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    公开号:WO1986001828A1
    申请号:PCT/JP1985/000518
    申请日:1985-09-18
    公开日:1986-03-27
    发明作者:Naganori Numao；Yoshiyuki Takahara；Seishi Kato
    申请人:Sagami Chemical Research Center；Central Glass Co., Ltd.；Hodogaya Chemical Co., Ltd.；Nippon Soda Co., Ltd.；Nissan Chemical Industries, Ltd.；Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 瑷状二重鎖 D M A 及 び そ の製造法、 該瓖状二重鎖
    [0003] D N A を含む微生物並び に それ ら を用い る ポ リ オ ウ ィ ル ス キ ヤ プシ ド蛋白 V P 1 の抗原块定部位を有 する蛋白質の製造法
    [0004] [技術.分野 ] ' *発明は、 急性灰白髄炎の病原体である ポ リ オ ウ イ ル スの キ ヤ プ シ ド蛋白 VP 1 の抗原块定部位を有す る蛋白質の、 遣伝 子組換え技術を利用 した、 製造技術に関する も の で あ る 。
    [0005] [背景技衛 ]
    [0006] 現在、 急性灰白锺炎に対する免疫賦与ほ、 ポ リ オ ウ イ ルス をホルマ リ ン その他の薬品で処理 し、 抗原性.を残 したまま感 染性を失わせたも の、 即ち不活化ワ ク チ ン の非経 口 投与、 又 は、 弱毒化 されたポ リ オウ イ ルスその もの、 即ち生 ワ ク チ ン の経 口投与に よ リ 行われている。
    [0007] こ の う ち 、 不活化ワ ク チ ン は、 免疫を賦与する た め に多量 の ウ ィ ル ス を 必要 と し 、 そ のため コ ス ト が高 く 、 ま た 、 賦与 した免疫を生涯にわた リ 維持する こ とがで き ない と い う欠点 を有す る 。
    [0008] 一方、 生 ワ ク チ ンほ、 増殖を繰 り 返すう ち に ウ ィ ル ス遺伝 子上に起こ る 突然変異によ り 高い病原性を有する株が出現す る可能性があ る。 そのため、 生 ワ ク チ ン接種に よ る 発症の危 険性及び種 ウ ィ ルス、 特に Sa b i n 3 型の祜渴化の阇題を有す る。 また、 免疫不全者への投与の危険性、 サル細胞を用い る こ と に よ る サ ル腫瘍ウ ィ ル ス の混入、 非常事態に よ る サルの 入手難、 将来におけるサル資源の枯渴化及びコ ス ト が高いな どの問題点も有する。
    [0009] また、 不活化ワ ク チ ンの代り に免疫賦与蛋白質を大腸菌菌 体内で生産させる試みがなされている。 即ち、 フ ァ ン · デァ • ヴエ リレ フ Oan der Werf)ら | an de r Werf , S. ,et a I . ; ジ ー ン （Gene)， 23 ， 85 ( 1983)] 及びマー ル · ジ 口 一 （特開 昭 59— 173084号） は、 1 型強毒株 Mahoney 型のキ ヤ プ シ ド蛋 白 VP1 をコ ー ドする cDNAを大腸菌で発現させてキヤ プシ ド蛋 白 VP1 を融合蛋白質の形で生産している。 そ こ には、 Sab in 1 ， 2 及び 3 型の よ う な弱毒株の相当する DNA 配列を用い ても よい旨の説明があるが、 その具体的手段、 実施可能性の 立証な どはな されていない。 また、 クゲ（Kuge)ら [Kuge， S.， et al .； ジ ャ ー ナル · ォ ブ · バ イ オケ ミ ス 卜 リ 一 （Journal of Bi ochemi stry) , 88 , 305 ( 1984 )] は 、 Ϊ_Γ_Ρ プ nr モ 一 タ ー を用いて Sab in 1 型のキ ヤ プシ ド蛋白 VP 1 を コ ー ドする c DNA をア ン ピ シ リ ン耐性遺伝子を含むプ ラ ス ミ ド中に組み 入れて発現させてギ ヤ プシ ド蛋白 VP 1 を融合蛋白質 と して生 産 し ている。 しか しながら、 どち ら の方法も 、 VP1 の発現量 が極めて微量であ り 、 大量のギ ヤ プシ ド蛋白 VP 1 を生産する こ と の で き る方法の出現が望まれている。
    [0010] 太癸明者 ら は、 前述の従来技術の問題点を解消するため銳 意研究を重ねた結果、 ポ リ オ ウ イ ル ス の特異的蛋白質の抗原 诀定部位を有する蛋白質を大量生産する こ と に成功 し、 本発 明 を完成す る に至っ た。
    [0011] なお、 *明細書において、 非融合 と はポ リ オ ウ イ ル ス由来 の蛋白質以外のボ リ ペプチ ド と の融合では ない と い う意味で あ り 、 ポ リ オ ウ イ ルスの VP3 蛋白（VP 1の前に コ ー ド されてい る） がつい て いて も よい し、 また、 VP 1 蛋白の途中か らの も の で あ っ て も よ い。
    [0012] 本発明は、 ポ リ オウ イ ルス弱毒株のキ ヤ プ シ ド蛋白 VP 1 の 抗原块定部位を有する蛋白質を融合蛋白質 と して又は非融合 の形で大量に生産する こ とができ る プラ ス ミ ド及び微生物並 びに それを用いる該蛋白質の製造法を提供す.る こ と を 目 的と する 。
    [0013] [発明の開示 ]
    [0014] *発明の第 1 の瑗状二重鎖 DNA は、 高癸現 プ ロ モー タ 一 · オペ レ ー タ — と 、 そ の支配を受ける下流領域 に位置する メ タ ピ ロ カテカ ー ゼ遺伝子の SD配列を含む メ タ ピ ロ カテ カーゼ遺 伝子のア ミ ノ 基末端部分をコ ー ドする DNA 領域 と 、 それに続 く ポ リ オ ウ イ ル ス弱毒株 Sab in 1 型、 Sab in 2 型又は Sab in 3 型 の キ ヤ プ シ ド蛋白 VP1 の少な く と も ァ ミ ノ 酸番号 32〜 105 に相当するペプチ ドを コー ドする DNA 部分 と を含む こ と を特徴 と する も の であ る 。
    [0015] *発明の第 2 の環状二重鎖 DNA は、 高発現 プ ロ モ ー タ 一 ， オペ レ ー タ — と 、 そ の支配を受ける下流領域に位置する SDK 列 と 、 翻訳開始コ ド ン と 、 これに読取枠の一致す る よ う に直 接接繞 された ポ リ オ ウ イ ル ス弱毒株 Sabin l 型、 Sab in 2型 又は Sabin 3 型のギヤ プシ ド蛋白 VP 1 の少な く と も ア ミ ノ 酸 番号 92〜 105 に相当するペプチ ドをコー ド'す る DNA 部分と 、 それ に続 く 翻訳終結コ ド ン と を合むこ と を特徴 と する も ので あ る 。
    [0016] 前記高発現 プ ロ モ ー タ一 · オ ペ レ ー タ 一 と し て は 、 λ フ ァ ー ジ 初期遺伝子群（PL)プ ロ モー タ ー · オペ レ ー タ 一 、 lac UV5 プ ロ モータ 一 · オペ レー タ 一、 i_LB プ α モー タ 一 ， オ ペ レ ー タ 一及び^ プロモー タ 一 · オペ レ ー タ 一 な どが挙 げ られる。
    [0017] PLプ ロ モー タ 一 · オペ レー タ 一は、 例えば λ フ ァ ー ジから 誘導 されたそ の iJjd HI - |u H I 断片中 に含まれている。 かか る 断片は、 λ フ ァ ージから直接切 り 出 し て も よ いが、 こ れを合む他の適当なプラ ス ミ ドなどか ら切 り 出 し て も よい。 かか る プ ラ ス ミ ド と しては、 例えば PKC30 プ ラ ス ミ ド [ネ ィ チ ヤ 一 （Nature)， 29_2 ， 128 ( 1981 )] 及び L - 10プ ラ ス ミ ド、 (市販品） が挙げられる。
    [0018] PLプ ロ モー タ 一 ， オペ レー タ 一を含む DNA S列 と し ては、 例えば、
    [0019] 次式 （ I ) ： CCAGTTCAATACAACAGGGTGCCACACCACGACAGGAACAAGCTAAT
    [0020] XXXXXXXX XXsxXXXXXXXXXXXXXXX: xxx :xxXx XXX:: x GTAττττTAAGGCGTT GT ΰGATA TGCCAA00GJ AAT_一一 . - 2
    [0021] x
    [0022] x
    [0023] x
    [0024] ATTCAAAGCATGGCCGAAGGTTGGTTG1GA0G 8AGCATCTGGGTAA. .
    [0025] X XXXXXXXXXXXXXxXXXX xxxxxxxxxxxxx: :xx:
    [0026] AACCACCATGAGCTOTGMAC -CGTCTAAAMTt LOOGGAAGGGCG
    [0027] x
    [0028] x
    [0029] x CTQCCAAAOOGAGTCTOAG GAATAATAACCGGTGATACTaAoaACA !GGi XXSXX:XXHXXXXXX :XXXXXX
    [0030] TGTTTGCGGATATCTTGAAAOATTCTGTAACATACAGATAACCCGGG AAA
    [0031] ACOCATTCATTAOOTAAATATCTCACCTACCAAACAGCCCAAATCAT G 400
    [0032] TCCAGATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAG
    [0033] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0034] 450
    [0035] GCTCAATGGAAAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACC
    [0036] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxm
    [0037] AGTT 3'
    [0038] xxxx
    [0039] ( 中、 .A' はデオギシァデニル酸基を.、 G はデオ ギシグァ ニ ル酸基を 、 c はデオ シ シチ ジル酸基を 、 T は チ ミ ジル 酸基 を表わ し、 τ は、 他の一太鎖 DNA の対応する 塩基が、 であ る と き は T を、 T であ る と きは A を 、 C であ る と き は G を、 G であ る と きは C を表わす。 ）
    [0040] で示 さ れ る DNA 配列 が挙げ られ る 。 該 DNA 配列は、 PLプ π モー タ一 · オペ レー タ ーを合む Hind IE - Bam H I 断片の
    [0041] II - ILa l 靳片に相当する DNA £列を含ん でいる 。
    [0042] 太癸明の第 1 の環状二重鎖 DNA における メ タ ビ ロ カテカ一 ゼ遣伝子の SD¾列を舍むメ タ ピロ カテカーゼ遺伝子のァ ミ ノ 基末端 （以下 「N 末端」 と い う） 部分をコ ー ドする DNA 配列 ほ > 例えばシ ユ ー ドモナ ス · プチタ ( Ps e u d o mon a s p u t i d a ) mt- 2 株（ATCC 23973)の TOし プラ ス ミ ドに舍 まれてい る。 か かる DNA 断片は、 T0Lプラ ス ミ ドから直接 S s t II 新片 と して 切 り 出 し て も よいが、 これを舍む他の適当な プ ラ ス ミ ドな ど か ら 切 り 出 し て も よい、 かかる プ ラ ス ミ ド と し ては、 例えば pTS 115 プ ラ ス ミ ド [イ ノ ウ エ， エス （Inouye, S.)， et aし； ジ ャ ー ナル . ォブ · バ クテ リ オロ ジー（ J . Bacterio 1.) , 145， 1137 ( 1981 ) ] 及び pYT3プ ラ ス ミ ド [ェ ビ ナ ， ワ イ （Ebina, Y . )， e t a 1.； ジ ャ ー ナル ， ォ ブ · バ ク テ リ オ ロ ジー （ J . Bacteri .) , JJi， 487 ( 1383 )]が挙げ られる 。
    [0043] 該 SD¾列 を含む メ タ ピ αカテカーゼ遺伝子の N 末端部分を コ ー ドする DN Α 配列 と しては、 例えば、 そ の一 *鎖が、 次式 （ II ) ：
    [0044] 5*… AATTCCGGTCACGTGCCGGCCAAGGCCGCCGCCGAAGGCTGGCCCTCGQ:
    [0045] TGTCAAGTGTTTCCGCAAACCGACTTGACCATCGAGTACTTCGCCACGTT ( Π ) GGCGGAAACAAACCTGACAACATGAACTATGAAGAGGTGACGTCATGAAC AAAGGTGTAATGCGACCGGGCCATGTGCAG— 3'
    [0046] (式中、 A 、 G 、 C 及び T は前記と同義であ る 。 ）
    [0047] で示 される DMA 配列が挙げられる。
    [0048] 太癸钥の第 2 の環状二重鎖 における SDg列 と しては、 メ タ ピ ロ カ テ カ ー ゼ遺伝子 の SD配列 、 λ C II の SD 列 、 λ c ro 遺伝子 の SDS列、 1 acZ遺伝子の SD配列、 trpLの SD配 列、 1 P P遣伝子の SD配列等が挙げ られる が、 メ タ ピロ カ テ カ ーゼ遺伝子の SD配列が好ま しい。
    [0049] メ タ ピ ロ カ テ カ ーゼ遺伝子の SD配列及び翻訳開始コ ド ン ATG を含む DN A 配列は、 例えば化学合成に よ リ 、 こ の部分を 作製 し 、 該 DN A 断片を高癸現プ.口モー タ 一 · オペ レ ー タ 一を も っ た しかる べき癸現用べク タ一へ組換え る こ と に よ リ 得る こ と ができ る 。 また、 高癸現プロモー タ ー · オペ レ ー ター及 ぴ メ タ ピロ カテカーゼ遺伝子の SD配列を含む発現用ベク タ ー か ら遺伝子工学的手法に よ り 、 作製 しても よ い。 こ の よ う な 発現用べク タ 一 と しては、 例えば PHT 3 プ ラ ス ミ ド （ェ シヱ リ シ ャ * コ リ HB 101/PHT3微ェ研菌窨第 7778号、 ェ シ.ュ リ シ ャ · コ リ C 600/pHT3 微ェ研菌寄第 7777号及びェ シ ヱ リ シャ • コ リ W 3110/PHT3微ェ研菌害第 7778号と し て通商産業省ェ 業技術院微生物工業技術研究所 （以下 「微ェ研」 と い う） に 寄託 されてい る。 ） 、 PHT 311 プラ ス ミ ド （ エ シ リ シャ · コ リ HB 101/ 1^311微ェ研菌寄第7934号と し て微ェ研に害託 されてい る 。 ） が挙げられる。
    [0050] 更に 、 メ タ ピロカテカーゼ遺伝子の SD配列及び翻訳開始コ ド ン を も ち 、 その後ろ に切断可能な制限酵素切新部位を もつ 癸現用べク タ 一 と しては、 例えば PYTU3 プ ラ ス ミ ド （ェシェ リ シャ · コ リ HB 101/pYTU3、 微ェ研菌寄第 7932号 と して微ェ 研に害託 されている。 ） が挙げられる。 こ の pYTU3 プラ ス ミ ドの SDS列及び開始コ ド ン域の DNA 配 列は、 次式 （ ΠΙ ) ：
    [0051] TGAAGAGGTGCATCG ATG TCG A ACT.TCTCG.ACGTAGC 7AC AGC T.
