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    公开号:WO1987001373A1
    申请号:PCT/JP1986/000441
    申请日:1986-08-28
    公开日:1987-03-12
    发明作者:Hideo Inoue；Eiko Ohtsuka；Akihiro Imura；Kenichi Masuda；Takashi Kamimura
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:C07H19-00
    专利说明:
    [0001] 明 m 発明の名称
    [0002] ピ リ K ピ リ ミ ジンヌ ク レォチ ド誘導体 技術分野
    [0003] 発明は、 螢光を発する ピ リ ド ピ リ ミ ジンヌ ク レォチ ド誘導体及びこれら を分子中又は分子末端に含むォ リ ゴ 又はポ U ヌ ク レ才チ ドに関する。
    [0004] 背景技術
    [0005] 生体髙分子、 特に蛋白質ゃ核酸にぉける構造と機能の 相関を明 らかに するために 、 螢光プロ ープを利用 し た研 究が広 く 行なゎれて ぃる 。 そ して核酸の研究にぉぃて は 核酸中に存在す る螢光性の徴量塩基をプロ ープ と して用 ぃる方法ゃ 、 核酸へ萤光分子を化学的に導入 し て これを プロ ープと し て用ぃる方法がぁる。 螢光性塩基を有する ヌ ク レ才シ ドの例 と し て は、 ァデノ シ ン類ゃシチジン類 をク ロルァセ 卜 ァルデヒ ドで化学修飾 し て得 ら れる、 下 記式で示されるょ ぅ な螢光性のェテ ノ 誘導体がぁる。
    [0006]
    [0007] H O O H
    [0008] 1 , N 6 ー ェテ ノ ァ 3, N
    [0009] デ ノ シ ン
    [0010] 特に 、 ェテ ノ ァデノ シン類 は 、 中性で強 く 螢光を発す る こ と ら 、 こ れをプ ロ ー プ と し て 用 ぃ て 種々 の研究が 行なゎ れて き た 。 し か し 、 こ れ ら は塩基対形成能を有 し な ぃ 。
    [0011] 発明の 開示
    [0012] 本発明者 ら は 、 螢光性を有 し グ ァニ ンぁ る ぃ は ァデニ ン と の塩基対形成が可能な 、 ビ リ ミ ジ ンヌ ク レ 才 チ ド誘 導体を得るべ く 鋭意研究を行な ぃ 、 本発明 に到達 し た 。
    [0013] 即ち 、 本発明 は 、 ー般式 （ I )
    [0014] Y 1 Z 1
    [0015] 式 （ I ) に ぉぃ て 、 X 1 と Y 1 は各々
    [0016] 0
    [0017] II
    [0018] H 0七 P — 0子 n を表ゎ す （ n は 0 , 1 , 2又は 3の
    [0019] 0 H
    [0020] 整数を示す 、 但 し X i と Y i が共 に n = 0で はなぃ ） Z i は水素又 は
    [0021] .0
    [0022] II
    [0023] H 0 P — 0子 m を表ゎ す （ m は 0 , 1 , 2又 は 3の
    [0024] 0 H
    [0025] 整数を示す ） 。 W i は水素又 は水酸基を表ゎ す 。
    [0026] と R 2 に っ ぃ て は 、 R 1 が ァ ミ ノ 基又 はハ ロ ゲ ンの と さ は 、 R 2 は 7位の炭素 と 8位の窒素間 の単結合 を表ゎ し 、 R 2 が水素又 は低級ァルキル基の と き は、 R 1 は 7位の炭素 と の カ ルポニル結合 （ C = 0 ) を表ゎ す
    [0027] で表ゎ さ れる ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド誘導体 、 及び分子中又は分子末端に 、 ー般式 （ E )
    [0028] 又
    [0029] Η
    [0030] ゎ
    [0031] X
    [0032] 0
    [0033] II
    [0034] は 0— P O Hを表ゎ す （ 但 し他方 は水素又は水
    [0035] 0 H
    [0036] 酸基を表ゎす 〉 （ r は 0. 1 , 2又 は 3の整数を示 し 、 s は 1 , 2又 は 3の整数を示す ） 。 W 2 は水素 又 は水酸基を表ゎ す 。 R i と R 2 に っ ぃ て は 、 が ァ ミ ノ 基又はハ ロ ゲ ンの と き は 、 R 2 は 7位の炭 素 と 8位の窒素間の単結合を表ゎ し 、 R 2 が水素又 は低級 ァルキル基の と き は 、 R i は 7位の炭素 と の カ ルポ ニル結合 （ ^： C = 0 ) を表ゎ す 。 で表ゎ さ れる螢光性ヌ ク レ 才 チ ド を 、 少な く と も 1 個 含有す る 才 リ ゴ又 は ポ リ ヌ ク レ 才 チ ド で ぁ る 。 図面の簡単な 説明 第 1 図 は 、 固相 リ ン酸 卜 リ ェス テル法に ょ る 才 リ ゴヌ ク レ 才 チ ド の合成 シ ス テ ム を示す 。 第 2図 は 、 本発明の ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン塩基の R N ase Aに ょ る水解反応を示 す 。 第 3図 と第 4図 は 、 本発明 の ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド を含む 才 リ ゴヌ ク レ 才 チ ド の 、 吸光度 と 温度の 関係を示す 。 第 5図は 、 本発明の 才 リ ゴヌ ク レ 才 チ ドの ホ モ ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に ょ る フ ン ガ ー プ リ ン ドを示す 。 第 6図 は 、 ホ ス フ ァ ィ 卜 · 卜 リ ェ ス テル法 に ょ る 才 リ ゴヌ ク レ 才チ ド の合成シ ステ ム を示す 。 発明を実施す る た め の最良の形態 本発明のー般式 （ I ) に ぉ ぃて特 に 好ま し ぃの は 、 X i 0
    [0037] II
    [0038] 及び Z又は Y が H Oそ P — 0子 n ( n は 1 , 2 又 は
    [0039] 0 H
    [0040] 3 の整数を示す 〉 で ， Z 1 が水素又 は水酸基で ， W 1 が 水素で ぁる化合物でぁ 。
    [0041] 水酸基が公知の適当な保護基で保護さ れて ぃる も の ち 本発明の範囲 に 含 ま れ Ό a
    [0042] —般式 （ I ) に ぉ ぃ て 、 X t と Y 1 が共 に水酸基 （ 本 発明 の範囲 に は含 ま れなぃ ） で W t と Z 1 が水素又は水 酸基の化合物 は 、 水銀化合物を用 ぃ る B ergst romら の方 法 （ J . O rg. C hem. ， il, 2174 ( 1982 ) ) に ょ っ て合 成で き る 。 別 な方法 と し て は 、 例 ぇ ば 、 5 — ョ ー ド デ 才 キ シ ゥ リ ジ ン に P d ( 0 A c ) 2 と P h 3 P の存在下 に ァ ク リ ル酸メ チルを作用 さ せ 、 得 ら れ た 化合物 の糖水酸 基を ァ セ チル基で保護 し た 後 、 4 位の 卜 リ ァゾ リ ド化を 行な ぃ 、 ァ ン モニ ァで処理 す る こ と に ょ り デ ォ キ シ シ チ ジ ン誘導体を得 、 次ぃで得 ら れた化合物 を水中で髙圧水 銀灯で照射 し 、 ピ リ ド C 2,3- d ] ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 シ ドを得る方法で ぁる 次に 、 一般式 （ I ) の化合物 に ぉ ぃ て R 1 がハ ロ ゲ ン のも の は 、 前記 ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 シ ド の塩基部の変換 反応に ょ っ て得る こ と ができ る 。 例 ぇば 、 ピ リ ド [ 2,3
