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    公开号:WO1988009504A1
    申请号:PCT/JP1988/000514
    申请日:1988-05-27
    公开日:1988-12-01
    发明作者:Yukio Hamaguchi；Kenji Ito；Yukio Tsujino；Kazuhiro Moriyama；Ikuya Takenaka；Takashi Morikawa；Hitomi Ohmi
    申请人:Toa Medical Electronics Co., Ltd.；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 一 明 白血球分類方法および試薬 技 術 分 野
    [0002] 本発明は、 臨床検査分野における血球の分類測定法に関する ものであり、 さらに詳しくは、 血液中の白血球を分類， 識別， 計数する方法および試薬に関するものである。
    [0003] 背 技
    [0004] 健常人の末梢血中の白血球には、 リンパ球， 単球， 好中球， 好酸球， 好塩基球の種類がある。 好中球， 好酸球， 好塩基球を まとめて顆粒球と呼ぶ。 これらは各々その機能が異つており、 血液中の白血 を種類別に計数することによって、 病気の診断 に貢献することができる。 たとえば、 好中球の増加は、 炎症， 心筋梗塞， 白血病などにみられ、 好中球の減少は、 ウィルス性 疾患， 再生不良性貧血， 無顆粒球症などにみられる。 好酸球の 増加は、 寄生虫症， ホジキン病， アレルギー疾患などにみられ る。 単球の増加は感染症の快復期， 単球性白血病などにみられ る o
    [0005] 上記、 リンパ球， 単球， 好中球, 好酸球， 好塩基球はいわゆ る正常細胞と言われるものである力 これらの他に、 ある種の 血液疾患の場合の末梢血中には異常細胞が出現することがある。 たとえば、 白血病などの患者の末梢血液中には芽球が見られる ことがある。 この異常細胞にも種々あるが、 その種類を分類し、 各異常細胞集団の細胞数をもとめることも臨床上大きな意味の あることである。
    [0006] 白血球を分類 *計数するために従来から最も良く実施されて いる方法は、 血液像鑑定 （視算法， 用手法） と呼ばれるもので める o
    [0007] この方法は、 血液をスライドグラス上に塗抹し、 血球を固定 し、 さらに染色したのち、 顕微鏡で観察し、 一つずつの白血球 の形態的特徵 （白血球の大きさ， 核の形態， 細胞質の形態， 顆 粒の有無等） や染色度合から測定者がいずれの血球であるかを 判定し、 分類 ·計数するものである。 このとき、 一般の検査室 では 100〜200個の白血球を計数し、 白血球全体の数の中に占 める各々の血球の百分率 （％) を測定値としている。
    [0008] この方法は、 顕微鏡による観察の前に、 血液の塗抹， 固定 染色等の繁雑な標本作成操作が必要であることと、 顕微鏡を用 いた分類 ·計数は、 血球のわずかな差を見分けなければならな いこととのために、 測定者に大きな負担をかけるものとなって いる。 さらに、 計数する白血球数が少ぃ上に、 塗抹試料上の血 球が不均一な分布となっている場合もあり、 熟練した測定者で も再現性のある測定値を出すことは難しい。
    [0009] このために、 白血球の分類♦計数が自動的に行なえる方法が 強く求められており、 現在のところ大きく分けて二種類の方法 が実現されている。
    [0010] そのうちの一つの方法は、 血球像をビデオカメラ等でとらぇ、 コンビュ一夕による画像処理によって白血球を分類するもので ある。 この方法は従来の視算法に原理的には近い方法であるが、 コンピュータによる処理では分類できない血球も多く、 完全に は視算法に取ってかわるものとはなっていない。 また、 装置が 複雑で大型になり、 価格が高くなるという問題もある。
    [0011] 白血球を自動的に分類♦計数するもう一つの方法は、 フロー システムを利用した方法である。 この方法は、 血球を希釈液中 に浮遊させた試料を用い血球が 1個ずつ細い検出器中を通過す るようにこの試料を流し、 このとき検出器で発生する信号を分 析することにより白血球を分類するものである。 このフローシ ステムを利用した方法は、 さらに、 二つの方法に細分される。 第 1の方法は、 赤血球を溶解剤で破壊し、 白血球のみが浮遊 した電解液を細孔中に流し、 血球が細孔を通過したときの細孔 部のインピーダンス変化を検出し、 検出信号の大きさによって 白血球.を分類するものである。
    [0012] 第 2の方法は、 光源と、 試料中の細胞が 1個ずつ細い流路を 流れるようにしたフローセルと、 細胞から発せられた光を検出 する測光部と、 検出信号を解析する解析装置とを備えたフロー サイ トメーターを使用するものである。 この方法では、 血球を 染色し、 染色された血球を光で照射し、 そのとき血球から発す る螢光および場合によっては散乱光を一緒に検出し、 検出信号 の強度によって白血球を分類しょうとするものである。
    [0013] この第 2の方法は、 複雑な染色過程が必要であったり、 光学 系を含んだ装置が複雑で高価なものとなる等の実用上の問題が める。
    [0014] 上記第一の方法の基礎となる原理のうちの一つは、 日本特許 第 508789号および米国特許第 3390326号に開示されている。 こ の原理は、 粒子がこれと誘電率を異にする流体媒質中に懸濁さ れた試料を流体通路に通過させ、 通路の狭隘部分において通路 を挟んで互に近接し対向して設けられた対をなす電極の間を粒 子が通過する際に粒子と流体媒質との誘電率の相違に起因する 電極間の電気ィンピーダンス変化を検出するものである。
    [0015] この原理を利用した具体的装置については、 たとえば、 黒川 一郎， 他：東亜自動血球計数器の使用経験， 臨床病理， 第 16 巻， 251〜255頁， 1968年に記載されている。 この装置は、 3.5 メガヘルツの高周波発振器を有し、 高周波電流を検出回路 に引加し、 血球が懸濁液にあって検出回路を通過する際に生ず る検出回路の電極間の電気ィンピーダンスの変化を検出するも のである。
    [0016] この東亜自動血球計数器を用いて白血球を測定することは、 たとえば、 黒川一郎， 他：臨床検査， 第 11巻， 148〜； L51頁， 1967年に記載されており、 血球懸濁液にサポニン （Saponin)を 添加し、 赤血球を溶解させ、 残留した白血球を測定している。
    [0017] 赤血球を溶解ざせる溶血剤としては、 サポニンの他にも 種々ある力 そのうち C T A C (セチルトリメチルアンモニ ゥムクロライ ド） 、 タージタルモニォニック N P X (Tergitol inonionic NPX) などは使用条件下で強力な溶血力を示すが、 白 血球の原形質も侵され、 ほとんど裸核の状態になる。 これに反 し、 サポニンは比較的白血球の原形をとどめている。 したがつ て、 東亜自動血球計数器のように高周波における電気ィンピ一 ダンスの変化を検出する機種の溶血剤として、 前 2者は不適当 であることが、 新谷和夫：白血球数算定の問題点， 臨床検査， 第 12巻， 900〜905頁， 1968年に記載されている。 ところで、 自動血球計数器を用いて白血球数を測定する上で は、 溶解した赤血球の膜 （ゴース ト） やノイズ信号の大きさに 比べて、 白血球による信号の大きさが充分に大きく、 両者が明 確に弁別されることが必要である。 この条件を確認するために 第 15図の様な累積粒度分布曲線が良く使われる。 第 15図は自動 血球計数器の信号閾値を横軸にとり、 この信号閾値以上の検出 信号数を縦軸にとって描いたものである。 第 15図において、 A 部が累積粒度分布曲線における、 いわゆる平坦部と呼ばれる部 分であり、 上記ノイズ信号やゴースト信号と比べて白血球信号 が充分に大きい状態で測定され、 安定した白血球数を得るため には、 この A部平坦部を伸ばす様に、 装置とそれに使用される 試薬とを調整する必要がある。
    [0018] ところが東亜摩動血球計数器に溶血剤サポニンを用いて白血 球を測定すると、 後述する D C.法と比べて上記平坦部が短 L、こ とが指摘されていた。 たとえば上記第 15図は、 高森裕二， 他： 白血球粒度分布の変動要因とその計数値におよぼす影響につい て、 M C Cニュース No.34, 12〜21頁， 東亜特殊電機， 兵庫， 1969年の表 1の中の希釈後室温で 5分放置した後サポニンを滴 加し累積粒度分布を測定したデータから描いたものであるが、 平坦部は閾値 350 から 400 までしかない。
    [0019] この様に、 東亜自動血球計数器にサポニンを用いて白血球 を測定した場合に平坦部が短い事の理由について、 ヘレマン (P . W . He l l eman) , 他： スキャ ンド · J ♦へマト （Scand . J . Haemat ) . 第 6巻， 180〜185 頁， 1969年には、 白血球の 異つた種類 （たとえば、 リ ンパ球と顆粒球のように） の誘電的 一 — 性質の差異によるものであろうと記載されている。
    [0020] たとえば、 第 15図の累積粒度分布曲線を注意深ぐ視ると、 第 1の平坦部 A部の右方に第 2の平坦部 B部が見られる。 第 15図 の累積粒度分布曲線から閾値レベルごとの白血球数を算出し、 第 16図に示す粒度分布曲線を描くと、 上記の事実はさらに明瞭 となる。 すなわち、 第 18図において、 Cで示す赤血球のゴース トおよびノイズの集団の右方に、 まず Dで示す白血球の第 1の 集団があり、 さらにその右方に Eで示す白血球の第 2の集団が ある。 この様に、 白血球粒度分布が二つの集団に分れているた めに、累積粒度分布の平坦部が短くなったと言うことが出来る。 以上のことは、 東亜自動血球計数器が、 白血球の二つの異っ た集団を分類 ·計数していたという事実を示すもので'あり、 上 述の高周波における電気ィンピーダンスの変化を検出する方法 (以下、 R F法と呼ぶ） によって白血球をさらに数種類に分類 識別し、 計数する可能性を示すものであった。
