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    公开号:WO1990000855A1
    申请号:PCT/JP1989/000741
    申请日:1989-07-25
    公开日:1990-02-08
    发明作者:Tadashi Matsunaga；Hitoshi Wake；Mayumi Ono；Kiyoshi Hishinuma；Hironori Umetsu
    申请人:Pentel Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C12N5-00
    专利说明:
    [0001] 明 細
    [0002] 植 物 組 織 培 養 法
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本発明は、 植物組織培養法に関し、 更に詳しく は、 '植物 組織、 器官あるいはそれらの一部あるいは培養細胞を培養 することによって、 これらの植物組織、 器官あるいは培養 細胞を増殖させ、 植物体を再生させ、 または植物の産生す る有用物質を生産させる、 改良された植物組織培養法に関 するものである。
    [0005] ' 背 景 技 術
    [0006] 一般に、 植物組織培養においては、 植物組織、 器官ある いはそれらの一部あるいは培養細胞を、 植物の生長に必要 な無機塩類、 ビタ ミ ン、 糖などのほかに植物ホルモン （ォ —キシン類、 サイ トカイニン類、 ジベレ リ ン類、 エチレン 類等） を加えた培地を用いて培養し、 カルスをつく らせた り、 そのカルスを植え継いで培養を続け有用物質を得たり、 又はそのカルスから植物体を再生 （復元） させたり してい る o
    [0007] 植物組織培養技術を用いて植物体を再生させる方法と し ては、 出発材料により脱分化系と分化系の 2種に大き く分 けられる。 脱分化系はカルスや液体培養細胞などの脱分化 した状態を経由して植物体を再生させる方法であり、 具体 的にはクラスターカルスから多く のシュ一 トを発生させ、 発生した各々のシュ一 卜から発根させて幼植物体を再生さ せる方法や、 細胞に直接不定胚 （体細胞胚） を形成させ幼 植物体にまで再生させる方法がある。 不定胚を経由して植 物体を再生させる場合においては、 不定胚の生長は、 その 段階によって球状胚、 心臓型胚、 魚雷型胚、 成熟胚の順に 生長していく ことが知られている。 一方、 分化系では成長 点を含む茎頂、 休眠芽、 側芽、 胚、 種子などが出発材料に なり、 さらに成長点を含まない胚軸、 子葉、 茎なども用い られる。 この分化系では上述した植物組織にマルチプルシ ユー トを形成させ、 ついでこれらを切除した単一シュー ト から連続的にマルチプルシュー トを発生させる連続シユ ー ト生産システムを確立し、 最終的に切除したシユ ー トから 発根させ幼植物体を再生させる方法がある。
    [0008] 脱分化系からの植物体再生においては、 培養細胞を長期 間継代培養していると、 一般に分化能が低下することが多 く、 培養細胞からの不定胚の形成率やカルスからのシユ ー ト、 根の形成率は低くなる。 また、 人為的に不定胚を誘導 する場台、 培地の無機塩類組成もさることながら、 植物ホ ルモンであるオーキシンやサイ トカイ二ンの種類、 濃度、 組合せについて検討することが一般的な手順となっている, しかし、 オーキシンやサイ トカイニンの処理だけでは不定 胚形成やカルスからのシュー トや根の形成を誘導できない 植物種も多い。 特に不定胚は、 魚雷型胚まで生長すると理 由は定かではないが生長を停止して植物体にまで再分化す る率が極めて低下するという現象が起こる。 一方、 分化系 での植物体再生では、 種々の植物や種々の組織を用いて脱 分化系と同様にオーキシンやサイ トカイニンなどの植物ホ ルモンの種類、 濃度、 組合せや、 培地の無機塩類、 微量有 機成分組成などについて検討されているが、 未だに植物や 組織によってはシュ一 ト ♦根の形成をしないものもある。 また、 脱分化系、 分化系のいずれにおいても、 植物ホルモ ン類を用いて植物組織培養する場合には、 植物ホルモンの 種類やその添加量によっては、 增殖や分化を阻害する等の 問題があった。 従って、 各種の植物組織や器官あるいは培 養細胞からの不定胚形成率を高め、 さらには不定胚の生長 や植物体への再生を効果的に促進させる方法が望まれると ころである。
