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    公开号:WO1990004789A1
    申请号:PCT/JP1989/001063
    申请日:1989-10-17
    公开日:1990-05-03
    发明作者:Kenji Yasuda；Takao Ogawa
    申请人:Meito Sangyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] --. 歯周病の免疫学的診断用試薬及び方法
    [0003] 技術分野
    [0004] 本発明は、 バクテロイ デス . ジンジバリ ス ( B actaroides ging ival is) の線毛抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒子からなるパク テロイデス . ジンジバリ ス挨出用試薬、 そのためのキッ ト及びそれを用 いる被検体中のバクテロイデス · ジンジバリス菌体の検出方法に関する。 また、 本発明はヒ ト被検体中のパクテロィデス · ジンジパリ スの線毛 抗原に対する抗体を測定することによる歯周病の診断用試薬及び歯周病 の診断方法に関するものである。 更に詳しくは、 バタテロイデス ' ジン ジバリスの線毛抗原を感作させたラテックス粒子からなる歯周病の診断 試薬及びこの試薬を用いてヒ ト被検体中のバクテロイデス ♦ ジンジバリ スの線毛抗原に対する抗体を測定することよる歯周病の診断方法に関す る。
    [0005] 背景技術
    [0006] バクテロイデス ♦ ジンジバリ ス （以下、 g ingival i sという） は歯 周病患者の口腔内、 特に歯肉縁下ポケッ トに高比率で生息し、 成人性歯 周炎の原因菌として注目されている。 齒周病には齒肉の炎症をともなう 歯肉炎と、 さらに齒周ポケッ 卜の形成、 歯根膜の破壊、 歯槽骨の吸収を ともなう歯周炎とがある。 さらに歯周炎は、 成人性歯周炎症と限局性若 年性歯周炎とに分けられる。 このうち成人性齒周炎は最も罹患率が高く、 出血、 排膿を伴う歯牙の動揺、 さらに重度の場合には齒牙の喪失に至る 疾患である。 しかしながら、 現在、 歯周炎の治療法はまだ完全に確立さ れていないのが現状であり、 できるだけ早期に成人性歯周炎を発見し、 予防的処置を施すことが最も重要であると考えられている。 上記の成人 性齒周炎の病巣局所には、 全細菌のうちの 7〜 8割がグラム陰性桿菌に よって占められ、 なかでも特に gingival isの顕著な増加が認められ ていることが報告されている。 そこで、 この B。 gingival isに注目し、 成人性齒周炎の診断の捕助的手段として、 本菌の存否ならびに多寡を知 るために種々の方法が提案されている。
    [0007] 例えば、 成人性齒周炎患者のプラーク （齒垢） 、 歯肉溝液及び唾液な どを血液平板上で嫌気的条件下で培養することにより黒色色素産生性 B acteroidesを検出し、 さらに詳細な生化学的性状を調べることにより B . gingival isであることを確認する方法が提案された。
    [0008] —方、 酵素免疫測定法を用いて、 プラーク （歯垢） 、 歯肉溝液、 唾液 及び血清中の^^ gingival is菌体表層抗原に対する抗体価の有無ならび にその程度を調べることにより、 病態の悪化と抗体価の上昇が栢関する ことを指標として成人性歯周炎症を診断することが試みられている。 さ らに蛍光顕微鏡を用いての検体を観察することにより特定細菌の有無を 判定することも試みられている。 しかしながら、 これらのいずれの方法 もかなりの時間と煩雑な操作ならびに高価な特殊装置を必要とするため に広く普及することはきわめて難しく、 迅速かつ簡便な診断方法の開発 が望まれている。
    [0009] 本発明者らは、 これらの従来方法の欠点を克服すベく鋭意研究の結果、 B . gingival isの種々の病原性因子の中で、 特に成人性歯周炎巣部にお いて初期定着に重要でありかつ同菌の表層菌体成分の中でも強い免疫原 性を示す線毛抗原に着目し、 この線毛抗原に対する抗血清又はモノク口 ーナル抗体を調製し、 これらの単独もしくは複数をラテツクス粒子に吸 着させて得た感作ラテックス粒子を用いれば、 迅速かつ簡便に B . ging ival isの存否ならびに多寡を判定することが可能であることを見出した。 特に、 被験者の口腔からの検体ならびに^ _^ gingivalis菌体浮遊液 (陽 性対照） を好ましくは特殊な処理剤で処理して、 菌体より線毛をその抗 原性をそこなうことなく迅速かつ多量に抽出し、 さらに菌体自体も溶解 することによ り、 菌体とラテックス粒子相互の非特異的凝集が起こらず、 B . gingivalisの存否ならびに多寡を信鎮性高く検出出来ることを見い 出し、 本発明を完成するに至った。
    [0010] 発明の開示
    [0011] かく して、 本発明によれば、 gingival isの線毛抗原に対する抗体 を感作させたラテックス粒子からなることを特徴とする^ ^ gingivalis 菌体の検出用試薬が提供される。 '
    [0012] また、 本発明によれば、 前記ラテッ クス粒子の懸濁液及び処理剤より なる B . gingivalis菌体を検出するためのキツ 卜が提供される。
    [0013] さらに本発明によれば、 前記検出用試薬を被検体と接触させて凝集像 の有無を判定することを特徴とする被検体中の^ _^ gingivalis菌体の検 出方法が提供される。
    [0014] かかる本発明の試薬及び方法によれば、 成人性齒周炎患者の齒周病巣 部における！^ gingival isの存否ならびに多寡を極めて簡単な操作で迅 速に検出可能であり、 短時間内に本疾患を診断し、 また病態の程度を把 握できる。
    [0015] 従来、 ヒ 卜のプラーク （歯垢） 、 歯肉溝液、 唾液等の被検体に処理剤 を加え、 検体中の B . gingivalisの線毛抗原を菌体より、 その抗原性を そこなうことなく分離するとともに、 菌体自体を溶解させることにより、 菌体とラテックス粒子の相互における非特異的凝集を阻止しながら^^ gingival isの線毛抗原をラテックス凝集反応により検出する方法は知ら れておらず、 迅速かつ簡便な成人性歯周炎の診断は不可能であった。
    [0016] 本発明によれば、 処理剤による B . ging ival is線毛抗原の分離と B . gingival is線毛抗体 ·惑作ラテックスを用いたラテックス凝集反応を粗 み合せることにより、 早期に成人性齒周炎の迅速且つ簡便な診断が可能 となった。
    [0017] また、 一方、 この旦. gingival isに対する抗体に注目し、 成人性歯周 炎の診断の手段として、 本菌に対する抗体の有無ならびに、 抗体価の程 度を測定する種々の方法が提案されている。
    [0018] 例えば、 成人性歯周炎患者の齒肉溝液、 唾液、 血液又は血清などの含 - まれている旦. i ix iisに対する抗体価を一元放射状免疫拡散法、 0 uchter lony法、 免疫電気泳動法、 受身赤血球凝集反応又は E L I S A法 などにより測定することが試みられている。 しかしながら、 これらの方 法はいずれも惑度が低かったり、 長い時間にわたる煩雑な操作と高価な 特殊装置を必要とするために広く普及することは難しく、 迅速かつ簡便 な診断試薬及び診断方法の開発が望まれている。
