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    公开号:WO1989001485A1
    申请号:PCT/T1988/000063
    申请日:1988-08-11
    公开日:1989-02-23
    发明作者:Doris Schäfer
    申请人:Gebro Broschek Kg；
    IPC主号:C07K1-00
    专利说明:
    Reinigung von Rohpeptiden mittels präparativer MitteldrucR- Flüssigkeitschromatographie. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruck-FlüssigkeitschromatographieWeiters bezieht sich die Erfindung auf eine mit einem solchen Verfahren hergestellte Peptidverbindung. Das Prinzip der Festphasensynthese von Peptiden ist von R.B.Merrifield zum Beispiel in "Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 801 bis 812, beschrieben. Im "International Journal of Peptide and Protein Research", Band 25, (1985), Seiten 449 bis 474 beschreibt M.Bodanszky das Prinzip der Peptidsynthese in Flüssigphase. Die EP-A 37 516 beschreibt eine Festphasensynthese eines Vasopressinderivates nach Merrifield, und im ersten Abschnitt auf Seite 8 wird eine Reinigung auf Molekularsieben (Trennung nach Molekulargewicht) beschrieben. Eine ähnliche Reinigung wird auch in der US-PS 4 148 787 und in "Collection Czechosliov. Chem,Comm.", Vol.31, (1966), Seiten 4581 bis 4591, beschrieben. In - der US-PS 4 093 610 wird im Zusammenhang mit einer Flüssigphasensynthese eine Reinigung auf Ionenaustauschern oder auf Molekularsieben beschrieben. WeitereReinigungsmethoden werden in der DE-OS 27 23 453 (Beispiel 19) und der DE-PS 1 643 273 beschrieben, wobei die letztere methodenur für Mengen im mg-Bereich durchführbar ist. Auf die Problematik der Peptid-Reinigung ist auch von G.Flouret et al. in "Int.J.P.eptide Protein Res.",13, (1979), Seiten 137 bis 141, hingewiesen worden. Im übrigen sei auch auf foloende, zum Stand der Technik gehörende Literaturstellen verwiesen:K.Noda in "Int.J.Peptide Protein Res.",19,(1982),Seiten 413-419; "Collection of Czechoslov. Chem.Comm.", Vol.32, (197),Seiten 1250- 1257;EP-A 112 809,insbesondere Beispiel 1, worin die nichtökonomische HPLCzur Aliredung kommt;US-PS 4 495 097;V.ou Vigneaued et al., (1960), J.Biol.Chem. Vol.235,Nr.12,Seiten 64-66. Ausführlicher werden bestimmte Reinigungsmethoden beschrieben inJ.Chromatoa., 38, (1968), Seiten 398-398,und M.Zaralet al., Collection CzechaAkv. Z m. ,m.,Vol.43,(1978),Seiten511-522. Mit allen diesen bekannten Reinigungsverfahren können im allgemeinen ökonomisch vertretbare Reinheitsgrade von 92 bis 94 % erreicht werden. Das hat - zur Folge, dass bei einer medizinischen Verwendung einer Peptidverbindung stets nachgewiesen werden musste, dass die sie begleitenden Nebenprodukte keine nachteiligen Folgen, Auswirkungen, Nachteile haben, was nicht leicht war, da man oft nicht wusste, aus was für Verbindungen die Nebenprodukte bestanden. Dieser Zustand ist unbefriedigend, zumal in der Medizin immer mehr Peptidverbindungen eingesetzt werden. Die Erfindung setzt sich zur Aufgabe, ein ökonomisches Reinigungsverfahren für Peptidverbindungen zu schaffen, mit welchem Reinheiten von über 99 % erreicht werden können. An Hand der bekannten Literatur musste man annehmen, dass es überhaupt nicht möglich ist, eine solche Reinheit auf ökonomische Art zu erreichen. Ebenso nahm man an, dass es absolut unmöglich ist, ein solches Peptid-Reinigungsverfahren mit hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden im industriellen Massstab durchzuführen. Völlig überraschend wurde nun doch ein solches Verfahren gefunden. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids, vorzugsweise einer wässerigen Rohpeptidlösung,mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographieist dadurch gekennzeichnet, dass man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die "reversed-phase-Silica"-Material, d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure, mit einer Korngrösse von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengrösse von 60 bis 300 Angström als stationäre Phase enthält, dass man dann bei einem Druck von pbis 40 bar mit einer mobilen Phase, bestehend aus (a) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel undI*EEr,oder (b) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 1G,oder (c) einer rein wässerigen Pufferlösung mit einem pH-Bereich von2 bis 10, wobei in allen drei obigen Fällen (a) bis (c) zusätzlich noch wenigstens ein Chelierungsmittel in geringer Konzentration und wenigstens eine stark polare organische Verbindung in geringer Konzentration vorhanden sein müssen, entweder isokratischoder mit einem Gradienten eluiert. und so das Gemisch auftrennt, und schliesslich das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktioniert. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens sind in den abhängigen Verfahrensansprüchen definiert. Das erfindungsgemässe Verfahren hat den Vorteil, dass es äusserst ökonomisch ist. Es ist weiter sehr vorteilhaft, dass das erfindungsgemässe Verfahren in einem niedrigen Druckbereich durchgeführt werden kann. Ebenso ist das Säulenfüllmaterial relativ billig, weil im erfindungsgemässen Verfahren irreguläre statt sphärische Partikel verwendbar sind. Im Vergleich zu entsprechendem HPLC-Material ist das erfindungsgemäss eingesetzte Säulenfüllmaterial gegenwärtig etwa 20 mal billiger. Während der Reinigung werden die Peptidverbindungen weder denaturiertnoch weisen sie einen Aktivitätsverlust auf; das erfindungsgemässe Verfahren ist also für die Peptidverbindungen äusserst schonend. Durch geeignete Wahl des Fliessmittels können die Peptidverbindungen rasch und selektiv getrennt werden. Die erfindungsgemäss aufgetrennten, gereinigten Peptidverbindungen weisen erstaunlicherweise eine Reinheit von über 99% auf, was mit grosser Wahrscheinlichkeit auf den Zusatz der erwähnten Chelierungsmittel und der erwähnten, stark polaren, organischen Verbindungen zurückzuführen ist. Weitereskönnen mit dem erfindungsgemässen Verfahren grosse Mengen an Lösungsmitteln eingespart werden. Der Nachweis der Peptidverbindungen in den Fraktionen erfolgt z.B. im UV-Licht bei einer Wellenlänge von 232 nm oder 275 nm. Zur Kontrolle der Reinheit und der Struktur des Peptides in den Fraktionen können die bekannten Methoden angewendet werden: beispielsweise HPLC, DC, Aminosäurenanalyse, Sequenzanalyse.Falls ein Puffer im Fliessmittel verwendetwird, so werden die entsprechenden Fraktionen vorteilhaft noch vor der . Lyophilisation entsalzt, z.B. an Ionenaustauschern oder mittels Molekularsieben. Um das fraktionierte, erfindungsgemäss oereinigte Peptid als Festkörper zu erhalten, wird die entsprechende Fraktion beispielsweise lyophilisiert. Mit dem erfindungsgemässen Reinigungsverfahren ist es möglich, beispielsweise 20-50 9Rohpeptid innerhalb von 3 Stunden zu reinigen. Für das erfindungsgemässe - Reinigungsverfahren können Peptidverbindungen verwendet werden, die sowohl mittels Festphasensynthese nach Merrifield ("Angewandte Chemie", Band 97, (1985), Seiten 810 bis 812) als auch in der Flüssigphasensynthese ("Int.J.PeptideProtein Res.",25, (1985), Seiten 449 bis 474) synthetisiert werden. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können insbesondere folgende Peptide gereinigt werden: Disulfid-Verbindungen,welche gemäss einem neuen Verfahren (beschrieben in der österreichischen Patentanmeldung A 1379/88) hergestellt worden sind, das im wesentlichen dadurch gekennzeichnet ist, dass man wenigstens ein Oxydationsmittel, welches kovalent oder elektrostatisch an eine feste Phase gebunden ist und welches - SH-Gruppen zu Disulfidbrücken oxydieren vermag, in Wasser unter Rühren vorlegt, dann eine wässerige Lösung der zu oxydierenden Peptidverbindung langsam dosiert derart zugibt, dass die Konzentration des zu oxydierenden Peptids so gering ist, dass die Wahrscheinlichkeiteiner intermolekularen Reaktion der Peptidmolekülevernachlässigbar klein ist, und die Reaktionsteilnehmer miteinander