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    公开号:WO1989002078A1
    申请号:PCT/JP1988/000846
    申请日:1988-08-25
    公开日:1989-03-09
    发明作者:Taro Hayakawa；Shuji Kodama；Kazushi Iwata；Junichi Kishi；Kyoko Yamashita；Hisashi Iwata
    申请人:Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] C I ) 明 細 書 慢性関節 リ ウ マ チ疾患の診断法
    [0002] 〔技術分野〕
    [0003] 本発明 は コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を定量す る こ と に よ り 慢性関節 リ ウ マ チ疾患を診断す る 方法に 関す る も の であ る 。 さ ら に し は、 本発明 は ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー （テ ィ シュ ' イ ン ヒ ビ タ ー · ォ ブ ' メ タ ロ プ 口 テ ア ー ゼ ： T I MP ) に対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を用 い る サ ン ド イ ッ チ法に基づ く 酵素免疫学的測定法に よ る ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の測定法を 手段 と し、 慢性 関節 リ ゥ マ チ疾患患者の血清中、 血漿中 あ る い は関節液 中の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量が それぞれ健常人の血 清中、 血漿中 あ る い は関節液中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量に比べて 明 ら かに高い値を示す こ と に基づ い て慢 性関節 リ ウ マ チ疾患の診断 を 行 う 方法に 関す る も の であ る 。 な お、 上記の酵素免疫学的測定法 と は、 固相抗体に 結合 さ せ る 抗体お よ び酵素標識 を付与す る 抗体 と し て コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の異な る 抗原決定基に対 し特異 的 に結合す'る 2 種類の モ ノ ク ロ ー ナル抗体を用 い る こ と を特徵 と す る コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の測定法を意味 す る 。
    [0004] 〔背景技術〕 . 従来、 慢性関節 リ ウ マ チ疾患の診断法 と し て は、 リ ウ マ チ 因子の検出法に基づい た Ro s e法、 Ro s e法の He 1 1 e r よ る変法、 RAHA— テ.ス ト お よ び RA— テ ス ト な どが用 い ら れている 。 しか ·し なが ら、 それ ら の方法は複雑な実験方 法を用い る点、 あ る い は診断までに長い 日 数を要する点 な どの欠点を有する 。
    [0005] と こ ろ で、 コ ラ ゲナーゼ イ ン ヒ ビタ ーは、 ヒ ト お よ び その他の動物の骨、 皮膚、 齒髓、 羊水、 血液、 関節液中 およ び関節軟骨細胞、 滑液細胞、 各種組織由来線維芽細
    [0006] — 胞、 線維肉腫細胞培養液中に存在する こ と が知 られてい る 。 コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー量を測定する手段と して は、 從来、 その生物活性を測定する こ と に よ る方法が知 られている。 し力 し、 J . Lab . Cl in . Med . 75, 258— 263 (1973)に Eisenらカ s、 また、 Arthritis and heuma- tism 27_, 285— 290 C 1984) に Caws tonらカ s記載 してレヽ る よ う に、 血清中、 血槳中あ る い は関節液中の コ ラ ゲナー ゼイ ン ヒ ビタ ー活性を測定す る に は、 それ ら の液中に、 そ の測定を妨害する 蛋白質、 た どえば、 な 2 - マ ク ロ グ ロ ブ リ ン が存在する ため、 従来知 られてい る測定方法に よ っ ては、 その測定は不可能であ る 。 早川、 岩田 ら は、 先に、 ゥ シコ ラ ゲナ一ゼィ ン ヒ ビタ ーに対する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 い、 サ ン ド イ ッ チ法に基づ く 酵素免疫学 的測定法 ΐΑ) を行 う こ と に よ り 微量の試料で精度良 く 簡便かつ迅速に コ ラ ゲナ 一ゼィ ン ヒ ビタ ー を特異的に定 量する方法を開癸 した力； （特願昭 62 - 42781号）、 本発明 者ら は、 ヒ ト 血清中、 血漿中あ る い は関節液中に存在す る コ ラ ゲナーゼ イ ン ヒ ビタ ー量が、 慢性関節 リ ウ マチ疾 患に か力 る こ と に よ り 明 ら かに増加す る こ と を癸見 し、 血清中、 血漿中 あ る い は関節液中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の量 を上記の酵素免疫学的測定法に よ り 測定す る こ と に よ っ て、 慢性関節 リ ウ マ チ疾患の診断 を 行い得 る こ と を見出 し た 。
    [0007] 〔発明の開示〕 '
    [0008] 本発明 は、 固相単体に結合 さ せ る 抗体お よ び酵素標識 を付与す る 抗体 と し て ゥ シ コ ラ ゲナ一ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の 異な る 抗原.決定基に対 し特異的 に結合す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を用 い て、 酵素抗体免疫学的測定法を行 う こ と に よ り 、 血清中、 血漿中 あ る い は関節液中 に存在す る ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ ィ .ン ヒ ビ タ ー を 定量 し、 そ の定量値 を 健常 人の示す値 と 比較す る こ と に よ り 、 被測定者が慢性関節 リ ウ マ チ疾患に かカゝ つ て い る か否カゝ を診断す る 方法 を提 供す る も の であ る 。
    [0009] 本癸明方法に お い て は上記の酵素免疫学的測定法が用 い ら れ る が、 固相単体 と し て抗原や抗体 を受動的 に 良 く 吸着す る ポ リ ス チ レ ン製、 ポ リ カ ー ボ ネ ィ ト 製、 ポ リ プ ロ ピ レ ン 製、 あ る い は ポ リ ビニ ー ル製の ポ ー ル 、 マ イ ク 口 プ レ ー ト 、 ス テ ィ ッ ク 、 試験管な どの種 々 の材料お よ び使用形態が任意に 選択、 使用 で き る 。 一方、 薛素標識 を 付与す る 抗体 と し て は 、 抗体含有物 を 硫安分画後、 D E A E - S e p h a c e 1の如 き 陰 ィ オ ン交換ゲル に よ り 精製 し た I g G画分、 さ ら に はペ プ シ ン 消化後、 還元 し て得 ら れ る 特異的結合部分 Fab 'を用 い る こ と も で き る 。 本発明方法は、 固相単体に結合 さ せ る 抗体お よ び酵素 標識を付与する 抗体 と し て、 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の異な る 抗原決定基に対 し、 特異的に結合す る 2 種類の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の钽み合わせを用 いた固-相抗 ^:酵素 免疫学的測定法に基づいた ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ 一の-定量を行い、 そ の結果を、 健常人の値 と 比咬す る こ と に よ っ て、 被測定者が、 慢性関節 リ ウ マ チ疾患に かか つ て い る か否かを診断す る も の であ る 。
    [0010] 以下実施例に よ り 本発明 を具体的に説明す る 。 ただ し、 本発明 は こ れ ら に限定さ れ る も の ではな い。
    [0011] 実施例 1
    [0012] 抗 ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ーモ ノ ク ロ ー ナル抗体の 作製
    [0013] (a) 抗原 一 ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ーの調製