    [0021] し力、し、 当時においては、 白血球数を安定に、 かつ正確に計 数することに主たる関心が向けられていたために、 累積粒度分 布曲線の平坦部が短いことの理由について詳細に追究されるこ ともなく、 むしろ、 できる限り平坦部を伸ばし安定に計数でき る様に装置と試薬を調整することに努力が向けられていた。
    [0022] —方、 前述のフローシステムを利用した方法のうちの第 1の 方法の基礎となる原理には、 上記の R F法の他に、 日本特許第 217947号および }国特許第 2656508号に開示されたものがある。 この原理は、 粒子がこれと導電率を異にする流体媒質中に懸濁 された試料を収約された電流通路に通過させ、 粒子と流体媒質 との導電率の相違に起因する電流の変化を検出するものであり、 以下 D C法と呼ぶ。 この D C法においては、 検出される信号の 大きさは、 ほぼ粒子の体積に比例している。
    [0023] この D C法と前述の R F法とを組み合わせて、 D C法によつ て粒子の体積の情報を得、 R F法によって粒子の大きさ情報に 加えて粒子の構造及び粒子を構成する材料の性質による情報を も得ることにより、 同一懸濁液中の異なる種類の粒子の混合物 の系から数個の異なる種類の粒子の集団を分類する装置が日本 特許第 785859号および米国特許第 3502974号に開示されている。 し力、し、 この特許においては、 白血球の異なる種類の集団を分 類♦計数する可能性については何ら示されていない。
    [0024] また、 前述の R F法を用いて、 血球を破壊せずにその内容物 のみを入れ換え、 血球の誘電率を変化させ、 しかる後に分類♦ 計数を行おうとする方法が、 日本特許第 936823号および米国特 許第 3836849号に開示されている。 この特許の第 2の実施例に おいては、 サポニン 1 %溶液 を 7 . 2の pHを有する燐酸塩 緩衝生理塩溶液に懸濁された 100^2の全血に添加し赤血球を溶 解させると、 白血球の 2個の明白なピークが現われることが示 されており、 東亜血球計数器による前述の測定例 （第 16図） の 結果と良く一致している。
    [0025] ところで、 R F法を用い、 血球に対して比較的緩やかな作用 を示すサポニンを用いた場合でも、 白血球の原形質が徐々に破 壊され、 白血球の信号がしだいに小さくなる。 上記日本特許第 936823号の様に血球を破壊せずに通常の pHで血球の内容物の入 れ換えを行おうとすれば、 上記サポニンの濃度を相当低いもの とし、 緩慢に白血球に作用させる必要があるが、 この場合には 測定のための前処理時間を通常の白血球測定のための前処理時 間 （3〜5分） よりも相当長い時間必要とするので短時間で多 検体を処理する自動測定装置にこの方法を使用することは実用 的ではない。
    [0026] これに対し、 比較的短時間に白血球を変化させその変化の度 合の差異から白血球を 3つの母集団に分類する方法が上記 D C 法を用いて実現されており特表昭 60 - 500Q97号公報および米国 特許第 4485175号に開示されている。
    [0027] この方法においては、 細胞溶解剤として前述の日本特許第 936823号にも記載されている第 4級アンモニゥム塩が使用され、 それを低濃度で用いることにより白血球に容積変化を生じさせ、 その差異から白血球を 3つの母集団に分類している。 ただし、 - この米国特許第 4485175号に示される実施例の結果は第 17図に 示す如くであり、 必ずしも白血球の 3つの母集団のリンパ球， 単球， 顆粒球が完全に分離，識別されているわけではない。
    [0028] また、 上記第 4級アンモニゥム塩は、 低濃度においても血球 に与える作用は大きく、 短時間のうちに溶血現象を生ずるため、 日本特許第 936823号に説明されているような、 血球の内容物を 入れ換えたり破壊せずに誘電率のみを変化させるようなことが 果して可能であつたか否か、 特許第 936823号にはデータが示さ れていないため不明である。
    [0029] さらに、 特表昭 61 - 502277号公報および国際公開番号 W085/ 0568 には、 白血球の分類 ·計数を行う場合、 第 4級アンモニ ゥム塩が白血球に大きな損傷を与えすぎるので、 むしろ緩慢に 作用するサポニンを高濃度で加え、 赤血球が溶解した時点で、 溶解作用を停止させ、 しかる後に、 フローサイ トメーター、 ま たは R F法と D C法を組み合わせた方法で分析する方法が記載 されている。
    [0030] この方法においては、 溶解作用を停止させるための固定剤を 必要とするが、 これを所定のタイミングで加えた後、 高温で細 胞を加熱するといつた特別の処理を必要とするので、 自動分析 装置においては、 あまり有効な方法ではない。
    [0031] 上述の様に、 フローシステムを利用して白血球を自動的に分 類 ·計数する方法のうち、 フローサイ トメーターを用いた第 2 の方法には装置が複雑で高価なものとなるという問題点がある。 また血球が細孔を通過したときの細孔部のィンビーダンス変化 を検出し、 検出信号の大きさによって白血球を分類する第 1の 方法には、 緩慢に白血球を変化させる場合には、 前処理に時間 がかかること、 または、 特別な固定剤を所定のタイミ ングで加 えるか、 もしくは加熱処理を必要とすること、 逆に強く白血球 を変化させる場合には、 白血球に大きな損傷を与えすぎ、 白血 球をせいぜい 3分類しかできない等の問題点があり、 実用上満 足される方法は得られていなかった。 また、 上記第 1の方法を 利用して前述の芽球等の異常細胞を分類♦計数できる技術は、 これまでに存在しなかった。
    [0032] さらに、 第 1の方法に使用される細胞溶解剤として、 サポ ニンは溶血力が不安定であり、 第 4級ァンモニゥム塩では上述 の様に強すぎる。
    [0033] 本発明の方法は、 細胞溶解剤としてサポニンもしくは第 4級 アンモニゥム塩を使用せず、 溶血力の安定した細胞溶解剤を使 用して赤血球を溶血させ、 かつ、 白血球を短時間に損傷させ、 上述の D C法と R F法とを組み合わせて分析することにより、 白血球分類において、 正常細胞の 5分類および異常細胞の分類 など従来得られなかつた飛躍的効果を提供するものである。 発明の開示
    [0034] 本発明は上記従来方法の問題点を克服し、 飛躍的効果を実現 するために、 下記の如き白血球分類用試薬及び白血球分類方法 を提供するものである。
    [0035] (1) 赤血球を溶解し、 白血球に作用して白血球を分類♦計数 可能とすることを特徵とする白血球分類用試薬であって： (a) 一般式
    [0036] RL - 9 一 (C Ho CH9 0) n -X 〔ここで、 は炭素数 10〜22のアルキルまたはアルケニル またはアルキニル基 ； R2 は 0， —または
    [0037] C00 ； nは 8〜30の整数； Xは S 0。 Na , COONa , O S O Na または ONa〕
    [0038] で表されるポリォキシエチレン系ァニォン界面活性剤である 第 1グループの界面活性剤
    [0039] および (b) —般式
    [0040] Rl _ R2 一 （CH2 C H2 0) n -H
    [0041] 〔ここで、 は炭素数 10〜22のアルキルまたはアルケニル またはアルキニル基 ； R2 は 0, —または
    [0042] C00 ； nは 8〜30の整数〕
    [0043] . で表されるポリオキシェチレン系ノニォン界面活性剤である 第 2グループの界面活性剤
    [0044] からなる群から選ばれる少なくとも 1種の界面活性剤を含有す る試薬。 '
    [0045] (2) 下記（a), (b)の 2液からなる白血球分類用試薬：
    [0046] • (a) 血液希釈剤であり、 高浸透圧化剤を含有する第 1液 ' および
    [0047] (b) 上記（1) に記載の試薬を含有する、 第 1液により希釈さ れた血液試料に添加される第 2液。
    [0048] (3) 第 1液にも界面活性剤を含有する上記（2) に記載の試薬。
    [0049] (4) 高浸透圧化剤を含有する上記（1〉 に記載の試薬。
    [0050] (5) 上記（1) ないし（4) のいずれかに記載の試薬に、 白血球 中の単球の大きさを選択的に小さくする可溶化剤を含有する試 薬。
    [0051] (6) 含有する可溶化剤が下記 5つのグループからなる群から 選ばれる少なくとも 1種のものである上記（5) に記載の試薬。
    [0052] 第 1グループの可溶化剤 （尿素系） ：
    [0053] 尿 素 チォ尿素
    [0054] 1,1 - ジメチルゥレア エチレン尿素 メチルウレタン 1,3 -ジメチル尿素 ウレタン （H„ NCOOC2 He )
    [0055] 第 2グループの可溶化剤：
    [0056] n -ォクチル - D -ダルコシド
    [0057] C H A P S (3 - C (3 - クロルァミ ドプロピル）
    [0058] ジメチルアン乇ニォ〕 - 1 -プロパンスルホネート） CHAP S 0 (3 - 〔 （3 -クロルァミ ドプロピル）
    [0059] ジメチルアンモニォ〕 - 2 - ヒ ドラキシ - 1 - . プロパンスルホネート）
    [0060] MEGA8, , 10 (ォクタノィル - , ノナノィル -また はデカノィル - N -メチルダルカミ ド）
    [0061] . シユークロースモノ力プレート '
    [0062] N -ホルミルメチル口イシルァラニン- 第 3グル: "プの可溶化剤 （グァ二ジン類） ：
    [0063] ヂォシアン酸グァニジン グァニルグァ二ジン
    [0064] グァニジン塩酸塩 グァニジンロダン塩
    [0065] グァニジン硝酸塩 1,1,3,3 -テトラグァニジン グァニジン炭酸塩
    [0066] グァニジンリン酸塩
    [0067] グァニジン硫酸塩
    [0068] 第 4グループの可溶化剤 （胆汁酸塩） ·.