    [0019] 本発明者らは、 これらの従来方法の欠点を克服すべく鋭意研究の結果、 B_ . gingival isの種々の病原性因子の中で、 特に成人性齒周炎病巣部に おいて初期定着に重要でありかつ同菌の菌体表層抗原の中でも特に強い 免疫原性を示す線毛抗原に着目し、 この線毛抗原をラテツクス粒子に吸 着させて得た惑作ラテックス標品を用いれば、 ヒ トの歯肉溝液、 唾液、 血液、 及び血清などのヒ ト被検体中の且. gingival isの線毛抗原に対す る抗体を迅速かつ箇便に検出し、 さらにその抗体価を測定することが可 能であることを見出した。
    [0020] かく して、 本発明の別の態様によれば、 且. gingival isの線毛抗原を 感作させたラテックス粒子からなることを特徴とする歯周病の診断用試 薬が提供される。
    [0021] また、 本発明によればさらに、 この診断用試薬をヒ ト被検体と接触さ せて凝集像の有無を判断することを特徵とする歯周病の診断方法が提供 される。
    [0022] かかる本発明め試薬を用いればいかなる且. gingival isにより発症し た成人性歯周炎患者の歯肉溝液、 唾液、 血液、 及び血清などの被検体中 の且. gingival is線毛抗原に対する抗体価も、 極めて簡単な操作で迅速 に検出可能であり、 一般の歯科診療室で、 いかなる旦. gingival isによつ て髡症した成人性歯周炎の過去及び現在の病態あるいは、 治療過程を迅 速かつ簡便に知ることができる。
    [0023] 本発明の研究によれば、 殊に旦. gingival is 3 8 1株の線毛抗原を感 作させて得られたラテックス粒子からなる診断用試薬を用いると ヒ ト被 検体中の種々の旦. gingival isの線毛抗原に対する抗体を感度よく検知 できることがわかった。
    [0024] すなわち、 且. gingival is 3 8 1株の線毛抗原を感作させたラテツク ス粒子は、 且. gingival is 3 8 1株の線毛抗原に対する抗体を吸着し、 その抗体を検知し得ると共に、 それ以外の多くの B . gingival is株の線 毛抗原に対する抗体も吸着することがわかった。 前記 3 8 1株以外の B . gingival is株と しては、
    [0025] B . gingival is R B 2 4 M - 2株、
    [0026] B . gingival is D / 2 6株、 B^. gingival is ATC C 3 3277株、
    [0027] B - gingival is W8 3株
    [0028] B · gingival is HW2 4 D - 1株、
    [0029] B . gingival is R B 22 D - 1株、
    [0030] B . gingivalis B H 1 8/1 0株、
    [0031] B . gingivalis 1 9 A 4株、
    [0032] B . gingivalis HG 379株、
    [0033] B . gingivalis H G 405株
    [0034] B . gingival is OMZ 3 1 4株
    [0035] B . gingival is OMZ 40 9株
    [0036] などの株が挙げられ、 これらの株の線毛抗原に対するに抗体に対しても 前記旦. ingivalis 3 8 1株の線毛抗原を感作させたラテックス粒子は 高い信鎮性をもって検出することができる。
    [0037] 以下、 本癸明について更に詳細に説明する。
    [0038] 《ラテックス粒子及びその調製 >
    [0039] 本発明の感作ラテツクス標品を製造するために用いるラテックス粒子 は、 通常、 免疫学的測定試薬に使用されるラテックス粒子であれば特に 制限はなく任意のものが使用でき、 その例としては、 例えばポリスチレ ン、 カルボキシル化ポリスチレン、 アミ ノ基を有するカルボキシル化ポ リ スチレン、 ポリ ビニル トルエン、 スチレンブタジエン共重合体、 カル ポキシル化スチレンブタジェン共重合体、 スチレン -ジビニルベンゼン - 共重合体、 ビニルトルエン第三ブチルスチレン共重合体、 ポリエステル、 ポリアクリル酸、 ボリメタクリル酸、 ボリアク リ ロニ ト リル、 ァク リロ 二トリル-ブタジエン - スチレン共重合体、 ポリ酢酸ビニルァク } レー ト、 ポリ ビニル- ピロ リ ドン、 塩化ビニル -ァク リ レー ト共重合体等の 合成高分子ラテックスの粒子があげられる。 さらにこれらの高分子ラテッ クス粒子はその表面を非ィオン界面活性剤等で処理したものであっても よい。 これら高分子ラテックスのなかでも特にポリ スチレンラテックス が好ましい。 ラテックス粒子の粒径は一般に 0 .0 1〜 1 0 .0 y"mの範 囲内にあることができ、 好ましくは 0 . 1〜1 .0 mの範囲内にあるの が望ましい。 さらにこのラテックスは通常、 凝集反応板法に使用される ことが多いので、 髙比重のラテツクス粒子であることが望ましい。
    [0040] 《旦. gingival isの線毛抗原の調製》
    [0041] 且. gingivalisの線毛抗原は、 旦. gingival isを嫌気的条件下で培養 し、 培養後菌体を集めて、 その線毛を分離する。 以下且. gingivalis3 8 1株-の線毛抗原を得る場合についてさらに具体的に説明するが、 線毛 抗原の調製はこの方法に限定されるわけではなく、 線毛を分離すること ができる方法であればその方法もまた使用できる。
    [0042] B.. gingivalis3 8 1株の線毛抗原を調製する場合は、 まず GAMブ ィヨン （日水製薬（株）製、 商品名） 、 Brain- Heart - I nfusionプロ ス （Difco) などにへミ ン、 メナジオン等を添加した培地に、 B . ging ivalis3 8 1株を接種して嫌気的条件下で約 3 7 °Cで培養すれば、 約 2 0時間またはそれ以後に多数の菌体が得られる。 これを集菌してピぺッ ティ ングなどにより物理的に線毛を剥離する。 次に、 線毛を硫安分画、 イオン交換クロマ トグラフ ィ一、 ゲル口過クロマ ト グラフ ィ 一に力 けて、 精製された旦. gingivalis3 8 1株の線毛抗原を得る。
    [0043] 抗体感作ラテツクスを所望とする場合には、 このようにして得られた 線毛抗原を免疫源と して用いて、 下記の如く してその抗体を調製するこ とができる。
    [0044] 他方、 抗原惑作ラテックスを所望とする場合には、 このようにして得 られた線毛抗原をそのまま前記の如くラテックスに感作させることがで きる。
    [0045] 《抗体の調製》 - 上記の如く して得られた B . gingival is線毛抗原を動物に免疫する。 例えばこの線毛抗原を F reundの完全アジュバンドと共にゥサギ、 ャギ などの動物の皮下又は筋肉内に注射して免疫し、 上記動物の血液からそ れ自体公知の方法に従って旦ニ ging ival is線毛抗原に対する抗血清を得 ることができる。
    [0046] —方、 上記線毛抗原でマウスを免疫し、 この脾細胞を取り出し、 マウ ス骨髄腫細胞とボリエチレングリコール等を用いて細胞融合させ、 ク口 一二ングした後、 gingival is線毛抗原に特異的に反応するモノク口 ーナル抗体を分泌するハイプリ ドーマを選択する。 のハイプリ ドーマ を培養することにより、 培地から B . gingival is線毛抗尿に特異的に反 応するモノ クローナル抗体を単離することができる。
