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    公开号:WO1989007270A1
    申请号:PCT/JP1989/000084
    申请日:1989-01-27
    公开日:1989-08-10
    发明作者:Minoru Ogura；Masanobu Sawai；Michio Ito；Hideki Kohno
    申请人:Mitsubishi Kasei Corporation；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 発明の名称
    [0003] 抗原 .抗体の測定法
    [0004] [技術分野]
    [0005] 本発明は抗原 ·抗体反応により抗原又は抗体を測定する方法に関す る。 特に医療における臨床検査の分野における血清、 血漿、 尿等に含 まれるタ ンパク質及びその関連物質を抗原 ·抗体反応を利用して定性 的に若しくは定量的に測定する方法に関する。
    [0006] [背景技術]
    [0007] 現在、 免疫診断の分野においては、 RIA法（ラジオィムノアツセィ' 法）、 EIA法（ェンザィムィ ムノアッセィ法）、 TIA法（免疫比濁法） 及び LPIA法（ラテツ クス凝集反応法）の 4つの方法が一般的に用いら れている。 この中で、 ラテックスの如き不溶性担体粒子に抗体若しくは抗原を 担持させ、 検討中の抗原若しくは抗体を担持させ、 検体中の抗原若し くは抗体と反応させて抗原又は抗体を測定する方法として
    [0008] (ィ） 反応で生成した凝集塊の沈降（1日〜 2日を要する）持って、 その 上清の濁度を測定して未反応ラテツクスの量を検知し、 これか ら検体中の抗原若しくは抗体の量を測定する方法（たとえば
    [0009] N.Dezelicら、 Croatica Chemica Acta , 42 457 ( 1970 ) )。
    [0010] (口） 反応混合物から凝集物を分離することなく、 そのままの状態 特定波長の光を照射して散乱光若しくは透過光の強さを測定 し、 その変化から検体中の抗原若しくは抗体を定量する方法（た とえば、 特公昭 58-11575号公報）。
    [0011] がある。 し力 し、 （ィ）の方法では反応開始から測定までに長時間を 要し、 （口）の方法においても高感度の測定を必要する項目について は必ずしも十分ではないという問題があつた。
    [0012] 他方、 不溶性担体に担持させた抗体又は抗原の抗原 ·抗体反応を 利用する抗体又は抗原の測定方法の一つとして、 一部の不溶性担 体を磁性体とする方法も提案されている（たとえば特開昭 61 128168号公報）。 しかしながら、 この公知の方法は、 担体の磁性を 利用して反応物を分離し、 その反応物中の予め結合されている蛍 光体或いは酵素の量を測定するもので、 複雑な搡作を必要と し た。
    [0013] 一方、 近年多数の検体の分析法として、 多くの小孔を有するプ レートの各小孔中で呈色反応などを行わせ、 その小孔の光学密度 を直接測定することによって検体中の或る成分を分析する方法が 提案され広く普及している。
    [0014] 例えば、 マイクロタイ夕一と呼ばれるプレートは、 8cmXl2cm 位の大きさのプレートに 96ケの穴を有し、 同時に 96検体の分析が 可能で、 光学密度の読み取りも専用のリーダーにより 30〜40秒で可 能である。 今、 このような器具を用いてラテックスの凝集反応に よる抗原.抗体反応の測定を前記 (ィ）の方法で行う場合、 沈降した 凝集物が光路をさえぎり光学的測定が不能となる。 このため、 （ィ） の方法を採用するならば、 横からの測光か（これは不可能に近いが )、 或いは液の移し替えを必要とするというような問題があった。
    [0015] [発明の開示]
    [0016] 本発明は、
