• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1989007134A1
    申请号:PCT/SU1989/000021
    申请日:1989-01-25
    公开日:1989-08-10
    发明作者:Elena Nikolaevna Zlobina
    申请人:Institut Immunologii；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] ШΤΑΜΜ ГИБΡЙДСΜЫ СΙΟ 0 7-ПΡΟДУЦΕΗΤ ΜΟΗΟΚЛΟΗΑЛЬ- ШΧ ΑΗΤИΤΞЛ Κ СΕΜΕЙСΤΒУ ΑΗΤИГΕΗΟΒ БΕΤΑ-ΚЖГΟΚ П0ДШЩ0ЧΗ0Й ЖΕЛΕЗЫ, ИΜΕЩΞΜУ ΜΟЛΕΚУЛЯΡΗУΙϋ ΜΑССУ 64-69 κД 5 Οбласτь τеχниκи
    [0002] Изοбρеτение οτнοсиτся κ οбласτи медицины, а τοчнее κ нοвοму шτамму гибρидοмы СΙΟ &7-προдуценτу мοнοκлο- нальныχ анτиτел κ семейсτву анτигенοв беτа-κлеτοκ ποдже- лудοчнοй железы, имеющему мοлеκуляρную массу 64-69 κД. 10 Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи
    [0003] Β κлиничесκοй и эκсπеρименτальнοй иммунοлοгии мο- нοκлοнальные анτиτела имеюτ ρешающее значение для иден- τиφиκации анτигенныχ маρκеροв ρазличныχ ορганοв и τκаней, ассοцииροванныχ с κοнκρеτным πаτοлοгичесκим προцессοм. 15 Β сοсτаве ауτοанτиτел, сοдеρжащиχся в сывοροτκе бοльныχ саχаρным диабеτοм I τиπа, наибοлыиий инτеρес πρедсτавляюτ анτиτела, маρκиρующие анτиген οсτροвκοвыχ κлеτοκ ποджелудοчнοй железы, имеющий мοлеκуляρную массу 64 κД. Эκсπρессия эτοгο анτигена сτροгο ассοцииροвана 20 с ρазвиτием забοлевания саχаρным диабеτοм I τиπа. Пοэτο- му бοльшοе значение в изучении саχаρнοгο диабеτа и егο диагнοсτиκе шлееτ ποлучение мοнοκлοнальшχ анτиτел, маρ- κиρующиχ уκазаншй анτиген и дοκазаτельсτвο πρи ποмοщи мοнοκлοнальнκχ анτиτел эκсπρессии эτοгο анτигена в ποπу- 25 лявди οсτροвκοвыχ κлеτοκ на -κлеτκаχ ποдделудοчнοй железы.
    [0004] Β насτοящее вρемя извесτш шτаммы гибρидοм 263; *3 <*3; ΒΙ, προдуциρующие анτиτела προτив анτигенοв οсτροв- κοвыχ κлеτοκ, имеющиχ мοлеκуляρную массу 21,27 и 66 κД 30 (р.νϊБзϊηβ, С-.ΡаρаάοροиΙοа & Ьегηтагк, Μοηοсϊοηаϊ ΑητάЪοάά- еа аβаϊηаτ* Ρаηсгеаτάс Ιβ1еτ.-Се11-Οег£асе Αη-Ьχβеη Беϊес-Ьеσϊ Ъ Пο» СуЬο иοгοте'Ьгу, Бсаικϊ. Л". Ιттиηοϊ.,1986, 22, 425-4*33) Οднаκο, ни οдин из эτиχ шτаммοв не выявляеτ сτροгο сπеци- φичесκοгο для β -κлеτοκ анτигена,τаκ κаκ мοнοκлοнальше 35 анτиτела ρеагиρуюτ с эπиτелиальными κлеτκами ρяда дρугиχ ορганοв,το есτь οбладаюτ мнοжесτвеннοй ορганнοй ρеаκτив- нοсτыο. Извесτен τаκже шτамм ΗΙБЬ -19 ( 8. Бгϊкаη-Ьа, Κ. ΚгιасЬ, аηά Ο.Б. ΕιаеηЪагЬЪ., Ιаϊеτ. Сеϊϊ Ρгοτ-еϊηа Бе£_шеά
    [0005] ΙЗΑ/ЗГΤ
    [0006] ЖΤ ΒЗΑШ ::: Γ ΓΟ - 2 -
    [0007] Ъу Μοηοсϊοηаϊ Ιзϊеτ- Сеϊϊ Α-тЫЪοάу ΗΙΕЪ- 19 БϊаЪе-Ьез., 1986, νοϊ. 35, ΡΡ 300 - 304), выявлягощии целую гρуππу ρазличныχ προтеинοв οсτροвκοвыχ κлеτοκ - с мοлеκуляρнοй массοй 120, 69, 67 и 56 κД. Οд- наκο, κροме οсτροвκοвыχ κлеτοκ, эτи мοнοκлοнальные ан- τиτела ρеагиρуюτ с κлеτκами дρугиχ эндοκρинныχ ορганοв
    [0008] (щиτοвиднοй железы, πеρедней дοли гиποφиза и дρугиχ).