    [0009] また従来から、 植物が産生するアル力ロイ ド、 テルぺノ ィ ド、 色素などの天然有機化合物は医薬、 食料などに広く 利用されてきた。 植物が産生するこれらの有用物質を得る には、 天然に生育した、 あるいは栽培された植物より抽出 する方法が古く から採用されてきたが、 植物の量や質など は自然の条件に左右され、 また収穫にも時間と手間がかか り有用物質を大量に得るためには有効な方法とはいえなか つた。 そのため近年では、 植物組織培養技術を用いて植物 培養細胞を大量に培養するこ とによって、 有用物質を計画 的、 安定的に生産することが行われている。 かような有用 物質生産を目的と した植物組織培養では、 有用物質を多量 に含む培養細胞を大量かつ迅速に培養することが望ま しい 力 使用する培地成分によつて培養細胞が有用物質を全く 産生しなく なったり、 産生量が非常に減少することがある。 従ってかような分野においては、 有用物質の産生が促進さ れるような植物組織培養法の出現が望まれている。
    [0010] さらにまた、 植物組織培養を利甩したクローン植物大量 培養法の一つと して、 人工種子の開発が着目され、 野菜や ィネなど多く の植物種で実用化に向けての試みがなされて いる。 人工種子は、 不定芽や不定胚などの植物体再生組織 を、 人工的な胚乳と人工膜によつて包埋したものである。 人工的な胚乳は、 植物体再生組織に栄養を与えたり発芽を 制御する物質を含む部分である。 人工膜としてはアルギン 酸カルシゥムが最適とされているが、 その他の高分子ゲル 化剤についても種々検討がされている。 かような人工種子 の発芽率を高めるために、 人工的な胚乳に植物ホル乇ンの —種であるァブシジン酸を添加するという報告もある。 し かしながら人工種子を播種したのち、 アブシジン酸が水に 溶解拡散するまでに時間を要するため、 必ずしも発芽率が 高まるとは限らない。 また、 高濃度の糖などを人工的胚乳 部分に添加する方法も提案されているが、 雑菌の繁殖を促 し、 生育に支障をきたす場合がある。 従って、 人工種子中 の不定胚などの植物体再生組織の生長を促進し、 その発芽 率を高めることができれば人工種子の実用化が一層進展す ることになろう。
    [0011] 発 明 の 開 示
    [0012] そこで本発明の主たる目的は、 その種類や添加量等によ つては增殖や分化を阻害する問題のあつた植物ホルモン類 を使用することなく、 植物組織や培養細胞を効果的に増殖 あるいは分化させることができる、 改良きれた植物組織培 養法を提供することにある。
    [0013] 本発明の他の目的は、 植物組織あるいは培養細胞からの 植物体再生を効率よく促進させることができる植物組織培 養法を提供することにある。
    [0014] 本発明の他の目的は、 有用物質産生能を有する植物細胞 を生長 （増殖） させ、 有用物質の産生を促進させることが できる植物組織培養法を提供することにある。
    [0015] 本発明のさ らに他の目的は、 高い発芽率を有する改良さ れた人工種子を提供することにある。
    [0016] すなわち本発明による植物組織培養法は、 光合成原核微 生物の培養濾液及び 又は抽出物を含む培地で植物組織、 器官あるいはそれらの一部あるいは培養細胞を培養するこ とを特徵とするものである。
    [0017] 本発明で使用される光合成原核微生物と しては、 シァノ パクテリァ類ゃ光合成細菌類等が好ま しく使用できる。 かような本発明の植物組織培養法によれば、 植物組織、 器官あるいは培養細胞の増殖を効果的に促進させることが でき、 不定胚の形成、 植物体の再生、 さ らには有用物質の 産生を促進させることができる。
    [0018] さ らに本発明によれば、 発芽率の高い人工種子を提供す ることができる。 すなわち、 本発明による人工種子は、 不 定胚のごとき植物体再生組織を人工胚乳および人工膜によ つて包埋してなる従来の人工種子において、 人工胚乳の中 に光合成原核微生物の培養濾液及びノ又は抽出物を含ませ たことを特徴とするものである。 発明を実施するための最良の形態
    [0019] 本発明で利用できる光合成原核微生物と しては、 シァノ バク テ リ ア類 [ R.Rippka and R. Y.Stan ier ， J. Gen. Microbiol Ill , 1-61 (1979) により種々分類されてい る。 ] や光合成細菌類等がある。 '
    [0020] シァノノ クテリア類と しては、 例えばクロログレオピシ ス厲 (Chl.orogloeopisis sp.)、 デ'ノレモカノレノヾ属 (Dermocar— pa sp.) 、 ノ ス ト ッ ク属 (Nostoc sp.)、 シネココ ッカス属 (Synechococcus sp. ) ォスシラ 卜 リア属（Osci 11 atoria sp.)があり、 具体例と しては、 ク ロ ロ グレオ ピシス属 ATCC 27181、 デルモカルパ属 ATCC 29371 、 ノス ト ッ ク属 ATCC 27895、 シネココッカス属 ATCC 27192 、 ATCC 29404、 ATCC 29534、 ATCC 27170、 ォスシラ ト リァ属 ATCC 27906 などが挙げられる。