    [0069] デォキシコ一ル酸ナトリウム
    [0070] タウロコール酸
    [0071] コ ー ル 酸 第 5グループの可溶化剤 （ハロゲン置換酢酸） ：
    [0072] トリクロ口酢酸ナトリウム
    [0073] ト リプロモ酢酸ナトリウム
    [0074] ジク 口口酢酸ナ ト リ ウム
    [0075] ジブロモ酢酸ナ ト リ ウム
    [0076] モノクロ口酢酸ナトリウム
    [0077] モノプロモ酢酸ナトリゥム
    [0078] (7) 上記（1) 〜（6) 項のいずれかに記載の試薬を使用し、 R F法および D C法なる粒子分析方法により白血球をリンパ球、 単球、 顆粒球に 3分類する方法。
    [0079] (8) 上記（7) 項に記載の方法により白血球をリ ンパ球、 単球、 顆粒球に 3分類し、 3分類用に使用された測定用試料中に所定 時間後特異的'に残る好酸球を R F法および D C法、 あるいは D C法のみにより計数することにより、 白血球をリ ンパ球、 単 球、 好酸球、 好酸球以外の顆粒球に 4分類する方法。
    [0080] (9) 上記（7) 項に記載の方法により白血球をリ ンパ球、 単球、 顆粒球に 3分類し、 一方、 上記（1〉 〜（6) 項のいずれかに記載 の試薬を使用することにより特異的に残された好酸球を R F法 および D C法、 あるいは D C法のみにより計数することにより、 白血球をリンパ球、 単球、 好酸球、 好酸球以外の顆粒球に 4分 類する方法。
    [0081] (10) 上記（δ) または（9) 項に記載の方法により白血球をリ ン パ球、 単球、 好酸球、 好酸球以外の顆粒球に 4分類し、 一方、 好塩基球を特異的に残す好塩基球測定用試薬を使用し、 好塩基 球を R F法および D C法、 あるいは D C法のみにより計数する ことにより、 白血球をリンパ球、 単球、 好酸球、 好塩基球、 好 中球に 5分類する方法。
    [0082] (11) 上記（1) 〜（6) 項のいずれかに記載の試薬を使用し、 R F法および D C法なる粒子分析方法により異¾細胞を検出す る方法。
    [0083] (12) 上記（1) 〜（6) 項のいずれかに記載の試薬を使用し、 R F法および D C法なる粒子分析方法により白血球をリンパ球、 単球、 顆粒球に 3分類し、 かつ、 異常細胞を検出する方法。
    [0084] (13) 第 2グループの可溶化剤：
    [0085] n -ォクチル β - D -ダルコシド
    [0086] C H A P S (3 - 〔 （3 - クロルアミ ドプロピル）
    [0087] ジメチルアンモニォ〕 - 1 -プロパンスルホネート） CHAP S O (3 - 〔 （3 -クロルアミ ドプロヒ。ル）
    [0088] ジメチルアンモニォ〕 - 2 - ヒドラキシ - 1 - .
    [0089] プロパンスルホネート）
    [0090] MEGA8, 9, 10 (ォクタノィル -， ノナノィル-また はデカノィル - N -メチルダルカミ ド）
    [0091] シユークロースモノ力プレート
    [0092] N -ホルミルメチル口イシルァラニン
    [0093] の内の少なくとも 1つを含有する試薬を用いて白血球を分類す る方法。
    [0094] 本発明の白血球分類用試薬の使用により、 血液中の赤血球は 溶解され、 各白血球種は個々に損傷を受ける。 このように処理 された試料を RF法および D C法を組み合わせた方法で'測定す ると、 各白血球が受ける損傷の度合による細胞の体積変化のス ピードの差異により白血球はリンパ球， 単球， 顆粒球の 3つの 集団に分離される。 本発明では R F法および D C法により二次 元の情報が得られることと、 本発明の試薬に特徴的作用がある ことにより、 第 4級アンモニゥム塩を細胞溶解剤として使用し、 D C法のみにより白血球を 3分類する米国特許第 4485175 号の 方法よりも、 すぐれた白血球 3分類が得られる。
    [0095] さらに、 本発明の白血球分類用試薬を使用し、 R F法と D C 法を組み合わせた方法で測定すると、 各白血球が受ける損傷度 合による細胞の体積変化のスピードの差異により白血球はリン パ球， 単球， 好酸球， 好酸球以外の顆粒球の 4つの集団に分離 される。 この場合、 R F法と D C法との組み合わせの方法には 種々ある力 <、 たとえば、 まず: R F法および D C法により白血球 をリ ンパ球， 単球， 顆粒球へ 3分類したのち、 所定時間後に特 異的に残る好酸球を R F法および D C法により、 または D C法 のみにより計数する方法は一つの効果的方法である。
    [0096] さらに、 上述のように白血球を 4分類し、 一方で、 好塩基球 測定用試薬を使用して好塩基球を特異的に残し、 この試料を R F法および D C法により、 または D C法のみにより測定する ことにより、 好塩基球数を計数する。 以上の結果、 好酸球数と 好塩基球数が算出されるので、 顆粒球中の残りの好中球数は、 顆粒球数から好酸球数と好塩基球数を引算することにより求め られる。 以上のようにして、 白血球中のリンパ球， 単球， 好中 球， 好酸球， 好塩基球の各個数および比率が確定され白血球の 5分類ができる。
    [0097] 本発明の方法は、 特表昭 61 - 502277号公報の方法のような不 安定な溶解剤サポニンを使用する必要もなく、 特別な固定剤に よる処理.や高温での加熱処理も不要であり、 特に自動分析装置 に使用する上で有利な方法である。
    [0098] 次に本発明の白血球分類用試薬の特徵的作用について述べる。 本発明の試薬に含有される第 1グループの界面活性剤はァニ オン系界面活性剤であり、 第 2グループの界面活性剤はノニ オン系界面活性剤である。 ァニオン系およびノニオン系界面活 性剤はともに一般的用途においては、 洗浄剤， 乳化剤， 分散剤， 浸透剤として繊維， ランドリ， 合成樹脂， 印刷インク， 金属， 写真， 食品， および医薬などの各工業分野で広く利用されてい る o
    [0099] これに対し、 米国特許第 4488175号の方法等に細胞溶解剤と して使用される第 4級アンモニゥム塩は、 カチオン系界面活性 剤である。 カチオン系界面活性剤は一般的用途においては、 界 面活性にもとづく湿潤性， 洗浄性， 表面張力低下能などの性質 が直接応用されることは少く、 主として殺菌剤， 消毒剤， 防水 剤， 柔軟剤， 帯電防止剤， 固着剤などとして、 繊維， ゴム， プ ラスチック， 医薬， 土木， 窯業, および石油などの工業分野に 広く使用されている。
    [0100] また、 細胞溶解剤として従来から頻繁に使用されてきたサボ ニンは、 上述のァニオン系、 ノニオン系およびカチオン系の 合成界面活性剤とは異り植物由来の天然化学物質であり、 製造 ロッ トによって、 その化学構造や化学的性質が変動する物質で ある o
    [0101] このように、 これら細胞溶解剤は化学的性質や由来が違うた - 1 1 - め、 白血球に対する作用も自ずから異る。
    [0102] 上述の細胞溶解剤の中で、 最も緩慢に細胞に作用するのはサ ポニンであり、 最も急激に細胞に損傷を与えるのは第 4級アン モニゥム塩である。 これに対し、 ァニオン系およびノニオン系 界面活性剤の細胞に対する作用の強さは、 サポニンと第 4級 ァンモニゥム塩の中間程度であると言える。
    [0103] 細胞に対する損傷の程度がたとえばリンパ球の大きさにより 比較すると第 1表のようになる。 ただし表中の数字は概略の値 を示す。 表 リ ンパ球の損傷 処 理 前 17Q〜250fj サ ボ 二 ン で 処 理 後 100〜120fj 本発明の界面活性剤で処理後 70〜80 U
    [0104] 第 4級アンモニゥム塩で処理後 50 このように、 第 4級ァンモニゥム塩は白血球に大きな損傷を 与えすぎるため、 白血球分類の目的に対しては、 好ましい溶解 剤とは言えない。 第 14図は第 4級ァンモニゥム塩を使用し、 R F法および D C法により白血球を測定した例を示すもので あるが、 白血球は複数の集団に分離されない。 これは、 第 4級 アンモニゥム塩により白血球が大きな損傷を受け、 細胞膜は 残るものの細胞質のほとんどが失なわれたため、 各白血球種か ら検出される信号強度の大小が、 R F法と D C法とで差が無く なったため、 二次元分布図上に分画されないものである。 このため、 R F法および C法を組み合わせた白血球分類方 法において細胞溶解剤として第 4級アンモニゥム塩を使用する ことは全く無意味なこととなる。 一方、 サポニンは緩慢に白血 球に作用するため、 前述のように前処理時間が長くかかるとい う問題がある上に、 溶血力も不安定である。
