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    公开号:WO1988010302A1
    申请号:PCT/JP1988/000595
    申请日:1988-06-17
    公开日:1988-12-29
    发明作者:Satoshi Nakamura；Yataro Ichikawa；Koki Horikoshi
    申请人:Teijin Limited；Rikagaku Kenkyusho；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 新規プラ ス ミ ド、 微生物細胞、 抗腫瘍活性ポ リ ぺプチ ドの製造方法及び分泌された抗腫瘍活性ポ リぺプチ ド 技術分野
    [0002] 本発明は抗艟瘍活性ポ リペプチ ドをコー ドする D N A領域' を舍む新規組換えブラス ミ ド、 該プラス ミ ドにより形質転換 された新規組換え微生物細胞、 該微生物を用いた抗腫瘍活性 ポ リ ぺプチ ドの菌体外分泌による製造方法及び分泌された抗 腫瘍活性ポ リ ベプチ ドに関する。 ，
    [0003] 本明細書において、 アミ ノ酸、 ポ リ ペプチ ドは IUPAC—IUB 生化学委員会 （C BN) で採用された方法により略記するも のとし、 たとえば下記の略号を用いる。
    [0004] A 1 a Lーァ ラ ニ ン
    [0005] A r g L—アルギニ ン
    [0006] A s n L— ァ ス ノ、。ラギン
    [0007] A s p L—ァスパラギン酸
    [0008] C y s L一 システィ ン
    [0009] G i n L—グルタ ミ ン
    [0010] G 1 u L—グルタ ミ ン酸
    [0011] G 1 y グ リ シ ン
    [0012] H i s L— ヒスチジ ン
    [0013] l i e L—イ ソ ロ イ シ ン
    [0014] L e u L一 口 イ シ ン L y s L一 リ ジン
    [0015] M e t L一メ チォニン
    [0016] P h e L一フ エ ニルァラニン
    [0017] P r o L—プロ リ ン
    [0018] .S e r Lーセ リ ン
    [0019] T h r Lース レオニン
    [0020] T r p L— ト リ プ ト フ ァ ン
    [0021] T y r Lーチロシン
    [0022] V 1 L—バ リ ン
    [0023] また、 DN Aの配列はそれを構成する各デォキシリボヌク レオチ ドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、 たとえ ば下記の略号を用いる。
    [0024] A アデニン （デォキシアデ二ル酸を示す。 ）
    [0025] C シ ト シン （デォキシシチジル酸を示す p )
    [0026] G グァニン （デォキングァニル酸を示す。 ）
    [0027] T チミ ン （デォキシチミ ジル酸を示す。 ）
    [0028] さらに、 （H2N)—及び一（C00H)はそれぞれァミ ノ酸配列の ァミ ノ末端側及びカルボキシ末端側を示すものであり、
    [0029] ( 5 ' ) —及び一 （3 ' ) はそれぞれ D N A配列の 5 ' 未端側及び 3' 末端側を示すものである。 背景技術
    [0030] し arswel 1り ま、 Bacillus Calmette-Guer in (BCG) などで gij もって刺激をうけたマウスにエ ン ド トキシ ンを投与した後に 採収した血清中に、 移植した Meth A肉腫による癌を出血壊死 させる物質が含まれていることを見出し、 この物質を腫瘍壊 死因子（Tumor Necrosis Factor. 以下 T N Fと略記すること もある） と名づけた 〔E. A. Carswellら、 Proc. Nat 1. Acad. Sc i.
    [0031] USA, 72, 3666 (1975) 〕 。 この T N Fはマウス、 ゥサギ、 ヒ ト等多くの動物中に見られ、 腫瘍細胞に特異的に、 しかも 種を越えて働く ことから、 制癌剤と しての利用が期待されて きた。
    [0032] 最近になって、 Pennicaらは、 ヒ ト T N Fの cDNAク ロー二 ングを行ない、 ヒ ト TN F蛋白質の一次構造を明らかにする と共に、 大腸菌におけるヒ ト T N F遺伝子の発現について報 告した 〔 D. Pennicaら、 Nature, 312, 724 (1984) 〕 。 その 後、 白井ら [T. Shiraiら、 Nature, 313^ 803 (1985) 〕 、 宗 村ら 〔宗村ら、 癌と化学療法、 1^， 160 (1985)〕 、 Wangら 〔A. M. Wangら、 Science, 228, 149 (1985)〕 及び Marmenout ら 〔 A. Marmenoutら、 Eur. J. B i ochem. , 152, 515 (1985) 〕 が intact及びァ ミ ノ末端 2 ァ ミ ノ酸欠失ヒ ト T N F遺伝子の 大腸菌における発現について相ついで報告している。
    [0033] このように遺伝子操作技術を用いることによって、 大腸菌 菌体内生産による純粋な intactヒ ト T N F及びア ミ ノ末端 2 ァミ ノ酸欠失 T N F蛋白質が多量に入手できるようになって 臨床始験に供されたが、 Native TNFから期待されたような効 果が発現しなかった 〔原中、 BIO medica, _3_, 343 (1988) 〕 , 一方、 最近の遺伝子操作技術の発達により、 種々の有用蛋 白質の微生物等を用いた大量生産が可能になったが、 大腸菌 での生産が最も重用されている。 この場合、 通常、 有用蛋白 質は菌体内に蓄積され、 蛋白質の性状において大きな欠点を 有している場合がある。
    [0034] 即ち、 従来、 蛋白質を菌体内に蓄積させることが検討され ているものに、 イ ンターフ ェ ロ ン一 r (INF— r ) 、 イ ンター ロイキ ン 2 '( I L 2 ) 、 ヒ ト成長ホルモン等があるが、 I 一 rの場合は、 菌体内で蓄積させると inclusion bodyができ てしまうため活性が発現しないことがある。 I L 2の場合は S— S結合のかけ違い等が発生して活性が出ないことがある。 またヒ ト成長ホルモンの場合は、 ァミ ノ末端の M e tが残る 場合があったりする。
    [0035] ところが、 T N Fを菌体内で蓄積させた場合には inclusion bodyの形成は見られず、 S— S結合のかけ違いもおこらず、 さらに特にァミ ノ末端の 2ァミ ノ酸欠失体などでは M e tの processing力、 ιΕしくおこってレヽる CM. Yamada ζ> ^ J， Biotechnひ Ι· _, 141, (1985) 〕 にもかかわらず、 上述のように 〔原中、 ΒΙ0 medica, 3 , 343 (1988)] 、 in vivo での効果が Native TNFよ り も低く、 従来の蛋白質の挙動と大きく異なる様相を示して いる。
    [0036] そこで本発明者は、 抗腫瘍活性を有するポ リぺプチ ドの菌 体内生産と菌体外分泌に闋する研究.を進めた結果、 驚くべき ことには、 抗腫瘍活性を有するポ リぺプチ ドを菌体外に分泌 させることにより、 理由は不明な点もあるが、 その活性が大 き く向上することを見出した。
    [0037] 本発明の目的は、 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドを大腸菌等で生 産するに当り、 菌体外に分泌させて活性の高められた形態で 生産することにあり、 しかして抗腫瘍活性ポ リペプチ ドをコ ― ドする D N A配列を含む菌体外分泌を可能とする D N A領 域及びその領域が組み込まれた新規組換えプラ ス ミ ドを提供
    [0038] ~ る しとに δる o
    [0039] 本発明の他の目的は、 上記新規組換えブラス ミ ドによって 形質転換され、 目的とする抗腫瘍活性ポ リペプチ ドを、 菌体 外に産生し得る新規組換え微生物細胞を提供することにある c 本発明の更に他の目的は、 該微生物細胞を用いて抗腫瘍活性 ポ リ ぺプチ ドを菌体外分泌生産させる方法を提供することに ある。 本発明の更に別の目的は、 該微生物細胞から分泌され た抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドを提供することにある。
    [0040] 本発明の更に他の目的は、 以下の説明により一層明らかに なるであろう。 発明の開示
    [0041] 本発明は、
    [0042] ( 1 ) 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドをコ一ドする D N A配列、 該 蛋白質の発現調節を行なうプロモータ一機能を有する D N A 配列、 及びシグナルべプチ ドをコー ドする D N A配列を有す る第 1の D N A領域、 及び、
    [0043] ( 2 ) 実質的に菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与え る D N A配列、 及び該 D N A配列の発現調節を行なうプロモ 一ター機能を有する D N A配列を有する第 2の D N A領域 を含むプラ ス ミ ド、 そのプラ ス ミ ドによって形質転換された 微生物細胞、 その微生物細胞を用いて抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドを菌体外分泌生産させる方法、 及びその微生物細胞から分 泌された抗腫瘍活性ポリベプチ ドに関するものである。
    [0044] 本発明における抗腫瘍活性ポリベプチ ドには、 第 1図に示 されたァミ ノ酸配列を合むポリぺプチ ド又は該ァミ ノ酸配列 においては 1又はそれ以上のァミ ノ酸残基の置換、 欠失又は 揷入がなされたァミ ノ酸配列を舍むポ リベプチ ドが含まれて おり、 従って、 ヒ ト TNF、 マウス TNF、 ゥシ TNF、 ゥ サギ T N F及びこれら TN Fの改変体も含まれる。
    [0045] またすでに報告されているところの、 第 1図記載のヒ ト TNF蛋白質において、 抗腫瘍活性を失活しないあるいは向 上させる範囲の改変、 すなわち、 ァミ ノ末端の 1 , 2 . 3 ， 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 1 0、 又は 1 1個のァミ ノ酸がそ れぞれ欠失した形の改変体、 Val1の Glu への置換、 Arg2の Glu への置換、 Ser4の Asn 又は Cysへの置換、 Ser5の Asp へ の置換、 Argsの Lys への置換、 ThrTの His 又は lie への置換、 Pro8の Ser又は Arg への置換、 Ser3の Tlir 又は Lys への置換、
    [0046] Asp13の Leu又は Arg への置換、 Lys11の欠失、 Val15の Ala への置換、 Va16の Leu への置換、 Val17の lie への置換、 Ala18の Gly, He, Ser, Thr, Val, Leu又は Pro への置換、 Pro2°の His への置換、 Ala22の Val への置換、 Gly24の Glu への置換、 Arg31の Asn への置換、 Arg32の His, Ala, Glu 又は Thr への置換、 a33の Asp への置換、 Asn34の Ar への置換、 Ala35の His, Met又は Gin への置換、 Leu36 の Phe への置換、 Ala38の Gin への置換、 Asn33の Asp への 置換、 Val41の Phe への置換、 Glu42 の Ser への置換、 Arg44 の Ser への置換、 Asp45の Asn への置換、 Gin47の Ser への 置換、 Val43の Leu への置換、 Cys63の Ala, Ser又は Leu へ の置換、 Thr72 , His73 の他のアミ ノ酸への置換 （特開昭 62 -48632号） Leu34の欠失又は Tyr への置換、 Ser35の欠失、 CysI D Iの Ala, Ser又は Leu への置換又は Gly ' 22の Ala, lie又 は Pro への置換を行つた改変体、 ァ ミ ノ末端に SerPheValGln Gly を付加した形の改変体、 ァ ミ ノ末端のァ ミ ノ酸のいくつ かがより塩基性度の高いァミ ノ酸に置き換わった形の改変体 (特開昭 62- 26226号） 、 Val1 〜Ala18 が H isSerThrLeuLys ProAlaAlaHisLeuIleGly と入れ換わった形の改変体、 Ala33 〜 Val 43 が AspArgAlaPheLeuGlnAspGlyPheSerし euSerAsnAsnSer LeuLeuと入れ換わつた形の改変体、 Val 1〜Thr 7が SerPheVal GlnGlyGluGluSerAsnAspLysIle と入れ換わつた形の改変体又 はこれらの改変体の組み合せなどのヒ ト T N F改変体も本発 明における抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドに包含される。
    [0047] さ らに菌体外分泌が効率良く行なわれるためには、 シグナ ルぺプチ ドの領域の後ろに融合させる成熟蛋白質のァ ミ ノ末 端のア ミ ノ酸が中性又は疎水性ァ ミ ノ酸であることが好ま し く、 該ア ミ ノ酸が S e rであることが最も好ま しい。 従って、 上述の各種 T N F改変体を効率よく菌体外に分泌させるため には、 第 1図記載のヒ ト T N F蛋白質においてァ ミ ノ末端の 2 ， 3又は 4個のアミ ノ酸がそれぞれ欠失した形の改変体を 基盤と して、 ァ ミ ノ末端以外の領域に対して上述のヒ ト T N F改変体における改変の範囲すなわち抗腫瘍活性を失わない あるいは向上させる範囲の改変をほどこすものが好ま しい。 抗腫瘍活性ポリぺプチ ドの発現調節を行うプロモータ一機 能を有する D N A配列及びシグナルペプチドをコードする D N A配列を有する遺伝子としては、 大腸菌 ーラクタマー ゼ遺伝子、 大腸菌アル力 リ性ホス フ ァ タ ーゼ遺伝子、 大腸菌 リポプロティ ン遺伝子、 枯草菌ぺニシ リナーゼ遺伝子、 枯草 菌プロテアーゼ遺伝子、 酵母 α因子遺伝子、 好アルカリ性バ チルス NOL 170 株ぺニシ リ ナーゼ遺伝子、 好アル力 リ性ヱァロ モナス （Aeromonas) Να212 株キシラナーゼ遺伝子、 好アル力 リ性バチルス Νοι Ν— 4株セルラーゼ遺伝子、 好アルカ リ性バ チルス Na ll39株セルラーゼ遺伝子等があげられるが、 好まし くは好アル力 リ性バチルス Να ΠΟ 株ぺニシリナーゼ遺伝子が 用いられる。 前記の各遺伝子內のプロモーター配列は、 各々 独立して他の各遺伝子のシグナルべプチ ド配列と組合せるこ ともできる。 適当なプロモーター配列、 適当なシグナルぺプ チ ド配列及び抗腫瘍活性ポ リぺプチドをコ一ドする D N Α配 列が、 この順序に連結された形が好適である。