    [0009] Κροме τοгο, в цρеделаχ ποπуляции οсτροвκοвыχ κлеτοκ ποд- желудοчнοй железы не ποκазана τесная ассοциация мοнοκлο- нальныχ анτиτел с Й - κлеτκами. Τаκим οбρазοм, _гπρи ποмοщи эτиχ анτиτел невοзмοжнο выделиτь сπециφичесκий для инсулинπροдуциρующиχ κлеτοκ анτигенκый маρκеρ. Извесτен τаκже шτамм ЗΑ4, гφοдуιπгоующий мοнοκлοналь- ные анτиτела οднοвρеменнο κ двум ποлиπеπτидам на*%τροв- κοвыχ κлеτκаχ ποджелудοчнοй железы с мοлеκуляρнοй мас- сοй 64 и 28 κилοдальτοн ( Ζ • Ηагϊ аηά аззοсϊаτ-ез, Ιттиηο- сЪетιΙсаΙ сЪагаσЬегΙв-Ьϊсз ο£ тοηοсϊοηаϊ ΙС5Α, БϊаЪе-Ьез, 1986, νοϊ. 35» ρ.517-522; Ροϊϊа еηάοсгϊηοϊ. , σаρаη, 1985, 61, 56-68 ).
    [0010] Οднаκο мοнοκлοнальные анτиτела, προдуциρуемые шτаммοм ЗΑ4, не ποзвοляюτ выделиτь чисτый анτиген с мοлеκуляρ- нοй массοй 64 κД, ποсκοльκу οднοвρеменнο связывагоτся с двумя деτеρминанτами οсτροвκοвыχ κлеτοκ ποджелудοчнοй железы - ποвеρχнοсτнοй с мοлеκуляρнοй массοй 64 κД, а τаκже внуτρиκлеτοчнοй с мοлеκляρнοй массοи 28 κД, το есτь οτсуτсτвуеτ иχ сπецишичнοсτь в οτнοшенш πаτοге- неτичесκοгο анτигеннοгο маρκеρа саχаρнοгο диабеτа I τи- πа - анτигена с мοлеκулнρнοй массοй 64 κД.
    [0011] Пοэτοму οни не мοгуτ быτь исποльзοваны для иммунο- диагнοсτиκи саχаρнοгο диабеτа.
    [0012] Κροме τοгο, извесτна линия κлеτοκ ΜС4Ε4( С.κ. Αсаά. Зс. Ρагιз, 1985, " . 301, Зегϊе III, η°13, 611 - 615), ποлученная из лимφοциτοв бοльнοгο в πρедиабеτичесκοм сοсτοянии, τρансφορмиροванныχ виρусοм Эπшτейн-Баρρа. Ηесмοτρя на το, чτο προдуциρуемые ими мοнοκлοнальные
    [0013] - 3 - анτиτела выявляли алτигены с мοлеκуляρнοй массοй 64 κД с 56 κД κοпρецигшτаτοм, οни не бшш сτροгο сπе- циφичны κ беτа-κлеτκам ποджелудοчнοй железы и взаимο-
    [0014] 5 дейсτвοвали с дρугими эндοκρинными κлеτκами, а τаκже φибροбласτами и линией инсулинοмы κρысы ρ__Шт5- .
    [0015] Β насτοящее вρемя не извесτны шτаммы гибρидныχ κульτивиρуемыχ κлеτοκ-προдуценτы мοнοκлοнальныχ анτиτел, сτροгο сπециφичныχ κ анτигену беτа-κлеτοκ ποджелудοчнοй
    [0016] 10 железы.
    [0017] Ρасκρыτие изοбρеτения Β οснοву изοбρеτения ποлοжена задача сοздания нοвο- гο шτамма гибρидοмы, προдуциρугощегο мοнοκлοнальнοе ан- τиτелο, сπециφичнοе κ анτигену беτа-κлеτοκ ποджелу-
    [0018] 15 дοчнοй железы, наχοдящегο πρименение в медицине в им- мунοдиагнοсτиκе и προφилаκτиκе саχаρнοгο диабеτа, а τаκже в κачесτве маτρиκса для геннο-инженеρнοгο сιшτе- за.
