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    公开号:WO1988008982A1
    申请号:PCT/JP1988/000435
    申请日:1988-04-28
    公开日:1988-11-17
    发明作者:Kenji Hosoda；Hideaki Suzuki；Tatsuji Yasuda
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] ο 細 リ ポゾー ム免疫 定法及びそのためのキッ ト 技術分野
    [0002] 本発明は、 リ ボゾー ム免疫測定法及びそのためのキッ ト 閿する。 明
    [0003] 背;！技術
    [0004] 近年、 医^分野においては、 病気の診断等を行うために、 抗原一抗体反応を利用した免疫涎定法がよく利用されている, 従来の免疫測定法は、 大き くわけて、 不均一測定法と均一測 定法に分けられるが、 疾患に閲する適格、 簡便な診断の重要 性は益々増して来ており、 洗浄操作の不要な均一測定法が相 丄 3 対的に重要度を増している。 しかしながら、. 均一測定法は、 測定感度の点で不十分なものが多い。
    [0005] そこで、 最近、 感度を改善することを目的と した種々のリ ポゾ一ム免疫測定法が提案されている。 これらの測定法にお いては、 測定対象である抗原と、 該測定対象抗原に対する抗 体とマーカ一を封入したリ ポゾー ムとを連結して成る リ ポゾ ー ム結合^体とを反応せしめることにより抗原一抗体^合体 を形成せしめ、 前記リ ポゾームからマ一力一を補体依存的に 放出 しめ、 放出された^ ^を^定するこ とにより測定対象 ί几 l ¾：■ OVi ί!ー る。
    [0006] この铉なリ ポゾ一ム免疫測定法の 1つの態様と して、 測定 対象抗原、 該測定対象抗原に対する第一の抗体と標識を封入 したリボゾームとを連結して成る リボゾーム結合抗体、 及び 該測定対象抗原に対する第二の抗体の三者を反応せしめるこ とにより抗原一抗体三元複合体を形成せしめ、 これに補体を 作用せしめることにより複合体となったリ ポゾーム中の標識 を放出せしめ、 そして放出された標識を測定することにより 測定対象抗原を測定する方法がある。 この態様のリボゾーム 免疫測定法として、 特開昭 60— 138465明細書には、 前記第一 の抗体及び第二の抗体として種を異にする抗体を用いる方法 が開示されている。 特開昭 61— 250558明細書には、 リ ン脂質 及び糖脂質の少なく とも一方とコ レステロールとからなる リ ボゾームに親水性の標識物質 封入し、 これに被験物質に対 する抗体の少なく とも一部を固定化して用いる前記の態様に 属する方法が記載されている。 特開昭 61— 269070明細書には、 前記の態様に属する一般的方法が記載されている。 また、 特 開昭 61— 250560明細書には、 被験抗原に対する第一抗体、 該 第一抗体に対する第二抗体と標識物質を封入したリ ボゾーム との接合体、 被験抗原に対する第三抗体、 及び補体の四者を 反応せしめることを特徵：とする リボゾーム免疫測定法が開示 されている。
    [0007] これらのいずれの方法においても、 第二抗体又は第三抗体 として、 （1) 分析対象抗原と特異的に反応することができ、 且つ（2) 補体を活性化することができるという、 二つの条件 を満たす抗体を用いる必要があるが、 この様な条件を満たす 抗体を得ることは必ずしも容易ではない。 従って、 本発明は、 前記第一の条件、 すなわち分析対象抗 原との反応性、 及び第二の条件、 すなわち補体を活性化する 能力を別個の抗体に担当せしめ、 これらの抗钵が特異的に結 合することができる様にすることにより、 前記の問題点を解 決しようとするものである。 発明の開示
    [0008] 前記の問題点は、 測定対象抗原に対する第--の抗体と標識 を封入したリ ポゾームとを連結して成る リ ポゾーム結合抗体. 測定対象抗原に対する第二の抗体、 及び測定対象抗原を反応 せしめることにより、 抗原一抗体複合体を形成せしめ、 補体 の存在下で前記リ ポゾ—ムから測定対象抗原の量に依存する 量において標識を放出せしめ、 そして該放出された標識を測 定することにより測定対象抗原を測定する方法において、 前 記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することができ且つ 補体を活性化する能力を有する第三の抗体を用いることを特 徴とする リ ポゾーム免疫測定法により解決される。