    [0017] 1. 不溶性の担体粒子の抗体又は抗原を担持させ、 この担持された 抗体又は抗原に、 抗原又は抗体或るいはその混合物を液体媒体中 で反応させて該反応の進行に伴う反応物の変化の度合いを測定す ることにより抗原又は抗体を測定する方法において、 上記担体粒 子として磁性体含有不溶性担体粒子と、 磁性体を含有していない 不溶性担体粒子を用いて上記反応を行い、 ついで反応混合物に磁 場を付与することにより未反応の磁性体含有不溶性担体粒子及び 磁性体含有不溶性担体粒子を含む凝集粒子を反応混合物から分離 し、 残存する磁性体を含有していない不溶性担体粒子を検知する - ことにより液体媒体中の抗原又は抗体を定性的に、 又は定量的に 測定することを特徴する抗原 ·抗体測定法。
    [0018] 及ぴ .磁性体含有不溶性担体粒子、 又は磁性体を含有していない不溶性 担体粒子に、 測定しょう とする抗原に対する抗体又は抗体に対す る抗原を感作した懸濁液と、 測定しょう とする抗原又は抗体を水 溶媒中で抗原 ·抗体反応が平衡に達しない或る一定時間反応させ、 さらに磁性体を含有しない不溶性担体粒子、 又は磁性体含有担体 粒子に測定しよう とする抗原に対する抗体又は抗体に対する抗原 を慼作した懸濁液を加え、 抗原.抗体反応が平衡に達するまで反応 させ、 反応が平衡に達した時点で反応混合物に磁場を付与するこ とにより、 未反応磁性体含有粒子.及び磁性体含有凝集粒子と磁性 体を含有していない不溶性担体粒子を分離し、 残存する磁性体を 含有していない不溶液担体粒子を測定することにより、 抗原又は 抗体を定性的に、 又は定量的に測定することを特徴とする抗原 · 体測定法。
    [0019] に関する。
    [0020] 以下、 本発明の抗原 ·抗体の測定法を詳細に説明する。
    [0021] 磁性体を含有する不溶性担体としては、 有機高分子物質及び無機微 粉末が使用可能である。
    [0022] 有機高分子物質と しては、 ポリスチレン、 スチレン -ブタジエン共 重合体粒子の如き乳化重合により得られる有機高分子のラテックスが あり、 特にポリスチレンラテックスが有用である。 無機微粉末として は、 セラミ ック微粒子、 シリ カ、 アルミナ、 シリ カ -アルミナ、 炭末 等が使用可能である。 不溶性担体粒子中に含有させる磁性体としては、 鉄及び磁性酸化鉄 が好ましく、 これを 5〜100%含有するように調整されたものが用いら れる。 .
    [0023] 不溶性担体粒子の粒径は 0.1μ〜5μの範囲内のものが用いられ、 0.2μ〜2μの範囲内の粒径を有する不溶性担体粒子が好ましい。
    [0024] 磁性体を含有していない不溶性担体としても、 上記の有機高分子物 質及び無機微粉末が使用可能であるが、 液体媒体中に分散させたと き、 測光するまでは自然の沈降がなく、 浮遊しているものが望ま し い ο
    [0025] また、 磁性体を含有しない不溶性担体として赤、 青、 緑、 黄色等の 色調のものを使用してもよい。
    [0026] この色調を持つ不溶性担体粒子は、 2種以上の抗体又は抗原を測定 するとき使用される。 この方法は、 例えば Αという抗原と Βという抗 原を同時に測定しょう とする場合、 磁性体含有担体粒子として A抗体 感作不溶性担体粒子と B抗体感作不溶性担体粒子を混合して使用す る。 一方磁性体を含有していない不溶性担体粒子としては A抗体感作 黄色不溶性担体と B抗体慼作青色不溶性担体粒子を混合して使用す ο
    [0027] 先づ、 A、 B抗原が測定しょう とする水溶媒中に含まれていない場 合には、 黄色と青色の不溶性担体粒子が存在し、 緑色となる。 抗原 A が多量にあり、 抗原 Bが存在しない場合には青色、 抗原 Bが多量にあ り抗原 Aが存在しない場合は黄色となる。 また抗原 Aと抗原 Bが共に或 る割合で存在する場合には、 黄と青を配合した色となる。
    [0028] 色調を有する不溶性担体粒子は、 有機高分子粒子又は無機微粉末粒 子中に種々の色調の色素を含有させるか、 粒子表面に色素を物理的吸 着法或いは化学的担持法によりコーティ ングする力、、 或いはアルブミ ン等のタンパクに色素を担持させ、 そのタ ンパクを不溶性粒子表面に 物理的に吸着させるか、 化学的に担持させることにより調製すること ができる。
