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    公开号:WO1989009274A1
    申请号:PCT/JP1988/000325
    申请日:1988-03-30
    公开日:1989-10-05
    发明作者:Hiroshi Deno；Hikaru Yamagata；Aya Itoh；Yoshie Emoto (Heiress Of Emoto, Tateki (Deceased)；Makiko Emoto (Heiress Of Emoto, Tateki (Deceased)；Mikiko Emoto (Heiress Of Emoto, Tateki (Deceased)；Tateki Emoto (Deceased)
    申请人:Seitaikinou Riyou Kagakuhin Shinseizougijutsu Kenk；
    IPC主号:C12P17-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] ト ロ ノ、。ン系アル力 ロ イ ドの生産方法 技 術 分 野
    [0003] 本発明はズボイ シァ、 ダッ ラ、 ノヽ シ リ ドコ 口、 ヒ ョ ス等の ト ロパン系アル力 ロ イ ドを代謝産生する植物の 組織を特定の培地を用いて組織培養するこ とにより ス コポラ ミ ンおよび/又はヒ ヨスチア ミ ン等の ト ロ ノ、。ン 系ア ル力 ロイ ドを製造する方法に関する。
    [0004] 背 景 技 術
    [0005] 植物の二次代謝産物の一つであるアル力 ロイ ドとし て、 例えばス コ ポ ラ ミ ンは鎮痙剤、 鎮痛剤および副交 感神経しや断薬として、 またヒ ヨ スチア ミ ンは副交感 神経しや断薬として、 それぞれ医薬として重用されて いる。 これらの化合物は、 天然の植物体中から抽出し て製造されているが、 天然物を原料としているため、 その生産が天候に左右されるこ と、 収穫時期が限定さ れていることなどが問題となっている。 そのためこれ らの化合物を植物の組織培養により生産する研究が内 外で数多 く行われた。 カルスによる生産では、 山田ら によ る ヒ ヨ スの カ ルス によ る生産例が知られてい る 〔 Plant Cell Reports 丄、 101〜 103 (1982) 〕 力く、 ス コボラ ミ ン舍量は 20ppmと、 天然の植物体中の舍量 と比較して低いものであった。 また山田らは、 ズボイ シァ（Duboisia Leichhardti i F. Muell)の組織培養に より得られる不定根中に著量のスコボラ ミ ンおよびヒ ヨスチアミ ンが存在することを見出している 〔 P l a n t Ce l l Repor ts _3_ 186〜188 (1984) } が、 その量は まだ充分とは言えないものであった。 そこで、 ズボイ シァ不定根の各種培養条件を検討し、 培地のア ンモニ ゥムィォンと硝酸ィオンの比率を 0. 2以上にすること および培地の溶存酸素濃度を 10ないし 65 ppmとするこ とにより、 トロパン系アルカ ロ イ ドの生産性を向上さ せることを見岀し、 本出願人はそれぞれ特願昭 60— 14 3882号および特願昭 60— 143881号として特許出願して いるが、 工業的な見地からはその生産性を更に高める ことが望まれる。
    [0006] したがってこのような組織培養により トロパン系ァ ルカロイ ドの工業的な生産を目指す場合、 さらに生産 性を高めることが重要な課題であった。
    [0007] このような事情にかんがみ、 本発明者らば、 ズボイ シァ、 ダッラ、 ノヽシリ ドコ 口およびヒヨス属等の ト ロ パ ン系アル力ロイ ドを産生する植物の不定根等の組織、 細胞を効率よく培養する方法を研究した結果、 次のよ うな事実を見出した。
    [0008] 発 明 の 開 示
    [0009] 本発明者らは、 上記植物の組織、 細胞を特定の化合 物を舍有する培地を用いて組織培養を行う と、 得られ る組織、 細胞中の ト ロパ ン系アル力ロイ ドの舍暈が向 上するか、 あるいは不定根等の組織、 細胞の生育が促 進され、 結果と して ト ロバン系アル力 ロ イ ドの生産性 が向上するこ とを見出し、 本発明を完成するに到った。 即ち、 本発明によれば、 ト ロパン系アル力 ロイ ドを 産生する植物の組織又は細胞を、 （A)ァ ミ ン類、 )舍硫 ア ミ ノ酸類及び Z又はォキシア ミ ノ酸類、 （0ジべレ リ ン、 （ )アブシジ ン酸及びノ又は抗サイ ト カ イ ニ ン物質 から成る群より選ばれる化合物を舍有する培地を用い て組織培養して ト ロパン系アル力ロイ ドを生産するこ とを特徴とする ト ロバン系アル力 ロ イ ドの生産方法が 提供される。