    [0009] 本発明はさ らに、
    [0010] (1) 測定対象抗原に対する第一の抗体と、 標識を封入した リ ポゾームとを連結して成る リ ポゾーム結合抗体 ；
    [0011] (2) 測定対象抗原に対する第二の抗体 ；
    [0012] (3) 前記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することが でき、 且つ補体を活性化することができる第三の抗体 ； 及び
    [0013] (4) 補体
    [0014] の内の少なく とも 1つを含んで成る リ ポゾ一ム免疫測定甩キ ッ ト、 を提供する。 図面の簡単な説明
    [0015] 第 1図は、 本発明のリポゾーム免疫測定法の原理を示す模 式図である。
    [0016] 第 2図は、 第二の抗体に結合したハプテン DNP量と標識物 質の放出量との関係を示すダラフである。
    [0017] 第 3図は、 本発明の方法により分析対象抗原 " 2 プラス ミ ノ一ゲン * イ ンヒビター （ 2PI )を測定する場合における検 量線の一例を示すグラフである。
    [0018] 第 4図は、 本発明の方法で測定した 2P I値と従来の薛素 免疫測定法で測定した " 2P I値の相関々係を示す図である。
    [0019] 第 5図は、 第二の抗体として西洋ヮサビパ一ォキシダ一ゼ ( HRP)と結合した抗 " 2P Iマウスモノ クローナル抗体 — 2 ) を用いた場合における第二抗体濃度と標識の放出量との 関係を示すグラフである。
    [0020] 第 6図は、 異る第二の抗体を使用した場合の、 該抗体の反 応混合物中濃度と標識物質の放出效率との関係を示すグラフ である。 図中、 Aは抗原ポリペプチ ド分子上の第一の抗体の 結合部位と第 2の抗体の結合部位が該ポ リぺプチ ドの一次構 造を基準にして比較的近い場合の結果を示し、 そして Bは第 一の抗体の結合部位と第二の抗体の結合部位が比較的遠い場 合の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
    [0021] 本発明のリ ポゾーム免疫測定法の原理を第 1図に模式的に 示す。 本発明においては、 （1) 測定対象抗原、 （2) 該測定対 象抗原に対する第一の抗体と、 標識物質を封入したリ ポゾ一 ムとを連結して成る リボゾーム結合抗体、 （3) 該測定対象抗 原に対する第二の抗体、 及び（4) 該第二の抗体と直接的又は 間接的に結合することができ、 且つ補体を活性化することが できる第三の抗体を反応せしめることにより抗原一抗体複合 体を形成せしめる。 これにより測定対象抗原の量に依存する 量の抗原一抗体複合体が形成される。 この複合体に補体を作 用させることにより、 前記複合体中の第三の抗体の作用によ り補体が活性化され、 活性化された補体の作用により複合体 に組み込まれた リポゾームが損傷されそれに封入されていた 標識物質が放出される。 従って、 この放出された標識物質を 測定することにより、 測定対象抗原を測定することができる c 従って、 本発明の方法においては、 リ ボゾーム免疫測定系 においてリ ポゾームから標識物質を放出せしめるために必要 な、 測定対象抗原に対する結合能力と補体活性化能力とを別 個の抗体により担当せしめるため、 抗体を容易に得ることが でき、 広範囲の種類の測定対象に対して使用することができ る o
    [0022] 本発明の測定系は、 抗原性を有する極めて広範囲の種類の 物質を測定するために使用することができる。 例えば、 本発 明において好ま しく測定される抗原と しては、 " 2 プラス ミ ノ ーゲンィ ン ヒ ビター （ " 2 P I )、 " 2 P I—プラ ス ミ ン複合体、 プロテイ ン（：、 プロテイ ン s、 プラス ミ ノ ーゲン、 組織プラ ス ミ ノ 一ゲンァクチベータ （TPA) 、 TPAイ ンヒビタ 一（TPA I ) TPA - TPA I複合体、 アンチ ト ロ ンビン Π ( AT M ) 、 ΑΤ Π一 ト ロ ンビン複合体、 フイブリ ノ ペプチ ド A、 B 15— 42等の 凝固線溶系因子が挙げられる。 さらには、 一フエ トプロテ ィ ン、 癌胎児性抗原（CEA) 、 胎盤由来グルタチォ ンー S — ト ラ ンスフ ェ ラ 一ゼ（GST— π ) のごとき癌マ一力一 ； C反応性 蛋白質（CRP) 等の炎症マーカー ； ヒ ト胎盤性ゴナ ド トロ ピン HC&). 黄体形成ホルモン（LH)、 卵胞刺激ホルモン放出因子 (FSH) 等のホルモン類 ； ォステオカルシン、 骨アル力 リ ホス フ ァ ターゼ等の骨代謝関連物質 ； イ ンタ 一ロイキ ン一 1〜6、 腫瘍壊死因子等各種の免疫関連物質等を測定することができ o