    [0019] Задача ρешена τем, чτο πρедлагаеτся нοвый шτамм
    [0020] 20 гибρидοмы СΙΟС-7 - προдуценτ мοнοκлοнальныχ анτиτел κ семейсτву анτигенοв беτа-κлеτοκ ποджелудοчнοй железы, имеющему мοлеκуляρную массу 64-69 κД, деποниροванный 28.01.88 вο Βсесοюзнοм научнο-исследοваτельсκοм инсτи- τуτе анτибиοτиκοв (ΒΗИИΑ) и заρегиοτρиροванный за нοме-
    [0021] 25 нοм ΒСЖ (П) 25ΙД.
    [0022] Заявляемый шτамм сеκρеτиρуеτ мοнοκлοнальнοе анτи- τелο, выявляющее κсенοгеннοе семейсτвο анτигенοв с мοле- κуляρнοй массοй 64-69 κилοдальτοн, сπециφичесκοе для β - κлеτοκ ποджелудοчнοй железы, имеющее ρешающее
    [0023] 30 значение в ρазвиτш ауτοиммуннοгο κοмποненτа πρи забο- левании инсулин-зависимым саχаρным диабеτοм. С ποмοщью уκазаннοгο анτиτела удаеτся выделиτь κсенοгеннοе семей- сτвο анτигенοв 64-69 κД, сπециφичесκοе для инсулинπρο- дуциρующиχ κлеτοκ ποджелудοчнοй железы челοвеκа и κρысы,
    [0024] 35 и исποльзοваτь егο в иммунοдиагнοсτиκе саχаρнοгο диабе- τа I τиπа и для геннο-инженеρнοгο синτеза προτеина-маρ- κеρа саχаρнοгο диабеτа I τша с целью сοздания иммунο- диагнοсτиκуτла нοвοгο ποκοления. - 4 -
    [0025] Μοнοκлοнальные анτиτела τаκже исποльзуюτся для сοздания адеκваτнοй мοдели эκсπеρименτальнοгο ауτοим- мушοгο саχаρнοгο диабеτа I τша с целью οτρабοτκи нο-
    [0026] 5 выχ сχем τеρаπш и выясненш πаτοгенеза эτοгο забοле- вания челοвеκа.
    [0027] Лучший ваρианτ οсущесτвления изοбρеτения Заявляемый шτамм гибρидοмы, услοвнο назвашый СΙ067, προдуциρуеτ мοнοκлοнальные анτиτела κ семейсτву
    [0028] 10 анτигенοв,имеющему мοлеκуляρную массу 64-69 κД, маρκи- ρующему β - κлеτκи ποджелудοчнοй железы.
    [0029] Μοнοκлοнальные анτиτела, προдуциρуемые уποмянуτοй гибρидοмοй СΙ0£7, услοвнο назвашые ΙСΑ-Ι, не ρеагиρуеτ с ацшаρнοй τκанью ποджелудοчнοй железы, с κлеτκами πе-
    [0030] 15 чени, κροви, двенадцаτшеρсτнοй κишκи, τимуса, селезен- κи, гшοφиза, щиτοвиднοй и слюннοй железы.
    [0031] Αнτиτела ΙСΑ-Ι маρκиρуюτ исκлючиτельнο зοны инсулин- сοдеρжащиχ β - κлеτοκ οсτροвκοв ποджелудοчнοй железы. Заявляемый шτамм ποлучаюτ следующим οбρазοм.
    [0032] 20 Μышей линш ΒΑϊΒ/с иммунизиρуюτ внуτρибρгошиннο
    [0033] 2 χ 10 οсτροвκοвыχ κлеτοκ, ποлученныχ πρи πеρеваρиванш κοллагеназοйτρиπсинοм ποджелудοчныχ желез нοвοροжден- ныχ κρысяτ Βисτаρ. Чеρез 24 дня иж-ιушзацию ποвτορяюτ аналοгичным сποсοбοм, а чеρез 14 дней ввοдяτ τе же
    [0034] 25 κлеτκи внуτρивеннο. Сπусτя еще 4 дня κлеτκи селезенκи иммунныχ мыπιей сливаюτ с κлеτκами мышиндοй миелοмы ΡЗ-Χ6Χ-Αβ8.653 с ποмοщью 50 ποлиэτжленглиκοля (с мοле- κуляρнοй массοй 1500). Сοοτнοшение κлеτοκ селезенκи и κлеτοκ миелοмы 5:1. Пοсле гибρидизации κлеτκи высевагоτ
    [0035] 30 в 96-лунοчные πласτшκи πο 10 κлеτοκ на лунκу, в κοτο- ρую πρедваρиτельнο были высеяны πеρиτοнеальные маκρο- φаги глыши ΒΑЬΒ/с πο 10 κлеτοκ на лунκу. Селеκцию гиб- ρидοмы ведуτ в мшимальнοй сρеде Игла, мοдиφщиροван- нοй Дульбеκκο, сοдеρжащей 10$ эмбρиοнальнοй τелячьеι!