    [0043] - d ] ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 シ ドの糖水酸基を ァセチル基 で保護 し た後、 ク ロ ロ ホルム中で P 0 Ci 3 と ジ メ チルホ ルム ァ ミ ドを 70 で 1 時間作用 さ せる こ と に ょ り 、 7 位 が Ci 体のもの が得 ら れる 。
    [0044] ま た R i が ァ ミ ノ 基のも の は 、 例 ぇば、 5 — ョ ー ドデ 才 キ シ ゥ リ ジ ン に P d ( 0 A c ) 2 と P h 3 P の存在下、 ァ ク リ ロ ニ 卜 リ ルを作用 さ せ る こ と に ょ り 、 5 位 に シ ァ ノ ビ ニル基が入 っ た 化合物 を得、 次ぃ で 4 位の 卜 リ ァゾ リ ド化を行な ぃ 、 その後ァ ン モニ ァで処理する こ と に ょ り デ 才キ シ シ チジ ン誘導体を得 、 次ぃで こ の化合物 の水 溶液に高圧水銀灯で 60分圚光照射を行な ぅ こ と に ょ っ て 得 ら れる 。
    [0045] こ れ ら の化合物 は 、 後述の如 く す べ て 螢光性を示 し か っ ピ リ ミ ジ ン 塭基 と し て の特性を示 し た 。
    [0046] 上記の如 く し て 得 ら れた 螢光性ヌ ク レ 才 シ ド は 、 その
    [0047] 3 ' 位又は 5 ' 位に 後述の如 き方法で リ ン 酸基を導入 し 本発明の ヌ ク レ 才 チ ド と す る こ と がで き る 。
    [0048] か く し て得 ら れた 一般式 （ I ) の化合物 は 、 螢光性で ぁ り かっ 核酸塩基のグ ァ ニ ン ぁ る ぃ は ァデニ ン と塩基対 を形成す る能カ が ぁ る ので 、 こ れを分子中又 は分子末端 に 有する 才 リ ゴ又 は ポ リ ヌ ク レ 才 チ ド は 、 螢光プ ロ ーブ と し て 利用 で き る 。 ぁ る ぃ は 、 こ れ ら の化合物 は 、 D N A ニ重 らせん中 に組み入れた際 に 、 塩基部分 は空 闥的に 適合 し て ぉ り 、 相補的な塩基間の水素桔'合形成能カ 又 は ス タ ッ キ ング作用 を増強する可能性も考ぇ ら れる 。
    [0049] ま た 、 本発明 の一般式 （ ΙΓ ) に ぉ ぃ て 特に好 ま し ぃの 0
    [0050] は 、 X 2 が ー P— 0— で ぁ り 、 Y 2 が ー 0— で W 2 が水
    [0051] 0 H
    [0052] 素でぁる 、 才 リ ゴ又はポ リ ヌ ク レ ォ チ ドでぁる 。
    [0053] 螢光性ヌ ク レ 才 シ ド又 はヌ ク レ才 チ ド を D N A才 リ ゴ マ ー ぁる はポ リ マ ー へ導入する に は 、 有機化学的に合成 する方法 と 、 酵素化学的 に導入す る 2通 り の方法が と ら れる。
    [0054] 有機化学的に合成する方法は 、 螢光性ヌ ク レ ォ シ ド ( F ) を含むォ リ ゴヌ ク レ 才 チ ド を直接合成す る方法で ぁ る 。 その方法 と し て 、 例 ぇば I takuraら が開発 し た 固 相 リ ン酸 卜 リ ェ ス テル法 ， ホ ス フ ァ ィ 卜 ♦ 卜 リ ェ ス テル 法等がぁる 。
    [0055] ( 固相 リ ン酸 卜 リ ェス テル法 は 、 第 1 図 に示 す サ ィ ク ルに従 っ て 合成を行な っ た 。 す なゎ ち ス テ ッ プ 1 と し て べ ンゼ ンスルホ ン酸 （ B S A ) で 、 5' — 水酸基の ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル基 （ D M T r 基 ) を除去 し 、 ステ ッ プ 2 で 、 ダィ マ ー プ ロ ッ ク を メ シ チ レ ン ス ルホ ン酸ニ 卜 ロ 卜 リ ァゾ ール （ M S N T ) で縮合 し 、 固相③ に担持さ れ た F含有才 リ ゴマ ー の鎮を伸長 し た 。 ま た 、 目 的 と異な る 配列の ォ リ ゴマ ー生成を 防ぐた め に 、 縮合反応 に ぉ ぃ て 未反応の 5' — 水酸基 は 、 4 ー ジメ チル ァ ミ ノ ピ リ ジ ン ( D M A P ) 存在下無水酢酸 （ A c 2 0 ) でキ ャ ッ ピ ン グを行な っ た 。 こ のサィ ク ルを く り 返す こ と に ょ っ て 、 目 的 と する 才 リ ゴマ ー を合成 し た 。 才 リ ゴヌ ク レ 才 チ ドのポ リ マ ー 支 持体か ら の切 り 出 し と リ ン酸の保護基の 除去は、 室温で ァ ン モニ ァ水で処理す る こ と に ょ り 行な っ た 。
    [0056] 更 に ァ ン モニ ァ水で加熟処理する こ と に ょ り 、 塩基部 の ァ シル基を 除去 し た 。 次ぃで逆層の シ リ カ ゲル カ ラ ム ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー で精製 し 、 必要な フ ラ ク シ ョ ン を分 取 し 、 5 ' — 末端の D M T r 基を除去 し 、 更に髙速液体 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ーで糖製 し た 。
    [0057] (3) ホ ス フ ァ ィ 卜 · 卜 リ ェス テル法 は、 第 6 図 に 示 す サ ィ ク ル に従 っ て 合成を 行な っ た 。
    [0058] す なゎ ち ス テ ッ プ 1 と し て 、 卜 リ ク ロ ロ 舴酸 （ T C A 〉 で 、 5 ' — 水酸基の ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル基 （ D M T r 〉 を 除去 し 、 ス テ ッ プ 2 で 、 ヌ ク レ 才 シ ド 一 3 ' — ホ ス ホ ァ ミ ダィ ド を テ 卜 ラ ゾ ー ル に ょ り 活性化 し た 。 ステ ッ プ 3で 、 活性化 し た ヌ ク レ 才 シ ド — 3 ' — ホ ス ホ ァ ミ ダ ィ ドを 5 ' — 水酸基 と カ ッ プ リ ングさ せ た 。 ま た 、 未反応 の 5 ' — 水酸基 は 、 4— ジ メ チル ァ ミ ノ ピ リ ジ ン （ D M A P ) 存在下 、 無水 ft酸でキ ャ ッ ピ ン グ し た 。 ステ ッ プ 5 で ョ ゥ素で 3 価の リ ン を 5 価に 酸化 し た 。 こ の サ ィ ク ルを く り 返す こ と に ょ り 、 目 的 と する 才 リ ゴマ ー を合成 し た 。 次ぃで リ ン 酸の保護基の除去を チ ォ フ I ノ ー ル に ょ っ て 行な っ た後 、 才 リ ゴヌ ク レ 才 チ ド のポ リ マ ー支持 体か ら の切 り 出 し は 、 ァ ン モ ニ ァ水 に ょ り 行な っ た 。 以 後、 常法に従 っ て精製 し た 。
    [0059] 螢光性ヌ ク レ 才 シ ド又はヌ ク レ 才チ ド を D N A 才 リ ゴ マ ー ぁ るぃ はポ リ マ ー に酵素化学的に導入する方法 と し て は 、
    [0060] 0) D N A ポ リ メ ラ ーゼを用 ぃるニ ッ ク ♦ 卜 ラ ンス レ ー シ ョ ン
    [0061] ( R igby, P . W . ら ， J . M ol . B iol . , 113, 237 ( 1977 ) 参照 ）
    [0062] (S) 未端デ才キ シヌ ク レ ォ チ ド 卜 ラ ンス フ I ラーゼを用 ぃ る 3' — 末端付加反応
    [0063] ( F . J . B 01 I u m , T he E nzymes, ( P . D .