    [0052] SD配列 Q_ I Sa 1 I
    [0053] (式中、 A 、' G 、 C 及び T は前記と同義で あ る 。 ） で示 される 。
    [0054] * 癸 明 に お い て 、 ポ リ オ ウ イ ル ス 弱毒株 Sab in l 型 、 Sab in 2 型又は Sab i π 3 型のキ ヤ プシ ド蛋白 '/ P 1 の少な く と も ァ ミ ノ 酸番号 32〜 105に相当するべ プチ ド を コ 一 ドする部 分 と し ては、
    [0055] 次式 ： - -·'
    [0056] Val Asp Asn Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp Lys Leu Phe V l Asp Asn Asp Ala Pro Thr し Arg Ala Ser Arg Lau Phe;又は Val Asp Asn Glu Gin Pro Thr Thr Arg Ala Gin Lys Leu Phe; で示 される ぺ プチ ドをコ一 ドする DNA 配列であれば如何なる も の で も よ い。 力 力 る DNA 配列の う ち、 Sabin l 型に係る も の は 、 例 え ば pBB2プ ラ ス ミ ド、 [ ノ モ ト ， ァ ギ オ （Nomoto, A. ) ， e t al . ;プロ シーデ ィ ング · ナシ ョ ナル · ァ カデ ミ ッ ク • サ イ エ ン ス · ユ ー · エ ス · エ ー （Proc. Natl . Acad . Sci . USA)， 73 , 5793 ( 1982)] か ら誘導 された そ の Tag I 新片、
    [0057] Tag I - 靳片及び I H I - Hnic II 断片な どに含ま れてい る。 該 T ag I 断片の DN A ¾列は、
    [0058] 次式 （ 17 ) :
    [0059] 50
    [0060] 5 '〜CGACACCCAGAGAGATGGACATCGTTGGTTTTGTGTCAGCt3TGTAATGAC
    [0061] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0062] 100
    [0063] TTCAGCGTGCGCTTGATGCGAGATACCACACATATAGAGCAAAAAGCGCT
    [0064] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxx
    [0065] 150
    [0066] AGCACAGGGGTTAGGTCAGATGCTTGAAAGCATGATTGACAACACAGTCC
    [0067] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxx
    [0068] 200
    [0069] GTGAAACGGTGGGGGCGGCAACGTCTAGAGACGCTCTCCCAAACACTGAA
    [0070] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxmxxxxxxxxxxxxx
    [0071] 250
    [0072] GCCAGTGGACCAGCACACTCCAAGGAAATTCCGGCACTCACCGCAGTGGA ( 17) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX2XXXXXXXXSSXXXXXXXXXX
    [0073] 300
    [0074] AACTGGGGCCACAAATCCACTAGTCCCTTCTGA7ACAGTGCAAACCAGAC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxx 200/S8dSfI:/i ΟΑ8λo/98l
    [0075]
    [0076] 850
    [0077] CAGTGCGAGAAATGGGACGACTACACATGGCAAACCTCATCAAATCCATC
    [0078] xxmxmxxxxxxxxxmmxxxsxmmmssxmmm
    [0079] 700
    [0080] AATCTTTTACACCTACGGAACAGCTCCAGCCCGGATCTCGGTACCGTATG
    [0081] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmmxxxxxmxxmxxxxx
    [0082] TTGGTATTT —3 '
    [0083] XXXXXXXXXGC
    [0084] (式：中、 A 、 G 、 C 、 T 及び X は前記と.同義であ る。 ）' で示 され、 該 I I - Κ Ρ Π I 新片の D N A 配列は、
    [0085] 次式 （ V ) ：
    [0086] 50
    [0087] 5* -CGACACCCAGAGAGATGGACATCC7TGGTTTTGTGTCAGCGTGTAATGAC
    [0088] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxmxxxxxxxxxxxxx
    [0089] 100
    [0090] TTCAGCGTGCGCTTGATGCGAGATACCACACATATAGAGCAAAAAGCGCT
    [0091] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxx
    [0092] 3:s Tii3い 3:Qiv:Gi£:G∑533Q xxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0093] VID0DVlDD010iVD3D03D¥001DD¥DVVD0DVX0D¥DVllI101V¥01 OO xxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0094] V3DiVyVDlVDlD0WVDDDiV0VO¥iDVDO¥DDDlVV¥0VD3DDD10V3 099 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0095] OlODDDDVaDVOOVIDOVlDlVllWVOOVlDlOVVOlWVllDODiyOD 009 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0096] DDlVVOVVIOVD fDiOVDiliV nrODlOVllDDiDlIIDOVlllVVDDlV 09S xxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0097] IVDlIlVDViOiiVIOOVOllDllDVDDliVVVDOVDDOVllOVDDlDlD 005 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0098] 1
    [0099] lSOO/S8df/l3d 810/98 ΟΛ 750
    [0100] TGTTGGTATTTCGAACGCCTATTCACACTTTTACGACGGTTTTTCCAAAG
    [0101] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxx
    [0102] 800
    [0103] TACCACTGAAGGACCAGTCGGCAGCACTAGGTGACTC03TCTATGGTGCA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmmxxxxxxxxmxxxx
    [0104] 850
    [0105] GCATCTCTAAATGACTTCGGTATTTTGGCTGTTAGAGTAGTCAATGATCA
    [0106] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxsmxxmxxxssixxxx
    [0107] 900
    [0108] CAACCCGACCAAGGTCACCTCCAAAATCAGAGTGTATCTAAAACCCAAAC
    [0109] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxx
    [0110] 350
    [0111] ACATCAGAGTCTGGTGCCCGCGTCCACCGAGGGCAGTGGCGTACTACGGC XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX2XXXXXXXXXXXXX
    [0112] 1000
    [0113] CCTGGAGTGGATTACAAGGATGGTACGCTTACACCCCTC7CCACCAAGGA XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX22XXXX2X xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0114] .E"-0VIDDV1DD¥00DVJ.1V1DVV1VV1DDDVDD1¥DV1D¥D011
    [0115] XXXXXXXXXXXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX DDTVD3DDDIi∑r)LLD01V10¥D30¥lDVIVVVDDVVD¥101DV3DD10¥ 09Ζ Ϊ
    [0116] 10V DlDDDD¥030W33ilW03iDD V3DDlV¥011VDaOVODDO¥00 0021 ' · xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0117] 0DVDV DlTVDVD¥010VllDiD0VDV3ViVVDDiDlV01D0V¥DlDVDD osn xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0118] DVW DDiiIVDVVD3V0i0¥3O3DllI¥DDV10V ODlilVVVV0¥llD
    [0119] 00Π xxxxxxxxxxxxmxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0120]
    [0121] 0901
    [0122] 9 I
    [0123] 8Σ8Ι0/98 OM (式中、 A 、 G 、 C 、 T 及び は前記 と 同義であ る 。 ） で示 され、 該 J H I - H i n c Π 断片の D N A S列は、 次式 （ W ) ：
    [0124] 50
    [0125] 5 '… GATCCATGATGGCAACTCGCAAACTGTTGGTGTCATACGCGCCTCCTGGA
    [0126] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxmxxxxsxxxxxxxxxxx
    [0127] 100
    [0128] GCCGACCCACCAAAGAAGCGTAAGGAGGCGATGTTGGGAACACATGTGAT XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0129] 150
    [0130] CTGGGACATAGGACTGCAGTCCTCATGTACTATGGTAGTGCCATGGATTA
    [0131] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxmxxxxxxxxxxxx
    [0132] 200
    [0133] GCAACACCACGTATCGGCAAACCATAGATGATAGHTCACCGAAGGCGCA
    [0134] χχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχ
    [0135] . 250 TACATCAGCGTCTTCTACCAAACCAGAATAGTCGTCCCTCTTTCGACACC
    [0136] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0137] 300
    [0138] CAGAGAGATGGACATCCTTGGTTTTGTGTCAGCGTGTAATGACTTCAGCG XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXSKSS2SXXXXXXXXXX 。M80/91800S/S8d:f/Is
    [0139]
    [0140] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0141] 101VVDl¥a01WV01¥3100VWOD01VO¥OVIOVDOVD3DXVVVDVDD
    [0142] 006 xxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0143] 0S8
    [0144] XXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0145] D0DIV0DDDXV¥0mDV0¥DiDVDllIVV¥DDlDVilD31DlIlD0¥ll
    [0146] 008 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0147] OS
    [0148] XXXXXXXXXXXXSXXXJKXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0149] ¥00I310VXVDm:V110V01V0VVDDlDlDVDVli:V13DVVlVDDV¥
    [0150] 002. XXXXXXXXXiSSXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0151] IVVOVVOOVaDilDOVDlDWlVODiDDDVViVllVDDDDlDDDlVDDlD
    [0152] 0S9 e ΐ
    [0153] 810/98 O TG TCGTGCCCCGCTCACCGGAGGCTCGAGTGOOGTACAG CCTGGGA
    [0154] : XXXxxxxxxxxxxxxxx: :xxxxx
    [0155] AACCASTCCTCCAATCACAACAGTTCOaAAACAATGAGTATOAAAACAG
    [0156] xxxxxxxxxxxx YYYVYYYYYYYYYYYYWVVVVVVVVVV.
