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    公开号:WO1986004092A1
    申请号:PCT/JP1985/000718
    申请日:1985-12-26
    公开日:1986-07-17
    发明作者:Tsuneya Ohno
    申请人:Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] —— Ί - 明 細 耋 ヒ卜癌特異的モノクロナ一ル抗体の製造法 技術分野
    [0002] 本発明はヒ卜癌に特異的なモノクロナール抗体の製造法に関する。 更に詳しくは、 ヒ卜癌組織及び癌患者の血液、 体液成分と反応する モノクロナール抗体の製造法に関する。
    [0003] 背景技術
    [0004] 従来、 癌の診断に使用されているものに、 CEA 〔癌胎児性抗原； Gold et.al. , J. Exp. Med. 121 , 439(1965), J. Exp. Med. 122 .467 (1967)J があった。 この CEAは、 種々の腫瘍組織において、 その 生産が著しく増量する癌関連抗原であり、 血中における CE A濃度 の変化は、 腫瘍組織の消長をよく反映する腫瘍マ一力一として利用 されてきた。
    [0005] この C E Aに対するモノクロナール抗体の細胞融合法による作製 に関しては次の文献が挙げられる。 '
    [0006] Accol la, R. S. et.al., Proc. Natl. Acad. ScLU. S. A. , 77， 563(1980) Hitchell.K.F., Cancer Immunol. I mmu not er. , 10,1(1980)
    [0007] Rogers, G.T. et.al., Br. J. Cancer, 43,1 (1981 )
    [0008] Kupchi k， H. Z.et.al. , Cancer Res.， 1, 3306(1981)
    [0009] しかし、 CEAは癌の捕捉率が低く、 ヘビースモーカー、 胎児等 にも検出されるなど、 特定の癌に対する特異性が少なく、 治療の目 安にはなり得ても、 癌の診断に利用するには間題があった。
    [0010] 本発明は、 かかる問題のない癌特異的モノクロナール抗体の製造 ：法に関するものであって、 本発明によって棒られたモノク□ナール 抗体を利用することにより、 癌の早期発見、 診断、 治療等の指針を 医節に提供できるのである。
    [0011] ところで、 モノクロナール抗体の製造方法に関しても、 ケーラー (Kdhler) 等によって、 免疫されたマウスから諷整された脾細胞と、 マウス骨髄腫細胞を融合させることにより、 均質ないわゆるモノク ロナール抗体を、 連続的に産生させうる細胞ラインが取得できるこ とが明らかにされている。 〔K8hler et.al, Nature, 256 495〜49 T (1975),Eur.J.rininunol.6 , 511 〜5ΐ9 (1976)) 。 この技術は、 抗体を分泌する Β—リンパ球を、 腫瘍細胞と融合させることからな り、 その際形成された維種細胞 （ハイアリドーマ） は、 両方の細胞 の性質、 即ち腫瘍細胞の無制限に增殖する能力と、 Β-リンパ球の 或る特定の抗体を産生する能力を有する。
    [0012] 従って、 このハイアリドーマを培養することにより、 永続的に特 定の均質な抗体を得ることが可能となった。 これ以後、 種々のハイ ァリドーマが作られ、 更にそれらのハイアリドーマより作られるモ ノクロナール抗体の利用に関し、 多くの研究がなされてきた。 特に 匕卜の瘙の診断♦治療に関する分野への利用に多くの関心ガもたれ てきている。
    [0013] しかし、 先に述べた CE Αの問題点を解決すべく提案された tト 癌特異的モノクロナ一ル抗体に於いても、 その要となる.ヒ卜癌特異 抗原を純度よく取得することができず問題を有していた。
    [0014] 即ち、 従来の技術に於いては、 モノクロナール抗体の製造に適し、 更にヒ卜の癌全般に応用できるヒ卜癌特異抗原の調製法が存在しな かったのである。 従ってヒ卜の癌の診断♦治療に用いるモノクロナ Q― ール抗体を作る為には、 従来癌細胞をそのまま動物の免疫に使用し ていたが癌細胞表面には、 無数といえる程の抗原決定基が存在する ので、 各々の抗原決定基に由来するモノクロナール抗体も無数に存 在するということになってしまう。 そしてその大部分は、 正常細胞' の抗原決定基に共通するものであるから、 癌細胞に特異的に反応す るモノクロナ一ル抗体を取得するためには、 非常に多数のハイアリ ドーマを取得し、 目的とする抗体を産生するハイアリドーマをスク リ一ニングする必要があった。
    [0015] 発明の開示
    [0016] 本発明者は、 かかる問題を解決すべく研究した結果、 少しの労力 で非常に効率よく目的とするモノクロナール抗体を産生するハイア リドーマを得るために用いる癌特異抗原、 及びその製法を見出し、 本発明を完成した。 本発明により、 従来の所望のハイプリドーマが 得られるかどうかを危惧しつつ、 やみくもに多大の労力を要してい た問題点を一挙に解決することができたのである。
    [0017] 即ち、 目的とする抗体を産生させるには、 被免疫動物に投与する 抗原物質の種類は、 可能な限り少ない方がよいとの考えのもとに、 種々の研究を行った結果、 正常細胞の膜成分と癌細胞の膜成分は、 密度勾配遠心分離分画パターンに於いて相違が認められ、 正常細胞 及び癌細胞の膜成分を、 蔗糖連続密度勾配緩衝液中で、 遠心分離す ることにより認められる膜成分の各々の密度に基く 3ケのピークを 持つ部分 （各々密度の大きい部分より H R . M R . 及び L R と名 付ける） のうち、 H Rすなわち重い膜成分よりなる部分が、 癌細胞 膜成分において、 正常細胞膜成分より多く認め れた （第 4図及び 第 5図参照） 。 この増加した H Rは、 正常細胞の癌化により生じた、 瘙特有の成分が含まれていると考えられるので V この H Rを分取し、 これを抗原としてマウス脾細胞とマウス腫瘍細胞とのハイプリドー マを得て、 モノク αナール抗体を産生させると、 容易に効率よく、 目的とするモノクロナール抗体が得られたのである。 次頁の表 Ίに この点を明らかにするデータを示しておく。