    [0021] また、 光合成細菌類と しては、 例えば、 ハロバクテリ ウ Λ (Halobacterium sp. ) 、 ロ ドシユー ドモナス属 (Rho- dopseudomonas sp.)、 口 ドスヒ リラム属 (Rhodospiri 1 lum sp.)があり、 具体例と しては、 ノヽロバクテリ ゥム · クチル プルム（H.cutirubrum) ATCC 33170 、 ハロバクテリ ウム 《 メ ディ テラネィ （H.mediterranei) ATCC 33500 、 ハロバク テリ ゥム · サッカゾレポゾレム（H. saccharovorum) ATCC 29252. ハロバクテリ ウム · サリナリ ウム （H.salinarium) ATCC 19700 、 ノヽ ロ ノくクテリ ウム · ソ ドメ ンセ （H.sodomense) ATCC 33755、 口 ドシユー ドモナス · ァシ ドフイ ラ（R.aeid - ophila) ATCC 25092、 口 ドシュ一 ドモナス ♦ ルティ ラ （R. rutila) ATCC 33872、 口 ドシュ一 ドモナス ♦ スフ エ ロイデ ス（R.spheroides) ATCC 17024 、 ロ ドシユー ドモナス ♦ ビ リデイ ス（R.viridis) ATCC 19567、 口 ドシユ ー ドモナス ♦ ブラスティ 力 （R.blastica) ATCC 33485 、 ロ ドス ピリ ラム · モ リ シァナム（R.molischianum) ATCC 14031 、 ロ ドス ピ リラム * ホ トメ ト リ クム（R.photometricum) ATCC 27871、 ロ ドス ピリ ラム · ルブラム（R.rubrum) ATCC 277 、 ATCC 17031 、 ロ ドス ピリ ラム · テヌェ（R.tenue) ATCC 25093な どが挙げられる。
    [0022] 上記した微生物あるいはその変種や変異株以外にも、 天 然から分離した海洋性あるいは淡水性の各種光合成原核微 生物も本発明において利用できる。
    [0023] 光合成原核微生物の培養は、 無機塩類等を含む培地を用 い、 タンク培養や太陽光を利用した屋外開放培養といった 培養法で行う ことができる。 また本発明においては、 目的 とする光合成原核微生物が天然にある程度豊富に存在する ならば、 その微生物の存在する海水あるいは淡水を、 光合 成原核微生物の培養液として使用することもできる。
    [0024] 光合成原核微生物の培養濾液は、 上述した培養法で得ら れた培養液を遠心分離あるいは濾過などを行つて取得でき る。 得られた培養濾液の生物活性が弱い場合は、 前記の濾 液を減圧濃縮などにより濃縮して用いてもかまわない。 こ の際、 濃縮倍率が大きく なり塩濃度が高く なると植物組織 に悪影響がなく なるまで脱塩したのち使用するのが望ま し い。 また、 光合成原核微生物の抽出物は、 前記した光合成原 核微生物の菌体または適度に破砕した菌体を、 常温または 加熱した適当な溶媒と接触させて溶媒中に抽出させること によつて得られたものである。 ここで用いる溶媒としては、 菌体によつて種々の溶媒を単独または複数併用してかまわ ないが、 一般的には水性溶媒が好ま しい。 水性溶媒として は、 水単独あるいは酸、 塩基、 塩類または有機溶媒を溶解 した水溶液などが使用できる。 また、 メタノール、 エタノ —ル、 酢酸ェチルエステル、 エーテル等の有機溶媒で抽出 後、 有機溶媒を除去した後、 水に溶解させてもよい。 本発 明で使用できる抽出物としては、 前記した方法により得ら れた抽出液、 あるいはこれらの抽出液から得られた分画液 などがあるが、 これらを適宜濃縮あるいは希釈して使用で きる。 さらに、 これらの抽出液あるいは分画液を減圧乾燥、 凍結乾燥、 噴霧乾燥等により乾燥し粉末としたものも使用 できる。 抽出液から活性の強い分画液を得るには、 透析、 ゲル濾過、 限外濾過等を行い、 分子量の大きさで分画し各 々の画分のうちから活性画分を選択すればよい。
    [0025] 上述した光合成原核微生物の培養濾液あるいは抽出物か ら有機溶媒による分画操作により得られた塩基性物質は、 特に生物活性が強いことが判明している。 有機溶媒抽出に よる分画操作は、 「物質の単離と精製」 （東京大学出版会、 1 976年発行） 2 5〜 3 1頁に記載の一般的理論と分画方法 に基づいて行う ことが可能である。 この方法は通常、 試料 水溶液に塩酸等の酸を加えて PH 3に調整後、 適当な有機溶 媒を加え酸性物資を抽出する。 しかしながら目的に応じて 適宜 PH等の諸条件を変えて抽出を行っても差し支えない。 分画に用いる有機溶媒としては、 エチルアルコール、 クロ 口ホルム、 酢酸ェチル、 ブ夕ノールなどを用いることが多 いが、 適当な溶媒を適宜選択して用いることができる。 ま た、 上述した方法で得られた塩基性画分から有機溶媒を除 去後、 水に溶解して用いてもよい。