    [0010] 発明を実施するための最良の形態
    [0011] 本発明方法が適用される植物として具体的には、 ズ ホ シァ · ¾：ォホロ イ デス (Duboisia myoporo i des) , ズボイ シァ · ラ イ ヒ ノヽルディ （Dubois i a 1 e i ch har d t i i ) 等のズボイ シァ属植物、 ダッラ .タツラ（Datura tatula) ダッラ ' アルボレァ（Datura arborea) , ダッラ ' ス ト ラモニゥム（Datura stramonium) 等のダッラ属植物、 スコボリ ア · ジャポ二力 (Scopol ia j aponica) 等のス コポリ ア属植物、 ヒ ヨ シァマス ' 二ガー （Hyoscyamus n i ger )等のヒ ヨス属植物およびァ ト ローバ · ベラ ド ン ナ（Atropa belladonna) 等のア ト ローパ属植物などの ナス科植物等が挙げられる。
    [0012] 本発明では前記植物の組織あるいは細胞を培養する に当たつては、 従来から知られている植物の組織培養 に使甩されている培地において、 （A)ア ミ ン類、 )舍硫 ァ ミノ酸類及びノ又はォキシァ ミ ノ酸類、 （Qジべレリ ン、 アブシジン酸及び Z又は抗サイ トカイ 二ン物質 から成る群より選ばれた化合物を舍有させたものを用 いることを特徴とする。 該成分以外の他の成分として は、 無機成分及び炭素源を必須成分とし、 これに植物 ホルモ ン類、 ビタ ミ ン類を添加し、 更に必要に応じて ァ ミ ノ酸類を添加する。
    [0013] 本発明で使用する こ とのできるア ミ ン類とは、 スぺ ルミ ン 〔 H2N- (CH2) 3fili- (CH2) 4-NH- (CHZ) 3-NH2〕 、 ス ペルミ ジン 〔H2N- (CHZ) 3NH- (CH2) 4-NH2 〕 、 ブ ト レシ ン 〔H2N-(CH2) 4- NH2〕 などのテ ト ラメ チレンジア ミ ン とその誘導体及びジァミノ プロバン 〔H2N- (CH2) 3-NH2J ジァ ミ ノ プロ ピルア ミ ン 〔H2N- (CHZ) 3-NH- (CH2) 3-NH2〕 などのポリ アルキレンポリ ァ ミ ン類及びその誘導体で ある。
    [0014] 本発明では該ァ ミ ン類の使用割合としては、 培地に おけるア ミ ン類の濃度が通常 O.OlmMないし 10mM、 好ま しく は 0. 1 mMないし 5 mMの濃度になるようにして使用 される。 本発明では前記ア ミ ン類を 1 種又は 2種以上 混合使用しても差し支えない。 本発明方法のようにァ ミ ン類を含む培地を用いて前記植物の組織を培養した 場合にはア ミ ン類を舍まない培地を使用した場合に比 ベて ト ロパン系アル力 ロ イ ドの生産量が増大する。 本発明で使用できる舍硫ア ミノ酸類とはメ チォニン 質、 シスチン類、 システィ ン類から選ばれるィ ォゥを 舍むア ミ ノ酸又はその誘導体である。 以下に、 これら について詳述する。
    [0015] 本発明に係るメ チォ二ン類は一般式 〔 I 〕
    [0016] NHR1
    [0017] R2SCHzCH2CHC0R3 〔 1 〕
    [0018] 0
    [0019] 〔式中、 R1 は H又は ！ - C- (Rは H又は低級アルキル 基） を示し、 は H又は低級アルキル基又は L—ァ ラニル基を示し、 R3は 0H、 NHz 又は OM (Mは金属ィォ ンを示す） で表わす。 〕
    [0020] で表わされるア ミノ酸とその誘導体であって、 具体的 にはメ チォニンおよび N—ホ レミ ルメ チォニン、 N— ァセチルメ チォニン、 N—プロ ピオニルメ チォニ ン等 の N—ァシルメ チォニン、 ホモ システィ ン、 2—ア ミ ノ 一 4 —ェチルチオブタ ン酸、 2—ア ミ ノ ー 4 —プロ ピルチオブタ ン酸等のメ チォニ ン以外の 2—ァ ミ ノ 一 4 —アルキルチオブタ ン酸、 シスタチォニン、 2 —ァ セチルア ミ ノ ー 4 —ェチルチオブタ ン酸等の N—ァ シ ルメ チォニン以外の 2—ァ シルア ミ ノ ー 4 —アルキル チォブタ ン酸、 2—ァ ミ ノ 一 4 ーメ チルチオブタ ン酸 ア ミ ド等の 2—ァ ミ ノ 一 4 —アルキルチオブタ ン酸ァ ミ ドおよび 2—ァセチルァ ミ ノ 一 4 —メ チルチオブタ ン酸ア ミ ド等の 2—ァシルァ ミ ノ 一 4 —アルキルチオ ブタ ン酸ァ ミ ドを例示できる。 本発明ではこれら化合 物のう ち該化合物中のカルボキシル基が培地を構成す る後述の無機成分と同じ金属ィオンと塩を形成してい ても良く、 本発明ではこの塩も培地成分として使用で きる。
    [0021] 本発明に係わるシスチン類は一般式 〔 I〕 〔 Π〕
    [0022]