    [0157] TAAATGACTTCGGTATTTTTAAGTCTGATCCAACCCGTGGCTGGAGTAAA n xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx:
    [0158] GAAGACCCTCGC TGGCCTGaTATOGTGCCATAGACTAGGACTOOCTAG
    [0159] CTOACCAT TGACGCCTTTTAOrnTTOAAAGTTCAATACACOAOOGTC
    [0160] TaTAOGTGGT TCTACCACCCTooOTTACCGGCTGGHATSTATACAAGGCA
    [0161] x
    [0162] x T ATCAATCTACGA一GCAAGGTGCTTCTGTACTGCAAGAAQCAG00Q3 Λ :xxx :xxx ΧΧΛΑ:x:
    [0163] C ACGTCTATA CGGATGGGAAGACCTTTAGTCATGGCAGGACACAGAAA ：
    [0164] »— ·
    [0165] Ml A AACCCC TGTTTACTACATTTAGTTTCAAAACGGCATGCCAGAAGAG,G
    [0166] TACAA ACTTCG AAAGTATATAGACGOOGTCCTGCAGGGACCAA ：GTAAA
    [0167] ACAOCTGACC TGTTOAATGAAGATCGGTCOCACCAGGGATTACGGTACGT
    [0168] OA8s/9s ssdfIofc00/ 8IS/s
    [0169] XXX:x xxxx日 xxxxxxx
    [0170] (式中、 A 、 G 、 C 、 T 及び X は前記と 同義であ る 。 ） で示 される 。
    [0171] また、 Sab in 2秩に係る も のは、 例えば p VS ( 2 ) 2503プラ ス ミ ド [ ト ヨ ダ ， ハノレ力 （Toyoda, H.) , et a 1. ； ジ ャ ー ナル ♦ ォ ブ ♦ モ ル キ ユ ラ 一 · バ イ オ ロ ジ ー （J . Moし Bi Qし） ， 174 ， 581 ( 1984 )] か ら誘導されたその ^ I - Llii.II 断片に舍ま れてい る。
    [0172] 該 _ΡΠ I - Π断片の DMA 配列は、
    [0173] 次式 （ H ) ：
    [0174] 50
    [0175] 5'— CTTGGATCAGTAATACCACATACAGACAAACCATCAACGATAGTTTCACA CATG XXXXXXXXXXXSXXXXXXXXXXXXXXXXXXmxXXXXXXXXXXXXXXX
    [0176] 100
    [0177] GAAGGTGGCTACATTAGCATGTTCTATCAAAGTAGGGTTGTTGTCCCGTT
    [0178] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxx
    [0179] 150
    [0180] GTCCACACCCAGAAAGATGGACATCCTGGGTTTTGTGTCAGCTTGCAATG
    [0181] 200
    [0182] ACTTCAGTGTGCGCTTACTGCGAGATACAACACACATTAGTCAAGAGGCT
    [0183] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxssxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0184] 000VDDlV01W0V3DiDDY311¥01VlDDDID3D110DDDDVDV¥3Dll OOS xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0185] . D3DDVVVaDl£3O0V0VD3OI13DDlDDilDDDlVY30Vi3DDDDVDV3VD oo xxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0186] DISD3DVOV3iIV0∑JiCaVIVDVDDVV001D¥D0DD¥0DIDDD0VDDDDV
    [0187] οεε
    [0188] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0189] CM ) V0¥DVDDi0DDi030ViV a3V33110VDD030D113Dll 0DIVV¥V¥l
    [0190] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0191] DViiVDDDVVDilDQ02SDDWDilVDXVD¥013DllVVDDVY0V0DDl¥
    [0192] t 2
    [0193] 8df/I3d 8Σ8Τ0/98 Ο xxxxxxxxxxxxxxxxssxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx x
    [0194] D00DiDV0iVIV¥DW03VD3DDDD0DDDDl¥130V0¥IlJ.IDlD0DIDD
    [0195] 008 xxxxxxxxxxxxxmmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0196] OOVVlD100I3DVDVOD3i∑JO¥iVIDVDlVVODlVVVlDDlDD01V10DV
    [0197] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0198] DD¥DD03DVDOV1VIVID1W1VD¥01V111DV 03VVD11¥ODIVOV3D
    [0199] 00Z xxxxxxxxxxxxxxxxssxxsxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0200] 0V¥i¥V¥30IVDiIV0¥10WYD10D¥DlDDiDlI110¥DlIDVDDlV0V
    [0201] 059 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0202] DillVDVDOilVIVDVOiiiiiWDDlDVVVDDOVOVDlDVVDllDlOVl
    [0203] 008 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0204] VDYV 0V110WimV3DiilDD01111DllV0VDD¥0DD0D0DVV¥D¥
    [0205] OSS
    [0206] S 2
    [0207] I 8Σ8Ϊ0/98 OM ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΣΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΚΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧ
    [0208] VDDDVVVVDY00V10V3000V010DDDlVDV ¥IVlX¥DIlDi.DDV33V0
    [0209] 0011 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxsxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0210] 3Dli0Vl a3aiDV0DVDDVDD100VD0¥0DDSiDDlDlDVDV0IDl¥DD
    [0211] 0S0I
    [0212] Vv y -vv yvvvv v vv v vv v v vvvYVVYVYYVYYY
    [0213] V ¥00DV Dl¥0ViDiDVDV3IVDV¥00iaDV01DDD0D0VD33DVV0¥3
    [0214] 0001 xxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0215] iVDIVVVlDDif3QD3iIDi03D10VOIVDDlllIVDIVVDlDVOIOOD10
    [0216] 0S6 xxxxxxxxxxxxx xxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0217] DiDDDVIDilDOllVeODDWDlDVVOlDDDVVDIDDDDDVlDVDOVlDV
    [0218] 006 xxxxxxxxxxxxxxxxxxmxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0219] VVVD iIlDDDiVDl¥JLlLlD¥D301I¥IDDDlV¥10DllVVDDDI0DVl
    [0220] 098
    [0221] 9 I
    [0222] 810/98 OM 1150
    [0223] TTAACGACTTATGGATTTGGACACCAAAACAAAGCTGTGTACACAG— 3 '
    [0224] XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0225] (式中、 A 、 G 、 C 、 T 及び X は前記と 同義であ る 。 ） 更に 、 Sabin 3 型に係る も のは、 例えば pVS ( 3 ) 2803プラ ス ダ ， ルカ（Ta oda , H . ) , et aし ； ジ ャ ーナル ' ォ ブ · モル キ ュ ラ ー · ォ ロ ジ J.Mo I .Bioし）， I ， 561 ( 1984 )] か ら誘導されたその I - Bgi II 断片に含ま れてい る 。
    [0226] 該 Sph I - Bgin靳片の DMA g列は、
    [0227] 次式 （M) ：
    [0228] 50
    [0229] 5 '…(： TGGGGTTTGTGTCAGGGTGTAATGATTTCAGTGTGGCiATTGCTGCGAGA
    [0230] GTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0231] 100
    [0232] CACCACTCACATTTCACAATCTGCGCTTCCACAGGGTATTGAAGATTTGA XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0233] 150
    [0234] TTTCTGAAGTTGCACAGGGCGCCCTAACTTTGTCACTCCCGAAGCAACAG
    [0235] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0236]
    [0237] GAOGACGCCTTCCAGACCCTATAAGCCGTQGCGTAC一 -TAGCTTA xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0238] 0¥00V01VV3001VDV0VD¥VDllV0DDiD0V¥30D0110DD0V00Vlll
    [0239] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0240] 10VDDD10V110D1V¥DODV11DDODJ.OOV1¥OOD1DV010J,¥VODDDOD
    [0241] 00 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0242] ODDDDlDDDDDlVlDDVDVllllVlVODlDOODVVODliDXVOVVVDDOl
    [0243] 0S9 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0244] IDVOVlOVODVOODiVDlOVVVOOVOVOaDVODODDVaDDOOOlVOVlDl
    [0245] 009 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0246] VVlVOVOOVlDiOOVDOVVaLOVDDIVODDDlVVlVVlODOVVOOVOllO
    [0247] OSS xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0248] ¥VD0030VVlD01DD1100VDilVVDDlV3¥01illD01DI0¥J,VDV01J, oos
    [0249] 6 2
    [0250] S00/S8df/I3d 0/98 O DV10XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0251] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0252] V0VDI¥0D0311ID0D1V1V0¥00VD111DDVVV0V013J,VI1D0DDVD0' 0001 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 丄丄 o svraf) よ？丄：) voqifSOTy aTOiuvj v丄 icov丄 3∞£ £ΰ )
    [0253] OSB xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0254] DOOVDVlODOaLDDlOlDlOOVlDOVOVVVOOOVVVDlVOVlliVDOOOi. ooe xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0255] 9VV¥D0ID0¥VlDWV10V03D0VVaVDlV01VV01D110J,DDlIDV00D 0S8 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0256] 008
    [0257] ο ε
    [0258] 8Σ8Ι0/98 OM (式中、 A 、 G 、 C 、 T 及び X は前記と 同義であ る 。 ） で示 される 。
    [0259] 本発明の第 1 の環状二重鎖 DNA は高癸現プ ロ モー タ 一 · ォ ペ レ 一 タ ー の 5'側上流に逆向き に位置 し、 そ の活性を制御す る温度感受性遺伝子部分を含むこ と が好ま し い。
    [0260] 太棻明の第 2 の環妆二重鎖 DNA は、 高発現プロ モー タ 一 · オペ レ ー タ — の 5'側上流に、 そ の活性を制御する温度感受性 遺伝子部分を含むこ とが好ま しい。
    [0261] 即 ち 、 高 発現 プ ロ モ ー タ 一 · オ ペ レ ー タ ー の活性 を 制 御 す る 温度感 受性遺伝子部分 と し て は 、 例 え ば λ フ ァ ー ジ c I 遺伝子の cl 857 変異遺伝子が挙げられる。 こ の cl857 (以下 「 cltsj と 'い う） 変異遺伝子は、 PLプ ロ モー タ ー * ォ ペ レ 一 タ ー の温度感受性 リ ブ レ ッ サ一をコ ー ドする 遣伝子で あ る 。
    [0262] こ の よ う な遺伝子を含む DNA 断片は、 例えば、 λ フ ァ ージ な どか ら直接取 り 出 しても よいが、 この よ う な断片を含むプ ラ ス ミ ド な ど 、 例えば PCQV2 プ ラ ス ミ ド [ ク イ ー ン ， シ ー (Queen , C. ) ;ジ ャ ー ナ ル · ォ ブ · モ レ ギ ュ ラ ー · ア ン ド • ァ プ ラ ィ Γ· · 、ン 不 テ ィ ク ス (Journal of Molecular and Appl ied Genetics) , 2 (1) , 1(1383)]から切 り 出 し て用いて も よ い。
    [0263] PCQV2 プ ラ ス ミ ド由来の cits変異遣伝子部分の DN A 配列 と し ては、 例え ば、 次式 （K) ： 50 '… AATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATATGAAGATTCTTGCTCAATTGTTA
    [0264] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0265] 100
    [0266] TCAGCTATGCGCCGACCAGAACACGTTGCCGATCAGCCAAACGTCTCTTC
    [0267] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0268] 150
    [0269] AGGCCACTGACTAGCGATAACTTTCCCCACAACGGAACAACTCTCATTGC
    [0270] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0271] 200
    [0272] ATGGGATCATTGGGTACTGTGGGTTTAGTGGTTGTAAAAACACGTGACCG
    [0273] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0274] 250
    [0275] CTATCCCTGATCAGTTTCTTGAAGGTAAACTCATCAGCCCCAAGTCTGGC
    [0276] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0277] 300 (IX)
    [0278] TATGCAGAAATCACCTGGCTCAACAGCCTGCTCAGGGTCAACGAGAATTA
    [0279] xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx x xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xx:x:
    [0280] ATTGAATTA ATTGGGTAAATCTCAACGCTAATTTGCAAGCACTTTO
    [0281]
    [0282] :xxxx
    [0283] TCTAAGCTTGGT xxx
    [0284] TTTTG
    [0285] TGAAGAGTC iCTTOG GTTGGAGCCTQ 3VI
