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    公开号:WO1988006184A1
    申请号:PCT/EP1988/000123
    申请日:1988-02-19
    公开日:1988-08-25
    发明作者:Renate Seelig；Hans Peter Seelig；Jean Burckhardt
    申请人:Renate Seelig；Hans Peter Seelig；Jean Burckhardt；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] Virusantigen, Verfahren zu seiner Gewinnung und Anwendung in Diagnose und Therapie (Impfstoff)
    [0002] Non-A, Non-B-Hepatitiserkrankungen sind in der Literatur ausführlich und zahlreich beschrieben. Ebenso bekannt sind aber die Schwierigkeiten der Erfassung des NANBH-Virus und Nachweis der Krankheit.
    [0003] Es wurden nun aus dem Stuhl von Non-A, Non-B-Hepatitispatienten Partikel isoliert und bezüglich ihres Molekulargewichts und ihrer Beschaffenheit charakterisiert sowie ein Nachweisverfahren auf das Vorhanden sein solcher Partikel gefunden und der Nachweis dieser Partikel zur
    [0004] Diagnose des Vorliegens einer Non-A, Non-B-Hepatitis bei leberkranken Patienten angewandt.
    [0005] Aus den aus dem Stuhl isolierten Partikeln wurde DNA isoliert und nach herkömmlichen Methoden kloniert. Die so erhaltenen klonierten DNA-Stränge wurden zum Nachweis des Vorliegens homologer oder sehr ähnlicher DNA wiederum im Stuhl, Serum, Lebergewebe und Körperflüssigkeiten von leberkranken Patienten verwendet, bei denen auf diesem Wege eine Non-A, Non-B-Hepatitis mit hinreichender Wahrscheinlichkeit diagnostiziert werden kann.
    [0006] Die Erfindung betrifft also zusammengefaßt die Isolierung Non-A, Non-B-Hepatitis-assoziierte Partikel, deren DNA sowie das Klonieren von DNA und die Verwendung sowohl dieser Partike als auch der erhaltenen DNA-Klone zur Eingrenzung von Lebe erkrankungen auf das Vorliegen einer Non-A, Non-B-Hepatitis. Weitere Aspekte der Erfindung liegen in der Entwicklung von erweiterten Nachweisverfahren und schließlich auch Impfstoffen auf Basis der zu erhaltenden Antikörper und durch Synthese synthetischer Peptide mit der Sequenz der Partikel, die diesen Virusproteinen entspricht und die sich aus der Sequenz der klonierten DNA vorhersagen läßt.
    [0007] Aus den Stuhlproben Non-A, Non-B-Hepatitis erkrankter Patienten wurde eine Substanz isoliert, die sich signifikant gehäuft im Stuhl solcher Non-A- Non-B-Hepatitis-Patienten findet, dagegen bei gesunden, sowie bei Patienten mit Lebererkrankungen anderer Genese in signifikant geringerem Ausmaß Verfahren zum Nachweis dieser Substanz wurde entwickelt, worin Polystyrolbeads mit verdünntem Serum von Non-A, Non-B-Hepatitis-Rekonvaleszenten beschichtet werden. Die gewaschenen beads werden dann mit einer 10 %-igen Stuhlsuspension eines zu untersuchenden Probanden inkubiert, wobei evtl. vorhandene Non-A -Non-B-Hepatitis assoziierte Substanz an die in dem Rekonvaleszentenserum enthaltenen, an die Polystyrolkugeln gebundenen Antikörper gegen diese Substanz bindet und so immobilisiert wird. Die Bindung der Non-A, Non-B-Hepatitis assoziierten Teilchen kann nachgewiesen werden durch Bindung von menschlichem IgG wiederum aus Rekonvaleszentenserum von Non-A- Non-B-Hepatitis-Patienten, das mit Jod 125 radioaktiv markiert ist. Bei Vorliegen der Non-A, Non-B-Hepatitis-assoziierten Substanz im Stuhl des Probanden wird radioaktives Immunglobulin an diese gebunden und das entsprechende Signal zum Nachweis verwendet.
    [0008] Bei Verwendung dieses Nachweisverfahrens für die HepatitisNon-A- Non-B-assoziierte Substanz in großen Kollektiven von Patienten mit Lebererkrankungen unterschiedlicher Genese zeigte es sich, daß diese Substanz hochsignifikant gehäuft bei Patienten mit gesicherter Hepatitis Non-A, Non-B im
    [0009] Stuhl nachweisbar ist (s. Tabelle 1). Bei Patienten mit anderen Lebererkrankungen, bei denen eine Non-A, Non-B-Hepatitis eher unwahrscheinlich ist, die teilweise in ihrem klinischen Bild jedoch einer akuten oder abgelaufenen Non-A, Non-B-Hepatitis ähneln können, insbesondere auch bei Patienten mit einer akuten unabgelaufenen Hepatitis A oder B fand sich dagegen nur in äußerst wenigen Fällen die Non-A, Non-BHepatitis-assoziierte Substanz (s. Tabellen 2 und 3). Hieraus ergibt sich, daß das Vorliegen dieser Substanz einen deutlichen Hinweis auf die Λtiologie einer zunächst: unbe kannten, entzündlichen Lebererkrankung liefern kann, und daβ der Nachweis dieser Substanz daher eine Untersuchung von hohen diagnostischem Wert zum Nachweis oder Ausschluß des Vorliegens einer Non-A, Non-B-Hepatitis liefern kann.
    [0010] Die mit der Non-A, Non-B assoziierte Substanz weist somit sine hohe Affinität gegenüber menschlichen Immunglobulinen und Fibronectin sowie dessen nicht kollagenbindenden Spaltprodukten auf. Die Bindung an Fab-2Bruchs tücke aus dem IgG gesunder und Hepatitis Non-A, Non-B- rekonvaleszenter Personen spricht gegen eine unspezifische Bindung der assoziierten Substanz an dem Fc-Teil der Immunglobuline. Die hohe Affinität gegenüber Fibronectin und dessen nicht kollagenbindenden Spaltprodukten ist eine Eigenschaft, die diese Substanz mit antigenen Proteinen anderer Viren gemeinsam hat (Seelig und Mitarbeiter 1983).