    [0048] 実際的に菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与える D N A配列としては、 第 1 0図記載のァミ ノ酸配列をコ一ド する D N A配列が好適である。 これには PMB9プラス ミ ド由来 の 遺伝子挙げられるが同じ蛋白質をコードするもので あればそれ以外のものも使用可能である。
    [0049] 実際的に菌钵外分泌を促進する作用を宿主細胞に与え る D N A配列の発現調節を行うプロモータ ー機能を有する D N A配歹 Ifとしては、 ト リプト フ ァ ン · オペロ ン · プロモー タ ー （ t r p プロモータ ー） 、 ラ ク ト 一ス - 才ペロ ン - プロ モーター （ l a c プロモーター） 、 t a c プロモーター、 P L プロモータ ー、 1 p pプロモーター、 好アルカ リ性バチ ルス NOL 170 株染色体由来の E Xプロモーター等があげられる が、 なかでも宿主の対数増殖後期で機能する性質を有する好 アル力 リバチルス Να 170 株染色体 D Ν Α由来の Ε Xプロモー タ一がとりわけ好ま しい。
    [0050] 本発明におけるプラス ミ ドは抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの発 現耷行う D N A領域及び钱抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの菌体外 分泌作用を行う D N A領域とからなる。
    [0051] 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの発現を行う D N A領域は、 抗腫 瘍活性ポ リぺプチ ドの発現調節を行う適当なプ πモータ一配 列、 適当なシグナルぺプチ ド配列及び抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドをコー ドする D N A配列がこの順序に連結された形のブラ ス ミ ドが最も好ま しい。 また適当なシグナルペプチ ド配列と 抗腫瘍ポ'リペプチ ドをコー ドする D N A配列とがその読み取 りフ レームを一致させた形で連結されることが、 とりわけ好 ましい。
    [0052] 抗腫瘍活性ポ リベプチ ドの菌体外分泌作用を行う D N A領 域は前述の実質的に菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に 与える D N A配列及び該 D N A ¾/ の発現調節を行うプロモ ータ一機能を有する配列からなる。
    [0053] これらのプラス ミ ドによって形質転換された組換え微生物 から分泌される抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドは、 菌体内蓄積型プ ラ ス ミ ドによって形質転換された組換微生物細胞から取出し た抗腫瘍活性ポ リ ペプチ ドより も均一で抗腫瘍活性が高い。 これらの菌体外分泌発現型プラス ミ ドの具体例としては pBXTNP l, PEXTNF3, PEXTNF4 が挙げられる。
    [0054] これらのプラス ミ ドはシグナルペプチドとそのう しろに融 合させた抗腫瘍活性を有する成熟型のポリぺプチ ドとの切り 錐しが分泌に際して容易に行なわれ、 分泌効率の点から見て もすぐれている。
    [0055] 特に PEXTNP3 は抗腫瘍活性を有するポリペプチ ドのァミ ノ 未端が S e rであり分泌効率が特にすぐれている。
    [0056] 上記プラス ミ ドを常法により適当な宿主に導入して形質転 換された微生物を得る。 この場合の適当な宿主としてはェシ ェ リ ヒア（Escher i ch i a) 属に属する微生.物を有利に使用する ことができる。 宿主としては、 前記のェシユ リ ヒア · コ リ HB101 株、 同 C600祙（ATCC23724) 、 同 C 600r— m—株
    [0057] (ATCC33525) 、 同 χ 1776株（ATCC31244) 、 同 LE392株（ATCC 33572)等、 通常のこの種の技術分野で用いられる微生物が有 利に用いられる。 なかでも、 エシュ リ ヒア - コ リ HB101株及 び同 C600r— m—株がとりわけ好ましい。 図面の簡単な説明
    [0058] 第 1図は設計したヒ ト T N F遺伝子の塩基配列を、 第 2図 は化学合成した合成ォ リ ゴヌク レオチドの塩基配列を、 それ ぞれ示したものである。 第 3図、 第 4図及び第 5図は、 ヒ ト T N F遺伝子の一部を有するプラスミ ド pTN P lBR, pTNF2 及 び PTNF3 の作成方法を、 それぞれ示したものであり、 第 6図 はヒ ト T N F遺伝子発現型プラス ミ ド PTNP401N N の作成方法 を示したものである。 第 7図は発現ブラス ミ ドぺクタ一 PAA41 の作成方法を示したものであり、 第 8図はヒ ト T N F遺伝子 高効率発現型プラス ミ ド PTNF401Aの作成方法を示したもので め 。
    [0059] 第 9図は、 好アルカ リ性バチルス Να170 株ぺニシリナ一ゼ 遺伝子プロモータ一領域及びシグナルべプチ ド領域の D N A 塩基配列の一部と、 そねに対応するシグナルぺプチ ド領域の ァミ ノ酸配列を示したものである。 第 1 0図は、 プラス ミ ド PMB9中に存在する K i 1 遺伝子の D N A塩基配列を示したも のであり、 第 1 1図は、 好アル力 リ性バチルス No.170 株染色 体 D N A中に存在する E Xプロモータ一領域の D N A塩基配 列を示したものである。 第 1 2図は、 プラス ミ ド D N Aの大 腸菌からの分離 · 精製方法を示したものである。 第 1 3図は、 好アル力 リ性バチルス No.170 ぺニシ リ ナーゼ遺伝子のク 口一 ン化の方法を示したものである。 第 1 4図、 第 1 5図及び第 1 6図は、 菌体外分泌生産に関与する情報を担う D N Α領域 を含むプラ ス ミ ド PBAP3, PBAP6, ρΒΑΡ7, ΡΒΑΡ7Δ Η, PBAP7A CCH, PEAP7ACH及び pEAP8 の作成方法を示したものである。 第
    [0060] 1 7図は、 ク ロ ラ ムフ エ ニコ ールァセチル ト ラ ンス フ ェ ラ 一 ゼ構造遺伝子を含むプラ ス ミ ド PCM71 の作成方法を示したも のである。 第 1 8図及び第 1 9図は、 ベニシ リナーゼ遺伝子 プロモータ一領域 · シグナルぺプチ ド領域を舍むプラ ス ミ ド pPSl, pPSIA H 及び P329PSの作成方法を示したものである。
    [0061] 第 2 0図は、 抗腫瘍活性ポ リ ベプチ ド遺伝子菌体外分泌発 現型プラ ス ミ ド pEXTNFl の作成方法を示したものであり、 第 2 1図は培養上清中に含まれる抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの活 性測定結果を示したものである。 第 2 2図及び第 2 3図は、 抗腫瘍活性ポ リベプチ ド遺伝子菌体外分泌癸現型プラス ミ ド PEXTNF3 及び PEXTNF4 の作成方法を、 それぞれ示したもので あり、 第 2 4図は培養上清中に含まれる抗腫瘍活性ポリぺプ チ ドの活性測定結果を示したものである。
    [0062] 第 2 5図は抗腫瘍活性ポ リぺプチドの分泌をゥエスタ ンブ 口 ッ ト法によって確認した結果を示すものである。 第 2 6図 は抗腫瘍ポ リぺプチドを投与する前及び投与した後の担癌マ ウスを示すものである。 第 2 7図 担痛マウスに抗腫瘍活性 ポ リぺプチ ドを投与した際の相対腫瘍重量の経時変化を示す グラフである。
    [0063] 発明を実施するための最良の形態
    [0064] 《抗腫瘍活性ポ リペプチ ド遺伝子のクローン化》
    [0065] ヒ ト T N F遺伝子は、 ヒ ト T N F蛋白質を構成するァミ ノ 酸 〔 D. Penn icaら、 前出〕 を指定するいくつかのコ ドンの中 から適当なものを選び、 それを化学合成することによって取 得できる。 ヒ ト T N F遺伝子の設計に際しては、 用いる宿主 細胞に最も適したコ ドンを選択することが望ましく、 後にク ^ 一ン化及び遺伝子改変を容易に行なえるように適当な位置 に適当な制限酵素による切断部位を設けることが望ましい。 また、 ヒ ト T N F蛋白質をコードする D N Α配列は、 その上 流に読みとりフ レームを一致させた形での翻訳開始コ ド ン ( A T G ) を有することが好ま しく、 その下流方向に読みと りフ レームを一致させた形での翻訳終止コ ドン（TGA , TAG ま たは TAA)を有することが好ま しい。 上記翻訳終止コ ドンは、 発現効率の向上を目的と して、 2つ以上タ ンデムに連結する ことがとりわけ好ま しい。 さ らに、 このヒ ト TN F遺伝子は その上流及び下流に作用する制限酵素の切断部位を用いるこ とにより、 適当なベク ターへのクローン化が可能になる。 こ のようなヒ ト TN F遺伝子の塩基配列の例を、 第 1図に示し o
    [0066] 上記のように設計したヒ ト T N F遺伝子の取得は、 上側の 鎖、 下側の鎖のそれぞれについて、 たとえば第 2図に示した ような何本かのォ リ ゴヌク レオチ ドに分けて、 それらを化学 合成し、 各々のオ リ ゴヌク レオチ ドを連結する方法をとるの が望ま しい。 各オ リ ゴヌ ク レオチ ドの合成法と してはジエス テル法 C H. G. Khorana, Some Recent Developments in
    [0067] Chemistry of Phosphate Esters of Biological Interest", John Wiley and Sons, Inc. , New York (1961) 、 ト リ エス テル法 〔 R. L. Letsingerら、 J. Am. Chem. Soc. , 89, 4801 (1967)] 〕 及びホスフアイ ト法 〔 M. D. Matteucciら、 Tetrahedron Lett. , 21, 719 (1980)〕 があるが、 合成時間、 収率, 操作の簡便さ等の点から、 全自動 D N Α合成機を用いたホス フアイ ト法による合成が好ま しい。 合成したォ リ ゴヌク レオ チ ドの精製は、 ゲル濾過、 ィォン交換ク口マ トグラフィ ー、 ゲル電気泳動、 逆相力 ラムによる高速液体ク 口マ トグラ フィ 一等を、 適宜単独も しく は組合せて用いることができる。
    [0068] こう して得られた合成オ リ ゴヌク レオチ ドの 5 ' 未端側の 水酸基を、 たとえば T 4—ポリヌクレオチ ドキナーゼを用い てリ ン酸化した後、 アニー リ ングさせ、 たとえば Τ4一 DNA リ ガーゼを用いて連結する。 合成ォ リゴヌク レオチドを連結し てヒ ト TN F遺伝子を作成する方法としては、 合成ォ リゴヌ クレオチ ドをいくつかのブロッ クに分けて連結し、 たとえば PB 322 C F.Bolivarら、 Gene, 2， 95 (1977) 〕 のようなべ クタ一に一度クローン化した後、 それらの各ブロ ックの D N A断片を連結する方法が好ましい。 このようなヒ ト TN F遺 伝子を構成するプロ ッ クの DN A断片を含むプラス ミ ドとし て、 好ましく は pTNFIB PT F2 または PTNF3 が用いられる。
    [0069] 上記のようにしてクローン化したヒ ト T N F遺伝子を構成 する各ブロ ッ クの D NA断片を連結した後、 適当なプロモー ター、 S D (シャ イ ン · ダルガーノ） 配列の下流につなぐこ とにより、 発現型遺伝子とすることができる。 使用可能なプ 口モーターとして、 ト リプト フ ア ン ' オペロ ン · プロモータ 一 （ t r pプロモーター） 、 ラク トース * オペロ ン ♦ プロモ 一ター ( l a cプロモーター) 、 t a cプロモータ一、 P L プロモーター、 1 p pプロモーター等があげられるが、 とり わけ t r pプロモータ一が好適である。 t r pプロモーター を有するブラス ミ ドとして、 好ましく は pYS31N、 又は l が用いられる。 さ らに、 発現効率向上を目的として、 ヒ ト TN F遺伝子下流に大腸菌で効率良く機能するターミ ネータ 一を付与することができる。 このようなターミ ネータ一とし て、 Ι ρ ρターミ ネータ一、 t r pターミ ネータ一等があげ られるが、 とりわけ trpAターミネータ一が好適であり、 trpA ターミ ネータ一を有するブラス ミ ドと して、 好ま しく は PAA41 が用いられる。 この発現型ヒ ト T N F遺伝子を、 たとえば PB R322由来のべクターにクロ一ン化することにより、 発現型 プラス ミ ドが作成できる。 ヒ ト T N F遺伝子発現型ブラス ミ ドとして、 好ま しく は pTNF 01NN又は PTNF401Aが用いられる。 こう して得られたヒ ト T N F遺伝子発現型ブラス ミ ドを適 当な制限酵素で切断し、 ヒ ト T N F遺伝子内の特定な領域を 除去した後、 適当な塩基配列を有する合成ォ リ ゴヌク レオチ ドを用いた遺伝子の修復を行なう。 かかる手法を用いること により、 ヒ ト T N F蛋白質中の 1又はそれ以上の任意のア ミ ノ酸を他のァミ ノ酸に置換したり、 付加したり、 また欠失さ せた形の抗腫瘍活性ポ リペプチ ドをコ一 ドする D N A領域を 含むプラ ス ミ ドの作成が可能になる。