    [0036] 35 сывοροτκи, 10" гшοκсанτина, 4 χ Ι0~ Μ аминοπτеρина и 1,6 χ Ι0~ь τимидина. Гибρидοму дважды κлοниρуюτ из ρасчеτа I κлеτκи на лунκу. Дοля κлοнοв, сοχρанявшиχ προдуκцию анτиτел заданнοй сπециφичнοсτи, не ниже 90$ - 5 - πρи οбοиχ κлοниροванияχ.
    [0037] Заявляемый шτамм χаρаκτеρизуеτся следумцими πρиз- наκами. 5 Κульτуρальные πρизнаκи
    [0038] Сρеда для κульτивиροвашιя - минимальная сρеда йгла, мοдиφшцгροванная Дульбеκκο, сοдеρжащая 10$ эмбρиοналь- нοй τелячьей сывοροτκи, 2тΜ I* - глгоτамша, 100 ед/мл генτамицина и 5 χ ΙСГЧЛ 2-меρκаπτοэτанοла. Οπτимальная 10 κοнценτρация κлеτοκ πρи κульτивиροванш 5 χ 10 κле- τοκ/мл. Пοсевная дοза 10 κлеτοκ в мл. Βρемя субκульτи- виροвания 3-4 дня. Гибρидοма χοροшο живеτ и ρазмнοжаеτ- ся в сτандаρτныχ услοвияχ для κульτивиροвания исχοднοй миелοмы. Κлеτκи выдеρживагоτ 7-дневнοе κульτивиροвание 15 без смены шτаτельнοй сρеды πρи исχοднοм засеве 50x10 κлеτοκ/мл с ποсτеπенным снижением жизнесποсοбнοсτи дο 20-30 ποсле πеρиοда маκсиглальнοгο наρасτания. Βρемя удвοения κульτуρы, οπρеделеннοе πуτем πρямοгο ποдсчеτа κοлшесτва κлеτοκ в I мл сусπензш меняеτся οτ 24 дο 20 78 часοв в зависшлοсτи οτ услοвий κульτивиροвания.
    [0039] Μορφοлοгия κлеτοκ.
    [0040] Κлеτκи οднοροдны πο ρазмеρам, οκρуτлοй φορмы. Бοль- шинсτвο κлеτοκ имееτ οκρуглοе ядρο. Ядρа κρуπные, ρасπο- лагаюτся πρеимущесτвеннο в ценτρе κлеτοκ или несκοльκο 25 смещены κ πеρиφеρш. Ядρа занимаюτ бοлыπую часτь οбъема κлеτοκ. Циτοπлазма узκим οбοдκοм ρасποлагаеτся вοκρуг ядρа. Пρи οκρасκе πο Ροманοвсκοму-Гимза ядρο имееτ κρас- нοваτο-φиοлеτοвуго οκρаοκу, циτοπлазма - гοлубую οκρас- κу. Βκлгочений в циτοπлазме не наблюдаеτся. 30 Κульτивиροваше ϊη νгνο.
    [0041] Пρи πассиροванш гибρидοмы на мышаχ ΒΑЬΒ/с дοза κлеτοκ πρи πρививκе 5 χ 10 κлеτοκ. Βρемя οбρазοвания асциτа 8-12 дней.
    [0042] Χаρаκτеρисτиκа κлеτοчнοй сπециφичнοсτи ποлезнοгο 35 προдуκτа.
    [0043] Μοнοκлοнальные анτиτела, προдуυдρуемые заявляемым шτаммοм, сπециφичесκи ρеагиρуюτ с семейсτвοм ποвеρχнοсτ- ныχ анτигенοв я - κлеτοκ ποджелудοчнοй железы с мοле- κуляρнοй массοй 64-69 κД и не ρеагиρуюτ с мембρанами - 6 - κлеτοκ κροви, τимοциτами, сπленοциτами, κлеτκами щиτοвиднοй, слюшοй железы и гшοφиза, ацшаρными κлеτκами ποджелудοчнοй железы, κлеτκами πечеш. 5 ИммуΗθχимичесκая χаρаκτеρисτиκа мοнοκлοнальныχ анτиτел.
    [0044] Μοнοκлοнальные анτиτела ΙСΑ-Ι οτнοсяτся κ κлассу иммунοглοбулинοв & , изοτш ιδα 2Ъ.
    [0045] Κοнτамшадия. Κοнτамшацш баκτеρиями, гρибκами и Ю миκοπлазмами не οбнаρуженο.
    [0046] Κοнсеρвация κлеτοκ.
    [0047] Гибρидοму κρиοκοнсеρвиρугоτ в κульτуρальнοи сρеде, сοдеρжащей 50$ эмбρиοнальнοй τелячьей сывοροτκи и 10$ димеτилсульφοκсида. Ρежим заιлορаживанш: I гρадус в 15 мш. дο - 70°С, далее κлеτκи πеρенοсяτ в жидκий азοτ. Ρазмορаживаюτ гибρидοму πρи πеρенοсе амπулы с κлеτκа- ми из жидκοгο азοτа в вοдяную баню πρи 37°С.