    [0064] B oyer, ed . ) , 3 rd E d. V ol .10 , pp.145- 171 , A cademic P ress, N ew Y ork , N . Y . ( 1974 ) 参 ノ昭"、 /）
    [0065] の 2っ が 、 通常用 ぃ ら れる 。
    [0066] ぃず れの酵素を用 ぃる場合 に も 、 基質 と し て は 、 好 ま し く は 、 ヌ ク レ 才 シ ド 5' — モ ノ リ ン酸が用 ぃ ら れる 。 螢光性ヌ ク レ 才 シ ド の 5' — 卜 リ リ ン酸の合成 は 、 Y os hi kawaら （ T etrahedron L ett. , 5065 ( 1967 ) ) の方 法 に従 っ て合成で きる 。 ま た 、 5' — モ ノ リ ン酸をィ ミ ダゾ リ ド と し た後ジ リ ン酸 と 反応さ せる 、 5' — 卜 リ リ ン酸の合成は 、 O tto ら の方法 （ J . A m . C hem . 87, 1785 - 1788 ( 1965 ) ) に従 っ て 行な ぅ こ と ができ る 。
    [0067] 次に合成 し た 5' — 卜 リ リ ン酸を基質 と し て 用 ぃ 、 D N A ポ リ メ ラ ーゼ を用 ぃ て 、 ニ ッ ク ， 卜 ラ ン ス レ ー シ ョ >を行な ぅ と 、 シ チジ ンの代 り に 、 螢光性ヌ ク レ 才 チ ド が導入さ れ螢光標識さ れた 才 リ ゴマ ー ぁ るぃ はポ リ マ ー を調製す る こ と ができ る 。 ま た 、 未端デ才 キシ ヌ ク レ 才 チ ド 卜 ラ ンス フ ヱ ラ ー ゼ を用 ぃる と 、 3 ' — 末端に螢光 性ヌ ク レ 才 チ ド ポ リ マ ー を付加する こ と がで きる 。
    [0068] 以下 、 参考例 ， 実施例 に ょ り 本発明 を詳述する 。 参考例 1
    [0069]
    [0070] (a) <b)
    [0071] <C) (d) (1) シチジ ン〈a> 14.73 を蒸留水 200δώ に 溶解 し 、 酢酸第 ニ水銀 21.53 を加ぇて 、 70 で 6 時間反応さ せ た 。 冷却 し た後、 6.5Μ塩化ナ 卜 リ ゥム水溶液 20 ^を加ぇて 、 室 温で 1 時間反応させ た 。 生成 し た 白色沈 ' を瀘取 し て 、
    [0072] 0.1Μ塩化ナ 卜 リ ゥ 厶 で 1 回 、 蒸留水 100 で 2 回 、 ェ タ ノ ール で 2 回 、 ジ ェ チルェ ー テル で 2 回ずっ 洗净 し 、 減圧下乾燥する と 、 5 — ク ロ ロ マ ー キ ュ リ ー シ チジ ン（b>が 273 得 ら れた 。
    [0073] (2) 5 — ク ロ ロ マ ー キ ュ リ ー シ チジ ン（b〉 19.1 を メ タ ノ ール 150ίώ に 懸濁 さ せ 、 こ れ に 0.1Μ 塩化 リ チ ゥ ムパ ラ ジ ゥ ム （ L i 2 P d Ci 4 ) メ タ ノ ー ル溶液 ァ ク リ ル酸メ チル 塩化第ニ銅 4.12 3 をそ れぞれ加 ぇ て 、 室温で 14時間撩拌 し た 。 パ ラ ジ ゥ ムの沈 ' を逋去 し 、 濾液に 硫化水素 を吹き込み生 じ た 沈殿を セ ラ ィ 卜 逋過で 除去 し た 。 逋液を飽和重曹水で 中和 し 、 減圧下濂縮乾固 し 、 残渣を水 ょ り 再結晶 す る と 、 （ E ) — 5 — （ 2 — メ 卜 キ シ カ ルポ ニルェテニル ） シ チジ ン（c〉 4.62 3 を得た 。
    [0074] (3) ( E ) — 5 — （ 2 — メ 卜 キ シ カ ルポ ニルェ テ ニル ） シチジ ン（c〉 590fflgを蒸留水 500^に溶解 し 、 髙圧水銀灯
    [0075] ( U shio U M 102 ) で 30分間照射 し た 。
    [0076] 反応液を減圧下乾固 し 、 残渣を水 ょ り 再結晶 し て 、 3 ー /3 — D — リ ポ フ ラ ノ シル ー 2 , 7— ジ 才 キソ ピ リ ド
    [0077] [ 2,3— d ] ピ リ ミ ジ ン（d〉 508/Bgを得た 。 物性値は以下 の通 り でぁ っ た 。 m. p. 240で
    [0078] U V λ max 330niB ( ε = 15 , 800 ) ,
    [0079] 250nn ( ε 15,000)
    [0080] ass ιαΖ e 295 ( + )
    [0081] N R ( D S 0 - d 6 - D i 0 )
    [0082] δ + 9.05 ( s, 1 H ) , 7 .58 ( d. 1 H J = 9H Z )
    [0083] 6.19 ( d.1 H . J = 9H z )
    [0084] 5.81 ( s, 1 H ) . 4.02 ( m， 3H ) , 3 .70
    [0085] 2H )
    [0086] 元素分析値 C H ts O s N 3 と し て 、
    [0087] C H N
    [0088] 計算値 （ ％ ) 48.82 4 .43 14 .23
    [0089] 実測値 （ ％ ) 48.61 4 .37 14 .01 参考例 2
    [0090] シ チ ジ ンの代 り に 2' — デ才 キ シ シ チ ジ ン ょ り 出発 し て 、 参考例 1 と 同様の方法 に 従 っ て 、 3 — 3 — D — V ー デ才キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ー 2 , 7— ジ 才 キソ ピ リ ド
    [0091] C 2 , 3 - d ] ピ リ ミ ジ ン を得 た 。 参考例 3
    [0092] シ チジ ンの代 り に 、 ァラ ビ ノ シルシ 卜 シ ン ょ り 出発 し て 、 参考例 1 と同様の方法に従 っ て 、 3 — /3 — D — ァ ラ ビ ノ フ ラ ノ シル 一 2, 7— ジ 才キソ ピ リ ド [ 2,3— d ] ピ
    [0093]
    [0094] (a) <b)
    [0095] 3 — 3 — D — リ ポ フ ラ ノ シル ー 2 , 7— ジ 才 キ ソ ピ リ ド
    [0096] [ 2,3- d ] ピ リ ミ ジ ン（a> 295fflgを無水ジ メ チルホルム ァ ミ ド 10 に 溶か し 、 こ れ に ョ ゥ化メ チル と炭酸 カ リ ゥ ム 0.21 2 を加 ぇ 、 室温で 12時闥反応さ せ た 。 炭 酸 カ リ ゥ ム を遽別 し 、 逮液を酢酸で中和 し 、 減圧下で 濂 縮乾固 さ せ 、 残渣を水 ょ り 再結晶 し て 、 3 — 3 — D — リ ポ フ ラ ノ シル 一 2 , 7— ジ 才 キソ ー 8 — メ チル ピ リ ド
    [0097] [ 2.3- d ] ピ リ ミ ジ ン（b〉 279fflgを得た 。 物性値 は以下 の通 り で り で ぁ っ た 。
    [0098] m. p. 263〜 265Ό
    [0099] U V λ max 330nm ( ε = 15,300 ) ,
    [0100] 253nm ( ε = 15,400)
    [0101] M ass fflZ e 309 ( M + )
    [0102] N R ( D S O - d6 - D 2 O ) δ + 9.06 ( s. 1 H ) . 7.57 ( d, 1 H , J = 9.5
    [0103] H z ) , 6.31 ( d, 1 H , J = 9.5H Z ) , 5.79 ( s, 1 H ) ,
    [0104] 元素分析値 C is H is O s N s と し て 、
    [0105] C H N
    [0106] 計算値 （ ％ ) 50.49 4.89 13.59 実測値 （ ％ ) 50.49 4.83 13.55 参考伢 5
    [0107]
    [0108] (a) (b>
    [0109]
    [0110] (C) <d) (1) 3 — jS — D — リ ポ フ ラ ノ シル ー 2 , 7— ジ才キソ ビ リ ド [ 2,3— d 〕 ピ リ ミ ジ ン（a) 2.01 gf を無水 ピ リ ジ ン 50 ^に溶か し 、 こ れに無水酢酸 を加ぇて 、 室温で 12時 間反応さ せた 。 氷冷下で メ タ ノ ール を加 ぇ 、 減圧下 で溶媒を留去 し 、 残渣をェ タ ノ ール水系で再結晶 し て 、
    [0111] V ,3' ,5' — 卜 リ — 0 - ァ セ チル ー 3 — i3 — D — リ ポ フ ラ ノ シル一 2 , 7 - ジ 才キソ ピ リ ド [ 2 , 3— d ] ピ リ ミ ジ ン（b〉 2.40 3 を得た 。