    [0023] 本発明において使用する リボゾームとしては、 常用の種々 のリボゾームを使用することができ、 その組成及び調製方法 はすでに知られている。 例えば、 構成成分としてコ リ ン、 ホ スフ ァチジルコ リ ン、 フ フイ ンゴ ミ エリ ン、 ホスフ ァチジ ン 酸、 ホスフ ァ チジルセリ ン等のリ ン脂質 ； 安定剤としてのつ レステロール類 ； 及びジチォピリ ジル化又はマレイ ミ ド化し たホスフ ァチジルエタノ ールア ミ ン （架穰性リ ン脂質） 等が 用いられる。 例えば、 ホスフ ァチジルコ リ ン、 コ レスタ ノ 一 ル及びジチォ ピ リ ジル化ホスフ ァチジルエタ ノ ール了 ミ ンを 溶剤に溶解した後、 溶剤を減圧除去してフィルムを形成した 後、 これに水性媒体を加えてボルテッ クスミ キサー等により 撹拌することにより リボゾーム懸濁液が得られる。 本発明において使用される標識と しては、 免疫測定法にお いて従来から使用されている任意のものを用いることができ その検出、 又は測定方法もよく知られている。 例えば酵素、 例えばグルコース 6 — リ ン酸脱水素酵素標識として用い、 発 色性にした酵素基質による可視光、 蛍光又は紫外線を測定す る方法 ； 蛍光剤、 例えばカ ルボキシルフルォ レセイ ン、 カ ル セィ ン等を標識と して用い蛍光発色を測定する方法 ； 発光物 質、 例えばルシゲ二 ン、 ル ミ ノ ール、 ルシフ ヱ リ ン等を標識 と して用いて発色を測定する方法 ； 色素、 例えばスルホ口一 ダミ ン等を標識と して用いて色素の放出量を測定する方法 ； 酵素基質、 例えばグルコース 6 — リ ン酸を標識と して使用し- 酵素、 例えばダルコース 6 — リ ン酸脱水素酵素を発色剤と し て用いて可視光線を測定する方法、 等が用いられる。 これら の標識をリ ポゾームに封入するには、 水溶性標識物質等を使 用する場合には標識物質を前記調製法において水性媒体層に 添加し、 脂溶性標識物質を使用する場合にはフィルム形成時 にフ ィ ルム中に導入するか、 又は界面活性剤を用いて導入す ο
    [0024] リ ポゾームに結合せしめる第一の抗体としては、 測定对象 抗原に対する任意の抗俅を使用することができる。 例えば、 測定対象抗原により感作されたゥサギ、 ャギ、 ヒッジ、 ラ ッ ト 、 ブタ、 モルモ ッ ト 、 ニヮ ト リ 、 マ ウス等の哺乳動物から 得られる抗血清を使用することができる。 また、 好ま しく は モノ ク ローナル抗体、 例えばマウ スモノ クロ一ナル抗体等を 使用することができる。 これらの抗体は、 完全な抗体分子、 例えば免疫グロブリ ン G (I gG)の形で使用することもでき、 又 はそのフラグメ ン ト、 例えば F (a ）2 , Fab 等の形で使用す る こともできる。 これらのポ リ ク 一ナル抗血清及びモノ ク ローナル抗体、 並びに抗体断片の調製方法はよく知られてお り、 本発明の前記抗体も既知方法に従って調製することがで きる。
    [0025] 前記のリポゾームと抗体分子との結合は共有結合により、 '通常はひ ンカーとしての二価試薬を用いて行われる。 本発明 に用いる二価性試薬としては、 グルタ ルアルデヒ ド等のジ了 ルデヒ ド化合物 ； ト ルエ ン一 2 , 4 —ジイ ソ シアナ一 ト、 ジ フ エニルメ タン一 4 ， 4 r ージイ ソ シ.