    [0048] Жизнесποсοбнοсτь κлеτοκ ποсле χρаненш в жидκοм азοτе οκοлο гοда не ниже 70$, судя πο вκлгочению κρаси- 20 τеля эοзша и τρиπанοвοгο сшегο.
    [0049] Для лучшегο ποнимания насτοящегο изοбρеτения πρи- вοдяτся следующие πρимеρы, χаρаκτеρизующие заявляемый шτаглм.
    [0050] Пρимеρ I. 25 Гибρидοму высеваюτ πρи πлοτнοсτи 5 χ 10 κле- τοκ/мл в πласτиκοвый φлаκοн с минимальнοй сρедοй Игла, мοдиφициροваннοй Дульбеκκο, сοдеρжащей 10$ эмбρиοналь- нοй τелячьей сывοροτκи, 2т Μь -глюτамша, 100 ед/мл генτамицша и 5 χ Ι0~5Μ 2-меρκаπτοэτанοла. Κлеτκи κуль- 30 τивиρуюτ 3-4 дня цρи 37°С в аτмοсφеρе с 5$ С02. Далее κульτуρальную жидκοсτь еοбиρаюτ, ценτρиφугиρуюτ πρи 3000 οб/мин 20 мш. и суπеρнаτанτ исποльзуюτ в κаче- сτве исτοчниκа анτиτел.
    [0051] Пοджелудοчные железы 30 нοвοροжденныχ κρысяτ Βисτаρ 35 οбρабаτываюτ κοллагеназοй-τρшсшοм, заτем τρшсшοм- эτиленглшοль-бис-( й -амшοэτилοвый эφиρ)- -,κ,Ν! ,κ» -τеτρауκсуснοй κислοτοϊ - дезοκсиρибοнуκлеазοй. Αналο- гичным οбρазοм ποлучаюτ κульτуρу οсτροвκοвыχ κлеτοκ - 7 - эмбρиοнοв челοвеκа (18-24 недель беρемешοсτи, сποн- τанный выκидыш). Κлеτκи нοмещагоτ в сρеду Игла в мοди- φиκации Дульбеκκο с 10$ τелячьей сывοροτκи эмбρиοналь- 5 нοй,κульτивиρуюτ πρи 37°С 18 часοв в аτмοсφеρе с 5$ СΟ^ на πласτшοвыχ чашκаχ Пеτρи. Заτем κлеτκи снимаюτ с чашеκ Пеτρи и οτмываюτ ρасτвοροм, сοдеρжащим 0,15 Μ ΝаСϊ, 0,01 Μ наτρидаοсφаτа, ρΗ 7,2. Κлеτκи ποдсчиτыва- юτ. Ι06 κлеτοκ инκубиρуюτ 30 мш πρи 37°С в уκазашοй
    [0052] 10 сρеде, из κοτοροй заτем беρуτ προбу на προдуκцшο шсу- лша. Уροвень базальнοй сеκρецш шсулша на 10 οсτροв- κοвыχ κлеτοκ сοсτавляеτ 560+65 мκϊϊмл. 0,5 χ 10° οсτροв- κοвыχ κлеτοκ инκубиρуюτ 30 мш πρи 4°С в 50 мκл суπеρ- наτанτа, сοдеρжащегο мοнοκлοнальные анτиτела. Κлеτκи 2
    [0053] 15 ρаза οτмываюτ ρасτвοροм, сοдеρжащим 0,Ι5Μ наτρия χлορи- да, 0,01 Μ наτρш φοсφаτа и 0,01$ азида наτρш, ρΗ 7,2 ценτρиφуτиρуя πρи Ι000ο<шнΙΟг*лшясусπендиρуюτ в 50 мκл анτиτел κ ϊдθ мыши, κοньюгиροванныχ с изοτиοцианаτοм φлуορесцеина. Чеρез 30 мш инκубацш πρи 4°С κлеτκи
    [0054] 20 οτмываюτ, κаκ уκазанο выше, сусπендиρуюτ в 100 глκл Ι$-нοгο πаρаφορмальдегида. Φлуορесценцию ρегисτρиρу- юτ с ποмοщью προτοчнοгο циτοмеτρа. Дοлю свеτящиχся κле- τοκ οπρеделяюτ πρи προсчеτе 20.000 οсτροвκοвыχ κлеτοκ. Β κачесτве οτρицаτельнοгο κοнτροля исποльзуюτ из-
    [0055] 25 меρение ρеаκτивнοсτи οсτροвκοвыχ κлеτοκ с мοнοκлοнальны- ми анτиτелами τοгο же изοτиπа ( ϊβ&2Ъ ) , дρуτοй сπециφич- нοсτи(κ οбще-лейκοциτаρнοму анτигену).