    [0047] 《抗線毛抗体惑作ラテツクス粒子の調製》
    [0048] 上記 B . gingival is線毛抗原に対する抗血清又はモノクローナル抗体 をラテックス粒子に感作させるには、 それ自体知られている方法に従レ、、 物理的吸着法又は化学的結合法が用いられる。
    [0049] 例えば、 物理的吸着法では先ず精製された旦ニ gingival is線毛に対す る抗血清又はモノ クローナル抗体をグリシン緩衝生理食塩水で 1 0〜 1 0 0 0 μ g/mQ,, 好ましくは 1 0 0 ~ 5 0 0 gZmfiに希釈する。
    [0050] —方、 ラテックス粒子をグリシン緩衝生理食塩水で 5— 1 O mgZmfiに 調製して、 上記抗体溶液と等容量で混和したのち、 4〜4 0°Cにおいて 3 0分〜 2 4時間ゆるやかに撹拌しながら吸着させる。
    [0051] また、 化学的結合法では、 先ず精製された gingivalis線毛に対す る抗血清又はモノクローナル抗体を蒸留水で 1 0 ~ 1 0 0 0 gZmfi、 好ましくは 1 0 0〜5 0 0 gZnifiに希釈する。 一方、 蒸留水で 1 O mg Ζηιβに調製したラテツクス粒子懸濁液を、 例えば、 0 .0 1 ~ 0 . 1 Μ 1一 Ethyl— 3 - ^ - dimethylaminopropyU carbodi iinide hydroch. loride水溶液とを等量ずつ混和し、 室温で 2時間反応し、 次いで遠心分 離により回収したラテックス粒子を蒸留水で再懸濁し、 その懸濁液と上 記線毛抗原溶液を等量ずつ混和し、 4〜 4 0 °cにおいて 3 0分〜 2 4時 間ゆるやかに撹拌しながらラテツクス表面に抗体を結合させる。
    [0052] 物理的吸着法、 化学的結合法ともラテックス粒子表層で抗体の吸着あ るいは結合していない部分をゥシ血清アルブミ ン （以下 B S Aと略す） でブロッキングしたのち、 遠心分離して得られる感作ラテツクス粒子を、 0 . 1〜 1 .0 %の B S Aを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、 必要 あれば 0 .0 1〜0 .5 %のァゾ化ソーダを加えておくのが好ましい。 《線毛抗原感作ラテックス粒子の調製》
    [0053] 前記の如く して得られた且. gingivalisの線毛抗原をラテックス粒子 に感作させるためには、 それ自体知られている物理的吸着法と化学的結 合法が用いられる。 その具体的方法を例示すると、 物理的吸着法では、 先ず精製された旦. gingivalisの線毛抗原を例えばグリシン緩衝生理食 塩水で 1〜 1 0 0 0 ；" g/mQ 、 好ましくは 1 0 0 ~ 5 0 0 gZmfi 希釈する。
    [0054] —方、 ラテックス粒子をグリ シン緩衝生理食塩水で 5 m gZm£ に調 製して、 上記線毛抗原溶液と等容量で混和したのち、 4~ 4 0 °Cにおい て 3 0分〜 2 4時間ゆるやかに撹拌しながら吸着させる。
    [0055] また、 化学的結合法では、 先ず精製された旦. gingivalisの線毛抗原 を蒸留水で i ~ l 0 0 O i gZmfi 、 好ましくは 1 0 0〜 5 0 0；" m& に希釈する。 一方、 蒸留水で 1 O mgZmfi に調製したラテックス 粒子懸濁液を、 例えば 0.0 1〜0.1 M 1 - E thyl - 3 — (3 - dime thyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride水溶液とを等量ずつ 混和し室温で約 2時間反応させ、 次いで遠心分離により回収したラテツ クス粒子を蒸留水で再懸濁し、 その懸濁液と上記線毛抗屎溶液を等量ず つ混和し、 4〜4 0 °Cにおいて 3 0分〜 2 4時間ゆるやかに撹拌しなが らラテックス表面に線毛抗原を結合させる。
    [0056] 以上の物理吸着法、 化学的結合法のいずれの方法においても、 ラテツ クス粒子表層で線毛抗原を吸着もしくは結合していない部分を B S Aを 用いてブロッキングしたのち、 遠心分離して得られる感作ラテツクス粒 子を、 0.1〜 1.0 %の B S Aを含むリ ン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、 また必要があれば 0.0 1〜 0.5 %のァゾ化ソーダを加えておくのが好 ましい。
    [0057] 《被検体およびその処理 >
    [0058] 本癸明においては、 歯周炎の感染が予想されるヒ トの衩検体、 すなわ ち、 ^ gingivalisを含んでいると推測されるヒ 卜のプラーク（歯垢）、 齒肉溝液、 唾液などの被検体を前記抗体を惑作させたラテツクス粒子か らなる挨出試薬に接触させるが、 その場合、 上記被検体をそのまま直接 使用すると、 感作ラテツクス粒子と B . gingivalis以外の菌体との非特 異的反応が生じる可能性があり、そのため B . gingival isの判定が不確 実になることがある。
    [0059] さらに、 初期の成人性歯周炎患者のプラーク（齒垢）、 歯肉溝液、 唾液 等の被検体中には、 B . ging ival i sの菌体数は少なく、 そのままで被検 体を感作ラテックスと反応させても、 抗原量が少ないので凝集反応を感 知し難いこともある。 しかし被検体を B . gingival i sの線毛の抗原性が 失われない条件下で抽出処理及び Z又は溶菌処理すると、 ラテッ クス粒 子に吸着する線毛の実質的割合が増加し、 初期の成人性齒周炎患者の如 きプラーク（歯垢).、 歯肉溝液、 唾液などの中に含まれている菌体が少量 の場合であっても、 ラテックス凝集反応を感度よく特異的に起こさせる ことができる。
    [0060] 従って本発明において、 被検体の抽出処理及び Z又は溶菌処理を行う ことは、 線毛抗原の検出感度を増加するために極めて好ましい態様であ る。
    [0061] かかる被検体の処理は、 g ing ival isの線毛の抗原性が喪失しない 処理剤で処理すればよく、 好ましくは B . g ingival isの線毛を実質的に 変性せず、 且つ g ingival isに対し抽出、 溶菌作用を有するものが有 利に使用される。
    [0062] かかる処理に使用される処理剤と しては、 上記の如く g ingival is の線毛の抗原性が喪失しないものであればよいが、 一般には各種界面活 性剤、 カオ トロピックイオンなどが好適に使用される。
    [0063] 界面活性剤と しては、 陰イオン性界面活性剤、 陽イ オン性界面活性剤、 両性界面活性剤、 非イオン性界面活性剤、 ステロイ ド系界面活性剤等の いずれであってもよいが、 就中、 非イ オン性界面活性剤及びステロイ ド 系界面活性剤が好ましい。 また、 カオ トロピックイオンと しては、 グァ 二ジン塩酸塩、 尿素及び S C N -、 I _、 C 120 、 N 0 3 -、 B r -、 C (T、 C H 3 C O O—などのィオンが使用される。 これらカオ トロ ピックイオン としては、 中でもグァニジン塩酸塩及び尿素が好ましい。
    [0064] 以下、 処理剤として適用可能な界面活性剤及びカオトロピックイオン の具体例を示すが本髡明はこれらに限定されるわけではない。