    [0023] (式中、 B 1と R 3は前記一般式 〔 I 〕 の場合と同一） - で表わされるァ ミノ酸とその誘導体であって具体的に はシスチン、 N , Γ—ジホルミルシスチン、 N , Nしジァ セチルシスチン、 N , Γ—ジプロピオニルシスチン等の
    [0024] N , Nしジァ シルシスチン、 ビス （ 2 —ア ミ ノ ー 2 —ァ ミノ カルボニルェチル） ジスゾレフィ ド、 ビス （ 2 —ァ セチルァミノ 一 2 —ァ ミ ノ カルボ二ルェチル） ジスル フィ ド等のビス （ 2 —ァシルア ミノ ー 2 —ァ ミ ノ カル ボ二ルェチル） ジスルフィ ドを例示する ことができる , 本発明ではこれら化合物のう ち該化合物中の力ルボキ シル基が培地を構成する後述の無機成分と同じ金属ィ オンと塩を形成していても良く、 本発明ではこの塩も 培地成分として使用できる。 本発明に係わる システィ ン類は一般式 〔 II〕
    [0025] NHR1
    [0026] I ( I )
    [0027] HSCH2CHC0 3
    [0028] (式中、 R1と R3は前記一般式 〔 I 〕 の場合と同一） で表わされるア ミノ酸とその誘導体であって具体的に はシスティ ンおよび N—ホル ミ ノレシスティ ンおよび N —ァ セチルシステ ィ ン、 N—プロ ピオニルシス テ ィ ン 等の N— ァ シルシスティ ン、 2—ア ミ ノ ー 3 — メ ノレ力 ブ トブタ ン酸ア ミ ドおよび 2—ァセチルァ ミノ 一 3 _ メ ルカプ トブタ ン酸ア ミ ド等の 2—ァシルァ ミ ノ 一 3 —メ ルカプ トブタ ン酸ア ミ ドを例示できる。 本発明で はこれらの化合物のう ち該化合物中のカルボキ シル基 が培地を構成する後述の無機成分と同じ金属ィ オ ン と 塩を形成していても良く、 本発明ではこ の塩も培地成 分として使用できる。
    [0029] 本発明の組織培養では、 培地の必須成分と して前記 した舍硫ア ミ ノ酸類の他に前逑の如く ォキシア ミ ノ酸 類を単独使用あるいは舍硫ア ミ ノ酸類と併用使用する こ とができ るな この場合のォキシア ミノ酸類と して具 体的には、 一般式 〔 IV〕 剛1
    [0030] I 〔 IV〕
    [0031] R4-CH (OH) CHC0 3 (式中、 Rlと R3は前記一般式 〔 I 〕 の場合と同一であ り、 R4は H又ば CH3を示す。 ）
    [0032] で表わされるア ミノ酸およびその誘導体であって、 具 体的にはセリ ン （R'、 R3、 R4= H) 、 ト レオニン （R'、 R3= 4 = CH3). N—ホルミルセ リ ン、 N—ァセチ ルセリ ン、 N—プロ ピオ二ルセリ ン等の N—ァシルセ リ ン、 2—ァ ミノ 一 3 —ヒ ドロキシプロパン酸ア ミ ド、 2—ァセチルァ ミ ノ 一 3 —ヒ ドロキシプロパン酸ァ ミ ド等の 2—ァ シルァ ミ ノ 一 3 —ヒ ド口キシプロノ、。ン酸 ア ミ ド、 N—ホルミル ト レオニン、 N —ァセチル トル ォニン、 N—プロ ピオニル ト レオニン等の N—ァ シル ト レオニン、 2— 7 ミノ ブタ ン酸ア ミ ド、 2—ァセチ ルァ ミ ノ ブタ ン酸ァ ミ ド等の 2—ァシルア ミ ノ ブタ ン 酸ア ミ ドを例示できる。 本発明では、 これら化合物の う ち該化合物中のカルボキシル基が培地を構成する後 述の無機成分と同じ金属ィォンと塩を形成していても よ く、 本発明ではこの塩も培地成分として使用できる。 本発明では培地に舍まれる前記した舍硫ァ ミノ酸類 および Z又はォキシァ ミノ酸類の使用割合としては 0.3 〜： LOmMの範囲であり、 該範囲の中でも 0. 5〜 3 milの範 西が特に好ま しい。 舍硫ア ミノ酸類とォキシア ミノ酸 類を併用使用する場合には、 両成分の合計量が前記範 面にあるようにして培養が行われる。 培地中の舍硫ァ ミノ酸類およびノ又はォキシア ミノ酸類の含有量がこ の範囲外にある場合には、 このよう な培地を用いて組 織培養を行っても ト ロパン系アル力 ロイ ドの生成量は それ程向上しないので、 本発明では該成分の含有量を 前記範囲にした培地を用いて組織培養が行われる。
    [0033] 本発明において使用できる抗サイ トカイ ニ ン物質と しては、 例えば、 アデニン、 ピリ ドピリ ミ ジ ンおよび ト リ アジンの誘導体等の抗サイ トカイ ニン活性を有す る化合物がある。 本発明におけるアブシジ ン酸の添加 量と しては、 培地におけるアブシジン酸の濃度が 1 0 - 8 〜1 0—5 M となるように添加する ことが望ま しい。 同様 に抗サイ トカイ ニンの添加量としては、 培地における 濃度が 1 0 _ 8〜10—5 Μ となるよう に添加するこ とが望ま しい。