    [0286] ,ε
    [0287] DXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
    [0288] • OiVlOllDDVDOWlOVliUVODllDOlVVIVOlDDDODlOlOOVlIll
    [0289] 008 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0290] VJ.OVDliD130aL33D DVVJ,DiViVVVXVODOV ODDOVOiVIOXVVVX
    [0291] 0S8 xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0292] 008 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0293] YDDDlDDIJ.¥0¥0VD0DlD101101 DD001¥0DDD0i0¥D103DD¥¥DD xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
    [0294] ¥00 VVlV Vll¥00DlV3iJ,V0DlVVlllVD0VVlVliD0D0001VVD0
    [0295] 059
    [0296] 0/98 O (式中、 A 、 G 、 C 、 T 及び X は前記と 同義であ る。 ） で示 される DNA 配列が挙げられる。
    [0297] 本発明の環状二重鎖 DNA には、 瘟度感受性遺伝子部分の下 流に ア ン ピシ リ ン耐性をコ一 ドする部分を含ませる こ とが好 ま し く 、 該部分が PBR322プラ ス ミ ド由来であ る こ と が更に好 ま し い。
    [0298] 本発明'の第 1 の環状二重鎖 DN A は、 例えば、 次の よ う に し て調製する こ とができ る。
    [0299] PCQV2 プ ラ ス ミ ドを制限酵素 gi iで消化 し突出末端を S1 ヌ ク レ ア ー ゼ で消化 して平滑末端と し 、 T4DfiA リ ガ ー ゼで再 ぴ瓖化 し 、 Q_L§ I 部位を消失 させて PHT 1 プ ラ ス ミ ド を得 る。 得 られた環状 DNA を、 コ ー ェ ン ら の方法' [プ ロ シ 一デ ィ ン グ · ナ シ ョ ナル · ア カデ ミ ッ ク · サ イ エ ン ス ， ュ 一 ， エ ス • ェ 一 (Proc . Natl . Acad.Sci . USA)， 68 , 2110 ( 1372 ) ]に 従 っ て 、 例えばェ シ ェ リ シャ · コ リ (Escherichi co 1 i )HB 101 株に形質転換 し、 ア ン ビシ リ ン耐性を指標に PHT 1 プラ ス ミ ド舍有株を ス ク リ ーニ ン グ し 、 増幅する 。 得 られた形質 転換株 よ り PHT 1 プ ラ ス ミ ド を単離する 。 こ の プ ラ ス ミ ド の H I 部位 と R I 部位と の間には、 λ フ ァ ー ジの ΡΒ 及び PLプロ モータ ーの リ ブ レ ッ サーである c l 蛋白質をコ一 ドす る 瘟度感受性遺伝子. c I tsが含まれてい る 。
    [0300] PHT 1 プ ラ ス ミ ド を R I 及 び Bam H I で消化 し て c i tsを含む断片を単離する。 こ の断片は、 前記式 （ K) で 示される DNA 配列からなる。 PCQV 2の相当する断片の 0_ I 部位に存在 した^塩基対 （前記式 （Κ ) の第 28番 目 の 塩基 対と第 27番 目 の 塩基対との間に存在した も の） は除去され てい る 。
    [0301] 一方、 pKC 30プ ラ ス ミ ドを i^ R I 及び I i Π で消化 し て長い断片を分離する 。 こ の断片は 1 個の Bam H I 部位を 有 し 、 末端から Bam H I 部位までの DNA 配列は、 PBR322の Eco R I 部位からその制限酵素開裂地図上反時計通 り に H I 部位までの DNA 配列に相当する。 こ の中には、 ア ン ピシ リ ン耐性をコー ドする部分と大腸菌内での複製起点 が含まれている。 また、 この IJJ H I 部位 と | Ι Π 末端との 間に 1 個'の' I 部位が存在し、 1^1 II末端 と Hpa I 部位の 間には PLプロモータ一 · オペ レータ—が存在する。 こ の J l Π末端 と I 部位との間の DNA 配列は、 前記式 （ I ) で示 される 。
    [0302] 以上のよ う に して得た両 DNA 断片を T4DNA リ ガーゼで接着 瑷化 さ せて プ ラ ス ミ ド を構築する 。 こ の プ ラ ス ミ ド を pHT 1 プ ラ ス ミ ド と 同様に して ク ロ ー ニ ング し、 増幅す る。
    [0303] PYT 3 プ ラ ス ミ ド を制限酵素 ^ ΐΠ で消化 し 、 メ タ ピ ロ カテカ一ゼをコー ドする部分を含む C-230 断片を単離し、 T4DNA ボ リ メ ラ ー ゼで 3'突出末端を消化 して平滑末端 と す る。 PHT 2 プ ラ ス ミ ド、を制限酵素 ILE I で消化 して開瑷させ、 こ れ に 平滑末端 と し た C-230 断片 を挿入 し て閉環 さ せ て pHT 3 プラ ス ミ ドを構築する。 このプラ ス ミ ドで大腸菌を形 質転換 し、 ア ン ピシ リ ン耐性を指標にする と と も に、 培養途 中で培養温度を 42 ¾程度に上昇させた後、 カテコ ール水溶液 で黄色 に着色す る コ ロ ニー を集めて、 こ の プ ラ ス ミ ド の ク ロ ー ニ ン グ及び増幅を行う。
    [0304] pYT 3 プ ラ ス ミ ドからの C- 230 断片に代えて PSLM K 1 プラ ス ミ ド （ こ の プ ラ ス ミ ドを もつ形質転換体の う ち 、 ヱ シ ヱ リ シャ · コ リ HB 101/pSLMK 1 は微ェ研菌寄第 7818号 と して、 ェ シ ヱ リ シ ャ · コ リ 《 3110/pSLM 1 は微ェ研菌寄第 7817号 と し て、 エ シ ヱ リ シャ · コ リ BR 1/pSLM 1 は微ェ研菌害第 7618号 と し て及びェ シエ リ シ ャ · コ リ RB 791/pSLMK 1 は微 ェ研菌寄第 7619号 と し て、 それぞれ微ェ研に害託 されてい る。 ） 又は PTCCM 1 プラ ス ミ ド （このプラ ス ミ ド' を も つ形質 転換体 の う ち 、 ェ シ ェ リ シ ャ · コ リ 791/pTCCH 1は 1384 年 8月 17日 、 FERM P-77815と し て微ェ研に寄託 され、 1385 年 8月 8日 付 で ブ ダペ ス ト 条約に基づ く 国際寄託に移管 さ れ 、 FERM BP- 882 号が与え られてい る 。 ） を ^_2 R I で消 化 し て 得た C-230断片の両突出末端を dNTPで う め、 こ れを PHT 2 プラ ス ミ ドに挿入 して pHT 3 プラ ス ミ ドを調製 して も よい。
    [0305] PSLM 1 プ ラ ス ミ ドの調製法は、 特願昭 53— 97108 号明細 書中 に詳述 されている。
    [0306] 次いで、 pHT 3 プ ラ ス ミ ドを H I で消ィ匕 し 、 突出末端 を T4DNA ボ リ メ ラ ーゼ又はク レ ノ ゥ断片で修復 し て平滑末端 と し 、 更に _^_Π で部分消化 し、 T4DNA リ ガー ゼ で再び瓖化 して pHT 31プ ラ ス ミ ドを得る。 接着部分は Η Ι 部位が再 生す る 。 PH T 31プ ラ ス ミ ド を ^! I で消化 し、 突出末端を T4DNA ボ リ メ ラ ーゼ又はク レ ノ ゥ断片で修復 して平滑末端と し 、 更 に で消化 し 、 T4DNA リ ガーゼで再び瑷化 して PHT 311 プ ラ ス ミ ドを構築する。 接着部分は Sa l I 都位が再 生する 。 PHT 3 プ ラ ス ミ ド以降の操作は、 メ タ ピ ロ カテカー ゼの N 末端部分をコ一 ドする DNA 部分に適当な制限酵素部位 を作製する ための'操作でぁ リ 、 PHT 3 プラ ス ミ ド を Pyun で 部分消化.する こ と に よ り メ タ ピロ カテ力一ゼ遣伝子中の El II 部位を利用 してポ リ オ ウ イ ル ス cDNA断片の挿入 を試みても よい。 また、 PHT 3 プラ ス ミ ドのメ タ ピ π カテカ ーゼ遣伝子 中の 部位を利用 しても よい。
    [0307] 次に、 pHT 311 プラ ス ミ ドを で消化 し、 突出末端を T4DNA ポ リ メ ラ ーゼ又はク レ ノ ウ断片で佟復 し 、 平滑末端と し て、 DNA 断片を得る。 一方、 ポ リ オ ウ イ ル ス由来 cDNAから VP1 遺伝子を合む DNA 新片を調製する。
    [0308] 例えば、 S ab i π 1 型では、 pBB 2 プラ ス ミ ドを Tag I で消 化 し 、 突出末端を T4DNA ボ リ メ ラ ーゼで修復 し、 VP 1 を舍 む DNA 新片を単離する。 該 DNA 断片と、 前述の pHT 311 プラ ス ミ ド よ り 得 られる DNA 断片と を T4DNA リ ガ一ゼ で接着環化 させ、 pHTP 31 プ ラ ス ミ ドを構築する。
    [0309] PBB 2 プ ラ ス ミ ド を H I 及び jjc II で消ィヒ し 、 突 出末端を T4DNA ボ リ メ ラ ーゼで修復 し、 VP 1を含む DNA 断片 を 単錐 す る 。 該 DNA 靳片 と 、 前述 の pHT 311 プ ラ ス ミ ド よ り 得 られ る DNA 断片と を T4DNA リ ガーゼで接着環化 させ、 pYTP 100プ ラ ス ミ ドを構築する 。 ρΗΤΡ 31プ ラ ス ミ ド、を
    [0310] I で消化 し 、 DNA 断片を調製する。
    [0311] PBB 2 プ ラ ス ミ ドを Κρη I で消ィ匕 し、 VP 1の カルボギシル 基末端 （以下 「C 末端」 と い う） 側を含む DNA 断片 を分離す る。 該断片 と 、 PHTP 31 プラ ス ミ ドを ii l で消化 して得た D'NA 断片 と を T4DNA リ ガーゼで接着環化させ pYTP 11 プ'ラ.'ス ミ ド を構築す る。
    [0312] Sab in 2 型については、 例えば、 pVS ( 2 ) 2503プ ラ ス ミ ドを pn I 及び^ II で消化 し、 突出末端を T4DNA ボ リ メ ラ 一ゼ で修復 し 、 平滑末端 と し て、 VP 1を含む DNA 断片を単離す る 。
    [0313] 該 DNA 断片 と 、 前述の pHT 311 プ ラ ス ミ ドか ら得 られ る DNA 断片 と を T4DNA リ ガ一ゼに よ り 接着環化 させ pYTP 200プ ラ ス ミ ドを構築する。
    [0314] Sab in 3 型 については、 例えば、 pVS ( 3 ) 2803プ ラ ス ミ ドを IZii I 及び fj Π で消化 し、 突出末端を T4DNA ボ リ メ ラ 一ゼ 又 は ク レ ノ ウ 断片 で修復 し 、 平滑末端 と し て、， VP 1を含む DNA 断片を単離する。 該 DM 断片と、 前述の pHT 311 プラ ス ミ ド よ り 得 られる DNA 断片と を T4DNA リ ガ一ゼで接着瓖化さ せ pYTP 300-1プラ ス ミ ドを構築する。 これは、 メ タ ピロ カテ 力一ゼ遺伝子の一部と ポ リ オウ イ ルス由来の DNA と のア ミ ノ 酸の フ レー ムが一致 していない。 従っ て、 フ レ ー ム を一致さ せる ために PYTP 300 - 1プラ ス' ミ ドを § l I で消化 し 、 突出末 端を S 1ヌ ク レ ア一ゼで消化 し、 T4DNA リ ガー ゼ で再環化さ せる こ と に よ リ PYTP 300プラ ス ミ ドを構築する。
    [0315] 术発明の第 2 の瑗状二重鎖 DNA は、 例えば、 次の よ う に し て調製する こ と ができ る 。
    [0316] ま ず 、 ポ リ オ ウ イ ル ス VP1 蛋白の Ν末端を非融合の形に する ために 、 . 現用.ベク タ 一 PYTU3(ェシェ リ シャ · コ リ ΗΒ 101/PYTU3 微ェ研菌害第 7332号と して微ェ研に寄託 されてい る 。 ） を利用する こ と ができ る 。 PYTU3 プ ラ ス ミ ド を Sal I で消化 し 、 突出末端を S 1ヌ ク レ ア ーゼで消化 して平滑末端と し 、 こ こ へ、 平滑末端化 し た ポ リ オ ウ イ ル ス Sab i n 1 型、 Sab in 2 型又は Sab in 3型 VP 1抗原領域を コ ー ドす る DNA 断 片を挿入する 。 Sab in 1 型の場合には、 例えば、 融合型の発 現プ ラ ス ミ ド PHTP31プラ ス ミ ド又は pYTPUプ ラ ス ミ ドを用い る こ と がで き る。
    [0317] PHTP31プ ラ ス ミ ド及び pYTPl lブ ラ ス ミ ド は 、 それぞれ ェ シ ヱ リ シ ャ · コ リ C 600/pHTP31 及びェ シ エ リ シ ャ ， コ リ C 800/pYTPl l と し て 、 ア メ リ カ ン · タ イ プ · カ ル チ ヤ 一 · コ レ ク シ ョ ン （ATCC)に害託 され、 それぞれ ATCC 39978及び ATCC 39972の寄託番号が付されている。
    [0318] PHTP31.プ ラ ス ミ ド を用い る場合、 これを制限酵素 Sal I で消化 し 、 713塩基対の DNA 断片を得る 。 こ の DNA断片を T4DNA ボ リ メ ラ 一ゼで平滑末端化 して、 PYTU3 の平滑末端化 した I 部位へ T4DNA リ ガ一ゼを用いて挿入 し て も よいが 平滑末端化せずに、 PYTU3 プラ ス ミ ドの Sal I 消化 DNA 断片 と 、 VP1 蛋白抗原部位を含む ^_[ 1 713 塩基対 DNA断片と を T4DNA リ ガ一ゼを用いて再び瑷化 し、 PYTP102 を得る。
    [0319] 次 に 、 C末端を非融合化する操作を行う 。 PYTP102 プ ラ ス ミ ド を制限酵素 l £ I で消化 し、 次に T4DNA ボ リ メ ラ ーゼに よ り 平滑末端化する。 市販の三つの フ レ ー ム に翻訳終結コ ド ン TAA を も つ次式 （ X ) ：
    [0320] 5 '… GCTTAATTAATTAAGC- 3'
    [0321] 3 '… CGAATTAATTAATTCG- 5'
    [0322] (式中、 A 、 G 、 C 及び T は前記と同義であ る 。 ） で示 さ れ る 18塩基対 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （以下 「翻訳 終結ュニ ッ ト 」 と い う） を T4ボ リ ヌ ク レ オチ ドギ ナ一ゼで 5' 末端 を リ ン酸ィヒ し 、 これ と 、 PYTP102 プ ラ ス ミ ド を pn I で消化 して T4DNAポ リ メ ラ 一ゼで平滑末端化 した DNA断片と を T4DNA リ ガーゼで接着環化させ、 PYTP102Kプ ラ ス ミ ドを得 る 。
    [0323] 一方、 N末端及び C末端の非融合化を同時に構築する こ と も で き る 。 pYTPllプ ラ ス ミ ドを_^ I で消化 し、 T4DNAポ リ メ ラ 一 ゼで平滑末端化する。 該 DNA断片と翻訳終結ュニッ ト と を T4 DNA リ ガーゼで接着させる。 更に、 制限鏖素 旦 I で 消化 し、 ァガロ ー スゲル電気泳動を行った後、 VP1 蛋白抗原 部位をコー ドする領域を舍む 1050塩基対の DNA断片を回収す る。 '
    [0324] PYTU3 プ ラ ス ミ ドを制限酵素 I と iLLJi l で二重消化 し、 4000塩基対の DNA断片を得、 これと、 前記 1050塩基対の DNA 断片と を T4DNAリ ガ一ゼによ り接着環化 して、 PYTP102P プ ラ ス ミ ドを得る。
    [0325] Sabin 2 型 については、 例えば、 融合型発現プラ ス ミ ド PYTP200 を制限 素.^ J I で消化し、 ァガ α — スゲル電気泳 動を行った後、 VP1 蛋白抗原部位をコー ドする領域を合む約 1180塩基対の DNA 断片を回収する。 該断片 と PYTU3 プ ラ ス ミ ドを制限酵素 ^ ll I で消化した DNA断片と を T4 DNAリ ガーゼ で接着環化 し て PYTP201 プラ ス ミ ドを構築する。
    [0326] PYTP201 プ ラ ス ミ ド を制限酵素 ！^ I で消化 し、 T4DNAボ リ メ ラ 一ゼ で平滑末端化する。
    [0327] 該 DNA断片 と、 翻訳終結ユニッ ト を T4ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ギ ナ一ゼで処理 し て 5'末端を リ ン酸化 した も の と を T4DfiAリ ガー ゼで接着環化して PYTP201J (プラ ス ミ ドを搆築する。
    [0328] ΡΥΤΡ200 プ ラ ス ミ ド、は、 ェ シ ヱ リ シャ 《 コ リ C 800/ pY TP 200 と し て、 ATCCに寄託され、 ATCG 33977の寄託番号が付されて い る 。
    [0329] Sab i π 3 型 に つ い ては、 例えば、 融合型発現プ ラ ス ミ ド ΡΥΤΡ300 を制限酵素 I で消化 した後、 T4DNAボ リ メ ラ ー ゼ で平滑末端化 し、 次いで制限酵素 |υ Η I で消化 し、 ァガ ロ ー ス ゲル電気泳動を行っ た後、 約 1500塩基対の DNA断片を 得る 。 '
    [0330] 一方、 PYTU3 プ ラ ス ミ ドを制限酵素 jj I 消化後、 S1ヌ ク レ ア ーゼで平滑末端化する。 次いで、 制限酵素 H I で消 化 し 、 ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動を行 っ た後、 約 3800塩基対 の DNA断片を 回収 した。 該 DNA断片 と前記約 1500塩基対の断 片 と を T4DNA リ ガ一ゼで接着環化 して PYTP301 プ ラ ス ミ ドを る.。 .