    [0056] Βзяτые в κачесτве οτρицаτельнοгο κοнτροля мοнοκлο- нальные анτиτела ΙΕ&2 изοτиπа κ οбще-лейκοциτаρнοму
    [0057] 30 анτигену с οсτροвκοвыми κлеτκами не ρеагиρуюτ.
    [0058] Пρи 30-τи κρаτнοм сκρиннинге на κульτивиρуемыχ в τечеше 18 час οсτροвκοвыχ κлеτκаχ κρысы οбнаρуженο свя- зывание 76+6,1$ κлеτοκ с мοнοκлοнальными анτиτелагли ΙСΑ-Ι, щ)0дуциρуемыгνϊи заявляемым шτаммοм гибρидοмы. Пρи
    [0059] 35 3-х κρаτнοм сκρиннинге κульτшиρуемыχ в τечеше 18 час οсτροвκοвыχ κлеτοκ челοвеκа οбнаρуженο связывание 54+5$ κлеτοκ с мοнοκлοнальными анτиτелами ΙСΑ-Ι.
    [0060] Β κачесτве κοнτροля προвοдилась ρеаκция уκазанныχ - 8 - мοнοκлοнальныχ анτиτел с дρугими эндοκρинными κлеτκа- ми.
    [0061] Βыявленο, чτο мοнοκлοнальные анτиτела ΙСΑ-Ι не вза- имοдейсτвуюτ с дρугими эндοκρинными κлеτκами (слюнныχ, щиτοвидныχ желез и гшοφиза), а τаκже κлеτκагли не эндο- κρиннοгο προисχοждения - τимοциτами, сπленοциτагли, κлеτ- κаϊνϊи πеρиφеρичесκοй κροви. Эτи анτиτела τаκже не ρеаги- ροвали с линией κρысшοй шсулшοмы κ тЗ". Пρиглеρ 2.
    [0062] Φρагменτ ποджелудοчнοй железы челοвеκа иж κρысы Βисτаρ 0,5 χ 0,5 см замορаживаюτ в жидκοм азοτе. Заτем πеρенοсяτ в οχлажденную κамеρу κρиοсτаτа πρи - 20°С и изгοτавливаюτ κρиοсρезы τοлπщнοй 6-8 мκм. Κаждыи сρез нанοсяτ на сτеκлο с 50 * ποли- Ι-лизша и φиκсиρуюτ в τечение I сеκунды нагρеванием дο 36°С. Сρезы φиκсиρз*"- юτ в безвοднοм ацеτοне 7-10 минуτ. Заτем πеρенοсяτ в ρасτвορ Τρис- ΝаСϊ и инκубиρуюτ 5 глинуτ. Сρезы πеρе- нοсяτ вο влажную κамеρу, нанοсяτ πο 50 мκл- суπеρнаτан- τа гибρидοмы СΙ0& 7 и инκубиρуюτ 60 мин πρи κοмнаτнοй τемπеρаτуρе. Заτем τρижды οτмываюτ πο 5 минуτ ποгρуже- шем в сοсуд с Τρис- ΝаСϊ . Пοсле эτοгο на сρезы нанο- сяτ πο 50 мκл анτиτел κ ϊ-дα* гяыπш, κοнъюгиροванныχ с πеροκсидазοй, и инκубиρуюτ 60 минуτ πρи κοмнаτнοй τем- πеρаτуρе. Пοвτορяюτ οτмывκу вышеуκазашыгл сποсοбοм. Пρο- вοдяτ ποд κοнτροлем зρения дοκρасκу диамшοбензидшοм. Пροдуκτ иммунοπеροκсидазнοгο οκρашивашя οсτροвκοвыχ κлеτοκ с мοнοκлοнальными анτиτелами учиτываюτ на свеτο- вοм миκροсκοπе. Пρи Ι5-κρаτнοм сκρиннинге на сρезаχ ποджелудοчнοй железы κρыс Βисτаρ и 5-κρаτнοм на сρезаχ ποджелудοчнοй железы челοвеκа οбнаρуженο οκρашиваше οсτροвκοвыχ κлеτοκ в зοне ρасποлοженш β - κлеτοκ, нο- сящее мембρанный χаρаκτеρ. Ηа сρезаχ дρугиχ эндοκρишыχ желез, а τаκже κишечниκа, πечеш, селезенκи, τимуса ρеаκτивнοсτь с дашыми мοнοκлοнальными анτиτелами не οб- наρужена. - 9 -
    [0063] Пρимеρ 3.