    [0011] Behandlung mit organischen Lösungsmitteln (Chloroform, Äther) und mit Hitze (70°C, 10 min.) zerstört die Bindungsaffinität der Non-A, Non-B assoziierten Substanz nicht. Während die Verdauung mit Chymotrypsin, Trypsin, Elastase und Neuraminidase keinen Einfluß auf die Bindungseigenschaften der Substanz zeigt, führt die Verdauung mit Papain zu einem vollständigen und schnellen Verlust der Bindungsaffinität.
    [0012] Nach Zentrifugation bei 150.000 g, 2 Std., läßt sie sich im Sediment nachweisen und stellt sich nach 72-stündiger Laufzeit bei einer Dichte von 1,3 (1,29 - 1,32) g/ml Cäsiumchlorid ein. Nach Auftrennung der bei 1,30 g/ml Cäsiumchloridbandenden Fraktion über eine Gradienten-Polyacrylamidgel-Elektrophorese werden in der Silberfärbung mehrere Bande unterschiedlichen Molekulargewichts dargestellt. Nach Transfer auf Nitrocel lulose lassen sich im Western-Blot mit radioaktiv markierten IgG und Fab-2-Fragmenten von Non-A, Non-B Hepatitis-Patienten und gesunden Probanden Bande darstellen, die bei Extraktion gesunder Kontrolls tühle nicht auftreten. Insgesamt werden 4 Banden dargestellt, zwei gut sichtbare Hauptbande mit einem geschätzten Molekulargewicht von ca. 64.000 und 56.000 sowie zwei schwächere Bande mit einem geschätzten Molekulargewicht von 51.000 und 43 . 000 . Die Banden mit Fab-2 -Bruchstücken sind schwächer und zeigen einen höheren Background. Die Auftrennung von Rohstuhlkonzentraten ohne Cäsiumchlorid-Reinigung nach SDS-Page und Blσtting zeigten in positiven Stühlen die beiden Hauptbande mit einem ungefähren Molekulargewicht um 60 .000 .
    [0013] Bei weiterer Analyse der Non-A, Non-B-Hepatitis-assoziierten Partikel ließ sich DNA isolieren und mit herkömmlichen Methoden in Fragmenten klonieren. Diese klonierten DNA-Fragmente aus dem Stuhl von Non-A, Non-B-Hepatitis-Patienten konnten als DNA-Sonden für die Untersuchung des Stuhls , Serums , Lebergewebe und Körperflüssigkeiten sowie Blutkonserven und Plasmaderivaten anderer Patienten mit Verdacht auf das Vorliegen einer Non-A, Non-B-Hepatitis verwendet werden. Mit den klassischen Hybridisierungsverfahren läßt sich so zeigen, ob in den unbekannten Stühlen- DNA vorliegt, deren Sequenz der Non-A, Non-B-Hepatitis-assoziierten DNA der erhaltenen Klone so ähnlich ist, daß sich ein Hybridisierungssignal zeigt. Mit diesem weiteren Nachweisverfahren für Hepatitis Non-A, Non-B-assozirerten DNA-Sequenzen konnten dann Proben von Probanden untersucht werden auf das Vorliegen von Non-A, Nσn-B-Hepatitis-assoziierter DNA. Die bisherigen Ergebnisse legen nahe, daß es sich bei der Non-A, Non-B-Hepatitis-assoziierten Substanz um ein Viruspartikel handelt und daß es sich bei der isolierten DNA-Sequenz um eine Sequenz einer Virus-DNA handelt, wie das Aufschlußverfahren einerseits und andererseits die Sequenz selbst zeigen .
    [0014] Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
    [0015] Beispiel 1
    [0016] Isolierung der Non-A-Non-B-Hepatiris assoziierter. Substanz aus Patientenscuhl. Verwendeter Puffer: Tris-HCl, pH 7,4; 0,05 N in allen Arbeitsschritten a) Aufarbeitung: 0,5 g Stuhl werden in 10 ml Puffer suspendiert, bei 8.00 0 g zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Der Rückstand wird noch einmal mit 10 ml und anschließend mit 5 ml Puffer ausgewaschen. Die gesammelten Überstände werden zentrifugiert (30 min., 10.000 rpm) und durch ein bakteriendichtes Filter filtriert (Millipore 0,22 um). Der Überstand wird mit PEG 6000 (Endkonzentration 10% bzw. 0.4 mol/l ) präzipitiert. Nach mindestens 2 und höchstens 12 Stunden wird das Präzipitat abzentrifugiert und in 10 ml Puffer gelöst. Diese Lösung wird mit 10 ml
    [0017] Freαn ausgeschüttelt, die Phasen durch Zentrifugation getrennt, die Freαnphase noch einmal mit 5 ml Puffer gewaschen. Die Fällung mit PEG und NaCl (Endkσnzentration 10% bzw. 0,4 mol/l ) wird wiederholt, Das Präzipitat in ca. 800 ul Puffer aufgenommen.
    [0018] Die so erhaltene Lösung wird mit RNase und DNase 1 Std. bei 37 ºC verdaut (80G ul PEG-Präzipitat in Tris-HCl-Puffer, pH 7,4; 0,05 M; 2.800 U RNase und 1.500 U DNase, proteasenfreie Präparationen, Boehringer). Isolierungen, die nicht zur Extraktion von DNA dienen, können ahne diese n Schritt durchgeführt werden.
    [0019] Nach Verdauung mit DNase und RNase wird das Inkubat auf einen Cäsiumchlorid-Gradienten gebracht.
    [0020] b) Isolierung der Non-A, Non-B assoziierten Substanz über einen Cäsium chlorid-Gradienten.
    [0021] Die Zentrifugenröhrchen werden mit 1 ml Cäsiumchlorid-Lösung mit einer Dichte von 1,4 g/ml gegeben und mit je 3 ml Cäsiumchlorid von ein er Dichte von 1,3 g, 1,25 g und 1,2 g/ml überschichtet. Alle CäsiumchloridLösungen werden mit dem oben genannten Puffer hergestellt, der Gradient wird mit 800 ul Stuhlextrakt überschichtet, die Zentrifugationsdauer beträgt 65 - 72 Stunden. Temperatur + 10°C, rpm 31.000. Nach Beendigung der Laufzeit wird der Gradient im unteren Bereich (Dichte 1,2 - 1, 4) in Fraktionen von ca. 200 ul gesammelt, im oberen Bereich Dichte 1,1 - 1,2 können größere Fraktionen entnommen werden. Die Dich te jeder Fraktion wird durch Messung des Brechnunqsindex bestimmt. Alle Frakt ionen werden ausgi ebig gegen Puffer dialysiert und 50 μ l jeder Fraktion in NANB-Assay auf Non-A, Non-B assoziierende Substanz untersucht. Von den positiven Fraktionen wird die Eiweißkonzentration nach Lowry bestimmt.