    [0034] 本発明で使用できるジベレ リ ンは、 式 (1)
    [0035] で示されるジバン核を持つ植物ホルモ ンの総称で、 こ れ迄に約 50種類のジペレリ ン 〔これらは通常 G A n ( η = 1 〜50の整数） で表記される〕 が報告されているが、 本発明ではこれら各種のジベレ リ ンのいずれも使用す るこ とが出来る。 本発明ではこれらジべレリ ンの中で も特に (2)式 (2)式
    [0036] で示されるジベレリ ン A 3 (G A 3 ) を用いるとベルベリ ン 等のイ ソキノ リ ン系アル力ロイ ドの含有量が増すので 好ましい。
    [0037] 培地に添加するジべレリ ンの使用割合は、 通常 10 9 モルノ £以上、 好まし く ば 10— 8〜10 _ 3モルノ £である. ジべレリ ンを舍む培地を用いて組織培養する方法で は、 トロバン系アル力ロイ ドの産生量が増大するだけ でな く、 該二次代謝産物が細胞外へ放出される量が著 しぐ増大するという特徴がある。 従って、 従来法に比 ベて培養系からの ト ロノ ン系アル力ロイ ドの分離回収 が容易となり、 かつ培養物を廃棄することなく繰り返 し使用することができるため、 トロパン系アル力ロイ ドの生産性を高めることができる。
    [0038] 本発明で使用される培地において、 前記した (A)ァ ミ ン類、 ©)舍硫ァ ミノ酸類及び Z又はォキシァミノ酸類. (0ジベレリ ン、 （Dァブシジン酸及びノ又は抗サイ トカ ィ ニ ン物質から成る群より選ばれた化合物以外の他の 培地成分については、 無機成分としては、 窒素、 リ ン. カ リ ウム、 ナ トリ ウム、 カルシウム、 マグネシウム、 ィ ォゥ、 鉄、 マンガン、 亜 18、 ホウ素、 モ リ ブデン、 塩素、 ヨ ウ素、 コ バル ト等の元素を舍む無機塩を挙げ る こ とができ、 具体的には硝酸カ リ ウム、 硝酸ナ ト リ ゥ ム、 硝酸ア ンモニゥ ム、 塩化ア ンモ ニゥ ム、 塩化力 リ ウ ム、 塩化カルシウ ム、 リ ン酸 1 水素カ リ ウ ム、 リ ン酸 2 水素カ リ ウ ム、 硫酸マグネシウム、 塩化マグネ シゥ ム、 硫酸ナ ト リ ウ ム、 硫酸第 1 鉄、 硫酸第 2 鉄、 硫酸マ ンガン、 硫酸銅、 モ リ ブデン酸ナ ト リ ウ ム、 三 酸化モ リ ブデ ン、 ヨ ウ化カ リ ウ ム、 硫酸亜鉛、 ホ ウ酸、 塩化コバル ト等の化合物を例示でき る。
    [0039] 該培地の炭素源と しては、 シ ョ糖等の炭水化物とそ の誘導体、 脂肪酸等の有機酸およびエタノ ール等の 1 級アルコ ールなどを例示できる。
    [0040] 該培地の植物ホルモ ン類と しては、 例えば、 ナフタ レン酢酸（N A A) 、 イ ン ドール酢酸（ί ΑΑ) 、 ρ—ク ロ 口 フエノ キ シ酢酸、 2 , 4 —ジク ロ ロフヱノ キシ酢酸 （2 , 4 - D) 、 イ ン ド一ル酩酸（Ι ΒΑ) およびこれらの誘導体 等のオーキ シン類およびべンジルアデニン（ΒΑ )、 カイ ネチ ン、 ゼァチ ン等のサイ ト カ イ ニ ン類を例示でき る。 本発明ではサイ ト カ イ ニン類は通常は培地に添加しな いこ とが望ま しいが、 必要に応じて添加する場合には サイ ト カ イ ニ ン類は濃度が通常 l O—KO . OZfflg Z 以 下の低濃度で使用する こ とが好ま しい。
    [0041] 該培地のビタ ミ ン類と しては、 ピオチ ン、 チア ミ ン (ビタ ミ ン B , ) 、 ピ リ ドキ シ ン （ビタ ミ ン B 6 ) 、 ピ リ ドキサ一ル、 ピリ ドキサミ ン、 パ ン ト テ ン酸カ ルシゥ ム、 ァスコルビン酸 （ビタ ミ ン C)、 イ ノ シ トール、 二 コチン酸、 ニコチ ン酸ァ ミ ドおよびリ ボフ ラビン (ビ タ ミ ン B2) などを例示できる。
    [0042] 該培地のァミノ酸類としては、 例えばグリ シン、 ァ ラニン、 グルタ ミ ン酸、 システィ ン、 フエ二ルァラ二 ンおよびリ ジンなどを例示できる。
    [0043] 本発明の前記培地は、 通常は、 前記無機成分を約 0.1 M ないし約 100mM 、 前記炭素源を約 1 gノ ないし 約 100gZ £、 前記植物ホルモ ン類を約 0.01 M ないし 約 100 M 、 前記ビタ ミ ン類を約 0. 1 mg/ &ないし約 150mg/ iおよび前記ァ ミノ酸類を 0 ないし約 lOOOnig £舍ませて使用されることが望ましい。