    [0026] 光合成原核微生物の培養濾液及び/又は抽出物の植物組 織培養用の基本培地への添加量は、 用いる菌、 培養条件、 抽出液量等の条件で変動するため、 あるいは、 各種分画操 作後の有効成分の回収率、 液量の増減等不確実な要因のた め、 一概に規定することは困難であるが、 有効な添加量は 実験により容易に決めることができる。 例えば、 光合成原 核微生物としてシネココッカス属 ATCC 27192 あるいは口 ドシユー ドモナス · ブラスティ カ ATCC 33485 を用いる場 合には、 培養濾液については 1 00倍に濃縮したもの、 抽出 液については 3 g乾燥菌体を 100ml抽出用液で抽出したも のを、 それぞれ植物組織培養用の基本培地に対して Q . i〜 2 0 %の濃度範囲で添加できるが、 添加濃度が高すぎると 効果が低下することがある。
    [0027] 植物組織培養に使用する基本培地や培養方法などは通常 の植物組織培養におけるものと同様である。 すなわち基本 培地と しては、 ムラシゲとスクーグ （Mu rash i ge Skoog) 培地（1962 ) [以下 " M S培地" と略記する] が代表的なも のと してあげられる力 ί、 その他の植物培養に適した種々の 培地、 あるいはそれらの改変培地を適宜選択して使用でき る。 さらに、 光合成原核微生物の培養濾液ゃ抽出物の他に、 通常の培養に使用される植物ホルモン、 ココナッツミルク、 カゼイ ン分解物や酵母抽出物なども目的に応じて培地に添 加してもよい。
    [0028] 本発明において培養の対象となる植物の種類は、 分化全 能性を有し組織培養が可能なものであれば特に制限はなく、 どんな植物でも適用可能である。 これら植物の組織、 器官 あるいはそれらの一部、 あるいは培養細胞を培養に供する ことができるが、 これらを初代培養あるいは継代培養した ものも培養可能である。
    [0029] 以下実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。 なお、 以下の実施例において使用するニンジン培養細胞 と不定胚の培養、 および光合成原核微生物の培養濾液と柚 出物の調製は下記のようにして行なつた。
    [0030] ( I ) ニンジン培養細胞の作製及び不定胚の培養
    [0031] 二ンジンの無菌種子の芽ばえにおいて胚軸が 1 0 cm位に 生長したものを約 l cm位に切断し、 下記培地中で 2 5 °C、 暗条件下で培養した。 培地は基本培地として MS培地を使 用し、 これにショ糖 3 %、 オーキシン類の植物ホルモンで ある 2,4-D (2,4-ジクロロフヱノキシ酢酸） I を添 加し pH 5.5〜pH 5.7に調製した。 約 1 ヶ月の培養後、 培地 中の 2,4-D濃度を O.llmg に減少させた培地に移植し、 振盪速度 9 0回/分のレシプロ式シヱ一力一を用いて振盪 培養した。 その後、 1週間に 1回の割台で 2,4- D O.llrag /^を含む培地に植え継いで二ンジン培養細胞を得た。 また、 ニンジン培養細胞は、 形態的分化を行なって不定 胚を形成することが知られている。 そこで、 液体培養にて 継代培養した上記培養細胞を 2, 4-Dを含まない基本培地に 移植して培養することにより、 不定胚を形成させた。
    [0032] (Π ) 光合成原核微生物の培養濾液及び抽出物の調製 シ ァ ノ バク テ リ ア類と して シネ コ コ ッ カ ス属 ATCC 27192 、 光合成細菌と して口 ドシユ ー ドモナス ♦ プラステ ィ 力 ATCC 33485 を用いた。 これらの光合成原核微生物を ATCC指定の培養条件にてそれぞれ培養後、 培養液を遠心濾 過して濾液を得、 さらにエバポレイターで 100倍に濃縮し た。 この濃縮液をモザイ ク荷電膜脱塩器 （デザルト ン DS- 103 ： 東ソ一株式会社製） で脱塩し、 0.45 mのメ ンブラ ンフィ ルターを用いて濾過し、 得られた濾液を光合成原核 微生物培養濾液として用いた。 一方、 上記光合成原核微生 物の培養液から菌体を集菌後凍結乾燥し、 水に対して 3 % になるように菌体を懸濁させ、 100°Cで 6 0分間熱水抽出 し、 遠心分離して上澄液を 0.45^ mメ ンブラ ンフィ ルター を用いて濾過して得られた抽出液を光合成原核微生物抽出 物と して用いた。
    [0033] 実施例 1 ： 二ンジン培養細胞の増殖
    [0034] ショ糖 3 %と 2,4-D 0.11 g/S を含む M S培地に （ Π ) で調製した光合成原核微生物抽出物を 1 %添加した培地と 無添加の培地を用い、 （ I ) で作製したニンジン培養細胞 を 2 5 °C、 暗条件下で 1 2日間液体振盪培養し、 細胞数を 調べた。 結果を表一 1に示す,