アナ一 ト等のジイ ソ シ アナー トィ匕合物； エチレングリ コールジグリ シジルェ一テル、 グリ セ リ ンジグリ シジルェ一テル等のジエポキ シ化合物 ； ビ ス （ 4 —アジ ドフ エ二ル） スルホ ン、 ビス （ 4 一アジ ドフ エ ニル） メ タ ン等のビスジァゾ化合物 ； 1 ーェチルー 3 — ( 3 —ジメ トキ シァ ミ ノ プロ ピル） カ ルボジイ ミ ド、 N , N ' 一 ジシク ロへキシルカルポジィ ミ ド、 1 ーシク ロへキ シルー 3 ― ( 2 —モルホ リ ニル一 4 ーェチ レ） カルボジィ ミ ドメ チル — p — ト ルエンスルホナ一 ト等のカルボジィ ミ ド化合物 ； N ― ( m—マレイ ミ ド安息香酸） 一 N—サク シンイ ミ ドエステ ル、 4— ( N—マレイ ミ ドメ チル） 安息香酸一 N—サク シン ィ ミ ドエステル、 4 一 （ N—マ レイ ミ ドメ チル） シク ロへキ サン一 1—カルボン酸一 N—サク シンィ ミ ドエステル等のマ レイ ミ ドーカルボン酸一 N—サク シンィ ミ ドエステル化合物 3— （ 2 — ピ リ ジルジチォ） プロ ピオ ン酸ー N—サク シンィ ミ ドエステル等のピ リ ジルジチオーカルボン酸一 N—サク シ ンィ ミ ドエステル化合物が挙げられる。 これらの二価試薬を 用いる連結反応の条件はすでによ く知られている。
    [0026] 本発明の方法においては、 測定対象抗原の量に関連する量 の標識物質を補体依存的にリ ポゾームから放出せしめる手段 として、 測定対象抗原に対する第二の抗体と、 該第二の抗体 に直接的又は間接的に結合することができ且つ補体を活性化 することができる第三の抗体とを用いる。 この第二の抗体と しては、 測定対象抗原に対する抗体であり且つ前記第一の抗 体とは異る抗原決定基に結合する任意の抗体を用いることが できる。 すなわち、 測定対象抗原により免疫感作されたゥサ ギ、 ャギ、 マウス、 ヒッジ、 ラ ッ ト、 ニヮ ト リ、 ブタ等の哺 乳類から得られるポ リ ク口一ナル抗体や、 各種のモノ クロー ナル抗体、 例えばマウスモノ ク ロ一ナル抗体を使用すること ができる。 この第二の抗体も、 第一の抗体と同様、 完全な抗 体分子の形態で使用することもでき又は種々の抗体フラグメ ン ト、 例えば F b ) 2 , Fab 等の形態で使用することができ る o
    [0027] 第三の抗体と しては、 第二の抗体との結合の態様に依存し て種々の抗体を用いることができる。 例えば、 第三の抗体と して第二の抗体と直接的に結合することができる抗体を用い る場合、 この第三の抗体は、 第二の抗体を抗原と して用いて 調製した抗体であり、 この様な抗体と して種々のポ リ ク ロ一 ナル抗体又はモノ ク ローナル抗体を用いることができる。 し かしながら、 本発明の好ま しい態様においては、 第三の抗体 を間接的に第二の抗体と結合せしめる。 この態様においては、 第二の抗体とは無関係のある種の抗原又はハプテンに對する 第三の抗体を調製する。 この場合、 この第三の抗体の調製に 用いた抗原又はハプテンあるいはこれらと同様に反応する物 質を前記第二の抗体に例えば共有結合により結合せしめ、 複 合抗体を第二の抗体として用いる。 この態様によれば、 第二 の抗体とは無関係に、 補体活性化能の強力な第三の抗体を選 択して使用することができ、 極めて有利である。 第三の抗体 を調製するための抗原として、 従ってまた第二の複合抗体の パー トナーとして、 種々の蛋白質又はポリぺプチ ドを用いる ことができ、 好ましく は分子量 30， 000以下の種々の蛋白質又 はポリペプチ ドを用いることができる。 例えば、 西洋ヮサビ パ—ォキシダーゼ、 ミ オグロビン、 グルタチオ ン一 S— ト ラ ンスフェラーゼ、 アビジン、 種々の合成ペプチ ド等を用いる ことができる。 しかしながら、 本発明の最も好ま しい態様に おいては、 第三の抗体を調製するための抗原として、 適当な キヤ リヤーに結合した低分子ハプテンを用い、 そして第二の 複合抗体のパートナーとして該ハプテンを使用する。 すなわ ち、 第二の抗体として 「低分子ハプテン化抗体」 を使甩する c この様なハブテンとしては、 2 , 4—ジニ ト ロフエニル基 (DNP) などのジニ ト ロベンゼン類、 2 , 4 , 6 — ト リ ニ ト ロ フエ二ル基（TNP) などの ト リ ニ ト ロベンゼン類、 ピオチノ ィ ル、 イ ミ ノ ビォチノ ィ ルなどのビォチン類、 アルドステロ ン， 17— ^ —エス ト ラ ジオ一ル、 デス トステロ ンなどのステロイ ド類、 ジフ エニルヒダン トイ ンなどのヒダン ト イ ン類、 フ ル ォロイ ソチオ シァネー トなどのフルォ レセィ ン類等、 適当な キヤ リャ一との結合によって抗原性を発揮するものであれば いずれでも良い。 