    [0029] 不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持させるめる方法は、 磁性体を 含有する不溶性担体粒子及び磁性体を含有していない不溶性担体粒子 共に共通であって、 測定しょうとする被検体中の抗原又は抗体に対す る担体又は抗原を物理的に吸着させるか或いは化学的に担持させるこ- とにより実施される。
    [0030] 担持させる抗体としては、 グロブリ ン、 IgG、 IgM、 F ( ab，）2、 F ( ab，）等がある。 また担持されるものとして抗原を用いる場合に は、 細胞片、 ハプテン、 抗原タンパク、 免疫複合体等が用いられる。 一般的に担持される抗原又は抗体の量は 0.01mg/m！〜 10mg/mlであ り、 好ましくは 0.05mg/m！〜 lmg/mlである。
    [0031] 抗体又は抗原を担持させた不溶性担体粒子は、 0.1Mリン酸緩衝液（ pH 7 )、 0.1M Tris-塩酸緩衝液（pH 8.0 )等の水溶媒中に 0.01〜10重量 %となるように分散され、 懸濁液を形成する。 磁性体を含有する不溶性担体粒子と磁性体を含有しない担体粒子の 配合割合は、 1 : 20〜20： 1であり。 好ましくは 1： 4〜4： 1である。 次に具体的な測定方法について説明する。
    [0032] (1) 磁性体を含有しいる感作不溶性担体粒子と磁性体を含有してい ない感作不溶性担体粒子を、 予め、 混合する方法。
    [0033] まず、 磁性体を含有する感作不溶性担体粒子と磁性体を含有し ていなぃ感作不溶性担体粒子を予め、 前述の配合比で混合してお く。
    [0034] この混合懸濁液と測定しよう とする血漿、 血清又は尿等に含まれ る抗原又は抗体（以下検体とする） と反応させる。 検体は 0.1M Tris-塩酸緩衝液（ pH 8 )や 0.1Mリ ン酸緩衝液（ pH 7 )等の緩衝液で 希釈してもよい。 反応は室温で平衡になるまで行う。 また、 反応 速度を速めるために 25〜50。Cの恒温槽で反応させてもよい。 通常 室温で反応が平衡に達するまで約 30分を必要とする。 '
    [0035] (2) 磁性体を含有する感作不溶性担体粒子又は磁性体を含有してい ない感作不溶性担体粒子と検体を反応させ、 続いて、 磁性体を含 有していなぃ慼作不溶性担体粒子又は磁性体を含有している感作 不溶性担体粒子を添加する方法。
    [0036] まず、 磁性体を含有している感作不溶性担体（又は磁性体を含有 していない慼作不溶性担体）と検体、 又は緩衝液で希釈した検体と を反応させる。 反応は測定する抗原又は抗体によつて異なるがー 般に室温で約 10分間行う。 反応時間は磁性体を含有している感作 不溶性担体粒子（又は磁性体を含有していなぃ感作不溶性担体粒子 )に担持された抗体又は抗原と検体中の抗原又は抗体との抗体 ·抗 原反応が平衡に達しない時間が選ばれる。 続いて、 磁性体を含有 していない感作不溶性担体（又は磁性体を含有している感作不溶性 担体）が前述の配合比で添加され、 さらに抗体 ·抗原反応を行う。 反応を室温で平衡になるまで行う。 また反応速度を速めるために
    [0037] 25〜50。Cの恒温槽で反応させてもよい。
    [0038] (1)、 （2)の方法共に反応は一般に分光器用セル、 96穴マイクロプレー トの内で行われ、 反応が平衡に達した時、 容器の外部から磁場をかけ るか、 又は反応混合中に磁性体粉又は磁性体小片を投入又は揷入する ことにより、 容器の測光をさえぎらない位置に磁性体を含有する感作 不溶性担体粒子と磁性体を含有しない感作不溶性担体粒子との凝集塊 および未反応の磁性体を含有する感作不溶性担体粒子を集める。 磁石 としては永久磁石、 電磁石等を使用する。 反応液中には浮遊している 磁性体を含有していない感作不溶性担体が残存する。 この残存量は抗 原測定の場合は検体中の抗原量に、 抗体測定の場合は検体中の抗体量 に依存する。 この残存量を外部より 0.3〜： L.0 mの範囲にある一定波長 の光の吸光度又は散乱光強度を測定することにより求める。 本発明に おいては目的とする既知の濃度の異なるレベルの検体についての吸光 度、 又は散乱光の強度を測定することにより、 検量線を作成してお き、 この検量線を用いて未知濃度検体の吸光度、 又は散乱光強度より 未知濃度の抗原又は抗体の濃度を定量することかできる。 また、 残存する磁性体を含有してない不溶性担体粒子の量を目視で 検知することにより、 定性的に抗原または抗体の量を判定することが できる。