    [0112] (2) 才キシ塩化 リ ン 0.3fflg に無水 ク ロ ロ ホルム 20 ^を加 ぇ 、 更に ジ メ チルホルム ァ ミ ド 0.2 を加ぇて 室 Sで 10 分間反応さ せ た 。 次に 、 V ,3' ,5' ー 卜 リ — 0 — ァ セ チルー 3 — ）3 — D — リ ポ フ ラ ノ シル 一 2 , 7— 才 キソ ピ ド C 2,3- d ] ピ リ ミ ジ ン（b) 630/¾を加ぇ、 70 で 2 時闥 反応さ せ た 。 次 に 、 反応液を 減圧下濃縮 し 、 ク ロ ロ ホル ム — 水の系で抽出 し 、 ク ロ ロ ホルム層を無水硫酸ナ 卜 リ ゥ ム で 乾燥 し た α ク ロ ロ ホルム を減圧下留去 し 、 シ リ カ ゲル カ ラ ム ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に ょ り 精製 し 、 2' ,3' ,5' ー 卜 リ — 0 — ァ セ チル 一 3 — J3 — D — リ ポ フ ラ ノ シ ル一 2 — 才 キソ ー 7 — ク ロ ロ ピ リ ド [ 2,3— d 】 ピ リ ミ ジ ン（ひ 408fflgを得た 。
    [0113] (3) V ,3' ,5' — 卜 リ — 0 — ァ セ チル—ー 3 — /3 — D - リ ポ フ ラ ノ シル 一 2 — 才 キソ 一 7 — ク ロ ロ ピ リ ド [ 2,3 - d ] ピ リ ミ ジ ン（ 44ffl を塩化メ チ レ ン に溶解させ 、 こ れ に ァ ン モニ ァ飽和 メ タ ノ ール 10 ^を加ぇて 、 室温で 12時間反応さ せ た 。 そ の後、 反応液減圧下濃縮 し て 、 残 渣をェ タ ノ ール ー 水系で 再桔晶 し て 、 3 — j3 — D — リ ポ フ ラ ノ シル一 2 — 才 キソ 一 7 — ク ロ ロ ピ リ ド [ 2,3— d ] ピ リ ミ ジ ン（d〉 26/SSPを得た 。 物性値は以下の通 り でぁ っ た 。
    [0114] m. p. 189 - 190Ό
    [0115] U V λ max 293nm ( ε = 8,400) ,
    [0116] M ass m/ e 314 ( + )
    [0117] N M R ( D S 0 - d6 )
    [0118] δ + 10.58 ( br s, 1 H ) , 7.81 ( d , 1 H , J = 8.1 H Z ) , 7.08 ( d, 1 H , J = 8.1 H z ) ,
    [0119] 6.07 ( s, 1 H ) , 5.50 ( s, 1 H )
    [0120] 元素分析値 C l2 H l2 0 5 N 3 CJ * H 2 〇 と し て
    [0121] C H N Ci
    [0122] 計算值 （ ％ ) 43.33 4.25 12.67 10.70
    [0123] 実測値 （ ％ ) 43.66 4.13 12.72 10.74 参考例 6
    [0124]
    [0125] (a> (b> Ac
    [0126]
    [0127] (C) <d>
    [0128] ΗΟ
    [0129]
    [0130] (e)
    [0131] (1) 5 — ョ 一 ドデ才 キ シ ゥ リ ジ ン（a) 460δ¾ίを 、 無水ジ 才 キサ ン 20/^に 溶か し 、 こ れに 齚酸パ ラ ジ ゥ ム 22 , 卜 リ フ ェ ニルホ ス フ ィ ン 34fflg , 卜 リ ェ チル ァ ミ ン 0.3fli2 , ァ ク リ ロ ニ 卜 リ ル 0, 13 ^を加 ぇ 、 100 で 12時間反応さ せ た 。 沈殿を S別 し た の ち 、 硫化水素ガ スを吹き込み、 生 じ た 沈殿を セ ラ ィ 卜 逋過で 除去 し た 。 嫿液を減圧下濃 縮 し 、 残渣をシ リ カ ゲル カ ラ ム ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ーで精 製 し 、 （ E ) — 5 — （ 2 — シ ァ ノ ェ テ ニル ） デ才 キ シ ゥ リ ジ ン（b) 159 を得た 。
    [0132] (2) ( E ) 一 5 — （ 2 — シ ァ ノ ェ テニル ） デ才 キシ ゥ リ ジ ン（b》 U0¾gを無水 ピ リ ジ ン 5 ««に 溶か し 、 こ れ に無水 酢酸 1 / ^を加 ぇて 、 室温で 12時簡反応さ せる 。 氷冷下で 、 メ タ ノ ール を加ぇて 、 10分囿反応さ せ た の ち 、 減圧 下で溶媒を留去 し 、 残渣を ェ タ ノ ール ー 水系で再咭晶 し て 、 3' , 5' — ジ — 0 — ァ セ チル ー （ Ε ) — 5 — （ 2 - シ ァ ノ ェテ ニル 〉 デ 才 キ シ ゥ リ ジ ン（c) 1 を得た 。
    [0133] (3) 3' ,5' ー ジ ー 0 — ァ セ チル ー （ E ) - 5 - ( 2 — シ ァ ノ ェテ ニル ） デ才 キ シ ゥ リ ジ ン <c》 2.00 §f を無水 ァ セ 卜 ニ 卜 リ ル 2θΑώに 溶か し 、 こ れ に氷冷下で 、 卜 リ ェチ ル ァ ミ ン 9.2fflg , 才 キ シ塩化 リ ン 1.12 ^を加 ぇ 、 次 に 1.3M 卜 リ ァゾ一 ル ァ セ 卜 ニ 卜 リ ル溶液 50βώを加 ぇて 、 室 '温で 90分間反応さ せ た 。 そ の後 、 水を加 ぇ て 10分間放 置 し て 、 反応液を減圧下乾固 さ せ て 、 残渣を水 — ク ロ ロ ホル ム系で抽 出 し た 。 ク ロ ロ ホルム層 を無水硫酸 ナ 卜 リ ゥ ムで乾燥 し た後 、 滅圧下で ク ロ ロ ホル ム を留去 し た 。 残渣を ジ 才キサ ン 20/ ^ に 溶か し 、 ァ ン モニ ァ水を加 ぇ て 、 室温で 12時間放置 し た 。 減圧下で S縮乾固 し 、 残渣を C 一 18逆相 シ リ カ ゲル カ ラ ム ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー （ 20% ァ セ 卜 ン Ζ水で溶出 ） に て精製 し 、 （ Ε ) — 5 — （ 2 — シ ァ ノ ェ テ ニル ） デ 才 キ シ シ チジ ン <e〉 1.28 3 を得た 。
    [0134] (4) ( E ) - 5 - ( 2 — シ ァ ノ ェテ ニル ） デォキ シ ゥ リ ジ ン（e) 250«？を蒸留水 500^ に溶か し 、 髙圧水銀灯で 60 分闥光照射 し た 。 反応液を減圧下濃縮 し て 、 残渣を シ リ カ ゲルカ ラ 厶 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に て精製 し 、 水か ら 再 結晶 し て 、 3 — — D —デ才 キ シ リ ポ フ ラ ノ シルー 2 才キソ一 7 — ァ ミ ノ ピ リ ド [ 2 , 3— d 】 ピ リ ミ ジ ン（f) 159fl¾f を得た 。
    [0135] 物性値 は以下の通 り でぁ っ た σ
    [0136] ra. p， 220Ό ( 着色 ）
    [0137] U V ( 中性 ） 252 308niB
    [0138] ( 酸性 ， PH 4.0 ) 257, 350 , 363nm
    [0139] N R ( D S 0 - d 6 )
    [0140] ( 中性 ） S + 7·28 ( d , J = 8.3H 2 ) ,
    [0141] 6.18 ( s, - N H a ) 6.07 ( d . J = 8.3
    [0142] H z ) , 5.88 ( d, 1 H , H - 1' ) , 5.85 < s 1 H , H - 4 )
    [0143] ( D M S 0 - d 6 - C F 3 C O O H - D a 0 ) δ + δ.87 ( s, 1 H , H — 4' ) ,
    [0144] 7.91 ( d , 1 H , J = 9.3H z ) , 6.69 ( d ,
    [0145] 1 H , J = 9.3H Z ) 6.10 ( t, 1 H H - Γ ) 元素分析値 C i2 H w 04 N 4 と し て
    [0146] C H N
    [0147] 計算値 （ ％ ) 51.79 5.07 20.13
    [0148] 実測値 （ ％ ) 51.64 5.10 20.05 参考例 7
    [0149] ァ ク リ ロ ニ 卜 リ ルの代 り に 、 ァ ク リ ル酸メ チルを用 ぃ それ以外は参考例 1 と同様に し て 、 3 — 3 — D — リ ボ フ ラ ノ シル ー 2 , 7— ジ 才 キ ソ ピ リ ド [ 2， 3— d ] ピ リ ミ ジ ンを得た 。 こ の生成物 は 、 参考倒 1 で合成 し た も の と ： 物性値は ま っ た く ー致 し た 。
