• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1990001542A1
    申请号:PCT/JP1989/000811
    申请日:1989-08-09
    公开日:1990-02-22
    发明作者:Jun Kazami；Haruji Nakamura；Toshio Goto
    申请人:Toray Industries, Inc.；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] ルシフェラーゼ、 それをコードする遺伝子およびルシ フェラーゼの生産方法
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本発明は、 生物発光反応を用いた分析法に有効な純化 された酵素ルシフェラーゼ及びそれをコードする遺伝子 に関する。 さらに本発明は、 前記遺伝子が挿入された新 規組換え体ベクター D N A、 該ベクター D N Aを有する 形質転換体、 及び該形質転換体を用いたルシフェラーゼ の生産方法を提供する。
    [0005] 背 景 技 術
    [0006] ゥミホタル ( Cypr i dina h i i g en orf i i ) は、 日本沿岸 に生息する海産甲殻類で、 刺激を受けて海水中に青白い 発光液を放出する。 発光は基質であるルシフェリンを酵 素であるルシフェラーゼにより酸化することによって起 こり、 ホタルや発光バクテリアの発光のように他の必須 成分を必要としない非常に単純な発光系であり、 微量分 析法への利用が期待される。
    [0007] しかしながら、 一般にルシフェリンは化学的に合成す ることによって大量に得ることができる力 ルシフェラ ーゼは酵素であるため化学合成ができず、 大！:に得るこ とは困難である。 ゥミホタルのルシフェラーゼの場合も 同様で、 充分に純化されたルシフェラーゼは得られてお らず、 海洋汚染の進行でゥミホタル自身の採集量が激減 したことと相まって、 量的な供給が保証されていない。 それ故に、 遺伝子組換え技術を利用した該酵素の大量生 産法の確立が期待されてきた。
    [0008] 本発明は、 高度に純化されたルシフェラーゼの化学合 成法、 もしくは遺伝子組換え法による合成を可能ならし め、 高純度の該蛋白質を大量に得るために、 該蛋白質を 特定する遺伝子配列を得、 クローニングされた遺伝子配 列を動物細胞、 酵母、 大腸 等で発現することを可能に し、 それらの細胞を用いて、 高純度の該酵素を大量に得 ることを目的とする。
    [0009] 発 明 の 開 示
    [0010] 本発明は第 1図のアミノ酸配列を有するルシフェラー ゼ、 及びそれをコードする遺伝子、 該遺伝子を含んでな る新規組換え体ベクター D N A、 及び該べクター D N A により宿主細胞を形質転換してなる形質転換体、 及び該 形質転換体を用いたルシフエラーゼの生産方法である。
    [0011] 図面の簡単な説明
    [0012] 第 l a図、 第 l b図、 第 l c図、 第 I d図は、 ゥミホ タル由来のルシフェラーゼの c DN Aの塩基配列及びァ ミノ酸配列を示す。 各列の上段は、 アミノ酸配列を示す C 各列の下段ほ c DN Aの塩基配列を示す。
    [0013] 第 2図は、 ゥミホタル由來のルシフェラーゼをコ一ド する c DNAを含む組換え体プラスミ ド p CLO 7の作 製法と、 その制限酵素地図を示す。
    [0014] 第 3図は、 動物細胞におけるゥミホタル由来のルシフ エラーゼの発現ベクター p S VL CL 5の作製法を示し たものである。
    [0015] 第 4 a図は、 酵母におけるゥミホタル由来のルシフエ ラーゼの発現ベクター pMF E 3 A、 pMFE 3 B、 pMFE 3 C、 pMF E 3 Dの制限酵素地図、 第 4 b図 は、 各々の発現ベクタ における フェロモン遺伝子/ ルシフェラーゼ c DN Aの接続部位近傍の塩基配列、 及 びアミノ酸配列を示したものである。
    [0016] 第 5図は、 酵母におけるゥミホタル由来のルシフェラ ーゼの発現べクタ一 P GL 1の作製方法を示したもので ある。
    [0017] 第 6図は、 大腸菌おけるゥミホタル由来のルシフェラ ーゼの発現べクタ一 P MT— C L P、 pMT— CLS、 pMT— CLTの作製方法を示したものである。
    [0018] 発明を実施するための最良の形態
    [0019] 本発明のルシフェラーゼは、 第 1図に示される 1番目 から 555番目までの 555個のアミノ酸配列からなる 蛋白質、 または、 第 1図に示されるアミノ酸配列のうち、 29番目のアミノ酸であるプロリンから始まる 527個 のアミノ酸配列からなる蛋白質、 30番目のアミノ酸で あるセリンから始まる 526個のアミノ酸配列からなる 蛋白質、 3 1番目のアミノ酸であるセリンから始まる 5 25個のアミノ酸配列からなる蛋白質、 もしくは 32番 目のスレオニンから始まる 524個のアミノ酸配列から なる蛋白質である。 さらに、 本発明のルシフェラーゼは 前記ルシフェラーゼと実質的に同等のルシブェラーゼ活 性が保持されているならば、 前記ァミノ酸配列の置換、 欠失、 揷入等から構成される蛋白質、 すなわちルシフエ ラーゼ同効物も本発明に含まれる。
    [0020] 本発明の遺伝子は、 上記ルシフェラーゼをコードする 遺伝子であって、 第 1図の下段に DN A塩基配列で示し たものであるが、 実質的に同等のルシフェラーゼ话性が 保持されているならば、 塩基配列の置換、 欠失、 揷入等 から構成される塩基配列も本発明に含まれる。
    [0021] 本発明のルシフェラーゼをコードする遺伝子を得る方 法を説明する。 まず、 ゥミホタルをグァニジンチオシァ ネート中で破砕した破砕液から全 RNAを抽出し、 オリ ゴ （ d T ) セルロースカラムクロマトグラフィ一により ポリ A+ RNAを精製する。 このポリ A+ RNAを出発 材料として c DNAを合成後、 g t l Oにクロ一ニン グして c DN Aライブラリーを作製する。
    [0022] 一方、 ゥミホタルより精製したルシフェラーゼ蛋白質 の N末端近傍のアミノ酸配列、 及びリジルェンドぺプチ ダーゼ分解によって得られたォリゴペプチドのァミノ酸 配列を決定し、 それらに対応するヌクレオチド配列を有 する数種類のオリゴヌクレオチドを化学合成し、 上述の c DNAライブラリーのスクリーニングのためのプロ一 ブとして用いる。
    [0023] プラークハイブリダィゼーション法によりこれらのプ ローブがハイプリッ ドを形成する組換え体の有する揷入 遺伝子の塩基配列の解析を行い、 ルシフェラーゼ蛋白質 のアミノ酸配列と一致すれば、 ルシフェラーゼ · タンパ クをコードする遺伝子の一部であると同定できる。
    [0024] さらに、 本発明は動物細胞、 酵母、 大腸菌に代表され る宿主細胞中で各々発現可能なプロモーターの下流に各 々上記 DNAを連結してなる組換えベクター DNA、 そ のベクター DN Aにより宿主細胞を形質転換してなる形 質転換体、 及びそれらの形質転換体を用いたルシフェラ ーゼの生産方法を提供するものである。
    [0025] 具体的には、 上述のようにして得られたゥミホタル由 来のルシフェラーゼをコードする c DN Aを、 動物細胞、 酵母、 大腸菌中において各々安定に保持され、 かつそれ らの細胞中において発現可能なプロモ一ターを持つべク ター DNAに連結し、 本発明の組換え体ベクター DN A が得られる。
    [0026] ここで、 プロモーターとは、 RN A合成酵素が認識結 合して RN A合成を開始するための信号であり、 その下 流に位置する D N A配列が m R N Aに転写される。 した がって、 ゥミホタル由来のルシフェラーゼをコードする 遺伝子が mRN Aに転写されるためには、 各々の細胞中 で機能するプロモーターの下流に、 ゥミホタル由来のル シフヱラーゼをコードする遺伝子が位置する必要がある。
    [0027] すなわち、 ベクター DNAに含まれるプロモーターの 下流の適当な位置にその認識配列の存在する適当な制限 酵素によりベクター DNAを切断し、 上記のルシフェラ ーゼをコードする遺 ί云子を含む DN Aを連結、 挿入した ものが用いられる。