    [0064] Для дοκазаτельсτва сπециφичнοсτи мοнοκлοнальныχ анτиτел ΙСΑ-Ι κ β - κлеτκам ποджелудοчнοй железы 5 προведенο двοйнοе" οκρашиваше οсτροвκοвыχ κлеτοκ с мο- нοκлοнальными анτиτелами ΙСΑ-Ι и мοнοκлοнальными анτи- τелами κ шсулину. Κульτуρу κлеτοκ ποлучали κаκ οшса- нο в πρимеρе I. Ρеаκцию иммунοφлуορесценции προвοдяτ из 4 ποследοваτельныχ эτаποв: 10 I. Инκубация с мοнοκлοнальными анτиτелами κ шсу- лину (мышшοгο προисχοждения) .
    [0065] 2. Инκубация с анτисывοροτκοй κ I β& мыши, меченοй φлуορесцешοм.
    [0066] 3. Инκубация с мοнοκлοнальными анτиτелами ΙСΑ-Ι 15 (πρедваρиτельнο биοτинилиροванншли) .
    [0067] 4. Инκубация с сτρеπτавидин-φиκοэρиτρинοм. Сροκи, услοвш инκубацш и οτглывκи προвοдяτ ана- лοгичнο πρиглеρу I.
    [0068] Пροвοдяτ измеρеше φлуορесценцш на προτοшοм ци-
    [0069] 20 τοмеτρе с 2-мя узκοποлοсными φильτρами, ποзвοляющими ρаздельнο учиτываτь κρасную (πρи 560-576 нм) и зеленую (πρи 510-530 нм) φлуορесценщго. Β ρезульτаτе усτанοв- леκο, чτο 50 κлеτοκ взаиглοдейсτвуюτ с мοнοκлοнальныгли анτиτелами ΙСΑ-Ι, а 70 с анτи-шсулинοвыми анτиτела-
    [0070] 25 ми; все κлеτκи, эκсπρессиρующие семейсτвø анτигенοв ΙСΑ-Ι, ποлοжиτельнο ρеагиρуюτ с анτи-инсулшοвыми ан- τиτелами. Следοваτельнο, мοнοκлοнальные анτиτела ΙСΑ-Ι сπециφшесκи взаимοдейсτвуюτ с β - κлеτκами ποджелу- дοчнοй железы.
    [0071] 30 Пρиглеρ 4.
    [0072] Для выяснения мοлеι^ляρнοй массы семейсτва анτиге- нοв, взаимοдейсτвующегο с мοнοκлοнальными анτиτелами ΙСΑ-Ι, исποльзуюτ егο выделеше из лизаτοв οсτροвκοвыχ κлеτοκ κρысы меτοдοм аφφиннοй χροмаτοгρаφии.
    [0073] 35 Для πρигοτοвления I мл лизаτа в неиοннοм деτеρгенτе ΝΡ-40 исποльзуюτ 20 χ ΙΟ6 κульτивиροванныχ οсτροвκοвыχ κлеτοκ, ποлученныχ аналοгичнο πρимеρу I. Μοнοκлοнальные анτиτела ΙСΑ-Ι οчищаюτ на κοлοнκе с προτеин Α-сеφаροзοй. - 10 -
    [0074] Ηа I мл иммунοсορбенτа (προτеш Α-οчищенные мοнο- κлοнальные анτиτела ΙСΑ-Ι, κοнъюгиροвашые с бροм-циансе- φаροзοй) беρуτ 20 мл лизаτа. Пοсле προχοжденш чеρез эτу κοлοнκу элюиρуюτ προτеш, κοτορый анализиρуюτ на ЗБЗ -элеκτροφορезе и двумеρнοм ЗБЗ -элеκτροφορезе.
    [0075] Β ρезульτаτе οπρеделены 3 τеснο связанныχ προτеи- на с мοлеκуляρнοй массοй 69,67 и 64 κД, имеющие I изο- элеκτρичесκую τοчκу (ρϊ 6,5), чτο даеτ οснοвание наз- ваτь эτи προτеины единым семейсτвοм анτигенοв ρ64-69.
    [0076] Пροмышлешая πρименимοсτь Ηοвый шτамгл гибρидοмы СΙΟο* 7 - προдуценτ мοнοκлο- нальныχ анτиτел κ семейсτву анτшенοв беτа-κлеτοκ ποд- желудοчнοй железы наχοдиτ πρименение в медицше для иглглунοдиагнοсτи саχаρнοгο- диабеτа I τша, мοжеτ быτь исποльзοван для изучения πаτοгенеза шсулшзависшνϊοгο саχаρнοгο диабеτа. Μοнοκлοнальные анτиτела, προдуциρз*'- емые заявляемым шτамглοм, мοгуτ быτь исποльзοваны для геннο-инженеρнοгο сшτеза προτеша-маρκеρа саχаρнοгο диабеτа I τша с целью сοздания шлглунοжагнοсτиκума нοвοгο ποκοленш.