    [0022] Verifizierung und Charakterisierung der Substanz
    [0023] c) Herstellung einer Gradienten-Page
    [0024] Zwei Lösungen mit verschiedenen Acrylamϊdkonzentratϊonen werden durch einen Gradientenmischer zu einem linearen Gradienten aufgeschichtet. Die Lösung mit der höheren AA-Konzentration enthält außerdem 15 % Saccharose, um Turbulenzen zu verhindern. Ansonsten sind die Lösungen zusammengesetzt wie bei LAEMMLI (1970) beschrieben. Dies gilt auch für das Kammgel.
    [0025] Die dialysierten und evtl. eingeengten Fraktionen des Cäsiumchlorϊd- Gradienten werden mit 10 μl SDS, 10 μl Glycerin und 5 μl beta- Mercaptoäthanol, 5 μl Bromophenolblau pro 100 μl Probe versetzt und 3 Min. im Wasserbad gekocht. Danach werden sie mit 5 μl 0,1%igem Pyronin versetzt und auf das Gel aufgetragen. Laufzeit 3 1/2 Stunden, Spannung 160 - 300 V, Stromstärke 40 - 25 A, Leistung 20 W.
    [0026] Ca. 5 Min. vor Ende des Laufes wird nach einmal 5 μl Pyronin aufgetragen und der Lauf beendet, sobald Pyronin das Kammgel durchlaufen hat. Das Gel wird entweder mit Silber gefärbt ( WRAY und Mitarbeiter 1981) oder ein Western-Blotting durchgeführt (TOWBIN und Mitarbeiter 1979). Das Blotting wird über Nacht bei 0,5 A, anschließend 1 Std. bei 1 A durchgeführt.
    [0027] d) Behandlung von Western-Blots
    [0028] Nach Beendigung des Blotting werden die verschiedenen Streifen (an den Pyroninmarkierungen kenntlich) ausgeschnitten und mitgeführte Molekulargewtchtstandards mit Amido schwarz gefärbt. Probenstreifen werden 24 - 72 Stunden in 1%iger Gelatine PBS-Läsung geschüttelt. Die IgG- Fraktion eines Patienten bzw. die Fab-2-Fragmente dieser IgG-Fraktion werden mit Jod 125 (Chloramin T) markiert: 0,5 mCi auf 100 ug Protein. Dabei werden etwa 70 % der Aktivität inkorpαriert. Der Tracer, dessen Volumen ca. 2 ug Protein entsprechen sollte, wird in 20 ml Gelatine/PBS verdünnt und damit die Streifen 12 Stunden unter Schütteln inkubiert. Danach werden die Streifen je 1 Stunde 3 x mit Gelatine-PBS, 2 x mit PBS-Tween 0,5 % und 1 x mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen der Streifen werden diese auf einen empfindlichen Röntgenfilm aufgelegt und bei -70°C 2 - 7 Tage exponiert. Beispiel 2 Nachweismethode f ür HNANB-assoz i ierte Substanz im S tuh l
    [0029] Polystyrol Beads (Plasticball Company, Chicago) wurden mit Serum von rekonvaleszenten Patienten mit Non-A, Non-B-Hepatitis in einer Verdünnung von 1:200 in Carbonatpuffer, pH 9,2, 0,01 Mol/1, 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die so beschichteten beads wurden mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) ausgiebig gewaschen. Die Stuhlproben wurden in Form einer 10 %-igen Stuhlsuspension (g/V) 2 Stunden bei 37°C mit den wie oben geschichteten Polystyrol Beads inkubiert, danach ausgiebig mit PBS, die 0,5 % Tween 20 enthielt, gewaschen und danach 1 Stunde mit humanem IgG aus dem Serum von Rekonvaleszenten von einer Non-A, Non-B-Hepatitis, das mit Jod 125 markiert war, bei 37°C inkubiert. Nach neuerlichem, ausführlichem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die an die Beads gebundene Radioaktivität einem Gamma-Counter ausgezählt. Stuhlproben, bei denen die gebundene Radioaktivität den dreifachen Wert der Negativkontrolle erreichte, wurden als positiv für das Vorliegen der Non-A, Non-B-Hepatitis-assoziierten Substanz befunden.
    [0030] Jede der beigefügten Tabellen 1 bis 4 wurde wie oben beschrieben erstellt und nach den angegebenen Kriterien ausgewertet. Es wurde festgestellt, daß gemäß Tabelle
    [0031] 1 bei Patienten einer gesicherten Non-A, Non-B-Hepatitis diese Substanz in einem großen Prozentsatz der Fälle gefunden wurde, daß gemäß Tabelle 2 bei Verwendung dieses Es say s für diese Non-A, Npn-B-Hepatitis-assoziierte Substanz bei einem Patienten kollektiv mit einer Vielzahl von ganz unter schiedlichen Lebererkrankungen, die aber nichts mit einer Non-A, Non-B-Hepatitis zu tun haben, die Substanz, wenn überhaupt, nur in sehr niedrigen Prozentsätzen gefunden wird.
    [0032] Tabelle 3 zeigt, daß man während der Untersuchung von Patientenkollektiven mit Hepatitis anderer Genese, also entweder Hepatitis A oder Hepatitis B zu einem sehr niedrigen Prozentsatz die Non-A, Non-B-assoziierte Substanz findet.
    [0033] Es ist festzustellen, daß man bei den Non-A, Non-3-Hepatitis- Fällen praktisch immer, also fast 30% positive Befunde hat, wohingegen bei den Hepatitis A, Hepatitis A-Verdacht, Hepatitis B und Posthepatitis B Patienten die Zahlen erheblich niedriger liegen.
    [0034] Die relative hohe positive Anzahl für die Substanz bei chronischen Hepatitis B-Patienten läßt vermuten, daß es sich um eine Doppelinfektion mit Non-A, Non-B und Hepatiti s B handelt.