    [0105] 本発明に使用される第 1グループ、 第 2グループの界面活性 剤は、 第 4級アンモニゥム塩のようには激しく白血球を損傷せ ず、 また、 サポニンよりは白血球に強く作用し、 白血球を分類 する上で極めて好適な程度に各白血球に損傷を与えるものであ る。
    [0106] 第 9図は、 細胞溶解剤添加前の血液を R F法および D C法で 測定することにより、 白血球を分画した例を示している。 顆粒 球 aと単球 bとは良く分離できているが、 リンパ球 cと赤血球 iとが分離されない。 また、 この図は赤血球の同時通過の影響 を強く受けている。 したがって、 このままでは白血球を分類 · 計数することはできない。
    [0107] ところが、 細胞溶解剤添加前でも、 白血球のみを注意深く分 離した試料であれば R F法および D C法で測定することにより、 白血球をある程度分画することは可能である。 その分画例を第 10図に示す。
    [0108] 分画はパーコール♦ハイパック （Percol卜 Hypaque)を使用し た比重差遠心分離法により血液中の白血球を分離することによ り得られ、 これを測定した。 若干の赤血球は分離されずに試料 中に残っている。 第 10図に示すように細胞溶解剤を使用しなく ても顆粒球 a , 単球 b , リンパ球 cを分離できる事がわかる。 しかし、 上記のように白血球のみを分離する作棄は、 熟練者に とっても非常に困難で、 かつ、 時間を要することであり、 また、 自動化することのできないものである。 したがって実用的には、 やはり、 赤血球を溶解させ白血球のみを残す方法が採用される。 しかし、 赤血球を溶解するための細胞溶解剤を添加すると、 白 血球もその溶解剤の作用を受ける。 したがって、 赤血球溶解後 も、 顆粒球， 単球， リンパ球が良く分離されて二次元分布図上 に現われるようにする必要がある。 ここで白血球のみを分離す る作業に用いた血液と同一の血液に後述の実施例 2と同じ細胞 溶解剤を添加し、 添加後 14秒から 5秒間、 R F法と D C法で測 定した白血球を分類した例.を第 11図に示す。 ここでは第 10図と 同じスケールで示している。.溶解剤添加後白血球は全体に縮小 していることがわかる。 また、 単球の体積縮小スピードが特に 大きく D C信号強度において溶解剤添加前には顆粒球よりも大 きかった単球が添加後は顆粒球よりも小さくなつていること力 注目される。 後述の実施例 2にもとづく第 2図は第 11図よりも スケールを拡大して示してある。 第 10図と第 2図のスケールは D C , R F法ともに異なる。 すなわち、 溶解剤添加後は細胞が 縮小するので検出信号も小さくなる。 第 2図では図を見やすく するために検出信号をより大きく増幅している （以下の実施例 においても同じ） 。
    [0109] 本発明の方法は、 本発明の試薬により赤血球を溶解し各白血 球に損傷を与え、 その損傷度合による細胞の体積変化のスピー ドの差異により白血球を分類 ·計数するものである。 しかも本 発明では細胞溶解剤を使用しているので前述のような遠心分離 の必要はない。
    [0110] 以上、 本発明の試薬の作甩により白血球の正常細胞が分類♦ 計数可能となる点について述べてきたが、 驚くべきことに、 本 発明の試薬を使用して赤血球を溶解し、 白血球を D C法および R F法により測定すると、 上記白血球正常細胞に加えて、 各種 異常細胞が検出され、 分類♦計数できることを本発明者は見い 出した。 第 18図は各種異常細胞の出現位置を示す説明図である。 第 18図の分布図自体は健常人の血液を本発明の試薬を用いて測 定したとき得られたものであり、 図中の各点は正常細胞により 得られた測定点である。 各異常細胞集団が存在する場合には、 第 18図中、 実線で囲まれた各領域付近に出現する。 異常細胞の うち、 左方移動 （l eft shift);細胞集団は領域 jに、 未成熟顆 粒粒 （I G) は領域 に、 芽球は領域' に、 異型リンパ球は領 域 mに、 リンパ芽球は領域 nに、 有核赤血球は領域 oに、 血小 板凝集細胞は領域 pに、 ほぼ出現する。 好中球には分葉核球と 杆状核球とがあり、 幼若な細胞ほど核が分葉状ではなく、 杆状 となる。 白血球中に幼若な細胞すなわち杆状核球が増えること を左方移動とよんでいる。 左方移動細胞、 未成熟顆粒球、 芽球 は、 正常白血球の未成熟すなわち幼若な状態の細胞であり、 こ の順に幼若性が強い。 白血球の未成熟細胞ほどその比重が軽い とされており、 そのため、 R F法による信号強度が小さくなる。 したがって、 幼若性の一番強い芽球が図中の最下方に出現して いる。 また、 血小板凝集細胞は何らかの要因により血小板が凝 集して白血球に匹敵する大きさとなって出現するものであり、 この細胞を識別除去することが正確な白血球数を得る上で重要 である。
    [0111] D C法または R F法またはその組み合わせにより白血球の異 常細胞を分類 ·計数した従来技術は無い。 光学的測定原理によ り白血球の異常細胞を検出した例はある （特開昭 61 - 88896号 公報参照） が、 この光学的測定原理によれば前述の通り装置お よび手順が極めて複雑になる。 また、 上記公報の 載によれば、 好塩基球以外の白血球は全て裸核化されている。 したがって、 上記公報に記載の方法においては異常細胞および好塩基球を検 出することはできるが、 好塩基球以外の正常な白血球を分類す ることができなくなるため、 正常な白血球細胞を分類 ·計数す るためには別の測定チヤンネルを必要とするという不都合が生 ずる。 本発明の方法および試薬によって初めて白血球の正常細 胞ぉよび異常細胞が同時に分類♦計数可能となつた。
    [0112] なお、 ポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する試薬を 白血球分類の目的に使用した先行技術としては、 特開昭 54 - 228 91号公報および米国特許第 409917号に開示された方法また は特開昭 82 - 71857号公報 （対応欧州特許公開公報第 214613号） に開示された方法などがある。 これらの方法は何れも本明細書 の従来技術の項で述べたフローシステムを利用した方法の内の 第 2の方法に属し、 光学的測定装置を利用した方法であり、 本 発明の方法とは全く測定原理がことなるため、 上記公報に開示 された試薬がインピーダンス検出を原理とする本発明の方法に そのまま適用できないことは言うまでもない。 しかも、 本発明 者の実験によれば、 上記公報に開示されたポリオキシエチレン 系界面活性剤の内のいくつかは本発明の白血球分類方法に適さ ないばかりでなく、 赤血球を溶解する能力にも欠けることが 判明した。 むしろ、 ある種のポリオキシエチレン系界面活性剤 は、 赤血球を保護することが必須要件とされる血球計数装置用 シース液の組成物として利用されているほどである （特開昭 62 - 87233 号公報、 特願昭 62 - 261386号、 特願昭 62 - 261387号 参照） 。
    [0113] 上記より理解されるように、 ポリオキンエチレン系界面活性 剤の中にも赤 ώι球を溶解する作用を有しないものが多くあり、 特に、 本発明の白血球分類用試薬に含有させる組成物として適 するものは、 さらに限定される。
    [0114] 本発明者は、 ポリォキシエチレン系界面活性剤を含む多種の ァニオン系またはノニオン系界面活性剤をスクリ一二ングした 結果、 請求の範囲（1) に記載の第 1グループぉよび'第 2グルー プの界面活性剤が本発明の目的に適合することを見い出した。
    [0115] なお、 請求の範囲（1) に記載の一般式において、 R j^ の炭素 数が 10〜22であり、 n (付加モル数） が 8〜30であれば本発明 の目的を達することができる力^ 白血球を、 より良く分画する ためには、 R j^ の炭素数は 12〜18であり、 nは 12〜15であるこ とが好ましい。
    [0116] ところで、 上記請求の範囲（1) に記載の試薬 （以下、 溶解試 薬と呼ぶ） を使用して採血直後の新鮮血を測定した場合には、 リンパ球、 単球、 顆粒球が良好に分画される。 ところが血液、 特に異常血液を採血後数時間、 一例として 8時間取置すると、 第 12図に示すような二次元分布が得られるようになる。 第 12図 中に記された a , b， cの領域は、 採血直後の通常の血液を測 - - 定したときの顆粒球、 単球、 リンパ球のそれぞれの存在領域を 示している。 通常の単球の存在領域 bの細胞数が異常に増加し、 リンパ球 c、 単球 bの分画が悪くなり、 顆粒球 aの個数が減少 する。 これは、 採血後の時間経過により、 異常血液の場合、 白 血球細胞が脆弱化し、 添加する溶解試薬の作用を強く受けるよ うになり、 顆粒球、 特に好中球の内の一部の細胞が採血直後よ りも速く体積縮小するようになったためである。 また、 血液に 対していきなり溶解試薬が作用するため、 個々の血球に対して 溶解試薬が均一に作用せず （溶解試薬液中に血球が均一に分散 しない） 一部の血球にのみ先行して溶解試薬が強く作用するこ とも一因になっている。