    [0014] J- Biochem. 96, 395~ 404(1984)に記載の本堯明者 ら の方法に従い ゥ シ未萌出知歯の根部歯髄を ィ ー グル MEM 培地 （ 日 水製薬製） で培養 し た培養外液か ら Con A - セ フ ァ ロ ー ス 、 ウ ル ト ロ ゲル Ac A 44お よ び DE— 52セ ル ロ ー ス の各カ ラ ム を用 いて コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を精製 し た 。 精酸ィ ン ヒ ビ タ ー は J . Mol . Biol . 80 , 579- 599 (1973) に記戴の Laemmliら の方法に従い ド デシル硫酸ナ ト リ ウ ム 一 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド電気泳動 （ SDS-PAGE) で 調べた と こ ろ 分子量約 32，000ダル ト ン （D )の単一バ ン ド を示 し た。
    [0015] (b) 抗体産生細胞の調製 6 週令の Balb/c雌マ ウ ス 2 匹 を ま ず フ 口 ィ ン ド完全ァ ジ ュバ ン ド 中で、 前記（ a ) で記述 し た精製 ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー で初回免疫す る 。 マ ウ ス に そ れぞれ 48 ； の ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 0.4mflの溶液 と し て腹腔内投与する 。 さ ら に 30日 目 に生理食塩水 に 溶解 し た 8 の ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 を追加免疫す る 。 最終免疫 と し て 58日 目 に腹腔内投与（95/^Ζ500 生理食 塩水） に よ り 補助免疫 し 、 3 .日 後 に マ ウ ス 脾臓 を取 り 出 し、 脾細胞 を調製す る 。
    [0016] ( c ) 細胞融合
    [0017] (1) 以下の材料お よ び方法 を 用 い-る 。
    [0018] RPMI 1640培地 ： RP I No .. 1640(Di f QO La¾o- ra t o r i es ) に 重炭酸ナ ト リ ウ ム （ 12mM)、 ピ ル ビ ン 酸 ナ 卜 リ ゥ ム （ 1 mM)、 L — グ ル タ ミ ン （ 2 mM：)、 ペ ニ シ リ ン G カ リ ウ ム （50 U/ J2)、 硫酸-ス ト レ ブ ト マ イ シ ン （ 50^ mi2) 、 お よ び 硫酸ァ ミ カ シ ン mi2) を 加え、 ド ラ イ ア イ ス で pH を 7.2に し、 0. 東洋 メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ 一 で除菌 ^過 す る 。
    [0019] NS- i 培地 ： 上記 RPMI 1640培地に 除菌 ^過 し た仔牛胎 児血清（Μ· A . Bioproducts) を 15 % ( v)の濃度に カロ
    [0020] PEG 4, 000溶液 ： RPMI 1640培地の ボ リ ェ チ レ ン グ リ コ 一ノレ 4,000 ( PEG 4,000、 Merck k CO. , Inc.) 50% Cw/ w) 無血清溶液を 調製す る 。
    [0021] ' 8 — ァ ザ グァ ニ ン 耐性 ミ エ ロ ー マ細胞 NS-1(P3-NS1-1) との融合は Selected Method in Cellular Immunology (ed. B - B. Mishel 1 and S . M . Shi igi)% W. H . Freeman and Corapany( 1980)、 351 ~ 372に記載の 0 iらの方法を若 千改変 して行っ た。
    [0022] (2) 前記（b)で調製 した有核脾臓細胞 （生細胞率 100% ) と ミ エ ロ ー マ細胞（生細胞率 100% ) と を 5 ： 1 の割合で 融合す る 。 脾臓細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞 と を別に前記の RPM I 1640培地で洗浄する。 次に同 じ培地にけん濁 し、 融合さ せる ため上記の割合で混合する 。 容量 50τιιβの円錐 形ス チ ロ ール樹脂製試験管（Iwaki Glass) を用い、 40mi2 の RPMI 1640培地中 400 x gf、 10分間遠心し、 上清を完全 に吸出'する 。 沈澱細胞に 37°C加温 PEG 4,000溶液 1.3mi2を 穏やかに撹拌 しなが ら 1 分間で滴下 し、 さ ら に 1 分間撹 拌し細胞を再けん濁、 分散さ せる 。 次に 37°C加温 PMI 1640培地 1 .3m£を 1 分間で滴下する 。 この.操作を さ らに 1 回籙返 した後、 同培地 9 mi2を 2 ~ ·3 分間 常に撹拌 し な力 ら滴下 し細胞を分散さ せる 。 これを 400 X 10分間 遠心分離 し、 上清を完全に吸引除去する 。 次に この沈殺 細胞に 37°C加温 NS-1培地 12.9mi2をすみやかに加え、 細胞 の大 き い塊 り を lOmfiの ピ ぺ ッ ト を用 いて注意深 く ピ ぺ ッ テ ィ ン グ し て分散する 。 さ ら に同培地 26mi2を加えて希釈 し、 ポ リ ス チ レ ン製 96穴マ イ ク ロ ウ ェル （ I waki Glass) に ゥ エル当 り 6.0X 105個 / O. lrafiの細胞を加える 。 な お、 こ の時使用する 96穴マ イ ク 口 ゥ エルは前処理と して 0.2 mfiの NS- 1培地を加え、 炭酸ガ ス培養器中（37°C )で一晚保 温 し、 使用時に培地を吸引除去 し てお く 。 細胞を加えた 上記のマ イ ク 口 ゥ エルを 7 %炭酸ガ ス / 93%空気中で温 度 37で、 湿度 100%下に培養に付する 。
    [0023] (d) 選択培地に よ る ハ イ プ リ ドーマの選択的増殖
    [0024] (1) 使用す る培地は以下の と お り であ る 。
    [0025] HAT培地 ： 前記（c)で述べた NS-1培地に さ ら に ヒ ボ キサ ン チ ン （100/iM：)、 ア ミ ノ プ テ リ ン （0.4/iM：)、 お よ び チ ミ ジ ン （16/iM)を加え る 。
    [0026] HT培地 ： ァ ミ ノ プテ リ ン を除去 した以外は上記 HAT 地 と 同一組成の も のであ る 。
    [0027] (2) 前記（c)の培養開始後翌 日 （ 1 日 百 ）、 細胞にパ ス ッ ー レ ピ ぺ ッ ト で HAT培地 2 滴 （約 0. ΐΜβ) を加'え る 。 2 、 3 、 5 、 8 、 11日 目 に培地の半分（0. Imi2)を新 し い HAT培 地で置 き 換え、 14.日 目 に培地の半分を新 し い HT培地で 置 き換え る 。 以降 3 ~ 4 日 毎に .培地の半分を新'し い HT培 地で置 き 換え る 。 通常 ' 2 — 3 週間で充分なハ イ プ リ ド ー マ の生育が観察さ れる 。 ハ イ ブ リ ドー マ生育全ゥ エ ル に ついて次項（e)記載の固相 -抗体結合テ ス ト 法 （ELISA) に よ り 陽性ゥ エ ルを チ ェ ッ ク す る 。 次に フ ィ ー ダ一 と し て 107個のマ ウ ス胸腺細胞を含む HT培地 l mfiをポ リ ス チ レ ン製 24穴セ ル ゥ ヱル（ I waki Glass) に加え た も の を用 い、 上記で検出 さ れた各陽性ハ イ プ リ ドー マの全内容物 を移す。 こ れ を前記（ c )に おける と 同様に 7 %炭酸ガ ス 存在下、 37°Cで約 1 週間培養に付す る 。 そ の間 1 〜 2 回 各 ゥ エ ル の上清 0.5w£を新 し い HT培地 0.5THJ2と 交換す る 。 ハ イ プ リ ド ー マの充分生育 した時点で E L I S A法に よ り 陽 性を 再確認 し、 それぞれにつ い て次項（ f )記載の限界希 釈法に よ る ク ロ ー ニ ン グを行 う 。 なお、 ク ロ ー ニ ン グに 使用後の残液を ボ リ ス チ レ ン製 2 5 C 7H 2祖織培養フ ラ ス コ Clwaki Glass)に移 し、 凍結保存甩試料を調製する 。
    [0028] (e) 固相 — 抗体結合テ ス ト （ELISA) に よ る 抗 ゥ シ コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー抗体産生ハ イ プ リ ド ー マ の 検 索 - Anal . B i oc em . 104 , 205 ~ 214 ( 1980 ) に記載の Rennar dら の方法を若干改変 した方法を用 い る 。 こ の方 法は、 ハ イ ブ リ ド ー マ抗体の検出 に適 し て い る 。 96穴 ミ ク ロ タ ィ ト レ ー シ ョ ン フ レ ー ト (F low Labora tor i es , Inc.) を 0.5~ 1.011 の ゥ シ コ ラ.ゲナ ー ゼィ ン ヒ ビ タ ーで コ ー ト し、 次に、 未コ ー ト 部分を 1 %牛血清ア ル ブ ミ ン CBSA)で ブ ロ ッ ク す る 。 こ れに前 （d)で得られたハ ィ ブ リ ド ー マ生育 ゥ エ ル の上清の一部を 加え て室温で約 1 時 間 イ ン キ ュ ベー ト す る 。 2 次抗体 と し て西洋わ さ びベ ル ォ キ シ ダー ゼ標識ャ ギ抗マ ウ ス ィ ム ノ グロ プ リ ン （capp - el Lab .)を 加え、' さ ら に室温で約 1 時間ィ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 次に過酸化水素 と 基質であ る 0 — フ エ 二 レ ン ジァ ミ ン を加え生成 し た褐色の程度を 肉眼で定性的に判定す る 力、、 あ る い は コ ロ ナ 2 波長マ イ ク ロ ブ レ ー ト 光度計 (MTP-22、 コ ロ ナ電気 ¾ ) を用 い て 500nmの吸光度を測定 す る 。