    [0150] 例の方法 に従 っ て 合成 し た種々 の ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド誘導体の 、 螢光特性を第 1 表 に示 し た 。 比較 と し て 1 , N s —ェテ ノ ァデ ノ シ ン の特性も示 し た （ 相 対強度は ェテ ノ ァデ ノ シ ン を 1.0と し た ） 。 F は 3 — 3 — D — リ ポ フ ラ ノ シル 一 2.7— ジ 才 キ ソ ピ リ ド [ 2,3— d ] ピ リ ミ ジ ン を意味 し 、 d F はそ の 2' デ 才 キ シ体を 意味 し 、 8 — M e , 7 - CI , 7 - N H 2 は 8 位ゃ 7 位が そ れぞれメ チル基 ， ク ロ ル基 ， ァ ミ ノ 基で置換 さ れて ぃ る こ と を示す 。
    [0151] 第 1 表
    [0152] 誘 導 体 ス max (nm) ^ex (nm) (nm) 螢光相対強度
    [0153] 250,330 330 380 17.3 dF 250,330 330 380 17.4
    [0154] 8 -Me ー F 253,330 330 385 10.4
    [0155] 7— CI ー 293 330 385 2.9
    [0156] •NH2 ー 252,308 308 356 8.7
    [0157] 7-NH2 -F* 257,350,363 350 396 25.3 ェテノァデノシン 265,275 300 410 1.0 螢光スぺク卜ルは PH 7.0で測定した。 （*は PH 4.0で測定した）
    [0158] 第 1 表ょ り 、 ぃずれもェテ ノ ァデノ シンょ り も強ぃ萤 光性を有するこ と 、 8位ゃ 7位を置換する と螢光強度の 減少をもた らすこ と 、 7位をァ ミ ノ 化 したもの は酸性条 件下では強ぃ螢光性を有する こ とがゎかる。
    [0159] 次に 、 3 — 3 — D — リ ポフ ラ ノ シルー 2 , 7— ジ才キソ ビ リ ド [ 2 , 3— d ] ピ リ ミ ジ ン ( F ) が、 ピ リ ミ ジ ン塩 基と し て認識されるかどぅ かにっぃて検討 し た 。 上田 ら の方法 （ G hem . P harm. B u iに 18., 2303 - 2308 ( 1970 ) ) に ょ り 、 化合物 F をジメ チルホルム ァ ミ ド中 ポ リ リ ン酸， 卜 リ ブチルァ ミ ンで加熟処理するこ と に ょ り 、 2' ,3' — 0 — 環状 リ ン酸体を合成 し た 。 こ の環状 リ ン酸体 と ピ リ ミ ジ ン塩基に特異的でぁる R N ase A と を 37°Gでィ ンキ ュ べ 一 卜 し ， その水解率を調べた 。 比較 と し て 、 ゥ リ ジ ンヌ ク レ 才 シ ド ( U ) も周様に処理 し た 結果を第 2 図に示 し た 。 第 2 図か ら 、 化合物 F は U と同 程度に ょ く 水解さ れる こ とがゎかる 。
    [0160] 実施例 1
    [0161]
    [0162] (a) (b) 3 — J3 — Dデ才キシ リ ポ フ ラ ノ シル — 2 , 7— ジ 才キ ソ ピ リ ド [ 2.3— d ] ピ リ ミ ジ ン（a) Q を無水 卜 リ ェ チ ルホス フ ェ ー 卜 5 ««に 溶か し 、 こ れを 0で に冷却 し て 、 才 キシ塩化 リ ン 613 ^を加ぇ 、 6 時閭反応さ せ た後、 氷 1 Sf を加ぇて加水分解 し た 。 減圧下濃縮 し た後、 残渣を 蒸留水 に 溶か し て 、 0 已 已 — セ フ ァ デ ッ ク ス ー 25 ( H C 0 3 ー 型 ） を用 ぃ 、 卜 リ ェテル ァ ン モニ ゥ ム ビ カ ーポネ ー 卜 の直線濃度勾配 に て 、 精製 し 、 3 — （ 5' ー 0 — ホス ホ リ ル 一 3 — D — V — デ才キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ） - 2 , 7 - ジ 才キソ ピ リ ド [ 2 , 3— d ] ピ リ ミ ジ ン (b> 575fflgを得た 。
    [0163] ヽ
    [0164]
    [0165] <b)
    [0166]
    [0167] (C) 3 — （ 5' ー 0— ホス ホ リ ル ー β — D ー デ 才キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ） - 2 , 7— ジ ^ キソ ピ リ ド [ 2.3- d ] ピ リ ミ ジ ン（ S8m9を無水ジ メ チルホルム ァ ミ ド 5 に溶か し こ れに カ ルポ ニルジ ィ ミ ダゾ ール 400ffl を加ぇて 、 室温 で 1 時間反応さ せ た 。 その後、 反応液を、 20βύの 1 96 ョ ゥ化ナ 卜 リ ゥ ム / ァ セ 卜 ン に 注ぎ、 精製 し た沈 38は讒別 し て 、 ァ セ 卜 ンで洗净 し 、 滅圧下で乾燥 し た 。 沈澱を無 水 ジチルホルム ァ ミ ド 5 ^に 溶か し 、 モ ノ — 卜 り ー η ― プチルァ ン モニ ゥ ム ホ ス フ ェ ー 卜 2 3 を加ぇ て 、 室温で 24時間反応さ せ た 。 減圧下、 濃縮 し た 後、 残渣を蒸留水 3 «ιδに 溶か し て 、 D E A E — セ フ ァ デ ッ ク ス Α — 25 ( Η C 0 3 — 型 ） を用 ぃ 、 卜 リ ェ チル ァ ン モニ ゥ ム ビ カ ー ポ ネ ー 卜 の直線濃度勾配 に て精製 し 3 — ( 5' ー 0- ジ ホ ス ホ リ ル 一 3 — D — デ 才 キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ） ― 2, 7— ジ 才 キ ソ ピ リ ド [ 2.3— d ] ピ リ ミ ジ ン (C) 53¾f を得た 。 実施例 3
    [0168]
    [0169]
    [0170] (d>
    [0171] 実施例 2 に ぉぃて 、 モ ノ ー 卜 リ - n - ブチル ァ ン モニ ゥ ムホス フ I 一 卜 の代 り に 、 ジ ー .卜 リ ー n —ブ チルァ ン モニ ゥ ム ジ ホス フ ヱ 一 卜 を用 ぃ て 、 同 じ 操作を行な ぃ 、 3 — （ 5 ' ー 0— 卜 リ ホ ス ホ リ ル 一 3 — D —デ 才 キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ） ― 2 , 7— ジ 才キ ソ ピ リ ド [ 2， 3— d ] ピ リ ミ ジ ン を得 た 。 実施例 4
    [0172] 本発明 の螢光性 ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ドを含む ドデカ マ ー の合成を以下の如 き固相 リ ン酸 卜 リ ェ ス テル合成法 ( 第 1 図参照 ） で行な っ た 。 固相支持体は 、 1 %架橋ポ リ ス チ レ ン樹脂を 3 ' — 末端 と なる シ チジ ン は 、 3 ' ― 水酸基 と樹脂 と を コ ハ ク酸ェ ステルで結合 し 、 担持 し た 合成は 、 第 1 図 に示すサィ ク ル に従 っ て 、 ダィ マ ープ ロ ッ ク 縮合を行な っ た 。
    [0173] ^^ッ プ 1 ( 脱 卜 リ チル化反応 ） 5 mol ヌ ク レ 才 シ ド相当 の樹脂を用 ぃ て 、 2 % べ ン ゼ ンスルホ ン酸 （ B S A ) ク ロ ロ ホルム溶液 2 fflgで 1 分 閽処理 し た （ 2 回 く り 返 し た ） 。
    [0174] ステ ッ プ 2 ( 縮合反応 ）
    [0175] ダィ マ一 20j niol を 200〜 300 J の ピ リ ジ ン に溶か し 、 縮合剤 と し て 、 メ シ チ レ ン スルホ ン酸ニ 卜 ロ 卜 リ ァ ゾ 一ル （ M S N T ) 10U mol を加 ぇ て 、 40 で 20分間反 応さ せ た 。
    [0176] ス テ ッ プ 3 ( キ ャ ッ ピ ン グ反応 ） （ 未反応物の非反応化 K吣 ）
    [0177] 無水酢酸 （ A c 2 0 ) 0.2 mlを 0.1M 4 — ジ メ チル ァ ミ ノ ビ リ ジ ン （ D M A P 〉 の ピ リ ジ ン 溶液 1.8 m Iと 混合 し （ 用 時調製 ） 、 反応さ せ た 。
    [0178] こ の操作 （ ス テ ッ プ 1 〜 3 ) を 、 5回 く り 返 し 、 ド デ カ マ ー を合成 し た 。
    [0179] 合成 し た ドデ カ マ ー （ dG G G A A F T T T C C O" ••• F は螢光性ヌ ク レ 才 シ ド ） は 、 次の頫序の操作 に従 っ て 、 脱保護 し精製 し た 。