    [0117] そこで、 溶解試薬の添加前に、 血球を均一に分散させるため の一般的希釈液により血液を薄めることだけでも、 上記問題点 はある程度解決する。 し力、し、 本発明者は採血後数時間ないし 数十時間放置した場合にも、 根本的に安定して白血球が分類♦ 計数できる試薬を考え出した。 それが、 請求の範囲 （2)〜（6) に記載の試薬である。
    [0118] 請求の範囲（2〉 に記載の試薬は、 2液で構成される。 第 1液 は、 いわゆる希釈液であり、 高浸透圧化剤を含有する。 第 2液 は、 請求の範囲（1) に記載の溶解試薬である。 まず、 第 1液で ある希釈液で血液を薄め、 かつ、 血球を均一に分散させたのち、 第 2液である溶解試薬を添加し、 赤血球を溶解させ、 かつ、 白 血球を分類♦計数可能とする。
    [0119] 第 1液中に含有される高浸透圧化剤により、 第 1液の浸透圧 は 285mOsin 以上に調整される。 白血球測定用溶液をこのように 高張液 （高浸透圧液） とした方法は、 前記特開昭 62 - 71857号 公報に記戴されているが、 前述の通りこの公報は光学的測定原 理を採用しているため、 この公報における高張液の作用， 効果 と本発明で第 1液を高張液としたことによる作用， 効果とは全 く異なる。 上記公報には高張液の血球に及ぼす作用によりリン パ球が円鋸歯状血液細胞になることにより、 リンパ球とノイズ との検出信号の弁別が改善されることが記載されている。 円鋸 歯状血液細胞になることにより、 何故ノイズとの弁別が改善さ れるのか、 この公報にはそれ以上の記載がな 、ため不明である が、 光学的測定原理と密接に関連した理由があるのであろう。
    [0120] 本発明のインピーダンス測定原理においては、 D C法もしくは R F法により、 細胞の大きさもしくは内部情報を検出しており、 細胞の外形がどのように変形されようと基本的には検出信号の + 強度に影響が及ばな 、。 本発明において第 1液を高浸透圧にし たことの目的は、 血球を高浸透圧下におくことにより、 血球の 細胞膜を脱水状態とし、膜を固くすることにより、 後に第 2液 である溶解試薬を添加したときに膜が急激なショックを受けな いように細胞膜を保護することにある。 血球を高浸透圧下にお くと、 このように細胞膜が保護される一方で、 細胞膜の収縮が 引き起こされるので、 血球の体積縮小が起こる。 インピーダン ス検出原理においては前述の通り細胞の大きさ情報を検出する ので、 血球の過度の体積縮小が起こったときには、 ノイズとの 弁別が困難となる。 そのため、 インピーダンス検出原理におい ては、 一般的には血球を高浸透圧下におくことは避けられてき た。 ところ力 予期に反して、 第 1液により血球を高浸透圧下 - - においたのち、 第 2液である溶解試薬を作用させた場合であつ ても、 最初から血液に溶解試薬を作用させた場合と同等に、 白 血球信号とノイズとが弁別されることがわかった。 これは、 第 1液の作用によつて白血球細胞膜が保護されたことによるもの であろう。 このように、 2液構成とし、 第 1液を高浸透圧液と することにより、 白血球細胞を第 2液である溶解試薬による過 激なショックから保護し、 なおかつ、 白血球信号とノイズとの 弁別を確保することが可能となった。 このことによって、 数十 時間放置した血液を測定した場合にも、 前記二次元分布図にお いて好中球が単球領域に入り込む現象を引き起こすことなく、 安定して白血球を分類 ·計数できるようになった。 第 12図と同 —の血液を、 同じく血液採取後 8時間放置後に上記 2液構成の 試薬で測定した例を第 13図に示す。 顆粒球 a、 単球 b、 リンパ 球 cがきれいに分画されており、 単球領域における細胞数の異 常な増加も認められない。 なお、 第 1液の浸透圧は約 285niOsni 以上であることが要求される。 それより低い浸透圧では白血球 膜が充分には保護されない。 高浸透圧化剤としてはエチレング リコール類、 アルコール類が好適に用いられる。
    [0121] ところで、 上述のように 2液構成とし、 第 1液を高浸透圧液 とすることが理想であるが、 一方、 2液構成とすることは分析 手順または分析装置の構成を複雑にするという点で好ましくな い。 そこで 1液の構成とし、 溶解試薬を高浸透圧液とした試薬 が考えられた （請求の範囲（4) に記載の試薬） 。 この試薬に よっても、 2液構成の試薬ほどには血球膜の保護作用が完全で はないが、 数十時間放置した血液を測定した場合にも、 前記 二次元分布図において好中球が単球領域に入り込む現象を引き 起こすことなく、 実用的レベルで安定して白血球を分類♦計数 できることが確認された。
    [0122] 上記 2液構成であれ、 1液構成であれ、 高浸透圧液に固 定 ¾0を含有させると、 さらに効果的である。 この固定剤は、 上 記高浸透圧液の白血球細胞膜保護作用を補助する作用をする。 なお、 白血球分類において固定剤を含有する試薬を用いた先行 技術には、 前記、 特開昭 54 - 22891 号公報、 特開昭 62 - 71857 号公報、 特表昭 61 - 502277号公報の他に、 米国特許第 3741875 号に記載された方法がある。 上記いずれの先行技術においても 固定剤添加後、 溶液を加熱処理する必要がある。 ところが、 本 発明においては固定剤を含有する試薬を添加後も加熱処理する 必要がない。 これは上記いずれの先行技術においても固定剤が 反応試薬の作用の中の重要な役割を担っているため、 加熱処理 によつて固定剤の反応を特に促進する必要があるのに対して、 本発明試薬におげる固定剤の役割は捕助的であるために、 あえ て加熱処理をして反応を促進させる必要がないためである。 加 熱処理を必要としない点は分析方法または分析装置を簡単化す る上で大きなメリッ トとなる。
    [0123] また、 本発明において、 請求の範囲（6) に記載の 5つのグ ループからなる群から選ばれる少なくとも 1種の可溶化剤を含 有させることも、 白血球の分類精度を向上させる上で効果的で ある。 可溶化剤は、 一般的には、 水に難溶または不溶の物質を その溶解度以上に見掛け上溶かす働きをするものであり、 工業 分野、 生物学分野に広く応用されている。 医学の分野において - - はビタミン類ゃホルモンなどを水溶性の医薬にするためにこの 可溶化剤が用いられている。 し力、し、 本発明における可溶化剤 の作用は、 上記一般的働きとは異なる。 白血球中の単球はもと もと界面活性剤を含有する溶解試薬との反応性が強く、 溶解試 薬添加後の体積縮小のスピードが最も速い細胞であるが、 溶解 試薬中に又は溶解試薬に先行して用いられる希釈液中に可溶化 剤を含有させると、 可溶化剤の作用により溶解試薬の単球に対 する作用が促進され、 単球が一段と速く体積縮小することを、 本発明者は見い出した。 すなわち、 本発明における可溶化剤の 作用は単球に対して選択的である。 また、 単球に対して選択的 に作用するこのような可溶化剤は、 前述の第 1グループおよび 第 2グループの界面活性剤の群から選ばれた、 本発明に特徴的 な、 界面活性剤を含有する試薬に対してばかりでなく、 先行- 技術から知り得るあらゆる白血球分類用試薬に対しても有効で あることが判った。 なかでも、 請求の範囲（6〉 に記載の第 2グ ループの可溶化剤が有効である。
    [0124] ところで、 前述の 2液構成の試薬の内の第 1液 （高浸透圧液 とした希釈液） にも界面活性剤を含有させることができる （請 求の範囲（3) に記載の試薬） 。 この場合の界面活性剤としては 請求の範囲（1) に記載の第 1グループおよび第 2グループの界 面活性剤から選ばれたものであってもよく、 また他の一般的界 面活性剤であつてもよい。 この第 1液中に含有された界面活性 剤の主たる作用は、 血球に対する溶解作用ではなく、 前述の可 溶化剤の作用に近い。 すなわち、 第 1液の浸透圧が高いため、 界面活性剤の溶解作用は弱められており、 後に続く溶解試薬の - - 添加によって引き起こされる血球の溶解作用の中でも特に単球 の収縮を促進するための予備処理を第 1液中の界面活性剤は 行っていると解される。 したがって、 第 2液中の界面活性剤の 方が第 1液中の界面活性剤よりも実質的に強い細胞溶解作用を 有することが要求される。 さもなければ、 第 2液の添加後も血 球細胞の溶解反応が進まないことになる。 なお、 上記条件は、 たとえば、 第 1液および第 2液に含有される界面活性剤がそれ ぞれ同種で且つ同濃度であつても、 第 1液の方が高浸透圧であ れば満足される。
    [0125] 上記本発明の全ての試薬【こは、 溶液を所定 pHに調整するため の緩衝剤が含有される。 所定 pHよりも低い pHでは、 溶解反応が 遅くなり、 実用的に要求される時間までに白血球が分類可能状 態にならない。 逆に、 所定 pH^:りも高い pHでは.、 溶解反応が促 進されすぎるため、 安定した状態での白血球分類が困難となる c また、 本発明に特徵的なことではないが、 本発明の全ての試 薬には、 一般的な、 酸化防止剤、 電気伝導度調整剤を必要に応 じて含有させることができる。