    [0029] (f) ク ロ ー ニ ン グ 前記（ d )の操作後、 各 ゥ エ ル中 に は 2 種以上の ハ イ ブ リ ド ー マが生育 し て い る 可能性があ る の で、 限界希釈法 に よ り ク ロ ー ニ ン グを 行い、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ハ イ ブ リ ド ー マ を取得す る 。 NS-1培地 rai2当 り フ ィ ー ダ一 と し て 107個の マ ウ ス胸腺細胞 を 含む ク ロ ー ニ ン グ培地 を 調製 し、 96穴マ イ ク 口 ゥ エルの 36ゥ エル、 36ゥ エル お よ び 24ゥ エ ル に ゥ エ ル当 り 5 個、 1 個お よ び 0.5個のハ イ プ リ ド ー マ を 加え る 。 5 日 目 、 12日 目 に全 ゥ エ ル に各約 Ο . ΐ πώの NS- 1培地を追加する 。 ク ロ ー ニ ン グ開始後 14~ 15日 で充分な ハ イ プ リ ド ー マ の生育が認め ら れ、 コ ロ ニ 一形成陰性 ゥ エルが 50 %以上であ る 群について EL I SA法 を行 う 。 テ ス ト し た全 ゥ エ ルが陽性でな い場合、 抗体陽 性 ゥ エ ル中の コ ロ ニ ー数を確認、 し、 ゥ エル'中 に 1 コ ロ ニ
    [0030] — が確認 さ れた ゥ エ ル を 4 〜 6 個選び再 ク ロ ー ニ ン グす る 。 最終的 に ゥ.:ン コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ' ン.ヒ ビ タ ー に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ハイ プ リ ド ー マ.17株が得 ら れた。 (g) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 の 生体外増殖お よ び生体内増 殖
    [0031] モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の増殖は常法に よ る 。 す な わ ち 、 モ ノ ク ロ ー ナル抗体 は、 得 ら れた各ハ イ プ リ ド ー マ を NS - 1培地な どの適当 な培養液で培養 （生体外増殖） し 、 そ の培養上清か ら 得 る こ と がで き る （モ ノ ク ロ ー ナル抗体 たん 白質濃度は 10〜 lOO igZ であ る ）。 一方、 大量に 抗 体 を 得 る た め に は脾細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞の 由来動物 と 同系の動物（Balb/c、 マ ウ ス ）に腫瘍形成促進剤 プ リ ス タ ン （2 , 6， 10 , 14— テ ト ラ メ チルペ ン タ デカ ン、 illdr i cli Chemical^: ) を マ ウ ス 一匹当た り 0.5m£腹腔內投与 し、 1 ~ 3 週間'後に、 各ハ イ ブリ ド ー マ 1 X 107値を 同 じ く 腹 腔内投与する こ と に よ り 生体内 で、 さ ら に、 1 ~ 2 週間 '後、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体たん白質濃度 4 〜 7 msZmflの腹 水を得る こ と がで き る 。
    [0032] (h) モ ノ-ク ロ ー ナ ル抗体の重鎮、 軽鎮及び ァ イ ソ タ イ プ
    [0033] 前記（ g )で得 ら れた各 々 の腹水を先ず ゥ シ コ ラ ゲナー ゼ イ ン ヒ ビ.タ ー を コ ー ト した ミ ク ロ タ イ ト レ ー シ ヨ ン プ レ ー ト に前述 し た ELISA法に従 っ て結合 さ せ る 。 PBSに よ る洗浄後次に、 ア イ ソ タ ィ ブ特異的 ゥ サギ抗マ ウ ス I g抗 体（ZymedLaborator ies)を ； 0Πえ る 。 PBSに よ る 洗浄後、 西 洋わ さ びペルォ キ シ ダー ゼ標識ャ ギ抗 ゥ サギ I gG( H + L ) .抗体を加え、 基賁 と し て 2, 2'— ア ジ ノ ー ジ （ 3 — ェ チル ベ ン ゾチア ゾ リ ン硫酸 — 6 ) お よ び過'酸化水素を用 いて 撿出 した。 そ の結果を ま と め て後掲の第 1 表に示 した。 得 ら れた ゥ シ コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー に对する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の'內 15個が免疫グ ロ プ リ ン 鎮 ァ 1 Z Λ を、 1 個力 s y 2 a / c を、 そ し て、 1 個力 s ァ 2 b Z « を有 し て い た。
    [0034] (i) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の精製
    [0035] 前記（g)で得 ら れた各腹水を硫安分画（40%飽和） 後、 塩化ナ ト リ ゥ ム 0.06 Mを含む 40mM.リ ン酸緩衝液、 P H 8.0 で平衡ィ匕 し た DEAE-Sephacel(p armac ia¾：)の 吸着画分 を分取 し、 こ の I g G画分を更に 0 . 42 M塩化ナ ト リ ゥ ム を 含む 50 mM リ ン酸緩衝液、 PH7 . 4で平衡ィヒ した S ephac ry i S - 300Super f ine ( Pharmacia社） カ ラ ム でゲ レ 月過 し、 培地中 の FCSおよ びマ ウ ス 由来の た ん 白質 を分離、 除去 5. し た。
    [0036] 実施例 2
    [0037] ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と モ ノ ク ロ ー ナル抗 体 と の交叉性
    [0038] Ca) 酵素標識モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ Fab' -POD複合体） の 0 調製法
    [0039] (1) Fab'画分の調製
    [0040] 実施例 1 ( i )で得 られた I gG画分を 0 . 1 M塩化ナ.ト リ ゥ ム含有 0.1M群酸緩衝液 （.PH4.2) に 溶解 し、 そ の溶液を 以下述べ る よ う に し てペ プ シ ン で消化 し た 。 す な わ ち 、5 前記画分中の IgGに対 し て .2 % (w/w)のべ プ シ ン を 加え、 -. · 37°Q、 24時間消化 し た。 更に そ の 消化物に ·2 M ト リ ス溶 液 を 加え て Ρ Ηを 7 . 0に調整す る こ と に よ り 消化反応を停 '止 さ せ、 0. IM リ ン酸緩衝液（ΡΗ7.0)で平衡化 し た ウ ル ト 口 ゲル AcA 44カ ラ ム （ LKB製） を 用 い た ゲル炉過に よ り0 F(ab')2画分を 分取 し た。
    [0041] 次 に 、 こ の F ( a b ' ) 2 画分 を エ チ レ ン ジ ァ ミ ン 四齚酸 (EDTA)含有 0.1 M リ ン 酸緩衝液（PH6.0)中 で透析 し、 終澳 度 10mM と な る よ う に ァ ミ ノ エ タ ン チ オ ー ル（MEA) を加え 37 °Cで 1 . 5時間還元 した後、 5 mM EDTA含有 0 . 1 M リ ン酸5 緩衝液（PH6.0) で平衡化 し た ウ ル 卜 口 ゲル AcA 44カ ラ ム を用 いてゲル ^過 し、 Fab '画分 を分取 し た。
    [0042] (2) マ レ イ ミ ド標識 POD画分の調製
    [0043] 上記（ 1 )の操作 と は別に、 以下述べ る よ う に して西洋 わ さ び由来ペル ォ キ シ ダー ゼ （ P 0 D ) に マ レ イ ミ ド を標識 し た。 すな わ ち、 PODを lOragZ τηώの量で 0.1M リ ン酸緩衝 液（ΡΗ7.0)に溶解 し、 その PODに対 し て、 25倍モル量の N 一 （ ε — マ レ イ ミ ド カ プ ロ ィ ル ォ キ シ ） コ ノ、 ク 酸ィ ミ ド (EMCS)を ジ メ チル ホ ル ム ア ミ ド溶液 と し て加え、 30°C、 30分間反応 さ せた。 こ れ を 0.1M リ ン酸緩衝液（PH6.0)で 平衡化 し た セ フ ア デ ッ ク ス G — 50カ ラ ム でゲル泸過 し、 マ レ イ ミ ド標識 POD画分を分取 し た。
    [0044] (3) Fa -POD複合体画分の調製 、