    [0331] PYTP301 プ ラ ス ミ ドを制限寧素 Κρπ I で消化 し 、 T4DNAポ リ メ ラ 一 ゼ で平滑末端化 し 、 次に 、 該 DNA断片 と 、 翻訳終 結ュニ ッ ト を T4ボ リ ヌ ク レ オチ ドキナーゼで処 し て 5'末端 を リ ン酸化 し た も の と を T4DNAリ ガーゼで接着環化 し て PYTP 3011 (プ ラ ス ミ ドを得る。
    [0332] ΡΥΤΡ 300 プ ラ ス ミ ド、は、 ェ シ ヱ リ シ ャ · コ リ C 600 /ΡΥΤΡ 300 と し て、 ATCCに寄託され、 ATCC 33373の寄託番号が付さ れ て い る 。
    [0333] 以上の よ う に して得 られる プラ ス ミ ドの う ち、 PYTP102Kプ ラ ス ミ ド、、 PYTP102Pプラ ス ミ ド、 ΡΥΤΡ301Kプ ラ ス ミ ド、は、 ボ リ オ ウ ィ ル ス Sab in型由来のボ リ ペ プチ ド の他に は、 N末端 に ATG でコ ー ド される メ チォニ ン のみを、 C末端に翻訳終結 ュニ ッ 卜 で コ ー ド され る 1 〜 2 個の ア ミ ノ 酸のみを コ ー ド し 、 pYTP201Nプラ ス ミ ドは、 ポ リ オ ウ イ ル ス Sab in型由来の ポ リ べ プチ ドの他には、 N末端に ATG でコ ー ド ざれる メ チォ ニ ン及び制限酵素切新部位をコ一 ドするための.1 又は 2倔の ア ミ ノ 酸を 、 C末端に翻訳終結ユニ ッ ト でコ ー ド される 1 個 のァ ミ ノ 酸の みをコ一 ドする。
    [0334] 以上の操作で各制限酵素に よる消化、 T4DNA リ ガ一ゼに よ る連結、 ア ン ピシ リ ン耐性を用いる ス ク リ 一 ニ ン グ及び各プ ラ ス ミ ド、の増幅などはすべて慣用の方法を用いる こ と がで き る 。 ま た 、 各 DNA 断片及び プ ラ ス ミ ドな どの分鎗精製に は フ エ ノ ール に よ る抽出、 エ タ ノ ールに よ る沈殿、 ァ ガ ロ ー ス ゲ ル電気泳動及び それに引続 く 抽出技術、 液体 ク ロマ ト グ ラ フ ィ 一 に よ る 分離な どの慣用の技術を用いる こ と がで き る 。
    [0335] 以上の よ う に して得られた *癸明の環状二重鎖 DN A を プラ ス ミ ド と し て用いてェシェ リ シャ属細菌を形質転換せ しめる と 、 キ ヤ プ シ ド蛋白 VP 1 の抗原块定部位を有する蛋白質 （以 下、 融合型の ものを 「VP1 融合蛋白質」 、 非融合型の も のを 「 VP1 非融合蛋 白質」 と い う ） の産生菌を得る こ と が で き る。 ェ シ ヱ リ シャ属細菌と しては、 ェ シ I リ シャ · コ リ を用 い る こ と が好ま しい。
    [0336] 以上の よ う に し て得られる VP 1 融合蛋白質の產生菌の典 型的な菌株は、 ATCCに寄託され、 以下に示す寄託番号が付さ れてい る。
    [0337] 寄託番号
    [0338] ェ シ ヱ リ シャ · コ リ C800/pHTP31 ATCC 39978 ェ シ リ シャ · コ リ C600/pYTPll ATCC 39972 ェ シ エ リ シャ · コ U CSOO/pYTPlOO ATCC 39975 ェ シ エ リ シャ * コ U C800/pYTP200 ATCC 39977 ェ シ ェ U シャ * コ リ C600/PYTP300 ATCC 39973 ェ シ ェ U シ ャ * コ U CSOO/pSL 1 ATCC 39974 また、 VP 1非融合蛋白質の産生菌の典型的な菌株は以下の と お り であ る。
    [0339] 'ェ シ エ リ シャ · コ リ C600/pYTP102P
    [0340] ェ シ エ リ シ ャ · コ U C 800/pYTP102K
    [0341] ェ シ エ リ シ ャ · コ リ C800/pYTP201N
    [0342] ェ シ ェ リ シャ · コ リ C800/pYTP301K
    [0343] これ ら の菌秩は微ェ研に寄託を依鎮 したが、 P2レ ベル に 相 当す る こ と を理由 に拒否 されたが 1985年 3月 12日 付で ド ィ チ ヱ · ザ ム ル ン グ · フ ォ ン · ミ ク ロ オル ガニ ス メ ン [Deutsche Samm 1 ung von M i k r o o rgan i sme n ( DSM ) ] に寄託さ れ、 以下に示す寄託番号が付されている。
    [0344] 寄託番号 ェ シ ェ U シ ャ ♦ コ U C600/pYTP102P DSM 3470
    [0345] エ シ リ シャ ♦ コ ！ C600/pYTP102K DSM 3469 ェ シ ェ リ シ ャ · コ リ G800/pYTP20 IN DSM 3472
    [0346] ェ シ ェ Iリ シャ ♦ コ リ C600/pYTP301K DSM 3471 末発明は、 また前記形質転換株を栄養培地に培養 して、 菌 体内に蓄積 した融合蛋白質又は非融合蛋白質を採取するこ と を特徴 とする ポ リ オウ イ ルス ワ ク チ ンの製造法を提供する も のであ る。
    [0347] 本発明の製造法で用いる栄養培地は慣用培地、 例えば LB培 地、 LB寒天培地、 SB培地などを用いる こ と ができ る 。 これら の培地 にほ必要に応 じてア ン ビシ リ ン な どの薬剤を添加す る。
    [0348] 本発明の製造法において、 形質転換株の培養は固型培地上 での培養、 液体通気培養などの慣用の方法で行う こ と ができ る 。 培養瘟度、 培地液性などの培養条件も形質転換前の菌 株、 例えばェ シ エ リ 、シャ · コ リ C 800、 ェ シ ェ リ シ ャ · コ リ HB 101 、 ェ シ ェ リ シャ · コ リ W 3110 、 ェ シ ェ リ シャ · コ リ RB791 、 ェ シ ヱ リ シャ · コ リ B1H などのそれ と同様である。 培養時間は、 通常数時間ない し 1 日程度であ る。
    [0349] 本癸明の製造法に用いる形質転換株は、 生育途中又は生育 後 、 培養温度 を通常の 30で程度か ら 42°C程度に する こ と に よ っ て高発現プロモータ一 ' オペ レータ 一、 例えば PLプロ モー タ — · オペ レータ ーの リ プ レ ッ サーであ る c l ts蛋白質 が不活性に なるため、 該プロモータ一 · オペ レー タ 一が活性 化され、 そ の支配を受ける VP 1 融合蛋白質又は VP 1 非融合蛋 白質を コ 一 ドする 遣伝子部分が強力に転写 され、 発現され る。
    [0350] 生育 した菌体は憤用の方法で集菌し、 水性懸濁液中におい て、 超音波処理又は一般的に用いられる酵素、 界面活性剤に よる菌体処理法によ リ菌体を破壊した後、 必要に応 じて高濃 度の尿素又は塩酸グァニジ ンなどの変性剤を含有する水溶液 で抽出 した後、 希釈等にょ リ活性を復元させる こ と によ リ 目 的と する V P 1 融合蛋白質又は VP 1 非融合蛋白質を得る こ とが でき る。 また、 この tt出液を ト リ ス塩酸緩衝液 （以下 「T r i s 一 H C A 」 と い う） 、 リ ン酸塩緩衝液で透析する こ と に よ り 目 的物を可溶性蛋白質と して得る こ とができ る 。
    [0351] [図面の簡単な説明] '
    [0352] 第 1 図、 第 2 図、 第 3 図、 第 4図、 第 5 図、 第 6 図、 第 7 図及び第 8 図は、 *発明の環状二重鎖 D N A の作製例を示す図 であ る。
    [0353] 第 9 図は、 p H T 3プラ ス ミ ドの作製例を示す図であ る。
    [0354] [発明を実施するための最良の形態]
    [0355] 次に、 本発明を実施例及び調製例によっ て、 更に詳細に説 明するが、 太癸明はその要旨を超えない限 り これ ら に よ っ て 限定 される も のではない。
    [0356] 以下において用いた緩衝液、 培地等の組成は以下の通り で あ る。
    [0357] T E緩衝液 ： lOmM Tris-HCil
    [0358] ImM EDTA
    [0359] pH 7.8又は 8.0
    [0360] 停止液 ：
    [0361] 1 % ドデ シル硫酸ナ ト リ ウ ム
    [0362] 0.1 %プ ロ モ フ ヱ ノ ールブルー、
    [0363] lOOm エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四酢酸ニ ナ ト リ ゥ ム （以下 Γ EDTAJ といラ） 及び
    [0364] 50%グ リ セ リ ン を含有
    [0365] (ベ セ ス ダ · リ サ ー チ ， ラ ボ ラ ト リ ー ズ · イ ン コ ー ポ レ 一テ ッ ド製）
    [0366] LB amp培地 ：
    [0367] NaCiL 5 g
    [0368] ぺ プ ト ン （Bactotryptone、 商標） 5 g
    [0369] 酵母ヱ キ ス 5 g
    [0370] ア ン ピ シ リ ン 25nig
    [0371] 水
    [0372] LB amp寒天培地 ：
    [0373] 前記 LB amp培地の各成分の他、 寒天 15 g を含有
    [0374] なお、 ス ク リ ーニ ング培地には LB anp寒天培地を、 増幅用 培養液には LB aap培地を用いた。
    [0375] 調製例
    [0376] [ I ] PHT 1 の作製 PCQV2 プ ラ ス ミ ド 7 jit g を 50 Α の反応液（6aM Tris-HCil pH7.9 、 6oM MgC£2 50aM NaCA ) 中、 Cla I 50ϋと 37°Cで
    [0377] 2 時間反応 さ せた。 フ ノ ー ル抽出、 ヱ タ ノ ー ル沈殿後、
    [0378] 50 ^ il の反応液 （0.2M NaC£、 50aM酢酸ナ ト リ ウ ム ΡΗ4.5、 lmM Z11SO4 、 5%グ リ セ リ ン） 中、 S 1 ヌ ク レ ア 一 ゼ 10U と
    [0379] 37で で 2 分間 反応 を 行 っ た 。 反応後、 フ エ ノ ー ル抽出 、 ヱ タ ノ ー ル沈殿 を 行い 、 次い で 、 の反応液 （86mM
    [0380] Tris - HC Jl pH7.8、 6.60M MgCj^^ lmM ATP 、 5oM DT 中、
    [0381] T4DNA リ ガ一ゼ 2.5Uを用いて、 15°Cで 17時間反応を行った。 反応後、 50nM NaCA 8 il及び QJ_ I 20Uを加えて、 37°Cで 2 時間反応 さ せ、 更に 70°Cで 5分間熱処理 し て酵素失活を 行 っ た 。 故冷後、 こ の溶液 を用 い て エ シ ュ リ シ ャ * コ リ
    [0382] HB 101株 を形質転換 し 、 ア ン ピ シ リ ン耐性を指標に PHT 1 プ ラ ス ミ ド を もつコ ロニーを ス ク リ ーニ ン グ し 、 慣用手段に 従っ て こ の プ ラ ス ミ ドを単離 した。
    [0383] [ II ] c I ts遣伝子の単戆
    [0384] PHT 1 プ ラ ス ミ ド、 10 g を 50 t il の反応液 （ 10 aM Tris-
    [0385] HC Jl pH8.0、 7mM MgCl2^ 0.1M NaCil 、 2αΜ β - レカプ ト エ タ ノ ール） 中、 |υ H I 100U と 30°Cで 3 時間反応を行つ た。 反応後、 70°Cで 5 分間加熱処理 し、 放冷後、 Eco I
    [0386] 10 £ (100U)緩衝液 (1M Tris-HCJi pH7.5、 70aM MgC il 2
    [0387] 500 nM NaCA 、 90aM 6 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ル） 10 ^ Ji及 び水 25 l を加え総量を 100 l と し、 37°Cで 2 時間反応を 行い、 反応後、 70°Cで 5分簡加熱処理し、 放冷した。 こ の溶 液 30 ^ £ に停止液 を加え、 分難用 0.7%ァガロースゲ ル に の せ、 電気泳動 （50aA、 30分間） した。 c l ts遺伝子の 含まれている 400塩基対の断片を切り 出 し、 精製後、 水
    [0388] JI に溶解 した。
    [0389] C ΙΠ ] pHT 2 の作製