    [0126] 図面の簡単な説明
    [0127] 添付した図面は次のように説明される。
    [0128] 第 1図は実施例 1における白血球の分類を示す二次元分布図 である。 この 次元分布図の横軸は D C法で測定したときの相 対信号強度を表わし、 縦軸は R F法により測定したときの相対 信号強度を表わす。 第 1図中の各点は、 それぞれの D C信号強 度と R F信号強度を示した各細胞に対応している。 第 1図 D C および R Fは各々 D C信号強度と R F信号強度を示す。 第 2図は実施例 2における白血球の分類を示す二次元分布図 であって、 図中の説明は第 1図と同じである。
    [0129] 第 3図は、 溶解剤添加後 90秒放置した以外は第 2図の場合と 同様に白血球を分類した二次元分布図である。
    [0130] 第 4図は、 実施例 2において第 3図の場合と同条件で行なわ れた D C法のみによる白血球の分類を示すグラフである。
    [0131] 第 5図は、 実施例 4において、 好塩基球測定用試薬を使用し、 R F法と D C法を組み合せて行なつた白血球の分類を示す二次 元分布図である。
    [0132] 第 6図は実施例 4において D C法のみで行なった白血球の分 類を示すグラフである。
    [0133] 第 7図は， 実施例 5における白血球の分類を示す二次元分布 図である。
    [0134] 第 8図は、 実施例 6における白血球の分類を示す二次元分布 図である。
    [0135] 第 9図は、 細胞溶解剤を添加せずに血液を希釈した試料を R F法および D C法により測定したときの二次元分布図である。 第 10図は、 細胞溶解剤を添加せずに白血球のみを分離した試 料を R F法および D C法により測定したときの二次元分布図で ある。
    [0136] 第 11図は、 実施例 2で使用したものと同じ細胞溶解剤を血液 に添加して R F法および D C法により測定したときの二次元分 布図である。 第 11図のスケールは、 第 9および 10図のスケール と同じである。 第 2図のスケールは、 第 11図のスケールを拡大 している。 - - 第 12図は、 採血後 8時間放置した血液に高浸透圧化剤を含有 しない試薬を添加して R F法および D C法により測定したとき の二次元分布図である。
    [0137] 第 IS図は、 採血後 8時間放置した血液に高浸透圧化剤を含有 した試薬を添加して R F法および D C法により測定したときの 二次元分布図である。
    [0138] 第 14図は細胞溶解剤として第 4級アンモニゥム塩を使用し、 R F法と D C法によって行なつた白血球の分類を示す二次元分 布図である。 - 第 15図は溶解した赤血球の膜 （ゴースト） やノイズ信号の大 きさに比べて、 白血球による信号の大きさが充分に大きいこと を確認するための累積粒度分布曲線である。 図中、 横軸は自動 血球計数器の信号閾値であり、 縦軸は該信号閾値以上の検出信 号数である。 第 15図中、 Aおよび Bは累積粒度分布曲線におけ る ¾a部である。 - 第 16図は第 15図の累積粒度分布曲線から閾値レベルごとの白 血球数を算出して描いた粒度分布曲線である。 図中、 Cは赤血 球のゴーストおよびノイズの集団であり、 Dは白血球の第 1の 集団、 Eは白血球の第 2の集団である。
    [0139] 第 17図は、 米国特許第 4485175 号の実施例に記載の D C法に よる白血球粒度分布曲線である。
    [0140] 第 18図は各種異常細胞の二次元分布図上の出現位置を示す説 明図である。
    [0141] 第 19図は、 急性リンパ球性白血病 （A L L ) 患者の血液を測 定した場合の二次元分布図である。 - 3 第 20図は、 成人 T細胞白血病 （A T L ) 患者の血液を測定し た場合の二次元分布図である。
    [0142] 第 21, 22図は、 急性骨髄性白血病 （A M L ) 患者の血液を測 定した場合の二次元分布図である。
    [0143] 第 23図は、 一検体中に左方移動 jおよび異型リンパ球 mが出 現した場合の二次元分布図である。
    [0144] 第 24, 25図は、 未成熟顆粒球 kが出現した場合の二次元分布 図である。
    [0145] なお、 第 1ないし 14図における符号 aないし iは次の意味を 有する ：
    [0146] a ：顆粒球 b 単 球
    [0147] c ： リンパ球 d 好酸球
    [0148] e ：好: 基球 f 赤血球ゴースト
    [0149] ：好酸球以外の白血球 h 好塩基球以外の白血球
    [0150] i ：赤血球
    [0151] 第 18ないし 25図における符号 jないし Pは次の意味を有する 1 j ：左方移動（l eft shift) k ：未成熟顆粒球 （ I G )
    [0152] 1 ：芽 球 m ：異型リンパ球
    [0153] n ： リンパ芽球 o ：有核赤血球
    [0154] P ：血小板凝集
    [0155] また、 第 2〜14， 18〜25図における R Fおよび D Cについて の説明は、 第 1図における説明と同じである。
    [0156] 発明を実施するための最良の形態
    [0157] 実施例 1
    [0158] 細胞溶解剤と して第 1 グループの界面活性剤の 1種で あるサンデッ ト E N (三洋化成工業線の商品名、 化学式 C 2H25— 0— (CH2 GH2 O) 2 S Og N a) を使用した 例を示す。
    [0159] 濃度 0.125%のこの細胞溶解剤 5 mlおよび 1Z60Mリン酸緩 衝剤と濃度 0.6%の塩化ナトリゥムとからなる希釈液 10mlで血 液 を希釈し、 PH7.Q 、 浸透圧 120ffl0sni 、 液温 26 の条件下 で、 細胞溶解剤添加後 14秒から測定を開始し、 5秒間白血球を 測定した結果を第 1図に示す。 この二次元分布図の横軸は D C 法で測定したときの相対信号強度を表わし、 第 1図の縦軸は RF法により測定したときの相対信号強度を表わす。 第 1図中 の各点は、 それぞれの DC信号強度と RF信号強度を示した各 細胞に対応している。
    [0160] 第 1図に示されるように、 白血球はリンパ球、 単球、 顆粒球 と推定される集団に分画される。 このように RF法と D C法を 組み合わせて測定し、 二次元分布図を描いているため、 第 17図 に示す D C法のみを用いた従来の白血球三分類測定結果よりも、 より良く白血球が分画されている。
    [0161] 実施例 2
    [0162] 細胞溶解剤として第 2グループの界面活性剤の中から濃 度 4.0%のェマルミ ン 140 〔三洋化成工業線の商品名、 C18H37-0- (CH2 CH2 0) 14Hを 56%、
    [0163] C16H33-0- (CH2 CH2 0) Hを S4%、
    [0164] C14H29— O— (CH2 CH2 0) UHを 7 %含有する。 〕 および濃度 0.5%のェマルゲン 420 〔花王線の商品名、 C18H37— 0— (CH2 CH2 O) pH) を使用し、 他は実施 例 1と同一の条件で測定した結果を第 2図に示す。
    [0165] 実施例 1と同様に白血球は 3つの集団に分離された。 各集団 がそれぞれリンパ球、 単球、 顆粒球であることは、 それぞれの 白血球種を分離した試料を測定すること、 および視算法との相 関試験により確認された。
    [0166] 第 2図を第 1図と比較すると、 顆粒球に対する単球の出現位 置が異つていることがわかる。 これは溶解剤の種類および濃度 によって各白血球の体積変化のスピードが異るためである。 第 2図では、 単球が損傷を受けるスピードが他の白血球に比して 特に大きいため、 本来、 顆粒球よりも大きい単球が顆粒球より も小さい （D C信号強度の小さい） 位置に出現している。
    [0167] さらに、 上記細胞溶解剤を使用した以外は実施例 1と同様に 調製された血液含有希釈液を、 溶解剤添加後 90秒まで放置し、 その後 5秒間測定した結果を第 3図に示す。 このようにすると 好酸球のみが特異的に残り、 他の白血球から分離して検出され ることを見出した。 これは、 この溶解剤に対して好酸球の膜が 強いことに起因しているものと説明される。 また、 同条件で D C法のみで測定した場合でも、 第 4図に示す結果が得られ、 他の白血球から好酸球が充分に分離されることが示された。
    [0168] 実施例 3