unter intensivem Rühren reagieren lässt, und anschliessend die rohe, eine Disulfidbrücke aufweisende Peptidverbindung aufarbeitet. Es können aber auch mit dem erfindungsgemässen Verfahren Peptide gereinigt werden wie Terlipressin der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH21CIS-Pressin der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-He2, Hamburg er-Peptid der Formel Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, Vasopressin und deren Derivate, Calcitonin, Somatostatin und Insulin. Es ist bevorzugt, mit dem erfindungsgemässen Verfahren Terlipressin zu reinigen, das mit dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigte Terlipressin ist extrem sauber und hat andere Charakteristiken als ein im Handel erhältliches, herkömmliches Terlipressin, was auf das Fehlen von Verunreinigungen zurückzuführen ist. Entsprechende Strukturformeln sind beschrieben in: "Handbook of Biochemistry" C-164 bis C-188 - Amino Acid Sequences of Proteins, C-265 (Handbook of Biochemistry selected date for MolecularBiology, 2nd ed tion (1970), Editor: Herbert A.SOBER, PhD, Published by: The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 44 128), und"Int.J.PeptideProtein Res.", 15, (1980),Seiten 342 bis 354. Die - nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern. Beispiel 1: Terlipressin10 g Terlipressin (Rohpeptid) der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys,-Pro-Lys-Gly-NH2,gelöst in 750 ml destilliertem Wasser, wurdemittels einer IdPLC-Anla3eder Firma Labomatic AG auf eine 45 x 880 mm Säule unter einem Druck von 15 bar aufgetragen. Packung: Reversephasematerial C18-60. Das Peptid wurde dann mit einem Fliessmittelgemisch von 26 %Methanol und 74 ,00,1 M Triethylammoniumphosphat (TEAP) pH 2,45, 0,4% DMSO und 0,05% EDTA mit einem Durchfluss von 60 ml/Min. eluiert und fraktioniert. Die Detektion des Peptides erfolgte bei 210 nm im Durchfluss. Das Peptid wurde dann mittels HPLC-Analyse in den Fraktionen nachgewiesen und die entsprechenden Fraktionen nach Zusammenschütten nach bekannten Methoden auf einem Ionenaustauscher entsalzt und lyophilisiert. Die Reinheit des somit erhaltenen Peptides wurde mittels HPLC-, Aminosäuren- und Sequenzanalyse bestimmt. Ausbeute: 83%,Reinheit 99,8%'. Die analytische HPLC wurde wie folgt durchgeführt:Säulengrössg: 4,6 mm x 250 mmStationäre Phase: Spherisorb ODS II, 5 Mobile Phase: 74% 0,1 molares Triethynolamminiumphosphat, pH 2,25, 26,MethanolTemperatur: 200CDruck: 148 barFluss: 1,5 ml/MinuteDetektion: 210 nmIn Fig.1 ist das entsprechende Chromatogramm abgebildet. Die Ordinate entspricht der optischen Dichte bei 210 nm, und die Abszisse entspricht der Retentionszeit in Minuten. Beispiel 2: CIS-PressinEs wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 vorgegangen, jedoch mit folgenden Abweichungen:Säule: 52 x 480 mmPackung: Reversephasematerial C18-20-100Fliessmittel: 18% Acetonitril / 82% 0,12 M TEAP pH 2,9 0,52/oDMF, 0,05% NTADurchfluss: 18 ml/min.Druck: 20 barDetektion: 232 nmProbemenge: 5 g gelöst in 200 ml dest. WasserAusbeute: 78% reinheit: 99,5%Beispiel 3: Asp-Ser-Asp-Pro-AroHamburger PeptidEs wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 vorgegangen, jedoch ist keine Entsalzunc nötig, sondern eine direkte Lyophilisation der gesammelten Fraktionen. WeitereAbweichungen waren: Säule: 37 x 1083 mm Packung: Reversephasematerial C18-30-60 Fliessmittel: 10% Methanol / 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in dest.Wasser, 0,3% NMP, 0,045% EDTA Druck: 17 barDurchfluss: 25 mifMin. Detektion: 210 nm, Probemenge: - 3 g gelöst in 70 ml dest.Wasser Ausbeute: 85% Reinheit: 99,7%
    权利要求:
    Claims
    Patentansprüche:1. Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruckflüssigkeitschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass man - das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die "reversed-phase- silica "-Material ,d.h.
    alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure mit einer Korngrösse von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengrösse von 60 bis 300 Angström als stationäre Phase enthält, - dann bei einem Druckvon 0 bis 40 bar mit einer mobilen Phase, bestehend aus (a) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen LikrasmittelundWasser, oder (b) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, oder (c) einer rein wässerigen Pufferlösung mit einem pH-Bereich von2 bis 10, wobei in allen drei obigen Fällen (a) bis (c) zusätzlich noch wenigstens ein Chelierungsmittel in geringer Konzentration und wenigstens eine stark polare organische Verbindung in geringer Konzentration vorhanden sein müssen, entweder isokratischoder mit einem Gradienten eluiert,
    und so - das Gemisch auftrennt, und - das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktioniert.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase eine Korngrössevon 20 bis 60 Mikrometer hat.
    3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase eine Porengrösse von 100 Angström hat.
    4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das "reversed-phase-silica"-Materialhauptsächlich irreguläre Silikat-Partikel mit einer Kettenlänge von C3 bis C18, insbesondere C8 oder C18, enthält.
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Chelierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe der Aminocarbonsäuren, vorzuosweiseEthylendiamintetraessigsäure (EDTA), und der Nitrilocarbonsäuren, vorzugsweise Nitrilotriessigsäure (NTA).
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die stark polare organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hexamethylenphosphortriamid, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) und N-Methylpyrrolidon (NMP).
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass das Chelierungsmittel in einer Menge von 0,01 bsi 0,1 Vol,-%, insbesondere 0,05 Vol, -% bezogen auf das Gesamtvolumen der mobilen Phase, vorhanden ist.
    8. Verfahrennach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurchgekenzxeichnet, dass die stark polare organische Verbindung in einer Mange von 0,05 bis 1 Vol.-%, inshesondere 0,5 Vol.-%, bezogen auf das Geaamtvolumen der mobilen Phase, vorhanden ist.
    9. Verfahren nach einem der Ansporüche 1 bis 8, dadurchgekennzeichnet, dass das zu raieigs Peptideine Konzentration von 1 bis 100mg, insbesondere von 1 bis 10 mg, Peptid pro ml Lösung aufweist.
    10. Verfahren nach einem der Ansrüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,dass das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetonitril, Ethanol, Methanol, Trifluoressigsäure und Methylenchlorid.
    11.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man das zu reinigende Rohpeptid, welches vorzugsweise als wässerige Lösung oder als wässerig/alkoholische Lösung vorliegt, mit einer Pumpe auf die Chromatographiesäule aufträgt.
    12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet,dass man bei einem Druckvon 12 bis 15 bar eluiert.
    13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einer Temperatur von 4 bis 80 C, insbesondere bei Raumtemperatur, vorzugsweise von 20 bis 25 C, arbeitet.
    14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Terlipressin der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-Nh2, CIS-Pressin der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2, Hamburger Peptid der Formel Asp-Ser-Pro-Arg, Vasopressin und deren Derivate, Calcitonin, Somatostatin, und Insulin reinigt.
    15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Gradient konkav, konvex oder linear ist, und eine Veränderung der Fliessmittelzusammensetzung und/oder eine Veränderung der Ionenstärke und/oder eine Veränderung des pH-Wertes umfasst.
    16. Peptidverbindung, insbesondere Terlipressin, vorzugsweise Terlipressin der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tys-Phe-Gln-Asn-CyS-Pro-Lys-Gly-NG2, gereinigt gemäss dem Verfahren nacheinem der Ansprüche1 bis 15.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-02-23| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1989-02-23| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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