    [0045] 上記（ 1 )の如 く し て調製 した画分中の Fab ' に対 して上 記（2)で得 ら れた画分中 のマ レ イ ミ ド標識 PODと し て等モ ル に な る よ う に レ て、 両画分を 混合 し、 更に Fab 'お よ び マ レ イ ミ ド標識 P 0 Dの終濃度が 100 i Mと な る よ う に 5. ra M ' ϋ-ΤΑ含有 0.1M リ ン酸緩衝液（pH6-0)で希釈 し た。 こ の混 合液を 4 °C、 20時間反応後、 Fa の 10倍モル量の N — ェ チルマ レ イ ミ ドで未反応の チ オ ー ル基を ブロ ッ ク し た。 こ れを 0 · 1 M リ ン酸緩衝液 （ pH6.5) で平衡化 し た ウ ル ト 口 ゲル Ac A 44カ ラ ム でゲル 過 し、 Fab' -POD複合体画分 を分取後、 0.1%牛血清ア ル ブ ミ ン （BSA) 及び 0.005 % チ メ ロ サ ー ル を添加 し、 4 で で保存 し た。
    [0046] Cb) ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ
    [0047] 実施例 1 (a)項で精製 し た ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー を SDS- PAGEに供 した後、 市販の POD標識ャ ギ抗 マ ウ ス 免疫 グ ロ ブ リ ン お よ び上記実施例 2 ( a ) で得 ら れ た Fab' -POD複合体を用 い て細胞工学 1 & 2 、 1061〜 1068 (1983)に 記載の 田部の方法に従 つ て ゥ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ を行い、 酵素抗体染色の パ タ ー ン を得た 。 こ れ を 第 1 図 に示す。 第 1 図 に おい て、 A及び B は ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ後の 二 ト ロ セ ル ロ ー ス膜を そ れぞれ実施 例 2 (a)で得 ら れた Fab' (ク ロ ー ン 7 - 3Π )— POD複合体及 び Fab' (ク ロ ー ン 7— 21B12) - POD複合体で免疫染色 し た 結果を示す も の で あ る 。
    [0048] ま た、 1 〜 16は下記の各モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （い ずれ も I g G タ イ ブ） の溶液に ゥ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ後の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を 浸 し た 後、 あ ら た め て 各 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を P O D標識 ャ ギ抗 マ ウ ス 免疫 グ ロ プ リ ン (Cappel · Laboratories製） で免疫染色 し た結果を示す も の であ る 。
    [0049] 1 ： ク ロ ー ン 7— 3F.1、 2 ： ク ロ ー ン 7— 4F2、 3:ク ロ ー ン 7— 5A1、 4 : ク ロ ー ン 7— 6C1、 5 ： ク ロ ー ン 7— 7F 11、 6 ： ク ロ ー ン 7— 8B2、 7 : ク ロ ー ン 7— 9B4、 8 ： ク ロ ー ン 7— 10E1K 9 ： ク ロ 一 ン 7— 1U5、 10 ： ク ロ ー ン 7— 12B6、 11 ： ク ロ ー ン 7— 15E8、 12 ： ク ロ ー ン 7— 18F3、 13 ： ク ロ ー ン 7一 19 F6、 14 : ク ロ ー ン 7一 20C2 ; 15 : ク ロ ー ン 7一 21B12, 16 ： ク ロ ー ン 7— 23G9。
    [0050] 第 1 図 に示 さ れ る と こ ろ カゝ ら 明 ら かな よ う に 、 上記 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 は 、 い ずれ も ウノン歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と 交叉す る こ と がわか っ た。
    [0051] 実施例 3
    [0052] サ ン ド ィ ツ チ酵素免疫測定法
    [0053] (a) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体結合ポ ー ルの調製法
    [0054] J - Immunoassay 4., 209〜 327 ( 1983 )に記載の石川 ら の 方法に従 っ て実施例 1 ( i )で得 られたモ ノ ク ロ ーナル抗 体を 0.1 % ア ジ化ナ ト リ ゥ ム含有 0.1 M リ ン酸緩衝液 （ PH 7.5) に溶解 し、 それを ΙΟΟ/^Ζ τ^ (A2 S。 = 0.15) の澳度 に驛整 した後、 そ の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体溶液に ボ リ ス チ レ ン ボーソレ（径 6.5rara、 Precisi.on Plastic Ball製） を浸 漬 し、 4 °Cに 24時間静置 した。 次に モ ノ ク ロ ーナル抗体 溶液を除去 した ^、 0. 1 % BSA 0. 1 %塩化ナ ト リ ウ ム及 び 0.1% ア ジ化ナ ト リ ゥ ム含有 10mMリ ン酸緩衝液（PH7.0) (以下緩衝液 A と 略記す る ） で 5 回洗浄 した後、 緩衝液 A に浸 し、 4 。Cで保存 した。
    [0055] - (b) サ ン ド イ ッ チ測定法 ·
    [0056] 精製 した コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ 一溶液、 あ る い は コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を含む試料溶液を 1 % BSAを含 む緩衝液 Aで希釈 し、 各試験管に 3ひ 0 /i βを加えた。 次に 前記（ a )項で調製 し た抗体結合ボールを加え、 37 °Cで 1 時間振 と う 加温後（第 1 反応） 、 0.1M塩化ナ ト リ ウ ム含 有 lOmMリ ン酸緩衝液（PH7.0) 3— mi2で各試験管を 3 回.洗浄 した。 次に実施例 2 (a)項で調製 した Fab ' -POD複合体を 20agZ試験管と な る よ う に 0.1_ % BSA及び 0.1 M塩化ナ ト リ ウ ム含有 10mMリ ン 酸緩衝液（pH7.0) で希釈 し 30°Cで 1 時間振 と う 加温 し た （第 2 反応） 。 反応終了後、 第 1 反 応終了時 と 同様に 洗浄 し た。 次に 0 . 1 M酢酸緩衝液 （ pH 5.5) に溶解 し た POD基質、' す な わ ち 0.0134% テ ト ラ メ チ ルベ ン チ ジ ン （TMBZ) を 0.3raj2加え、 更に 0.01%過酸化水 素 0. lm£を 加えて 30。Cで 1 時間振 と う 加温（第 3 反応） 後、 1 .33 N硫酸 0.6¾βを添加する こ と に よ り 反応を停止さ せ た。 そ の反応混液の A4 5 Q値 を.分光光度計で測定 し、 標準 直線 よ り ^料 中 の コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 量 を 求 め た。
    [0057] (c) サ ン ド.ィ ツ チ測定用 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の選択
    [0058] コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 定量す る こ と が可能な モ ノ ク ロ ー ナル钪体の組み合わ せ を探す 目 的で実施例 1 (i) 項の方法で精製 し た ク. ロ ー ン 7— 3F1、 7 - 6C1、 7— 19F6、 お よ び 7— 21B12の各モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体か ら Fab' -POD複 合体を調製 し た。 一方、 ク ロ ー ン 7— 3F 1、 7— 4F2、 7— 5A 7 - 6C1、 7 - 7F1 7 - 8B2、 7 - 9B4、 7 - 10El i、 7 一 11A5、 7 - 12B6、 7 - 15E8、 7 - 18F3、 7— 19F6、 7— 20C2、 7 - 21B12 お よ び 7— 23G9 の各モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 固 相 と し て、 試験管当た り I n の精製 し た ゥ シ齒髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を用 レ、 て実施例 3 ( b )項の方法に よ り サ ン ド イ ッ チ定量 を 行 っ た。 得 ら れた A4 5。