    [0039] 第 1図は底面が V字型になったマイクロタイターを用い、 各列 2倍希 釈濃度の抗原の検体を入れ反応させた後底部より磁場をかけたもので あるが、 磁性体含有担体及び凝集担体は V字型底部に速やかに沈殿 し、 抗原濃度の濃い場合には上澄が完全に透明で、 抗原濃度が薄くな るにつれ白色度が濃くなり V字型底部の沈殿物（実際には渴色〜黄色 を带びている）は次第に見えなく なつてくる。 この沈殿物の見える度 合いにより抗原量の土を目視により見分けることは容易であり、 場合 によっては標準品に基いて対照を作成しておく ことによ り或る量まで は定量を行うことも可能である。
    [0040] また、 従来モノクロナール抗体はラテツクス凝集法には利用が難し いと言われていたが、 本発明方法においては、 モノ クローナル抗体で 感作した磁性体を含有しない不溶性担体粒子と、 ポリ クローナル抗体 で感作した磁性体を含有した不溶性担体粒子を用いることによ りモノ クローナル抗体及びポリクロ一ナル抗体と反応する抗原を前記と同様 の方法で定性的に又は定量的に測定することができる。
    [0041] 本発明方法は、 従来の磁性体含有粒子を用いた技術と比較し、 次の 点が異なる。
    [0042] 1. 標識した不溶性担体粒子を使用しないため、 磁性体粒子又は磁 化粒子を含む凝集粒子を反応容器内に磁場をかけることによって 集め、 上清を除く といった操作や洗浄が不要であり、 操作が簡便 である。 つま り、 同一の反応容器内で、 反応から測定まで行うこ とが可能である。 このことは操作の自動化において大きなメ リ ツ トとなる。
    [0043] 2. 本癸明は、 ケィ光色素やラジオアイソ トープを使用せず、 特別 な装置や施設を必要としない。 つまり、 一般的な分光器あるいは マイクロプレートリーダによって測定が可能である。
    [0044] 3. 本発明は、 凝集粒子を測定するのではなく、 残存する磁性体を 含有していない不溶性担体粒子を測定するものである。 つま り、 検体中に抗原又は抗体が存在しない時吸光度及び散乱光強度が最 大となり、 抗原又は抗体量が増加するに従って磁性体を含有しな い不溶性担体粒子の吸光度及び散乱光強度は減少する。 これによ り、 測定装置の感度が最もよい吸光度又は散乱光強度となるよう に磁性体を含有しない不溶性担体粒子濃度を予め調整することが できる。 従って、 特にブランク値に近い低濃度検体を感度よく検 知することが可能である。
    [0045] また、 凝集した粒子を速やかに除くことが可能であるので、 測 定に要する時間が短時間であるので、 測定に要する時間が短時間 ですむ。
    [0046] [図面の簡単な説明] 第 1図は、 底面が V字型になったマイクロタイターを用い各列 2倍希 釈濃度の HCG (ヒ ト 繊毛性ゴナドトロピン）の検体を入れ反応させた 後底部より磁場をかけ磁性体含有不溶性担体粒子及び凝集した磁性体 含有不溶性担体粒子を底部に沈殿させた状態を示す図面である。 な お、 図面において、 Hは 9000m IU/mlの HCGを含有し、 以下 2倍希釈 で Aは HCGを含有していないものを示す。
    [0047] [発明を実施するための最良の形態 ]
    [0048] 以下に本発明を実施例をあげて説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
    [0049] 実施例 1 AFPの検出
    [0050] (試薬の調整法）
    [0051] - 磁性体含有抗 AFP感作ラテックスの調整法。