    [0070] 《好アル力 リ性バチルス No.170 株ぺニシ リ ナーゼ遺伝子のク ローン化》
    [0071] ぺニシリナーゼ生産能を有する好アル力 リ性バチルス Να 170 株（PERM B P— 467)を適当な条件下、 たとえば 3 0 で振とう 培養し、 得られた菌体を遠心分離によって集める。 この菌体 から、 公知の方法、 たとえばフ ヱノ ール法によって D N Aを 抽出し、 染色体 D N Aを得る。
    [0072] こう して得られた D N Aを、 たとえば Eco R I のような制限 酵素で部分的に切断し、 適当なプラ ス ミ ドベクター、 たとえ ば PMB9プラス ミ ドの EcoR I サイ トへの挿入を行ない、 好アル 力 リ性バチルス No.170 株染色体 D N Aを組み込んだ組換えプ ラス ミ ドを得る。 この組換えブラス ミ ドを、 たとえばェシヱ リ ヒア · コ リ HB101株（ATCC33694) に公知の方法、 たとえば CaC ^ 2 法 〔 M. V. Norgardら、 Gene, _3_, 279 (1978)〕 を用 いて導入、 アンピシ リ ン及びテ ト ラサイ ク リ ンに耐性の形質 転換株をスク リ一二ングすることにより、 好アル力 リ性バチ ルス ΝαΠΟ 株ぺニシリナーゼ遺伝子及びぺニシリナーゼの菌 体外分泌生産に闋与する情報を担う D N Α領域を有する組換 えプラス ミ ド、 たとえば pEAPlを得る。
    [0073] 得られた組換えプラスミ ドの D N A塩基配列を、 たとえば マキサム一キ レノヾ一 ト法 し A, M. Maxamら、 Methods Enzymo l. , 65, 499 (1980) ] あるいは M 13ファージを用いたジデォキシ チェーン * ターミ ネーショ ン法 〔F. Sanger, Sc ience, 214,
    [0074] 1205 (1981) ] により決定し、 ぺニシリ ナーゼ遺伝子プ モ 一ター領域、 シグナルペプチ ド領域、 成熟ペプチド領域の構 造、 さ らにべニシリナ一ゼの菌体外分泌に闋与する好アル力 リ性バチルス Nd l70 株由来の E Xプロモータ一領域及び pMB9 プラス ミ ド由来の K i 1遺伝子の構造を明らかにする。 第 9 図に、 好アルカリ性バチルス Να ΠΟ 株ぺニシリナーゼ遺伝子 プロモータ一領域 · シグナルぺプチ ド領域の D N A塩基配列 を示す。 また、 第 1 0図にプラス ミ ド PMB9由来の K i 1遺伝 子の D N A塩基配列を、 第 1 1図に好アルカ リ性バチルス No. 170 株由来の E Xプロモーター領域の D N A塩基配列を、 そ れぞれ示す。 さ らに、 シグナルペプチ ド領域及び K i 1遺伝 子については、 対応するァミ ノ酸配列も合わせて示す。
    [0075] このぺニシリナーゼ遺伝子及びぺニシリナ一ゼの菌体外分 泌生産に関与する情報を担う D N A領域を有する組換えブラ ス ミ ドを出発材料と して、 自然欠失を利用した方法、 あるい は S 1 —ヌク レアーゼ、 DN A—ポ リメ ラーゼ等の修飾酵素 や合成ォ リ ゴヌク レオチ ドを用いる人為的方法により、 好ァ ルカ リ性バチルス Να 170 株由来の Ε Xプロモータ一領域とプ ラス ミ ド ΡΜΒ9由来の K i 1 遺伝子から成る菌体外分泌生産に 関与する情報を担う D N A領域全域、 及びぺニシリナーゼ遺 伝子の全域あるいは一部を含む、 組換えプラス ミ ドが得られ る。 このようなプラス ミ ドと して、 好ま しく は pEAP3， PBAP6, ΡΒΑΡ7, ΡΕΑΡ7ΔΗ, PBAP7ACCH, pBAP7ACH, ρΕΑΡδ が用いら れる。
    [0076] また、 上述のベニシ リナーゼ遺伝子及びぺニシ リナーゼの 菌体外分泌生産に関与する情報を担う D Ν Α領域を有する組 換えプラス ミ ドを、 適当な制限酵素で切断し、 ぺニシリ ナー ゼ遺伝子プロモータ一領域及びシグナルべプチ ド領域を含む DN A断片を得る。 この DN A断片を、 必要なら適当な合成 オ リ ゴヌク レオチ ド · リ ンカ一を介して、 適当なプラス ミ ド ベクター、 たとえば pCMl [T. J. Close と R. Rodr iguez, Gene, 20, 305 (1982)〕 と PCM7 CT. J. Close と R. Rodr i guez， Gene, 20, 305 (1982)] とのハイ ブリ ッ ド · プラス ミ ド PCM71 にク ローン化し、 ぺニシリナ一ゼ遺伝子プロモータ一領域及びシ グナルペプチ ド領域を有するプラス ミ ドが得られる。 ぺニシ リナーゼ遺伝子プロモータ一領域及びシグナルペプチ ド領域 を有するプラス ミ ドと して、 好ま しく は PPS1， PPSIA H, P329PSが用いられる。 《抗腫瘍活性ポ リペプチド遺伝子分泌発現型プラ ス ミ ドの作 成〉
    [0077] 前に得られた抗腫瘍活性ポ リぺプチドをコ一ドする D N A 領域を含むプラスミ ドを、 適当な制限酵素で切断することに より、 抗腫瘍活性ポ リペプチ ドをコードする D N A領域を舍 む D N A断片を得る。
    [0078] 次にこの D N A断片を、 適当なプロモーター領域及びシグ ナルぺプチ ド領域を有するプラスミ ドに揷入することにより、 適当なプロモータ一領域及びシグナルぺプチ ド領域に抗腫瘍 活性ポ リぺプチ ドをコ一 ドする D N A領域が連結した形のプ ラ ス ミ ドが得ら,れる。 このようなプロモータ一領域 · シグナ ルぺプチ ド領域を有する遺伝子としては、 大腸菌 —ラクタ マ ーゼ遺伝子、 大腸菌アル力 リ性ホスファターゼ遺伝子、 大 腸菌リ ポプロティ ン遺伝子、 枯草菌ぺニシリナ一ゼ遺伝子、 枯草菌プロテア一ゼ遺伝子、 酵母 因子遺伝子、 好アル力 リ 性バチルス No.170 株ぺニシリナーゼ遺伝子、 好アル力 リ性ェ 了 nモナス （Aer omonas) No, 212 株キシラナーゼ遺伝子、 好ァ ルカ リ性バチルス Nd N— 4株セルラ ーゼ遺伝子、 好アル力 リ 性バチルス No.1139株セルラーゼ遺伝子等があげられるが、 好 ましく は好アル力 リ性バチルス Na l7Q 株ぺニシリナーゼ遺伝 子が用いられる。 前記の各遺伝子内のプロモータ一領域は、 各々独立して他の各遺伝子のシグナルべプチ ド領域と組合せ ることもできる。 適当なプロモータ一領域、 適当なシグナル ぺプチ ド領域及び抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドをコ一 ドする D N A領域が、 この順序に連結された形のプラスミ ドが最も好ま しく、 各種酵素類あるいは合成ォ リ ゴヌ ク レオチ ドを用いる 方法により、 適当なシグナルぺプチ ド領域と抗腫瘍活性ポ リ ぺプチ ドをコ一ドする D N A領域とがその読み取り プ レー — を一致させた形で連結されることが、 とりわけ好ましい。
    [0079] さ らに前記の各種プラス ミ ドを組み合わせることにより、 適当なプロモータ ー領域、 シグナルぺプチ ド領域下流に抗腫 瘍活性ポ リペプチ ドをコー ドする D N A領域を連結した D N A領域、 及び好アル力 リ性バチルス Νοι 170 株由来の Ε Xプロ モータ一領域と ΡΜΒ9ブラス ミ ド由来の K i 1 遺伝子から成る 菌体外分泌生産に闋与する情報を担う D N A領域とを合わせ 持つようなブラス ミ ドが得られる。 なお、 この際に、 抗腫瘍 活性ポ リペプチ ドをコー ドする D N A領域を含む D N A断片 を、 適当なプロモータ一領域 · シグナルべプチ ド領域及び菌 体外分泌生産に関与する情報を担う D N A領域を合わせ持つ ようなブラス ミ ドに直接挿入すれば、 上記のブラス ミ ドが、 より簡便に得られる。 このプラス ミ ドを用いることにより、 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの菌体外分泌が可能になる。 このよ うな菌体外分泌発現型ブラス ミ ドとして、 好ま しく は P E XT N F I , PEXTNF3 又は PEXTNF4 が用いられる。
    [0080] なお、 本発明において適当なプロモーター領域、 シグナル ぺプチ ド領域、 抗腫瘍活性ポ リペプチ ドをコー ドする D N A 領域、 E X プロモーター領域及び K i 1 遺伝子は、 これらと 生物学的機能において同等な D N A領域、 すなわち該 D N A 領域に对してヌ ク レオチ ドの置換、 ヌ ク レオチ ドの欠失、 ヌ ク レオチ ドの挿入及びヌク レオチ ド配列の逆位その他の突然 リぺプチ ドを生産させることができる。 このような宿主とし てはェシエ リ ヒア（Escherichia) 属に属する微生物を有利に 使用することができる。 宿主としては、 前記のェシヱ リ ヒア · コ リ HB101株、 同 C600株（ATCC23724) 、 同 C600r— m—株 (ATCC-33525) 、 同 z 1776株（iTCC31244) 、 同 LE392株（ATCC 33572)等、 通常のこの種の技術分野で用いられる微生物が有 利に用いられる。 なかでも、 ェシヱ リ ヒア * コ リ HB101株及 び同 C600r— m—株がとりわけ好ましい。
    [0081] このようにして得られた組換え微生物を、 それ自体は公知 の方法で培養する。 培地としては、 抗腫瘍活性ボリペプチ ド の生産に適した培地であって、 かつ宿主微生物の生育に適し た培地を甩ぃ得るが、 たとえば M 9培地 〔T. Maniatisら編、 Molecular Clonin P440 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1982)] 、 L B培地 〔T. Maniatisら編、 Molecular Cloning P440 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York
    [0082] 1982) 〕 、 B P B培地（Difco製） 、 Nutrient寒天培地等を基 本培地として調製したものを用いればよい。 その他、 必要に 応じて、 炭素源、 窒素源の他にァミ ノ酸、 ビタ ミ ン等の栄養 素を添加してもよいし、 発現型プラス ミ ドの宿主内安定化の ために適当量の抗生物質等を添加してもよい。
    [0083] 培養は、 PH、 温度、 酸素供給量を目的の組換え微生物に適 した条件で行なう。 菌体外分泌発現型プラス ミ ドを有する組 換え微生物の培養においては、 該微生物が生育してその菌体 量が最大に達したとき、 即ち对数増殖後期から培地中に抗腫 瘍活性ポ リペプチ ドが生成、 蓄積するまでの時間中、 同一培 地で培養をそのまま继続するのがよい。 たとえばェシェ リ ヒ ァ属の微生物の前記菌体量が最大に達したときから培地中に 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの生成、 蓄積が停止するまでの時間 は、 ほぼ 12〜48時間の範囲である。 なお、 PH条件は特に影響 されないが、 PH 5〜 8の範囲、 特に PH 7. 2が適当である。 《抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの活性評価〉
    [0084] 菌体外分泌発現型プラス ミ ドを有する組換え微生物を培養 した後、 例えば遠心分離により微生物を除去する。 得られた た抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドを含有する培養上清について、 直 接あるいは常法による濃縮操作によつて濃縮した後、 活性の 評価を行なう。 活性の評価は、 マウスに移植した MethA肉腫 を壊死させる効果を見る in vivo 活性測定法 （Carswellら、 前出） 、 マウス L細胞に対する細胞障害性を見る in vitro活 性測定法 〔Ruff， J. Immunol., 126^ 235 (1981) 〕 等により 行なう ことができる。
    [0085] 《抗腫瘍活性ポ リ ぺプチ ドの分離 · 精製》
    [0086] 菌体外分泌発現型プラス ミ ドを有する組換え微生物培養上 清からの抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの分離 · 精製は、 公知の通 常知られている蛋白質の分離 · 精製法に従えばよいが、 抗腫 瘍活性ポ リベプチ ドに対する抗体を用いたァフィ ニティ ー · カ ラ ム · クロマ ト グラフィ 一が有利である。 なかでも、 抗腫 瘍活性ポ リぺプチ ドに対するマウス · モノ ク ローナル抗体を 用いたァフ ィ 二ティ 一 · カ ラ ム ♦ ク ロマ ト グラ フ ィ 一がと り わけ好適である。 こう して得られた抗腫瘍活性ポ リぺプチ ド ：品について、 S D S—ポ リ アク リルア ミ ド · ゲル電気泳 動 〔ϋ. K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)〕 による分子量 解析、 ァミ ノ末端のアミ ノ酸配列解析及びァミ ノ酸組成分析 を行うことにより、 シグナルべプチ ドが正しく切断された抗 腫瘍活性ポリペプチ ドの分泌が確認できる。 また、 こう して 得られたヒ ト TN F'蛋白質及び抗腫瘍活性ポリぺプチ ド精製 品を用いることにより、 in yjyo 抗癌活性 (前出） に関する 検討が可能となる。
    [0087] 本発明による菌体外分泌発現型プラス ミ ド特には pEXTNFl, PEXTNP3 又は PEXTNF4 なかんずく PEXTNF3によって形質転換 された組換え微生物細胞から分泌される抗腫瘍活性ポ リぺプ チ ドは、 菌体内蓄積型プラス ミ ドによって形質転換された組 換え微生物細胞から取出した抗腫瘍活性ポリぺプチ ドよりも 均一で抗腫瘍活性が高い。 実施例
    [0088] 以下、 実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが、 本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
    [0089] 実施例 1 (ヒ ト T N F遺伝子の設計）