    [0018] Βϋち本発明はヒ卜癌細胞をホモジナイズした細砕混合物を遠心分 離し、 その上澄を不連続蔗糖密度勾配液中遠心分離し、 密度勾配の 不連続面に集まった分画を採取した後、 これを連続蔗糖密度勾配液 に重扈し、 超遠心分雛を行って密度 1. 191 ρ〜 1 10/5の癌特異的 抗原に富んだ画分を分雜し、 これを抗原として動物を免疫し、 その 免疫脾細胞と骨髄腫細胞との融合細胞を作り、 目的とする抗体を產 生するハイアリド マをスクリーニングし、 クローニングを行い、 次いで培養することを特徴とするヒ卜癌特異的モノクロ'ナール抗体 の製造法である。
    [0019] 又、 更に膜成分の糖蛋白質の糖部分を、 種々の糖分解酵素 （マン ノシダ一ゼ, ダルコシダーゼ， ガラク卜シダーゼ， フコシダ一ゼ， キシ Αシダ^ゼ, N—ァセチルダルコシダーゼ， N—ァセチルガラ ク卜シダーゼ等〉 の混合液にて、 分解除去すると、 瘙特異抗原とし ての特異性が更に強くなることが明らかとなつた。 本発明の上記 2 つの抗原の製法は、 種々のヒト癌に共通して癌特異的抗原の製法と して使甩可能であり、 しかも、 その抗原の分離の為に使用する癌の 種類により、 癌種特異的抗原となることは、 非常に興味深いと考え られる。 、、
    [0020]
    [0021] *1：乳癌、 胃癌の H R及び M Rを免疫抗原として得られたハイブリドーマ。
    [0022] 細胞ラインは細胞をそのまま免疫抗原としたもの。
    [0023] 癌細胞のソニケ一卜を抗原として E L I S Aを行い陽性の結果がでたハイブリド マ数, 癌組織細胞の染色において陽性の結果を示したハイブリドーマ数。
    [0024] 正常細胞に反応せず癌細胞にのみ反応した Λイブリドーマ数 p
    [0025] ヒ卜胃癌より分離確立されたセルライン。 新潟大学第 Ί病理 渡辺教授より入手 , ヒ卜胃癌よ 0分離確立されたセルライン。 新潟大学第 Ί病理 渡辺教授より入手, ヒ卜胃癌より分離確立されたセルライン。 斩潟大学第 Ί病理 渡辺教授より入手,
    [0026] 以下本発明の製造法を詳細に説明する。
    [0027] ヒ卜の癌組織を水冷下で切り刻み、 適当な緩衝液、 例えば 5%蔗 糖含有トリス塩酸緩衝液を、 ゆつくり加えながらホモジナイズする。
    [0028] 次に約 650x gから約 1，500x g， 約 10分間で遠心分離してペレ ッ卜を除いた上澄を 100, 000 g， 10分間程度遠心分雛し、 核小体、 ミ卜コンドリア等を沈澱せしめる。 次いで^ %〜28%、 通常は約 25 %蔗糖含有緩衝液と、 45%〜60%、 通常は約 50%蔗糖含有緩衝液の 不連続蔗糖密度勾配上に、 上記上澄を重層し、 約 60，000x g〜約 層， 000 x g, 約 SO分以上、 通常は約 90分間程度遠心分離を行う。 密度勾配の不連続面に、 目的抗原を含む分画が集まる。 この分画を 採取し、 約 20%蔗糖濃度に緩衝液で調整し、 次に緩衝液、 例えば、 卜リス塩酸緩衝液を用いた約 20%〜約 50%の連続蔗糖密度勾配に重 層し、 約 60，000x g〜約 200，000x g, 4時間以上遠心分雛を行う。 目的とする抗原は、 水溶液の密度 1.191ρ〜 1.210 の分画にある (糖濃度としては 41. &%〜45.2%に換算される） 。
    [0029] この分画を集め、 塩酸緩衝液で、 糖濃度約 20%以下になるように 薄め v 60，000x g〜200,000 x g, 約 60分以上通常は 90分閭程度遠 心分離を行うと、 本発明の目的とする抗原が、 ベレツトとして得ら れる （この抗原を仮に H R-300と名付ける〉 。
    [0030] 更に癌特異性の高い抗原を得るために、 次の操作を行う。 HR— • 300より、 冷却され foアセトン， エーテル， クロ口ホルム， メタノ ールの如き有機溶媒を用い、 脱脂操怍をし、 次いで適当な糖分解酵 素を用い、 グリコリシスを行わせる。 グリコリシスは、 適当な緩 衝液中例えば 0.05 Mクェン酸ソーダ緩衝液中で行わせ、 糖分解酵 素としては、： α—ダルコシダーゼ， 3—ダルコシダーゼ， ひ一マン ノシダーゼ， jS—マンノシダーゼ, 一ガラク卜シダーゼ 3—ガ ラク卜シダーゼ， a— L—フコシダーゼ, 3—キシロシダーゼ， (X —Ν—ァセチルグルコサミニダーゼ， 3— Ν—ァ tチルガラク卜サ ミニダーゼ等の混合物を用いる。 脂質と糖部分を除かれた HR-300 は、 遠心分離約 60，000X g〜200，000 xg, 約 60分以上、 通常は 90 分間によりペレツ 卜として集められる。 これを HR-100と名付ける。
    [0031] 次にモノクロナール抗体の調製法について説明する。 先ず動物に、 適当なアジュバン卜、 例えばフロイン卜完全アジュ バン卜と共に本発明の抗原を数回投与することにより免疫抗体を産 生させる。 例えば BALBZCマウスに、 本発明抗原を Ί匹当り Ί 〜60^g を腹腔又は皮下投与し、 1〜2週間後に、 アジュバン卜を 抜いた抗原を 1〜20 g 静脈投与すれば、 動物は免疫される。 免疫動物から抗体産生細胞を得るには、 通常、 脾細胞を利用する のが実際的である。 例えば前記 BA LBZCマウスの脾臓を、 アジ ： Lバン卜抜き抗原投与の 3日後に摘出し、 冷 S3しながら RPM I - 1640あるいは PBS緩衝液中で細かく刻み、 次いでステンレスメヅ シュで瀘し、 前記緩衝液で適当な細胞数に調製する。
    [0032] 細胞融合に使甩する骨髄腫細胞系は、 例えば Kohler等により、
    [0033] Euに丄 Immuno!.Vol _δ 29Ζ-295 (1976) に記載されている、 Ρ3- NSI
    [0034] /1-Ag4-1 (一般に NS— Ίと呼ばれている〉 の如き、 BALBZC マウス MOP C21由来の骨髄腫を使用する。 この種の細胞系は 8— ァザグァニン耐性であり、 ヒポキサンチン♦グァニンホスホリポシ ル卜ランスフェラーゼを欠くために、 HAT培地 （ヒポキサンチン 一アミノプテリン一チミジン含有培地） 中で生存できない。
    [0035] 細胞融合剤としては、 平均分子量 1000〜6000のポリエチレングリ -a—：|： .