    [0052] 10% ( W/V )の 0.7μπιの磁性ラテツクス（ロンヌプーラン社製ェ スタボール SML266 )から分離したラテツクス 1%を分散させた 0.1Mの Tris-塩酸緩衝液（ pH 8.0 ) lccに、 ヒ ト AFP (アルファフエ トプロテイン）を動物に免疫して得られる抗 AP 特異抗体 lmgを 加え、 約 1時間撹拌し、 感作した後、 遠心分離（ 16,000 rpmで 10 分間）し、 上清を除き、 分離されたラテックスを 0.3%牛血清ァ ルブミ ン /0.1Mの Tris-塩酸緩衝液（pH 8.0 )に再分散させ、 更に 1 時間撹拌する。 再度遠心分離 ( 16,000 rpmで 10分間）を行った後 上清を除き、 0.1Mリン酸緩衝液（pH 7 )に再分散させる。 • 磁性体を含有しない抗 AFP感作ラテックスの調整法。
    [0053] 10% ( W/V )の 0.497μπιのポリスチレンラテツ クス （Dow社製） から分離したラテックス 1%を分散させた 0.1Mの Tris-塩酸緩衝液 ( pH 8.0 ) lccに、 抗 AFP特異抗体 lmg/mlを加え約 1時間撹拌し、 感作した後違心分離（ 16,000 rpmで 10分間）し、 上清を除き、 分 離されたラテツクスを 0.3%牛血清アルブミン /0.1Mの Tris-塩酸緩 衝液（pH 8.0 )に再分散させ、 1時間撹拌する。 再度遠心分離（ 16，000 rpnTC10分間）を行った後、 上清を除き 0.1Mリ ン酸緩衝 液（pH 7 )に再分散させる。
    [0054] (操作方法）
    [0055] ' 1%の磁性体含有抗 AFP感作ラテックスと 1%の磁性体を含有しな い AFP感作ラテックスを 1 ： 1の割合で混合した後、 0.1Mリ ン酸緩 衝液で 8倍に希釈する。 これをラテックス調整試薬とする。
    [0056] AFP標準品（250ng/ml、 ダイアヤト口ン社製）を AFPの含まれて いない人血清で 2倍希釈した系列を作製し、 これを検体とする。
    [0057] 96穴マイク口プレー ト （Falcon社製 Flexible Assay Plate平底） に検体 50μ1、 緩衝液（ 0.1M Tris-HCl ( pH 8.0 ) ) 50μ1、 ラテックス調 製試薬 50μ1を加え、 よく混合した後 30分室温で反応させる。 次に、 永久磁石をマイクロプレートの検体分注部測面に外部よりあて、 ' 測面に磁性体を含むラテックス凝集塊及び未反応磁性体含有ラ テックスを集める。 約 5分で磁性体を含有する凝集塊及び未反応磁 性体含有ラテックスを集めることができる。 そして、 このマイク 口プレー ト上に残存している磁性体を含有していない不溶性担体 粒子の濃度をマイクロプレー トリーダ一（日本インタ一メ ッ ト社製
    [0058] NJ2000 )によ り、 波長 620nmで、 その吸光度を測定することによ り測定した。
    [0059] 表 1に吸光度と AFP濃度の検量線データを示す。
    [0060] 表 1 AFP検量線デ—夕
    [0061] 波長 度 0 4.0 7.9 15.7 31.3 62.5 125 250 ng/ml ) 吸光度 0.824 0.749 0.608 0.484 0.392 0.334 0.290 0.27 (O.D)
    [0062] 実施例 2 大腸菌易熱性ェンテロ トキシンの検出
    [0063] (試薬の調製法）
    [0064] • 磁性体含有抗ェンテロ トキシン感作ラテックスの調整法
    [0065] コ レラ菌ェンテロ トキシンと大腸菌易熱性ェンテロ トキシンは 互いに免疫学的に抗原共通性を有するため、 コレラ菌ェンテロ ト キシンを動物に免役して得られる大腸菌易熱性ェンテロ トキシン 抗体 0.1mg/mlを、 10%の磁性体含有ラテックス（ロンヌプーラ ン社 製エスタポール SML266 )から分離したラテックス 1%を分散させた 0.1M Tris-HCl緩衝液（pH 8.0 )を lcc中に加え約 1時間撹拌し、 感作 する。 遠心分離（16，000 rpmで 10分間） し、 上淸を除き、 沈降した ラテツクスを 0.1%牛血清アルブミ ン /0.1M Tris-HCl緩衝液（pH 8.0 )に再分散させ、 約 1時間撹拌した後、 遠心分離（16,000 rpmで 10分 間）する。 上清を除き、 0.1Mリ ン酸緩衝液に再分散させる。