    [0028] ここで使用するプロモーターは、 各々の宿主細胞中で 機能するものなら何でも良く、 例えば動物細胞において は動物細胞遺伝子もしくは動物ウイルス遺伝子のプロモ 一夕一等があげられる。 より具体的には、 SV 40の後 期プロモーター、 チミジンキナーゼ遺伝子のプロモータ 一、 SV 40の初期プロモーター、 サイ トメガロウィル ス遺伝子のプロモーター等があげられる。 酵母において は、 酵母遺伝子のプロモーター等が用いられる。 例えば、 酵母の抑制性酸性フォスファターゼ遺伝子 ( P HO 、 ガラクトース代謝酵素遺伝子 （ G A L 厂）、 α:フエロモ ン遺伝子 （ AiF " 2 ) のプロモーター等が用いられる。 大腸菌においては、 大腸菌遺伝子、 ファージ遺伝子のプ 口モーター等が用いられる。 冽えば、 大腸菌ラク トース 分解酵素の遺伝子 （ ί a c ) のプロモーター、 t r p オペロンに由来するプロモーター、 えファージの Pし プ 口モーター等があげられる。 また、 合成 t a cプロモー ターなども使用できる。
    [0029] 本発明で用いるベクター DN Aは、 各々の細胞中で安 定に保持され、 その細胞中で機能するプロモーターを持 つものなら何でも良い。 例えば、 動物細胞では、 プラス ミ ドベクター、 ウィルスベクター等があげられるが、 よ り具体的には、 P SV 2 [S V 40の初期プロモーター を持つ： J. Mo 1. Ap p 1. Ge n e t. U S A、 1、 3 2 7 ( 1 9 82 ) ]、 p S VL ( SV40の後期 プロモーターを持つ： フアルマシア社製）、 等があげら れる。 ϋ母においては、 pMF« 8 [ フェロモン遺伝 子 （ MP" " ί ) のプロモーターを持つ： Ge n e、 3、 1 55 ( 1985 ) ].、 P AM85 [抑制性酸性フォス ファターゼ遺伝子 ( P H O 5 のプロモーターを持つ： P r o c Na t l. Ac a d. S c i. US A、 80、 1 ( 1 9 83 ) ] 等があげられる。 大腸菌においては、 pMT— 1 [ t r オペ口ンのプロモーターを持つ発 現ベクター P KM 6 (特開昭 6 1 — 247387号） 由 来]、 p UC 1 8Zp UC 1 9 [ G e n e、 3 3、 1 0 3 ( 1 9 85 ) ] 等があげられる。
    [0030] 宿主細胞において機能する蛋白質分泌のためのシグナ ル配列をコードする塩基配列の下流に、 ルシフェラーゼ をコードする c DN Aをつなぐことで、 ルシフェラーゼ を細胞外に生産させることができる。 このシグナル配列 に特に制限はなく、 動物細胞においては、 例えば、 イン ターロイキン一 2 ( I L - 2 ) のシグナル配列等があげ られる。 酵母においては、 フェロモンのシグナル配列 等があげられる。 大腸菌の場合は、 ーラクタマーゼの シグナル配列等があげられる。 細胞内に生産させる場合 は、 シグナル配列を連結する必要はない。
    [0031] 宿主細胞として大腸菌を用い、 細胞内にルシフヱラー ゼを生産させる場合には、 発現させたい遺伝；
    [0032] 子がコードされる領域の 5， 末端にメチォニンをコード する塩基配列である "AT G" を付加し、 大腸菌中で機 能するプロモーター及び S D配列の下流に連結する必要 がある。 ここでいう S D配列とは、 リボソームが m R N A上の同配列を認識、 結合して、 その下流にある " A T G " よりタンパク合成を開始するための信号である。 ま た、 メチォニンを付加するのは、 分泌タンパクをコード している真核生物の遺伝子の多くは、 分泌のためのシグ ナル配列の下流に本来のタンパクをコードしており、 ま ずシグナル配列を含む形でポリべプチドの前駆体を合成 し、 このタンパクが分泌される過程でシグナル配列が切 断除まされるため、 最終的に生産されるタンパクの N末 端にはタンパク合成の開始信号として必須であるメチォ ニンの信号が付いていない場合が多いためである。 また、 ゥミホタルより精製した天然型のルシフェラ一ゼがセリ ン及びスレオニンの 2種類の N末端を持つタンパクの混 合物であること、 また、 多くの真核生物ではシグナル配 列はァラニン—X—ァラニン配列の次で切断され、 ゥミ ホ夕ル ·ルシフェラーゼの塩基配列より予想されるアミ ノ酸配列中にァラ二'ンーグルタミン酸ーァラニン一プロ リンという配列が存在することから、 本発明のベクター は N末端領域に関して、 メチォニンの下流にプロリン、 セリン、 またはスレオニンから始まるぺプチドをコード する 3種類の発現べクタ一が用いられる。
    [0033] 前記各々の組換え体べクタ一 D N Aにより動物細胞、 酵母、 大腸菌に代表される宿主細胞を各々形質転換した 形質転換体とは、 前記組換え体べクタ一 D N Aを各々の 宿主細胞に導入することによって得られる。
    [0034] 本発明で使用される動物細胞としては特に制限はなく、 例えば、 COS一 1細胞 （アフリカミ ドリザル腎臓由来 S V40形質転換細胞）、 CHO細胞 （チャイニーズハ ムスター卵巣由来） 等があげられ、 好ましくは COS— 1細胞が用いられる。 本発明において使用される酵母と して【ま特【こ铕(!限まなく、 3え【ま、 Saccharojiiyces cerev- jsiae、 ShizosaccharoMyc.es poabe, Pic ia pastoris等 があげられる。 本発明において使用される大腸菌に特に 制限はなく、 例えば、 HB 1 0 1、 JM 109等があげ られる。
    [0035] 組換え体ベクター DN Aを宿主細胞中に導入する方'法 に特に制限はないが、 例えば、 宿主細胞が動物細胞の場 合ほ、 D E AE—デキス トラン法 [Mo 1. C e l l. B i o l. . 5、 1 1 88 ( 1 9 85 ) ]、 カルシウム 一リン酸共沈法 [C e l l、 .14、 7 25 ( 1978 ) ] . 電気穿孔法 [ EMB〇 J. 、 1、 84 1 ( 1 982 ) ] 等があげられる。 中でも、 D EAE—デキス トラン法が 好ましく用いられる。 宿主細胞が酵母の場合は、 プロ 卜 プラスト法 [P r o c. N a t l. Ac a d. S c i. USA. 75、 1 92 9 ( 1 97 8 ) ] が好ましく用い られる。 また、 宿主細胞が大腸菌の場合は、 好ましくは 塩化カルシウム法 [ J. M 0 1. B i o l. . 53、 1 54 ( 1 970 ) ] が用いられる。
    [0036] このようにして組換え体べクタ一 D N Aを動物細胞、 酵母、 大腸菌に代表される宿主細胞中に各々導入するこ とにより、 ゥミホタル由来のルシフェラーゼをコードす る遺伝子を含む DN Aをベクター DN Aに揷入した新規 な組換え体ベクター： DNA、 さらにルシフェラーゼ生産 能を有する形質転換体を得ることができる。
    [0037] 上記形質転換体を各々培地に培養し、 培養物よりルシ フェラーゼを得ることができる。 培地としては、 各々の 培養に用いられるものであれば何でも良く、 例えば、 動 物細胞の場合はダルべッコ変法ィーグル培地等があげら れ、 酵母では YEPD培地 （ 20 トリプトン Z
    [0038] 10 g/1 酵母エキスノ20 gZml グルコース） 等があげられ、 大腸菌では L培地 （ 10 gZl トリプ トン 酵母エキス Zl O gZl 塩化ナトリ ゥム） 等があげられる。
    [0039] 培養温度は各々の細胞が生育できる温度であれば何度 でも良い力 例えば 15〜45°Cが好ましく、 さらに好 ましくは動物細胞、 大腸菌では 25〜 40 Ό、 より好ま しくは 30〜37°Cである。 酵母では 1 5〜40°C、 よ り好ましくは 20〜30°Cである。 培養時間にも特に制 限はないが、 通常 1〜 10日間、 好ましくは動物細胞、 酵母では 3〜7日間、 大腸菌では 1〜3日間である。
    [0040] プロモーターがその発現に適当な誘導を必要とする場 合、 例えば、 動物細胞におけるメタ口チォネイン遺伝子 のプロモーター、 酵母における抑制性酸性フォスファタ ーゼ遺伝子のプロモーター、 大腸菌における t r p プ 口モーター等を用いる場合では適当な誘導物質を加える. 適当な物質を除く、 培養温度を変化させる、 紫外線等を 照射する等、 各々のプロモーターに応じた手段により、 培養中にプロモーターの発現に誘導をかけることができ る。 具体的には、 大腸菌において プロモーター を使用した場合、 t r p オペロンの誘導物質であるェ AA (インドールァクリル酸） を培地に添加することに より、 プロモーターの発現を誘導できる。