    [0036] ユールがよく、 特にポリエチレングリコール 1500が望ましい。 濃度 は分子量に従い 40%〜50%が使用され、 ポリエチレングリュール
    [0037] 1500使用の場合は、 RPM I -1640で 50%に調製して使用する。 綑 胞融合は、 先ず前記の如き抗体産生細胞と骨髄腫細胞を、 R PM I
    [0038] — 1640で洗い、 前者と後者とを 4： 1 -10： 1の比率で混合し、 800 g , 5分間程遠心分離を行い沈澱させ、 培地をデカン卜する。 このペレツ卜に前記細胞融合剤を Ί〜2Χ106 細胞数当り 1 （3Τ )位い 1分間にわたりゆっくり攪拌しながら滴下し、 更に攪拌を 銃けながら 5〜10分間かけて、徐々に RPM I -1640 (37°C， 5〜 10/ ώ)で懸濁する σ 400〜 S00g, 5分間遠心分離後、 上清をデ カン卜し、 15%ゥマ血清含有 RPM Γ— 1640で、 細胞数 〜 2x10 6 個 Z に調製する。 ハイブリドーマの分離は、 HAT培地中で の培養によるのが適当である （HATセレクション〉 。 ¾ず、 ％穴 の組織培養用のプレー卜の各穴に、 前記融合の完了した細胞液を 0 .1 ずつ入れ、 > 37 , M時間培養し、 培養液の半量を HAT培地で 置換する。 以後、 Ί〜4日間陽で、 半量の培養液を HAT培地で置 換しながら 3週閭程培養を続ける。 親細胞は全て死滅し、 融合細胞 のみ生育してくるので、 以後は 15%ゥマ血清添加 RPMI -1δ40で 培養し、 抗体-を産生させる。 次にこれらのハイアリドーマより、 目 的とする抗体を産生しているか否かを、 適当な方法例えば酵素免疫 抗体法（ E L I S A ) で調べる。 - 抗原.は、 目的とする抗体に応じて選ばれるが、 乳癌特異抗体のス クリ一ニングには、 例えばヒ卜乳癌組織より分雛されたセルライン ^10 7及ぴ丁ー470、 又、 胃癌特異抗体のスクリーニングにはヒ 卜胃癌組織から分離されたセルライン K A T 0 、 並びにコン卜ロ ールとしてマウス正常細胞由来のセルライン 3 T3の細胞膜成分を 用いる。 細胞成分の調製は、 本発明の抗原 HR-300の調製法に従う。
    [0039] 先ず上記の抗原を調製し、 ¾当な緩衝液例えば炭酸ソ一ダ緩衝液
    [0040] ( ΡΗ 9.5〉 で 3〜5 g に希釈し、 96穴のマイクロタイター プレー卜の各穴にコー卜する。 4°Cで一夜放置後、 ポリ才キシェチ レンソルビタンモノラウレー卜 （ツイーン 20〉 含有リン酸緩衝液
    [0041] ( PBS)でよく洗い、 例えばゥマ血清によるァロッキング操作後、 前記ハイブリドーマ培養液を 0.1 /^ずつ加え、 37°Cで 5〜6時間放 置する。
    [0042] 次に培養液をデカン卜し、 前記 PBS緩衝液でよく洗った後、 Ί %ノーマルャギ血清を加え、 37eC, Ί時間程静置し、 非特異的吸着 をアロックする。 次いで前記 PBS緩衝液で洗浄後、 ャギ抗マウス グロプリンのパー才キシダーゼ抱台 I gGを旭え、 3Γ0， 4時間程 インキュベー卜後、 前記 PBS緩衝液でよく洗う。
    [0043] 基質のオルトフェ二レンジアミンジヒドロク aライド及び過酸化 水素含有クェン酸ソーダ緩衝液を加え、 30分後に吸光度を測定する。 抗体を産生しない細胞の培養液をコントロールとして、 各穴の吸光 度との差により有意の色素反応を程したものを陽性とする。
    [0044] 目的とする抗体は、 乳癌の場合には MCF7及び T一 47Dに陽性 であり、 又胃癌の場合には KATOIIIに陽性で、 夫々マウス 3T3 に陰性のものとし、 更に病理切片に対する特異性があることを確認 し、 それを産生するハイブリドーマを得る。
    [0045] 病理切片は、 ヒ卜癌組織のホルマリン固定バラフイン切片より調 製する。
    [0046] キシレンにより脱パラフィン後、 100 %エタノールより 70%エタ ノール迄段階的処理を行い、 終りに PBS緩衝液でよぐ洗う。切片 にヒアル口ニダーゼを 37°C， Ί時間作用させ P B S緩衝液で洗净後、 トランシ' α—ル添加ノーマルャギ血清で 37Ό, 10分間程インキ: Lベ —卜する。 PBS緩衝液で洗浄後、 前記スクリーニング後のモノク ナール抗体を 37°C， 20分間反応させる。 又 PBS緩衝液で洗浄後、 ャギ抗マウスグロアリンのパ一ォキシダ一ゼ抱合 I Q Gフラクショ ンを加え、 30分間室温でインキュベー卜する。 更に PBS緩衝液で 洗淨後、 過酸化水素を添加した DAD (3, 3' —ジァミノべンジ ダイン） 飽和 PBS緩衝液中に 10分間浸する。 PBS緩衝液で洗浄 した切片を、 常法に従いメチレンプル一染色し、 エタノールにて脱 水後、 キシレンで洗い病理切片とし、 顕微鏡観察を行う。
    [0047] 目的とする寧特異的抗体產生ハイプリドーマは、 適当な方法で分 別 培養し、 単一細胞から由来する単一クローン細胞株とする （ク ローニング〉 。 リミティングダイリ 1—シヨン法（限界希釈法》 が 一般的である。
    [0048] 例えば.、 B A L B Z◦マウスの胸線細胞または脾臓細胞をフィー ダ一として Ί〜 5X10' Ζ/Η になるように調製し、 ％穴組織培養用 アレー卜の各穴に 0.1ro2ずつ分注しておく σ 次に前記のスクリ一二 ングした抗体産生ハイアリドーマのうすい懸濁液を作り、 前記プレ 一卜の各穴に分注する。
    [0049] フィーダ一及びハイブリドーマの懸濁は、 HAT培地又はゥマも しぐは胎児仔牛血清添加 R PM I一 1640培地で行い、 八ィプリド一 マは、 各穴に Ί籠ずつ入るように調製する。 フィーダ一は必ずしも 加えなくともよい。 次いで、 5%C02 培養装置にて 37。Cで培養す ると、 1〜2週間後にクローンが生育してくる。 顕微鏡で Ίつの穴 に 1個のク CIーンのみ生育しているものを選び、 前記スクリーニン グの方法で分析し、 目的とする抗体を産生しているクローンを選択' する。