ハプテ ンを用いる抗体の調製方法はすでに よく知られている。 第二の抗体と して抗原との複合抗体、 又 は低分子ハプテ ン化抗体を使用する場合、 第二の抗体とハプ テン等との連結方法と してはすでに知られている方法を用い ることができる。 例えば、 第二の抗体と抗原蛋白質又はポ リ ペプチ ドとを連結するには、 例えば、 リ ボゾームと抗体分子 との結合に関して前に挙げた二官能価架橋剤を用いる。 また- 第二の抗体と低分子ハプテンとを連結するには、 低分子ハプ テンの官能基を利用して抗体のア ミ ノ基、 カルボキシル基^ と縮合せしめるか、 又はリ ポゾームと抗体分子との結合に関 して前にを挙げた二官¾価架撟剤を用いる。 ハプテン化抗体 のハプテン置換基の数は 1 〜 2 0個 Z抗体分子が適当である r 第三の抗体が第二の抗体に対する抗体である場合、 及び第 二の抗体とは無関係のハプテン等対する抗体である場合のい ずれにおいても、 第三の抗体は補休活性化能を有しなければ ならない。 この様な抗体と しては種々のポ リ ク 口ーナル抗体 及びモノ ク ロ一ナル抗体を使用することができ、 例えばゥサ ギ由来の抗体やマウスモノ ク ロ一ナル抗体を用いることがで きる。 また、 これらの抗体は完全な抗体分子と して使用する ことができ、 また、 補体活性化能を維持している限り、 抗体 の各種のフラ グメ ン 卜の形で用いることもできる。
    [0028] 本発明において用いられる補体と しては、 任意の動物稀の ものを用い得る力《、 好ま しいのはモルモッ トの補体である。 本発明の方法の実施において用いる反応媒体としては P H約 5. 0 〜10. 0、 好ましく は PH 6. 5 〜 8. 5の種々の緩衝液、 例え ばゲラキ ンべロナール緩衝液、 H epes 緩衝液、 Tr i s緩衝液等 を用いることができる。 反応温度は特に臨界的ではなく、 例 えば 2 5 〜 5 0 °C、 好ましく は 3 0 °C〜 4 0 での範面であ り、 例えば 3 7 °Cである。
    [0029] 本発明の方法は、 前記のごと く、 （1) 測定对象抗原、 （2) リボゾーム結合第一抗体、 （3) 第二の抗体、 （4) 第二の抗体 に結合する第三の抗钵、 及び ） ハプテ ンの相互反応により 行われるが、 これらの反 iS成分の反応混合物への添加の順序 は特に臨界的ではなく、 任意の順序で添加することができ、 又は実質的に同時に混合することができる。 一つの好ま しい 態様においては、 （1) 測定对象抗原、 （2) リボゾーム結合第 一抗体及び（3) 第二の抗体を混合して所定時間ィ ンキュベー トすることにより、 抗原一抗体三元複合体をまず形成せしめ、 次に（4) 第三の抗体及び（5) ハプテンを添加して所定時間ィ ンキュペートすることにより標識物質の放出を行う。 この様 に二段階の反応を行う場合、 例えば第一段階の反応は約 3 0 分間行い、 そして第二段階の反応は約 1時間行う。
    [0030] 本発明はまた、 前記のリボゾーム免疫測定法を行うための キッ トに関する。 前記の測定方法を実施するには、
    [0031] (1) 測定対象抗原に対する第一の抗体と、 標識を封入した リボゾームとを違結して成る リ ボゾーム結合抗体 ；
    [0032] (2) 測定対象抗原に対する第二の抗体 ；
    [0033] (3) 前記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することが でき、 且つ補体を活性化することができる第三の抗体 ； 及び (4) 補体 ；
    [0034] が必要である。 しかしながら、 これらは測定実施の現場にお いて調製することも可能であるから、 本発明の測定キッ トは. 前記 4種類の成分をすベて含有するもののみならず、 そのい ずれか 1種類、 2種類又は 3種類の成分のみから成るもので もよい。 この発明のキッ トはさ らに、 反応成分を稀釈するた めの緩衝液を含有することができ、 さらに、 放出された標識 の検出のために必要であればそのための試薬を含有すること もできる。
    [0035] 次に、 実施例により この発明をさ らに具体的に説明する。 実施例 1.