値 を 後掲の 第 2 表に示す。 な お、 第 2 表中の A 45。値 は試料 1 rig添加 の値力 ら コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 添加 し な い時の値 を差 し 引 い た数値であ る 。 上記 4 種類の い ずれの Fa b ' - POD複合体を 用 い た場合に お い て も 、 固相 と し て 7— 4F2、 7 - 11A5、 7 - 12B6、 7 - 18F3、 7 - 20C2、 お よ び 7 - 23G9 の 6 種類の抗体を用 い た時の A4 5。が 2 以上の値を示 し た。 次に こ れ ら 24通 り の耝み合わせについて、 ゥ シ齒髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の添加量を変えてサ ン ド ィ ツ チ定 量を行っ た。 Fab' (ク ロ ー ン 7— 6C1) 一 PODを複合体 と し て、 ク ロ ー ン 7 — 23 G9抗体を固栢と した場合に得 られた 結果を第 2 図 に示す。 第 2 図に示す よ う に、 添加 し た ゥ シ歯髄コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量 と A45。の間に直線関 係が成立 し、 定量感度は試験管当 た り 約 1 P3(32 a mofi) であ っ た。 .上記以外の綴み合わ せにつ いて も 上記の直線 関係がみ ら れ、 いずれの組み合わせについて も サ ン ド ィ ツ チ定量が可能で'あ る こ と がわか つ た。
    [0059] 実施例 4
    [0060] ヒ ト 血清中の コ ラ ゲナーゼ ィ ン ヒ ビタ ー の同定
    [0061] (a) ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム の調製
    [0062] Nature 214, 1302~ 1304(1967)に記载の Ax nら お よ び Pro Natl . Acad. Sci . USA, 61_ 636- 643C1968) に記 載の Cua t r e c as as らの方法に従っ て臭化シ ア ン を介 して 担体の セ フ ァ ロ ー ス 4 B に リ ガ ン ド と し て実施例 1 ( i ) 項で得 ら れた精製モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を 固定化 した。 次 に抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B ゲル 0 . 3 miZを ガラ ス管に充 填 し、 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 mM塩化カ ル シ ウ ム 含有 30mMト リ ス -塩酸緩衝液（PH8.0) で平衡化 し使用 し た。
    [0063] Cb) ヒ ト 血清コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
    [0064] ヒ 卜 血清 l mi2を 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 mM塩化 カ ル シ ウ ム含有 3 OmMト リ ス ー 塩酸緩衝液（PH8.0) に対 し て透析 し た後、 上記（ a )項記載の方法に 従 っ て調製 し た ク ロ ー ン 7— 21B12抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B カ ラ ム に供 し、 上記緩衝液で洗浄 し （非吸着画分）、 次に カ ラ ム を 2 M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 30mM ト リ ス — 塩酸緩衝液（PH7.5) お よ び 0.5 M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 0.2 M グ リ シ ン 一 水酸化 ナ ト リ ウ ム緩衝液（PH 10.5)で順次洗净 し （洗浄画分）、 最 後 に カ ラ ム.に吸着 し た蛋 白質を 0.2 M グ リ シ ン 一 塩酸緩 衝液（PH2.0)で溶出 し た（溶出画分） 。 得 ら れた溶出画分 を 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 m M塩ィ匕カ ル シ ウ ム含有 30mM ト リ ス - 塩酸攀衝液（PH8.0) 中で透折 し た後、 も う —度ク ロ ー ン 7- 21B12-抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B カ ラ ム を用 い た再ァ フ ィ 二 テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に供 し 、 上 記 と 同様の操作に よ り 溶出画分に コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を得た 。 そ こ で、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 に対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体力 S ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン上 ビ タ ー と 交叉す る の か否か を検討す る た め、 上記 の溶出画分を SDS-PAGEに 供 し た後、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を 行 っ た 。 第 3 図 は ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ後 の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を 1 : ク ロ ー ン 7— 3F1、 2 : ク ロ ー ン 7— 6C1、 3 ： 7— 19F6、 4 ： ク ロ ー ン 7— 21 B 12お よ び 5 ： ク ロ ー ン 7 — 23 G 9の各モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体か ら調製 し た Fab' -POD複合体で免疫染色 を 行 つ た結果を示す も の であ る 。 第 3 図 に示さ れ る よ-う に、 ヒ ト 血清中 に も ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ ー に対する モ ノ ク ロ ーナル抗体 と 反応する コ ラ ゲナーゼ ィ ン ヒ ビ タ ーが存在する こ と が わかっ た。 しか も 、 それ ら の分子量は い ずれ も 実施例 1 ( a)項で得 られた ゥ シ齒髄コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の そ れ と 同 じ 32 , 000 D であ る こ と 力 Sわか っ た。 - 実施例 5
    [0065] サ ン ド ィ ツ チ測定法に よ る ヒ ト 血清中の コ ラ ゲナ ー ゼィ ン ヒ ビ タ ー の定 δ
    [0066] (a) 標準直.線の作成
    [0067] ヒ ト コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー をサ ン ド ィ ツ チ定量す る の に最も 適 し たモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の組み合わせにつ いて検討 した。 実施例 3 ( c )項に示 し た よ う に、 ゥ シ歯 髄コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ ー を感度良 く 定量で き る 4種 類の Fab' -POD複合体、 すなわち、 Fab ' (7— 3F1)-P0D、 Fabノ 6C1) - P0D、 FalD' C7— 19F6) - PODお よ び Fab'(7— 21B12)-PODと 6 種類の固相用抗体、 すなわ ち、 ク ロ ー ン 7 - 4F2、 7 - 11 A5, 7 - 12B6、 7— 18F3、 7 - 20C2および 7— 23G9のモ ノ ク ロ ー ナル抗体を用 いた 24通 り の組み合 わ せの う ち 、 実施例 4 (b)項に記載 し た と お り に カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー処理 し た ヒ ト 血清コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー を定量で き る 組み合わせを調べた。 そ の結果、 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 を抗原 と し た場合、 用 いたほ ん どの組み合わ せで A 45。の シ グナルは全 く 検 出 さ れなか っ たが、 固相用抗体 と し て ク ロ ー ン 7-23G9抗 体、 複合体 と し て Fab' (ク ロ ー ン 7-6C1)— PODを用 い た場 合、 サ ン ド イ ッ チ定量可能であ る こ と がわ 力、 つ た。 次に 上記の祖み合わせ を用 い て、 実施例 3 ( c )項に示 し た方 法に よ り 、 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の添加量 を変えてサ ン ド イ ッ チ定量を行 う こ と に よ っ て標準直線 を作成 し 、 得 ら れた結果を第 4 図に示す。 第 4 図 に み ら れる よ う に 、 添加 し た ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一量 と A4 5。の 間に直線関係が成立 し 、 ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量が可能であ る こ と がわ か っ た。 し か し、 そ の定量感度は試験管当 た り 約 10P3( 320 a πιοώ) で あ り 、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の場合の定量 感度（'試験管当た り 1 Ρ に比べ て 10倍低い こ と がわ か つ た。