    [0050] スクリーニングされたハイプリドーマは、 生体外培養または生体 内培養のいずれにおいても、 抗体産生せしめることが可能である。 生体外培養は、 ハイプリドーマを適当な栄養培地、 例えば、 胎児 仔牛血清あるいはゥマ血清を補充した R P M I一 1640培地中で適当 時間培養すればよく、 他の免疫グロプリンを含まない純粋なモノク ロナール抗体を得るのに適している。 多量のモノクロナール抗体を 得るには、 生体内培養が好都合である。
    [0051] 例えば、 以下に示す方法で行う。 B A L B Z Cマウスに 2 , 6 , 10, 14, —テ卜ラメチルペンタデカン （プリスタン） を 0. 5¾J2腹腔 内投与し、 2〜20日経過後、 スクリーニングされたハイアリドーマ を腹腔内に Ί〜5 Χ 106 個投与する。 2〜3週間後に増殖、 定着し たハイプリドーマは腹水癌化した株であるので、 必要匹数のマウス に腹腔内投与することにより、 2〜3週間後より連続して、 目的と するモノクロナール抗体を含む腹水を得ることができる。 適当な方 法により特異的な抗体活性を確認し、 適当な精製手段、 例えば、 硫 安による塩析法、 D E A Eセルロース等によるイオン交換法、 ゲル 濾過法、 ァフィ二テイクロマ卜グラフィ一等により、 高純度の標品 が得られる。
    [0052] 本発明モノクロナール抗体は、 後記実施例によって示される如く、 癌に特異的抗原抗体反応を示すものであり、 この性状を利用して、 非常な高感度の癌検出可能な診断薬が提供される。
    [0053] 次にモノクロナール抗体を用いた診断薬についてヒ卜乳癌のモノ ク σナール抗体を例にとって説明する σ
    [0054] ヒ卜乳癌から分皺されたセルライン ΜΌ F 7 ( A T C C寄託番号 HTB-22) 及び T— 47D (ATCC寄託番号 HTB-133) の培養 上清中には、 本発明のモノクロナール抗体（ヒ卜乳癌組織より調製 した本発明の癌特異的抗原 H R B G-300及び H R B C -100より誘導 されたモノクロナ一ル抗体） に反応する物質が認められる。 このこ とは、 癌患者の血清中にも上記モノクロナ一ル抗体と反応する物質 が存在する可能性を示唆し、 鋭意研究の結果本発明が完成した。 本発明診断薬は、 本発明のモノクロナール抗体を使用するもので あれば、 いずれの免疫学的試験法を利甩するものであってよい。 試験法としては例えば、 補体結台反応法 （CF) , 免疫 ί寸着血球 凝集反応法（ I A H A〉 ， 逆受身血球凝集反応法（ R— P H A ) , 放射線免疫測定法（ R I A ) ， 酵素免疫測定法（ E I A〉 》 酵素免 疫抗体法（ E L I SA)等が使用できる σ
    [0055] 本発明抗体は、 それぞれの方法に応じて適当な形態に調製すれば よい。
    [0056] 逆受身血球凝集反応法を利用する場合は、 本発明抗体を微粒子に グルタールアルデヒド， タンニン酸， 塩化クロム等を使用して結合 させる。 微粒子としては、 哺乳類♦鳥類の赤血球， ポリスチレンラ テックス， 塩化ビニル, ガラスビーズ等が適当である。
    [0057] 放射線免疫測定法を利用する場合は、 本発明抗体を 131 I , 1Ζα I , , C, 3(H等のラジオアイソトープでラベルする。
    [0058] 酵素免疫抗体法を利用する場合は、 酵素をグルタールァルデヒド を使用して本発明抗体に結合させる。 酵素はパ一才キシダーゼ， グ ルコース才キシダーゼ， アルカリホスファダーゼ， ベータ一ガラク 卜シダーゼ等が使用できる。
    [0059] 本発明の癌特異的抗原画分及びそのグリコシダーゼ処理物を使用 して得たモノクロナール抗体は、 原材料として使用する癌の種類に 対応した癌特異性を有するものであり、 その使用する癌に対する診 断薬が作られる。 後記実施例では乳癌、 胃癌組織又は培養細胞を使 用して抗原を調製し、 モノクロナール抗体を作成し、 胃、 乳各々の 癌の診断薬を作製した。
    [0060] 例えば、 この実施例 3及び実施例 4で作成されたモノクロナール 抗体（ H R画分を使用して得られた抗体及び H R画分をグリコシダ ーゼ処理したものを使用して得られた抗体〉 は、 各々の乳、 胃癌待 異的抗原の構成物質のうちの同一分子上の抗原決定基を認識してい たので、 この 2種のモノクロナ一ル抗体を、 いわゆる 「サンドイツ チ法」 に利用して、 乳及び胃癌の血清学的診断薬を作成した。
    [0061] 「サンドィツチ法」 とは、 同一分子上の空間的に異つた位置に二 つの抗原決定基を持つ抗原と、 その各々の決定基に対応する 2種の 抗体を使用する抗原分析法である。 具体的には、 抗原特異性の低い 抗体 (a) と、 分析的に指標となり得る物質で標識された特異性のよ. り高い抗体（b) を用いる σ
    [0062] 即ち、 抗体（a) をガラスビーズ， プラスチックプレー卜等に塗布、 吸着させ、 次いで目的とする抗原を含む液体を接触させ、 この抗原 及び類似の抗原を集め、 最後に前記標識された抗体 (b) を接触させ、 標識を分析することにより、 目的とする抗原の存在を知る方法であ る。 この方法の利点は、 非常に抗原特異性は高いが、 感度が不足し ているようなモノクロナ一ル抗体を合理的に利用できることにある。 本発明を具体的に説明する。 先ず、 実施例 3の H R分画に対する モノク ナ一ル抗体を、 0.05 Mの炭酸ソーダ緩衝液（ PH 9.5) 又は適当な緩衝液例えば PBS緩衝液： (U0 mM N a C I , 13 m N az HP0 , 2mM N aHz P04 ( H 7.6) ) で 3〜20 g の濃度に希釈する。 処理されていないミクロタイタ 一アレー卜の各穴に 0.1〜 0.2 の一定量ずつ分注し、 低温で一夜 放置後、 適当な緩衝液、 例えば 0.05 %ポリ才キシエチレンソルビ タンモノラウレー卜 （ツイーン 20〉 を含む PBS緩衝液でよく洗浄 する。 次に分析されるべき検体 （ヒ卜の血清， 体液等〉 を、 適宜段 階的に希釈し、 これを 0.1〜 0.2«の一定量加え 37 で 3〜6時間 インキエベ一卜した後、 前記のツイーン 20含有 P B Sで各穴をよく 洗う。 