    [0180] (0 浪 ァ ン モ ニ ァ水 16«ώと ピ リ ジ ン 4 ^を加 ぇ 、 室温 で 24時間反応さ せ た 。
    [0181] さ ら に 、 50で に加熟 し て 4 時間反応 さ せ た 。
    [0182] 逆相 シ リ カ ゲルカ ラ ム ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一 （ ci8 カ ラ ム ： ゥ 才 ー タ ー ス社製 ， 35〜 100 771 ) で 、 精製 し た （ ァ セ 卜 ニ 卜 リ ルグラ ジ ェ ン 卜 ： 10%— 35% ) 。 80%酢酸に 溶か し 、 室温で 20分闥処理 し て 、 5' ー 末端の ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル基を除去 し た 。
    [0183] (V) 逆相髙速液体ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に て精製 し た ( 東洋ソ - ダー ： T S K - 410A K ) 。
    [0184] ^ ィ 才 ン交換髙速液体ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に て精製 し て 、 単ー ピ ー ク を得た （ 東洋ソ ー ダ ： T S K gel I E X 540 K ) 。
    [0185] 以上の様な方法で下 に示す 5種類の 自 己相補的な ドデ カ マ ー （ 12量体 ） を合成 し た 。
    [0186] 5 ' dG G G A A C G T T C C C 3 ' 3 ' C C C T T G C A A G G G d 5 '
    [0187] 5 ' dG G G A A F T T T C C C 3 ' 3 ' C C C T T T F A A G G G d 5 '
    [0188] 5 ' dG G G A A F C T T C C C 3 ' 3 ' C C C T T C F A A G G G d 5 '
    [0189] 5 ' dG G G A A F A T T C C C 3
    [0190] 3 ' C C C T T A F A A G G G d 5
    [0191] 5 ' dG G G A A F G T T C C C 3 ' 3 ' C C C T T G F A A G G G d 5 ' ドデカ マ ー の U Vスぺ ク 卜 ルに ぉぃて 、 343 の吸収 ょ り 、 螢光性ヌ ク レ 才 チ ドの存在が確認さ れた 。
    [0192] (2) 各 ドデカ マ ー の吸光度 （ 260nm ) の 温度変化を測定 し 、 T ra を算出 し た 。 結果を第 2 表 と 第 3 図 と 第 4 図 に 示 し た 。 （ 測定条件 ： 濃度 0.75 A 260 . 溶媒 0.1 M N a Ci , 0.01 M カ コ ジル酸ナ 卜 リ ゥ ム ） 。 ドデ カ マ ー Να 2 , 3 は変曲点を有 さ ず （ 第 4 図参照 ） 、 測定温度で は自 己 相補的なニ重鎖は形成 し て ぃなぃ こ と がゎ かる 。
    [0193] ま た 、 ドデ カ マ ー Να 1 . 4 ， 5 は ぃずれも T m が算出 でき （ 第 3 図参照 ） 2 っ の興味ぁ る点が観察で き た 。 即 ち 、 ① Να 1 , 5 の T m の変化 ょ り 、 C→ F の変換 は 、 T m の上昇 （ 50.5Τ;→ 58.4Τ; ) を も た ら し 、 2 重鎖結合安 定化の効果が ぁ る こ と がゎ かる 。 す な ゎ ち 、 C→ F の 変 換 は 、 G と の水素桔合能を保持 す る ばか り で な く 、 結合 を強化する も ので ぁ る 。 こ れ は 、 D N Aプ ロ ー ブ に F を 導入 し た場合 に 、 ょ り 強ぃハ ィ ブ リ ダィ ー シ ョ ン 能カ が期待さ れ 、 感度の 向上に もっ な がる も の と 思ゎれる 。 ② Να 4 , 5 の T m の変化 ょ り 、 F は Gの みな ら ず 、 弱 ぃ な が ら も A と 水素結合を形成す る こ と がゎか っ た 。
    [0194]
    [0195] OH >
    [0196] r rn'in oo〇丄丄 vdvv〇99P
    [0197] ΟΊΖ o〇丄丄〇dvV9〇9P 'ε
    [0198] ^r 〇oo丄丄丄」ννΘΕ)ΘΡ ·ι o SOS ZS2 000丄丄 'L
    [0199] 001 osroec dP
    [0200]
    [0201] z οε
    [0202] imo/98df/ Dd ε.ειο/.8 O (3) Να 2 の ドデカ マ ー 5 ' —末端を放射性標識 （ Ρ ) し 、 蛇毒ホス ホ ジ ェス テ ラ ーゼで限定加水分解を行なぃ 2 次元ホモ ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー で こ れの フ ィ ン ガ ー プ リ ン 卜 を行な っ た と こ ろ第 5 図 に示 し た 如 き結果が得 ら れ た 。 第 5 図 の結果は 、 本発明 の萤光性 ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド は 、 通常の ヌ ク レ 才 チ ド と同程度 に 基質 と なる こ と を示 し 、 塩基配列の正 し ぃ こ と が確認さ れた 。 実施例 5
    [0203] 本発明 の螢光性 ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ドを含むぺ ン タ デ カ マ - ( 15量体 ） の合成を以下の方法で行な っ た 。
    [0204] (1)
    [0205]
    [0206] (a> 3 — 3 - D — デ才 キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ー 2 , 7— ジ 才 キ ソ ピ リ ド [ 2 , 3 - α ] ピ リ ミ ジ ン（a) 2 を ピ リ ジ ン 15 に懸濁 させ 、 こ れに 卜 リ ェ チルァ ミ ン 0.194 ， 4 一 ジメ チル ァ ミ ノ ピ リ ジ ン （ D M A P ) 6 , 4 , 4' — ジ メ 卜 キシ 卜 リ チル ク ロ ラィ ド （ D M T r — Ci ) 407fli を 加ぇ室温で 5時間反応させ た後、 水 を加 ぇ 、 ジ 工 チ ルェ ー テルで抽出 し た 。 減圧下、 溶媒を留去 し た後、 シ リ カ ゲルカ ラ ム に ょ り 精製 し 、 3 — ( 5' — 0 — ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル 一 3 — D— デ才 キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ） ―
    [0207] 2.7— ジ 才キソ ピ リ ド [ 2 , 3— d ] ピ リ ミ ジ ン（b) 490 を得た 。
    [0208] (2)
    [0209]
    [0210] Pr
    [0211] CH3 O-P-Nヽ Pr
    [0212] (b) (C)
    [0213] 3 - ( 5' ー 0— ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル — 3 — D — デ 才 キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ） 一 2 , 7— ジ 才キソ ピ リ ド [ 2,3— d ] ピ リ ミ ジ ン（b》 490/¾を C H 2 Ci 2 5 に 溶解 し 、 ジ 'ィ ソ プ ロ ピルェ チルァ ミ ン 0.585Λ«加ぇ 、 次ぃで ク ロ ロ - , Ν — ジ ィ ソ プ ロ ピル ァ ミ ノ ー メ 卜 キ シ ホス フ ィ ン をゅ っ く り と 滴下 し 、 15分間反応さ せ た 後、 メ タ ノ ール 0.2 ^を加ぇ 、 酢酸ェ チル 30^ , 卜 リ ェ チルァ ミ ン で抽出 し た 。 減圧下、 溶媒を留去 し た後シ リ カ ゲル カ ラム に ょ り 精製 し 、 3 — ( 5' ー 0 — ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル ー 3' — 0 — ジ ィ ソ プ ロ ピル ァ ミ ノ メ 卜 キ シ ホ ス フ ィ ニル 一 /3 — D — デ 才 キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ） ―
    [0214] 2 , 7— ジ 才 キソ ピ リ ド [ 2 , 3— d ] ピ リ ミ ジ ン（c〉 ZZQ を得た 。