    [0035] Tabelle 4 zeigt folgendes: Eine Untersuchung an Empfängern mit einer Bluttransfusion, die prinzipiell als Risikopatienten zu gelten haben, weil bei Blutrαnsfusionen häufig eine Non-A, Non-B-Hepatitis Infektion eintritt. Es handelt sich um eine prcspektive Studie.
    [0036] Hieraus ergibt sich sehr deutlich, daß abhängig vom Schweregrad der Folgen dar Transfusion einerseits Patienten gar nichts geschehen ist, wo also diese Substanzen nur in sehr geringem Maße ausgeschieden worden ist, andererseits bei Patienten, bei denen die Krankheit erkennbar ist und bei denen, die eine ganz manifeste Hepatitis haben, in über
    [0037] 70 % der Fälle diese Substanz nachweisbar ist.
    [0038] Beispiel 3: Isolierung von DNA aus dem Stuhl und Klonierung von DNA-Sequenzen und deren Einbau in entsprechende Vektoren.
    [0039] Einbau dieser DNA in Klonierungsvektoren.
    [0040] Aus dem Stuhl von Patienten mit Non-A, Non-B-Hepatitis wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, Non-A, Non-B-Hepatitis-assoziierte Partikel isoliert und, wie dort beschrieben, mit RNAs und DNAs behcandelt und über einen
    [0041] Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt und ausgiebig dialysiert. Die dialysierten Fraktionen wurden auf die oben beschriebene Art auf die Anwesenheit von NANB-assoziierter Substanz untersucht. Die Fraktion der Dichte von 1,3 g/ml im Cäsiumchloridgradienten wurde mit 50 Mikrogramm Proteinase K, 1 % SDS und EDTA in einer End-konzentration von 10 mM/l 6 Stunden bei 37°C verdaut. Proteine wurden durch Extraktion mit 80 %-igem Phenol
    [0042] (Gewicht/Volumen) und Chloroform entfernt, und daraufhin die in der wässrigen Phase gelöste DNA in Gegenwart von 0,3 Mol/1 Matriumacetat mit einem zweieinhalb-fachen Volumen an Äthanol für 60 Stunden bei -70°C gefällt. Danach wurde zentrifugiert und das Sediment einmal mit 70 %-igem Äthanol gewaschen, getrocknet und daraufhin in TE-Puffer bestehend aus 10 mmol/l Tris, pH 3,0, und 1 mmol/l EDTA, in einem Volumenverhältnis von einem Mikroliter/ 5 mg aufgearbeitetem Stuhl, aufgencmmen.
    [0043] 15 Mikroliter dieser DNA-Stammlösung wurden in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 Mikroliter mit 6 Einheiten KlenowPolymerase (DNA-Polymerase I, großes Fragment), 1 Mikroliter einer Lesung von dATP , dTTP und dGTP, jeweils in einer Konzentration von 1 mM/l, sowie 5 Mikroliter alpha32P-d CTP (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/ml) im Inkubationspufferfür Klenow- Pol ymerase nach den Angaben des Herstellers (Boehringer, Mannheim) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 2,5 Mikroliter einer 1 mMol/l dCTP-Lösung zugegeben und die Probe eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubierr. Nach Inaktivierung des Enzyms durch Erhitzen auf 68°C für 10 Minuten wurde die Reaktionslöung auf 0°C abgekühlt. Danach wurde das Reaktionsgemisch zusammen mit 2 Einheiten T4-DNA-Ligase, 1 Mikrogramm phosphorylierter EcoR-I-Linker und 6 Mikroliter 10 mM ATP-Lösung für 16 Stunden bei 16°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde danach auf eine Endkonzentration von 150 mMol/l NaCl eingestellt und mit 240 Einheiten EcoR-I Restriktionsendonuclease (80
    [0044] Einheiten/Mikroliter) 3 Stunden bei 37°C verdaut. Die Reaktion würde durch Zugabe von 5 Mikroliter 80 %-igem Pheno l und 1 Mikroliter 20 %-igem SDS gestoppt. Die radioaktiv markierte und mit Linkern versehene DNA wurde von Salz und nicht legierten Linkern über eine Sepharose 4B-CL-Säule (3 ml Säulenvolumen, 25 cm Länge) abgetrennt und mit 2,5 Volumina Äthanol 16 Stunden bei -70°C gefällt. Die präzipitierte DNA wurde 10 Min. bei 14.000 g zentrifugiert und das Sediment bei 150 Mikroliter 70 %-igem Alkohol gewaschen, getrocknet und in 10 Mikroliter TE-Puffer aufgenommen.
    [0045] Beispiel 4: Einbau der isolierten DNA in lambda-Phagen und Transfektion auf Bakterien.
    [0046] Zur Ligation mit der Vektor-DNA wurden 2 Mikrogramm DNA des Phagen-lambda 1149 mit 2 Einheiten EcoR-I (4 E/Mikrcliter) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 6 Mikroliter (Inkubationspuffer nach Angabe des Enzymherstellers (Boehringer, Mannheim) 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Dann wurde das Enzym durch 10-minütiges Erhitzen auf 68°C inaktiviert. Diese Lösung wurde mit 3 Mikroliter markierter DNA, die wio im vorigen Beispiel beschrieben, isoliert wurde, 1 Mikroliter 5 mM ATP und 1 unit T4-DNA-Ligase bei Raumtemperatur ligiert. 4 Mikroliter dieses Reaktionsansatzes wurden in lambda-PhagenhülIen verpackt (unter Verwendung eines fertigen Vernakkungsextrakts der Firma Giga-Pack, Vector-cloning Systems). Mit diesen verpackten Phagen wurde der Escherichia Coli Stamm NM 514 infiziert. Zum screening auf das Vorhandensein eingebauter DNA wurden ca. 105 "plaque fcrming units" auf 22 x 22 cm screening plates der Firma Nunc ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Phagen-DNA wurde auf Nitrozellulosefilter durch Abklatsch übertragen und die so erhaltenen Abklatschfilter wurden mit 1 Mikroliter der oben beschriebenen radioaktiven DNA Stammlösung gemäß Maniatis et al. (1982) hybridisiert, gewaschen und 6 Std. bei 70°C autoradiographiert.