    [0090] 第 1図に示した塩基配列のヒ ト TN F遺伝子を設計,した。 設計に際しては、 ？61111 &ら 〔 D.Pennicaら、 Nature, 312,
    [0091] 724 (1984)〕 の報告したヒ ト TN F前駆体 cDNAの構造遺伝子 部分の塩基配列を基盤として、 適当な制限酵素による切断部 位を適当な位置に設け、 5 ' 側に翻訳開始コ ドン （ATG) を、 そして 3' 側に 2個の翻訳終止コ ドン （TGA及び TA A) をそれぞれ付与した。 また、 5 ' 側翻訳開始コ ドン上流 には制限酵素 C la I による切断部位を設け、 S D配列と翻訳 開始コ ドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ一との 連結を可能にした。 更に、 3 ' 側翻訳終止コ ドン下流には制 限酵素 Hind ΠΙによる切断部位を設け、 ベクター · プラ ス ミ ド と容易に連結できるようにした。
    [0092] 実施例 2 (オ リ ゴヌク レオチ ドの化学合成）
    [0093] 実施例 1で設計したヒ ト T N F遺伝子は、 第 2図に示した ように 1 7本のオ リ ゴヌク レオチ ドに分けて合成する。 ォ リ ゴヌ ク レオチ ドの合成は全自動 D N A合成機 （アプライ ド · ノ ィ ォ システムズ、 モデル 380A) を用いて、 ホス フ ア イ ト法 により行なった。 合成オ リ ゴヌ ク レオチ ドの精製は、 ァプラ ィ ド · ノ ィ ォ システムズ社のマニュ アルに準じて行なった。 すなわち、 合成オ リ ゴヌク レオチ ドを含むア ンモニア水溶液 を 5 5 °Cで一晩保つことにより、 D N A塩基の保護基をはず し、 セフアデッ ク ス G— 50フ ァ イ ン ♦ ゲル （フ ア ルマ シア） を用いたゲル濾過によつて、 高分子量の合成ォ リ ゴヌク レオ チ ド画分を分取する。 ついで、 7 M尿素を含むポ リ アク リ ル ァ ミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 2 0 %) の後、 紫外線シャ ド ウィ ング法により泳動パター ンの観察を行なう。 目的とする 大きさのバン ド部分を切出して、 そのポ リ アク リ ルアミ ドゲ ル断片を細かく破砕した後、 2〜 5 の溶出用バッ フ ァ ー 〔 500mM NH40Ac- 1 mM BDTA- 0. 1 %SDS(pH7. 5 ) 〕 を加え、 3 7 でで一晩振とう した。 遠心分離により、 目的の D N Aを 含む水相の回収を行なった。 最後に合成ォ リ ゴヌク レオチ ド を含む溶液をゲル濾過カ ラム （セフアデッ クス G— 50) にか けることにより、 合成ォ リゴヌクレオチ ドの精製品を得た。 なお、 必要に応じて、 ポリアク リ ルアミ ドゲル電気泳動を繰 り返し、 合成オ リゴヌク レオチ ドの钝度の向上をはかった。 実施例 3 (化学合成ヒ ト T N F遺伝子のク ローン化）
    [0094] 実施例 2で作成した 1 7本の合成ォ リ ゴヌク レオチ ド（TP
    [0095] — 1 〜 TNP— 17) を用いて、 ヒ ト T N F遺伝子を 3つのプロ ッ クに分けてクローン化した。
    [0096] 0. 1〜； L 0 の合成ォ リ ゴヌク レオチ ド TNF— 2 〜 TNF— 6の 5 ' 末端側を、 5〜 1 5ュニッ トの T 4 —ポ リ ヌク レオ チドキナーゼ （E. Coli &タ イ プ、 宝酒造） を用いて、 それぞ れ別々にリ ン酸化する。 リ ン酸化反応は 10〜20 の 5 0 mM Tris-HC (PH9. 5 ) , 1 0 mM MgC 2 , 5 mMジチオスレィ トール、 1 0 mM ATP水溶液中で、 3 7 でで、 3 0分間行なつ た。 反応終了後、 すべての合成才 リ ゴヌク レオチ ド水溶液を すべて混合し、 フエノ ール抽出、 エーテル抽出により T 4一 ポ リ ヌクレオチドキナーゼを失活、 除去する。 この合成オ リ ゴヌクレオチ ド混合液に、 新たに 0. 1 〜； L 0 の合成ォ リ ゴ ヌク レオチ ド TNF— 1及び TNF— 7加え、 9 0 で 5分間加 熱した後室温まで徐冷して、 アニーリ ングを行なう。 次に、 これを減圧乾固した後に、 3 0 の 6 6 mM Tris-HC^ (pH 7. 6 ) ， 6. 6 mM M C^ 2 , 1 0 mMジチオスレイ ト 一ル、 1 mM ATP永溶液に溶解させ、 300ユニッ トの T4一 DNA リガーゼ (宝酒造） を加えて、 1 1 °Cで 1 5時間連結反応を行なった t 反応終了後、 ポリアク リ ルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 % ) を行ない、 ェチジゥムブロマイ ド染色法により泳動パタ —ンの観察を行なう。 目的とする大きさ （約 220bp)のバン ド 部分を切出して、 実施例 2の方法に従ってポ リ アク リルァミ ドゲルより D N Aを回収する。
    [0097] 一方、 3wの大腸菌用プラス ミ ド PBR322 (約 4.4 Kbp) (ベ セスダ · リサーチ · ラボラ ト リ ーズ） を 3 0 の 1 O mM Tris-HC (pH7.5 ) , 6 0 raM NaC£ , 7mM MgC^ 2 水溶液 に溶解させ、 1 0ユニッ トの制限酵素 C la I (ニューイ ング ラ ン ド · バイ オラブス） を添加して、 3 7 で 1時間切断反 応を行なった。 制限酵素 C la I による切断の後、 フ エノ ール 抽出、 エーテル抽出を行ない、 エタノ ール沈澱により D N A を回収する。 この D N Aを 3 0 の 5 0 mM Tris-HC^ (PH 7.4 ) ， lOOmM NaC , 1 0 mM MgS04水溶液に溶解させ、 1 0ユニッ トの制限酵素 S al I (宝酒造） を添加して、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なった。 反応絡了後、 ァガロースゲ ル電気泳動 (ゲル濃度 0.896) を行ない、 ェチジゥムブロマ ィ ド染色法により切断パターンの観察を行なう。 プラス ミ ド PBR322の大部分を含む約 3.7 KbP の DN Aの部分に相当する バン ドを切出し、 そのァガロースゲル断片を 3倍量（volZwt) の 8 M NaC^ 04水溶液に溶解させた。 Chenらのグラスフ ィ ル ター法 〔[： · W.Chenら、 Ana 1. B i ochem. 101, 339 (1980) 〕 に より、 約 3.7 Kbp の D N A断片 （ C la I ~~ al I ) をァガ ロースゲルより回収した。
    [0098] 先に得られたヒ ト T N F遺伝子の一部を含む約 220bp の D N A断片について、 前記の方法に準じて末端のリ ン酸化反 応を行なった後、 プラス ミ ド PBR322の大部分を含む約 3.7 Kbp の DN A水溶液と混合する。 エタノ ール沈澱の後、 前記の方 法に準じて両 D N A断片の連結反応を行なつた。
    [0099] ェシエ リ ヒア · コ リ C600r— m—株の形質転換は、 通常の CaC^ 2 法（M. V. Norgardらの方法） の改良法で行なった。 す なわち、 5 ^の L培地 （ 1 %ト リ プト ン、 0.5 %酵母エキス、 0. 5 % NaC^ , PH7.2 ) にェシエ リ ヒア · コ ！； C600r-m- 株の 1 8時間培養基を接種し、 菌体を含む培養液の 600nmに おける篛度 （ODs。o)が 0.3に達するまで生育させる。 菌体 を冷たいマグネシウム ♦ ノ ッ フ ァー 〔0.1 M NaC^ , 5 m MgC 2 , 5 mM Tris-HC^ (PH7.6 . 0 ：) 〕 中で 2回洗 い 、 2 の冷したカルシウム · ノ ッファー 〔100mM CaC^ 2 , 250raM KC£ , 5 mM MgC i 2 , 5 mM Tris- HC ^ (PH7. 6 , 0 で） 〕 中に再懸濁させ、 で.2 5分間放置する。 次に菌体 をこの容量の 1 Z 1 0にカルシウム · バッ フ ァ一の中で濃縮 し、 連結後の DNA水溶液と 2 ： 1 (vol. ： vol. ) 混合する c この混合物を & 0分間、 0 で保った後、 1 «1 のし 8 &培地 ( 1 % ト リ プ ト ン、 0. 5 %酵母エキス、 1 % NaC^ , 0.08% グルコース、 pH7.2 ) を添加し、 3 7 °Cで 1時間振とう培養 する。 培養液を、 選択培地 〔アンピシリ ン （シグマ） 3 0 Ζ<π£を含むし培地プレー ト〕 に Ζプレー トの割合で接 種する。 プレー トを 3 7 で一晩培養して、 形質転換株を生 育させる。 得られたアンピシ リ ン耐性のコロニーより、 公知 の方法を用いて DN Αを調製し、 ァガロースゲル電気泳動に より、 目的のプラス ミ ド PT IBR (約 4. 0 Kbp)の取得を確認し た。 第 3図に、 プラス ミ ド PTNFIBR の作成方法を示す。 以上と同様な手法により、 合成ォ リ ゴヌク レオチ ド TNF— 8〜 TNF— 13を用いてブラス ミ ド PTNF2N (約 3. 1 Kbp)を、 合 成オ リ ゴヌク レオチ ド TNF—14〜 TNF— 17を用いてプラス ミ ド PTNF3(約 2. 4 Kbp)を、 それぞれ作成した。 第 4図及び第 5 図に、 プラス ミ ド PTNF2N及び PTNF3 の作成方法を、 それぞれ 示す。 こう して得られたヒ ト T N F遺伝子の一部を含むブラ ス ミ ド PTNFIBR, PTNF2N 及び pTNF3 の、 合成ォ リ ゴヌク レオ チ ド使用部分の塩基配列が設計通りであることは、 マキサム ギルバー ト法（A. M. Maxamら、 前出） によって確認した。
    [0100] 実施例 4 (ヒ ト T N F遺伝子発現型プラス ミ ドの作成）
    [0101] 実施例 3で得られたプラス ミ ド PTNFIBR 1 0 を、 実施例 3 と同様にして制限酵素 C la I及び S al I で切断し、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) の後、 実施例 2 の方法に準じて、 ヒ ト T N F遺伝子の一部を含む約 200bp の D N A断片 （ C la I ^ ~~ S ai l ) をポ リ アク リ ルア ミ ドゲル より回収した。
    [0102] 次に、 実施例 3で得られたプラス ミ ド PTNF2 1 0 wを 100 の 1 0 mM Tris-HC (pH7. 5 ) ， 6 0 mM NaC^ , 7 mM MgCi 2 水溶液に溶解させ、 4 0ュニッ 卜の制限酵素 P vuH (宝酒造） を添加し、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なった。 そして、 実施例 3の方法に準じて制限酵素 S al I による切断. ポ リ アク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 % ) の後、 実 施例 2の方法に準じて、 ヒ ト T N F遺伝子の一部を含む約 170bp の D N A断片 （ S al I < ~~ P vuH ) をポ リ アク リ ルァ ミ ドゲルより回収した。 また、 実施例 3で得られたプラ ス ミ ド pT 3 1 0 wも 100 Wの 1 0 mM Tris-HC^ (pH7.5 ) ， 6 0 mM aC^ , 7 mM
    [0103] MgC^ 2 水溶液に溶解させ、 4 0ュニッ トの制限酵素 P vuH 及び 4 0ュニッ トの制限酵素 Hindm (宝酒造） を添加し、 3 7でで 1時間切断反応を行なった。 そして、 ポリアク リル アミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) の後、 実施例 2の方法 に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 llObp の DNA 断片 （P vuE* ~~ ^Hindlir) をポ リアク リルァミ ドゲルより回 収した。
    [0104] —方、 大腸菌 t r pプロモータ ーを有するプラス ミ ド
    [0105] PYS31N (約 47 Kbp) (特開昭 62— 153300号に記載） 5 を、 上記と同様に制限酵素 C la I及び HindDIで切断し、 ァガロー スゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8 %) の後、 実施例 3の方法に 準じて、 プラス ミ ド PYS31Nの大部分を舍む約 47 Kbp の DN A断片 （Clal ^ ~~ -HindH) をァガロースゲルより回収した c こ う して得られた、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 220 bp、 約 170bp 及び約 llObp の 3つの DN A断片とブラス ミ ド PYS31Nの大部分を含む約 4.7 bp の DNA断片とを混合し、 ェタノ ール沈澱の後、 実施例 3の方法に準じて、 T4— DNA ij ガーゼによる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の 方法に準じてェシヱ リ ヒア - コ リ C600r— m—株に導入し、 形質転換株の中より目的のヒ ト TN F遺伝子発現型プラ ス ミ ド PTNF401NN (約 5.5 Kbp)を有するクローンを選択した。 第 6 図に、 そのプラス ミ ド PTNF401NN の作成方法を示した。
    [0106] また、 上記プラ ス ミ ド PYS31N5 を、 上記の方法に準じて 制限酵素 Ρ νιιΠで部分分解した後、 さ らに制限酵素 Hind で 切断し、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0. 8 %) の後、 実施例 3の方法に準じて、 t r pプロモータ一を含む約 2. 7 Kbp の D N A断片 〔 P νιιΠ (2) ~~ HindH] をァガロースゲ ルより回収した。