    [0065] ( 1 )陰イオン性界面活性剤：例えば、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 テ ト ラ ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 ドデシルスルホン酸ナト リ ウム、 テ トラデ シルスルホン酸ナト リ ウム、 ドデシルベンゼンスルホン酸ナ ト リ ウム、 ドデシル— N -サルコシン酸ナ ト リ ウム、 など。
    [0066] ( 2 )陽イオン性界面活性剤：例えば、 ドデシルト リ メチルアンモニゥ ムクロリ ド、 テ トラデシルト リ メチルアンモニゥムクロ リ ド、 セチル ト リ メチルアンモニゥムブロ ミ ド、 ドデシルピリ ジニゥムブロ ミ ド、 セチ ルピリ ジニゥムクロ リ ド、 テ トラデシルアンモニゥムブロ ミ ド、 など。
    [0067] ( 3：)両性界面活性剤：例えば、 パルミ トイルリゾレシチン、 N - ドデ シルーべタイ ン、 ステアリル- N -ベタイ ン、 ドデシルー -ァラニン、 など。
    [0068] ( 4 )非イオン性界面活性剤： ポリオキシエチレングリ コール（7)デシ ルエーテル、 ポリオキシエチレングリ コール（n)ドデシルエーテル、 ポ リオキシエチレングリ コール（10)ト リデシルエーテル、 ポリオキシェチ レングリコール（11)テ トラデシルエーテル、 ポリオキシエチレングリ コ ール（n)セチルエーテル、 ポリォキシェチレングリ コ一ル（n)ステアリル エーテル、 ポリオキシエチレングリ コール（n)ォレイルエーテル、 ポリ ォキシエチレングリコ一ル（17)セチルー ステアリ ンエーテル、 ポリオキ シエチレングリコ一ノレ（n)p - t—ォクチノレフエニノレエーテノレ、 ポリオキ シエチレングリ コ ーノレ（n)p—ォクチノレフエ二メレエーテノレ、 ポリオキシェ チレングリ コール（n)p - ノニルフエニルエーテル、 モノ ラウ リ ン酸ソル ビタン、 モノパルミチン酸ソルビタ ン、 モノ ステアリ ン酸ソルビタ ン、 モノォレイ ン酸ソルビタン、 ポリ オキシエチレングリ コール（n)モノ ラ ゥ リ ン酸ソルビタン、 ポリオキシエチレングリ コール（n)モノパルミ チ ン酸ソルビタ ン、 ポリォキシエチレングリ コール（n)モノ ステアリ ン酸 ソルビタン、 ポリオキシエチレングリ コール（n)モノォレイ ン酸ソルビ タン、 ラウ リルジメチルァミ ンォキシ ド、 n-ォクチル - β - D - グ リ コシ ド、 ォクタ ノ ィルー Ν—メチノレグノレカ ミ ド、 ノナノ ィルー Ν—メチ ルグルカ ミ ド、 デカノ ィル— Ν - メチルダルカ ミ ド、 η-ヘプチル— S - D -チォグルコシ ド、 n-ォクチルー - D -チォグルコシ ド、 など。
    [0069] (5)ステロイ ド系界面活性剤：例えば、 コール酸ナ ト リ ウム、 デォキ シコール酸ナ ト リ ウム、 ケノ デォキシコール酸ナ ト リ ウム、 タ ウロコ ー ル酸ナ ト リ ウム、 タウロデオキシコール酸ナ ト リ ウム、 ジギトニン、 3 - [ ( 3 -コールアミ ドブロ ピル） ジメチルアンモニォ]一 1 - プロパンサ ルフェイ ト、 3 - [ (3 -コールァミ ドプロピル） ジメチルア ンモニォ] - 2 -ハイ ドロキシ - 1 -プロパンサノレフェイ ト 、 など。
    [0070] (6)カオ トロピックイオン ：例えば、 C Ci23C O O Na、 NaS C N、 NaCfi04、 Nal、 NaBr、 NaN 03、 NaCfi、 尿素、 グァニジン塩酸 塩、 など。
    [0071] 本発明の処理剤は、 前述したように、 B . gingivalisの線毛の抗原性 を喪失しないもの、 好ましくは線毛を実質的に変性せず且つ口腔内に存 在する細菌に対し溶菌作用を有するものであればよく、 比較的簡単なテ ス トにより好適なものを選択することができる。 すなわち、 処理剤の水溶液中に口腔内細菌を入れ、 菌体は一部又は全 て溶解するが、 その線毛はその抗原性が喪失しない程度に存否するか、 実質的に変性されないで存在することを調べることによって本発明の処 理剤として使用しうるか否かを選別することができる。
    [0072] 本癸明において被挨体の抽出及び 又は溶菌処理に使用される処理剤 は、 一般的に種々の緩衝液に溶解して使用され、 例えば界面活性剤の場 合、 0.5~7重量％、 好ましくは 1〜5重量％の濃度で使用され、 ま た力オト ビックィォンの場合 0.1〜 1 0Μ、 好ましくは 1〜 8Μの 濃度で使用される。
    [0073] 前述した処理剤による被検体の処理は通常 4〜 40°C、 好ましくは 2 0〜3 7°Cで 1分〜 2 4時間、 好ましくは 5分〜 1 0分間行うのが望ま しい。
    [0074] 《抗原の検^》
    [0075] 前記したヒ トの被検体或いは抽出、 溶菌処理した被検体は、 本凳明の 抗体感作ラテックス粒子と接触させることによつて被検体中の線毛抗原 の有無又は量を調べるために使用される。 その際抽出、 溶菌処理した場 合には、 処理に使用した薬剤は除去しなくてもよく、 また除去してもよ レ、。
    [0076] また、 抗線毛抗体感作ラテックス粒子は、 通常、 リン酸緩衝液中に懸 濁させて使用される。 例えば 0.1 ~ 1重量％の B S Aを含むリン酸緩 街生理食塩水を用い、 これにラテックス粒子が 0.5~ 1 .0重量％含む 懸濁液となるように調整して使用される。
    [0077] かく して得られた懸濁液と、 被検体又は抽出、 溶菌処理した被検体の 液とを混合することにより、 ラテックス粒子の凝集反応を調べる。 懸濁 液と被検体液との混合は、 混合させた液中のラテックス粒子の濃度が 0 . 3〜 1 . 5重量％、 好ましくは 0 . 5〜 1 . 0重量％となるように、 懸濁 液及び被検体液のそれぞれの濃度を予め調整しておくのが望ましい。 混 合された液中のラテツクス粒子の濃度が前記範囲よりも低くなると、 ラ テックス粒子の凝集が検知し難くなる傾向になるので望ましくない。 凝集反応は上記混合液を凝集板上に滴下し、 例えば室温にて約 1 ~ 1 0分間、 好ましくは 2〜 5分間放置することにより行なうことができ る。 凝集したラテックス粒子の有無又は程度を肉眼で観察するか、 或い は光学的方法 （例えば、 分光光度計を用いて透過光又は散乱光を測定す る方法） によって測定することができる。
    [0078] 《抗体の検出》
    [0079] 本発明においてはまた、 前述の如く して得られた旦. ging ival isの線 毛抗原を感作させたラテッ クス粒子の懸濁液と、 ヒ トの被検体、 例えば 歯肉溝液、 唾液、 血液又は血清などを混合しラテッ クス粒子の凝集状態 を観察又は測定することによ り、 被検体中の互. gingival i sの線毛抗原 に対する抗体の有無又は量を調べることもできる。
    [0080] 殊に前述したように且. g ingival i s 3 8 1株の線毛抗原をラテックス 粒子に吸着させた感作ラテックス粒子を用いると、 種々の旦. gingival H菌株により発症した成人性歯肉炎患者の歯肉溝液、 唾液、 血液または 血清などの検体中に含まれている種々の旦. g ing ival is菌体に対する抗 体を検出できるので、 各種且. g ing ival is菌株のそれぞれの線毛抗原で 感作したラテックス粒子を用意しなく ても、 成人性歯周炎の診断が可能 であるという利点がある。 本発明による旦. g ing ival isの線毛抗原感作 ラテックス標品を用いることにより、 すなわち、 該ラテックス粒子の例 えば 0.1 %ゥシ血清アルブミン · リン酸緩衝生理食塩水 （B S A - P B S) 0.5〜 1 .0 %懸濁液と、 患者の歯肉溝液、 唾液、 血液、 及び血 清などの被検体を約 1 0 ： 1 (容量） の割合で例えば凝集反応板上に滴 下し、 次いで室温にて約 3 ~ 5分ゆるやかに揺り動かして反応させた後、 明るいところでラテックス粒子の凝集状態あるいはその程度を観察する か、 前述の如き光学的手法によって評価し、 且. gingival is線毛抗原に 対する抗体価を測定することにより、 成人性歯肉炎の診断を迅速かつ簡 便に行なうことができる。