    [0035]
    [0036] 註） ： 細胞数の測定は、 「植物組織培養の技術」 （1983 年発行、 竹内、 中島、 古谷、 朝倉書店） p. 38 に準じて下記のように測定した。
    [0037] セルラーゼ * オノズカ R - 10 2%、 マルセロチ ーム E-10 1 %、 ドリセラーゼ 2%、 塩化カル シゥム （ C a C 12 2 H2 0 ) 0.5%、 マンニ トール 0.7Mを用いて、 30 、 60分間、 振幅 7 cm. 振盪回数 90回 Z分で振盪し、 次に 50回
    [0038] Z分の振盪を 90分間行ない、 遊離してきたプロ 卜プラス トの数を 0.1翻の深さのへモサイ トメ一 夕一を用いて計測し細胞を測定する。 実施例 2 ： 二ンジン培養細胞からの植物体の再生
    [0039] ショ糖 3%を含む MS培地に （Π) で調製された光合成 原核微生物の培養濾液及び抽出物を 1 %添加した培地と無 添加の培地を用い、 （ I ) で作製したニンジン培養細胞を 25°C、 暗条件下で 30日間液体振盪培養し、 形成された 不定胚について 1 0 日目、 2 0 日目、 3 0 日目に観察した 結果を表一 2に示す,
    [0040] 表一 2
    [0041]
    [0042] 註） 2 不定胚形成率 ： 不定胚数を全細胞あるいは細胞塊 数で割った値。
    [0043] *3 符号の説明
    [0044] 〇 ： 不定胚から発芽、 発根の形態の変化がすみや かに起こり生長も早かつた。
    [0045] X ： 不定胚から発芽、 発根の形態の変化がすみや かに起こ らなかった。 実施例 3 ： 二ンジン不定胚からの植物体の再生
    [0046] 二ンジン不定胚は （ I ) で得られた不定胚から 148 及び 200 m のナイ ロ ンメ ッ シュを用い 148 〜200 n m の大き さの不定胚を選別し使用した。 得られた球状から魚雷型ま での不定胚を植物ホルモンを含まない M S培地で液体振盪 培養した。 この際、 （Π ) で調製された光合成原核微生物 の培養濾液及び抽出物 1 . 5 %を添加した培地と無添加の培 地を用いた。 2 5 °C、 明条件下 （ 2000ルックス、 1 6時間 照明） で 3 0日間培養し、 不定胚の状態を調べた結果を表 一 3 (1) に示す。
    [0047] 表一 3 (1)
    [0048]
    [0049] X ： ほとんど胚の生長が認められない。
    [0050] △ ： 胚の生長は認められるが、 期間内では
    [0051] 植物体の再生が認められない。
    [0052] 〇 ： 成熟胚を経由し、 植物体を再生している さらに、 光合成原核微生物の培養濾液中及び抽出物中の 高分子画分と低分子画分の植物体再生への影響を調べた。 すなわち、 （Π ) で調製した光合成原核微生物の培養濾液 及び抽出物 5 0 mlを V I SKASE社の透析用セル口一スチュー ブ （商品名 "セルロースチューブ 30/32" ) を用いて蒸溜 水 1 £ に対して透析した。 得られた透析液を高分子画分と し、 透析外液は減圧濃縮によって 5 0 mlまで濃縮して低分 子画分と し、 それぞれ以下の実験に供した。 一方、 ニンジ ン不定胚は 425 及び 800 a m のナイ ロ ンメ ッ シュを用いて 425 〜800 m の不定胚を選別し、 これを植物ホルモンを 含まない M S培地で液体振盪培養し、 植物体にまで再生さ せた。 このとき、 上記のように して分画した光合成原核微 生物の培養濾液中又は抽出物中の高分子画分又は低分子画 分を、 それぞれ 200 g Z mlの濃度で添加した培地と無添 加の培地を用いた。 2 5 °C、 明条件下 （ 2000ルッ クス、 1 6時間証明） で 1 0 日間培養し、 植物体の再生を調べた 結果を表 - 3 (2) に示す。
    [0053] 表一 3 (2)
    [0054] 実施例 4 ： カ ト レアのプロ トコーム状球体からの植物体の
    [0055] 再生
    [0056] 材料は、 カ ト レア類に属するレリオカ ト レア （Laelio- cattleya) の側芽の成長点付近の分裂組織から誘導された プロ トコ一ム状球体 （以下 P L Bと略記する） である。 P L B培養培地としては、 ハイポネッ クス （Hyponex ； 6.5- 6-19) にジャガイモジュース 7 %、 炭素源と してシ ョ糖 2 %を含むものを使用した。
    [0057] 初期誘導の P L Bの中から成熟した P L Bを選び、 さ ら に各々の 1個の P L Bを 4つに分割し、 供試用 P L Bを調 製した。