    [0169] pHを 10.0とし、 他の条件は実施例 2と同一として、 溶解剤添 加後 13秒から 5秒間測定した。 この場合にも、 実施例 2と同様 に好酸球のみが特異的に分離されることが示された。
    [0170] 以上の: 3つの実施例において、 細胞溶解剤の濃度は 0.125お よび 4.5%であったが、 0. 01〜15%好ましくは 0. 05〜10%の濃 - - 度範囲であれば同様の結果が得られる。 pHは 7.0 または 10.0で あつたが、 4。0〜12 好ましくは 7.0〜10.0の範囲であれば 良い。 浸透圧は 120inOsffl であったが、 50〜400fflOsm 、 好ましく . は 100〜200fflOsni の範囲であれば良い。 液温は 26。Cであったが、 10〜37での温度範囲であれば同様に測定可能である。 ただし、 温度によつて溶解剤添加後の測定開始時間を変更する必要があ る場合がある。
    [0171] また、 希釈液中の緩衝剤等の組成および濃度は、 上記実施例 に何ら限定されるものではない。 さらに、 上記実施例では、 細 胞溶解剤と希釈液とは別の液としたが、 両者を最初から一体と して一つの溶解液として用意しても良い。
    [0172] 実施例 4
    [0173] 以上三つの実施例においては、 顆粒球中の好塩基球は分離さ れていない。 好塩基球を分離し計数するためには、 たとえば以 下の様にする。
    [0174] 濃度 1.44%のェマルゲン 123 - P 〔花王線の商品名、 化学式 (C1 H25-0- (CH2 CH2 0) 23H] 、 濃度 0.435%の o -フタル酸 カリウム、 濃度 0.025%の塩酸、 濃度 0.025% の硝酸を含有する好塩基球測定用試薬 10mlで血液 80 を希釈し、 PH3.0 、 浸透圧 60m0sffl、 液温 33°Cの条件下にて、 溶解剤添加後 13秒から 5秒間測定する。
    [0175] R F法と D C法を組み合わせて測定した結果を第 5図に示す。 また、 D C法のみで測定した結果を第 6図に示す。 いずれにし ても、 好塩基球のみが特異的に残り、 他の白血球から識別され て測定される。 これは、 この溶解剤によって好塩基球以外の白 血球が全て裸核化され、 好塩基球のみが残つたためである。 なお、 上記好塩基球測定用試薬において、 界面活性剤は ェマルゲン 123 - Pに限られることなく、 一般式
    [0176] - 0 - ( C H 2 C H 2 0 ) n Hで表わされるノニオン系界面 活性剤であれば良い。 ただし、 Rは炭素数 10〜20 (好ましくは 12〜： L8) のアルキル基、 nは 6〜； L00 (好ましくは 15〜40) であ る。 また、 塩酸および硝酸は pHを約 3. 0 に調整するものであり、 塩酸、 硝酸および酢酸のグループの中から少くとも一つを選ん でも良い。 浸透圧は 10〜400 (好ましくは 20〜； L00)の範囲であれ ば良い。 液温は 10〜4(TCの範囲であれば良い。
    [0177] 以上の様にして、 好塩基球を分類 ·計数し、 実施例 3の方法 で、 リ ンパ球、 単球、 顆粒球および顆粒球の中の好酸球を分 類 ·計数し、 顆粒球数から好酸球数および好塩基球数を引算 ύ て好中球数を算出することにより、 全白血球中のリンパ球、 単 球、 好中球、 好酸球、 好塩基球の個数および比率が求められる。
    [0178] 以上の方法により、 105検体の血液について測定し、 これを 1検体につき 500細胞を観察した場合の視算法と比べたときの、 5種の白血球比率についての相関係数を第 2表に示す。
    [0179] ^ 2 表
    [0180] リ ン パ 球 0.95
    [0181] 単 球 0.48
    [0182] 好 中 球 0.90
    [0183] 好 酸 球 0.95
    [0184] 好 球 0.85 このように、 本実施例の方法は白血球を分類 ·計数する方法 の現在のところ基準となっている視算法と良好な相関を示して おり、 本発明の方法により充分に白血球が 5種類に分類，計数 されることが示された。 本実施例の結果は、 血球が細孔を通過 するときのインピーダンス変化を電気的に検出する方法におい ては、 はじめて白血球を 5種類に分類 ·識別することが可能と なったことを記す画期的なものである。
    [0185] 実施例 5
    [0186] 本発明の 2液構成の試薬の一組成例およびその試薬による測 定例を示す。
    [0187] 試薬組成
    [0188] 第 1 液 （希釈液）
    [0189] ◎緩衝 剤
    [0190] リ ン酸ニナトリウム （12水塩）
    [0191] N a H P 04 ♦ 12H2 0 9.0 g リン酸一ナトリウム （無水）
    [0192] N a H 2 P 0 4 3.0 g ◎酸化防止剤
    [0193] EDTA - 2 K 0.1 g ◎電気伝導度調整剤
    [0194] 塩化ナ ト リ ウ ム N a 0.16^： ◎可溶化剤
    [0195] CHAP S 0.4 g ◎高浸透圧化剤
    [0196] ェチレングリ コール 70.0 g ◎固 定 剤
    [0197] ホルマリ ン 50.0 g ◎水 （PH7.2 , 浸透圧 14QQiii0sin) 1000 ml 第 2 液 （溶解試薬）
    [0198] ◎緩 衝 剤 '
    [0199] リ ン酸ニナトリウム （12水塩）
    [0200] N a2 HP04 · 12H2 0 9.0 g リン酸一ナト リウム （無 水）
    [0201] N a H2 P 04 3.0 g ◎酸化防止剤
    [0202] EDTA - 2 K 0.1 s dj -メチォニン 1.0 g ◎固 定 剤
    [0203] ホ ル マ リ ン 30.0 g- ©ポリオキンエチレン系界面活性剤
    [0204] E - 212
    [0205] -H 0.5 g
    [0206] C18H35~ 0 ~ (C xi2 ∑12 0) 12 - -
    [0207] ◎水 （PH7.2 , 浸透圧 920mOsm) 1000 ml 採血後 4時間経過後の血液 と液温 26での第 1液 2 mlとを 混合後、 25秒間放置したのち、 液温 26ての第 2液 1 mlを加え 250 倍希釈試料とし、 第 2液添加後 60秒から 6秒間測定した結 果を第 7図に示す。 白血球は顆粒球 a、 単球 b、 リンパ球 cに 3分類されている。
    [0208] 実施例 6
    [0209] 本発明の 2液構成の試薬の他の一組成例およびその試薬によ る測定例を示す。
    [0210] 試薬組成
    [0211] 第 1 液 （希釈液）
    [0212] ◎緩 衝剤 .
    [0213] リン酸ニナトリウム （12水塩）
    [0214] リン酸一ナトリウム （無 水）
    [0215] N a H 2 P 04- 2.3 g ◎酸化防止剤
    [0216] E D T A - 2 K 0.1 g d -メチォニン 1.0 g 塩化ナ ト リ ウ ム N a 2.5 g ◎可溶化剤
    [0217] C H A P S 0.4 g ◎高浸透圧化剤
    [0218] ェチレングリコール 70. 0 g- エタノーノレ 100.0 g
    [0219] ◎固 定 剤
    [0220] . ホルマリ ン 100.0 g
    [0221] ©ポリォキシェチレン系界面活性剤
    [0222] E - 212
    [0223] C18H35"° (CHn C Ho O) 12-H 0.06g
    [0224] ◎水 1000 ml
    [0225] (PH7.4 , 浸透圧 3000fflOsin)
    [0226] 第 2 液 （溶解試薬）
    [0227] ◎緩 衝 剤
    [0228] リン酸ニナトリウム （12水塩）
    [0229] リ
    [0230] N a H2 P 04 1.5 g ◎酸化防止剤
    [0231] EDTA - 2K 0.1 g dQ -メチォニン 1.0 g
    [0232] ©電気伝導度調整剤
    [0233] 塩化ナ ト リ ウ ム N a Cj 2.3 g
    [0234] ◎固 定 剤
    [0235] ホルマリ ン 100.0 s
    [0236] ©ポリオキシエチレン系界面活性剤
    [0237] E - 212
    [0238] C H¾5-0- (CH2 C H2 0) 12 H
    [0239] ◎水 (PH7.2 , 浸透圧 1380iiiOsffl) 1000 ml 採血後 4時間経過後の血液 12 と液温 26°Cの第 1液 2 mlとを 混合後、 20秒間放置したのち、 液温 26 の第 2液 1 mlを加え 250 倍希釈試料とし、 第 2液添加後 40秒から 6秒間測定した結 果を第 8図に示す。 白血球は顆粒球 a、 単球 b、 リンパ球 cに 3分類されている。 .