    [0390] P C 30 プ ラ ス ミ ド 8 g を 80 ;L £ の反応液（ 10aH Tris- HC pH7.5、 7mM MgC Jl 2 、 60aM NaC S. , 7nM /8 — メ ルカプ ト エ タ ノ ー ル ） 中、 J Π 80U と 37 °Cで 30分間反応を行つ た。 反応後、 フ ノ ール抽出、 ヱタ ノ 一ル沈毆を行っ た後、 沈殿物 を 水 10 ^ JI に溶解 し た 。 こ の溶液に、 緩衝液（1M Tris- HC 1 pH7.5、 70nM MgC 2 、 ·500πΜ NaCi , 30mH β - メ ル カプ ト エ タ ノ ール） 10 il 、 Eco R I 15 μ, 1 (80U) 及 び水を加え総量 100 L と し、 37でで 30分間反応 した。 反応 後、 フ エ ノ ー ル抽出、 エ タ ノ ール沈殿を行い沈殿物を水 20 に溶解 した。 こ の窑液 l it A に 、 [ Π ] で調製 した溶液 5 ^ 1 , 緩衝液（880aM Tris-HC ΡΗ7.6, Β6ΟΜ MgC^, 50nM DTT 、 lOmM ATP)2 L Q. ¾ 水 及び T4DNA リ ガ一ゼ 1 t (2.8U)を加え、 15でで 18時間反応した。 反応後、 こ の溶液 10 L JI'に水 30 J を添加し、 . pHT 1 プ ラ ス ミ ド の場合 と同様に し て ェ シ ヱ リ シャ * コ リ HB 101株を形質転換 し、 ア ン ピシ リ ン耐性を指標に PHT 2 プラ ス ミ ドをもつコ ロニー を ス ク リ 一 ニ ング し、 こ のプラ ス ミ ドを単建した。 [ 17 ] メ タ ピ ロ カテカーゼ遺伝子の調製
    [0391] PSLMK 1 プ ラ ス ミ ド 33 it g を 、 の反応液 （0.1M
    [0392] Tr is-HC ϋ ρΗ7.5、 7πΜ MgCil 2 、 50αΜ NaC S. , 9οΜ 3 - メ ル カ プ ト エ タ ノ ール） 中、 R I (180U)と 37°Cで 3 時間反 応 させた。 反応後、 反応液を 70°Cで 5分間加熱処理 した。 放 冷後、 こ の反応液に停止液 を加え、 分難用 0.7 %ァガ ロ ー ス ゲル に のせ、 電気泳動（150nA、 2.5 時間） を行った。 メ タ ピ ロ カテ力一ゼ遺伝子の含まれている 1200塩基対の DNA 新片 を 切 リ 出 し た後、 慣用手段に従 っ て精製 し 、 水 20 JI に溶解 した。 こ の溶液 18 ^ £ を含む 50 ϋ の反応液 （ 50aM Tri s - HC J3. ρΗ7.2、 ΙΟαΜ MgCl2^ 0. lnM DTT 、 0.04oM dNTP) 中、 DNA ポ リ メ ラ ーゼ I ク レ ノ ウ断片 5ϋと 25°Cで 30分間加溘 し、 平滑末端化 した。 反応後、 フ エ ノ ール抽出及び ク ロ ロホ ル ム抽出を行い、 エ タ ノ ール沈殿後、 沈殿物を水 10 A に溶 解 した。
    [0393] [ V ] pHT 3 の作製
    [0394] [ ΙΠ ] で得 られた pHT 2 プラ ス ミ ド 5.4 /t g を 50 ^ il の反 応液（IOBM Tris-HC £ PH7.5、 7mM MgC 2 、 0 - 1M KC 、 7 mM j6 - メ ル カ プ ト エ タ ノ ール） 中、 80Uと 37°Cで 3 時間反応させた。 反応後、 フ エ ノ ール抽出及びエ タ ノ ール沈 殿を行い、 沈殿物を水 20 ϋ に溶解 した。 こ の溶液 15 / il に
    [0395] [ 17 ] で得 られた DNA 断片溶液 8 、 緩街液（880aM Tris- HCil pH7.6, 66mM gC 2 、 50oM DTT、 lOoH ATP)5 μ. 9. , 水 7 il及び T4DNA リ ガ一ゼ 15 ^ il (42U) を加え、 12°Cで 18時 間反応後、 フ ノ ール ¾出、 エ タ ノ ール沈殿を行い、 沈殿物 を水 20 t il に溶解 した。 こ の溶液に、 緩衝液（lOOaM Tris- HC Jl pH7.5、 70iM HgG A 2 ^ 1 M KC Jl、 70aM 8 - メ ルカブ ト エ タ ノ ー ル） 3 it jl、 水 9 it A及び £ l 8 μ, 5. (48U) を加 え、 37°Cで 3 時間反応後、 70でで.5分間加熱処理 した。. 放冷 後、 こ の溶液を用いて、 PHT 1 プラ ス ミ ドの場合と同様に し て ェ シ ェ リ シ ャ · コ リ HB 101株を形質転換 し、 ア ン ビシ リ ン 耐性並びに 30でから 42 °Cに培養潼度を上昇させた後、 5%力 テコー ル水溶液を噴霪する と菌体が黄色を帯びる こ と を指標 に し て PHT 3 プラ ス ミ ドをもつ菌株をス ク リ ーニ ン グ した。 更に、 得られた菌体を慣用手段に従っ て増幅用培養液で培養 し、 精製する こ と に よ っ て PHT 3 プラ ス ミ ド 2mgを得た。
    [0396] 以上の よ う に し て得 られた PHT 3 プラ ス ミ ドは各種のェ シエ リ シャ属細菌に導入され、 昭和 59年 8 月 17日付で微ェ研 に寄託され、 以下の寄託番号が付されている。
    [0397] ェシヱ リ シャ · コ リ HB101/PHT3 微ェ研菌害第 7778号
    [0398] ェ シ ヱ リ シ ャ * コ リ C800/PHT3 微ェ研菌害第 7777号
    [0399] ェ シ ヱ リ シ ャ · コ リ W3110/PHT3 微ェ研菌寄第 7778号
    [0400] [ VI ] PHT311の作製
    [0401] [ V ] で得 られた pHT 3 ブ ラ ス ミ ド 及び Baa H I 15U を 20 ^ A の反応液（10aM Tris-HCl pH8.0、 7m MgCi2^ lOOmM NaG £ 、 2mM /S — メ ルカプ ト エ タ ノ ー ル） 中で 3時間 反応 さ せた 。 エ タ ノ ー ル沈殿後、 20 Ji の反応液 （ 50 BM Tr i s - HCil PH7.2、 ΙΟαΝ MgC >2 O. laM DTT 、 80 μ. M dNTP) に溶解 し、 ク レ ノ ウ新片 1Uを加えて、 22 °C で 0.5 時間反応さ せた。 フ エ ノ ー ル で除蛋白処理 した後、 ヱタ ノ ー ル沈殿を 行 っ た。 更に 、 20 μ Α の反応液 （ 10aM Tri s-HC 5. pH7.5、 7mM MgC£2、 60aM NaC , 7mM /8 - メ.ルカブ ト エ タ ノ ール） に溶解 し、 L n20U と 37でで 3時間反応させた。 エタ ノ ー ル沈毆後、 の反応液 （88aM Tris-HCA pH7.8、 6.6mM MgCil 2、 10mMジチオ ス レ ィ ト ール、 ΙπΜ ATP)に溶解 し、 T4DNA リ ガーゼ 2.8Uを加えて 15でで 20時間反応させた。 この反応物 を用いて、 ヱ シ ヱ リ シャ * コ リ HB101 株を形質転換させた。 ア ン ピ シ リ ン耐性形質転換株の中から、 第 1 図に示すよ うな. PHT 31プ ラ ス ミ ドをもつ菌を単離した。 更に、 通常の方法を 用いて 、 pHT31プ ラ ス ミ ドを得た。 pHT 31 プラ ス ミ ド、 5 ^ g を 、 20 μ« £ の反応液 （ iOmM Tr i s-HC 1 pH7.5 、 7mM ¾gGl 2 、 150nM NaC a.、 0.2mM EDTA 、 7mM /3 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ール） 中で^! I 15U と共に、 37°Cで 3 時間反応さ せた。 ヱ タ ノ 一ル沈殿後、 ク レ ノ ウ断片反応液 20 £ に溶解 し、 ク レ ノ ウ断片 IIIと共に 22°Cで 0.5時間反応させた。 ヱタ ノ ー ル沈殿後、 反応液 20 ^ Α に溶解 し、 Euill 20Uと 37°C で 3 時間反応させた。 エ タ ノ ール沈殿後、 T4DNA リ ガ一 ゼ反応液 20 JI に溶解し、 T4DNA リ ガーゼ 2.8Uと共に、 15°C で 20時間反応 させた。 こ の反応物を用いて、 ェ シヱ リ シャ * コ リ HB 101株を形質転換させた。 ア ン ビシ リ ン耐性形質転換 株の中か ら第 1 図に示すよ う な PHT311 プ ラ ス ミ ド を単離 し た。 こ のプ ラ ス ミ ドは、 I 部位を 1 ケ所 も ち 、 こ こ に 、 外来遺伝子を揷入する こ と によ り 、 メ タ ビ ロ カテ カ 一ゼ遺伝 子 と の融合遺伝子がつ く られる。
    [0402] 実施例 1 PHTP31の作製
    [0403] pBB 2 プ ラ ス ミ ド （ノ モ ト ， ァ ギ オ（Hoaoto，A.)， et al .； プ ロ シ 一 デ ィ ン グ · ナシ 3 ナル * ァ 力デ ミ ッ ク · サ イ エ ン ス ♦ ユ ー · エ ス * エ ー （Proc， Natl . Acad . Sc i - USA) , 79 , 5793 ( 1982)) 20 jit g を緩街液（10，M Tr is-HCil PH 7.5 、 7mM MgCl2 lOOnM NaC 1、 7nM /8 — メ メ ルカ プ ト エタ ノ ー ル） 20 μ Α 中、 I I 20Uと 80°Cで 2降間反応させた後、 4 %ボ リ ア ク リ ル ア ミ ド電気泳動を行 っ た。 約 700 塩基対の DNA 断片をマ キサ ム （Masaa) と ギルパー ト （G i 1 b e r t ) の方法
    [0404] ( プ ロ シ 一 デ ィ ン グ * ナシ ョ ナル · ア カデ ミ ッ ク * サ イ エ ン ス ♦ ュ 一 · エ ス ♦ エ ー （Proc. Nat 1. Acad . Sc i . USA) , 74 , 560 ( 1977 )) に従っ て回収した。 これを緩衝液 （ 87 aM Tris - HC £ pH8.8、 6.7nM MgC J2.2 、 10πΜ β 一 メ ル カ プ ト エ タ ノ 一 レ 、 8.7 M EDTA, ie.6aM(NH4)2S0 、 330 /t M dCTP、 dATP、 dGTP, dTTP) 20 Jl 中、 T4DNA ボ リ メ ラ 一ゼ 2.5Uと 37 °Gで 15分間反応させた。 フ エ ノ ール処理後、 エ タ ノ ー ル沈殿 を行い、 沈殿物を 10aM Tris-HC£ PH 7.5 、 laM EDTA溶液 10 A に溶解 し た。 こ の溶液には、 1 t ji あた り の DNA が 含 ま れ て い る 。 こ の DNA 断片は 、 ボ リ オ ウ ィ ル ス Sabin 1 株か ら得 ら れた c D K Aの う ち 、 ギ ヤ プシ ド蛋白 VP1 を コ 一 ドする DNA 領域を舍む 713 塩基对 （ 2373〜 3085) であ る。
    [0405] 一方、 PHT311プ ラ ス ミ ド lO it g を緩衝液 （ 10 aM Tris- HCil ρΗ7.5、 7πΜ 150ηΗ NaCl , 0.2aM EDTA、 7nN /S — メ ルカ プ ト エ タ ノ ール） 20 it £ 中、 ^ i l 10Uと 37°Cで 2 時間反応させた。 エ タ ノ ール沈殿後、 沈殿物を緩衝液 （87 oM Tri s-HC 1 pH8.8、 6.7aM MgCil2、 10aM j8 — メ レカプ ト エ タ ノ ー Jレ 、. 6.7oM EDTA、 16.6BM (NH4)2S04、 330 jtt H dCTP, dATP、 dGTP、 dTTP) 20 t 中、 T4DNA ボ リ メ ラ 一ゼ 2.5Uと 37 で 15分間反応させた。 フ ヱ ノ ール処理後、 エ タ ノ ール沈殿 を行 っ た。 沈殿物を緩衝液（50aK Tris- HC5. pH 9.0 、 laM
    [0406] MgC 5. 2 、 0. ImM ZnC 12 、 IJHM スペル ミ ジ ン） 20 ;t ϋ 中、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ 一ゼ （ ゥ シ腸） 1Uと 37で で 30分間反応さ せた。 フ ヱ ノ ール処理後、 ヱタ ノ ール沈殿を行っ た。 沈殿物 を 、 lOmM Tr i s-HC 1 pH7.5、 leM EDTA^液 20 1 に溶解 し た。 こ の溶液には、 l t jl あた リ 0.4 μ. g の DNA が含まれて いる 。
    [0407] こ の DNA 1 ]L z を前述のポ リ オ ウ イ ル ス Sabin 1 型 VP1 を コ ー ド す る DNA 領域を合む DNA 断片 0.4 it g と共に緩衝液 ( 66aM Tr i s-HC 1 pH7.6 、 6.6eM MgCjL2、 10BM DTT 、 ImM ATP)20 ;t il 中、 T4DNA リ ガ一ゼ 2.8U と 15°Cで 15時間反応さ せた。 こ の反応物を用いて、 ェシヱ リ シャ * コ リ HB101 株を 形質転換 し、 ア ン ビシ リ ン耐性株の中から 、 第 1 図に示した PHTP31ブラ ス ミ ドを単戆した。