    [0081] 本発明に従って、 前述のように被検体中の旦. gingivalisの線毛抗原 に対する抗体を調べる前に、 予め被検体を、 前処理して被検体中に存在 する菌体並びに血球細胞を溶解処理しておくと、 ラテックス粒子との非 特異的凝集反応が軽減され測定感度が増加するのでより好ましい。 この 溶解処理には、 菌体並びに血球細胞を溶解しうる作用を有するものが使 用されるが、 その例としては、 前記した如き界面活性剤又はカオトロピッ クイオンが挙げられる。
    [0082] 前述した被検体の菌体及び血球細胞の溶菌処理に使用される試薬は、 一般的に種々の緩衝液に溶解して使用され、 例えば界面活性剤の場合、 0.5~7重量％、 好ましくは 1〜5重量％の濃度で使用され、 また力 オト口ピックィオンの場合、 0.1〜 1 0M、 好ましくは 1〜8 Mの濃 度で使用される。
    [0083] 前述した菌体並びに血球細胞の溶解処理は、 通常 4〜4 0。C、 好まし くは 2 0~3 7°Cで 1分〜 2 4時間、 好ましくは 5分〜 1 0分間行うの が望ましい。
    [0084] 発明を実施するための具体的態様 次に本発明を調製例、 試験例および実施例によってさらに詳細に説明 するが、 本発明はこれに限定されるものではない。
    [0085] 調製例 1
    [0086] B . gingivalis 3 8 1株からの線毛抗原の調製。
    [0087] B . gingivalis 3 8 1株を G A Mブイ ヨン培地 （日水製薬） で嫌気 的条件下で大量培養後、 遠心分離により集菌した。 その菌体を 2 0 mM ト リス塩酸緩衝液 （PH 7.4) + 0.1 5 M NaCi2+ 1 0 mM MgCj22 に懸濁しビベッティ ング後マグネティ ックスターラーで撹拌して物理的 に線毛を剥離した。
    [0088] 遠心分離により菌体を除去し、 その上清を 4 0 %飽和硫安沈澱し、 得 られた沈渣を 2 OmMト リス塩酸緩衝液 （PH 8.0) に溶解後、 透析に より脱塩した。
    [0089] 次に D E A E - S epharose (pharraacia) を用いたィオン交換ク口マ トグラフィ一により食塩の濃度勾配をかけ、' 0.1 5 M食塩で溶出して くる画分を線毛抗原と した。
    [0090] さらに、 これを Sephacryl S - 5 0 0 (Pharmacia) を用いたゲル 濾過ク口マ トグラフィ一にかけ単一のピークであることを確認した。 調製例 2
    [0091] 線毛抗原に対する抗血清の調製。
    [0092] 調製例 1の線毛抗原 （ 1 mg) をゥサギ 1 匹当り 1 mi2の F reundの完全 アジュバン トにより油中水滴型乳剤と して皮下に 3週間おきに合計 2回 注射して免疫し、 最終追加免疫から 7 日目に全採血し、 常法通り抗血清 を分離した。
    [0093] 調製例 3 線毛抗原に対するモノクローナル抗体の調製。
    [0094] 調製例 1の線毛抗原 （1 0 0 /^g) をマウス 1匹当り 0.1 m の F reun dの完全アジュバントと共に油中水滴型乳剤として、 BalbZcマウス (早） 、 皮下に 3週間おきに合計 2回注射して免疫し、 追加免疫後、 3 日目に Balb/cマウス、 脾細胞を採取し Eagle's MEMで 3回洗铮し た。
    [0095] —方、 Balb/cマウス由来のミエローマ細胞 （S P2Z0) を Eagle's MEMで 3回洗浄する。 ミエローマ細胞と脾細胞を Eagle's MEM中 で 1 ： 1 0に混合し、 1 , 20 Orpml 0分遠心後、 上清を除去しペレツ トを良くほぐして、 0.5mfiのポリエチレングリコール 40 0 0 ( 1 mfi) + Eagle's MEM C 1 mj2) +DMS OC0.3 5mi2) の混合溶液を 3 7 °C下でペレツ トに静かに滴下しながら、 1分間混合した。 次に Eagle's MEM 1 Omfiを少しずつ加え、 - 1 , 20 0 rpm 1 0分遠心し、 上清を 除去した。
    [0096] ペレッ トに 1 0 %ゥシ胎児血清を含む R PM I - 1 64 0を加え 5 x 1 05細胞 mfiぐらいに浮遊させ 9 6穴マイクロタイターブレートに 1 0 0 i2ずつ分注した。 その後、 ^1八丁培:¾、 HT培地によりハイプリ ドーマを選択し 1 5日目頃に調製例 1の線毛抗原をコーティ ングした 9 6穴マイクロタイタープレートを用いて、 E L I S A法により B . ging ivalis 38 1株の線毛抗原に対する抗体産生ハイブリ ドーマをスクリ 一二ングした。
    [0097] スクリーニングしたハイプリ ドーマは限界希釈法によりクローニング した。 限界希釈法は i 0 %ゥシ胎児血清を含む R PM I— 1 6 40培地 にハイ ブリ ドーマ 5細胞 Zrai2、 Balb/cマウス胸腺細胞 5 X 1 06細胞 /πι を加え、 9 6穴マイクロタイタープレー トに 0.2mi2ずつ分注し、 調製例 1の線毛抗原に反応するモノクローナル抗体を分泌する 1 コロニ —の Wellを選び出した。 この操作を 2回繰り返しクローニングを完了 し/^ *
    [0098] モノ クローナル抗体の調製はハイブリ ドーマを無血清培地にて培養し 培養液から抗体を採取することにより行った。
    [0099] 次に、 得られたモノ クローナル抗体を硫安塩析、 D E AEイ オン交換 クロマトグラフィー、 ならびにゲル口過クロマ トグラフィー後、 濃縮し て、 O u c h t e r l o n y法により抗体のサブクラスを調べた。 なお、 ゥサギ抗マウス I g G!、 I g G2 I g G2b、 I g G3、 I gMは L I TTON B I O N E T I C S社製の標品を使用した。 その結果 N o . - 1 は I gM、 N o .-2は I g G N o .- 3は I g G！であった（第 1表 参照）。
    [0100] 第 1表 モノ クローナル 体のサブクラス
    [0101] 調製例 4
    [0102] 抗体感作ラテックス粒子の調製
    [0103] 日本合成ゴム（株）のラテックス粒子 G 2 8 0 1 をグリ シン緩衝生理食 塩水で 0.5 %となるように懸濁し、 それに等量の調製例 3で得られた モノ クローナル抗体 No.1の 0.1 溶液を混合し、 3 7。Cで 9 0 分間反応させた後、 0.1 %ゥシ血清アルブミン · リン酸緩衝生理食塩 水（B S A— P B S )でブロッキングし、 最終的に B S A— P B Sで 0. 5 %に懸濁して抗体感作ラテツクス粒子溶液を調製した。
    [0104] 調製例 5
    [0105] B_. gingivalisS 8 1株の線毛抗原感作ラテックス標品の調製。