    [0058] P L B培養培地に対して （ Π ) で作製した光合成原核微 生物の培養濾液及び抽出物を 0.5%添加した寒天培地と無 添加の寒天培地で、 2 5 °C、 明条件下 （ 2000ル ッ ク ス、 1 6時間照明） で 6 ◦ 日間培養し、 4 0 日後の置床 P L B の状態と、 6 0 日後の増殖した P L B数とそれからのシュ 一卜発生数を調べた結果を表— 4に示す。
    [0059] 表一 4
    [0060] 実施例 5 ： ダバコ · カルスからの植物体の再生
    [0061] 材料は、 タ ノく コ （ Nicotiana tabacum L.cv. Bright Yellow) の茎の髄組織由来のカルスである。 カルスの培養 は、 MS培地を使用し、 これに植物ホルモンとして、 イ ン ドール酢酸 （ lnigZ ） と力イネチン （ を添 加した寒天培地上で継代培養した。
    [0062] 上記基本培地に対して、 （Π) で調製した光合成原核微 生物の培養濾液及び抽出物を 1.5%添加した培地と無添加 の培地を作製した。 それぞれの培地に対して、 継代培養さ れたカルスを力 ミ ソリの刃を用いて 5誦角の大きさに切断 し、 力ルス切片を試験管中の寒天培地に試験管 1本に 1個 の割合で移植したものを各々 25本用意し、 25で、 明条 件下 （2000ルツ クス、 16時間照明） で 14日間培養し、 発生したシュー トを観察した。 その結果を表— 5に示す。
    [0063] 表一 5
    [0064] 実施例 6 ： セ ン トボーリ ァ葉柄からの植物体の再生
    [0065] ナフ タ レ ン酢酸 （lmgZ ） と力 イ ネチ ン （ ImgZ ） を含む M S培地を基本培地と し、 （ Π ) で調製した光合成 原核微生物抽出物を 2.0%添加した培地と無添加の培地を 作製した。 それぞれの 300ml容の三角フラスコ中の寒天培 地に 5删位に切断したセ ン トポーリァ葉柄を置床し、 置床 後 1週間は暗所培養し、 その後 2 0 °C、 明条件下 （ 2000ル ッ ク ス、 1 6時間照明） で 3 0 日間培養し、 発生した シュ ー ト及び葉の状態を観察した。 その結果を表一 6に示す。
    [0066] 表一 6
    [0067] 実施例 7 ： ニン ジ ン培養細胞からのカ ロチノ ィ ドの生産 カ ロチノ ィ ド産生二ンジ ン培養細胞は、 キン トキニンジ ンの根より誘導したカロチノィ ド産生能を有する細胞を用 いた。
    [0068] 培地は、 M S培地を使用し、 これにショ糖 （ 3 %) 、 2, 4-D ( 1 mg/ JI ) 添加し、 ΡΗ 5·5〜 5.7に調整し寒天を 1 %加えた寒天固体培地を基本培地と して使用した。 この基 本培地に光合成原核微生物の培養濾液及び抽出物を 1 %添 加したものと、 無添加のものを調製し、 2 5 °C、 暗条件下 で上記のカロチノィ ド産生ニン ジ ン培養細胞を 5 ◦ 日間培 養し、 細胞内に蓄積されたカロチノィ ド量を測定比較した t カロチノィ ド量は、 培養細胞の生重量を測定後、 乳鉢中 で細胞を破砕し、 少量のアセ ト ンを加えて抽出し、 3mlの 石油エーテルを加えて、 石油エーテル層中にカロチノィ ド を移行させ、 分光光度計を用いて石油エーテル層の 453M における吸光度を測定することによつて算出した。 その結 果を表一 7に示す。
    [0069] 表一 7
    [0070] 実施例 8 ： ヨウシュャマゴポゥ培養細胞からのべ夕シァニ
    [0071] ンの生産
    [0072] ヨウシュャマゴボウ培養細胞は、 ヨウシュャマゴボウの 茎より誘導したベタシァニン産生能を有する細胞を用いた, 培地は、 M S培地を使用し、 これにショ糖 （3 %) 、 2, 4-D を添加し、 pH 5.5〜 5.7に調整した培地を 基本培地として使用した。 この基本培地に （Π ) で調製し た光合成原核微生物の培養濾液及び抽出液を 1 %添加した ものと無添加のものを調製し、 光照射 （ 2000ルッ クス） 条 件下、 2 5 °Cにて、 上記のベタシァニン産生ヨウシュャマ ゴボウ培養細胞を 1 4 日間液体懸濁培養し細胞内に蓄積さ れたベタシァニ ン量を測定比較した。
    [0073] ベ夕 シァニ ン量は、 培養細胞の生重量を測定後、 乳鉢中 で細胞を破砕し、 少量の水を加えて抽出し、 遠心分離後上 澄の 535nmにおける吸光度を分光光度計を用いて測定する ことによって算出した。 その結果を表一 8に示す。
    [0074] 表一 8
    [0075] 生 里 ベタシァニ ン量 添 力 Π 物 ( g ) ( g / g生 量） 無 添 カロ 4 . 2 1 4 9
    [0076] シァノバクテリ ア類
    [0077] •培 養 濾 液 1 9 . 8 2 5 8