    [0041] この際に、 非誘導条件下で産生される微量のタンパク の存在が細胞の増殖等に悪影響を与える場合には、 非誘 導下ではプロモーターの発現をできるだけ抑制しておく ことが好ましい。 例えば、 非誘導下では完全に発現の抑 制されるプロモーターを用いる、 プロモーターの抑制遺 伝子と組み合わせる等があげられる。 具体的には例えば、 t r p プロモーターの場合、 t r p オペロンの抑制 遺伝子を同一プラスミ ド上に持つ組換えプラスミ ドを用 いることが好ましい。 この抑制方法としては、 トリフ。卜 ファン リブレッサー遺伝子 （ 亡 厂 PR) [Nu c l e i c Ac i d s Re s. 、 8、 1 552 ( 198 0 ) ：] が用いられる。 これらとは別に、 前述のように、 生産されるタンパクを細胞外に分泌させる方法を用いる ことも可能である。
    [0042] 培養物は、 適当な方法、 例えば遠心分離等により培養 上清と細胞とに分け、 その培養上清もしくは細胞抽出液 中のルシフヱラーゼ活性をルミノメーター等を用いて検 出する。.この培養上清もしくは細胞抽出液はそのままで も粗酵素液として使用可能である力 必要により、 例え ば' F. I. T s u j iの方法 [M e t h 0 d s in Enzymol. 、 57. 364 ( 1978) ]記載の 方法により精製して、 純化されたルシフェラーゼを得る ことができる。
    [0043] 実 施 例
    [0044] 以下、 実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。 実施例 1
    [0045] c DNAライブラリーの作製
    [0046] 千葉県館山湾内で採集後、 凍結保存したゥミホタル 5 gを 6M グァニジン チオシァネート ZSniM クェ ン酸ナトリウム（PH 7.0) 0. 5 % ザルコシン酸ナト リウム溶液 75 mlに懸濁し、 ポリ トロンホモジナイザ ― (キネマティ力社製） で破砕した。 塩化リチウム溶液 (アマシャム社製キッ ト） を加え、 塩化リチウム共沈法 によって約 600 gの RN Aを得た。 このうち 300 gの RNAをオリゴ （dT) セルローカラム （コラボ レイティブ リサーチ社製） クロマトグラフィーによつ て精製し、 約 15 gのポリ （A) + RNAを得た。 こ のうち 2〃gから cDNA合成キッ ト （ライフ テクノ 口ジーズ社製） を用いて 1 gの 2本鎖 DNAを得た。 このうちの 0. 15 gを JS c oRI メチラーゼで処 理して c oRェ切断部位を保護し、 T 4 DNA リ ガーゼを用いて c oRI リンカ一を結合した。 さら に、 (： ひ1¾ェで処理し、 両末端を c oR I切断部位 に変換した。 この DNAを T.4 DNA リガーゼを使 つて； g t 10の £ c oRI部位に揷入した後、 i n v i t r o ノヽ。ッケージングによりファージ ノヽ。一ティ クル中に導入した。 これを大腸菌 NM5 14に形質導入 し、 1 X 106 P FUの c DN Aライブラリーを得た。 実施例 2
    [0047] オリゴヌクレオチド ， プローブの作製
    [0048] F. ェ. . T s u j iの方法 [Me t h 0 d s i n E n z ymo l. 、 57、 364 ( 1978 ) ] で精製 したゥミホタル · ルシフェラーゼ 100 gを凍結乾燥 した後、 100 1の 8M 尿素/ 1 M トリス塩 酸（pH 7.6)/0. 14M 2—メルカプトエタノールに 溶解して、 37 °Cで 3時間保温して一 SH基をピリジル ェチル化した。 これに 200 ^ 1の 0. I liM トリス 塩酸（PH 9.0)、 1 1の 2—メチルメルカプトエタノー ル、 1 1の 2 1 リジルエンドぺプチダーゼ (和光純薬社製） を加えて、 37 °Cで 1時間消化した。 これを VYDAC 2 18 TP 54 ( C18) ( VYD AC社製） の HP LCにかけ、 オリゴペプチドを分離し た。 得られたオリゴペプチドのうち 13個について、 ァ ミノ酸シークェンサ一 470 A (アプライ ド バイオシ ステムズ社製） を用いて N末端のアミノ酸配列を解析し たところ、 以下の 13個のアミノ酸配列を得た。
    [0049] フラグメント 1 3
    [0050] 1 5 10
    [0051] Ala-Arg-Tyr-Gln-Phe-Gln-Gly-Pro-Met-Lys
    [0052] (Cys) フラグメント 1 8
    [0053] 1 5 9
    [0054] Arg-Phe-Asn-Phe-Gln-G lu-Pro-Gly-Lys フラグメン ト 2 1
    [0055] 1 5 10
    [0056] Arg-Asp-I le-Leu-Ser-Asp-G ly-Leu- Cys-G lull 15
    [0057] Asn-Lys-Pro-Gly-Lys フラグメント 2 3
    [0058] 1 5 10
    [0059] Gly-Gln-G ln-Gly-Phe-Cys-Asp-His-Ala-Trp-
    [0060] 11 13
    [0061] Glu-Phe-Lys フラグメント 2 7
    [0062] I 5 10 Glu-Phe-Asp-Gly-Cys-Pro-Phe-Tyr-Gly-Asn-
    [0063] II 15 18
    [0064] Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Tyr-Cys-Lys フラグメント 3 8
    [0065] I 5 10 Gly-Gly-Asp- ( ) -Ser-Val-Thr-Leu-Thr-Met-
    [0066] II 15 · 17
    [0067] Glu-Asn-Leu-Asp-61y-Gln-Lys フラグメント 4 0
    [0068] I 5 10 His-Val-Leu-Phe-Asp-Tyr-Val-Glu-Thr-Cys-
    [0069] II 15 20 Ala-Ala-Pro-Glu-Thr-Arg-Gly-Thr-Cys-Val-
    [0070] 21 25 30
    [0071] Leu-Ser-Gly-His-Thr-Phe-Tyr-Asp-Thr-Phe フラグメント 4 7
    [0072] 1 5 10
    [0073] Glu-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Asp-Cys-Tyr-( ) -
    [0074] 11 15 16
    [0075] Asn-Thr-( )-Asp-Val-Lys フラグメン卜 5 0
    [0076] I 5 10
    [0077] ( )-Leu-Met-Glu-Pro-Tyr-Arg-Ala-Val-Cys-
    [0078] II 15 20
    [0079] ( )-Asn-Asn-I le-Asn-Phe-Tyr-Tyr-Tyr-Thr 次に上記の 1 3種のアミノ酸配列のうち下記の 5種に 対するォリゴヌクレオチドを D N A合成装置 （アプライ ド バイオシステムズ社製） を用いて作製した。 なお塩 基配列中の Iは、 デォキシイノシンを示す。
    [0080] プローブ I (フラグメント 2 7の 6番のアミノ酸 配列に対応）
    [0081] Glu - Phe - Asp - Gly - Cys - Pro
    [0082] GAA TTT GAT GGT TGT CCT G C C C C C A A G G
    [0083] 3 ' -CTT AAA CTA CCI ACA GG-5 '
    [0084] C G G G
    [0085] プローブ II (フラグメント 2 3の 6〜 1 0番のァミノ 酸配列に対応）
    [0086] Cys-Asp-His-Ala-Trp
    [0087] TGT GAT CAT GCT -TGG
    [0088] C C C C A
    [0089] G
    [0090] 3 ' -ACA CTA GTA CGI ACC-5 '
    [0091] G G G プローブ ΙΠ (フラグメント 4 7の 4〜 9番のアミノ酸 配列に対応）