    [0044] 本発明のズボイ シァ属植物の組鎩培養に用いられる 前記培地として具体的には、 従来から知られている摘 物の組織培養に用いられている培地、 例えば、 ムラ シ ゲ · スク一グ Γ 62) (Murashige Skoog 〕 の培地、 リ ンスマイ ヤー · ス.クーグ（RM-1965) 〔Linsmaier & Skoog 〕 の培地、 ホワイ ト （'63) C White 〕 の培地、 ガンボルグ 〔G- amborg 〕 の B -5培地、 三井の M- 9培地、 ニッチ ' ニッチ 〔Nitsch itsch 〕 の培地等に前記し た炭素源および植物ホルモンを添加し、 更に必要に応 じて前記したビタ ミ ン類、 ァ ミノ酸類を添加して調製 される培地を例示できるが、 本発明ではこの中でも特 にニ ッ チ · ニ ッ チ、 リ ンスマ イ ヤ一 · ス ク 一グ又はム ラ シゲ ' スクーグの培地を用いて調製される培地が好 ま しい。 なお、 上記した従来公知の培地の組成に関し ては、 例えば、 竹内、 中島、 古谷著の 「新植物組織培 養」 P386〜P39 1、 朝倉書店、 1 979年に記載されている。 本発明で使用できる前記培地は液体培地又は寒天や ゼラ チ ン等を通常 0. 5 〜 1 %含有させた同型培地であ るが本発明では液体培地を用いる こ とが好ま しい。
    [0045] 本発明の組織培養では、 ト ロパ ン系アル力ロ イ ドを 代謝産生する植物の組織片を、 前記培地を用いて組織 培養し、 ト ロバン系アル力 ロ イ ドを含有する培養細胞 ないし培養組織を得る。 本発明では該培養組織として は不定根が特に好ま しい。
    [0046] 本発明の組織培養に用いられる前記植物の組織とし て具体的には、 該植物の根、 葉、 茎、 種子、 花芽など の他にも本発明に係わる組織培養あるいは他の従来の 組織培養方法によって得られる該植物の培養細胞ない し培養組織を例示できる。 本発明では、 これらの中で は植物組織を前もって組織培養して得られる不定根を 使用してこれを本発明に係わる培地を用いて組織培養 するこ とが特に好ま し く 、 この場合には原料の不定根 が本発明の培地を用いて増殖培養されて ト ロパ ン系ァ ルカ ロ イ ドを多量舍有する不定根が得られる。
    [0047] 本発明では通常前記した組織片あるいは細胞から力 ルスが誘導され、 該カルスを継代培養して得られる培 養細胞ないしは培養組織は本発明の前記培地を用いて 増殖培養されて ト ロパン系アル力 ロイ ドを多量舍有す る培養物、 特に不定根を得るというような組織培養の 方法を用いることが好ましい。
    [0048] 本発明では不定根を用いる場合に、 植物の組織片を 例 は ¾根病菌 （例えば Agrob ac ter i um rh i zogenes ) で感染させ、 これによつて出現する毛根を用いるこ と もできる （例えば本出願人に係わる特願昭 61 - 89975号 で提案した方法を用いることもできる。 ）
    [0049] 本発明の方法によって得られる ト ロパン系アルカロ イ ドとして具体的には、 スコポラ ミ ン、 ヒ ヨスチア ミ ン及びこれらの化合物のァセチル化合物を例示できる が、 この中でばスコポラ ミ ンと匕ヨスチア ミ ンが好ま しい 0
    [0050] 本発明では ト ロパン系アル力 ロイ ドを舍有する培養 細胞から該ァルカロイ ドを分難する方法としては、 例 えば薬局法等に記載-されている、 ト ロパン系アルカロ イ ドを含有する植物からこれら化合物を単離精製する 場合に用いられてきた通常の方法を採用することがで き る。
    [0051] 以下、 本発明の方法を実施例によって更に具体的に 説明する。
    [0052] 実 施 例 1 当社薬草園にて栽培した Duboisia myporoides B.Br. の葉を洗浄し、 10%ア ンチホルミ ン液に 10分間浸漬し、 次いで滅菌水で 3 回洗'净した後、 約 l otに切断し、 ナ フタ レン酢酸およびべンジルアデニンをそれぞれ 10—5 M および 10- 6M となるように添加したリ ンスマイ ヤ一 • スクーグの寒天培地に置床し、 25°Cで 30日間培養す る。 カルス形成と同時に発生した不定根を切り出し、 イ ン ドール酪酸を 10— 5M になるよう に添加したニ ッチ ， ニ ッ チの液体培地に移植し、 2年間継代培養した。 このようにして得た不定根 lOmg (乾燥重量） をスペル ミ ジンを 1 milになるよう に添加し、 ィ ン ドール酪酸を 10"5M になるよう に添加したニッチ · ニッチの液体培 地 20m£を舍む 100111£容の三角フラスコに移植し、 3週 間振とう培養した。 得られた不定根 190mg (乾燥重量） を乾燥後、 塩基性のク ロ口ホルム一メ タノ ール液 50 mi て抽出した。 これに 40 の 1 N硫酸を加えてアル力 口 ィ ド層を硫酸層に移した。 さ らに、 ア ンモニア水 2 m£ およびク ロロホルム 40 m を加えてアル力ロイ ドをク 口 口ホルム層に移し、 これを減圧濃縮し、 ガスク ロマ ト グラフでアル力ロイ ド量を分折した。 この場合のアル 力ロイ ドの生産量を表 1 に示した。 なお、 ガスク ロマ トグラフの分折は以下の条件で行った。