    [0078] • 抽 出 物 1 4 . 6 2 2 5
    [0079] 光 合 成 細 菌 類
    [0080] •培 養 濾 液 1 6 . 3 2 3 2
    [0081] •抽 出 物 1 4 . 8 2 4 8 実施例 9 ： ニンジン不定胚の生長
    [0082] 光合成原核微生物の培養濾液中および抽出物中の塩基性 物質を以下のようにして分画した。 すなわち、 （ Π ) で調 製した光合成原核微生物の培養濾液及び抽出物それぞれに 1 Nの塩酸を加えて pH 3に調整後、 クロ口ホルムを加え酸 性物質を抽出し、 次に、 それぞれの水層の pHを 1 Nの水酸 化ナ ト リウムを加えて ρΗ Ι 2に調整し、 クロ口ホルムを加 えて塩基性物質を抽出した。 次いでクロ口ホルムを減圧蒸 留して除去し PH4の超純水に溶解し、 その後凍結乾燥を行 い、 供試塩基性物質とした。
    [0083] —方、 ニンジ ン不定胚は、 （ I ) で得られた不定胚から 148 m のナイ ロ ンメ ッ シュを用いて 148 m 以上に生長 した不定胚のみを選別し使用した。 選別された不定胚のほ とんどは、 球状から初期の心臓型胚であった。
    [0084] かく して選別された不定胚を、 植物ホルモンを含まない M S培地で液体振盪培養して生長させ、 あるいは植物体に まで再生させた。 この際、 （Π ) で調製した光合成原核微 生物の培養濾液あるいは抽出物を 1 . 5%添加した培地と無 添加の培地、 さらには光合成原核微生物の培養濾液ぁるい は抽出物から得られた塩基性物質を l OOppm添加した培地を 用いて、 2 5 °C、 明条件下 （ 2000ルッ ク ス、 1 2時間照明） で 1 ヶ月間培養し、 不定胚の生長状態を調べた結果を表一 9に示す。
    [0085] 生長 し た不定胚の数 *5 添 力 Π 物 (個数ノ 100ml) 無 添 加 60 (20) シ ァ ノ バ ク テ リ ア類
    [0086] • 培 養 濾 液 200 ( 1 20)
    [0087] •抽 出 物 180 ( 1 60)
    [0088] ♦培養濾液塩基性物質 420 (3 1 0)
    [0089] •抽出物塩基性物質 680 ( 530 ) 光 合 成 細 菌 類
    [0090] •培 養 濾 液 250 ( 180)
    [0091] • 抽 出 物 3 1 0 (21 0)
    [0092] •培養濾液塩基性物質 480 ( 200 )
    [0093] •抽出物塩基性物質 530 (3 1 0) 註） $5： 生長した不定胚とは、 不定胚の長さが 5iira以上に 生長したものである。
    [0094] *6： ( ) 内の数値は、 芽、 根の再生が確認できた数 を示す。 実施例 1 〇 ： 二ンジン不定胚を用いた人工種子の調製
    [0095] 光台成原核微生物抽出物中の高分子画分と低分子画分を 以下のようにして分画した。 すなわち、 （Π) で調製した 光台成原核微生物抽出物 50 mlを V1SKASE社の透析用セル ロースチューブ （商品名 "セルロースチューブ 30/32 " ) を用いて蒸溜水 1 に対して透析した。 得られた透析液を 高分子画分とし、 透析外液は減圧濃縮によって 5 0 mlまで 濃縮して低分子画分とし、 それぞれ以下の実験に供した。 —方、 ニンジン不定胚は、 （ I ) で得られた不定胚から 148 // m のナイロンメ ッ シュを用いて 148 以上に生長 した不定胚のみを選別し使用した。 選別された不定胚のほ とんどは、 球状から初期の心臓型胚であった。
    [0096] かく して得られた不定胚を M S培地 2 5 ml中に懸濁し、 包埋剤として 3 % ( w/v)アルギン酸ナトリウムを含む 7 5 mlの M S培地と上記の懸濁液とを混ぜ合せ、 混液 100mlを 得た。 このとき、 （Π ) で調製した光合成原核微生物の培 養濾液もしく は抽出物、 または上記のようにして分画した 光合成原核微生物抽出物中の高分子画分もしく は低分子画 分を、 それぞれ上記混液 100mlに対して 1 0 % (w/v) の濃 度で添加した。 かく して得られた最終混液を、 5 0 mM塩化 カルシウム溶液中に滴下することによって、 アルギン酸力 ルシゥムからなる人工膜を有する球状の人工種子を得た。 次いでこの人工種子を、 無菌的に 2 5て、 明条件 （ 2000 ルックス、 1 2時間照明） で 1 ヶ月間培養し、 発根、 発芽 状態を調べた。 結果を表— 1 ◦に示す。 表一 1 0
    [0097] 人工種子数 発根数 発芽数 添 力!] 物 (個） (個） (個） 無 添 加 1 0 1 23 2 1 シ ァ ノ バ ク テ リ ア類
    [0098] •培 養 濾 液 1 28 48 39