    [0092] Met - Ala - Ala - Asp - Cys - Tyr
    [0093] ATG GCT GCT GAT TGT TAT C C C C C A A G G
    [0094] 3， - TAC CGI CGI CTA ACA AT - 5
    [0095] G G
    [0096] プローブ IV (フラグメント 5 0の 3〜 7番のアミノ酸 配列に対応）
    [0097] Met- -Glu- -Pro-Tyr-Arg
    [0098] ATG GAA CCT TAT CGT
    [0099] G C C C
    [0100] A A
    [0101] G G
    [0102] AGA
    [0103] G
    [0104] 3 ' -TAC CTT GGI ATA TC-5，
    [0105] C G G プローブ V (フラグメント 13の 1〜 10番のァミノ 酸配列に対応）
    [0106] Ala-Arg-Tyr-G ln-Phe-Gln-Gly-Pro-Met-Lys GCT CGT TAT CAA TTT CAA GGT CCT ATG AAA
    [0107] C C C G C G C C G A A A A G G G G AGA
    [0108] G
    [0109] 3， - CGI GCI ATA GTT AAA GTT CCI GGI TAC TTT-5'
    [0110] T G C G C
    [0111] 以上の 5種のオリゴヌクレオチド各々 1 gを、 10 1の5011^'1 トリス塩酸（pH 7.6)Z 10 mM 塩化 マグネシウム/ /SmM ジチオスレィ トール Z 1 mM スペルミジン/ / 100 mM. 塩化カリウム に溶解し、 5 1の [ y— 32 P ] AT P (3000Ci/m ol;アマシャム 社製） 、 85 1の蒸留水、 2 1の丁 4 ポリヌクレ ォチド キナーゼ （宝酒造社製） を添加して、 37 で 1時間反応して32 P標識した。 実施例 3
    [0112] プラークハイブリダィゼーシヨン法による c DN Aラ イブラリーのスクリーニング
    [0113] 実施例 1で作製した c D N Aライブラリーを用いて、 50枚の寒天プレートに 1枚当たり約 1万個のプラーク を出現させた。 このプラークをナイロン 'メンブレンに 移し取り、 0. 5M 水酸化ナトリウム/^. 5M 塩 化ナトリウム溶液中で DN Aを変性させた後、 0. 5 M トリス塩酸（PH 7.0) 1. 5 M 塩化ナトリウム溶液中 で中和した。 このメンブランを 80°Cで 2時間保温して、 ファージ DNAをメンブラン上に固定した後、 50 mM リン酸ナトリウム（PH 7.4)ZO. 7 5 M 塩化ナトリウ ム 5 Xデンハルト溶液 （ 0. 1 % 牛血清アルブミン /0. 1 % フイコール Z0. 1 % ポリビニルピロリ ドン） / ED ΊΑ/0. 1 % S D S/10 0
    [0114] 1 変性サケ精子 DN A溶液中で 45 °Cで 2時 間保温してプレハイブリダィゼーシヨンを行つた。
    [0115] 次に、 新たな同溶液中にメンブランを移し、 5 C i /mlとなるように実嗨例 2で標識したオリゴヌクレオ チドプローブ Vを添加して、 45 °Cで一夜保温してハイ ブリダィゼーシヨンを行った。 約 1 6時間後、 6 X S S C [ 9 0 mM クェン酸ナトリウム（PH 7.0)/O. 9 M 塩化ナトリウム] ノ 0. 1 % S D Sを用いて室温下で 30分間ずつ 2回、 次に 45 °Cで 30分間ずつ 2回メン ブランの洗浄を行った。 このメンブランを風乾した後、 X—〇MATTMARフィルム （コダヅク社製） を用いて、 - 70°C、 48時間オートラジオグラフィーを行った。
    [0116] フィルムを現像し、 32個の陽性クローンを得た。 寒 天プレート上のこれらの陽性クローンよりファージを增 殖させ、 ファージ DN Aを精製した。 DNAは一 20°C で保存した。
    [0117] 実施例 4
    [0118] ルシフェラーゼ蛋白質と遺伝子の 1次構造の比齩
    [0119] 実施例 3で得られた 32個の陽性クローンのうち、 最 犬の約 1900塩基対の揷入断片を含むクローンえ CL 07より揷入断片を制限酵素 J5 c oRIで切り出し、 プ ラスミ ド pUC 18にサブクローニングし、 組換え体プ ラスミ ド P CL 07を作製した （第 2図）。 この 1. 9 k bの c o R I断片の塩基配列の決定は、 通常のジデ ォキシ法を用いて行った。 決定された塩基配列を第 1図 に示す。
    [0120] 得られた遺伝子の情報と、 実施例 2で得られた蛋白質 の情報とを比較することにより、 第 1表に示すように蛋 白質と遺伝子の 1次構造を対応させることができた。 そ の結果、 第 1図に示すようにゥミホタル由来のルシフエ ラーゼの遺伝子の塩基配列が特定され、 また該蛋白質の ァミノ酸配列を規定することができた。 第 1表. アミノ酸配列と适 の 1 ¾¾造との対応（その 1 )
    [0121] アミノ酸配列の^ Jfの結果 道 β 1 ίλ¾造との対応 フラグメント 7— 1
    [0122] Thr-Cys-Gly-Ile-C s-Gly-Asn-Tyr-Asn-Gln Thr-Cys-Gly-I le-Cys-Gly-Asn-Tyr-Asn-Gln
    [0123] ' ACA TGC GGC ATA TGT GGT AAC TAT AAT CAA フラグメント 7— 2
    [0124] Glu-Gly-Glu-Cys-Ile-Asp-Thr-Arg-Cys-Ala- Glu-Gly-Glu-Cys-Ile-Asp-Thr-Arg-Cys-Ala- GAA GGA GAA TGT ATC GAT ACC AGA TGC GCA
    [0125] Thr-Cys-Lys Thr-Cys-Lys
    [0126] ACA TGT AAA フラク 'メン卜 1 2— 1
    [0127] ひ s-Asn-Val-C s-Tyr~L s-Pro-Asp~Arg- Ile- Cys-Asn-Val-Cys-Tyr-L s-Pro-Asp-Arg-Ile- TGT AAT GTC TGC TAC AAG CCT GAC CGT ATT
    [0128] Ala Ala
    [0129] GCA フラグメン卜 1 2— 2
    [0130] Val-Ser-His-Arg-Asp-( )-Glu Val-Ser-His-Arg-Asp-C )-Glu
    [0131] GTT TCA CAT AGA GAT GTT GAG フラグメント 1 3
    [0132] Ala-Arg-Tyr-Gln-Phe-Gln-Gly-Pro-Met-Lys Ala-Arg-Tyr-Gln-Phe-Gln-Gly-Pro-Met-Lys
    [0133] (Cys) (ひ s)
    [0134] GCC AGA TAT CAA TTC CAG GGC CCA TGC AAA
    [0135] フラグメント 1 8
    [0136] Arg-Phe-Asn-Phe-Gln-Glu-Pro-Gly-Lys Arg-Phe-Asn-Phe-Gln-Glu-Pro-Gl -Lys
    [0137] AGA TTT AAT TTT CAG GAA CCT GGT AAA フラグメント 2 1
    [0138] Arg-Asp-I le-Leu-Ser-Asp-Gly-Leu-Cys-Glu- Arg-Asf>-Ile-Leu-Ser-As -Gly-Leu-Cys-Glu- CGA GAC ATA CTA TCA GAC GGA CTG TGT GAA
    [0139] Asn-Lys-Pro-Gly-Lys Asn-L s-Pro-Gly-Lys
    [0140] AAT AAA CCA GGG AAG フラグメン卜 2 3
    [0141] Gly-G ln-G ln-Gly-Phe-Cys-Asp-H is-Ala-Trp- Gly-Gln-Gln-Gly-Phe-C>'s-Asp-His-Ala-Trp- GGA CAG CAA GGA TTC TGT GAC CAT GCT TGG
    [0142] Glu-Phe-Lys Glu-Ph -L 's
    [0143] GAG TTC AAA t to
    [0144] CD AAT T TT CGT AAC ATC AAC TTCACA TAC Ac.