    [0107] , 次に第 7図の A記載の塩基配列を有するォ リ ゴヌク レオチ ドを、 実施例 2の方法に準じて、 合成 · 精製した。 得られた 2本の合成ォ リ ゴヌク レオチ ドそれぞれ 0. 5 について、 実 施例 3の方法に準じて、 末端のリ ン酸化を行い、 ァニ ー リ ン グの後、 先に得られた約 2. 7 Kbp の A断片 〔 P vuH (2) ^ ~~ Hindl] と混合し、 ヱタノ ール沈澱の後、，実施例 3の方 法に準じて、 T4—DNA リガーゼによる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてェシニ リ ヒ ア · コ リ C600r— m—株に導入し、 形質転換株の中より目的のプラ ス ミ ド PAA41(約 2. 7 Kbp)を有するクローンを選択した。 このよ うなブラス ミ ドは、 プラス ミ ド PYS31Nからコ ピ一数制御領域 を除去し、 t r pプロモーター下流に存在するク ローニング* サィ トの下流に大腸菌 trpAタ一 ミ ネ一タ一を付与した形の、 多コ ピー · 高効率発現べクターであり、 第 7図にその作成方 法を示した。
    [0108] このプラ ス ミ ド PAA41 2 を、 上記と同様に制限酵素 C la I 及び HindlHで切断し、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0. 8 % ) の後、 実施例 3の方法に準じて、 ブラス ミ ド PAA41 の大部分を含む約 2. 7 Kbp の D N A断片 （C la l ^ ~~ ^HindlE) をァガロースゲルより回収した。 また、 先に得られたヒ ト TN F遺伝子発現型プラ ス ミ ド PTNF401NN 5 を、 上記と同様に制限酵素 C la I及び Hindu で切断し、 ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) の後、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TNF遺伝子全域を含 む約 490bp の D N A断片 （C la I ^ ~~ -HindU) をポ リ アク リ ルア ミ ドゲルよ り回収した o
    [0109] こう して得られた、 プラ スミ ド PAA41 の大部分を含む約 2.7 Kbp の D N A断片とヒ ト T N F遺伝子全域を含む約 490bp の DNA断片とを混合し、 エタノ ール沈澱の後、 実施例 3の 方法に準じて、 T4— DM リガーゼによる連結反応を行なった。 反応 了後、 実施例 3の方法に準じて、 ェシエ リ ヒ ア · コ リ 600r— m—株に導入し、 形質転換株の中より目的のプラ ス ミ ド PT 401A (約 3.2 Kbp)を有するク口ーンを選択した。 この プラ ス ミ ドは、 ヒ ト TNF遺伝子をより-効率良く発現させる 能力を有しており、 第 8図にその作成方法を示した。
    [0110] 実施例 5 (好アル力 リ性バチルス Ndl70 株染色体 D N Aの調 ぺニシリナ一ゼを菌体外に生成、 蓄積する能力を有する好 アルカ リ 性のバチルス Νο 70 株（FBHM BP— 467)を培地 [； (g / ϋ ) ： グリ セロール 2.0、 酵母エキス 5.0、 ポ リ ペプ ト ン 5.0、 K2HP04 1.0 , gS04 · 7 H2G 0.2を NaHC03 1 0で PH9.0に調整したもの〕 中、 3 0 t:で 1 5時間振盪培養を行 ない、 対数増殖後期の菌体を集菌後、 フ ノ ール法による DN A抽出法によって染色体 DNAを抽出、 精製し、 染色体 DNA 5 mgを得た。 実施例 6 (好アル力 リ性バチルス No_170 株染色体 D N A断片 のべクタ一への挿入） 実施例 5で得られた染色体 DNA 1 0 をとり、 常法に準じ て、 制限酵素 EcoR I を加え、 3 7 t:で反応させて部分的に切 断した。 一方、 ベクターとして用いるテ ト ラサイ ク リ ン耐性 の PMB9プラス ミ ド D N A (ベセスダ · リサーチ · ラボラ ト リ —ズ） を制限酵素 EcoR I で完全に切断して 6 5 ：、 5分の熱 処理後、 前者と混合し、 実施例 3の方法に従って T4一 DNA リ ガーゼによって 1 0 t：、 2 4時間 D N A鎖の連結反応を行な い、 6 5 T：、 5分の熱処理後、 反応液に 2倍容のエタノ ール を加えて染色体 D N Aを組み込んだプラ ス ミ ド D N Aを沈澱、 採取した。
    [0111] 実施例 7 (好アル力 リ性バチルス No_170 株ぺニシ リナ一ゼ遺 伝子のク口一ン化）
    [0112] 実施例 6で得られた好アル力 リ性バチルス Να170 株染色体 D Ν Αを有するプラス ミ ドを、 通常の CaC^ 2 法（M. V. Norgard らの方法、 前記） により、 ェシエ リ ヒア · コ リ HB101株に導 入した。 これらの形質転換株の中からア ン ピシ リ ン及びテ ト ラサイ ク リ ンに耐性の株をスク リ ーニングし、 好アルカ リ性 バチルス No.170 株べニシリナ一ゼ遺伝子を有するク ロー ンを 選択した。 この菌体を培養した後第 1 2図のように処理する ことにより、 ぺニシ リナーゼ遺伝子を含む 4. 5 Kbp の挿入を 有する組換えブラス ミ ド PEAPI が得られた。 さ らに、 常法に 準じて各種制限酵素による切断を行ない、 制限酵素切断点地 図を作成した。 第 1 3図に PEAPIの制限酵素切断点地図を示 す。
    [0113] 実施例 8 (好アル力 リ性バチルス ΝαΠΟ 株染色体 DNAを有 するプラス ミ ドの DN Α塩基配列の決定） 好アル力 リ性バチルス ΝοιΠΟ 株の染色体 DNAを含むブラ ス ミ ド 'の DN A塩基配列の决定は、 M13シークェンシング · キッ ト （アマ一シャム） を用い、 M13フ ァ ージによるジデォ キ シ · チヱーン · タ ー ミ ネーショ ン法 （F. Sanger. 前出） に より行なった。 第 9図に好アルカ リ性バチルス Να170 铢ぺニ シリナーゼ遺伝子プロモータ一領域 · シグナル領域の D N A 塩基配列を、 第 1 0図にプラス ミ ド PMB9由来の K i 1遺伝子 の D N A塩基配列を、 そして第 1 1図に好アル力 リ性バチル ス ΝοιΠΟ 株染色体 DNA由来の Ε Xプロモーターの DNA塩 基配列を、 それぞれ示した。
    [0114] 実施例 9 (好アル力 リ性バチルス Να170 株染色体 DNAを有 する各種プラ ス ミ ド誘導体の作成）
    [0115] 前記実施例 7で得られたプラ ス ミ ド pEAPl を有するェシェ リ ヒア - コ リ HB101株を继代していく中で、 ぺニシリナーゼ 活性の増強（PEAPIの約 3倍） された変異体 （アンピシ リ ン耐 性、 テ ト ラサイ ク リ ン感受性） を得た。 この変異体から第 1 2図の方法によりプラス ミ ドを調製したところ、 ぺニシリ ナーゼの構造遺伝子の上流約 4 Kbp が脱落したプラス ミ ド PEAP3(約 5.8 Kbp)が得られた。 第 1 4図に PEAP3の制限酵素 切断点地図を示す。
    [0116] こう して得られた PEAP3プラ スミ ド 1 を常法に準じて制 限酵素 EcoR I と Hindnを加えて、 3 7 、 2時間反応させて 切断した。 次に常法に準じて D N Aポ リ メ ラーゼ I ラージ ♦ フラグメ ン トを加えて、 室温で 3 0分間反応させ、 D N A切 断面を平滑末端と し、 ついで、 実施例 3の方法に準じて T4一 DNA リガ—ゼによって、 室温、 2 4時間 D N A鎖の連結反応 を行い、 6 5 で、 5分間の熱処理後、 反応液に 2倍容のエタ ノ ールを加えてプラ ス ミ ド D N Aを沈澱、 採取した。 得られ たプラ ス ミ ド D N Aを実施例 Ί と同様にェシヱ リ ヒ ア · コ リ HB101株に導入形質転換し、 ア ン ピシ リ ン耐性形質転換株か ら第 1 2図の方法によりプラ ス ミ ドを分離精製し、 約 1. 0 Kbp の EcoR I ^ ~~ Hindm DNA断片の脱落したプラ ス ミ ド pEAP6(約 4.8 Kbp)を得た。 第 1 4図に PBAP6の作成方法を示した。
    [0117] 次に、 プラス ミ ド PBR329 (約 4.15Kbp) 〔 し. Covarrub iasら、 Gene, Π, 79 (1982) 3 DNA 1 0 wを、 常法に準じて制限酵 素 AccIIで切断した後、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 1. 5 %) を行ない、 エ レク ト 口エ リ ユ ー シヨ ン法 〔P. J. Greene り、 "Methods in Molecular Biology vol.7, Marce 11 Dekker, 1974, P.87〕 を用いて、 ク ロ ラ ムフ ヱニコ 一ルァセチル ト ラ ンス フ ヱ ラ ーゼ （C AT) 遺伝子を含む の D N A断片 （ 1. 3 Kbp)を回収した。 また先に得られたプラ ス ミ ド PEAP6 を常法に準じて制限酵素 Sma l で切断した後、 上 記の AccH^ ~~ ^Accnの D N A断片と混合し、 実施例 3の方 法に準じて T4一 DNA リガーゼを用いて連結した。 上記と同様 にして、 ェ シエ リ ヒ ア · コ リ HB101株に導入形質転換し、 ク 口 ラ ムフ ヱ ニコ ール及びァ ン ピシ リ ン耐性形質転換株からプ ラ ス ミ ドを分離精製し、 プラ ス ミ ド PEAP6 に C A T遺伝子が 第 1 4図において反時計まわりの向きに揷入された形のブラ ス ミ ド PEAP7(約 6. 1 Kbp)を作成した。 第 1 4図に PEAP7の作 成方法を示した。
    [0118] こう して得られたプラス ミ ド PEAP7 を常法に準じて制限酵 素 Hindfflで切断し、 常法に準じて DN Aポ リ メ ラーゼ I ラー ジ · フ ラグメ ン トにより末端を平滑化した。 実施例 3の方法 に準じて T4— DNA リガーゼを用いて自己連結反応を行ない、 上記と同様にして、 プラスミ ド PEAP7 の Hindi [サイ トを欠失 させた形のプラ ス ミ ド ΡΕΑΡ7ΔΗ (約 6.1 Kbp)を作成した。 第 1 5図に の作成方法を示す。
    [0119] さらにプラ ス ミ ド ΡΕΑΡ7ΔΗ を、 常法に準じて制限酵素 C la Iで切断し、 常法に準じて D N Aポ リメ ラーゼ I ♦ ラー ジ ， フ ラグメ ン トにより未端を平滑化する。 実施例 2の方法 に準じ T4一 DNA リガーゼを用いて連結反応を行ない、 上記と 同様にしてェシェ ヒア · コ リ HB101株に導入して形質転換 し、 クロラムフ ヱニコール耐性 · ァンピシリ ン感受性の形質 転換株からブラス ミ ドを分離精製し、 プラ ス ミ ド ΡΕΑΡ7ΔΗ 中に 2ケ所存在する C la Iサイ トを両方共欠失させた形のプ ラ ス ミ ド PEAP7ACCH (約 6. 1 Kbp)を作成した。 第 1 5図に PEAP7ACCH の作成方法を示す。
    [0120] 得られたプラス ミ ド ΡΕΑΡ7ΔΟ:Η を、 常法に準じて制限酵 素 Hincnで切断し、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8 %) の後、 ぺニシリナーゼ遺伝子 （一部欠失） を含まない約 3.8 Kbp の HincE^ ~~ HincHの DNA断片をエレク ト ロ エ リ ュ一ショ ン法より回収する。 一方、 上述のプラス ミ ド pEAP7 も同様にして制限酵素 Hi ncn切断、 ァガロースゲル電気泳動 (ゲル濃度 0. 8 %) を行ない、 ぺニシリナーゼ遺伝子を含む 約 2.3 Kbp の HincII^ ~~ inc Πの D N A断片を回収する。 こ れら 2種の D N A断片を、 実施例 3の方法に準じて T4一 DNA リガーゼを用いて連結し、 上記と同様にしてェシエ リ ヒア · コ リ HB101株に導入形質転換し、 クロラムフヱニコ ール及び アンピシリ ンに耐性の形質転換株の中からプラス ミ ドを分離 精製し、 プラス ミ ド pEAP7ACH (約 6.1 Kbp)を作成した。 第 1 5図に PEAP7ACHの作成方法を示す。
    [0121] こう して得られたブラス ミ ド PEAP7ACHを、 常法に準じて 制限酵素 Hpa Iで切断した後、 末端をリ ン酸化した S al I リ ンカ一 （宝酒造） と混合し、 実施例 3の方法に準じて T4一 DNA リガーゼを用いて連結反応を行なう。 ェタノ ール沈澱の後、 常法に準じて制限酵素 C la I及び S al Iで切断、 ァガロース ゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8 %) を行ない、 ぺニシ リナーゼ 遺伝子後半部、 E Xプロモーター領域及びベクターの大部分 を含む 4.5 Kbp の C la I ~~ ^ Sai lの DNA断片をエレク ト 口エ リ ユ ーシヨ ン法により回収する。 一方、 後述の実施例 1 0で得られたプラス ミ ド P329PSを同様にして制限酵素 C la I及び S al Iで切断、 ポ リ アク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動 （ゲ ル濃度 596) を行ない、 ぺニシ リ ナーゼ遺伝子プロモーター 領域及びシグナルべプチ ド領域を含む約 200bp の Sal I ~~ ^ C la lの DNA断片をエレク ト ロエ リ ユ ーシヨ ン法により回 収する。 こう して得られた 2種の DNA断片を混合し、 実施 例 3の方法に準じて T4—DNA リガーゼで連結後、 上記と同様 にしてェ シエ リ ヒア · コ リ HB101株に導入形質転換し、 ク口 ラ ムフ ユ二コ ール耐性の形質転換株の中からプラス ミ ドを分 離精製し、 分泌プラス ミ ドベクター PEAP8(4.7 Kbp)を作成し た。 第 1 6図に PEAP8の作成方法を示す。
    [0122] PEAP8で形質転換したェシヱ リ ヒア · コ ！J (Escherichia fl).