    [0066] • 磁性体を含有していない抗ェンテロ トキシン感作ラテツクス
    [0067] 磁性体を含有していなぃ感作ラテックスについては市販品（デン 力生研株式会社コレラ菌ェンテロ トキシン-大腸菌易熱性ェンテロ トキシン検出用キッ ト）の感作ラテツクスを使用した。
    [0068] (操作方法）
    [0069] 1%の磁性体含有感作ラテツクスを 0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.0 )で 8倍に希釈し、 磁性体を含有していない感作ラテツクス（デン力生 研社製）と 1 ： 2の割合で混合し、 これをラテックス調整液とする。 ェンテロ トキシンを 40ng/mlの割合で含有する 0.1M Tris-HCl緩 衝液（pH 8.0 )を 0.1M Tris-HCl緩衝液（pH 8.0 )で 2倍希釈系列をつ く りこれを検体とした。
    [0070] 96穴マイ クロプレー ト （Falcon社製 Flexible Assay Plate 平底） にサンプル 50μ1、 ラテックス調整試薬 ΙΟΟμΙを分注し、 よ く混合し た後 30分室温で反応させる。
    [0071] 次に永久磁石をマイクロプレー トの検体分注部側面に外部よ り あて、 側面に磁性体を含むラテツクス凝集塊および未反応磁性体 含有ラテツクスを集める。 約 5分で磁性体を含有する凝集塊および 未反応磁性体ラテツクスは集めることができる。 そしてこのマイ クロプレートをマイクロプレートリ一ダー（日本ィンタ一メ ッ ドネ土 製 NJ2000 )により、 波長 620ηπιで、 その吸光度を測定する。 表 2に その吸光度と濃度の検量線データを示す。
    [0072] 表 2 ェンテロ トキシン検量線データ
    [0073] 波長 620n
    [0074] 実施例 3 AFP， CEA同時検出
    [0075] (試薬の調整法）
    [0076] 3-1 磁性体含有抗 AFP感作ラテックスの調整法
    [0077] 10% ( W V )の平均粒径 0.7μπιの磁性ラテッ クス（ロンヌプーラ ン 社製エスタポール SML266 )かち分離したラテックス 1%を分散させ た 0.1Mの Tris-塩酸緩衝液（pH 8.0 ) lccにヒ ト AFP (アルファフエ ト プロテイン）を動物に免疫して得られる抗 AFP特異抗体 lmgを加 え、 約 1時間撹拌し、 感作する。 遠心分離（16,000 rpmで 10分間） し、 上清を除き、 沈殿したラテッ クスを 0.3%牛血清ァルブミ ン /0.1M Tris-塩酸緩衝液（pH 8.0 )に再分散させ、 1時間撹拌する。 再度、 遠心分離（16，000 rpniで 10分間）を行った後、 上清を除き、 0.1Mリン酸緩衝液（pH 7 )に再分散させる。
    [0078] 3-2 磁性体含有抗 CEA感作ラテックスの調整法
    [0079] 10% ( W/V )の平均粒径 0.7μπιの磁性ラテックス（ロンヌプーラ ン 社製エスタポール SML266 )から分離したラテックス 1%を分散させ た 0.1Mの Tris-塩酸緩衝液（pH 8.0 ) lccにヒ ト CEA (カルシノエンブ リオニック アンティジヱン）を動物に免疫して得られる抗 CEA特 異抗体 0.5mgを加え約 1時間撹拌し、 感作する。 遠心分離（16,000 rpmで 10分間）し、 上清を除き、 沈殿したラテックスを 0.1%牛血清 アルブミ ン /0.1M Tris-塩酸緩衝液（ pH 8.0 )に再分散させ、 1時間攬 拌する。 再度、 遠心分離（16，000 rpmで 10分間）を行った後、 上清 を除き、 0.1Mリン酸緩衝液（pH 7 )に再分散させる。 3-3 磁性体を含有しない抗 AFP感作ラテックスの調整法