あらかじめ N AKAN E等の方法により （P.K.NAKANE AND A. KAWAOI, J.Hi stoc eiii. Cytochem. , 22 1084,1974) ヮサビバ一才キシ ダ一ゼで標識しておいた後記 H R B C -100及び H R G C - 100に対す る夫々のモノクロナール抗体 3〜 5 9 / を含む PBS緩衝液 0.1 〜.0.2 を加え、 37°C3〜6時間インキユーべ一卜後、 ツイ一 ン 20含有 PBS緩衝液でよく洗う。 基質の OPD (オル卜フ Iニレ ンジアミンジヒドロク口ライド〉 及び過酸化水素含有クェン酸ソ一 ダ（PH 5.S) を加え、 室温で 30分後、 0.4M—硫酸 50/ を加え混 合した後、 各穴の吸光度を測定する。 492nm と 610nm の差により抗 原の濃度を算出する。 この診断薬の有用性を証明するために、 癌患 者の血清を使用し癌の診断を行った。 例えば、 乳癌患者 10名、 胃癌 患者 8名及び健康者夫々 10名の血清を用い、 後記実施例 '5の方法に より吸光度を測定した。 その結果を第 Ί及び第 2図に示す。 10倍希 駅した各血清の 492 波長における吸光度をプロッ卜したもので、 乳癌患者、 胃癌患者ともに、 その吸光度は 0. 3以上であり、 健 康者の平均吸光度は 0. 1以下であった。 このことは、 乳癌患者及び 胃癌患者の血液中には乳癌特異抗原及び胃癌特異抗原が多量に存在 し、 健康者の血液中には殆んど存在していないことを示している。 健康者のうち Ί名 （ 8力月の妊婦） のみが吸光度 0. 23 と若干高い 値を示した。 第 3図は、 乳癌患者、 前記妊婦、 他の健康者 2名の血 清の各希釈倍率における吸光度をグラフ化したものである。 以上か ら明らかな如く、 一定希釈倍率の吸光度を調べることにより、 明確 な乳癌診断及び胃癌診断ができることが判明し、 その有用性が証明 された。
    [0063] 図面の簡単な説明
    [0064] 第 1図は乳癌患者及び健康者、 第 2図は胃癌患者及び健康者の夫 々の血清の 10倍希釈における吸光度分布図を示し、 第 3図.は乳癌患 者及び健康者の血清の各希訳段階に於ける吸光度図を示す。 第 4図 は正常細胞膜成分を蔗糖密度勾配遠心分離で分離した各分画と蔗糖 密度と蛋白濃度の関係を表わすグラフ （図中 0— 0は蛋白濃度、 X —Xは蔗糖濃度を表わす） を示し、 第 5図は胃癌細胞膜成分を蔗糖 密度勾配遠心分離で分離した各分画と蔗糖密度と蛋白濃度の関係を 袠わすグラフ （図中書 -秦は缉白濃度、 ▲—▲は蔗糖濃度を表わす〉 を示す。
    [0065] 発明を実施するための最良の形態
    [0066] 以下本発明を実施例をあげて説明する。
    [0067] 実施例 Ί
    [0068] 抗原 H R B C -300及び H R G C -300の製造
    [0069] ヒ卜の乳癌組織及び胃癌組織を水冷下で細切し、 夫々 5 %蔗糖 ( WZW〉 含有 T N E緩衝液 （ 0. 01 M—卜リス一塩酸 （f)H 7. 5〉 ， M-N a.Ql, 0.003 -EDTA ( PH 8.0) ) 中で細胞 破碎装置を用い均質化する。 その際、 上記卜リス塩酸緩衝液は、. 癌 組鎩 1 g当り 4 の割合で加え、 15秒破砕後 30秒冷却する操作を 4 画くり返す。次いで 650gで 10分間遠心分離し、 その上清（ s u p — T) を更に 10，000g, 10分間遠心分雛すると、 核小体， ミ卜コン ドリア等は沈殿し、 目的とする抗原成分を含む上澄 （ s u p— 2) が得 5れる。
    [0070] 次に 20%蔗糖（WZW) 含有 TN E緩衝液 8 と 50%蔗糖 （WZ W) 含有 TN E緩衝液 6^の不連続密度勾配を作り上記上澄（sup- 2) 25^を重層し、 のスインギングバケツ卜で 100，000g, 90分間遠心分離を行う。 目的抗原を含む分画は、 密度の異なる両緩 衝液の界にて得られる。 次いで 15^ずつの 20% (W/W) 蔗糖含 有 TN E緩衝液と、 50% (WZW) 蔗糖含有 TN E緩衝液を甩い、 連続密度勾配を作り、 その上に 20%蔗糖濃度になるように、 T E 緩衝液で調製した上記の不連続密度勾配遠心で密度界面に得られた 試料 10 を重層し、 100, 000 g, 12時藺 SW27にて遠心分雛を行う。 遠心分離後スイングバケツ卜の底より 1.2/^ずっ32〜33分画に分け る。 糖の密度を測定し、 1.191/5- 1.21 (41·6%〜45·2%糖濃 度〉 密直の分画を集め、 Τ Ν Ε緩衝液で糖濃度が 20%以下になるよ うに調製し、 100, 000 g, 90分間遠心分離を行い、 ペレツ卜を採取 することにより目的とする抗原が得られる （この抗原を HRBC— 300及び H RG C-300と名付ける） α
    [0071] 実施例 2
    [0072] 2-1 抗原 H R B C -100及び H R G C -TOOの製造
    [0073] 実施例 1で得た抗原 H R B G -300及び H R G C -300を夫々 0。Cに 冷 SIしたァセ卜ンの菡当量で脱脂後、 HRBC-300又は HRGC-3 00 SOO g 当り 50 /zg の各種の糖分解酵素 （ α—マンシダーゼ 16 6 unit ^Sf, j5—マンノシダ一ゼ 16& ur t ^gf, ひ一ダルコシタ一 ゼ 3.2 unit/fflSf, iS—グルコシダーゼ 20 unit/ms, ひ一ガラクト シダーゼ 24 unit/ssp, iS—ガラク卜シダ一ゼ 125 unit//ssp, - L—フコシダーゼ SSunitZ^, 3—キシロシダーゼ 12 ur / α— Ν—ァセチルダルコサミニダ一ゼ 2.5 unit {3— N—ァ セチルガラク卜サミニダ一ゼ υηは ：生化学工業株式会社） を、 0.05 Mクェン酸ソ一ダ緩衝液 （ PH4.0 ) 中にて 37°C—夜反 応させる。 次に Ί M卜リス塩酸緩衝液 （ PH 7.5) を加えて反応を 停止させる。 これに等量の飽和硫安 （ PH 7.0〉 を滴下して 30分間 混合後、 遠心分離 4 、 10，000x g, , 20分間にて沈澱を得る。 こ れを PBS緩衝液 （ PH 7.6) に溶かし、 さらに PBS緩衝に透析 して、 目的とする糖成分の除去された抗原 H R B C -100及び H R (3 C-100を悸る。