    [0047] Von 70 positiven Hybridisierungssignalen wurden 17 zugeordnete Phagenkolonien in einer Dichte von ca. 5 Plaques pro cm ausplaziert. Nach plaques purification nach BENTON und DAVIS (1978) wurden von den schließlich erhaltenen 16 positiven Plaques Lysate hergestellt. Mehrere dieser Phagen enthielten DNA-Inserte in einer Länge zwischen 0,3 und etwa 1,5 KB, die mit einer Probe der ursprünglichen DNA-Stammlösung hybridisierten.
    [0048] Beispiel 5: Charakterisierung eines DNA-Fragmentes von 0,45 KB und Subklonierung dieses Fragmentes in einem Plasmid PUC 19 in Escherichia coli.
    [0049] Das DNA-Fragment wurde durch Verdauung mit entsprechenden Restriktionsendonucleasen (EcoR-I) unter den oben bereits beschriebenen Bedingungen aus dem der Phagen DNA entfernt, das Fragment dann auf Agarose Gel von der lambda-Phagen DNA getrennt und die dem Insert entsprechende DNA-Bande aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert. Die solchermaßen isolierte Insert-DNA wird dann genau wie oben beschrieben, in Vektor-DNA PUC 19 hineinligiert und dann auf Escherichia coli Stamm DH 1 transfiziert. Nach Selektion von Bakterienstämmen, die dieses Plαsmid mit dem eingebauten Hepatitis Non-A, Non-B-DNA-Insert aufgenommen haben und vermehren wurde die Züchtung dann durchgeführt und wie bei T. Maniatis et al. 1982, in "Molecular Cloning, a laboratory manual", beschrieben, aufgearbeitet.
    [0050] Das gleiche Insert wurde radioaktiv markiert und mit Southern-Analyse auf Hybridisierung mit dem DNS-Ausgangsmaterial, DNS-Extraktionen aus Stühlen von Kontrollpersonen, Hepatitis B-Virus-DNS und Escherichia coli Plasmid PBR 322 geprüft.
    [0051] Beispiel 6: Nachweis von Non-A, Non-B-assoziierter DNA im Serum
    [0052] 2 - 5 ml Serum werden bei 150.000 g 2 Stunden zentrifugiert. Das Sediment wird in 200 ul Proteinase K-Lösung (0,5 mg/ml + 10 mmol EDTA) bei 37°C 1 Stunde verdaut. Danach werden zu dieser Lösung 165 μl einer heiß gesättigten Natriumjod Lösung (2,5 g Natriumjodid/ml H2O, 75°C) gegeben (Endkonzentration 12,5 M). Diese Lösung wird 10 Minuten auf 90°C erhitzt und unmittelbar durch Nitrozellulosefilter mittels Vakuum filtriert (Dot-Blot-Apparatur, Schleicher + Schüll). Nach der Filtration wird die Nitrozellulosefolie 3 x mit 70%igem Äthanol gewaschen und darauf 10 Min. bei Raumtemperatur in 100 ml Essigsäureanhydrid (100 ml 0,1 M Triäthanolamin + 250 ul Essigsäureanhydrid) inkubiert. Nach der Inkubation wird die Folie im Vakuum bei 80°C 1 - 2 Stunden gebacken. Die trockene Folie wird in Vorhybridisierungslösung gebracht und 3 Stunden bei 65 °C inkubiert (6 x SSC, 1 x Denhardt, 0,5 % SDS, 20 ug/ml Hitze denaturierte Heringssperma-DNS entsprechend den Angaben in: Maniatis, Molecular Cloning, 1982). Mittels Nick-Translation (siehe Maniatis, Molecular Cloning, 1982) mit 32P-markierte Probe über Nacht unter Prähybridisierungsbedingungen inkubiert. Danach wird die Nitrozellulosefolie 3 x gewaschen (1) 6 x SSC, 1 x Denhardt, 0,5 % SDS, 20 μg/ml Heringssperma-DNA, 2) . 1 x SSC, 0,5 % SDS, 1 x Denhardt, 3) . 0,1 x SSC + 0,05 % SDS). Nach Trocknen der Folie wird diese auf einen Röntgenfilm (Kodak X-Ornat) aufgelegt (Autoradiographiezeit 6 Stunden bis 2 Tage bei -70°C). Bei Seren mit hohem Gehalt an HNANB-Viren kann die Ankonzentrierung von 2-5 ml Serum durch Zentrifugation entfallen und die Seren nach Proteinase-K-Verdauung entsprechend der Methode (Seelig et a l., klinikarzt 2/1985, Seite 86 ff) direkt auf Nitrozellulose aufgetragen werden. (s. Bsp. 7)
    [0053] Beispiel 7: HNANB-DNA-Nachweis im Serum
    [0054] 200ul Serum werden mit 75ul Proteinase K-Lösung (Boehringer) (4 mg/ml) und 25 ul 0,5 M EDTA bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Das Inkubat wird mit 100ul 1 N NaOH 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mit 250 ul 2 M NH4OAc neutralisiert. 500 ul des Ansatzes (entsprechend 181 ul Serum) werden auf Nϊtrozellulose aufgetragen (Dott-BIott-Apparatur Schleicher + Schüll). Mach nochmaliger Neutralisierung mit 250 ul 2 M NaH4OAc werden die Filter in Vakuum bei 80°C 45 Minuten getrocknet. Die Filter werden in 6 x SSC*, 0,5 % SDS**, 1 x Denhardt-Lösung*** und 20 ul/ml Hitze denaturierter (5 Minuten, 100°C) Heringsperma-DNA bei 65°C 3 Stunden prähybridisiert. Zur Hybridisierung die über Nacht unter Prähybridisierungsbedingungen erfolgt, wird das durch Nick-Translation mit 32P-markierten Inserte der Phagenclone verwendet (spezifische Aktivität ca.1 - 2 x 109 cpm/ug DNA). Die Filter werden danach jeweils einmal 20 Minuten bei 65°C mit 6 x SSC, 1 x DenhardtLösung, 0,5 % SDS, 20 ug/ml denaturierter Heringssperma-DNA, danach mit 1 x SSC, 0,5 % SDS 1 x Denhardt-Lösung und 0,1 x SSC, 0,05 % SDS gewaschen und bei 80 C getrocknet. Die Autoradiographie erfolgt mittels Röntgenfilm und Verstärkerfolie (intensiv fying screens Kodak) mit einer Autoradiographiezeit von 6-48 Stunden bei -70°C.