    [0106] 日本合成ゴム （株） のラテックス粒子 G 2 8 0 1をグリシン緩衝生理 食塩水で 0.5%となるように懸濁し、 それに等量の調製例で得られた 旦. gingival is 3 8 1株の線毛抗原の 1 0 0 ηβダリシン緩衝生理 食塩水溶液を混合し、 3 7 °0で 9 0分間反応させた後、 0.1 %ゥシ血 清アルブミ ン · リ ン酸緩衝生理食塩水 （B S A— P B S) でブロッキン グし、 最終的に B S Α— P B Sで 0.5 %になるように懸濁し線毛抗原 感作ラテックス標品を調製した。
    [0107] 試験例 1 (得られたゥサギ抗血清およびモノクローナル抗体と口腔内常 在菌との反応）
    [0108] 前記調製例 1の線毛抗原に対するゥサギ抗血清及びモノクローナル抗 体 No.1、 2、 3と下記口腔 B a c t e r o i d e s 2 1種株と抗原抗 体反応をラテツクス凝集反応により調べた。
    [0109] (a) ヒ ト口腔内に存在し、 成人性歯周炎を発症させる B . g i n g i a 1 i sに属する下記株； .
    [0110] B— · g i n g i v a l i s J 8 1珠、
    [0111] B . g i n g i v a 1 i s RB 2 4M- 2株、
    [0112] B . g i n g i v a l, i s 6/2 6株、
    [0113] B . g i n g i v a l i s ATC C 3 3 2 7 7株、 B s n s v a 1 s W8 3株、
    [0114] B l n g l v a 1 s HW2 4 D - 1株、
    [0115] B S i g v a 1 s R B 2 2 D— 1株、
    [0116] B . g i n g v a 1 s B H 1 8Z 1 0株、
    [0117] B g i n g i v a 1 s 1 9 A 4株、
    [0118] B . g i n g v a 1 s H G 3 7 9株、
    [0119] B . i n g i v a HG 4 0 5株、
    [0120] B - g i n g v a OMZ 3 1 4株及び
    [0121] B g i n g i v a i s OMZ 4 0 9株
    [0122] (b ) ヒ ト口腔内 i 存在するが成人性歯周炎を発症させない下記株
    [0123] B . e n d o d o n a 1 i s H G 3 7 0株、
    [0124] B . e n d o d o n a 1 i s H G 4 1 3株、
    [0125] B . e n d o d o n a 1 i s H G 5 9 1株、
    [0126] B . 'a s a c c h a r o l y t i c u s N C T C 9 3 3 7 - 7 6株、 B . m e l a n i o g e n i c u s H G 4 6 5珠、
    [0127] B . m e l a n i n o g e n i _c u_s H G 5 5 7株、
    [0128] B . i n t e r m e d i u s ATC C 2 5 6 1 1株、
    [0129] B . b u c c a e OMZ 3 3 0株
    [0130] ラテックス凝集反応は、 下記の方法により行った。
    [0131] 上記 2 1種の菌株を、 それぞれ純粋培養し、 その菌体懸濁液 4 >«ώを 採取し、 4 >"βの 6 Μ、 グァニジン塩酸塩溶液と和し、 5分間、 室温で 静置した。 これに調製例 2および 3で得られた Β . g i n g i v a l i 3 8 1線毛抗原に対するゥサギ抗血清およびモノク口一ナル抗体 No. - 1、 No.-2および No. -3でそれぞれ感作したラテックス粒子懸濁液 を 40；" £加え、 凝集反応板上で 3分間、 混和した後、 下記の基準に従 い凝集の程度を判定した。
    [0132] 凝集の判定基準；
    [0133] - ：凝集を認めない。
    [0134] 士 ：辺緣部にわずかに凝集塊を認める。
    [0135] + ：全体にわたり小さな凝集塊を認める。
    [0136] + + ：全体にわたり大きく凝集塊を認める。
    [0137] + + + ：凝集塊のみとなり、 白濁が消失する。
    [0138] (一、 士は凝集陰性、 +、 +十、 + + +は凝集陽性。 ）
    [0139] 第 2表に示されるようにゥサギ抗血清およびモノクローナル抗体 No. -1、 2、 3は全ての B · g i n g i v a l i sとは反応したが、 B . e n d o a o n t a l i s、 B - a s a c_c h a— r_o l y— t_i_ C -ii_s、 B . me 1 a n i n o g e n i c u s N B . i n t e r m e d i u sお よび B . b u c c a e < は全く反応せず B . _^_i n g i v a l i sとの 間に高い特異性を認めた。
    [0140] 第 2表（ゥサギ抗血清およびモノクローナル抗体と口腔 Bac teroidesとの抗原抗体反応）
    [0141] 試験例 2
    [0142] プラーク（歯垢）中の旦. g i n g i v a l i s線毛抗原の検 ffi及び B . g i n g i v a l i s菌体の同
    [0143] 健常者（6名）及び成人性歯周炎患者（6名）の臼歯部のプラーク（齒垢） をスケーラーを用いて採取し、 4 βの 6M、 グァニジン塩酸塩溶液と 和し、 5分間、 室温で静置した。 これに調製例 4で得られた旦. g i n g i v a I i s線毛抗原に対するモノ クローナル抗体 No.1で惑作した ラテックス粒子懸濁液を 40 £加え凝集反応板上で 3分間、 混和した 後、 試験例 1のラテックス凝集の判定基準に従い、 凝集の程度を判定し た。
    [0144] —方、 健常者（ 6名）及び成人性齒周炎患者（ 6名）のプラーク（歯垢）中 の旦. g i n g i V a 1 i sの同定は、 下記のようにして行った。
    [0145] 即ち、 輸送培地（R T F : R e d u c e d T r a n s f e r F 1 u i d )にプラーク（歯垢）を懸濁し、 ゥサギ脱繊血及びへミ ン、 メナジ オンを含む C D C培地（C 0 n t r 0 1 D e s e a s e C e n t e r開発）に播種し、 嫌気条件下で数日間培養する。 生育のみられたコロ ニーのうち、 黒色化したコロニーを選びこれを分離し、 純培養後、 R a P I D ANA S y s t e m(M c D O NN E L L D O U G L A S社製）により同定試験を行なった。さらに、 旦. g i n g i V a 1 i s と同定されたものの培養上清をガスクロマ トグラフィーにかけ、 フエ二 ル齚酸の産生を調べることにより^^ g i n g i V a 1 i sであること を再確認した。
    [0146] 第 3表に示されるように健常者（6名）のプラーク（歯垢）ではラテック ス標品の凝集は認めず、 全て陰性の結果を示した。 また、 プラーク（歯 垢）中に存在する細菌の同定試験では B . g i n g i v a l i sを認め なかった。 一方、 成人性歯周炎患者（6名）のプラーク（歯垢）ではラテツ クス標品の凝集を認め、 全て陽性の結果を示した。 一方、 プラーク（歯 垢）中に存在する細菌の同定試験では B . g i n g i V a 1 i sを認め た。