    [0068] (b) サ ン ド イ ッ チ測定法に よ る 健常人血清中 お よ び慢性 関節 リ ウ マ チ患者血清中の コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 の定量 ·
    [0069] 上記（ a )項に示 し た モ ノ ク ロ ー ナル抗体の組み合わ せ を 用 い て、 健常人血清 50検体お よ び慢性関節 リ ゥ マ チ患 者血清 14検体の 中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を サ ン ド イ ッ チ定量 し 、 そ の結果を 後掲の第 3 表に示 し た。 な お、 こ のサ ン ド イ ッ チ定量に お い て は、 標準直線 の作成に は抗原 と し て実施例 4 ( b )項で精製 し た ヒ ト 血 清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 を 用 レ、 た。 ま た、 こ の定量 は、 検体血清 を 1 % BSAを含む緩衝液 A で 1 , 600倍に希釈 し て行 っ た。 第 3 表に示 し た数値は、 同一の実験系 を 2 回行っ た結果の平均値であ る 。 第 3 表にみ られる よ う に、 嫿常人血清 1 m 中に存在する コ ラ ゲナーゼィ ン ヒ ビタ ー 量は平均 1.23土 であ る の に対 し、 慢性関節 リ ウ マ チ患者血清 1 mfl中に存在す る コ ラ ゲナ ーゼィ ン ヒ ビタ 一 量は平均 2.08± 0.58/^と高い値 （ P 《0.001)を示した。 従って、 血清中の コ ラ ゲナ一ゼ ィ ン ヒ ビタ ー をサン ド ィ ツ チ定量する こ と に よ り 、 被測定者が慢性関節 リ ゥ マチ 疾患にかかっ てい る か否かを知る こ と がで き る 。
    [0070] (c) サ ン ド ィ ツ チ測定法に よ る健常人関節液中お よび慢 性関節 リ ウ マチ患者関節液中の コ ラ ゲナーゼイ ン ヒ ビタ ーの定量
    [0071] 上記（ b )項に示'したの と 同 じ方法を用 いて、 健常人関 節液 7 検体お よ び慢性関節 リ ゥ マチ患者関節液 5 検体の 中に存在する コ ラ ゲナーゼ ィ ン ヒ ビタ ーをサン ド ィ ツ チ 定量 し、 その結果を後掲の第 4 表に示 した。 第 4表にみ られる よ う に、 健常人関節液 i mi2中に存在する コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー量は平均 2.35 ± 0.36 であ る のに対 し 慢性関節 リ ゥ マチ息者血清中に存在する コ ラ ゲナーゼィ ン ヒ ビタ 一量は平均 9.49± 1.77/^と 高い値（ p < 0.001) を示した。
    [0072] 従っ て、 関節液中に存在する コ ラ ゲ'ナーゼイ ン ヒ ビタ 一をサ ン ド イ ッ チ定量する こ と に よ り 、 被測定者が、 慢 性関節 リ ゥ マチ疾患にかカゝつ て い る か否かを知る こ と が で き る 。
    [0073] 実施例 6 ヒ ト 血清中の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の精製
    [0074] 実施例 4 の （ b ) で最終的に得 られ た溶出画分中 に は前 述 し た と お り 、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 と 反応す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー が存在す る （第 3 図参照） 。 し カゝ し、 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー以外に も 、 上記モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 と は 反応 し な い蛋 白質が多種存在す る こ と が認め ら れた。 そ こ で、 こ.の溶出画分 を 0.1M リ ン酸緩衝液（PH7.5)で平衡 化 し た AcA 44カ ラ ム を 用 い てゲル炉過 を 行い、 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー と 他の蛋 白質 と を分離す る こ と に よ り ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を精製 し た。 第 5 図 は得 られた血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン 'ヒ ビ タ ー （ 1 )、 対照'と し て の ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー （ 2 )お よ び分 子量マ ー カ 一 （3)の各 SDS-PAGEパ タ ー ン を示 し て い る 。 第 5 図 に み ら れ る よ う に 、 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の分子量は ゥ シ齒髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の それ と 同様、 32, 000 D であ る こ と 力 sわ 力 つ た。
    [0075] 実施例 7
    [0076] サ ン ド イ ッ チ測定法に お け る 精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の標準直線の作成
    [0077] 実施例 6 に おい て得 ら れた精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の添加量 を変え て、 実施例 5 の （ a)項記載 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の組み合わ せ を 用 い てサ ン ド ィ ッ チ定量を行 う こ と に よ っ て標準直線 を 作成 し た 。 得 ら れ た結果は第 6 図 に示す と お り であ る 。 第 6 図 に み ら れ る よ う に、 添加 し た ヒ ト 血清コ ラ ゲナー ゼ イ ン ヒ ビタ ー量 l A45。の間に直線関係が成立 し、 こ の時の定量感度は試 験管当た り 1.5P^(48 a moi2)であ っ た。 こ の定量惑度は、 実施例 5 の （a)項で作成 し た標準直線の場合に比べて 6.7 倍高 く 、 ま た、 実施例 3 の（ c )項記載の ゥ シ齒髄コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 の場合に比べて 1 . 5倍低い こ と がわ か つ た。
    [0078] 実施例 8
    [0079] サ ン ド ィ ツ チ測定法に よ る ヒ ト 体液中の コ ラ ゲナー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の 定量 に基づ く 慢性関節 リ ゥ マ チ 疾患 の診 断
    [0080] Ca) サ ン ド ィ ツ チ測定法に よ る 健常人血清中 お よ び慢性 関節 リ ゥ マ チ疾患患者血清中の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量