    [0053] カ ラム ： Silicone 0V-17 ( 1 ) on
    [0054] Chromosorb (Mesh 80〜： 100) 3 mm ^ X 1 m ガラ'スカラム
    [0055] キヤ リ ャガス ： 2
    [0056] 力 ラム温度 ： 200. *C
    [0057] 実施例 2〜 6及び比較例 1
    [0058] ア ミ ン類としてブ ト レシン、 ジァ ミ ノ ブ口ノ、'ン、 ジ ア ミノ エタ ン、 カダベリ ン又はジァ ミノ プロ ピルア ミ ンを培地に添加した以外は実施例 1 と同様にして行つ た結果 （実施例 2 〜 6 ) 及びア ミ ン類を添加しない培 地を用いて実施例 1 と同様に行った結果 （比較例 1 ) を表 1 に示した。
    [0059] 実 施 例 7
    [0060] ズボイ シア (Duboisia myporoides B.Br) の葉を 10 %ア ンチホルミ ンで処理したのち、 ベンジルアデニン 10"5 含むリ ンスマイ ヤー . スク一グ（LS)の寒天培地 に置床した。 1 ヶ月後発生した苗条を同じ培地で 40日 間継代培養して得られるまだ木化していないズボイ シ ァ苗条の茎を 1 〜 2 cm程度切断し、 24時間振とう培養 し Agrobacterium .rhizogenes ΗβΙ-lの懸濁液（107偭 m£) に浸漬後、 植物ホルモンを含まない LS寒天培地 に置床した。 3週間後苗条の茎の切断部位から不定根 が発生した。 これをア ンピシリ ン 0. 1！^ ^舍む LS液 体培地で 2 日藺処理し菌を舍まない自己増殖性のズボ イ シァ感染不定根を得た。 このズボイ シァ感染不定根 を LS液体培地で 1年間継代培養した。 この不定根 lOnig (乾燥重量） をスペルミ ジンを 1 mMになるよう に添加 した LS液体培地 20 miを舍む l OO mi容三角フ ラスコ に移 植し、 2週間振とう培養した。 得られた不定根 150mg (乾燥重量） を乾燥し、 実施例 1 と同じ方法で抽出し、 アル力ロイ ド量を分折した。 この場合のアル力 ロイ ド の生産量を表 2 に示した。
    [0061] 実 施 例 8
    [0062] ア ミ ン類と してプ ト レシ ンを添加した培地を用いた 以外は実施例 7 と同様にして行った結果を表 2 に示し た。
    [0063] 比 較 例 2
    [0064] 実施例 7 においてスペル ミ ジ ンを添加しなかった以 外は該実施例と同様にして行った結果を表 2 に示した。
    [0065]
    [0066] 2 添 加 量 生 育 量 スコポラ ミ ン ヒヨスチア ミ ン 実 験 添 加 物
    [0067] (mM) (g/£) (mg/ a ) (mg/ j6 ) 比較例 2 ,0 4.1 10.7 29.5 実施例 7 スペルミジン 1 7.5 16.5 63.8 実施例 8 プ ト レ シ ン 1 7.3 16.1 54.8 培養組織 毛根病菌で感染させて使用
    [0068] 実 施 例 9, 10, 12, 13
    [0069] 実施例 1 と同様にして 2年間継代培養して得た不定 根 10mg (乾燥重量） をイ ン ドール酪酸を 10— 5M になる よう に添加したニ ッチ · ニ ッチの液体培地 20 m£を含む 100 ！^容の三角フ ラスコ に移植して培養開始後 10日 目 に L —メ チォニン濃度が各々 0.3m,1. 0. 5 m . 1. 0 mM 及び 2.0mMとなるように L —メ チォニンを先の液体培 地に添加して、 さ らに 11日間振とう培養した。 得られ た不定根を実施例 1 と同様の方法で抽出し、 ア ルカ ロ ィ ド量を分析した。 この場合のア ル力 ロイ ドの生産量 を表 3 に示した。
    [0070] 実 施 例 11
    [0071] 実施例 1 と同様にして 2年間継代培養して得られた 不定根 lOragを L —メ チォチン濃度が 1. O mMとなるよう に L —メ チォ二ンを添加し、 又イ ン ドール酪酸を 10— 5 M となるように添加したニッチ · ニ ッ チの液体培地 20 を舍む 10ひ m£容の三角フ ラスコ に移植して 3週間振 とう培養して得られた不定根を乾燥後、 実施例 1 と同 様に処理してアル力 ロイ ドを分析した結果を表 3 に示 した。
    [0072] 比 較 例 3
    [0073] 実施例 9 において L —メ チ才ニンを添加しない培地 を用いた以外は該実施例と同様に行った結果を表 3 に 示した。 比 較 例 4
    [0074] 実施例 9 において L 一メ チォニン濃度を 0. 2ηιΜとし た以外は該実施例と同様に行った結果を表 3に示した。 実 施 例 14 , 15
