ノ イ ラ ミ ニダーゼである請求項 5 記載の キメ ラ遺伝 子
    7 請求項 4 、 5 、 ま た は 6 の いず れか 1 項に記載 の キ メ ラ遺伝子を含み、 かつ 大腸菌中で増殖可 能なブラ スミ ド
    8 . キメ ラ遺伝子が 、 ア ビボ ッ ク ス ウ ィ ルスの増殖 に 非必須なゲ ノ ム領域由 来の塩基配列中 に 挿入さ れて い る請求項 7 記載のプラ ス ミ ド 。
    9. ア ビ ボ ッ ク ス ウ ィ ルス の 増殖 に 非必須なゲ ノ ム 領域 に 請求項 4 、 5 、 ま た は 6 の いず れか 1 項に 6 記載 の キ メ ラ遺伝子を組み込ん だ組み換え ア ビボ ッ ク ス ウ イ ルス 。
    10. ア ビ ボ ッ ク ス ウ ィ ルス が フ ァ ウルボ ッ ク ス ウ イ ルスで あ る請求項 9 記載の組み換え ア ビポ ッ ク ス ウ ィ ル ス 。
    11. プ ロ モ ー タ ー の支配下 に ないマ ー カ ー遺伝子を 含むプ ラ ス ミ ド のマ ー カ ー遺伝子の 上流に ウ ィ ル ス 由 来 D N A 断片 を挿入 し、 そ のプラ ス ミ ドを用 い て 組 み換 え ウ ィ ルス を構築 し 、 マ ー カ ー遺伝子 を欠い た 細胞 を そ の 組 み換 え ウ ィ ルスで感染さ せ 、 マ ー カ ー 遺伝子 を発現 し た細胞を選択 し 、 揷入 し た I〕 N A 断片の 塩基配列 を解析 す る こ と よ り な るプ ロ モ ー タ ー活性を有す る塩基配列 の 選択方法 。
    12. マ — カ ー遺伝子が I a c Z 遺伝子.で あ る請求項
    1 0 記載のプ ロ モ ー タ — 活性を有 す る 塩基配列 の選択方 法 。
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    EP0419666A1|1991-04-03|
    EP0419666A4|1991-05-15|
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1990-07-12| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU JP KR US |
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP63/335605||1988-12-29||
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