    [0081] 実施例 7 に示 し た標準直線に基づい て健常人血清 50検 体お よ び慢性関節 リ ゥ マ チ患者血清 14検体の中に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー をサ ン ド ィ ツ チ定量 し た。 その結果は後掲の第 5 表に示さ れてい る 。 な お、 こ のサ ン ド ィ ツ チ定量に おい て は、 標準直線の作成に は抗原 と して実施例 6 項で精製 し た ヒ ト 血清コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 用 い た。 ま た 、 こ の 定量は、 検体血清 を 1 % BSAを含む緩衝液 Aで 1，600倍に希釈 し て行 っ た。 第 5 表 に示 し た数値は、 同一の実験系 を 2 回行 っ た結杲の平均 値であ る 。 第 5 表に み られ る よ う に、 建常人血清 1 mi2中 に存在する コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー量は平均 184 ± 31 n であ る の に対 し、 慢性関節 リ ウ マ チ患者血清 1 m に 存在する コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー量は平均 312土 87n^ と 高い値（ P 《 0.001) を示 し た。 従っ て、 血清中の コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー をサ ン ド ィ ツ チ定量す る こ と に よ り 、 被測定者が慢性関節 リ ゥ マチ疾患にかかっ てい る か 否かを知る こ と がで き る 。
    [0082] Cb) サ ン ド ィ ツチ測定法に よ る 饈常人血漿中およ び慢性 関節 リ ゥ マ チ疾患患者血漿中の コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ーの定量
    [0083] Br . J - Haemato l . 33 , 239〜 247( 1976) に記載の
    [0084] Ludlamと Cashの方法に従っ て、 健常人血液およ び慢性関 節 リ ゥ マチ疾患患者血液か ら それぞれの血漿を採取 した なお、 こ こ で採取 し た血漿は、 血液に EDTA、 プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン E i、 お よ びテ オ フ ィ リ ン を加え冷却 した後、 4 °Cで 1900 X 60分間遠心分離 し て得 られた上澄であ り 、 血液中の血小板は、 分解さ れずに沈澱画分に と どま っ て い る 。
    [0085] 上記の如 く して得 られた健常人血漿 26検体お よ び慢性 '関節 リ ゥ マ チ疾患患者血漿 24検体の中に存在す る 各コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー を上記（ a )項に示 し 方法 と 同 じ 方法を用 いてサ ン ド イ ッ チ定量 し た。 そ の結果は後掲の 第 6 表に示す と お り であ る 。 第 6 表にみ ら れる よ う に、 建常人血漿 Ι πώ中に存在する コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー 量は平均 64± 10ngであ る の に対 し、 慢性,関節 リ ゥ マ チ疾 患患者血漿中に存在する コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー量は 平均 84± 23n3と 高い値（P 《0.001)を示 した。
    [0086] (c) サ ン ド イ ッ チ測定法に よ る健常人関節液中および慢 性関節 リ ゥ マチ疾患患者関節液中の コ ラ ゲナーゼ ィ ン ヒ ビタ ー の定量
    [0087] 上記（ a )項に示 した方法 と 同 じ方法を用 いて、 饈常人 関節液 7 検体お よ び慢性関節 リ ゥ マチ疾患患者関節液 5 換体の中 に存在す る コ ラ ゲナーゼ ィ ン ヒ ビタ ーをサ ン ド イ ッ チ定量 した。 その結杲は、 後'掲の第 7 表に示す と お り であ る 。 第 7 表にみ られる よ う に、 健常人関節液 l mfi 中 に存在す る コ ラ ゲナーゼィ ン ヒ ビタ ー量は平均 357土 51 であ る のに対 し、 慢性関節 リ ゥ マチ疾患患者血清中 に存在す る コ ラ ゲナーゼィ ン ヒ ビタ 一'量は平均 1'424 ±'26 と高い値（ p 《 0.001)を示 し た。
    [0088] 従っ て、 関節液中に存在す る コ ラ ゲナーゼ イ ン ヒ ビ タ 一をサ ン ド イ ッ チ定量する こ と に よ り 、 被測定者が、 慢 性関節 リ ゥ マチ疾患にかかっ てい る か否か知る こ と がで き る 。
    [0089] 実施例 9
    [0090] モ ノ ク ロ ーナル抗体と コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー と の特 異的反応の確認
    [0091] 実施例 4 ( b )項に示 した よ う に、 サ ン ド イ ッ チ測定法 に用 い る 2 種類のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ク ロ ー ン 7— 6C1 と ク ロ ー ン 7 - 23G9)は ヒ ト コ ラ ゲナーゼ ィ ン ヒ ビタ ー と 反応する が、 血清、 血漿あ る い は関節液な どの よ う に、 種 々 の蛋白質が高濃度で溶解 してい る 系中でも こ の モ ノ ク ロ ー ナル抗体力 s コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と 特異的 に 反応 し て い る こ と を確認す る ため の試験 を 行 っ た。 嫿常 人血清あ る い は リ ゥ マ チ疾患患者血清 を それ ぞれ 0 . 1 M 塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 mM塩ィ匕カ ル シ ウ ム 含有 30πιΜト リ ス —塩酸緩衝液（Ρ Η 8 . 0 ) で 5 倍に希釈 した後、 実施例 4 (a)項記載の方法に従 っ て調製 し た ク ロ ー ン 7 - 23G9 (サ ン ド イ ッ チ測定法の 固相'用 ^:体） 結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B カ ラ ム に 供 し、 実施例 4 の （ b )項記載の方法に従 っ て溶 出画分 を得た 。 こ の溶出画分 を SDS-PAGEに供 し た後、 ゥ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を 行 い 、 サ ン ド ィ ツ チ測定法の 標識抗体であ る Fa （ク ロ ー ン 7 - 6CD-P0D複合体で免疫 染色を行 っ た 。 そ の結果は第 7 図 に示 と お り であ る 。 こ の第 7 図 に見 ら れ る よ う に、 1 : 精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー、 2 : 健常人血清、 3 : リ ウ マ チ疾 息患者血清の い ずれ を用 い た場合に も 、 単一バ ン ド を示 す こ と か ら 、 本発明 の診断法に お け る サ ン ド イ ッ チ測定 法に よ り 、 極め て特異的 に コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ーが 定量 さ れて い る こ と が示 さ れた。
    [0092] 以上述べた こ と か ら 明 ら か な よ う に 、 本発明方法を 用 い る こ と に よ り 、 慢性関節 リ ウ マ チ疾患の診断を、 簡便 に 、 短時間内 に さ ら に感度良 く 行 う こ と がで き る 。 第 1 表 ク ロ ー ン番号 サ ブク ラ ス Z鎮
    [0093] 7 - 3F1 IgGl/ κ
    [0094] 7 - 7F11 IgGl/ κ 7- 8B2 IgG2a/ κ 7- 9B4 IgGl/ JC 7 - 10E11 IgGl/ K
    [0095] 、 7— 11A5 IgGl/ に
    [0096] 7 - 12B6 IgGl/
    [0097] 7- 14E9 IgGlZ /c
    [0098] 7- 18F3 I gG2b/ に 7- 19F6 IgGl/ « 7 - 20C2 IgGl/ K 7- 21B12 IgGl/ K 7- 23G9 IgGl/ K
    [0099]
    [0100] LDd 8ム 0Z0/68 O 第 3 表
    [0101] ' 建常人血清 慢性関節リゥマチ患者血清 検体 コラゲナーゼ 検体 コラゲナーゼ 検体 コラゲナーゼ
    [0102] ノヒ 匕グtT一 金" "5" つ 匕匕グ一 Λ £ ノ匕 ヒグ一 i Zm
    [0103] 1 0.82 26 1.03 1 ' 1.33
    [0104] 2 0.87 27 1.50 2 1.42
    [0105] 3 1.40 28 1.23 3 2-02
    [0106] 4 1.07 29 1.63 4 2.02 '
    [0107] 5 1.17 30 1.33 5 1.74
    [0108] 6 1.40 31 1.40 6 2.85
    [0109] 7 1.33 32 1.40 7 2.02
    [0110] 8 1.27 33 1.17 8 3.54