    [0215] (3) 3 — ( 5' — 0 — ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル 一 3' — 0 — ジ ィ ソ プ ロ ピル ァ ミ ノ メ 卜 キ シホ ス フ ィ ニル ー 3 — D — デ 才 キ シ リ ポ フ ラ ノ シル ） 一 2 , 7— ジ 才 キ ソ ピ リ ド
    [0216] C 2.3- d ] ピ リ ミ ジ ン（ を D N A シ ン セ サィ ザ ー （ ァ プラ ィ ド パ ィ 才 シ ステ ムズ社製 ） の基質 と し て 用 ぃ ホ ス フ ァ ィ 卜 ♦ 卜 リ ェ ス テル法 （ 第 6 面 参照 ） に ょ り 、 本 発明 の螢光性 ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド を含むぺ ン タ デ カ マ ー を合成 し た 。
    [0217] 合成 し た ぺ ン タ デ カ マ ー は次の順序 に 従 っ て 脱保護 し 、 精製 し た 。 漉 ァ ン モ ニ ァ水 に 溶解 し た ぺ ン タ デ カ マ ー を
    [0218] 55 でー夜放置 し 、 ァ ン モニ ァ を減圧下留去 し た後 、 セ フ ァ デ ッ ク ス G — 50で濂過 し 、 濃縮後ェ タ ノ ー ル沈 ¾を 行 っ た 。 その沈瀕を ホルムァ ミ ド に 溶解後 、 7 M 尿素、 20 % ポ リ ァ ク リ ルァ ミ ドゲルに ょ り 電気泳動 し 、 ぺ ン タ デ カ マ ー を含む目 的パ ン ド を切 り 出 し 、 0.5M酔酸 ァ ンモ ニゥ ム ， 1 % ドデシル硫酸ナ 卜 リ ゥ 厶 （ S D S ) , 1IBM E D T A に ょ り 抽出 し 、 濃縮後ェ タ ノ ー ル沈 ¾ に ょ り 以 下に示す 3種類のぺ ン タ デ カ マ ー を得た 。
    [0219] 0) 5 ' dA G A G C G T C G A C C G A T 3 ' 00 5 ' dA G A G C G T F G A C C G A T 3 '
    [0220] 5 ' dA G A G C G T F G A F C G A T 3 ' ぺ ン タ デカ マ 一（i)は PB R 322中 S al I認識部位を含 むシ ー ク 工 ンス （ pB R 322の塩基の番号 ( 645〜 659 ) でぁ り 、 周様の シ ー ク ェ ン ス中で 、 （5)は 1 個 、 ®は 2個 のシ チジ ン （ C ) を本発明 に ぉける螢光性 ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド （ F ) に 変換 し て ぃ る 。 ぺ ン タ デカ マ 一（δ) ® の U Vスぺ ク 卜 ル に ぉ ぃ て 、 330nm の吸収 に ょ り 螢光性 ヌ ク レ ォ チ ドの存在が確認さ れた 。 実施例 6 ぺ ン タ デカ マ ー の 5' 末端標識
    [0221] 10 ϋの ぺ ン タ デカ マ ー 水溶液 （ 20pmol ) , 3 の キ ナ -ゼ緩衝液 （ 0.5M T r i s - H Ci p H 7.6, 0.1 M M g Ci 2 , 50 mMジ チ 才 ス ィ 卜 ー ル ， 1mMス ぺ ル ミ ジ ン ， 1mM E D T A 〉 、 5 ^ の [ ァ 一 32P ] — A T P ( Ou Ct ) と 水を加ぇて全量を 29 J と し 、 ょ く 攛拌 し た後、 T 4ポ リ ヌ ク レ 才 チ ド キ ナ 一ゼ 1 ( 2.5u ) を加 ぇ て で 30分間反応 さ せた 。 0.25 E D T A 1.2/ JIを加 ぇ酵素反応を止め水 50 変性サケ精子 D N A 3 ^ 1 ( U id ) を加ぇた後、 フ I ノ ー ル抽出 を行ぃ 、 水層を セフ ァ デ ッ ク ス G— 50 Fカ ラ ム に かけ ぺ ン タ デカ マー 画分を分取 し た 。 次ぃで ェ タ ノ ール沈 ¾を 行ぃ 、 沈 ' を水に溶解 し て 、 PB R 322と のハ ィ プ リ ダ ィ ゼ ー シ ョ ン に ぉける D N Aプ ロ ーブ と し て 使用 す る ま で ー 20 で保存 レ た 。 実施例 7 5' 末端標識 し た ぺ ン タ デ カ マ ー と PB R
    [0222] 322と の八ィ ブ リ ダィ ゼ ー シ ョ ン '
    [0223] DB R 322 25 x gt / 100 i ( I O111 T ri s — Η Ci Η 8.0, 1ηιΜ Ε D Τ A ) を 1 で 10分間加熟 し た後、 0 ^ で 1 分間急冷 し 、 次ぃで 20mM T ri s — H Ci pH 7.4, 1m E D T A に ょ り 希积系列を調製 し . こ の溶液を ニ 卜 Φ セル ロ ー ス メ ンブ ラ ン に対 し 、 1 ス ポ ッ 卜 ぁ た り PB R 322が 0.5 3 , 0.25 9 . 0.125 3 , 0.062〃 3 . 0.031 g. , 0.016 3 と な る 様 に ブ ロ ッ テ ィ ン グ し た 。 こ の ニ 卜 ロ セル ロ ー ス メ ンブラ ン を 1.5 M ' N a Ci 、 0.5M N a Ci — H C で 3 分 間 . 次 ぃで 1.5 M N a Ci , 0.5M T r i s - H Ci pH 7.2 1mM E D T Aで 3 分間処理 し 、 乾燥後 、 真空 才 ー プ ン 中 80°Gで 2 時間加熱 し た 。
    [0224] こ の ニ 卜 ロ セル ロ ー ス フ ィ ル タ ー を 6 x S S C ( 0.9 N a C , 0.09 M ク ェ ン酸ナ 卜 リ ゥ ム ） ， 0.5 6 S D S , 変性サケ精子 D N A 20 Sf Z /s2 , デ ンハル 卜 溶液 ( 0.1%牛血清 ァルブ ミ ン ， 0.1%フ ィ コ ール ， 0.1 %ポ リ ビニル ピ ロ リ ド ン ） 中 55°Cで 3 時間プ レハ ィ ブ リ ダィ ゼ ー シ ョ ン を行 っ た 。 次ぃで 6 X S S C , 0.5% S D S ， 変性サケ精子 D N A 20 §f Zs2 , デ ンハル 卜 溶液
    [0225] に 実施例 6 で調製 し た D N Aプ ロ ープ ） ， ® , ⑩を 1 x r
    [0226] 106 cpiB Ζ δώと なる様に加ぇ 、 55でで 18時間ハ'ィ プ リ
    [0227] ダィ ゼ ー シ ョ ンを行 っ た後、 55°C に ぉ ぃ て 2 X S S C ,
    [0228] ( 0.3 N a CJ . 0.03 M ク ェ ン酸ナ 卜 リ ゥ ム ） で 2
    [0229] 回 ， 2 X S S C , 0.196 S D S 1 回で洗净 し 、 乾燥後 才
    [0230] ー 卜 ラ ジ 才 グラ フ ィ ー に かけ た 。 次ぃ で周ニ 卜 ロ セル ロ
    [0231] ー ス フ ィ ル タ ー を 、 65 に ぉ ぃ て 2 X S S Cで 2 回 、 2
    [0232] X S S C , 0.1% S D S で 1 回洗净 し 、 乾燥後才 ー 卜 ラ
    [0233] ジ 才グラ フ ィ ー に かけ た 。 次ぃ で周 ニ 卜 ロ セル ロ ー ス フ
    [0234] ィ ルタ ー を 、 72で に ぉ ぃて 2 X S S Cで 2 回 ， 2 X S S
    [0235] C , 0.1 % S D S で 1 回洗淨 し 、 乾燥後才 ー 卜 ラ ジ ォ グ
    [0236] ラ フ ィ ー に かけ た 。 '
    [0237] そ の結果、 55 洗净で は G) (5) © と も に 0.031 3 の p
    [0238] B R 322ま で検出 可能で ぁ っ た が 、 65°C洗净 に ぉ ぃ て は
    [0239] (0が ΡΒ R 322と ニ重鎖結合できず に ほ と ん ど洗ぃ流さ
    [0240] れて ぃ ま ぅ の に対 し 、 （S)ぉ ょび ©で は 55°C洗淨の場合 と
    [0241] ほ ぽ周程度に PB R 322が検出可能で ぁ っ た 。 72 洗淨
    [0242] で は（i) (5) © と も に ニ 重鎖結合できず 、 PB R 322の検出
    [0243] はで き なか っ た 。 し た が っ て Cか ら F へ の変換は G と の
    [0244] 水素結合を強化 し 、 そ の結果 T m が 上昇 し ニ.重鎖結合が
    [0245] 安定化する こ と が 、 ハ ィ プ リ ダィ ゼ ー シ ョ ン の系で証明
    [0246] さ れた 。 す なゎ ち D N Aプ ロ ープ中の C を F に 変換す る