    [0147] 第 3表（プラーク（歯垢））中の B . g i n g i v a l ! s線毛抗原の検出） 被検者 No. ラテック ス プラーク（歯垢）
    [0148] 凝集反応 C B. ingival
    [0149] isの有無
    [0150] 健常者 1 ― 無
    [0151] " 2 士 叛
    [0152] " 3 ―
    [0153] " 4 ― 無
    [0154] " 5
    [0155] " 6
    [0156] 成人性歯周炎
    [0157] 患者 7 + 有
    [0158] " 8 + + 有
    [0159] " 9 + 有
    [0160] " 1 0 + 有
    [0161] 〃 1 1 + + + 有
    [0162] 〃 1 2 + + 有 試験例 3
    [0163] 成人性歯周炎患者および健常者のプラーク（歯垢）と各種処理剤を作用 させた場合のラテックス凝集反応
    [0164] この試験例 3は、 処理剤の種類を種々変えて、 それがラテックス凝集 反応に及ぼす影響を調べるために行ったものである。
    [0165] 即ち、 試験例 2の成人性歯周炎息者 No.1 1および健常者 No.1の臼 歯部のプラーク（歯垢）をスケーラーを用いて採取し、 下記第 4表に示し た濃度の処理剤 4 と和し、 5分間、 室温で静置した。
    [0166] これに試験例 4で得られた Β . g i n i v a l i s線毛抗原に対す るモノ クローナル抗体 No. — 1で感作したラテックス粒子懸濁液を 4 Ο β加え、 凝集反応板上で 3分間、 混和した後、 試験例 1のラテック ス凝集の判定基準に従い、 凝集の程度を判定した。
    [0167] 第 4表（成人性歯周炎患者および健常者のプラーク（歯垢）と各種処理剤 を作用させた場合のラテックス凝集反応） 処理剤の種類 ラテックス凝集反応
    [0168] 濃度
    [0169] 成人性齒周炎患者 謹
    [0170] 1.ポリオキシエチレングリ 2% + +
    [0171] コール（n)p- 1-ォクチル
    [0172] フエニルエーテル
    [0173] 2.n-ォクチル- -D- 2.5% + + + —
    [0174] グリ コシ ド
    [0175] 3.ノナノィル -N-メチル 2% + + +
    [0176] グルカミ ド
    [0177] 4.n-へブチル - - D-チォ 2.6% + + +
    [0178] グノレコシ ド
    [0179] 5.n-ォクチル- - D-チォ 2.2% + + ― グルコシ ド
    [0180] 6.ネ 1 2% + + + ―
    [0181] 1 ώ + + +
    [0182] 8.尿素 8M + + +
    [0183] 9.グァニジン塩酸塩 6M + +十
    [0184] 10.なし + + 表中氺 1は、 3 - [ (3 -コールアミ ドプロピル） ジメチルアンモニォ]
    [0185] - 1 -プロパンサルフェイ ト、
    [0186] * 2は、 3- [ ( 3 -コールアミ ドプロピル） ジメチルアンモニォ]
    [0187] - 2-ノヽィ ドロキシ - 1 -プロパンサルフェイ ト、 9のグァニジン塩酸塩は試験例 2の結果を併記した。 試験例 1
    [0188] 且- gingivalis3 8 1株の線毛抗原感作ラテックス標品とヒ 卜の各種口 腔 B acteroidesの菌体抗原に対するゥサギ抗血清とのラテックス凝集反 応0 .
    [0189] 下記 21種の菌株が使用された。
    [0190] (a) ヒ トロ腔内に存在し、 成人性歯周炎を発症させる旦. gingival! さに属する下記株；
    [0191] B.gingivalis ό 8 丄 ゝ
    [0192] B.gingivalis RB24M- 2株、 B.gingivalis 6/26株、
    [0193] B.gingivalis ATCC33277株、 E.gingivalis W83株、
    [0194] B.gingivalis HW24D-1株、 B.gingivalis RB22D-1株、
    [0195] B.gingivalis BH18/10株、 B.gingivalis 19A4株、
    [0196] B.gingivalis HG379株、 E.gingivalis HG405株、
    [0197] B.gingivalis OMZ314株、及び互， gingival is OMZ409株
    [0198] (b) ヒ ト口腔内に存在するが成人性齒周炎を発症させない下記株； 旦- endodontalis HG370株ゝ 且- endodon talis HG413株ゝ B - endodont alis HG591株、 且- asaccharolyticus NCTC9337 - 76株、 B · melaninoge nicus NG465珠ゝ B_- melaninogenicus HG557株、 B · intermedins ATCC 25611株、 旦. buccae OMZ330株、
    [0199] 上記 2 1種の菌株を、 それぞれに適した培養方法にて大量培養後、 遠 心分離により集菌する。 その菌体を好気的条件下にて処理して死菌とし、 リン酸緩衝生理食塩水 （P H 7.4) で 2 m ノ mfiに懸濁する。 次に、 ゥサギ 1匹当り 1 m の死菌体をそれぞれ Freundの完全アジュバン トを 用いた油中水滴乳剤として皮下に、 3週間おきに合計 2回注射して免疫 し、 最終追加免疫から、 7 日目に採血して、 それぞれの菌株に対する抗 体価を一元放射性免疫拡散法などにより確認したのち、 それぞれの抗血 清を常法により分離した。
    [0200] 上記方法により得た各種菌株に対するゥサギ抗血清（4 )と調製例 5で調製した互. ging ival is 3 8 1株の線毛抗原感作ラテックス標品 （4 0 μ Ά ) を凝集反応板上にて、 3分間、 十分混和したのち、 明るい場所 でラテックス粒子の凝集の程度を判定した。
    [0201] ラテックス凝集反応の判定は下記基準に従って 5段階に評価した。 そ の結果を第 5表に示す。
    [0202] 凝集の判定基準
    [0203] - ：凝集を認めない。
    [0204] 土 ：辺縁部にわずかに凝集塊を認める。
    [0205] + ：全体にわたり小さな凝集塊を認める。
    [0206] + + ：全体にわたり大き く凝集塊を認める。
    [0207] + + + ：凝集塊のみとなり、 白濁が消失する。
    [0208] (一、 土は凝集陰性、 十、 + +、 + 十 +は凝集陽性を示す）
    [0209] 5表 （旦- gingival is 3 8 1株の線毛抗原感作ラテツクス標品と各種 口腔 Bacteroidesに対するゥサギ抗血清とのラテツクス凝集反応） 上記第 5表に示されるように、 ヒ ト成人性歯周炎を発症させる且. gi ngivalisの各種株に対するゥサギ抗血清は供試したラテツクス標品と全 て凝集反応が陽性と認められた。