    [0074] 2-2 抗原の分析
    [0075] 蛋白質の定量を乳癌の抗原 （ HRBC-300, HRBC-100) を例 にして Low「 y法 〔 Lowry, 0. H.， osenbrough, N.J. , Farr, A.し & Randall, R.J. , (195DJ. Biol. Chem. 193 ,265) にて以下の如ぐ行う σ
    [0076] 3〜20 g の蛋白質を含む試料液 200 ϋ に、 硫酸銅-酒石酸一 アルカリ混合液（ 1 %硫酸銅 5水塩水溶液： 1%酒石酸カリウム水 溶液： 0.1N-N aOH + 2%N a2 C03 水溶液， Ί ： Ί ： 100) を加えて混合し、 室温に 10分間放置後、 フ Iノール試薬 （ X 1/2 ) を 0.1/η加え、 混合し、 室温に 30分間放置し、 660
    [0077] 光度を測定し、 BSAを標準として定量する。 -Τδ- 糖の定量はアンスロン法〔生化学実験講座， 糖質の化学 （下)
    [0078] 310 (東京化学同人） 〕 で次のように行う。
    [0079] 1 3〜 2 g の糖を含む試料液 50 ϋ にアンスロン硫酸（アン ス 0ン10 を 0.25 /«の蒸溜水に溶かした後、 冷水中で濃硫酸 4.Γ 5 ^を加え、 更に蒸溜水 Ί を加えて作る〉 300 l を加え、 沸騰 水中で 10分間加熱し、 流水で室温に戻した後、 620 m の吸光度を 測定し、 可溶性デンプンを標準として定量を行う。 結果は下記の 表 2の如くである。 表 2
    [0080]
    [0081] '■0300の調製時に得られる分子量の小さい糖蛋白成分 c
    [0082] MRを各種糖分解酵素により収理したもの。
    [0083] (以下余白〉 — - ^ 実施例 3
    [0084] H R B C-300及び H RG C-300を免疫抗原とするモノクロナール 抗体の製造
    [0085] 3-1 マウス脾細胞の免疫化
    [0086] 6週令の BALBZC又は NGBマウスの腹腔に、 当量のフロイ ン卜完全アジュバン卜を含む P B S緩衝液 0. に溶解した H R B C-300又は HRGC-300の夫々 50^g を投与し、 Ί週間後に、 当量 のフロイン卜不完全アジュバン卜を含む PBS緩衝液 0.3 /^に溶解 した HRBC— 300又は HRGC-300 25 を腹腔投与する。 更 に 1週間後に、 PBS緩衝液 0.3 に溶解した HRBC-300又は H RGC-300夫々 5 9 を尾静脈投与する。 次いで 3日後に脾臓を摘 出し、 PBS緩衝液で洗い、 ステンレスメッシュで瀘して単一細胞 の懸濁液とし、 次いで PBS緩衝液にて細胞数を 2X106 個ノ に なるように調製する。
    [0087] 3-2免疫化脾細胞とマウス骨髄腹細胞との融合
    [0088] 使用するマウス骨髄腫細胞は、 例えば Kof ler等によって iに丄 Iffl muru)l. _ 292〜295 (197S)に記載されているように、 BALBZC' マウス MOPC21から誘導されたもので、 マウス骨髄腫 Ίと 呼ばれている。 先ず、 RPM I— 1640完全培地 （グルタミン 2 m , ピルビン酸ソーダ 1 mM, フンギゾン 0.25 /id, ス卜レ ブ卜マイシン 50 zg /mi, ペニシリン 50 unit /Hi, ゥマ血清 15%) で培養し こ対数増殖期のマウス骨髄腫細胞を、 ゥマ血清不含の RP M I— 1640の培地で洗い、 細胞数 5X105 個 ^になるように、 ゥ マ血清不含 RPM I—1640培地で調製する。 次に実施例 3-1で調製 した免疫化マウス脾臓細胞懸濁液 40^と、 上記マウス骨髄腫細胞懸 衝液 10 を混合し、 800gで 5分間遠心分離してペレツ卜を形成さ せ、 上澄はデカン卜により完全に除く α このべレツ卜に、 37でに加 温したポリエチレングリコール （ PEG— 1500〉 溶液（ゥマ血清不 含 RPM 1—1640で 50%濃度に調製した PEG— 1500溶液〉 Ί を、 攙拌しながら徐々に加え、 1分閭攪拌を続ける。 次に、 ゥマ血清不 含 RPM 1—1640 6/^を、 攪拌を続けながら 6〜 7分間にわたり 徐々に加える σ δ00 g， 5分間遠心分離し、 上澄を除いた後、 RP Ml— 1640を加えて、 細胞数 2X106 個/^の懸濁液とする。
    [0089] 3-3 HATセレクション
    [0090] 実施例 3-2で調製した細胞懸濁液を、 96穴の組織培養甩プレー卜 の各穴に ずつ分注し、 5°/oC02 培養装置中で 37°Cで培養す る。 24時間後、 各穴の培養液に の HAT培地 （ヒポキサンチ ン， アミノアテリン及びチミジン含有 RPM I— 1S40(Littiefielcf， Science 5 , 709〜Π0， 1964) を加え、 次に Ο.ΐ ずつ培養液を除 き、 培養を続ける。 更に培養開始より 2日 3日， 5曰, 8日， 11 日； U日， 日毎に、 上記の如く、 培養液の半量を HAT培 地で置換する操作を繰り返す。 この K A Tセレクションにより骨髄 腫細胞は死滅し、 融合細胞のみ生育してくる α 生育してきたハ ァ リドーマをゥマ血清添加 RPM I—1640で培養し、 その培養液を酵 素免疫抗体法（ E L I S Α)の分析試斜とする。
    [0091] 3- 酵素免疫抗体法 '
    [0092] 実施例 1の方法によって、 セルライン 3Τ3 (マウス正常細胞由 来のセルライン， ATCCに CCL92として寄託されている〉 ， t ルライン MCF7及びセルライン T— 47D (両セルライン共にヒ卜 乳癌より分離確立されたもの、 ATCCに各々 HTB— 22及び HT B-133として寄託されている〉 セルライン KATODI (ヒト胃癌よ り分離確立されたもの、 新潟大学渡辺教授より入手） の培養細胞よ り抗原を調製し、 炭酸ソーダ緩衝液 （ 0.05 NaHC03 , 0. 05 M N a2 C03 , ΡΗ 9.5) にて 4 g Z/H«濃度に希轵する。 次に 96穴のマイクロタイタ一プレー卜の各穴に、 それぞれ ず つ分注し、 アレー卜の表面をシールした後、 4°C一夜放置する。 翌 ^20) を含む PBS緩衝液でよく洗った後、 実施例 3- 4で調製し たハイアリドーマの培養液 0.1 ずつを各： Λ:に加え、 37°Cにて 6時 間放置する。 コントロールとして、 抗体産生していない細胞の培養 液を使用する。