    [0145] yy (yyy丫ynAnpheTマAs .sマ TFマ AnAsnI lAnpheT TrTr:T ThsesTh ----I--l----- ¾ CTC ATGA GOT ΏΑ GA COA TAC AO TGT ;G
    [0146] (yg ；g丫y )yyMlPFOTrArAlLKetTAll LeuetGalcseulprT7AavavaGuocs--- •I----------l--
    [0147] :¾Vァ y( )FP AsnThrVaTL AsnThti,LASASva T:,T-l---- AC TGT TACAG on CTGTCC GC GA TG G AG G
    [0148] py(PyyTTLeuLcs GlueuMetAlaAlaAScsluLeuLeuA la AlaAs GMetTr------l----------- AC AOAT TAT G TCTA TCA OOA3 TTC CAT A - PyyPyyAThTph LeuserGlHThrphTrAleTpSiseSTph ,eusepGHiThrphh7s--(----r-iI-----l A AOGGT orT GCA CCGA AC AOA OO GC GAO - EC
    [0149] ggyyyy AlAlplThrcsalaaroluThrATGlThT AlPTOThTATGvGcsallaAaGluv------------II- ----- AG AOA TCTC onA TAT GTT GG G TTC GC
    [0150] PyPyyy HialLTlluThTassveupheASTvlGlalLeueTraGauGsvphASv-----..-------- --.- ァ V iO. 一
    [0151] Eyypyy GluAs:AllnL nLelGlnLSGGs luAsuAsG一 :T---------- ATC ACCAC TOT GTACC CC GGT GO G TGO
    [0152] yyP(yp(丫yhTlGlAalThFLeuTMet Gseマ ValThrTtlGlAs selTvShrMe G---l-I--- .---l •-- T AAA TACGCAA GAT ATC G
    [0153] 実施例 5
    [0154] S V40後期プロモーターを有する発現ベクター P S V Lへのルシフェラーゼ c D N Aの揷入
    [0155] 実施例 4で得られ ゥミホタル由来のルシフエラーゼ をコードする前記の 1·. 9 kbの Έ c oRェ断片 1 に各々 1. 5mMの dATP, d T TP, dCTP及び d GTPの存在下に、 5ユニッ トの大腸菌 DNA ポリ メラーゼ I ラージ フラグメント （宝酒造社製） を 作用させ、.末端を修復した。 また、 ベクターの PSVL (S V40後期プロモーターを持つ発現ベクター： ファ ルマシア社製） は、 制限酵素 aェにより分解した。
    [0156] ついで末端を修復した 1. 9 k b断片 （0.
    [0157] と p SVLの S m a l分解物 （0. とを T4 DNA リガーゼによって結合し、 その反応液を用いて 大腸菌 HB 10 1コンビテン卜細胞.（宝酒造社製） の形 質転換を行い、 この 1. 9 k b断片の組み込まれた組換 え体プラスミ ドを得、 P SVLC L 5と命名した （第 3 図） 。
    [0158] 実施例 6
    [0159] COS - 1細胞によるゥミホタル由来のルシフェラー ゼの £
    [0160] 実施例 5において作製した発現ベクター P SVLCL 5 ( 1 0 ju g ) を、 COS— 1細胞に D E AE -デキス 卜ラン法 [M o l. C e l l. B i o l. . 5、 1 1 8 8 ( 1985 ) ] を用いて導入した。 また、 コントロー ルとして P SV L ( 1 0 M g ) を同様にして COS— 1 細胞に導入した。
    [0161] これらの細胞を 25 cm2 の培養フラスコ中で、 10
    [0162] % 牛胎児血清を含むダルべッコ変法ィーグル培地 （日 水製薬社製） 10 mlを用いて 5 % CO 2 の存在下、
    [0163] 37°Cで 5日間培養した。 培養途中及び培養終了後、 培 養液 l m lを採取し、 3, 000 r pm、 10分間、 4 °Cで遠心して、 その上清を集め、 培養上清とした。
    [0164] また、 培養終了後、 細胞はトリプシン処理によって培 養フラスコからはがした後、 1 m lの P B S (—） （日 水製薬社製） で洗净し、 3, 000 r p m、 10分間、
    [0165] 4 °Cで遠心し上清を捨てた。 これをさらに 2回繰り返レ、 200 ^ 1の P BS (—） に懸濁した。 凍結融解を 3回 繰り返し、 細胞抽出液とした。
    [0166] 実施例 7
    [0167] 動物細胞により生産されたルシフェラーゼの活性測定 実施例 6に示した培養上清中のルシフヱラーゼ活性の 測定は、 下記の方法によって行い、 その結果を第 2表に 示した。 すなわち、 30 1の培養上清に 27ひ 1の 測定用緩衝液 [ 100 mM リン酸ナトリウム（PH 7.0) /200 mM 塩化ナトリウム] を混合した。 2 1の 33 ゥミホタル ·ルシフェリンを混合し、 発生す るフォ 卜ン数を直ちにルミノメーター （ L uma c L 20 10 ) を用いて 30秒間計測した。 発光強度は 1秒 当たりの平均フオ トン数として示した。 コン トロールと して p S VLを導入した COS— 1細胞の培養上清につ いても同様にして発生するフォ トン数を計測した。
    [0168] 実施例 6に示した細胞抽出液中のルシフヱラーゼ活性 は、 下記に記載した方法により行い、 その結果も第 2表 に示した。 すなわち実施例 6で作製した細胞画分の 10 1を 290 1の上記測定用緩衝液と混合し、 さらに 2 1の 33 /Mゥミホタル ·ルシフェリンを混合し、 培養上清の場合と同様にしてルシフヱラーゼ活性を測定 した。
    [0169] 第 2表 ルシフェラーセ' ¾tt (xi05cps/ml)
    [0170] 钿胞内 ブラスミド 24時間 48時間 72時間 96時間 120時間 120時間
    [0171] (a) PSVLCL5 2.2 4.0 4.3 4.6 5.2 1.2 (No. 1)
    [0172] (b) SVLCL5 2.3 5.8 8.3 9.0 10.5 3.0 (No. 2)
    [0173] (c) PSVLCL5 2.1 3.1 3.8 4.1 5.5 0.8 (No. 3)
    [0174] (d) PSVLCL5 2.3 4.0 5.5 5.7 6.7 1.4 (No. 4)
    [0175] (e) pSVL 2.0 2.5 2.3 2.3 2.1 0.2 (コントロール） 実施例 8
    [0176] 薛母発現ベクター用オリゴヌクレオチドの合成とァニ 一リング
    [0177] ( 1 ) ゥミホタルより精製した天然型のルシフェラー ゼが、 第 1図に示したアミノ酸配列の第 3 1番目のァ ミノ酸であるセリンと第 3 2番目のアミノ酸であるスレ ォニンの N末端を持つ 2種類のぺプチドの混合物である こと、 （ 2 ) c D N Aより推定されるルシフェラーゼの アミノ酸配列の N末端に、 タンパクの分泌のためのシグ ナル配列の特徵を持つアミノ酸配列が存在すること、 ( 3 ) 多くの真核生物ではシグナル配列はァラニン一 X ーァラニン配列の次で切断される力 ゥミホタルのルシ フエラーゼにおいてもァラニン一グルタミン酸一ァラニ ンープロリンの配列が存在すること等の理由により、 第 1図に示したゥミホタル由来のルシフェラーゼのァミノ 酸配列中の第 2 9番目のアミノ酸であるプロリン （ Y P 型）、 第 3 0番目のアミノ酸であるセリン （Y N型）、 第 3 1番目のアミノ酸であるセリン （Y S型）、 第 3 2 番目のアミノ酸であるスレオニン （Y T型） から始まる ルシフェラーゼ · タンパクを作製し、 酵母の αフヱロモ ンのシグナル配列の下流に連結するために、 以下の 1 0 本のオリゴヌクレオチドを合成した。 YP— 1 5' -CCTTCAAGTACTCCA-3'
    [0178] γρ - 2 5， -CTGTTGGAGTACTTGAAGG-3，
    [0179] Y S— 1 5， -AGTACACCA - 3'
    [0180] Y S— 2 5， - CTGTTGGTGTACT - 3'
    [0181] Υ τ— 丄 5 -ACTCCA-3
    [0182] ΥΤ - 2 5， -CTGTTGGAGT-3'
    [0183] ΥΝ - 1 5' -TCGTCGACACCA-3'
    [0184] ΥΝ - 2 5， -CTGTTGGTGTCGACGA-3'
    [0185] U— 1 5， -ACAGTCCCAACATCTTGTGAAGCTAAAGAAGGAG
    [0186] AATGTAT-3'
    [0187] U- 2 5'-CGATACATTCTCCTTCTTTAGCTTCACAAGATGT
    [0188] TGGGA-3'
    [0189] 合成才リゴヌクレオチド YP— 2、 YS— 2、 YT - 2、 YN— 2、 U— 2の 5本については、 5， 末端を T 4 DNA キナーゼによってリン酸化した。 すなわち、 各ォリゴヌクレオチド 300 p m o 1を各々 20 1の 反応液 [ 5 OmM 卜リス塩酸 （PH 7.6) / 1 OmM 塩化マグネシウム/ 1 mM スペルミジン ZS mM ジチオスレィ トール ZO. 1 mM ED TA] 中で T 4 DNA キナーゼ （宝酒造社製〉 10ユニッ トを用いて、 37 °Cで 1時間反応させ、 70 °Cで 5分間加熱した後、 一 20°Cで保存した。