    [0111] Q 1.03 34 1.10 9 2.28
    [0112] 10 1.40 35 1.17 10 1.96
    [0113] 11 1.03 36 1.17 11 2.53
    [0114] 12 1.33 37 1.23 12 1.90
    [0115] 13 1.13 38 1.63 13 1.71
    [0116] 14 し 40 39 1.03 14 1.74
    [0117] 15 0-82 40 1.40
    [0118] 16 0-92 41 1.03
    [0119] 17 1.03 42 1.33
    [0120] 18 1.07 43 1.57
    [0121] 19 1-17 44 1.53
    [0122] 20 1.33 45 1.27
    [0123] 21 1.47 46 1.10
    [0124] 22 1.33 47 1.17
    [0125] 23 1.13· 48 1.40
    [0126] 24 1 -47 49 1.10
    [0127] 25 1.00 50 1.03
    [0128] 平均 1 -23±0-20 平均 2.08±0.56 第 4 表 健常人関節液 慢性関節リゥマチ患者関節液 検体 コラゲナーゼインヒビター 検体 コラゲナーゼィンヒビター
    [0129] ^ 'τ' 番号
    [0130] 1 2.30 1 8-04
    [0131] 2 2.04 2 12.33
    [0132] 3 2.56 3 7.78
    [0133] 4 2.30 4 10.76
    [0134] 5 3.02 5 8.54
    [0135] 6 2.04
    [0136] 7 2-39
    [0137] 平均 2.38±0.31 /nd 平均 9·49±1.77/^Ζ)/ώ
    [0138] 第 5 表 健常人血清 慢性関節リゥマチ患奢血清 検体 コラゲナーゼ 検体 コラゲナーゼ 検体 コラゲナーゼ
    [0139] ¾ W-&ゥ イ ン タ一 番县 つ 1- し'々ノ 一 番号 ィつ V ' c_'々ク 一一
    [0140] igf mぬ
    [0141] 1 123 26 155 1 200
    [0142] 2 131 27 225 2 213
    [0143] 3 210 28 185 3 303
    [0144] 4 161 29 245 4 303
    [0145] 5 176 30 200 5 261
    [0146] 6 210 31 210 6 428
    [0147] 7 200 32 210 7 303
    [0148] 8 191 33 176 8 531
    [0149] 9 155 34 165 9 342
    [0150] 10 210 35 176 10 294
    [0151] 11 155 36 176 11 380
    [0152] 12 200 37 185 12 285
    [0153] 13 170 38 245 13 257
    [0154] 14 210 39 155 14 261
    [0155] 15 123 40 210
    [0156] 16 139 41 155
    [0157] 17 155 42 200
    [0158] 18 161 43 236
    [0159] 19 176 44 230
    [0160] 20 200 45 191
    [0161] 21 221 46 165
    [0162] 22 200 47 176
    [0163] 23 170 48 210
    [0164] 24 221 49 165
    [0165] 25 150 50 155
    [0166] 平均 184±31 平均 312±87 第 6 表 健常人血漿 慢性関節リゥマチ疾患患者血漿 コラゲナ コラゲナ コラゲナ コラゲナ 檢体 ーゼィン 検体 ーゼィン 検体 ーゼィン 検体 ーゼィン 番号 ヒビター 番号 ヒビター 番号 ヒビター 番号 ヒビター
    [0167] ( / i
    [0168] 1 70 15 51 1 60 15 49
    [0169] 2 75 16 57 2 74 16 61
    [0170] 3 84 17 53 3 110 17 119
    [0171] 4 70 18 60 4 65 18 82
    [0172] 5 54 19 60 5 79 19 109
    [0173] 6 49 . 20 64 6 88 20 88
    [0174] 7 74 21 56 7 91 21 119
    [0175] 8 73 22 62 8 89 22 95
    [0176] 9 64 23 74 9 59 23 125
    [0177] 10 72 24 61 10 65 24 115
    [0178] 11 62 25 78 11 81
    [0179] 12 67 2 & 44 12 52
    [0180] 13 54 13 68
    [0181] 14 74 14 69 平均 64土 10 平均 84土 23 第 7 表 健常人関節液 慢性関節リゥマチ患者関節液 検体 コラゲナーゼインヒビタ一 検体 コラゲナーゼィンヒビター 香 番号
    [0182] 1 345 1 1206
    [0183] 2 306 2 1850
    [0184] 3 384 3 1167
    [0185] 4 345 * 4 1614
    [0186] 5 453 5 1281
    [0187] 6 306
    [0188] 7 359 平均 357±51 平均 1424 ±296
    [0189] 〔図面の箇単な説明〕
    [0190] 第 1 図 は ゥ シ歯髄 ゴ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を S D S - PAGEに供 し た後、 種 々 の モ ノ ク ロ ー ナル抗体 を 用 い た時 の ゥ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グパ タ ー ン を示す図であ り 、 第 2 図は固相 7— 23G9抗体一複合体 Fab ' (7— 6C1 )-P0D測 定系での ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の標準直線 を示す図であ り 、 第 3 図 は ヒ ト 血淸 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を SDS-PAGEに供 し た後、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ を行 っ た時の免疫染色のパ タ ー ン を 示す図であ り 、 第 4 図は固相 7一 23G9抗体一複合体 Fab ' (7— 6C1 )-P0D測定 系での ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の標準直線 を 示す図であ り 、 第 5 図 は ヒ ト 血清か ら 精製 し た コ ラ ゲヂ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の SDS-PAGEノ タ ー ン を示す図であ り 、 第 6 図 は精製 し た ヒ 卜 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 角 い て、 サ ン ド イ ッ チ測定 し た時の標準直線 を示す図で /あ り 、 第 7 '図 は ヒ ト 清 を I.gG(7 - 2 G9)抗体結合ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム に供 し て得 ら れた溶出画分 を SDS-PAGEに 供 し た後、 Fab'(7— 6C1)-P0D複合体を用 レ、 た時の ゥ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ ノく タ ー ン を示す図であ る 。
    权利要求:
    Claims
    5S 求 の 範 囲
    コ ラ ゲナーゼィ ン ヒ ビタ ーの異な る抗原決定基に対 し . 特異的に結合する 2 種類のモ ノ ク ロ ーナ ル抗体の み合 わせを用 いたサ ン ド ィ ツ チ法に よ り 、 酵素免疫学的に血 5 清中、 血槳中あ る い は関節液中に存在する コ ラ ゲナーゼ ン ヒ ビタ ー を定量 し、 その定量値を健常人の値と 比較 する こ と を特徵と する慢性関節 リ ゥ マチ疾患の診断法。
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    1989-03-09| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1989-03-09| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): DE FR GB IT |
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    优先权:
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