    [0036] (a) 抗体封入リ ポゾームの作成
    [0037] 5 mMジノ、°ル ミ ト イ ルホス フ ァ チジルコ リ ン （DPPD) 100 、
    [0038] 1 0 ^ コ レステ ロ ール 5 0 、 1 mMジチォ ピ リ ジル化ジノ、。ル ミ ト イ ルホス フ ァ チ ジルエタ ノ ールァ ミ ン（DTP— DPPE) 2 0 をナス型フ ラ ス コ に入れ、 溶媒を減圧除去し、 フ イ ルムを 作成した。 3 0分間真空乾燥し、 0. 2 M 力ルボキ シフルォ レ セイ ン （CF)溶液 を加え、 ボルテ ッ ク ス ミ キサ一で攪拌 し、 CP含有リ ボゾーム （MLV)を作成した。 遠沈により リ ポゾ ームを洗浄した。 一方、 ァセチルメ ルカプト無水コハク酸を 用い、 常法により SH化した抗" 2PI マウスモノ ク ロ ーナル抗 体（MCA 1 ) (濃度 0. 5 / i) 1 r を、 洗浄したリ ポゾームに 加え、 終夜反応させた。 未反応の抗体を遠沈除去し、 抗休封 入リ ポゾームを作成した。 (b) DNP化抗体の作成
    [0039] 0. 1 M 炭酸緩衝液 （PH8.0 ) 中 1 ingZ 濃度の抗 o 2PI マ ウスモノ ク ローナル抗体（MCA 2') (MCA 1 とは異な ；亢原部位 を認識する） 20( ^に、 ジォキサン中 10、 5 、 2.5 、 1.25又 は 0.62mgZm£のジニ ト ロ フルォロベンゼン（DNP) 溶液を加え、 室温で 5時間反応させた。 この場合、 MCA2 と D の比率は
    [0040] MCA 2 /DNP = 1X200, 1X100, 1X50, 1X25, 1 Z12.5、 又は 1Z6.25(WZW)となる。 反応後、 リ ン酸緩衝生理食塩氷 (PBS) に対して終夜透析を行い、 各 DNP化量の抗《 2Π マウ スモノ ク ロ ーナル抗体（DNT— MCA 2 ) を作成した。
    [0041] (c) リポゾーム免疫測定法一（1)
    [0042] 測定対象抗原である " 2ΡΙ の濃度 120ngZm£、 3 0 ngXm£ および 0 ngZ のものをそれぞれ 2 5 と、 MCA 1感作リ ポ ゾーム 5 0倍稀釈液 （ゲラチ ンべロナール緩衝液、 PH7. 4、 5 mM Mg* 、 5 mM C a* ) 5 と、 各 DNP化 MCA 2 (およ びコ ン ト ロ ールとして D P化されていない (濃度 5 /miY各 2 5 /^を混合し、 3 7 °Cで 3 0分間ィ ンキュベ一 ト した後、 ゥサギ抗 DNP化抗体 （濃度 2 0 m /mi) 2 5 およ びモルモッ ト補体 3 CH5。25^を加え、 3 7 でで 1時間ィ ンキ ュぺ一 ト し、 MTP— 32螢光マイ ク ロプレー ト リ 一ダ一で螢光 を測定した。 この結果を第 2図に示す。 マーカー （螢光） の 放出割合は、 明らかに DNP化量に比例しており、 D 化抗体 が本免疫反応に有効に面与していることが明らかである。
    [0043] (d) リ ポゾ一ム免疫測定法一（2)
    [0044] DNP化第二抗体を用いた !Jポゾ一人免疫破壊測定法（し ILA) 各濃度 （120 ， 60. 30 - 15 , 7. 5 ng r ) の抗原 2PI) 溶液 2 5 に、 MCA 1封入リ ポゾ一ム稀釈液 5 と DNP化第 二抗体 〔マウ スモノ ク ロ ーナル抗体（MCA 2 ) 、 MCA 2 /D P = 1Z200 (反応比） = 1 Z15.3 (結合比） もの〕 2 5 を 加え 3 7 °cにて 3 0分反応した後、 第三の抗体と してのゥサ ギ抗 DNP化抗体 2 5 、 およびモルモ ッ ト補体 2 5 を加え 3 7 °Cにて 1時 反応させた。 また、 比較実験と して、 ゥサ ギ抗 DNP抗体のみを除いたものを用いて、 LILAを行った。 結 果は第 3図に示したごと く、 抗 ~ 1
    [0045] 5原 （《 2PI)特異的に反応が進 行していることがわかる。
    [0046] (e) 本発明のリ ポゾーム免疫測定法と従来の酵素免疫測定法 との比較
    [0047] 本測定法を用いて煩発性血管内凝固症候群（DIC) 患者 1 8 名の血漿中の《 2PI レベルを測定した。 その結果を、 従来法 である " 2P1 の酵素免疫測定法による結果と比較したところ、 第 4図に示したごと く、 r = 0.9549と良好な相関を示し、 本 法がな 2PI を特異的に測定していることが明白である。
    [0048] 実施例 2.