    [0408] こ の プ ラ ス ミ ド に舍 まれ る ポ リ オ ウ イ ル ス Sab in 1 型 の cDNAは 、 文献 （ノ モ ト ， ア キォ（Noaoto , A. ) , et aし； プ ロ シ ー デ ィ ン グ · ナ シ 3 ナル ， ア カ デ ミ ッ ク · サ イ エ ン ス · ユー · エ ス · ェ一 （Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA) , 79 , 5793 (1982) )で示される と こ ろの 2373塩基目か ら 3085塩基 目 まで の 713塩基対である。
    [0409] 実施例 2 pYTP 11 の作製
    [0410] ΡΒΒ2ブラ ス ミ ド 15 jtt g を緩衝液 （ lOaM Tr i s - C 3. pH7.5、 7mM MgCil 2 、 7mM β - メ ルカプ ト エ タ ノ ー ル） 20 ϋ 中、 ΡΠ I 20Uと 37°Cで 3 時間反応 した後、 1.2%ァ ガ口一 スゲ ル電気泳動にかけた。 約 800塩基対の DNA 断片を ド レ ッ ツ I ン （Dre tzeu) ら の方法 （ア ナ リ テ ィ カル · バ イ オ ケ ミ ス ト リ 一 （Ana l . B i ochea . ) , 112 , 295 ( 1981 ) ) に従 っ て回収 し た。 こ れを 10aM Tri s-HC il pH 7.5 、 ImM ED TA溶液 20 £ に 溶解 した。 こ の溶液には l it A あた り 0.03 jtt g の DNA が含ま れて い る 。
    [0411] 一方、 PHTP31ブ ラ ス ミ ド を緩街液 （ 10aM Tris-HC Jl pH7.5 、 7aM MgC 12 、 7aM 一 メ ルカ プ ト エ タ ノ ール） 20 it 中 、 Ι^ Ι Ι Οϋ と 37°Cで 2 時間反応 させた。 エ タ ノ 一 ル沈殿後、 沈殿物 を緩衝液 （ 50aM Tr i s-HC il PH9.0、 la MgC JH 2 、 0. InM ZnC S.2 、 IBM ス ペル ミ ジ ン） 20 殳 中、 アル カ リ ホ ス フ ァ タ ーゼ （ゥ シ腸） 1Uと 37°Cで 30分間反応さ せた。 フ ユ ノ ール ¾理後、 エ タ ノ ール沈殿を行っ た。 沈殿物 を 10aM Tris-HC l pH7.5 、 laM EDTA窑液 20 A に溶解 した。 こ の溶液に は、 あた り 、 0.25 g の DNA が含まれてい る。 こ の DNA 1 と前述の DNA 0.3 g と を緩衝液 （88aM Tri s - HCJ2. pH7.8、 6.6aM MgCil 2 、 ΙΟαΝ DTT、 0.4αΜ ATP) 20 u A 中、 T4DNA リ ガーゼ 2.8ϋと 15°Cで 15時間反応させた。 こ の反応液を用いて、 エシュ リ シャ * コ リ HB101 株を形質転 换 し 、 ア ン ピシ リ ン耐性形質転換株の中か ら第 2 図に示 した PYTP11プラ ス ミ ドを単建 した。
    [0412] こ の プ ラ ス： ミ ド に舍まれ る ポ リ オ ウ イ ル ス Sab i n 1 型の cDNAは、 前記文献で示される と こ ろ の 2333塩基目 か ら 3683塩 基目 ま での 1291塩基対である。
    [0413] 実施例 3 PYTPIOO の作製
    [0414] PBB2ブラ ス ミ ド 15 g を 20 /t 1 の反応液 （ 10 aM Tr i s- HCil pH8.0、 7iM MgCi 2 ^ 100aM KaC 、 2aM /3 — メ レカ ブ ト エ タ ノ ール） 中で H I 30Uと 30°Cで 3 時間反応 した 後 、 エ タ ノ ー ル沈殿 した。 こ れ を 20 ^ Α の反応液 （ 10aM Tri s - HCil pH8.0、 7aM MgC Jl 2 、 6O1M NaC S. 、 7aM j6 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ール） に溶解 し、 iHjic II 30Uと 37°Cで 3時間 反応 させた。 エタ ノ ール沈殿後、 T4DNA ボ リ メ ラ ーゼ反応液 20 ϋ に瑢解 し、 T4DNA ボ リ メ ラ ーゼ 2.5Uと 37°Cで 15分間反 応させた。 フ ユ ノ ールで除蛋白 ¾理 した後、 1.2%ァガロー スゲル電気泳動にかけて、 約 1870塩基対の DNA 断片をゲルよ リ 回収 した。 これを 10aM Tris-HC il pH7.5、 laM EDTA瑢液 20 l に溶解 し た。 こ の溶液に は、 1 JI あ た り 0.07 g の DNA が合まれている。
    [0415] こ の DNA 0.5 /i g と 実旌例 1 の PHT311プ ラ ス ミ ドか ら 得た DNA 断片 I jr g と を T4DNA リ ガーゼ反応液 20 JI 中で、 T4DNA リ ガーゼ 2.8ϋと 15°Cで 15時間反応させた。 こ の反応物 でェ シ ェ リ シャ · コ リ HB 101 株を形質転換 し 、 ア ン ビシ リ ン 耐性形質転換株の中から第 2 図に示される よ う な pY TP 100 プ ラ ス ミ ドを単 ϋ した。
    [0416] こ の プ ラ ス ミ ド に合まれる ボ リ オ.ウ ィ ル ス Sab in 1 型の cDN Aは前記文献で示すと こ ろ の 2150塩基目 か ら.3315塩基目 ま での 1888塩基対であ る。
    [0417] 実施例 4 PYTP200 の作製
    [0418] pVS(2) 2503ブ ラ ス ミ ド （ ト ョ ダ ， zヽ リレ 力 （Toyoda, H.)， et al . ； ( ジ ャ ー ナル · ォブ · モルギ ュ ラ ー · バ イ ォ Q ジ一 (J. Μ·ο 1. B i 01. ) , 174 ， 561 ( 1984) ) 15 μ, g を緩街液（8aM Tri s- HC J2. pH7.5、 60M NaCil 、 6BM MgCi2 、 8nii! /6 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ル） 20 A 中、 ί 5 I 3011 と 37°C で 3 睁間 反応 させた。
    [0419] エ タ ノ ー ル沈殿後、 沈殿物を緩衝液（10aM Tri s- HC Jl PH 7.5 、 7mM MgC Jl 2 、 60nM NaCl 、 7mM /S - メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル） 20 it jl 中、 5 ¾Π 30υ と 37°Cで 3 時間反応 させた。 これを 1.2%ァガロー スゲル電気泳動にかけて、 約 1180塩基 対の flNA 断片をゲルよ り 回収 した。 これを T4DNA ボ リ メ ラ ー ゼ反 液 C 67iH Tris-HCil pH8.8、 6.7aM MgCA2、 lOaM β ー メ レ カ プ ト エ タ ノ ー レ、 6.7iM EDTA, 18· 8麓 M (ffH4)2S >4 、
    [0420] 330 it H dCTP、 dATP、 dGTP, dTTP) 20 ϋ 中、 T4DNA ボ リ メ ラ ーゼ 2.5Uと 37°Cで 15分間反応させた。 フ ヱ ノ ー ル処理後、 エ タ ノ ール沈殿を行い、 10aM Tris-HCil pH7.5、 laM EDTA溶 液 20 ^ £ に溶解した。 こ の溶液には、 1 £ あた り 0.05 ;jug の DMA が含まれている。 こ の DNA 0.5 it g と実施例 1 に記載 し た PHT311ブ ラ ス ミ ド ょ リ 得た DNA 断片 1 ft g と を緩衝液
    [0421] C 66iiM Tris-HCil P.H7.6, 6.6oM MgC£ 2 、 lOaM DTT、 laM ATP) 20 it A 中で T4DNA リ ガーザ 2.5Uと 15°Cで 5 時間反応させ た。 こ の反応物でェ シ エ リ シ ャ ， コ リ HB 101株を形質転換 し 、 ア ン ビ シ リ ン耐性形質転換株の中か ら第 3 図に示 した PYTP200 プ ラ ス ミ ドを単雜した。
    [0422] こ の プ ラ ス ミ ド に合 まれ る ポ リ オ ウ イ ル ス Sab in 2 型 の cDNAは、 前記文献で示すと こ ろ の 2288塩基 目 から 3442塩基目 ま での 1157塩基対である β
    [0423] 実旌例 5 ΡΥΤΡ300 の作製
    [0424] PVS(3)2803プ ラ ス ミ ド （ ト ョ ダ ， ハ ル 力 （Toyoda, H. ) , et al . ; ジ ヱ イ · モ ル · ノく ィ オ ル （J. Mo 1. Biol .) , 174 , 581 ( 1984) ) 15 /i g を緩衝液（8aM Tri s-HCA pH7.7、 125aM 80
    [0425] NaCil 、 6mN MgCjl2、 β - メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ル、 0.01
    [0426] % Tri tonX- 100) 20 £ 中、 I 30Uと 37 °Cで 3 時間反応 させた 。 エ タ ノ ー ル沈殿後、 沈穀物を緩衝液 （ 10邐 M Tr i s- HCil pH7.5、 7BM MgG i 2 、 60BM NaCi , 7aM β - メ ルカ プ ト ヱ タ ノ 一ル） 中、 ^ Π 30ϋ と 37°Cで 3 時間反応 させた後、 1.2%ァガロー スゲル電気泳動にかけた。 約 1040 塩基対の DNA 断片をゲルよ り 回収 した。 これを緩衝液 （87aM T r i s - H C il pH8. 8、 6.7aM MgCJl 2 、 10aM /3 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ノレ 、 8.7aM EDTA、 18.8BM (NH4) 2SC>4 、 330 }ί M dCTP、 dATP、 dGTP, dTTP) 中、 T4DNA ボ リ メ ラ ーゼ 2.5Uと 37 °C で 15分間反応させた。 フ ユ ノ ール処理後、 エ タ ノ ール沈殿 を行 、 、 沈殿物を 10aM Tr is-HC il pH7.5, laM SDTA溶液 20 l に溶解 した。 この溶液には あた リ 0.05 iL g の DNA . が合 ま れ て い る 。 こ の DNA 0.5 j^ g と実旄例 1 に記載 した PHT311プ ラ ス ミ ドから得た DNA 断片 l jx g と を緩衝液 （86aM Tri s - HC il pH7.8、 6.6aM MgC 8. 2 、 lOoM DTT、 laM ATP) 20 it ϋ 中、 T4DNA リ ガ一ゼ 2.5ϋ と共に 15°Cで 15時間反応させ た。 こ の反応物を用いてェシ ヱ リ シャ · コ リ HB101 秩を形質 転換 し 、 ア ン ビシ リ ン耐性形質転換株の中か ら第 3 図に示 し た PYTP 300 - 1 プ ラ ス ミ ドを単建 した。
    [0427] 次いで、 PYTP300- 1 プ ラ ス ミ ド を緩衝液（8遍 M Tris- HC 5. ρΗ .3、 150ΒΜ NaC l , 6aM MgC S. 2 、 60Μ 3 — メ レカ プ ト エ タ ノ ー ル） 20 A 中、 Sai l 10Uと 37°Cで 3 時間反応 させた。 ヱタ ノ 一ル沈殿後、 沈殿物を緩衝液（50麕 M CH3C00Na, 200暹 M iiaC£ 、 laM Z11SO4 、 0.5%グリ セ ロ ール） 20 /t £中、 S1ヌ ク レ アーゼ 50(1 と 37でで 30分間反応させた。 フ エ ノ ール 処理後、 エ タ ノ ール沈嚴を行い、 沈黷物を緩衝液（88重 M Tr is - HCi pH7.8、 6.6aM MgCA 2 、 IO1M DTT、 laM ATP)20 ft 9. 中、 T4DNA リ ガーゼ 2.5Uと 15°Cで 15時間反応させた。
    [0428] こ の反応物を用いて、 ヱシ ヱ リ シャ * コ リ HB101 株を形質 転換 し、 ア ン ビシ リ ン耐性形質転換株の中から、 第 3 図に示 し た PYTP300 ブラ ス ミ ドを単戆した。
    [0429] こ の ブ ラ ス ミ ド、 に含まれ る ボ リ オ ウ ィ ル ス Sab in 3 型 の cDN Aは前記文献で示すと ころの 2418塩基目から 3458塩基目 ま での 1041塩基対であ る。
    [0430] 実施侑 6 PYTP102の作製