    [0055] * 20 x SSC (Standard Saline Citrat) entspricht 3 M NaCl, 1,5 M Natriumeitrat.
    [0056] ** SDS Natrium dodecylsulfat
    [0057] *** 100 x Denhardt-Lösung entspricht 2 % Ficoll; 2 % Polyvinylpyrolidon, 2% Bovin Serumalbumin. Beispiel 8
    [0058] Dieses Beispiel zeigt eine einfachere Variante bezüglich der Probenvorbereitung zum Dot Blot:
    [0059] 1 ml Serum wird mit 350μl Proteinase K-Lösung (3 mg/ml Proteinase K, 10 mM TRIS pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 0,5 % SDS) und 125 μl 0,5 M EDTA -30 Min. bei 37°C inkubiert. Darauf wird die Lösung mit 8 ml 2 M TCA (pH 7,0), 3,2 ml 2 MNH4AC, 20 μl t RNA (10 mg/ml) und 5,3 ml H2O auf 16 ml verdünnt und die DNA mit 10 ml isopropanol bei Raumtemperatur für 30 Min. gefällt. Die DNA wird abzentrifugiert (15 Min. bei 8000rpm), das Pellet mit 2 ml 70 % Ethanol gewaschen und in 600μl 10 mM TRIS pH 8,4 und 1 mM EDTA aufgenommen, einmal mit Phenol, einmal mit Chloroform extrahiert und nochmals gefällt. Aliquots der gefüllten DNA können für die Dot Blots oder für Restriktionsanalysen eingesetzt werden.
    [0060] Die Darstellung von partikelassoziierter DNA aus Stuhlproben erfolgt in gleicher Weise. Stuhlsuspensionen werden allerdings vorher steril filtriert und mit PEG gefällt.
    [0061] Beispiel 9
    [0062] Wenn nur relativ wenig der N-A, N-B-assoziierten Substanz vorliegt, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die DNA durch Amplifizieren nachzuweisen:
    [0063] Der Nachweis von Non-A, Non-B-DNA im Serum kann zweckmäßig durch Hybridisierung mit radioaktiv markierter klonierter Non-A, Non-B-DNA-Probe nach vorangehender spezifischer enzymatischer DNA-Amplifizierung nach bekannter Methode (SAIKI et al., Science 230, 1350, 1985) erfolgen. 25μl Serum + 50μl NaJ (gesättigte Lösung) mischen und 2 Min. bei 37°C inkubieren, danach 10 Minuten bei 0°C inkubieren. Das inkubat wird auf eine polycarbonatmembran (z.B. Uni Pore von Firma BioRadLab) gegen TE-Puffer (10 mmol Tris; lmmol EDTA) 20 Min. dialysiert. 5μl des Dialysats werden für die spezifische enzymatische DNA-Amplifikation entnommen. Die Amplifikation erfolgt nach bekannter Methode (SAIKI et al. 1985) mit Hilfe von je 0,5 μg Oligoprimer (Paa B bzw. C und D). Die Oligoprimer-Paare werden nach bekannten Sequenzierungsdaten mittels eines
    [0064] DNA-Synthesizers (Applied BioSystem 381) hergestellt. Nach Amplifizierung wird das Reaktionsgemisch auf einem 2%igen Agarosgel elektrophoretisch aufgetrennt, danach auf eine Nylonmembran (Genofit) transferiert und mit einer nach FEINBERG et al. 1983 (Annal. Biochem. 132, 6-13) mit 32P markierten klonierten HNANB-DNA-Probe hybridisiert. Nach Autoradiographie werden positive Resultate anhand mitgeführter Standards und Längenmarker identifiziert.
    [0065] Beispiel 10
    [0066] Nachweis von DNA in geprüft infektiösem Plasmaderivat: Renger F. et al. veröffentlichten in "Deutsches Gesundheitswesen" Vol. 36, S. 560-563 (1981) eine Studie über eine kontrollierte Hepatitis Non-A, Non-B-Epidemie, ausgelöst durch die Applikation infektiöser Antirhesusfaktor D immunglobulinpräparate. Die Herkunft dieser kontaminierten Präparate konnte vollkommen aufgeklärt werden. Nach Applikation dieses anti-D-Präparates erkrankten 79 % von 116 immunisierten schwangeren Frauen. Dieses anti-D-Präparat (Charge I Ampulle A und C) sowie eine Charge mit niedriger Infektiosität (Charge II Ampulle B und D), die durch das selbe Säulensystem gereinigt wurde, standen zusammen mit Kontrollpräparationen (Gammavenin, Endobolin, Rhesonativ) zur Verfügung. Diese präparationen wurden zusammen mit Pufferkontrollen, Hepatitis B-Virus-haltigem Serum, Positivkontrollen mit clonierten Virus-DNA-Fragmenten eingesetzt. Der Nachweis erfolgte mittels DNA-Amplifikation durch die Primer 237-238 (entstammen dem 0,4 Kb EcoRl-Fragment). Ergebnisse:
    [0067] In mehrfachen, unter verschiedenen Bedingungen durchgeführten Experimenten, fand sich nach Amplifikation ein starkes Signal in der Charge I (Ampulle A und C), ein schwaches Signal bei guter Amplifikationsausbeute in der
    [0068] Charge II (Ampulle B und D). Die drei Kontroll-Lyophilisate Gammavenin, Endobolin und Rhesonativ ergaben kein Signal. Der Zusatz von Hepatitis B-Virus-Genomspezifischen Primern zu den verschiedenen Gammaglobulin-Präparationen ergab ebenfalls keinen Hinweis auf die evtl. Kontaminierung mit Hepatitis B-Genom. Die mitgeführten Kontrollen dienten der Beurteilung der Effizienz der Amplifikation sowohl mit HBV-spezifischen Primern als auch mit Non-A, Non-B-spezifischen Primern. Der Nachweis der Identität der in der infektiösen Charge befindlichen DNA mit der DNA aus den Feces eines Patienten mit Hepatitis Non-A, Non-B sprechen für die Identifizierung einer in Hepatitis Non-A, Non-B-implizierten DNA.