    [0080] 10%(W/V)粒径 0.45〜0.55μπιの青色ポリ スチレンラテッ クス（口 ンヌプーラン社製エスタポール Κ050 Blue)から分離したラテッ ク ス 1%を分散させた 0.1Mの Tris-塩酸緩衝液（ pH 8.0 ) lccに抗 AFP特 異抗体 lmgを加え約 1時間撹拌し、 慼作する。 遠心分離（16,000 rpmで 10分間）し、 上清を除き、 沈殿したラテックスを 0.3%牛血清 アルブミン /O.lMTris-塩酸緩衝液（pH8.0)に再分散させ、 1時間撹 拌する。 再度、 遠心分離（16，000rpmで 10分間）を行った後、 上清 を除き、 0.1Mリン酸緩衝液（pH7)に再分散させる。
    [0081] 3-4 磁性体を含有しない抗 CEA感作ラテツクスの調整法
    [0082] 10%( W/V)の粒径 0·45〜0.55μπιの黄色ポリスチレンラテッ クス （ ロンヌプーラン社製エスタポール Κ050 Yeloow)から分離しラテツ クス 1%を分散させた 0.1Mの Tris-塩酸緩衝液 lccに抗 CE A特異抗体 0.5mgを加え、 約 1時間撹拌し、 感作する。 遠心分離（ 16,000 rpmで 10分間）し、 上清を除き、 沈殿したラテックスを 0.1%牛血清アルブ ミン /O.lMTris-塩酸緩衝液（pH 8.0)に再分散させ、 1時撹拌する。 再度、 遠心分離（16，000rpmで 10分間）を行った後、 上清を除き、 0.1Mリン酸緩衝液（ pH 7 )を再分散させる。
    [0083] 3-1、 3-2、 3-3、 3-4で調整した各ラテックス調整液を 0.1Mリン酸 緩衝液（pH7.0)で 2倍に希釈し、 等量づっ取り、 十分混合し、 A P、 CEA同時検出調整液とする。
    [0084] (操作方法） AFP標準品（ 250ng/ml、 ダイアヤトロン社製）を AFPと CEAを含 んでいない人血清で 2倍希釈系列を調整する。 また、 CEA標準品（ 160ng/mL 三菱化成製）を AFPと CEAを含んでいない人血清で 2倍 希釈系列を調整する。 AFP、 CEAともにある濃度をもつ検体のモ デルとして AFP標準品 250ng/mlと CEA標準品 160ng/mlを 1： 1で混 合し、 AFP 125ng/ml、 CEA 80ng/mlを含む溶液を作成し、 これを 0.1M Tris-HCl緩衝液で希釈し、 2倍希釈系列を調整する。 これら の調整した 3種類の希釈系列を検体として測定した。
    [0085] 96穴マイクロプレート（Falcon社製 Flexible Assay Plate平底） にサンプル 50μ1、 0。2M Tris-HCl緩衝液（ρΗ 8.0 ) 50μ1、 AFP, CEA 同時検出調整液 50μ1を分注し、 よく混合した後 30分室温で反応させ る。 次に永久磁石をマイク口プレー トの検体分注部側面に外部よ りあて、 側面に磁性体を含むラテックス凝集塊及び未反応磁性体 含有ラテツクスを集める。 約 10分で磁性体を含有する凝集塊およ び未反応磁性体含有ラテックスを集めることができる。 マイクロ プレートを目視的に色合いを観察することにより、 AFP、 CEAを 検出した。 結果を表- 3に示す。 表一 3
    [0086] AFP澳度 （ng/ml) 0 3.9 7.8 15.7 31.3 62.5 12.5 25.0 CEA濃度 （ng/ml) 0 0 0 0 0 0 0 0
    [0087] ①
    [0088] 色 合 い 緑 緑 黄緑 黄緑 黄緑 黄
    [0089] AFP濃度 （ng/ml) 0 0 0 0 0 0 0 0 CEA濃度 （ng/ml) 0 2.5 5 10 20 40 80 160
    [0090] ②
    [0091] 色 合 い 緑 緑 青緑 青緑
    [0092] AFP濃度 （ng/ml) 0 1.9 3.9 7.8 15.7 31.3
    [0093] CEA （ng/ml) 0 1.25 2.5 5 10 20
    [0094] ③
    [0095] 色 合 い 緑 緑 緑 緑 透明 透明 透明 透明
    [0096] ^∞ マイクロプレートの反応液の色が黄の場合は AFP陽性、 青の場 合は CEA陽性、 緑の場合は AFP、 CEAともに陰性、 透明の場合は AFP、 CEAともに陽性となる。