    [0123] LS¾ 3¾·63/0日！、 coli)HB101株すなわち Escherichia coli HB101 CpEAP8 〕 3 通商産業省工業技術院徴生物工業技衛研究所に徴ェ研条寄第 1909号 〔PERM BP-1909] として寄託された。
    [0124] 実施例 1 0 (好アル力 リ铨菌ぺニシリナーゼ遺伝子プロモー
    [0125] タ一領域 · シグナル領域を有するプラス ミ ドの 作成）
    [0126] C A T遺伝子誘導体を含むプラス ミ ド PCMI (約 4. l Kbp;フ アルマシア） を常法に準じて制限薛素 EcoRI及び Sal Iで切 断し、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8%) の後、 実 施例 9の方法に準じて約 0.5 kbp の C AT遺伝子の後半部分 を含む ScoRI^ ~~ Sal Iの DNA断片を回収する。 さらに、 C AT遺伝子誘導体を含むプラ ス ミ ド PCM7 (約 4.1 Kbp;ファ ルマ シア） を上記と同様にして、 制限酵素 EcoR I及び S al I で切断し、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8%) の後、 C AT遺伝子前半部分とべクターの大部分から成る約 3.1 Khp の EcoRI ^ ~~ al Iの DN A断片を回収する。 これらの DN A断片を混合し、 実施例 3の方法に準じて T4-DNA リガーゼ で連結し、 実施例 9の方法に準じて CAT遺伝子誘導体を含 む新規プラ ス ミ ド PCM7U約 3.6 Kbp)を作成した。 第 1 7図に PCM71の作成方法を示す。 前記実施例 9で得られたプラス ミ ド PEAP3 を常法に準じて 制限酵素 R sa Iで切断し、 ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 (ゲル濃度 5 %) 後、 実施例 9の方法に準じてぺニシリナ一 ゼ遺伝子プロモータ一領域及びシグナル領域を含む R sa I― →Rsa Iの DNA断片 （約 200bP)を回収する。 この R sa I— →Rsa Iの DN A断片と末端をリ ン酸化した H i nd ΠΙリ ンカ一 (宝酒造） とを混合し、 実施例 3の方法に準じて T4— DNA リ ガーゼを用いて連結した後、 常法に準じて制限酵素 Hindmで 切断する。 ポ リ アク リルア ミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) の後、 実施例 9の方法に準じて末端が Hindmサイ 卜に変換さ れたぺニシ リナ—ゼ遺伝子プ口モータ一領域及びシグナルぺ プチ ド領域を含む D N A断片 （約 210bP)を回収する。 一方、 上述のプラス ミ ド PCM71 を常法に準じて制限酵素 Hindmで切 断し、 上記のぺニシリナーゼ遺伝子プロモータ一領域及びシ グナルぺプチ ド領域を含む Hindm^ ~~ ^Hindnの D N A断片と 混合し、 実施例 3の方法に準じて T4一 DNA リガーゼを用いて 連結させ、 実施例 9の方法に準じてアンピシリ ン耐性、 ク 口 ラ ムフ エニコール耐性の形質転換株よりプラス ミ ド pPSl (約 3. 7 Kbp)を分離 · 精製した。 このプラス ミ ド pPSlにおいては、 ぺニシ リ ナーゼ遺伝子プロモータ 一領域及びシグナルべプチ ド領域が、 C A T遺伝子の上流に同じ読み取り方向で挿入さ れた構造を有している。 第 1 8図に PPSIの作成方法を示した。
    [0127] こう して得られたプラス ミ ド PPSIを常法に準じて制限酵素 HindlEで部分分解し、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8 %) の後、 上記と同様にして 2ケ所存在する Hindinサイ トのうち 1ケ所のみが切断された HindlE^ ~~ ^HindHIの DN A 断片 （約 3.7 Kbp)を回収する。 この HindlE^ ~~ ^Hindmの DN A断片を常法に準じて DN Aポリ メ ラーゼ I ♦ ラージ ' フ ラ グメ ン トを用いて末端を平滑化した後、 実施例 3の方法に準 じて T4—DNA リガーゼによって自己閉瑗させる。 このように して上記方法に準じて、 プラス ミ ド pPSl中のぺニシリナ一ゼ 遺伝子プロモータ ー領壊上流に存在する Hindffiサイ トを欠失 させた形のプラス ミ ド PPSIAH (約 3.7 Kbp)を作成した。 第 1 9図に PPSIAH の作成方法を示す。
    [0128] さらにプラス ミ ド PPSIAH を常法に準じて制限酵素 C la I で切断した後、 末端をリ ン酸化した S al I リ ンカ 一 （宝酒造） と混合し、 実施例 3の方法に準じて T4— DNA リガーゼを用い て連結反応を行なう。 エタノ ール沈澱の後、 常法に準じて制 限酵素 HindlE及び S al Iで切断し、 ポ リアク リ ルアミ ドゲル 電気泳動 （ゲル濃度 5 %) を行ない、 ぺニシリナーゼ遺伝子 プロモーター領域及びシグナルぺプチ ド領域を含む約 210bp ©Sai l < ~~ ^Hindmの D N A断片をェレク ト 口エ リ ユ ーショ ン法により回収する。 一方、 プラス ミ ド も同様にして 制限酵素 Hindm及び S al Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳 動 （ゲル濃度 0.8 %) を行ない、 ベクターの大部分を含む約 3.6 Kbp の HindHT^ ~~ -Sai lの DN A断片を回収する。 こう して得られた 2種類の DN A断片を混合し、 実施例 3の方法 に準じて T4— DNA リガーゼで連結した後、 上記方法に準じて、 プラス ミ ド P329PSを作成した。 第 1 9図に P329PSの作成方法 を示す。 実施例 1 1 (抗腫瘍活性ポ リぺプチ ド遺伝子菌体外分泌発現 型プラス ミ ド pEXTNFl の作成）
    [0129] 実施例 4で作成したヒ ト T N F遺伝子発現型プラス ミ ド PTNF401NN を、 常法に従って制限酵素、 A va I及び H i nd ΙΠで 切断し、 ポ リ アク リルァミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) の後、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト T N F遺伝子の大部分 を含む約 460bp の Ava I ~~ ^ H i nd ΠΙの D N A断片を回収する ( —方、 実施例 9で作成した分泌ブラス ミ ドベクタ一 PEAP8 を- 常法に従って制限酵素 Hindfflで切断し、 ァガロースゲル電気 泳動 （ゲル濃度 0. 7 %) の後、 実施例 3の方法に準じて、 線 状化 PEAP8 DNA を回収する。 これら 2種の D N A断片を混合、 常法に従って D N Aポ リ メ ラーゼ I · ラージ · フラグメ ン ト により未端を平滑化した後、 実施例 3の方法に準じて、 T4— DNA リガ一ゼによる連結を行なう。 連結後の D N A混合物を、 実施例 3の方法に準じてェシユ リ ヒア · コ リ HB101株に導入 形質転換し、 抗腫瘍活性ポ リ ペプチ ド遺伝子菌体外分泌発現 型ブラス ミ ド PEXTNPI (約 5. 2 Kbp)を作成した。 このブラス ミ ドは、 第 1図記載のァミ ノ酸配列において 8番目の P r oか ら 157番目の L e uまでの配列で表わされる抗腫瘍活性ポ リ ぺプチ ドが、 第 9図記載のァ ミ ノ酸配列における 3 0蕃目の A 1 aの下流に連結された形の融合蛋白質をコー ドする D N A領域を含んでいる。 .第 2 0図に pEXTNFlの作成方法を示す。 実施例 1 2 (菌体外分泌発現型プラ ス ミ ド pEXTNFl を有する 組換え微生物の培養）
    [0130] 実施例 1 1 で得られた抗腫瘍活性ポ リ ベプチ ド遺伝子菌体 外分泌発現型プラス ミ ド P EXTNF I を有するエシュ リ ヒア · コ リ HB101株を最終濃度 2 0 Ζ»ι のクロラムフヱニコールを 含む LBGG培地 〔 1 % ト リ プト ン、 0. 5 %酵母エキス、 1 %
    [0131] N C , 0. 1 %グルコース、 0. 05〜 0. 2 %グリ セロール （pH 7. 2 ) 〕 に接種し、 3 7 :で 2 4時間振とう培養を行なう。 培養終了後、 遠心分離によって菌体を分離し、 得られた培 養上清を活性評価用試料とした。 また、 培養上清中に含まれ る全蛋白質を硫安分画法 （ 8 0 %飽和） により分画し、 遠心 分離によって得られた沈澱を適当量の P B Sバッ フ ァー（150 mM C iを含む 2 0 railリ ン酸バッ ファー、 ρΗ 7. 4 ) に溶解さ せた後、 P B Sバッ フ ァーに対して透析を行なった。 こう し て得られた培養上清濃縮物についても活性の評価を行なった ( 実施例 1 3 (pBXTNF l にコードされる抗腫瘍活性ポ リぺプチ
    [0132] ' ドを舍む培養上清の活性評価）
    [0133] 抗腫瘍活性ボリぺプチ ドを含む培養上清の活性測定は、 前 記 Ruf fの方法に準じて行なった。 すなわち、 実施例 1 2で得 られた抗腫瘍活性ポリぺプチドを舍む培養上清又は培養上清 濃縮物を順次培地で希釈した試料 と、 4 X 1 0 5 個 κ の濃度のマウス L一 929 繊維芽細胞 （ATCC CCL— 929)懸濁 液 を、 9 6穴の組織培養用のマイ クロプレー ト （コー スター） 内で混合した。 なおこの際に、 最終濃度 1 / m£の ァクチノ マイ シン D (コスメゲン、 萬有製薬） を添加してお く。 培地としては、 5 % (vo lZ vo l)のゥ シ胎児血清を舍むィ —グルの ミ ニマム · エッセンシャル培地 （曰水製薬） を用い た。 上記マイ クロプレー トを、 5 %炭酸ガスを含む空気中、 3 7でで 2 0時間培養した後、 ク リ スタ ル ♦ バイオレッ ト溶 液 〔 5 % (vo l Z vo l)メ タ ノ ール水溶液に、 0. 5 % (wt/ vo l ) のク リ ス タル · バイオレ ツ トを溶解させたもの〕 を用いて生 細胞を染色した。 余分なク リ スタ ル · バイオレ ツ トを洗い流 し乾燥した後、 残ったク リ スタ ル · ノ、 'ィォレ ツ トを の 0. 5 % S D S水溶液で抽出し、 その 595nmにおける吸光度を EL I SAアナライザー （東洋測器、 ETY— 96型） で測定する。 この吸光度は、 生き残った細胞数に比例する。 そこで、 抗腫 瘍活性ポ リベプチ ドを含むサ ンプルの希釈溶液を加えない対 照の吸光度の 5 0 %の値に相当するサ ンプルの希釈倍率をグ ラ フ （第 2 1図） によって求め、 その希釈倍率をュニッ 卜 と 定義する。 第 2 1図より、 実施例 1 2で得られた抗腫瘍活性 ポ リベプチ ドを含む培養上清 中には約 1 0ュニッ 卜の 活性が、 培養上清濃縮物 中には約 320ュニッ トの活性 が、 それぞれ含まれていることがわかる。
    [0134] 実施例 1 2で得られた抗腫瘍活性ポ リ ぺプチ ドを舍む培養 上清又は培養上清濃縮物中に含まれる総蛋白質量は、 プロテ イ ン ' ア ツ セィ · キッ ト （バイ オ ♦ ラ ッ ド） を用いて定量し、 ゥ シ血清アルブミ ンを用いた検量線より計算した。 上記で得 られた活性の値及び蛋白質定量の結果より抗腫瘍活性ポ リぺ プチ ドを含む培養上清濃縮物の比活性を計算したところ、 1. 0 X 1 0 3 (ユニッ ト Z mg ) の比活性を有していることが明 らカ、になった。 '
    [0135] 実施例 1 4 (抗腫瘍活性ポ リ ぺプチ ド遺伝子菌体外分泌発現 型プラ ス ミ ド PEXTNP3 及び PEXTNP4 の作成） 実施例 4で作成したヒ ト TN F遺伝子発現型プラス ミ ド TNF401A を、 常法に従って制限藓素、 A I及び Hindlffで切 断し、 ポ リ アク リ ルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) の 後、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の大部分を 含む約 460bp の Ava I—→HindEIの DN A断片を回収する。