    [0247] こ と に ょ り 、 ょ り 高ぃ温度でのハ ィ ブ リ ダィ ゼ ー シ ョ ン が可能で ぁるた め 、 非選択的吸着が なぃ 、 新規な髙感度
    [0248] D N Aプ ロ ーブ と な り ぅ る 。 実施《I 8
    [0249] ニ ッ ク 卜 ラ ンス レ ー シ ョ ン法 に ょ る方法
    [0250] <a> 用 ぃ た 試薬
    [0251] 大腸菌 D N Aポ リ メ ラ ーゼ I ( B oehringer — M annh ein な ど 、 5 un の 50%グ リ セ ロ ール溶液を原液の ま ま 使用 ） ， 脾艨 D N ase I [ 1 ^ ζ «ώと なる ょ ぅ に 0.01 Μ塩酸に 溶か し 、 — 20°Cで保存 。 使用 時に希釈液 ( 10 mM T ri s - H C I , H 7.5, 5 m M g
    [0252] C I a , ゥ シ血清 ァルブ ミ ン ） に て 10倍 に 希釈 し 0 で 2 時間放置 し て 活性化 し た ぁ と さ ら に終濃度 に し て 用 ぃ る ] , ニ ヅ ク 卜 ラ ン ス レ ー シ ョ ン緩衝液 （ 10倍量 ， 500 mM T ris - H C I , H
    [0253] 7.5, 50 mM M g C I z , 10 mM 2 — メ ル カ プ 卜 ェ タ ノ ール 〉 ， dN T P溶液 （ 各 0.1 «1 の （1丁 丁 ？ ， dG T P . d A T P ぉ ょ び、 ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 シ ド ー 5' — 卜 リ ホ ス フ ヱ ー 卜 （ d F T P ) 溶液 ） ， 試料 D N A ( 10 mM T ri s H C I , H 7.5, 10 mM K G I 0.2 mM E D T A に l i Sf Z ^ Jl と な る ょ ぅ に ス フ ァ ー ジ H i nd HI フ ラ グメ ン 卜 D N A を溶かす ） 。
    [0254] (b〉 方法
    [0255] (1) 6.5 Δ の ニ ッ ク 卜 ラ ン ス レ ー シ ョ ン緩衝液、 10 U Si の dD T P溶液， 2 JW JIの試料 D N A ( 1 ^ Z S. ) と水を加 ぇて全量を 65 Jl と し 、 ょ く 撹拌 し た ，
    [0256] (2) 活性化 し た D N ase l 溶液 を加ぇて室温 に 2分藺放置 し て ニ ッ ク を入れた 。 っ ぃで 、 大腸菌 D N Αポ リ メ ラ ー ゼ I を 2 加 ぇ て 14°Cで 1 時間反応さ せた 。
    [0257] (3) 0.25 M E D T Aを 加 ぇて 68でで 10分間 加温 し 、 酵素反応を止め た 。 フ ヱ ノ ール抽出 を 2 回 ， ェ タ ノ 一ル沈濺を 2 回锞 り 返 し た 。 最後の沈 ¾を 0.5 の 10 mM T ris — H C I , H 7.5, 10 ιηΜ K
    [0258] C I , 0.2 mM E D T Aに 溶か し て 使用 時 ま で 一 20 に 保存 し た 。
    [0259] 産業上の利用 可能性
    [0260] 本発明 に係る ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド誘導体 、 及び分子中又は分子末端に ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド誘導体単位を少な く と も 1 個含有す る 才 リ ゴ又 は ポ リ ヌ ク レ 才 チ ド は 、 塩基対形成能を有 する螢光 D N Aプ ロ ー ブ と し て 、 生体髙分子、 特に蛋 白 質ゃ核酸 に ぉけ る構 造 と機能の相 関を明 ら かに する種々 の研究 、 ま た 、 迅速 な病原微生物の周定 、 遺伝疾患ゃ 、 遺伝病の診断 、 さ ら に正常細胞 と癌細胞の鑑別等に使用 す る こ と がで き る 。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1. ー股式 （ ェ ） で表ゎさ れる ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才チ ド誘導体。
    R
    'Ν
    ノ
    0 ュ Ν3 ( I )
    桔合を表ゎ し 、 R 2 が水素又は低級ァルキル基の と き は 、 R i は 7位の炭素 と の カ ルポニル結合
    ( ;C - 0 ) を表ゎ す
    / ノ
    2. 般式 （ I ) に ぉ ぃて 、 X 及びノ又は Y i が
    0
    II
    H Oそ P— 0子 n ( n は 1 , 2又 は 3の整数を示す ） で
    0 H
    Z 1 が水素又は水酸基で . W i が水素で ぁる 、 請求の範 囲第 1 項記載の ピ リ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド誘導体。
    3. 分子中又 は分子末端に 、 ー般式 （ E ) で表ゎ さ れる ピ ド ピ リ ミ ジ ン ヌ ク レ 才 チ ド誘導体単位を 、 少な く と も 1 個含有す る 才 リ ゴ又 はポ リ ヌ ク レ 才 チ ド 。 '
    Y Ο Γ 又 は
    j P — O + s を表ゎ し 、 X 2 が Η Ο Ρ — Ο Γ の 0 Η 〇 Η
    の と き Υ 2 又 は Z a は ー 0 — を表ゎ し （ 但 し 他方は - 水素又 は水酸基を表ゎ す ） ， Y 2 又 は Ζ 2 は ー 0— 又
    （ 但 し 他方は水素又 は水 1 , 2又 は 3の整数を示 し 示す 〉 。 W 2 は水素又 は水 酸基を表ゎす。 R i と R 2 にっぃて は、 R i がァミ ノ 基又はハ ロゲンの とき は、 R 2 は 7位の炭素と 8位の 窒素圜の単結合を表ゎ し 、 R 2 が水素又は低級ァルキ ル基の と きは、 R 1 は 7位の炭素 とのカ ルポニル結合
    ( 0 ) を表ゎす。 ，
    0
    II
    4. ー般式 （ H ) にぉぃて 、 X 2 が — Ρ— Ο—でぁ り
    0 Η
    Υ 2 が ー 0— で W2 が水素でぁる 、 請求の範囲第 3項記 載の才 リ ゴ又はポ リ ヌ ク レ 才チ ド。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3686150D1|1992-08-27|
    EP0235301A4|1989-10-12|
    DE3686150T2|1993-03-04|
    EP0235301B1|1992-07-22|
    JPH0725788B1|1995-03-22|
    EP0235301A1|1987-09-09|
    US4965350A|1990-10-23|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1987-03-12| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1987-03-12| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CH DE FR GB |
    1987-05-04| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1986905396 Country of ref document: EP |
    1987-09-09| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1986905396 Country of ref document: EP |
    1992-07-22| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1986905396 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP60/197689||1985-09-09||
    JP19768985||1985-09-09||DE19863686150| DE3686150D1|1985-09-09|1986-08-28|Pyridopyrimidin-nukleotid-abkoemmlinge.|
    DE19863686150| DE3686150T2|1985-09-09|1986-08-28|Pyridopyrimidin-nukleotid-abkoemmlinge.|
    JP50461886A| JPH0725788B1|1985-09-09|1986-08-28||
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