    [0075] 実施例 11で L 一メチォニンの代わり に L—シスチン を 0. 5 mM、 1. 0 mM用いた以外は該実施例と同様に行つ た結果を表 3 に示した。
    [0076] 比 較 例 5, 6
    [0077] 実施例 11で L 一メ チォ二ンの代わり に L—シスチン を 0. l mM、 0. 2 mMとした以外は該実施例と同様に行つ た結果を表 3 に示した。
    [0078] 実 施 例 16 , 17 , 18
    [0079] 実施例 11で L—メ チォニンの代わりに L—システィ ンを 0。 3 mM、 0. 5 mM、 3 mM用いた以外ば.該良施例と同 様に行った結果を表 3 に示した。
    [0080] 比 較 例 7
    [0081] 実施例 11でしーメ チォニンの代わりに L —システィ ンを 0. 1 用いた以外は該実施例と同様に行った結果 を表 3 に示した。
    [0082] 実 施 例 19 , 20
    [0083] 実施例 11で L一メ チォニンの代わり に Lーセ リ ンを 0. 5 mM及び 3. 0 用いた以外は該実施例と同様に行つ た結果を表 3 に示した。
    [0084] 比 較 例 8 実施例 1 1で L —メ チォニ ンの代わり に L —セ リ ンを 0. 1 ηι Μ用いた以外は該実施例と同様に行つた結果を表 3 に示した。
    [0085] 比 較 例 9〜14
    [0086] 実施例 9 において L 一メ チォニ ンの代わり に表 1 に 示したア ミ ノ酸を 1. 0 m M添加した培地を用いて該実施 例と同様に行った結果を表 3 に示した。
    [0087] (本頁以下余白）
    [0088] 実 施 例 21
    [0089] 実施例 7 においてス ペル ミ ジ ンの代わりに L —メ チ ォニンを用いた以外は該実施例と同様に行った結果を 表 4 に示した。
    [0090] 実 施 例 22
    [0091] 実施例 21で L —メ チォニンの代わりに L ーセ リ ンを 用いて培地の L —セ リ ン濃度が 3 m Mとなるよう にした 以外は該実施例と同様にして行った結果を表 4 に示し た。
    [0092] 比 較 例 15
    [0093] 実施例 21において L —メ チォ二ンを添加しなかつた 以外は該実施例と同様にして行った結果を表 4 に示し た。
    [0094] (本頁以下余白）
    [0095]
    [0096] n sreoo/88dr/JDd WZ60/68 O 実 施 例 23
    [0097] 実施例 1 においてスペル ミ ジンの代わり にジベレ リ ンの GA3 を 10-SM 用いた以外は該実施例と同様に行い アルカ ロ イ ド量を分析した。 さ らに培地中に存在する アル力 ロイ ドの量についても同様の方法で定量し、 ァ ルカ ロイ ドの総生産量を表 5に示した。
    [0098] 比 較 例 16
    [0099] 培地にジべレ リ ン GA3 を添加しないこ とを除き実施 例 23と同様に行い、 この場合のアル力 ロ イ ドの総生産 量を表 5に示した。
    [0100] 実 施 例 24〜26
    [0101] lOOccのエルレンマイ ヤーフ ラスコ に 10-5M のイ ン ドール酩酸を舍むニ ッチ · ニ ッ チの液体培地を 20m«仕 込み、 これに先の実施例 23で用いたズボイ シァの不定 根のシー ドを 0.5 g 移植して培養を行い、 実施例 23で は培養開始時に GA3 を添加したのに対して本実施例で ば培養 3週間目に GA3 を培地に 10_δΜ、 10— 5Μ又は 10一4 Μ 添加して培養を続け、 1週間後にフラスコから液体 培地のみを全量回収して、 この培地中のアル力ロイ ド の量をガスク ロマ トグラフ ィ 一によつて分析した結果 を表 6 に示す（Run 1 )。
    [0102] 次に先の液体培地を除いた残りの培養フラスコに更 に新しいニッチ · 二ツチの液体培地 20m£を加えて 3週 間培養した後、 これに GA3 を 10—6ίΚ 10"5M 又は 10- 4M となるよう先と同様に添加して培養を続け、 1週間後 に培養フラスコから液体培地のみを全量面収して、 こ の中に含まれるアルカ ロイ ドの量を分圻した結果（Run 2 ) を表 6 に示した。
    [0103] 比 較 例 Π
    [0104] 常法に従い lOOcc 用エルレンマイ ヤーフラスコを用 い、 10- 5M のイ ン ドール酪酸を含む二ツチ · ニ ッチの 液体培地 （20m ) にズボイ シァ不定根の種細胞 0. 5 g を仕込み、 4週間培養を行った後培養を止め、 不定根 および培地を回収した。 回収した不定根中に含まれる ヒ ヨスチア ミ ンは 396 μ g、 スコポラ ミ ンは 1023 μ g で あり、 一方培地中に存在するヒ ヨスチア ミ ンは 2 g 、 スコポラ ミ ンは 5 〃 g であった。