    [0190] 各オリゴヌクレオチドのァニーリングは次のように行 つた。 YP型では YP— 1、 リン酸化した ΥΡ— 2、 U — 1、 及びリン酸化した U— 2を、 YS型には YS— 1、 リン酸化した YS— 2、 U— 1、 及びリン酸化した U— 2を、 ΥΤ型には ΥΤ— 1、 リン酸化した ΥΤ - 2、 U 一 1、 及びリン酸化した U - 2を、 ΥΝ型には ΥΝ - 1、 リン酸化した ΥΝ— 2、 U— 1、 及びリン酸化した U— 2を、 各々 50 pmo 1ずつ混合し、 70°Cで 5分間加 熱後、 インキュベーターの電源を切り 42°Cになるまで 放置した。
    [0191] 実施例 9
    [0192] if母びフ： Lロモン遠 '伝子のプロモーター 有する発現 ベクター PMF 8へのルシフェラーゼ c DN Aの揷入 ゥミホタル ' ルシフェラーゼ c DN A中に存在する制 限酵素 C I a I切断部位に実施例 8に示した合成オリゴ マーを組み込み、 5， 末端に S i; t I部位を持ち、 N末 端 28、 29、 30、 3 1個のアミノ酸を削ったルシフ エラーゼ c DN Aを作製.した。
    [0193] 酵母の発現ベクター pMF α 8 [Ge n e. 3、 1 5 5 ( 1 9 85 ) ： AT CC . 37 41 8 ] は、 フエ口 モン遺伝子のリーダー配列をコードする領域の直後を制 限酵素 S t u lで切断し、 上述のルシフェラーゼ c DN Aを挿入した。 作製した発現ベクターは、 各々 PME F 3 A (YP型）、 pMEF 3 B (YS型）、 pMEF 3 C (YT型） 、 PME F 3 D (ΥΝ型） と命名した （第 4 a図） 。 作製した各々の発現べクタ一の フエロモン遺伝子ノ ルシフェラーゼ c D N Aの接売部位近傍の塩基配列は、 ルシフェラーゼ c DN A内の配列である 5， - TATA AATGGTCCAAGGA— 3， をプライマーとして、 通常のジデォキシ法によって、 正しく挿入されているこ とを確認した。 pMFE3A、 pMFE3 B、 pMF E 3 C、 及び PMFE3 Dにおける フェロモン遺伝子 Z ルシフェラーゼ c DN Aの接続部位近傍の塩基配列、 及 びアミノ酸配列は第 4 b図に示した。
    [0194] 実施冽 10
    [0195] 酵母 G AL 1遺伝子のプロモーターを有する発現べク ター P 103へのルシフェラーゼ c DN Aの揷入
    [0196] 実施例 3で得た； CL07より、 1. 3 kb、 0. 6 k bの 2つの E c oR I断片を各々プラスミ ド pUC l 8にサブクローニングし、 プラスミ ド p CL07 12、 P C L 0742を作製した。 p C L 07 ( 1 u g) ^ 及 び P C L 07 1 2 ( 1 g ) を H i /1 d IIIと βざ IIで 切断し、 P CL 07よりルシフェラーゼの Ν末端を含む DNA断片を、 p CL O 7 1 2よりルシフェラーゼの C 末端を含む DNA断片を精製した。 この 2断片をプラス ミ ド P S PT 1 8 (ベーリンガー マンハイム社製） の H i n dill部位にサブクローニングし、 得られた組換え 体プラスミドを P S T CL 8 1と命名した。 、
    [0197] 次に、 この P S TC L 81 ( l〃g) を B a /nH Iで 切断し、 クローニングした全 c DNA配列を β a Hェ 断片として回収した。
    [0198] 一方、 酵母の G A JL ίプロモーターを持つ発現べクタ 一 Ρ 103 [ S a cell a rojnyc.es cerevisiaeの G A L ίプロ モーター {Mo l. C e l l. B i o l. . 4、 14 0 ( 1 9 84) } の下流に、 S a /HH I切断部位を含む ポリリンカーを持つ： 大阪大学 ·原島 俊 助教授より 洪与された] 約 0, 1 gを B a mH Iで切断し、 T 4 DNA リガーゼを用いて前記の c DN A断片約 0. 1 gと連結し、 GA L 2プロモーターの下流にルシフエ ラーゼ c DNAの挿入された発現ベクター p GL 1を作 製した （第 5図）。
    [0199] 実施例 1 1
    [0200] 薛母によるゥミホタル由来のルシフェラーゼの生産 実施例 9において作製した発現ベクター PMFE 3 A、 pMF E 3 B、 pMF E 3 C、 pMFE 3 D各々 10 gをプロ トプラスト法 [ P i o c . Na t l. Ac a d. S c i. USA. 7 5、 19 29 ( 19 7 8 ) ] によつ Xi#-g:S a cellar oja ces cerevisiae 20B-12株 [ G e n e 37, 1 55 ( 1 985 ) ] 株に導入した。
    [0201] これらの形質転換体を 1 1の培養フラスコ中で 100 mlの YEPD培池を用いて 30°Cで 3日間培養した。 培養途中及び培養終了後、 培養液 5 mlを採取し、 4°C、 10分間、 3, 000 r pmで遠心して、 その上清を集 め培養上清とした。
    [0202] また培養液 1 m 1分の菌体は 5 mlの減菌蒸留水で洗 浄後、 11111の501111^ リン酸ナトリウム（pH 7.5)/ 0. 1 % T r i t o nX— 100に懸濁した。 1 m l のガラス ♦ ビーズ （直径 0. 45 mm) 懸濁液を加え、 0 °Cで、 時々ミキサーで激しく撹拌しながら 5分間放置 した。 軽く遠心してガラス · ビーズを分離し、 上清はさ らに 1. 5 mlのエツペンドルフ チューブに移し、 5 分間、 1 5, 000 r p mで遠心した。 この上清を菌体 抽出液とした。 ..
    [0203] 実施例 1 2
    [0204] 酵母によるゥミホタル由来のルシフェラーゼの生産 実施例 10で作製した発現ベクター p GL 1 ( 10 g ) は、 実施例 1 1と同様にプロ 卜プラス 卜法によって 酵母 Sacc/aroijyces cerevisiae YSH2676株（（a) u a3-52
    [0205] le.ul-112 trp! ρΛο3 p/)o5 hisl-29 )株に導入し a- に、
    [0206] この形質転換体を 1 1の培養フラスコ中で 1 00 m l の培地 （ 1 % 酵母エキス/ 2 % ペプトン/ /2 % ガ ラク トース） を用いて 30°Cで 2日間培養した。 培養途 中及び培養終了後、 培養液 5 mlを 3, O O O r pm、 1 0分間、 4eCで遠心して、 その上清を集め、 培養上清 とした。
    [0207] また、 菌体抽出液も実施例 1 1 と同様にして調製した c 実施例 1 3
    [0208] 薛母により生産されたルシフェラーゼの活性測定
    [0209] 実施例 1 1に示した培養上清中のルシフェラーゼ活性 の測定は、 実施例 7に記載した動物細胞の培養上清のル シフェラーゼ话性の測定と同様にして行い、 その結果を 第 3表に示した。 コントロールとして、 pMFa Sを導 入した S, cerevisiae 20B-12株の培養上清についても同 様にして発生するフォ トン数を計測した。
    [0210] 実施例 1 1に示した酵母細胞中のルシフェラーゼ活性 は、 下記に記載した方法により行い、 その結果も第 3表 に示した。 すなわち、 実施洌 1 1で作製した細胞抽出液 10 lを 290 1の上記測定用緩衝液と混合し、 さ らに 2 1の 33 M ゥミホタル 'ルシフェリンを混 合し、 培養上清の場合と同様にしてルシフェラーゼ活性 を測定した。 第 3表 ルシフェラーセ'活性（X 105 cps/ml) ブラスミド 12時間 21時間 38時間 47時間 64時間
    [0211] (a) pMFE3 A 菌体内 く 0.01 く 0.01 0.01 0.02 0.01 菌体外 0.05 0.02 4.84 13.47 2.11
    [0212] (b) PMFE3B 菌体内 く 0.01 く 0.01 0.Ώ2 0.01 く 0.01 菌体外 0.06 0.20 6.22 2.73 1.02
    [0213] (c) PMFE3C 菌体内 く 0.01 く 0.01 0.02 0.01 0.01 菌体外 0.10 0.21 2.76 0.79 0.89
    [0214] (d) pMFE3D 菌体内 く 0.01 く 0.01 0.02 0.01 0.01 菌体外 0.06 0.21 3.97 0.76 1.02
    [0215] (e) cont r o 1 菌体内 く 0.01 く 0.01 く 0.01 0.01 く 0.01 菌体外 0.06 0.04 0.05 0.06 0.11 実施例 1 4
    [0216] 薛母により生産されたルシフエラーゼの活性測定
    [0217] 実施例 12に示した培養上清中のルシフェラーゼ活性 の測定は、 実施例 7に記載した動物細胞の培養上清のル シフヱラーゼ话性の測定と同様にして行い、 その結果を 第 4表に示した。 コントロールとして、 P 103を導入 した cerevisiae YSH2676株の培養上清についても同 様にして発生するフォ トン数を計測した。
    [0218] 実施例 1 2に示した酵母細胞中のルシフェラーゼ活性 は、 実施例 1 3 と同様にして行い、 その結果を第 4表に 示した。 第 4表 ルシフェラーゼ活性 （ X 105 c p s /m 1 ) クローン N o. 20時間 43時間 51時間
    [0219] ( a ) No. 1 菌体内 0.06 0.07 0.07
    [0220] 菌体外 0.53 7.28 7.71
    [0221] ( b ) N o. 2 菌体内 0.04 0.06 0.07
    [0222] 菌体外 0.44 3.04 3.49
    [0223] ( c ) No. 3 菌体内 0.07 0.07 0.06
    [0224] 菌体外 0.40 3.00 4.70
    [0225] ( d ) N o. 4 菌体内 0.05 0.10 0.09
    [0226] 菌体外- 0.92 5.89 6.27
    [0227] ( e ) No. 5 菌体内 0.06 0.08 0.05
    [0228] 菌体外 0.50 2.52 2.47
    [0229] ( f ) c o n t r o l 菌体内 0.01 n.t. n.t.