    [0049] (a) 1 mgZ 濃度の実施例 1 (b) で使用した抗 " 2PI モノ ク 口 一ナル抗体 — 2 ) 1 ？ ^に、 マ レイ ミ ドベ ンゾィ ルサク シ ンィ ミ ドエステル（MBS) 0. 2 mgZ 3 0 ジメ チルホルム了 ミ ド（DMP) を加え、 2 5 °Cにて 3 0分間反応させ、 セ フ アデ ッ ク ス G— 25カ ラ ム （ ø 1 0 mm X 2 5 cm ) を通し、 MBS化 MCA— 2を得た。 この MBS化 MCA— 2 と、 2. 8 mgZ◦. 2 ccの- SH化西洋ヮサビノヽ0—才キシダーゼ (horse raddish eroxidase HRP)を混合し、 4 °Cで終夜反応させ、 ウルトロゲル Λ(:Λ34αΚΒ) カ ラ ム ( Φ 1. 5 cmX 2 5 cm) を通し、 HRP結合 MCA— 2を作 成した。
    [0050] (b) 実施例 1 (c) とほぼ同様の操作を行い、 但し第三の抗体 としてゥサギ抗 DNP抗体のかわりに、 ゥサギ抗 HRP抗体を用 いて LILAを行ったところ、 第 5図に示すごと く、 " 2PI 120 ngZ において、 第二の抗体である HRP— に依存的に し ILAが進行することが明らかになった。
    [0051] 実施例 3.
    [0052] 第二の抗体の種類が測定に及ぼす影響を調べるため、 第二 の抗体として実施例 1 (b) において調製した DNP化 MCA— 2 (第 6図 A) のほかに、 同様にして調製した DNP化 CA- 3 (第 6図 B) を使用し、 これらの第二抗体の濃度と標識の放 出量との闋係を諷ベた。 第 6図から明らかなごとく、 MCA— 3を使用した場合、 その最適濃度は MCA— 2に比較して狭か つた。 しかしながら、 本発明の方法は第二の抗体の濃度をあ らかじめ最適な一定濃 に固定して行う ことができるから、 CA- 3の使用は必ずしも不利ではない。
    [0053] 三宝ら、 Blood, Vol 69， o2 (1987), PP 446〜453 によれ ば、 第一の抗体として使甩した MCA— 3は "2PI 抗原ポリべ プチド分子上の中央部分に結合し、 MCA— 2は MCA— 1より かなり離れた N—末端側に結合し、 そして M A— 3は MCA— 1の結合部位の近傍であってその C末端側に結合する。 従つ て、 本実施例の上記の結果は、 発明の方法が第二の抗体に対 する抗原決定基の部位によらず良好に適用し得ることを示し ている。
    [0054] 実施例 4.