    [0093] 次に培養液をデカン卜し、 0.05 %ツイ一ン添加 PBS緩衝液で 5回洗い、 Ί %ノーマルャギ血清添加 PBS緩衝液 ずつを加 え、 3rc, 1時間放置後、 ツイーン添加 PBS緩衝液でよぐ洗う。 次に、 冷凍ストックからの Ί ： 30に PBS緩衝液で希釈したャギ 抗マウスグロプリンのヮサビパ一才キシダ一ゼ抱合 I gGフラクシ ヨンを、 0.1^ずつ加え、 37°C, 4時間インキ .1ベ一卜する。 各穴 をツイーン 20添加 PBS緩衝液で 4回洗い、 基質として 容 の 40mM ABTS ( 2, 2/ —アジノージー （ 3—ェチルベンゾ チアゾリン） スルホン酸ジアンモニゥ厶塩〕 及び Ί/ 00容の 30% 過酸化水素を含む 0.5%クェン酸リン酸ソ一ダ緩衝液（ pH 5.8) を加える。 30分後に各穴の吸光度を測定する。 コン卜ロールより有 意の色素反応を呈したものを陽性とし、 乳癌の場合は HRBC- 300 及び MCF7, T— 47Dの 3者に反応し、 マウス 3T3に反応しな いものを還び出す。 又、 胃癌の場合は HRGC-300と KATODIに — 2:2 - . 反応し、 マウズ 3 T3に反応しないものを選び出す。 更に病理組織 切片に対する反応特異性があることを確認し、 限界希釈法によるク a—二ングを行う。
    [0094] 3-5組織切片の染色法
    [0095] ヒ卜乳癌及び胃癌のホルマリン固定パラフィン切片を先ず、 キシ レンに浸し、 パラフィンを溶出させ、 次いで 100 %〜70%エタノー ル溶液に段階的に浸し、 終りに P B S緩衝液でよく洗浄する。
    [0096] 次にヒアルロニダーゼ （600 inl/! 0.01 M PBS緩衝液 PH 6.5) 0.15 idを、 切片に 37°C, Ί時間作用させる。 PBS緩衝液 で洗浄後、 蛋白分解酵素阻害剤の卜ラジロール 0.5 unitゾ i を添 加したノーマルャギ血清 （ PBS緩衝液にて 50%濃度に調製） で、 37 , 1·0分間インキュベートし、 組織への非特異的な吸着をプロッ クする。 PBS緩衝液で静かに洗浄後、 実施例 3-4でスクリーニン 、 グしたモゾクロナ一ル抗体で、 37 , 20分間インキ 1ベー卜する。 PBS緩衝液で 3回洗浄後、 ャギ抗マウスグロアリンのヮサビパー ォキシダ一ゼ抱合 I g(3フラクション （ PBS緩衝液で全ャギ血清 に対し 100 I QGZ に調製〉 を、 室温にて 30分作甩させる。 更に P B S緩衝液で洗浄後、 過酸化水素 30%を添加した D A D (3, 3r —ジァミノべンジダイン） 飽和 PBS緩衝液中に、 室温にて 10 分間浸す。 次いで PBS緩衝液中にて洗浄、 メチレンアル一で染色 し、 70%〜100 %のエタノールで、 段階的に脱水を行い、 終りにキ シレンで洗い、 病理切片とする。
    [0097] 3-6限界希釈法 ~ "~、
    [0098] 実施例 3-4でスクリーニングしたハイプリドーマを、 ゥマ血清添 加 RPM I— 1640で培養し、 次いで、 細胞数 100個 ， 50個/^, -Z3-
    [0099] 10個ノ^及び 5個/^に、 ゥマ血清添加 RPM I一 1640で希釈する。 次に各々の懸濁液を、 ％穴組織培養用アレー卜に 0.1/^ずつ分注し、 培養する。 細胞增殖の認められた穴の培養液を、 実施例 3-4の EL ISAに則り、 抗体產生の有無を調べる。 この操作を 2度橾り返し て、 単一クローン細胞を得た。
    [0100] 3- 抗体の大量生産
    [0101] BALBZCマウスに、 プリスタン （ 2, 6, 10, U—テトラメ チルペンタデカン〉 0.5^を腹腔内投与し、 20日後に実施例 3-6で 得た単一クローン化ハイアリドーマを 2X100 個接種する σ 10〜20 日後に腹水癌が現われ、 腹水癌株が得られる。 このの腹水癌株を、 他の複数の BALBZCマウスに 2Χ106 個程度、 腹腔内投与する と、 2〜 3週間後より目的とするモノクロナール抗体を含む腹水が 得られる。
    [0102] HRB C- 100及び H R.G C- 100についても、 実施例 3の各工程を 経て、 各癌特異的モノクロナ一ル抗体を産生するハイアリドーマ反 びそれの産生するモノクロナ一ル抗体を得る。
    [0103] 精製分析の結果は、 夫々分子量 HRBC-300 ( I gGt 〉 、 HR BC-100 ( I gG1 〉 、 及び HRGC-100 ( I gG2a) は 16万ダル 卜ン、 HRGC ( I gM〉 は 90万ダル卜ンであった。
    [0104] 3-8抗体の精製
    [0105] 実施例 3-Tにより得られる抗体を含有する腹水 10^に、 当量の PBS緩衝液を加え、 次いで、 3δ /0Ν a 2 S0420βώを加え、 最終 的に 18%Na2 S04溶液とする。 10,000に p.m.15分間遠心分離し、 上清を除去し、 ペレツ卜を PBS緩衝液で一夜透析する。 次いでプ 口ティン Aセファロ一ス 4Bカラムに吸着させ、 酢酸緩衝液 （ 0.1 M酢酸， O.U M N a C i H 5.0,. 3〉 で溶出するフラク シヨンをアールするな
    [0106] 実施例 4
    [0107] H R B C-100及び H R G C-100を免疫抗原とするモノク□ナール 抗体の製造
    [0108] 実施例 3に記載された方法に従い.、 HRBC-300及び HRGC— 300に代り、 H R B C-100及び H R (3 C-100を抗原として B Aし B ZCマウスを免疫し、 その免疫化脾細胞とマウス骨髄腫との融合細 胞を作り、 HATセレクションにより八ィァリドーマを得て、 EL I S A及び癌組織切片の染色により、 目的抗体を産生するハイ ブリドーマをスクリーニングし、 限界希訳法によりクロ一ニングを 行い、.次いで目的とする抗体を産生せしめた。 当該抗体の分子量は 夫々約 16万ダル卜ンであり、 クラス サ クラスは、 HRBC-100 は I g<31 、 HROC-100は I gG2aであった。