    [0210] —方、 ヒ ト成人性齒周炎を発症させない B . endodontalisH G 3 7 0 株、 同 H G 4 1 3株、 同 5 9 i株、 且. asaccharolyticusN C T C 9 3 3 7— 7 6株、 旦. melaninogenicusH G 4 6 5株、 同 H G 5 5 7株、 B.. intermedius2 5 6 1 1株及び旦. buccaeO M Z 3 3 0株に対する ゥサギ抗血清は、 供試ラテックス標品と実質的に凝集反応が認められず 陰性と判定された。
    [0211] このように、 本発明の旦. gingivalisの線毛抗原感作ラテックス粒子 は、 ヒ ト成人性歯周炎を発症させる B . gingivalisの各種菌株の抗血清 に対して凝集反応が特異的に認められることが確認された。
    [0212] 試験例 5
    [0213] (健常者および成人性歯周炎患者の検体中の各種旦. gingivalis菌株に 対する抗体の検出）
    [0214] 6名の健常者 （プラーク（歯垢） 中に成人性歯周炎を発症させる且. g ingivalisが検出されなかった者。 ) 及び 6名の成人性歯周炎患者の歯 肉溝液、 唾液、 血液、 及び血清 （各々、 4 >«β ) に前記調製例 5で得ら れた且. gingiv lis 3 8 1株の線毛抗原感作ラテックス標品 （ 4 0 /" β ) を凝集反応.板上で 3分間、 十分、 混和したのち、 明るい場所でラテック ス粒子の凝集の程度を判定した。 ラテックス凝集反応の判定は試験例 4 の判定基準に従った。 その結果を第 6表に示す。 第 6表
    [0215] 嫿常者及び成人性齒周炎患者の検体中の各種旦. gingiva l is菌株に対す る抗体の検出及び凝集の程度。
    [0216] 第 6表に示すように健常者 6名のうち、 4名はラテックス凝集反応が 陰性であつたが、 2名は凝陽性であった。 このよ う に凝陽性を示した健 常者は過去にヒ ト成人性歯周炎を発症するには至っていないが、 B . g i ngival is菌により感染したことがあると診断できる。
    [0217] 一方、 成人性歯周炎患者 6名は、 全てラテックス凝集反応陽性であつ 試験例 6
    [0218] 成人性歯周炎患者及び健常者の齒肉溝液と各種処理剤を作用させた場合 のラテックス凝集反応。
    [0219] この試験例 6は、 処理剤の種類を種々変えて、 それがラテックス凝集 反応に及ぼす影響を調べるために行ったものである。 即ち、 試験例 5の 成人性齒周炎患者 N 0 - 1 1及び健常者 N 0.1の歯肉溝液を採取し、 下記第 7表に示す濃度の処理剤 4 i2 と和し、 5分間、 室温で静置した。
    [0220] これに調製例 5で得られた旦. gingivalis3 8 1株の線毛抗原で感作 したラテックス粒子懸濁液を 4 0 "β 加え、 凝集反応板上で 3分間、 混 和した後、 試験例 4のラテックス凝集の判定基準に従い、 凝集の程度を 判定した。 その結果を第 7表に示す。
    [0221] 表 （成人性歯周炎患者及び馐常者の歯肉溝液と各種処理剤を作 用させた場合のラテツクス凝集反応） ラテックス凝集反応 処理剤の種類 濃度
    [0222] 成人性歯周炎息者 健常者 、ポリォキシエチレン
    [0223] グリコール（n)P- 1 - ォクチノレフエニノレエ
    [0224] 一テル 2% ++ 、11-ォクチル -0-グル
    [0225] コシ ド 2-5¾ +++ 、ノナノ ィル メチル
    [0226] グルカ ミ ド 2% +++ - 、n-へブチル -J8-D-チォ
    [0227] グルコシ ド 2.6% +++ 、n-ォクチル - D-チォ
    [0228] グルコシ ド 2.2% ++ - 、3- [3-コールァ ミ ドプ
    [0229] 口 ピソレ）ジメチソレアン
    [0230] モニォ ] -1-プロパン
    [0231] サノレフェイ ト 2% +++ - 、 3 - [(3-コールァ ミ ド
    [0232] プロ ピル）ジメチルァ
    [0233] ンモニォ] - 2-ハイ ド
    [0234] 口キシ- 1-プ口パンサ
    [0235] ルフェイ ト 2% +++ 、尿素 8M +++
    [0236] 、グァニジン塩酸塩 6M +++
    [0237] 、なし + + 産業上の利用可能性
    [0238] 以上述べたとおり、 本発明の試薬及び方法を用いれば、 歯周病の病原 菌である旦. gingival is又はそれに対する抗体を迅速かつ簡便に、 高感 度で特異的に検出することができ、 歯周病の早期発見、 治癒状態の診断 等に利用することができる。
    权利要求:
    Claims

    請求の範囲
    1 - ノくクテロイデス · ジ'ンジ、ノく リ ス ぐ B acteroides gingival is) の 線毛抗原に対する抗体を感作させたラテツクス粒子からなることを特徵 とするパクテロイデス · ジンジバリ ス菌体の検 ffi用試薬。
    2 . 該抗体が抗血清又はモノ クロナール抗体である請求の範囲第 1項 記載の試薬。
    3 - パクテロイデス · ジンジバリ スの線毛抗原に対する抗体を感作さ せたラテツクス粒子の懸濁液及び処理剤よりなるバクテロイデス · ジン ジバリス菌体を検 ffiするためのキッ ト。
    4 . 該処理剤が、 パクテロイデス · ジンジバリスの線毛を実質的に変 性させることのない界面活性剤又はカオ トロピックィオンである請求の 範囲第 3項記載のキッ 'ト。
    5 - 該処理剤が、 バクテロイデス · ジンジバリ スの線毛の抗尿性を実 質的に喪失させない処理剤である請求の範囲第 4項記載のキッ ト。
    6 . 請求の範囲第 1項記載の検 K用試薬を被検体と接蝕させて凝集像 の有無を判定することを特徴とする被検体中のパクテロイデス · ジンジ バリス菌体の検出方法。
    7 . 該被検体がプラーク （歯垢） 、 歯肉溝液または唾液である請求の 範囲第 6項記載の方法。
    8 . 該被検体に、 予めパクテロイデス ' ジンジパリ スの線毛の抗原性 を実質的に喪失させない処理剤を作用させる請求の範囲第 6項記載の方 法。
    9 . 該処理を界面活性剤及びカオトロピックィオンから選ばれる処理 剤を用いて行なう請求の範囲第 6項記載の方法。
    1 0 . バクテロイデス · ジンジバリ スの線毛抗原を感作させたラテツ クス粒子からなることを特徵とする歯周病の診断用試薬。
    1 1 . バタテロイ デス . ジンジバリ スがバクテロイ デス . ジンジバリ ス 3 8 1株である請求の範囲第 1 ひ項記載の試薬。
    1 2 . 請求の範囲第 1 0項記載の診断用試薬を被検体と接触させて凝 集像の有無を判定することを特徵とする歯周病の診断方法。
    1 3 . 被検体が、 歯肉溝液、 唾液、 血液又は血清である請求の範囲第 1 2項記載の診断方法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1990-05-03| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1990-05-03| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): DE FR GB IT |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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