    [0055] 測定キッ ト
    [0056] 試薬 A 測定対象《 2 Π に対する第一の抗体と標識カルボ キシフルォ レツセィ ンを封入した リ ポゾームとを 連結して成る リ ボゾーム結合抗体、 及び ΤΝ Ρ (ハプ テン） 化抗体を含む懸濁液 (試験管 Α ) 試薬 B モルモッ ト補体凍結乾燥粉末 （試験管 Β ) ； 試薬 C ゥサギ抗 ΤΝΡ抗体凍結乾燥タブレッ ト （タブレツ ト C ) 。
    [0057] 使用法
    [0058] 試験管 Αに検体 5； ^を加え、 3 7 にて 3 0分間イ ンキュ ベー ト した後、 タブレツ ト Cを加え、 次に試験管 Λの口と試 験管 Bの口とを連結して上下をゆつ く り逆転させて試薬 B及 び Cを Aに溶 させ、 全体をさ らに 3 7 °Cにて 1時問ィ ンキ ュベー ト した後、 蛍光を測定する。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. 測定対象抗原に対する第 iの抗体と標識を封入したリ ポゾームとを連結して成る リボゾーム結合抗体、 測定対象抗 原に対する第二の抗体、 及び測定対象抗原を反応せしめるこ とにより抗原一抗体複合体を形成せしめ、 補体の存在下で前 記ひポゾームから測定対象抗原の量に依存する量において標 識を放出せしめ、 そして該放出された標識を測定することに より測定対象抗原を測定する方法において、 前記第二の抗体 と直接的又は間接的に結合することができ且つ補体を活性化 する能力を有する第三の抗体を用いることを特徵とする リ ポ ゾーム免疫測定法。
    2. 前記第三の抗体がゥサギ抗体である、 請求の範囲第 i 項に記載の方法。
    3. 前記第三の抗体がマウスモノ ク口一ナル抗体である請 求の範囲第 1項に記載の方法。
    4. 前記第三の抗体が低分子ハプテンを認識する抗体であ り、 そして前記第二の抗体として該低分子ハプテンと結合し た抗体を用いる、 請求項 1 に記載の方法。
    5. 前記低分子ハプテンとして、 2 , 4—ジニ ト ロフエ二 ル基（DNP) などのジニ ト ロベンゼン類、 2 > 4 , 6 — ト リ 二 ト ロフエ二ル基（TNP) などの ト リ ニ ト ロベンゼン類、 ビォチ ノ ィ ル、 ィ ミ ノ ビォチノ ィ ルなどのビォチン類、 アルドステ 口 ン、 17— iS—エス ト ラ ジォ一ル、 デス トステロ ンなどのス テロイ ド類、 ジフエニルヒダン トイ ンなどのヒダン トイ ン類. 又はフルォ ロ イ ソチ才 シァネー ト などのフル才 レセイ ン類を 用いる、 請求項 4 に記載の方法。
    V
    6. 標識物質と して、 カ ルボキ シルォ レセイ ン、 カ ルセィ ' ン 、 ルシゲニ ン、 スルホ ローダミ ン、 酵素 RP)、 基贾又は 低分子酵素を用いる、 詰'求の範囲第 1項に記載の方法。
    7. 測定対象抗原が、 " 2 プラ ス ミ ノ 一ゲンィ ン ヒ ビタ 一 ( a 2Ρί)、 a 2PI 一プラ ス ミ ン複合体、 プロ テイ ン（：、 プ ティ ン S、 プラ ス ミ ノ ーゲン、 組織プラ ス ミ ノ 一ゲンァク チ ベータ （TPA) 、 ΤΡΛィ ン ヒ ビタ 一 （ΤΡΛ I ) 、 TPA- ΤΓΛ I 複 合体-、 ア ンチ ト ロ ンビ ン H (ΛΤΙΚ) 、 ΛΤΚΙー ト π ：'ビン複合 体、 フイ ブリ ノ ペプチ ド A , B ^ 15— 42等の凝固綿溶系因子、 α'— フエ トプロ テイ ン、 '癌跆児性抗原（CEA) 、 グルタ チオ ン 一 S— - ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼ（GST— ） のごとき癌マーカ 一 ； C反応 蛋白質（CRP) 等の炎症マーカー ； ヒ ト胎盤性ゴナ ド ト ロ ピン ) 、 黄体形成ホルモ ン （LH)、 ^¾剌激ホル モ ン放出因子（FSH) 等のホルモ ン類 ； ォステオカ ルシ ン、 骨 アル力 リ ホス フ ァ タ 一ゼ等の骨代謝関連物質 ； 又はィ ンタ ー ロイキ ン一 1〜 6、 腫瘍壊死 子である、 請求項 1 に記載の 方法。
    8. (I) 測定対象抗原に対する第一の抗体と、 標識を封入 したリ ポゾームとを違結して成る リ ポゾーム結合抗体 ；
    (2) 測定対象抗原に対する第二の抗体 ；
    (3) 前記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することが でき、 且つ補休を活性化することができる笕三の抗体 ； 及び ) 補体 ； の少なく とも 1つを含んで成る ボゾーム免疫測定法用測定 ャッ ト
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