    [0069] Die Untersuchung von weiteren 57 Stuhlproben von Patienten mit sporadischer und posttransfusioneller HNANB mittels Radioimmunoassey wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben und im Dot-Blot-Verfahren, ergab eine signifikante Korrelation der beiden üntersuchungsverfahren hinsichtlich nachweisbarer HNANB-assoziierten Substanz (RIA) und nachweisbarer DNA (Dot-Blot, siehe Beispiel 7). Die beigefügten Abbildungen erläutern die Erfindung:
    [0070] Fig. 1 ist die Sequenz des Genoms
    [0071] Fig. 2 ist eine Übersicht über die Schnittstellen mit EcoRl sowie die offenen Leserahmen und Leseraster Fig. 3 und Fig. 4 zeigen den Plus- und Minusstrang einer ca. 0,3 Kb
    [0072] Sequenz, also einer Teilsequenz des Genoms Fig. 5 zeigt den offenen Leserahmen, und zwar die
    [0073] Leseraster 1A, 2A und 3A, und Fig. 6 zeigt den offenen Leserahmen für die Leseraster 1B,
    [0074] 2B und 3B.
    [0075] Die Sequenzierung der in den Figuren beigefügten Sequenzen erfolgte nach der Sanger-Methode nach Umklonieren von PUC 8 in M 13 bzw. Bluescript Vektor.
    [0076] Die Charakterisierung dieser in Fig. 1 gezeigten ursprünglich vorliegenden aus Stuhlisolaten isolierten DNA zeigt, daß es sich um eine partiell doppelsträngige zirkuläre DNA handelt.
    [0077] Die DNA zeigt Verwandtschaft mit HBV-DNA. Wenn ein kloniertes 0,45 Kb Fragment oder gereinigtes Stuhlmaterial mit 32P markiert und in einer Southern-Analyse an HBV-DNA hybridisiert wurde, ergaben beide Proben ein Signal, allerdings etwa 1000-fach geringer als mit sich selbst. Plasmid pBR 322 und Lambda Phage ergaben kein Signal, in Vorversuchen konnte die gereingite Stuhlprobe, ohne denaturiert zu werden, sehr gut mit dem kleinen Fragment der E.coli Polymerase markiert werden.
    [0078] Mit Klenow polymerase behandelte Stuhlprobe migrierte in einem Agarosegel deutlich langsamer als die unbehandelte Probe. Dies spricht dafür, daß die untersuchte DNA, ebenso wie HBV-DNA, partiell doppelstrangig ist. Die Ergebnisse und Behandlung mit Restriktionsenzymen und Primerextension beweisen eine circuläre Struktur der DNA. Die mehrfach durchgeführten Sequenzanalysen beider DNA
    [0079] Stränge ergaben 4998 Basenpaare. Die Sequenz ist vom 5'- zum 3'-Ende dargestellt, die Nummerierung mit 1 beginnt im ersten Nucleotid des 2,5 Kb EcoRI-Fragments in dem DNA-Strang, der die großen offenen Leserahmen enthält (siehe Abb. 2). Ein in der Darstellung nicht gezeigtes DNA-Fragment von ca. 10 bis 20 Basenpaaren wurde experimentell nachgewiesen und grenzt an die 2,5 und 1,5 Kb EcoRl-Fragmente und bedingt also den Ringschluß der linear abgebildeten DNA (vgl. Abb.2). Der Nachweis dieses Fragments wurde durch ein Amplifikationsexperiment erbracht, wobei gereinigte Virus-DNA mit Klenow Polymerase und den beiden synthetischen Primern 13 und 17 inkubiert und die DNA-Sequenz zwischen den Primern mehrfach amplifiziert und nach Elektrophorese durch Southern-Analyse nachgewiesen wurde. Da die beiden Primer an den beiden Enden der sequenzierten DNA liegen, kann eine Amplifizierung eines Fragmentes nur erfolgen, falls die DNA zirculär vorliegt. Das Virus-Genom besitzt damit eine Gesamtlänge von 5.010 bis maximal 5.050 Basenpaare. Dieses Resultat wird zusätzlich durch unabhängige Southern-Analyse des Genoms bestätigt. Die Restriktionskarte des Genoms liegt vor. Die Reihenfolge z.B. der einzelnen EcoRI-Fragmente ist: 1,5 / 0,45 / 0,3 / 0,15 und 2,5 Kb.
    [0080] Bezüglich besonderer Merkmale der Sequenz ist auszuführen, daß eine Tange palindromische Sequenz (Hairpin) zwischen den Basenpaaren 2.097 und 2.149 am Ende eines offenen Leserahmens liegt (Pos. 4, Abb. 2).
    [0081] An der Position 424 und 3.303 befindet sich je eine "CTG"-Box. Bei der CTG-Box von 3.303 befinden sich auch 2 Repeats, die Sequenzhomologie mit den direkten Repeats der Hepadnaviridae aufweisen. Die offenen Leserahmen finden sich hauptsächlich nur auf einem Strang. Der andere Strang ist wie bei Hepatitis B-Virus-DNA bis auf kleinere Peptide geschlossen. Während der offene DNA-Strang ohne weitere Modifizierung für Proteine bis zu Molekulargewichten über 40.000 codieren kann, sind im Komplementärstrang weite Bereiche aller drei Leseraster geschlossen bis auf 5 Peptide von einem kleineren Molekulargewicht von ca. 6.000 (siehe Abb. 2 und Abb. 5 und 6).
    [0082] Alle überlappenden clone ergaben für die gleiche Sequenz identische Resultate mit einer Ausnahme, wo an der Pos. 2.381 in einem Fall G , in einem anderen Fall A gefunden wurde. Ein Sequenzierfehler ist auszuschließen.
    [0083] Das gibt einen Hinweis darauf, was durch weitere Befunde bestätigt wird, daß Abweichungen von einigen Prozent, insbeondere 1 bis 2 %, in der Regel keinen Einfluß auf die Funktion der Sequenz haben, so daß funktioneile äquivalente Abweichungen bis 5 %, insbesondere bis 2 % von der Grundstruktur haben können. Das gleiche gilt auch für die von solchen DNAs kodierten Proteinen.