    [0240] 白血球 3分類をこの実施例 6の方法で行い、 一方で、 好酸球 数の測定を実施例 3の方法で、 好塩基球の測定を実施例 4の方 法で行い、 第 2表と同様に 50検体の血液について視算法と比べ たときの、 相関係数を第 3表に示す。 第 3 表
    [0241] リ ン パ 球 0.98 単 球 0.83 好 中 球 0.95 好 酸 球 0.95 好 塩 基 球 0.81 第 3表に示された結果を第 2表の結果と比べると、 単球の相 関係数が著しく改善されていることがわかる。
    [0242] なお、 実施例 5， 6においては、 11は7.2 または 7.4 であつ たが、 pHは 6〜8の範囲であれば良い。
    [0243] 実施例 7
    [0244] 実施例 2に記載の試薬を用い、 白血球異常細胞を検出した例 を以下に示す。
    [0245] 第 19図は、 急性リンパ球性白血病 （A L L ) 患者の血液を測 定した例を示すものであり、 リンパ芽球 nが出現している。 こ のようにリンパ芽球の出現を検出することによりリンパ球性白 血病を見つけることができる。
    [0246] 第 20図は、 成人 T細胞白血病 （A T L ) 患者の血液を測定し た例を示すものであり、 異型リンパ球 mが出現している。 この ように異型リンパ球の出現を検出したときはリンパ球性の疾患 が疑われる。
    [0247] 第 21図は、 急性骨髄性白血病 （A M L ) 患者の血液を測定し た例を示すものであり、 芽球 £ が出現している。 このように芽 球の出現を検出することにより骨髄性白血病を見つけることが できる。
    [0248] . 第 22図は、 同じく、 急性骨髄性白血病 （A M L ) 患者の血液 を測定した例を示すものであり、 芽球 ί が顕著に出現している。 第 23図は、 一検体中に左方移動 jおよび異型リンパ球 mが出 現した例を示すものである。
    [0249] 第 24図は、 未成熟顆粒球 kが出現した例を示すものである。 第 25図は、 未成熟顆粒球 kおよび異型リンパ球 mが出現した 顕著な例を示すものである。
    [0250] 本発明の方法を具体的分析装置として実現する上では、 種々 の構成例が考えられる。
    [0251] 最も単純に考えられる方法は、 R F法の測定チャンネル （以 下 R Fチャンネルと呼ぶ） および D C法の測定チャンネル （以 下 D Cチャ ンネルと呼ぶ） を有した第 1の検出部と、 D C チャンネルのみを有した第 2の検出部と、 同じく D Cチャンネ ルのみを有した第 3の検出部を備え、 第 1の検出部において、 - - 白血球分類用試薬を使用して、 リンパ球、 単球、 顆粒球を分- 類 *計数し、 第 2の検出部において、 好塩基球測定用試薬を使 用して好塩基球数を計数し、 第 3の検出部において白血球分類 用試薬を使用して好酸球のみを残し、 好酸球数を計数し、 好中 球数を演算で求めるものである。 し力、し、 この方法では 3つの 検出部ごとに異る測定試料を作製しなければならず、 各々異る 細胞溶解剤または希釈液およびそれらの貯蔵タンク等を必要と するため、 装置が複雑で大きくなるという欠点がある。
    [0252] ― この点については、 たとえば実施例 2に述べた溶解剤を使 用すれば改善される。 すなわち、 R Fチャンネルおよび D C チャンネルを有した第 1の検出部と、 D Cチヤンネルのみを有 した第 2の検出部とを備え、 第 1の検出部において前述のよう にリンパ球、 単球、 顆粒球を分類 ·計数し、 続いて所定時間経 過し好酸球のみが特異的に残った時点で好酸球数を計数し、 筹 2の検出部においては前述のように好塩基球数のみを計数する 方法である。 この方法においては、 細胞溶解剤も 2種類で済み、 検出部も二つ備えるのみで良いから、 装置構成は、 はるかに簡 単となる。 し力、し、 好酸球が計数可能となるまでに、 所定時間 待つ必要があり、 多検体を短時間に連続的に測定する自動分析 装置には好ましくない。
    [0253] この点を解決するためには、 最初の方法と同じく D Cチャン ネルを有する第: 3の検出部を設けると良い。 そして、 第 1の検 出部で 3分類したのちその溶解液を第 3の検出部に移送し、 こ こで所定時間待機したのち、 好酸球を計数する。 その間、 第 1 の検出部においては次検体測定用の溶解液が作製され、 3分類 の測定が第 3の検出部の計数と並行して進められる。 このよう にすれば、 多検体を間断なく連続的に測定することが可能とな る o
    [0254] なお、 1検体あたりの処理時間を短縮することを、 さほど重 視しない場合には、 好酸球を測定するための第 3の検出部を設 けずに、 第 2の検出部における好塩基球の計数が完了したのち、 その液を排出し、 第 1の検出部で 3分類の測定が終了した溶解 液を D Cチヤンネルを有する第 2の検出部に移送し、 所定時間 待機後、 好酸球を計数する様にしても良い。
    [0255] なお、 白血球の異常細胞が出現した場合には、 上.記装置構成 例において 3分類用の検出部において検出される。 .
    [0256] ここには記載しないが、 その他にも種々の装置構成例が容易 に考えられる。 .
    [0257] 産業上の利用可能性
    [0258] 以上のように、 本発明にかかる白血球分類試薬および分類方 法は、 白血球を 3ないし 5分類し、 白血球の正常細胞および 異常細胞を同時に分類♦計数するのに適している。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    (1) 赤血球を溶解し、 白血球に作用して白血球を分類 ·計数 可能とすることを特徵とする白血球分類用試薬であつて：
    (a) 一般式
    Rl _ R2 一 C H2 C H2 O) n - (ここで、 R， は炭素数 10〜22のアルキルまたはアルケニルま たはアルキニル基； R2 は 0， 0—または COO ； nは 8〜30の整数； Xは S 0。 Na , COONa ,
    0 S 00 Na または ONa)
    で表わされるポリオキシエチレン系ァニオン界面活性剤である 第 1グループの界面活性剤
    および
    (b) 一般式
    Rt 一 R2 - (CH2 CH2 0) n 一 H (ここで、 は炭素数 10〜22のアルキルまたはアルケニルま たはアルキニル基； Rn は 0, ~ ^))~ 0—または C 00 ； nは 8〜30の整数）
    で表されるポリォキシェチレン系ノニォン界面活性剤である第 2グループの界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも 1 種の界面活性剤を含有する試薬。
    (2) 下記（a) ， (b) の 2液からなる白血球分類用試薬：
    (a) 血液希釈剤であり、 高浸透圧化剤を含有する第 1液およ び
    (b) 請求の範囲第（1) 項に記載の試薬を含有する、 第 1液に より希釈された血液試料に添加される第 2液。
    (3) 第 1液にも界面活性剤を含有する請求の範囲第（2) 項に 記載の 1¾
    (4) 高浸透圧化剤を含有する請求の範囲第（1) 項に記載の試 薬。
    (5) 請求の範囲第（1〉 ないし（4) 項のいずれかに記載の試薬 に、 白血球中の単球の大きさを選択的に小さくする可溶化剤を 含有する試薬。
    (6) 含有する可溶化剤が下記 5つのグループからなる群から 選ばれる少なくとも 1種のものである請求の範囲第（5) 項に記 載の試薬：
    第 1グループの可溶化剤 （尿素系） ：
    尿 素 チォ尿素
    1,1 - ジメチルゥレア エチレン尿素
    メチルウレタン 1,3 - ジメチル尿素 ウレタン N C 00 C2 Hc )
    第 2グループの可溶化剤：
    n -ォクチル； 3 - D - グルコシド
    C.H A P S (3 - 〔 （3 - クロルアミ ドプロピル）
    ジメチルアンモニォ〕 - 1 - プロパンスルホネー ト） CHAP S O (3 - 〔 （3 - クロルアミ ドプロピル）
    ジメチルアンモニォ〕 - 2 - ヒ ドラキシ - 1 - プロパンスルホネー ト） ME GA8, 9, 10 (ォクタノィル - , ノナノィル -また はデカノィル - N -メチルダルカミ ド）
    シユークロースモノ力プレート
    N -ホルミルメチルロイシルァラニン
    第 3グループの可溶化剤 （グァ二ジン類） ：
    チォシアン酸グァニジン グァニルグァ二ジン
    グァ二ジン塩酸塩 グァニジンロダン塩
    グァニジン硝酸塩 1,1,3,3 -テトラグァニジン グァニジン炭酸塩
    グァニジンリン酸塩
    グァニジン硫酸塩
    第 4グループの可溶化剤 （胆汁酸塩） ：
    デォキシコール酸ナトリウム
    タウロコール酸
    コール酸
    第 5グループの可溶化剤 （ハロゲン置換酢酸） ：
    卜リクロ口酢酸ナトリウム
    トリプロモ酢酸ナトリウム
    ジクロ口酢酸ナト リウム
    ジブ口モ酉乍酸ナト リ ウム
    モノクロ口酢酸ナトリゥム
    モノプロモ酢酸ナトリウム
    (7) 請求の範囲第（1) 〜（6) 項のいずれかに記載の試薬を使 用し、 R F法および D C法なる粒子分析方法により白血球を リンパ球、 単球、 顆粒球に 3分類する方法。
    (8) 請求の範囲第（7) 項に記載の方法により白血球をリンパ 球、 単球、 顆粒球に 3分類し、 3分類用に使用された測定用試 料中に所定時間後特異的に残る好酸球を R F法および D C法、 あるいは D C法のみにより計数することにより、 白血球をリン パ球、 単球、 好酸球、 好酸球以外の顆粒球に 4分類する方法。
    (9) 請求の範囲第（7) 項に記載の方法により白血球をリンパ 球、 単球、 顆粒球に 3分類し、 一方、 請求の範囲第（1) 〜（6) 項のいずれかに記載の試薬を使用することにより特異的に残さ れた好酸球を R F法および D C法、 あるいは D C法のみにより 計数することにより、 白血球をリ ンパ球、 単球、 好酸球、 好酸 球以外の顆粒球に 4分類する方法。
    (10) 請求の範囲第（8〉 または（9) 項に記載の方法により白血 球をリンパ球、 単球、 好酸球、 好酸球以外の顆粒球に 4分類し、 一方、 好塩基球を特異的に残す好塩基球測定用試薬を使用し、 好塩基球を R F法および D C法、 あるいは D C法のみにより計 数することにより、 白血球をリ ンパ球、 単球、 好酸球、 好塩基 球、 好中球に 5分類する方法。
    (11) 請求の範囲第（1) 〜（6) 項のいずれかに記載の試薬を使 用し、 R F法および D C法なる粒子分析方法により異常細胞を 検出する方法。
    (12) 請求の範囲第（1) 〜（6) 項のいずれかに記載の試薬を使 用し、 R F法および D C法なる粒子分析方法により白血球を リンパ球、 単球、 顆粒球に: 3分類し、 かつ、 異常細胞を検出す る方法。
    (13) 第 2グループの可溶化剤： n -ォクチノレ yS - D -グノレコシド
    C H A P S (3 - C (3 - クロルァミ ドプロピル）
    ジメチルアンモニォ〕 - 1 -プロパンスルホネート） CHAP S O (3 - 〔 （3 -クロルアミ ドプロピル）
    ジメチルアンモニォ〕 - 2 - ヒドラキシ - 1 - プロパンスルホネート）
    MEG A 8, 9, 10 (ォクタノィル -， ノナノィル -また はデカノィル - N -メチルダルカミ ド）
    シユークロースモノ力プレート
    N -ホルミルメチルロイシルァラニン
    の内の少なくとも 1つを含有する試薬を用いて白血球を分類す る方法。
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