    [0097] [産業上の利用可能性]
    [0098] 本発明に係わる抗原 ·抗体の測定法は、 凝集塊を任意の方向に引 き寄せることができるのみならず、 引き寄せられた担体は器壁部 に容易に再拡散しないことら、 極めて微量の抗体又は抗原を定性 的にも しくは定量的に迅速に測定することができ、 更に操作が簡 便であるという特徴を有する。 従って、 医療、 生化学、 衛生学、 疫学等の種々の分野における微量物質の測定に利用することがで きる。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. 不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持させ、 この担持された抗 体又は抗原に、 抗原又は抗体或いはその混合物を液体媒体中で反 応させて該反応の進行に伴う反応物の変化の度合いを測定するこ とによ り、 抗原又は抗体を測定する方法において、 上記担体粒子 として磁性体含有不溶性担体粒子と、 磁性体を含有していない不 溶性担体粒子を用いて上記反応を行い、 ついで反応混合物に磁場 を付与することによ り未反応の磁性体含有不溶性担体粒子および 磁性体含有不溶性担体粒子を含む凝集粒子を反応混合物から分離 し、 残存する磁性体を含有していない不溶性担体粒子を検知する ことにより、 液体媒体中の抗原又は抗体を定性的に又は定量的に 測定することを特徴とする抗原 ·抗体測定法。
    2. 磁性体含有不溶性担体粒子又は磁性体を含有していない不溶性 担体粒子に、 測定しようとする抗原に体する抗体又は抗体に対す る抗原を感作した懸濁液と、 測定しょう とする抗原又は抗体を液 体媒体中で抗原.抗体反応が平衡に達しない或る一定時間反応さ せ、 さらに磁性体を含有しない不溶性担体粒子又は磁性体含有不 溶性担体粒子に測定しょうとする抗原に対する抗体又は抗体又は— に対する抗原を感作した懸濁液を加え、 抗原 ·抗体反応が平衡に達 するまで反応させ、 反応が平衡に達した時点で反応混合物に磁場 を付与することにより、 磁性体含有粒子及び磁性体含有凝集粒子
    _ - - ：
    -. ， と磁性体を含有していない不溶性担体粒子を分離し、 残存する磁 性体を含有していない不溶性担体粒子を測定することにより、 抗 原又は抗体を定性的に又は定量的に測定することを特徴とする抗 原-抗体測定法。
    3. 磁性体として鉄及び/又は磁性酸化鉄を含有する不溶性担体粒子 を使用する請求の範囲第 1項又は第 2項記載の抗原'抗体測定法。
    4. 不溶性担体粒子として有機高分子物質よりなる粒子を使用する 請求の範囲第 1項、 第 2項又は第 3項記載の抗原 ·抗体測定法。
    5. 不溶性担体粒子として無機微粉末を使用する請求の範囲第 1項、 第 2項又は第 3項記載の抗原 ·抗体測定法。
    6. 不溶性担体粒子としてポリスチレンラテッ ク ス粒子又はスチレ ン-ブタジエン共重合体粒子を用いる請求の範囲第 4項記載の抗原- 抗体測定法。
    7. 不溶性担体粒子としてセラ ミ ック微粒子、 シリ カ、 アルミナ、 シリ カ-アルミナ、 炭末又は金属の微粉末を用いる。 請求の範囲第 5 項記載の抗原 ·抗体測定法。
    8. 磁性体含有不溶性担体粒子と磁性体を含有していない不溶性担 体粒子の配合比が 1： 20~20： 1である請求の範囲第 1項又は第 2項 記載の抗原 ·抗体測定法。
    9. 残存する磁性体を含有していない不溶性担体粒子を目視で検知 することにより検体中の抗原又は抗体を定性的に判定する請求の 範囲第 1項又は第 2項記載の抗原 ·抗体測定法。
    10. 磁性体を含有していない不溶性担体として色素を含有する有 機高分子物質よりなる粒子を使用する請求の範囲第 1項又は第 2 項記載の抗原 ·抗体測定法。
    11. 色素を含有する有機高分子物質よりなる粒子と して 2種類以上 の色素を含有する有機高分子物質よりなる粒子を使用する請求 の範囲第 10項記載の抗原 ·抗体測定法。
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