    [0084] Zusammenfassend läßt sich somit folgendes sagen: Die Non-A, Non-B-assoziierte Substanz ist gekennzeichnet durch die signifikante Bindung an immunglobuline und die Bindung an Fab2-Bruchstücke gereinigten IgGs, durch Bindung an nicht kollagenbindende Fibronectinspaltprodukte sowie durch die infektiösität gegenüber menschlichen Zellkulturlinien, die morphologisch darstellbar sind durch virustypische Veränderungen derselben und molekulargenetisch durch den Nachweis einer spezifisch hybridisierenden, gelelektrophoretisch bei einer scheinbaren Größe von 3,2 KB wandernden DNA (ungeschnitten und unter nativen Bedingungen), innerhalb dieser Zellkulturen. Die in den infizierten Zellen sowie im Serum von Non-A,
    [0085] Non-B-Hepatitis-Patienten nachweisbare DNA hybridisiert mit der aus Non-A, Non-B-Substanz isolierten, ca. 5 KB großen DNA bzw. der aus diesem Material hergestellten klonierten DNA.
    [0086] Die mte Sequenz von ca. 5.000 Basenpaaren gemäß Fig. 1 und Teilsequenz von ca. 300 Basenpaaren gemäß Fig. 3 und 4 der klonierten DNA wurden bestimmt und mit bekannten menschlichen DNA-Sequenzen, Phagen-DNA-Sequenzen, Plasmid-DNA-Sequenzen und bekannten publizierten Virus-DNA-Sequenzen verglichen. Sie entsprechen nach diesen Daten keiner bisher beschriebenen Sequenz. Nach dem offenen Leserahmen der Sequenz kann man Rückschlüsse auf die kodierten und exprimierten virusspezifischen Proteine ziehen. Damit kann man die hydrophilen und hydrophoben
    [0087] Regionen innerhalb der Peptide identifizieren und somit ist die Herstellung synthetischer Peptide aus den möglichen antigenen Epitopen in den hydrophilen Regionen möglich.
    [0088] Die gefundene DNA, insbesondere die auf dieser DNA sich befindlichen Gene können zur insertion in entsprechende Expressionsvektoren, wie Zellen und Bakterien (z.B. E.coli und Hefen, wie Syccharomyces cereviciae sowie Zellkulturen), und damit zur Herstellung von Virusantigenen benutzt werden. Damit ist die Diagnostik und die Herstellung von Immunreagentien und Vaccinen möglich. Bei der Diagnostik sind insbesondere die Untersuchung auf Infektiosität (Blutkonservenuntersuchung) und die Diagnose einer akuten, chronischen oder zeitlich zurückliegenden Infektion zu nennen, in Zellkulturen hergestellte Antigene sowie die entsprechenden, durch diese Virus-DNA in vivo und in vitro synthetisierten Proteine können zur Erstellung immunologischer Diagnostika benutzt werden. Die DNA-Sequenz läßt sich zur Identifizierung potentieller Virusproteine und deren synthetischer Herstellung, also die Herstellung synthetischer antigener Peptide, verwenden, ebenso wie sich die DNA bzw. DNA-Teilsequenzen zur Herstellung synthetischer DNA oder RNA bzw. DNA- oder RNA-Fragmente und für den
    [0089] Einsatz derselben als Sonden oder Primer für die Diagnostik einsetzen lassen, schließlich kann man die DNA bzw. die erstellte DNA-Sequenz zur Herstellung synthetischer Viren (vollkommene DNA-Synthese) und zur insertion von synthetischer DNA oder DNA-Fragmente in entsprechende
    [0090] Vektoren verwenden, um Virusexpressionsprodukte zu erhalten.
    权利要求:
    ClaimsPatentansprüche
    1. NANB-Hepatitis assoziierte DNA, enthaltend vor allem die DNA nach Figur 1 sowie funktionelle Äquivalente und Teilsequenzen davon.
    2. NANB-Hepatitis assoziierte DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie höchstens 5 %, insbesondere höchstens 2 % Abweichung von der Struktur und/oder der Kettenlänge der DNA nach Fig. 1 zeigt .
    3. NANB-Hepatitis assoziierte DNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie partiell doppelstrangig zirkulär und aus einem NANB-Hepatitis assoziierten Partikel bzw. aus Virus isoliert ist.
    4. DNA-Teilsequenz nach Anspruch 1 -3, dadurch gekennzeichnet, daß sie Fig. 3 bzw. 4 mit maximal
    5 %, vorzugsweise maximal 2 %, Abweichung entspricht.
    5. Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch eine DNA nach Anspruch 1 bis 4 kodiert sind oder derart kodierten Proteinen entsprechen.
    6. Proteine nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Sequenzen der offenen Leserahmen gemäß
    Fig. 5 und 6 entsprechen.
    7. Verfahren zur Herstellung der NANB-assoziierten DNAs nach Anspruch 1 -4 (sowie der Proteine nach Anspruch 5 und 6) aus Stuhl, Gewebe, Körperflüssigkeiten oder Viruskulturen, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial, ggfs. nach vorheriger Sterilfiltration und Fällung mit PEG bei Stuhlsuspensionen, mit DNase und ggfs. RNase zur Verdauung inkubiert wird, dann ein Dichtegradient, insbesondere CsCl, d = 1,3, angelegt wird, worauf Dialyse, Verdauung mit Proteinase K, Phenolextraktion, Äthanolfällung und ggfs. Extraktion und erneute Fällung und Isolierung sowie ggfs. Klonen und ggfs. exprimieren in entsprechenden Vektoren erfolgen.
    8. Verwendung der DNAs nach Anspruch 1 bis 4 als DNA-Sonden zur Diagnose, insbesondere nach klassischen Hybridisierungsverfahren, oder zur Expression in geeigneten Vektoren.
    9. Verwendung der DNAs nach Anspruch 1 bis 4 zur Synthese von Proteinen zur Erzeugung immunologischer Reagentien für den Nachweis von NANB-Hepatitis und zur Erzeugung von Impfstoffen.
    10. Verwendung der DNAs nach Anspruch 1 bis 4 oder der auf diesen DNAs befindlichen Gene bzw. der entsprechenden DNA-Sequenzen zur Herstellung synthetischer Viren und zur Insertion der natürlichen oder synthetischen DNAs oder DNA-Fragmente in entsprechende. Vektoren zur Bildung von Virusexpressionsprodukten und zur Herstellung von Virusantigenen.
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    优先权:
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