    [0230] 菌体外 0.08 0.13 0.03 実施例 1 5
    [0231] ±腸菌発規ベクター用オリゴヌクレオチドの合成とァ ニーリング
    [0232] 大腸菌トリプトファン合成遺伝子 （ t r p ) オペロン のプロモーターと S D配列の下流にメチォニン一プロリ ン （EP型）、 メチォニンーセリン （E S型）、 メチォ ニンースレオニン （E— T型） で開始される該ルシフェラ ーゼの発現ベクターを作製するために、 以下の 6本のォ リゴヌクレオチドを合成した。
    [0233] E P - 1 5 ' -CGATGCCGTCAAGT ACACCA-3 '
    [0234] EP - 2 5' -CTGTTGGTGTACTTGACGGCAT-3 '
    [0235] E S - 1 5'-CGATGAGTACACCA-3'
    [0236] E S - 2 5 '-CTGTTGGTGTACTCAT-3 '
    [0237] E T - 1 5'-CGATGACACCA-3'
    [0238] E T— 2 5' -CTGTTGGTGTCAT-3 ' 合成オリゴヌクレオチド EP— 2、 E S— 2、 ET - 2、 及び実施例 8の ϋ一 2の各々 300 pmo 1は、 実 施例 8と同様にして N末端を T 4 DNA キナーゼを 用いてリン酸化し、 一 20°Cで保存した。
    [0239] 各オリゴヌクレオチドは、 £ 型では£ ー 1、 リン 酸化した EP— 2、 U— 1、 及びリン酸化した U— 2を、 E S型には ES— 1、 リン酸化した E S— 2、 U— 1、 及びリン酸化した U— 2を、 E T型には ET— 1、 リン 酸化した E T— 2、 U— 1、 及びリン酸化した U— 2を 各々 50 pm o 1ずつ混合し、.実施例 8と同様にしてァ ニーリングした。
    [0240] 実施例 1 6
    [0241] 女腸蘭 t r P プロモーター》有する発現ベクター p MT 1へのルシフェラーゼ c D N Aの揷入
    [0242] 大腸菌トリプトファン オペロン ( t r p ) のプロモ 一ター及び S D配列を持つ発現ベクター pMT - 1 [ p KM 6 (特閲昭 6 1 - 247 3 8 7号） 由来] は、 制限 酵素 S m a l、 C 2 a I と P V u IIで切断した。
    [0243] 一方、 実施例 3で作製した発現ベクター p C L 0 7を S m a lと（： a Iで切断し、 C i a Iより下流のルシ フェラーゼ c D N Aを含む DN A断片をァガロースゲル 電気泳動法により分離、 精製した。
    [0244] pMT - 1の切断断片と P CL 0 7の精製断片の各々
    [0245] 0. を T 4 D NA リガーゼ （宝酒造社製） を 用いて連結し、 再び制限酵素 S /n aェで切断した後、 市 販の大腸菌 HB 1 0 1コンビテン卜細胞 （宝酒造社製） を形質転換し、 プラスミ ド PMT— CL 0 7を作製した。 このプラスミ ドは、 t ϊ' p プロモーター ZS D配列の 下流に C 1 a I部位より下流のルシフェラーゼ c DN A を持つ。
    [0246] この pMT— C L O 7を制限薛素 C I aェで切断し、 その 0. 1 gと実施例 1 5で作製した合成 DN Aの 5 1とを T 4 DNA リガーゼで連結し、 t r p プ 口モーター/ S D配列の下流に、 メチォニン一プロリン (EP型）、 メチォニンーセリン （ES型）、 メチォ二 ンースレオニン （ET型） で開始される該ルシフェラー ゼ遺伝子を持つ発現ベクターを作製した。 作製したブラ スミ ドは各々、 pMT - CLP、 pMT - CLS、 及び pMT— CLTと命名した。
    [0247] 作製した各々の発現べクタ一の S D配列 Zルシフェラ ーゼの接続部位近傍の塩基配列は、 ルシフェラーゼ c D N A内の配列である 5， -T AT AAATGGTCC A AGGA- 3 ' をプライマーとして、 通常のジデ才キシ 法によって、 正しく揷入されていることを確認した。
    [0248] pMT - CLP、 pMT - CLS、 pMT - CLTの 制限酵素地図と確認した塩基配列を第 6図に示す。
    [0249] 実施例 17
    [0250] 大腸菌によるゥミホタル由来のルシフェラーゼの生産 実施例 16で作製した発現ベクターを用いて大腸菌 H B 101株を形質転換し、 得られた形質転換体を 5 ml の L培地 （アンピシ-リン： 100 mgZlを含む） で 1 晚、 37°Cで静置培養した。 翌日培養液の 1mlを採取 し、 50 mlの合成培地 [ 2 XM 9—力ザミノ酸培地 ( 6 g/1 リン酸二水素カリウム Zl 2g,l リン 酸水素ニナトリウム/ OgZl カザミノ酸 Zl O g /1 塩化ナトリウム Zl gZl 塩化アンモニゥムノ） / 1 mg/1 塩酸チアミン 25 Omg/1 硫酸マ グネシゥム Zl % グルコース Zl O OmgZl アン ピシリン] に懸濁し、 25 eCで 1晚振盪培養した。 翌朝、 培養液に I AA (最終濃度 2 Omg/l ) とグルコース (最終濃度 1 %) を加え、 1 2. 5 %のアンモニア水で pHを 7. 5に調整して、 25 °Cで 3時間培養を続けた。 3時間後、 IAA、 グルコース、 アンモニア水を同様に して加え、 さらに 3時間培養を続けた。 培養終了後、 培 養液 8mlを遠心して集菌し、 菌体を 0. 5mlの TE 緩衝液 [ 1 OmM卜リス塩酸（pH 8.0)/ 1 mM ED T Α] に懸濁した。 42°Cの温水と ドライアイス · ァセ 卜 ン液を用いて凍結融解を 3回繰り返して溶菌後、 10分 間、 10， O O O rpmで遠心し、 その遠心上清を粗酵 素液とした。
    [0251] 実施例 1 8
    [0252] 大腸菌により生産されたルシフェラーゼの活性測定 実施洌 17で作製した粗酵素液中のルシフェラーゼ活 性の測定は、 下記に記載した方法によって行い、 その結 果を第 5表に示した。 すなわち、 150 ^ 1の粗酵素液 に 150 1の前記測定用緩衝液、 2 1の 33 M ゥミホタル .ルシフェリンを混合し、 発生するフオ トン 数を 30秒間計測し、 その結果を第 5表に示した。 コン トロールとして PMT— CLR (合成 DNAが逆方向に 揷入されたプラスミ ド） を導入した大腸菌 HB 10 1に ついても同様にして発生するフォ トン数を計測した。 第 5表 プラスミド ルシフェラーセ'活性
    [0253] (cps)
    [0254] (a) pMT-CLP 200
    [0255] (b) pMT-CLS 870
    [0256] (c) PMT-CLT 540
    [0257] (d) pMT-CLR 200
    [0258] (control)
    [0259] 産業上の利用可能性
    [0260] ゥミホタル由来のルシフヱラーゼは非常に発光強度の 強い発光系であり、 抗体分子を本酵素と結合させて Eェ
    [0261] A (酵素抗体アツセィ法） に、 また、 DNA/RNA分 子と本酵素とを結合させて DN Aプローブ法に利用する など、 各種検査法への利用が期待できる。
    [0262] 本発明によって、 ゥミホタル由来のルシフェラーゼを コードする c DNAの 1次構造が特定され、 同時に該ル シフェラーゼの 1次構造が明らかになった。 さらに、 本 発明にあるルシフェラーゼの発現べクターを持つ動物細 胞、 酵母、 大腸菌の大量培養により、 該ルシフェラーゼ を安定的に生産させる方法が開かれ、 該ルシフェラーゼ 安価で大量に得ることができるようになるものと期待 される。
    [0263] また、 プロテイン ·エンジニアリングの手法を用いて、 該ルシフェラーゼの安定性の増加、 発光量子収率の改善、 発光条件の改善、 発光波長の変更等を行う方法が開かれ た。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    ( 1 ) 第 1図に示す 1番目から 5 5 5番目に至るアミノ 酸配列を有する純化されたルシフェラーゼ及びその 同効物。
    ( 2 ) 第 1図に示す 2 9番目から 5 5 5番目に至るアミ ノ酸配列を有する純化されたルシフェラーゼ及びそ の同効物。
    ( 3 ) 第 1図に示す 3 0番目から 5 5 5番目に至るアミ ノ酸配列を有する純化されたルシフェラーゼ及びそ の同効物。
    ( 4 ) 第 1図に示す 3 1番目から 5 5 5番目に至るアミ ノ酸配列を有する純化されたルシフェラ一ゼ及びそ の同効物。
    ( 5 ) 第 1図に示す 3 2番目から 5 5 5番目に至るアミ ノ酸配列を有する純化されたルシフェラーゼ及びそ の同効物。
    ( 6 ) 請求の範囲第 1〜 5項記載のルシフェラ一ゼまた はその同効物をコードする遺伝子。
    ( 7 ) 第 1図に示す塩基配列である請求の範囲第 6項記 載の遺伝子。
    -
    ( 8 ) 宿主細胞中で発現可能なプロモーターの下流に請 求の範囲第 6項記載の遺伝子を連結してなる組換え 体ベクター D N A。
    ( 9 ) 大腸菌中で発現可能なプロモーター及び S D配列 の下流に請求の範囲第 6項記載の遺伝子を連結して なる組換え体ベクター DN A。
    ( 10 ) 請求の範囲第 8または 9項記載のベクター DN Aにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換 体。
    ( 11 ) 宿主細胞が動物細胞、 酵母及び大腸菌からなる 群から選ばれた 1種である請求の範囲第 10項記載 の形質転換体。
    ( 12 ) 請求の範囲第 10または 1 1項記載の形質転換 体を培養することを特徴とするルシフェラ一ゼの生 産 ί¾。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Konecki et al.1982|Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase genes of mouse and Chinese hamster: construction and sequence analysis of cDNA recombinants
    US5168062A|1992-12-01|Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
    ES2304791T3|2008-10-16|Alto nivel de expresion de proteinas.
    US5541309A|1996-07-30|Modified apoaequorin having increased bioluminescent activity