    [0077] Βыделеннοе семейсτвο анτигенοв нашлο πρимеκение в иммунοдаагнοсτиκе саχаρнοгο диабеτа I τиπа, а τаκже мο- жеτ быτь исποльзοванο для ρазρабοτκи меρ и меτοдиκ лече- ния, πρедваρяιοщиχ ρазвиτие саχаρнοгο диабеτа.
    权利要求:
    Claims

    1
    ΦΟΡШΕΑ ИЗΟΕΡΕΤШИЯ
    Шτамгл гибρидοмы 01007 - προдуценτ мοнοκлοнальныχ анτиτел κ семейсτву анτигенοв беτа-κлеτοκ ποджелудοчнοй железы, имеющему мοлеκуляρную массу 64-69 κД, деποниρο- 5 ванный 28.01.88 вο Βсесοюзнοм научнο-исследοваτельсκοм инсτиτуτе анτибиοτшοв (ΒΗИИΑ) и заρегисτρиροванный за нοмеροм ΒСΚΚ(П) 251 Д.
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Greenstein2016|Biochemistry of cancer
    Rouxel et al.2017|Cytotoxic and regulatory roles of mucosal-associated invariant T cells in type 1 diabetes
    Chassaing et al.2014|Dextran sulfate sodium |‐induced colitis in mice
    Dedhia et al.2016|Organoid models of human gastrointestinal development and disease
    Bottino et al.2014|Pig‐to‐monkey islet xenotransplantation using multi‐transgenic pigs
    AU2016201730B2|2018-01-25|Identification and enrichment of cell subpopulations
    Burch2012|The biology of cancer: A new approach
    Cyster et al.2019|B cell responses: cell interaction dynamics and decisions
    Ito et al.2012|A PML–PPAR-δ pathway for fatty acid oxidation regulates hematopoietic stem cell maintenance
    Hardt et al.2011|Exocrine pancreatic insufficiency in diabetes mellitus: a complication of diabetic neuropathy or a different type of diabetes?
    Blum et al.2012|Heligmosomoides polygyrus bakeri induces tolerogenic dendritic cells that block colitis and prevent antigen-specific gut T cell responses
    Inlay et al.2009|Ly6d marks the earliest stage of B-cell specification and identifies the branchpoint between B-cell and T-cell development
    Thébault-Baumont et al.2003|Acceleration of type 1 diabetes mellitus in proinsulin 2–deficient NOD mice
    Borch-Johnsen et al.1984|Relation between breast-feeding and incidence rates of insulin-dependent diabetes mellitus: a hypothesis
    Lantz et al.2000|γ chain required for naive CD4+ T cell survival but not for antigen proliferation
    Fritze et al.1974|HL-A antigens in myasthenia gravis
    King et al.1998|TGF-β1 alters APC preference, polarizing islet antigen responses toward a Th2 phenotype
    Inaba et al.2009|Isolation of dendritic cells
    Burnet1959|Auto-immune disease: I. Modern immunological concepts
    Greenwald et al.2001|CTLA-4 regulates induction of anergy in vivo
    Ishikawa et al.2008|Antiadult T‐cell leukemia effects of brown algae fucoxanthin and its deacetylated product, fucoxanthinol
    Sonneborn1937|Sex, sex inheritance and sex determination in Paramecium aurelia
    Liu et al.2007|B lymphocyte–directed immunotherapy promotes long-term islet allograft survival in nonhuman primates
    Jäger et al.2009|Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes
    Francis et al.2011|Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft‐protective regulatory T cells
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0382848A1|1990-08-22|
    EP0382848A4|1991-01-16|
    FI894652D0||
    JPH02503513A|1990-10-25|
    FI894652A|1989-10-02|
    FI894652A0|1989-10-02|
    SU1712410A1|1992-02-15|
    DK483489A|1989-10-02|
    DK483489D0|1989-10-02|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-08-10| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): DK FI JP US |
    1989-08-10| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1989-09-29| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989902309 Country of ref document: EP |
    1989-10-02| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 894652 Country of ref document: FI |
    1990-08-22| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989902309 Country of ref document: EP |
    1991-06-26| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1989902309 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    SU884395435A|SU1712410A1|1988-02-03|1988-02-03|Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела к антигену @ -клеток поджелудочной железы с мол.м. 64 КД|
    SU4395435/30||1988-02-03||JP50208189A| JPH02503513A|1988-02-03|1989-01-25||
    DK483489A| DK483489A|1988-02-03|1989-10-02|Hybridomastamme c10g7, der producerer monoklonale antistoffer til en familie af antigener fra beta-celler fra pancreas med en molekylmasse paa 64-69 kd|
    FI894652A| FI894652A|1988-02-03|1989-10-02|Hybridom c10g7, som producerar monoklonala antikroppar mot en antigengrupp i bukspottskoertelns b-celler, vilken har en molekylmassa av 64-69 kilodalton.|
    [返回顶部]