    [0136] 一方、 実施例 9で作成した分泌プラスミ ドベクタ一 PEAP8 を、 常法に従って制限酵素 HindlEで切断し、 ァガロースゲル 電気泳動 （ゲル濃度 0. 7 の後、 実施例 3の方法に準じて、 線状化 PEAP8 DNA を回収する。
    [0137] また、 第 2 2図の A記載の塩基配列を有するォ リ ゴヌク レ ォチ ドを、 実施例 2の方法に準じて、 合成、 精製した。 得ら れた 2本の合成ォ リゴヌクレオチ ドそれぞれ 0. 5 PSについて、 実施例 3の方法に準じて、 末端のリ ン酸化を行ない、 ァニー リ ングを行なった。
    [0138] ァニーり ングによって得られた 2本鎖ォ リ ゴヌク レオチ ド を、 先に得られた線状 PEAP8 DNA断片 （HindlE^ ~~ ^Hindm) 及びヒ ト TNF遺伝子の大部分を舍む約 460bp の DNA断片 (Aval ^ ~~ -Hindn) と混合し、 エタノ ール沈澱の後、 実施 例 3の方法に準じて、 T4— リガーゼによる連結反応を行 なった。 連結後の DN A混合物を、 実施例 3の方法に準じて ェシエ リ ヒア * コ リ HB101株に導入形質転換し、 抗腫瘍活性 ポ リ ぺプチ ド遺伝子菌体外分泌発現型プラス ミ ド PEXTNF3(約 5.2 Kbp)を作成した。 このプラス ミ ドは、 第 1図記載のァミ ノ酸配列において 3蕃目の S e rから 157蕃目の L e uまで の配列で表される抗腫瘍活性ポ リペプチドが、 第 9図記載の 了 ミ ノ酸配列における 3 0番目の A 1 aの下流に連結された 形の融合蛋白質をコー ドする D N A領域を含んでいる。 第 2 2図に PEXTNP3の作成方法を示す。
    [0139] さ らに、 第 2 3図記載のォ リ ゴヌク レオチ ドを用い、 上記 と同様な手法により、 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ド遺伝子菌体外 分泌発現型プラス ミ ド PEXTNF4(約 5. 2 Kbp)を作成した。 この プラス ミ ドは、 第 1図記載のァ ミ ノ酸配列において 1番目の V a 〗 から 157審目の L e uまでの配列で表される抗腫瘍活 性ポ リべプチ ドが、 第 9図記載のァ ミ ノ酸配列における 3 0 審目の A 1 aの下流に連結された形の融合蛋白質をコー ドす る D N A領域を含んでいる。 第 2 3図に PEXTNF4の作成方法 を示す。
    [0140] 実施例 1 5 (各種菌体外分泌発現型プラス ミ ドを有する組換 え微生物の培養）
    [0141] 実施例 9で得られた分泌ブラス ミ ドベクタ一 PEAP8 を有す るエシュ リ ヒア · コ リ HB101株、 実施例 1 1で得られた抗腫 瘍活性ポ リベプチ ド遺伝子菌体外分泌発現型プラス ミ ド PEXTNF1 を有するェシ リ ヒア · コ リ HB101株、 又は実施例 1 4で得られた抗腫瘍活性ポ リぺプチ ド菌体外分泌発現型プ ラス ミ ド PEXTNF3 又は P TN卩 4 を有するェシエ リ ヒア · コ リ HB101株を、 それぞれ L B G培地 〔 1 % ト リプ ト ン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % NaC^ . 0. 1 %グルコース （PH7. 2 ) 〕 に 接種し、 3 7 でで 2 4時間振とう培養を行なう。
    [0142] 培養終了後、 遠心分離によって菌体を分離し、 得られた培 養上清を活性評価用試料と した。 実施例 1 6 (各種抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドを含む培養上清の in vitro抗癌活性評価)
    [0143] 前記実施例 1 5で得られた各種抗腫瘍活性ポリぺプチ ドを 舍む培養上清の in vitro抗癌活性測定は、 実施例 1 3と同様 な方法で行なった。 第 2 4図より、 プラスミ ド PEXTNFI を有 する大腸菌の培養上清 中には約 3 8ュニッ トの活性が、 プラスミ ド PEXTNF3 を有する大腸菌の培養上清 100 中には 約 11 000ュニッ トの活性が、 そしてプラス ミ ド PEXTNF4 を有 する大腸菌の培養上清 中には約 330ュニッ トの活性が、 それぞれ含まれていることがわかる。 また、 分泌プラス ミ ド ベクター PEAP8 を有する大腸菌の培養上清は、 活性を有して いなかった。
    [0144] 実施例 1 5で得られた各種抗腫瘍活性ポ リぺプチドを舍む 培養上清中に舍まれる総蛋白質量は、 プ ϋティ ン * アツセィ ， キッ ト （バイ オ · ラ ッ ド） を用いて定量し、 ゥ シ血清アルブ ミ ンを用いた検量線より計算した。 上記で得られた活性の値 及び蛋白質定量の結果より抗腫瘍活性ポリベプチ ドを舍む培 養上清の比活性を計算したところ表 1のような結果が得られ ο
    [0145] 表 1 プラス ミ ドの種類 ρΈΑΡ8 PBXTNFI PEXTNF3 PBXTNF4 活性 （UZ-ιί ) 0 3.8 x 102 1. lxlO5 3.3X 103 蛋白質量 （mg m£ ) 0.65 0.63 0.32 0.52 比活性 （UZmg) 0 6. Ox 102 3. 4X 105 6.3 x 10 また、 前記実施例 1 5で得られた PEAP8を有するェシェ リ ヒ ア · コ リ HB101株及び PEXTNP3を有するェ シエ リ ヒ ア · コ リ HB101株からの培養上清 分に相当する培養上清濃縮 物に对して、 Tr is— HC ^ バッ フ ァ ー （PH6. 8 ) と S D Sと 2 一メ ルカプ ト エタ ノ ールとグ リセロ ールとを、 それぞれ最終 濃度 6 0 mM , 2 % > 4 %■ 1 0 %になるように加え、 S D S 一ポ リ アク リルアミ ドゲル電気泳動 〔鈴木、 遺伝、 ， 43
    [0146] (1977)〕 を行なった。 分離用ゲルは 1 5 %とし、 泳動バッ フ ァ 一は SDS_Tris . グリ シン系 〔U. K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)] を用いた。 電気泳動終了後、 ゲル中の蛋白質を， 2 5 mM Tris- 192mM グ リ シ ン （pH8. 3 ) — 2 0 %メ タ ノ ー ルのバッ フ ァ 一中で、 電気泳動的にニ ト ロセルロ ース · フ ィ ルターに吸着させ、 ゥエスタ ン · プロ ッ ティ ングを行なった 蛋白質を吸着させたニ ト ロセルロ ース · フ ィ ルタ ーを 5 % ゥ シ血清アルブミ ンを舍む P B Sバッ フ ァ一中に 6 0分間浸 した後、 一次抗体と してャギ抗ヒ ト T N F蛋白質抗血清 〔後 記実施例 1 7で得られた大腸菌菌体内産生ヒ ト T N Fを抗原 と して、 ャギを免疫することにより取得 （大塚アツセィ研究 所製） 〕 を用いた間接法で、 ペルォキシダーゼ標識抗体を用 いたイ ミ ユ ン · ブロ ッ ト · ア ツ セィ ， キ ッ ト （ノ ィ ォ · ラ ッ ド） により、 培養上清中の抗腫瘍活性ポ リベプチ ドを特異的 に染色した。 なお、 対照用と して、 PTNF401NNを有するェ シ エ リ ヒ ア ' コ リ C600— r _m株のライゼー トを用いた。 結果 の一部を複写して第 2 5図に示した。 PEXTNF3を有する大腸 菌の培養上清中に、 抗腫瘍活性ポ リベプチ ドに由来するバン ドが検出された。
    [0147] 前記の表 1及び第 2 5図の結果より、 好アル力 リ菌ぺニシ リナーゼ遺伝子シグナル領域の下流に、 了ミ ノ末端にセ リ ン を有する抗腫瘍活性ポ リぺプチ ド遺伝子を融合させることに より、 抗腫瘍活性ポリペプチ ドめ高效率菌体外分泌が達成さ れることがわかる。
    [0148] 実施例 1 Ί (抗腫瘍活性ポリぺプチ ドの精製）
    [0149] 実施例 4で作成したヒ ト TNF遺伝子発現型プラスミ ド PTNF401NN を有するェシヱ リ ヒア ' コ リ C600r— m—株を 3 0 Z のアンピシ リ ン、 0.2 %のグルコ ース及び 4 mgZ <«のカザミ ノ酸を含む M 9培地 〔0.6 % Na2HP04- 0.3 % KH2P04- 0.05% NaC^— 0. 1 %NH4C£水溶液 （PH7.4 ) をォ — トク レーブ滅菌した後に、 別途にォー トク レーブ滅菌した MgS04水溶液及び CaC^ 2 水溶液をそれぞれ最終濃度 2 mM及 び 0.1 mMになるように加える〕 200 に接種し、 0Ds。。 が 0.7に達するまで、 3 7 で振とう培養を行った。 次いで、 最終濃度 5 0 の 3— ーィ ンドールァク リル酸を培養 液中に添加し、 さらに 3 7でで 1 2時間振とう培養を続けた c 遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、 P B Sバッ フ ァ ー (150mM N C£を含む 2 0 mMリ ン酸バッ フ ァ ー、 PH7.4 ) を用 いて菌体の洗浄を行なった。 洗浄後の菌体を 1 0 ^の？ 83 バッ フ ァーに懸篛させ、 超音波発生装置 （久保田、 200M型） を用いて菌体を破壊した後、 遠心分雜により菌体残渣の除去 を行なった。
    [0150] 得られたライゼ一 トからのヒ ト TNF蛋白質の精製は、 Shiraiら [T. Shiraiら、 Nature, 313, 830 (1985) 〕 の方法 に従い、 DEAE—セ フ ァ ロ 一ス - カ ラ ム · ク ロマ ト グラ フ ィ ー により行なった。 本粗精製品中のヒ ト T N F蛋白質含量は約 3 0 %であった。
    [0151] ヒ ト T N F蛋白質に対するモノ ク口ーナル抗体を産生する マウス · ハイ プリ ドーマは、 Kohlerと Milsteinの方法 〔Kohler と Milstein, Nature, 256, 495 (1975) 〕 により取得した。 すなわち、 上記ヒ ト TN F粗製品を用いて雄 BalbZ cマウス を免疫し、 該マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞 P3— X63— Ag8— UI細胞 〔D. E. Yeltonら、 Current Topics in Microbiology and Immunology, 81， 1 (1978)〕 とを融合させる。 融合後の細胞混合物を選択培地で培養することによりハイ ブ ！) ドーマ細胞のみを選択し、 さらにその培養上清中の抗体の ヒ ト T N F粗製品との結合能を.調べることにより、 ヒ ト T N F蛋白質に対する抗体を産生するク口一 ンを取得した。
    [0152] ヒ ト T N F蛋白質に対するモノ ク 口 ーナル抗体を産生する マウス ' ハイ プリ ドーマ培養上清からのモノ ク口ーナル抗体 の精製は、 プロティ ン A · セファロ一ス ♦ カ ラ ム · クロマ ト グラ フ ィ ー （フ ア ルマ シア） を用いて行なった。 得られたモ ノ ク α—ナル抗体精製品と、 活性型ァフィ ニティ一支持体ァ フ ィ · ゲル 1 0 (バイ オ - ラ ッ ド） とを、 0. 1 M M0PSバッ フ 了一 （PH7. 5、 半井化学薬品） 中で 4 t:で 2時間力 ップリ ン グさせて、 ヒ ト T N F蛋白質及び抗腫瘍活性ポ リベプチ ド精 製用ァフィ二ティ 一 ' カ ラ厶を作成した。
    [0153] 前記実施例 1 5で調製した抗腫瘍活性ポ リ ぺプチ ド遺伝子 菌体外分泌発現型プラスミ ド PEXTNF3 を有する大腸菌の培養 上清を上記ァフィニティ一 · カ ラムに通し、 抗腫瘍活性ポ リペプチ ドのみを特異的にカ ラムに吸着させた。 カラムを P B Sバッ ファ一及び 500mM NaC を含む 2 0 mMリ ン酸バッ フ ァー （PH7. 4 ) で充分洗浄した後、 3 M NaSCN水溶液 （PH 7. 4 ) を用いて、 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドを溶出させた。 溶 出した抗腫瘍活性ポ リペプチ ドを、 限外濾過にて濃縮し、 P B Sバッ ファ一に置換した後、 S D S—ポ リアク リルア ミ ド · ゲル電気泳動 （分離用ゲル濃度 1 5 %) を行なった。 電 気泳動^了後、 ゲル中の蛋白質のバン卞を色素を用いて染色 したところ、 分子量約 17， 000の位置のみに 1本のバン ドが観 察され、 9 8 %以上の純度の大腸菌菌体外分泌抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドが得られたことが確認できた。