    [0099] ♦抽 出 物 1 30 68 72
    [0100] •抽出物の高分子画分 1 38 1 1 3 89
    [0101] ♦ 抽出物の低分子画分 1 21 43 38 光 合 成 細 菌 類
    [0102] •培 養 濾 液 1 28 54 38
    [0103] •抽 出 物 1 30 78 60
    [0104] •抽出物の高分子画分 1 34 1 0 1 73
    [0105] • 抽出物の低分子画分 1 31 64 5 1
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1 . 光合成原核微生物の培養濾液及び 又は抽出物を含む 培地で植物組織、 器官あるいはそれらの一部あるいは培 養細胞を培養することを特徵とする植物組織培養法。
    2 . 植物組織、 器官あるいはそれらの一部あるいは培養細 胞を培養して増殖させる請求の範囲第 1項記載の培養法。
    3 . 植物組織、 器官あるいはそれらの一部あるいは培養細 胞を培養して不定胚を形成させる請求の範囲第 1項記載 の培養法。
    4. 植物組織、 器官あるいはそれらの一部あるいは培養細 胞を培養して植物体を再生させる請求の範囲第 1項記載 の培養法。
    5 . カルスを培養して植物体を再生させる請求の範囲第 4 項記載の培養法。
    6 . 不定胚を培養して植物体を再生させる請求の範囲第 4 項記載の培養法。
    7 . 植物組織片を培養して植物体を再生させる請求の範囲 第 4項記載の培養法。
    8 . プロ トコ一ム状球体を培養して植物体を再生させる請 求の範囲第 4項記載の培養法。
    9 . 植物組織、 器官あるいはそれらの一部あるいは培養細 胞を培養して植物の産生する有用物質を生産させる請求 の範囲第 1項記載の培養法。
    1 0 . 光台成原核微生物の培養濾液中及び Z又は抽出物中の 塩基性物質を含む培地を用いる請求の範囲第 1項記載の te "口¾塞
    愛 + o
    11 . 光合成原核微生物の培養濾液中及び/又は抽出物中の 高分子画分又は低分子画分を含む培地を用いる請求の範 囲第 1項記載の培養法。
    12 . 光合成原核微生物がシァノバクテリァ類または光合成 細菌類である請求の範囲第 1項記載の培養法。
    13 . 植物体再生組織を人工胚乳および人工膜によって包埋 してなる人工種子において、 前記人工胚乳に光合成原核 微生物の培養濾液及びノ又は抽出物を含ませることを特 徴とする人工種子。
    14. 光合成原核微生物の培養濾液中及び Z又は抽出物中の 高分子画分又は低分子画分を前記人工胚乳に含ませる請 求の範囲第 1 3項記載の人工種子。
    15 . 光合成原核微生物がシァノバクテリア類または光合成 細菌類である請求の範囲第 1 3項記載の人工種子。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0380692A1|1990-08-08|
    EP0380692A4|1991-01-09|
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    EP0525914B1|1996-03-20|
    EP0525914A1|1993-02-03|
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    EP0380692B1|1994-06-22|
    DE68916407D1|1994-07-28|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1990-02-08| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1990-02-08| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1990-03-26| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989908506 Country of ref document: EP |
    1990-08-08| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989908506 Country of ref document: EP |
    1994-06-22| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1989908506 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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