    [0109] 実施例 5 ヒ卜乳癌及び胃癌の診断
    [0110] 実施例 1の方法によって得られた抗原 HRBC-300, 及び HRGC— 300 に対するモノクロナ一ル抗体を、 夫々炭酸ナ卜リウ厶緩衝液 ( α.0 aHC03 , 0.05 M Naつ C03 ， PH 9.5) で 4/ g 濃度に諷製し、 96穴のマイクロタイタープレー卜の各 穴にそれぞれ 0.1 ずつ分注し、 プレー卜をシールした後、 37Ό3 時間、 続いて 4Ό, 一夜放置する。
    [0111] 翌朝 0.05 %ツイ一ン 20を含む PBS緩衝液（以後ツイーン 20· PBSと呼ぶ） でよく洗う。 次に乳癌患者及び健康者各 10名ずつよ り採取し、 又、 胃癌患者 8名から同様に採取し、 調製した血清を、 PBS緩衝液で 10倍, 20倍, 40倍， 80倍， 160 倍に希釈し、 0.1 ずつ上記 96穴マイクロタイタ一プレー卜の各穴に分注し、 36。Gで 3 時間インキュベー卜し、 血清を除去後、 ツイーン 20* PBSでよく 洗浄する。
    [0112] 次に予め調製保存しておいたヮサビパー才キシダーゼ抱合抗 HRBC -100抗体及びヮサビバ一才キシダ一ゼ抱合抗 H R G C - 100抗体
    [0113] (Nakane等の方法により調製 (P.K.Nakane and A. awaoi, J.Histoc em.Cytochem.,22 1084,1974) 〕 を、 夫々に 0.5%BSA添加 PB S緩衝液（牛血清アルブミンが 0.5%濃度になるように 0.025°/0ッ ィーン 20添加 PBSで調製した緩衝液〉 で、 5 g ノ/^濃度に調製 し、 その 0.2/^を、 上記マイクロタイタ一アレー卜の各穴に分注し、 36°Cで 3時間インキュベートする。 ツイーン 20· PBSでよく洗浄 後、 マイクロタイタープレー卜の各穴に、， 0.005 %の過酸化水素を 含有する Mc I I V e i n e' s緩衝液（ H 5.3) で 0.5 ゾ^ に調製しだ才ルトフエニレンジアミンジヒドロクロライド 0· 1 を 分注し、 30分間インキュベートする。
    [0114] 次いで、 0.05 ^ずつの ひ. —硫酸溶液を添加し、 反応を停止 せしめた後、 コロナ 2波長マイクロアレー卜光度計 （コロナ電気株 式会社製〉 で、 波長 492 maで吸光度を測定する。 乳癌患者 10名、 胃 癌患者 8名及び健康者 10名の血清の、 10倍希釈における吸光度を夫 々第 1図及び第 2図に示す σ ますこ、 乳癌患者 Ί名、 健康者 3名 （う ち Ί名は比較的吸光度の高かった 8ヶ月の妊婦〉 の血清の、 各希积 倍率における吸光度を、 第 3図に示す。 以上から、 明確に癌患者と 健康者との区別ができ、 本発明の抗体を使用した癌の診断キッ卜の 有用性が証明されている。 産業上の利甩可能性
    [0115] 実施例で明らかな如く、 本発明の抗原 H R -300及び H R -100は、 癌特異的であり、 これらの使甩により、 容易に各種の癌に特異的に 反応する抗体が得られ、 また得られた癌特異的抗体を利用すること により、 明確な癌の診断が可能である等が証明され、 本発明の効果 が確認された。
    [0116] 従って本発明の製造法によって製造されたヒ卜癌特異的モノクロ ナール抗体は癌（特に乳癌、 胃癌〉 特異抗原を患者の血液、 体液か ら早期に発見し、患者の診断♦治療の指針を医師に提供する。 また 初期治療の終った患者の再発に関するモニタリングの手段として有 甩である。
    权利要求:
    Claims

    - Z7- 請求の範囲
    1 ヒ卜癌細胞をホモジナイズした細砕混合物を遠心分離し、 そ の上澄を不連続蔗糖密度勾配液中遠心分離し、 密度勾配の不連続面 に集まった分画を採取した後、 これを連続蔗糖密度勾配液に重層し、 超遠心分離を行って密度 1. 191 p〜 1. 210Pの癌特異的抗原に富ん だ画分を分離し、 これを抗原として動物を免疫し、 その免疫脾細胞 と骨髄腫細胞との融合細胞を作り、 目的とする抗体を產生するハイ プリドーマをスクリーニングし、 クローニングを行い、 次いで培養 することを特徴とするヒ卜癌特異的モノクロナール抗体の製造法 σ
    2 細碎混合物の遠心分離を約 650 x g〜約 1500 Χ gで行うこと を特徴とする特許請求の範囲第 1項記載の製造法。
    3 不連続蔗糖密度勾配液中の遠心分離を約 10で以下の凍らない 温度で約 60，000 x g〜約 200, 000 x g , Ί〜2時間で行うことを特 徴とする特許請求の範囲第 Ί項記載の製造法。
    4 連続蔗糖密度勾配に重層して行う超遠心分離を約 10°C以下の 凍らない温度で約 60，000 x g〜200, 000 x g , 4時間以上で行うこ とを特徴とする特許請求の範囲第 Ί項記載の製造法。
    5 t卜癌 乳癌であることを特徴とする特許請求の範囲第 1項 記載の製造法 σ
    6 ヒ卜癌が胃癌であることを特徴とする特許請求の範囲第 Ί項 記載の製造法。
    7 特許請求の範囲第 Ί項に記載された抗原が更に糖分解酵素処 理により糖部分が除かれたものである特許請求の範囲第 Ί項〜第 6 項のいずれかに記載の製造法。 '
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0207170A1|1987-01-07|
    EP0207170A4|1988-06-23|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-07-17| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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