    [0154] また同様にして、 上記で得られた PTNP401NNを有する大腸 菌のライゼ一トを上記ァフィ二ティー * カラムにかけること によって、 ヒ ト T N F蛋白質の精製を行ない、 ヒ ト T N F蛋 白質精製品を取得した。
    [0155] 実施例 1 8 (分泌抗腫瘍活性ポリペプチ ドの性質）
    [0156] 前記実施例 1 7で得られた大腸菌菌体外分泌抗腫瘍活性ポ リぺプチ ド精製品を、 気相プロティ ンシーケンサ一 （A B I， モデル 470A) にかけ、 了ミ ノ末端のアミ ノ酸配列解析を行な つたところ、
    [0157] H2N— Ser— Ser— Ser— Arg— Thr— Pro— Ser— Asp—
    [0158] という結果が得られた。 この結果は、 ぺニシリナーゼのシグ ナルぺプチ ドが分泌の際に正しく切断されたことを示すもの である。 また、 アミ ノ酸組成分析結果からも、 大腸菌が菌体 外に分泌した抗腫瘍活性ポ リべプチ ドは計画通りのものであ ることが支持された。
    [0159] 一方、 ヒ ト TN F蛋白質精製品についてもァミ ノ末端のァ ミ ノ酸配列の解析を行なったところ、 ァミ ノ末端のア ミ ノ酸 と してメ チォニン、 ノ リ ン、 アルギニン、 セ リ ンが検出され た。 すなわち、 菌体内に産生されたヒ ト TN F蛋白質は多様 なァ ミ ノ末端をもつことが分かった。
    [0160] また、 このようにして得られた精製標品の in vitro抗癌活 性を実施例 1 3の方法に準じて測定したところ、 菌体内産生 ヒ ト TN F蛋白質は 1 X 1 07(ュニッ ト Zing) の比活性を、 菌体外分泌抗腫瘍活性ポ リペプチ ドは 2〜 4 X 107(ユニッ ト Zmg) の比活性をそれぞれ有していた。
    [0161] 以上より、 菌体外分泌により、 均質かつ高比活性を有する 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドが取得可能であることが明らかとな つた。
    [0162] 実施例 1 9 (分泌抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの in vivo抗癌活 性評価）
    [0163] 分泌抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドの in vivo 抗癌活性測定は、 前記 Carswellらの方法に準じて行なった。 すなわち、 l x
    [0164] 1 06 個の MethA肉腫細胞を 5 0 の RPMI1640培地 （二ッス ィ） に懸濁させ、 BALBZ cマウス （ 6〜 8週令、 雄、 チヤ一 ルス · リバ一） 側腹部皮下に移植する。 移植後、 腫瘍径が 6 〜 1 0細に達した？〜 1 0 日目に、 前記実施例 1 7で調製し た分泌抗腫瘍活性ポ リぺプチ ド 1 0 を尾静脈より投与した c 投与後 2 4時間以内に、 腫瘍表面に出血壊死像が観察され、 本発明の分泌抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドが、 in vivo において も顕著な抗癌活性を有していることが明らかとなった。 投与 前の担癌マゥスと出血壊死を起した担瘙マウスの一例を第 2 6図に示した。 また、 同様にして、 1 0 の分泌抗腫瘍活 性ポ リぺプチ ド又は菌体内産生ヒ ト TN F蛋白質、 又は生理 食塩水を担瘙マウスに尾静脈投与し、 2 4時間後における出 血壊死の程度を前記 Carswellらの方法に準じて比較した。 結 果を表 2 に示す。 表 2より、 分泌抗腫瘍活性ボリぺプチドは in vivoにおいても、 in vitroの場合と同様に、 菌体内生産 ヒ ト TN F蛋白質よりも高い活性を有していることがわかる, 表 2 出血壊死の程度
    [0165] — + ++ +++ コ ン トロール （生理食塩水） 6匹 0匹 0匹 0匹 菌体内産生ヒ ト TN F蛋白質 0匹 5匹 2匹 0匹 分泌抗腫瘍活性ポリぺプチド 0匹 1匹 3匹 4匹 さ らに、 上記と同様な担癌マウスの尾静脈に、 1 0 の分 泌抗腫瘍活性ポ リぺプチド又は菌体内産生ヒ ト T N F蛋白質 を 2回投与して相对腫瘍重量の経時変化を調べた。 結果を第
    [0166] 1
    [0167] 2 7図に示す。 第 2 7図において腫瘍重: は一 X (腫瘍長径）
    [0168] 2
    [0169] X (腫瘍短径） 2という式により計算した。 この場合にも、 分 泌抗腫瘍活性ポリぺプチ ドは菌体内産生ヒ ト TN F蛋白質よ り も有効であることがわかる。 さ らに、 上記の相対腫瘍重量 の計算式の要素として腫瘍の厚みは舍まれていないが、 分泌 抗腫瘍活性ポリ ぺプチ ドを投与した場合の腫瘍の厚みの減少 は、 菌体内産生ヒ ト T N F蛋白質を投与した場合と比べて顕 著に大き く 、 分泌抗腫瘍活性ポリ ベプチ ドと菌体内産生ヒ ト T N F蛋白質との活性の差は、 実際には、 第 2 7図に示した 差より も大きい。
    [0170] 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の 各種の変形は本発明の範囲に舍まれるものである。
    [0171] 〔規則第 1 3規則の 2 の寄託された微生物への言及〕 ィ 寄託機関
    [0172] 名 称 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号
    [0173] (郵便番号 305 )
    [0174] 寄 託 日
    [0175] 昭和 6 3年 6月 1 0 曰
    [0176] ノヽ 受託番号
    [0177] 微ェ研条寄第 1 9 0 9号 （F E P H BP - 1909 )
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. (1) 抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドをコ一ドする DN A配列、 該ポ リべプチ ドの発現調節を行なうプロモーター機能を有す る D N A配列及びシグナルぺプチ ドをコードする D N A配列 を有する第 1の DN A領域、 及び
    ' (2) 菌体外分-泌を促進する作用を宿主細胞に与える DN A 配列及び該 D N A配列の発現調節を行なうプロモータ一機能 を有する D N A配列を有する第 2の D N A領域、
    を含むプラス ミ ド。
    2. 抗腫瘍活性ボリペプチ ドをコ—ドする D N A配列が、 第 1図に示されたァミ ノ酸配列を舍むポ リベプチ ドをコ一ド する DN A配列又は該ァミ ノ酸配列において 1又はそれ以上 のァミ ノ酸残基の置換、 欠失又は揮入がなされたァミ ノ酸配 列を含むポ リぺプチ ドをユードする DN A配列を少なく とも 含む請求の範囲第 1項記載のプラ ス ミ ド。
    3. 第 1の DN A領域におけるプロモーター機能を有する
    DNA配列が、 好了ルカ リ性バチルス （Bacillus) No.17ひ 株の 染色体 DN A由来である請求の範囲第 1項記載のプラス ミ ド,
    4. シグナルペプチ ドをコードする D N A配列が、 好アル カ リ性バチルス （Bacillus)No l7Q 株の染色体 DNA由来であ る請求の範囲第 1項記載のプラス ミ ド。
    5. 実質的に菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与え る DNA配列が、 プラ ス ミ ド pMB9由来である請求の範囲第 1 項記載のプラス ミ ド。
    6. 第 2の D N A領域におけるプロモータ一機能を有する DNA配列が、 好アルカ リ性バチルス （Bacillus) Ndl70 株の 染色体 DNA由来である請求の範囲第 1項記載のプラス ミ ド。
    7. プラス ミ ド pEXTNFl, PEXTNF3又は PEXTNF4 である請求 の範囲第 1項記載のブラス ミ ド。
    8. (1) 抗腫瘍活性ポ リペプチ ドをコー ドする D N A配列、 該ポ リぺプチ ドの発現調節を行なうプロモータ一機能を有す る D N A配列及びシグナルべプチ ドをコ一 ドする D N A配列 を有する第 1の DN A領域、 及び
    (2) 菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与える DN A 配列及び該 D N A配列の発現調節を行なうプロモーター機能， を有する D N A配列を有する第 2の D N A領域、
    を含むプラス ミ ドによって形質転換された組換え微生物細胞。
    9. 該微生物細胞がェシエ リ ヒア（Escherichia) 属に属す る請求の範囲第 8項記載の微生物細胞。
    10. 該微生物細胞がェシェ リ ヒア · コ リ （Escherichia col i) HB101株である請求の範囲第 8項記載の微生物細胞。
    11. (1) 抗腫瘍活性ポ リペプチ ドをコー ドする D N A配列、 該ポ リぺプチ ドの発現調節を行なうプロモータ一機能を有す る D N A配列及びシグナルペプチ ドをコー ドする D N A配列 を有する第 1の DN A領域、 及び
    (2) 菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与える DN A 配列及び該 D N A配列の発現調節を行なうプロモーター機能 を有する DNA配列を有する第 2の DNA領域、
    を含むプラス ミ ドによって形質転換された組換え微生物を、
    -5 菌体外に抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドが生成しそして蓄積するま で培養し、 培養物から抗腫瘍活性ポ リぺプチ ドを採取するこ とを特徵とする抗腫瘍活性ポリぺプチ ドの製造方法。
    12. 該微生物がェシエ リ ヒア（Escherichia) 属に属する請 求の範囲第 1 1項記載の方法。
    13. 該微生物がェ シヱ り ヒア ' コ リ （Escherichia coli) HB101株である請求の範囲第 1 1項記載の方法。
    14. (1) 抗腫瘍活性ポリぺプチ ドをコ一 ドする DN A配列、 該ポ リべプチ ドの発現調節を行なうプ口モーター機能を有す る D N A配列及びシグナルぺプチ ドをコ一ドする D N A配列 を有する第 1の D N A領域、 及び
    (2) 菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与える D NA 配列及び該 DN A配列の発現調節を行なうプロモーター機能 を有する D N A配列を有する第 2の D N A領域、 - を含むプラス ミ ドによって形質転換された組換え微生物細胞 から分泌された抗腫瘍活性ポリペプチ ド。
    15. 第 1図に示されたァミ ノ酸配列を有する請求の範囲第 1 4項記載のポ リぺプチ ド。
    16. 第 1図に示されたアミ ノ酸配列において 1又はそれ以0 上のァミ ノ酸残基の置換、 欠失又は挿入がなされたァミ ノ酸 配列を有する請求の範囲第 1 4項記載のポ リぺプチ ド。
    17. プラス ミ ド PEXTNFI, PEXTNF3又は PEXTNF4 によって形 質転換されたェ シェ リ ヒア（Escherichia) 属に属する微生物 から分泌された請求の範囲第 1 4項記載のポ リペプチ ド。
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
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