    US4440859A|1984-04-03|Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
    CA1200773A|1986-02-18|Expression linkers
    CA1341569C|2008-03-25|Microbial production of human fibroblast interferon
    US4582800A|1986-04-15|Novel vectors and method for controlling interferon expression
    FI88175B|1992-12-31|Rekombinant-dna-molekyler och foerfaranden foer framstaellning av polypeptider liknande humant -interferon
    DE69635452T2|2006-07-13|Hohe expressionsrate des grün-fluoreszierenden proteins
    DK169726B1|1995-01-23|DNA-isolat omfattende en kontinuert sekvens, som koder for humant serumalbumin, og fremgangsmåde til konstruktion deraf samt en replicerbar mikrobiel udtrykkelsesvektor, som er i stand til at udtrykke DNA-sekvensen, en mikroorganisme, som er transformeret med vektoren, en gæringskultur af en sådan mikroorganisme og en fremgangsmåde til fremstilling af humant serumalbumin i moden form ved dyrkning
    US6143527A|2000-11-07|Chain reaction cloning using a bridging oligonucleotide and DNA ligase
    KR930001117B1|1993-02-18|Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법
    CA1340872C|2000-01-11|Microbial expression of interleukin ii
    US5629203A|1997-05-13|Method for integrative transformation of yeast using dispersed repetitive elements
    AU618612B2|1992-01-02|Insulin precursors
    SU1644720A3|1991-04-23|Способ получени антигенной детерминанты вируса СПИД
    CA1340522C|1999-05-04|Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
    KR960016560B1|1996-12-14|인체 과립구 콜로니 자극인자 폴리펩타이드 유도체, 이를 코드화하는 dna, dna를 함유하는 재조합 플라스미드, 플라스미드를 함유하는 미생물 및 폴리펩타이드를 제조하는 방법
    US5922583A|1999-07-13|Methods for production of recombinant plasmids
    US5096825A|1992-03-17|Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof
    JP3979678B2|2007-09-19|新規糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該酵素の製造方法
    EP0075444B1|1992-12-23|Methods and products for facile microbial expression of dna sequences
    Kaster et al.1983|Analysis of a bacterial hygromycin B resistance gene by transcriptional and translational fusions and by DNA sequencing
    EP0154133B1|1990-05-16|Plasmidic expression vehicles, and method of producing a polypeptide therewith
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    KR900702010A|1990-12-05|
    EP0387355B1|1996-11-06|
    DE68927437T2|1997-03-06|
    AT145004T|1996-11-15|
    EP0387355A4|1991-01-23|
    EP0387355A1|1990-09-19|
    DE68927437D1|1996-12-12|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    WO1988000617A1|1986-07-22|1988-01-28|Boyce Thompson Institute For Plant Research|Use of bacterial luciferase structural genes for cloning and monitoring gene expression in microorganisms and for tagging and identification of genetically engineered organisms|US7728118B2|2004-09-17|2010-06-01|Promega Corporation|Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation|
    US7879540B1|2000-08-24|2011-02-01|Promega Corporation|Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation|
    US7989621B2|2005-09-26|2011-08-02|National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology|Method for producing substituted imidazo[1,2-A]pyrazines of -1--3-oxo-3,7-dihydroimadazo[1,2-a]pyrazin-8-yl)propyl)guanidine|JPH088863B2|1987-11-30|1996-01-31|キッコーマン株式会社|ルシフェラーゼ|US5876995A|1996-02-06|1999-03-02|Bryan; Bruce|Bioluminescent novelty items|
    US6247995B1|1996-02-06|2001-06-19|Bruce Bryan|Bioluminescent novelty items|
    US6416960B1|1996-08-08|2002-07-09|Prolume, Ltd.|Detection and visualization of neoplastic tissues and other tissues|
    JP3795533B2|1996-12-12|2006-07-12|プロルーム・リミテツド|感染性物質を検出及び同定するための方法及び装置|
    EP1925320A3|1998-03-27|2008-09-03|Prolume, Ltd.|Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics|
    EP1064360B1|1998-03-27|2008-03-05|Prolume, Ltd.|Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics|
    法律状态:
    1990-02-22| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP KR US |
    1990-02-22| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1990-04-05| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989909235 Country of ref document: EP |
    1990-09-19| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989909235 Country of ref document: EP |
    1996-11-06| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1989909235 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP19929588||1988-08-09||
    JP63/199295||1988-08-09||
    JP20417388||1988-08-17||
    JP63/204173||1988-08-17||DE68927437T| DE68927437T2|1988-08-09|1989-08-09|Verfahren zur herstellung von luciferase durch rekombinante expression eines luciferase-kodierenden gens|
    EP89909235A| EP0387355B1|1988-08-09|1989-08-09|Process for preparing luciferase by recombinant expression of a luciferase-coding gene|
    KR1019900700491A| KR900702010A|1988-08-09|1990-03-08|루시페라아제, 그것을 코우드 하는 유전자 및 루시페라아제의 생산방법|
    US08/260,042| US5604123A|1988-08-09|1994-06-15|Luciferase, gene encoding the same and production process of the same|
    [返回顶部]