    [0105] (本頁以下余白） ン へ レ リ ノ 培地に放出されたアル力 ロ イ ドの量 （ g/20 m£培地） 実 験 Run
    [0106] 〔モル濃度〕 ヒ ヨ ス チ ア ミ ン ス コ ボ ラ ミ ン LトトL $ τϋ Μ σ'ι丄 17 ί ナ Γ )し 1 2
    [0107] 1 5 3 1 8 6 実施例 24 GA3 10-"
    [0108] 2 4 2 1 3 2
    [0109] 1 1 7 3 5 1 8
    [0110] 〃 25 GA3 10-5
    [0111] 2 1 3 6 4 3 8
    [0112] 1 2 3 8 7 2 5
    [0113] 〃 26 GA3 10
    [0114] 実 施 例 27
    [0115] 実施例 1 においてスペルミ ンの代わりに、 アブシジ ン酸を 10— 7 M になるように添加した以外は同様に行つ た結果を表 Ί に示した。
    [0116] 比 較 例 18
    [0117] 培地にァブシジン酸を添加しないことを除けば実施 例 27と全く同じ条件で培養した。 この場合のアルカ ロ イ ドの生成量を表 7 に示した。
    [0118] 実 施 例 28
    [0119] 培地にアブシジン酸の代わりに抗サイ トカイ ニン物 質である 4一ブチルァ ミ ノ — 2 —メ チルチオピリ ド 〔2 , 3- d 〕 ピリ ミ ジンを 10- 6 M になるよう に添加する ことを除けば実施例 27と全く同じ条件で培養した。 こ の場合のアル力 ロイ ドの生成量を表 7に示した。
    [0120] (本頁以下余白）
    [0121] 生 育 量 ア ル力ロイ ド舍量 （％) 添 加 物
    [0122] (g /£) スコ ポ ラ ミ ン ヒ ヨ スチア ミ ン 比較例 18 9.5 0.60 0.20 実施例 27 ァブシジン酸 10-7M 9.0 0.95 0.25
    [0123] 〃 28 B A P 10- 6M 9.4 0.90 0.26
    [0124] B A P ： 4 —プチルァ ミ ノ 一 2—メ チルチオ ピ リ ド 〔 2， 3- d 〕 ピ リ ミ ジ ン
    [0125] 産 業 上 の 利 用 可 能 性
    [0126] 本発明の組織培養による ト αパン系アルカ ロイ ドの 生産方法を採用すれば、 従来法に比べて 卜 ロパン系ァ ルカロイ ドを、 中でも特にスコポラ ミ ンおよび/又は ヒ ヨスチア ミ ンを大量に効率よ く生産するこ とができ る。
    权利要求:
    Claims

    4
    31 請 求 の 範 翻
    . ト ロパン系ア ル力 π ィ ドを産生する植物の組織又 は細胞を^ア ミ ン類、 ©)舍硫ア ミ ノ 酸類及び Z又は ォキ シア ミ ノ 酸類、 （Qジベレリ ン、 )ァブシジ ン酸 及び/又は抗サイ ト カ イ ニ ン物質から成る群よ り選 ばれた化合物を舍有する培地を用いて組織培養して ト ロパン系アル力 ロ イ ドを生産する こ とを特徴とす る ト ロ ノ ン系ア ル力 ロ イ ドの生産方法。
    . 培地に舍有される舍硫ア ミ ノ 酸類及び/又はォキ シァ ミ ノ酸類の濃度が 0. 3 〜： l O mMである こ とを特徴 とする請求の範囲第 1 項記載の ト ロパン系アルカ ロ ィ ドの生産方法。
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    引用文献:
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    法律状态:
    1989-10-05| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
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    1991-03-13| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988902939 Country of ref document: EP |
    1991-09-07| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1988902939 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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