    [0431] PYTU3 プ ラ ス ミ ド を緩衝液（10aM Tr is- HC il PH 7.5 、 7mM MgC Jl 2 、 150aM NaCil 、 0.2oM EDTA、 7aM β - メ ルカ プ ト エ タ ノ ール） 20 il 中、 I 5U と 37°G で 3時 間反応させた。 エ タ ノ ール沈殿後、 沈嚴物を 10aM Tris-HCil PH 7.5、 laM EDTA溶液 20 /t il に溶解した。 一方、 ポ リ オウ イ ル ス Sab in 1 型 cDNAのうち、 VP1 蛋白質をコ ー ドする DNA領 域を合む PH TP 31 プ ラ ス ミ ド を緩衝液 （ 10 aM Tri s- HCi pH 7.5 、 7mM MgCi 2 、 150a NaCil , 0.2iM EDTA, 7mM /8 — メ ル カ プ ト エ タ ノ ール） 20 ϋ 中、 I 20U と 37 で で 3時間反応させた。 反応後； 1.2%ァ ガ ロ ー ス電気泳勖 を行い、 713塩基対の DNA 断片を憤用の方法で ¾出 した。 ェ タ ノ 一 ル沈殿後、 沈殿物を 10 aM T r i s-HC 9. PH 7.5 、 laM EDTA溶液 20 Jl に瑢解した。 この DNA 断片ほ、 ポ リ オウ ィ ル ス Sab i n 1 型 cD Aの う ち、 文献 （ ノ モ ト ， アキォ（Noaoto , A.)， e t aし；プロシーデイ ング · ナシ ョ ナル ， ア カデ ミ ッ ク • サ イ エ ン ス · ユ ー · エ ス · エ ー （Proc .Nat l . Acad. Sc i . USA , 79 , 5793 (1982) ) で示される と ころ の 2373塩基目から 3085塩基目 までの 713塩基対である。
    [0432] こ の DNA 断片 0.5 と ρΥΤϋ 3 プラ ス ミ ドを Sal I で 切断 した DNA 0.2 ^ g とを緩衝液（88麗 M Tri s— HGA PH7.6, 6.6mM M Cl2, 10aM DTT、 ΙοΜ ATP)20 μ. Jl Φ , T4DNA リ ガ一 ゼ 2.5U と 15°Cで 15時間反応ざせた。
    [0433] こ の反応液 を用い て、 エ シ リ シ ャ · コ リ HB 101.株を 形質転換させ、 ア ンピシ リ ン耐性菌の中から第 4図に示した pYTP 102プ ラ ス ミ ドを単雜 した。 次いで、 慣用の方法に従 い、 ェ シェ リ シャ · コ リ C 600 秩を pYTP 102ブラ ス ミ ドを用 い て 、 形質転換させ、 ェ シ ヱ リ シャ · コ リ C 600/ρΥΤΡ 102を 単戆 した。
    [0434] 実施例 7 PYTP102Kの作製
    [0435] PYTP 102 プ ラ ス ミ ド l it g を緩衝液（10aM Tr i s— HC A pH7.5 、 7BM HgCi 2 、 ？aM β - メ ルカプ ト エタ ノ ール） 20 t il 中、 I 5U と 37°Cで 2睁間反応させた。 エ タ ノ ール 沈殿後、 沈殿物 を緩衝液（87aM Tris - HC Jl PH8.8、 6.7njM MgCil 2 、 ΙΟαΜ β - メ ルカプ ト エ タ ノ ール、 8.7BM EDTA、 16.8ιΜ (ΝΗ4) 2S0 ^ 330 Μ dCTP、 dATP, dGTP, dTTP) 20 ϋ 中、 T4DNAボ リ メ ラ 一ゼ 2.8U と 37 °Cで 15分間反応させた。 フ エ ノ ー ル処理後、 エ タ ノ ール沈殿を行い、 沈殿物 と 、 市販 のユ ニ バ ー サ ル · ト ラ ン ス レ ー シ ョ ン · タ ー ミ ネ 一 タ ー · オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （ ブ ア ルマ シ ア P-Lバ イ オ ケ ミ カ ル販 売） 0.5 g を T4ボ リ ヌ ク レオチ ドキナ一ゼで ¾理 し て 5'末端 を リ ン酸化 し た も の と を緩衝液（86靂 M Tris - HCil PH7.8、 6.6BM MgCil2> lOaM DTT, lnM ATP) 20 μ il 中、 T4DNAリ ガ一 ゼ 2.5ϋ と 15°Cで 15時間反応させた。 こ の反応液を用いて、 ェ シ I リ シャ · コ リ HB 101株を形質転換させ、 ア ン ビシ リ ン 耐性菌の中か ら第 4図に示 した PYTP102Kプ ラ ス ミ ド を単離 し た。 次-いで、 慣用の方法に従い、 エシュ. リ シ ャ * コ リ C800 株を PYTP102Kブラ ス ミ ドを用いて、 形質転換 させ、 ェ シエ リ シ ャ · コ リ C800/PYTP102Kを単蕙した。
    [0436] 実施 8 PYTP102Pの作製
    [0437] pYTPllプ ラ ス ミ ド lO it g を緩衝液（10麗 M Tris- RGSL PH7.5 、 7nM MgCl 2 、 50BM (NH4)2S04 ) 20 l 中、 Pst l 30Uと 37でで 3 時間反応させた。 エ タ ノ ール沈殿後、 沈殿物を緩衝 液（87aM Tris - HC J3. pH8.8、 8.7aM MgCil 2 、 HaM /3 — メ レカ プ ト エ タ ノ ーリレ、 8.7iaM EDTA、 I6.60M (HH4)2S04、 330 Ιί Μ dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTP) 20 l 中、 T4D A** リ メ ラ 一 ゼ 2.8U と 37°Cで 15分間反応させた。 フ ノ ール処理後、 ヱ タ ノ 一 ル沈殿を行い、 沈殿物と市賑のユニバー サル · ト ラ ン ス レ 一 シ ヨ ン · タ ー ミ ネ ー タ一 · オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド （フ ァ ルマ シ ア P-Lバ イ オケ ミ カル販売） 0.5 μ, g を T4ボ リ ヌ ク レ ォチ ドキナーゼで処理して 5'末端を リ ン酸化 したも の とを緩 衝液（88遍 M Tris- HCil PH7.8、 6.6aM MgCA 2 、 I OIBM DTT、 M ATP)20 it £ 中、 T4DNAリ ガ一ゼ 2.5U と 15°C で 15時間反 応させた。 ヱタ ノ 一ル沈殿後、 緩衝液（lOaM Tris- HCil PH 7.5 、 7aM HgCJi 2 、 150oM NaCil、 0.2iM EDTA、 7ιΜ β - メ ル カブ ト エ タ ノ ール） 中、 I 30Uと 37で で 3時 間反 ί£ さ せ た後、 1.2% ァ ガ ロ ー ス ゲ ル電気泳動を行 つ た。 約 1050塩基対の DNA断片を憤用の方法に従っ て回収 し た。
    [0438] 一方、 PYTU3 プ ラ ス ミ ド、 5 ft g を緩衝液（8aM Tri s-HCil pH
    [0439] 7.4 、 6aM MgC Si 2 、 lOOoN NaCJH、 5iM 3 — メ ルカプ ト ェ タ ノ 一 ル） 20 Ji 中、 ilx l 18Uと 37°C で 3時間反応さ せ た。 エ タ ノ ール沈殿後、 沈殿物を緩衝液（10aM Tris - HC1 PH
    [0440] 7.5 、 7nM MgC jl 2 、 150aM NaC il、 0.2aM EDTA, 8αΜ β 一 メ ル カ プ ト エ タ ノ ール） 20 £中、 ^J I 20U と 37°Cで 3時 間反応 させた。 し 2%ァガ π—スゲル電気泳動を行い、 約 4000塩基対の DNA断片を回収した。
    [0441] 前記約 1050塩基対の DNA断片 0.5 g と約 4000塩基対の DNA 断片 1.0 さ とを緩衝液 （SSaJiTris— HC il PH7.8、 6.6 αΝ MgC 1 、 lOaM DTT、 laM ATP) 20 it中、 T A DNAリ ガ一ゼ 2.5ϋと 15°C で 15時間反応させた。 こ の反応液を用いて、 ヱ シ ェ リ シャ · コ リ HB101株を形質転換させ、 ア ン ビ シ リ ン耐 性菌の中から、 第 5 図に示した PYTP102Pプラ ス ミ ドを単肇し た。 次いで、 慣用の方法に従い、 ェシヱ リ シャ · コ リ C800 株を PYTP102Pプラ ス ミ ドを用いて、 形質転換させ、 ェ シ I リ シャ · リ G600/PYTP102Pを単離した。
    [0442] 実施例 9 PYTP201Nの作製
    [0443] ΡΥΤΡ200プ ラ ス ミ ド lO it g を緩衝液（10邐 M Tris— HCil pH 7.5 、 7iM MgCil 2 、 150邏 M NaC l 、 0.2aM EDTA、 7αΜ β 一 メ ル カ プ ト エ タ ノ ール） 中、 I 30Uと 37°Cで 3時 間反応 させた。 1.2%ァガロ ー スゲル電気泳動を行い、 約 1180塩基対の DNA断片を回収した。 .
    [0444] 一方、 PYTU3 プ ラ ス ミ ド 5 t g を緩衝液（10邐 M Tris- HCil PH7.5 、 7aM MgC Ji 2 、 150iM NaCil 、 0.2aM EDTA、 7oM β 一 メ ル カ プ ト エ タ ノ ール） 20 jit A 中、 ^J I 20Uと 37°Cで 3 時間反応させた。 1.2%ァガロー スゲル電気泳動を行い、 約 4500塩基対の DNA断片を回収した。
    [0445] 前記約 1180塩基対の DNA断片 0.5 g と約 4500塩基対の DNA 断片 l . O ^ g とを緩衝液（88薦 M Tris - HC £ pH7.8、 6.6 iM MgC 1 2 、 10aM DTT、 laM ATP) 20 it il中、 T4DNAリ ガ一ゼ 2 · 5ϋと 15°C で 15時間反応させた。 こ の反応液を用いて、 ェ シ ェ リ シャ * コ リ HB101株を形質転換させ、 ア ン ビ シ リ ン耐 性菌の中か ら、 第 6 図に示した PYTP201 プラ ス ミ ドを単孃し た。
    [0446] PYTP201 プ ラ ス ミ ド 2 ;t g を緩衝液（8薦！！ Tris-HCA PH7.4 、 6αΝ MgC Jl 2 、 50aM NaCA 、 8麗)（ /3 — メ ル カ プ ト エ タ ノ ール） 20 it il 中、 ai I 10Uと 37°Cで 3時間反応 させた。 ェ タ ノ 一 ル沈殿後、 緩衝液（87aM Tris- HC£ pH8.8、 6.7iM MgCil2、 1 Oi S - メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル 、 8.7aM EDTA、 16.6BM ( H4)2S04 、 330 M dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTP) 20 jtt il 中、 T4DNA ボ リ メ ラ ーゼ 2.8ϋ と 37°Cで 15分間反応さ せた。 フ エ ノ ー ル処理後、 エ タ ノ ール沈嚴を行い、 沈殿物と市蕨のュニ ノく一サ レ · ト ラ ン ス レ 一 シ 3 ン · タ 一 ミ ネ 一 タ ー · オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド （ ブ ア ルマシア P-L バ イ オケ ミ カ ル販売）0.5 ;t g を T4ボ リ ヌ ク レオチ ドキナーゼで ¾理 して 5'末端を リ ン酸化 した も の と を緩衝液（68aM Tris- HGil pH7.8、 6.6a MgCil2、 lOo DTT, laM ATP)20 l 中、 T4DNAリ.ガーゼ 2.5U と 15°C で 15時間反応させた。 こ の反応物を用いて、 ェ シ ヱ リ シャ · コ リ HB 101株 を形質転換させ、 ア ン ピ シ リ ン耐性菌の中か ら 、 第 6 図 に示 し た PYTP201Hプラ ス ミ ドを単難 した。 次い で 、 慣用 の 方法 に従い 、 ェ シ ヱ リ シ ャ * コ リ G800 株 を PYTP201Nプ ラ ス ミ ド、を用いて、 形質転換させ、 ェ シ エ リ シャ • コ リ C800/PYTP201Nを単縷した。
    [0447] 実 ¾例 10 PYTP301Kの作製
    [0448] PYTP 300 ブ ラ ス ミ ド を緩衝液（10 aM Tris - HC1 pH 7.5 、 7aM gCi2, 50a (NH4)2S0 ) 20 £ 中、 Pst I 20U と 37でで 3 時間反応させた。 エタ ノ ール沈殿後、 沈穀物を緩 衝液（87邐 Tr is- HG Jl pH8.8、 6.7ιΝ Μ80Α2, ΙΟιΜ /3 ー メ レカ プ ト エ タ ノ ー jレ、 8.7aM EDTA、 16.6αΜ (NH4)2S04、 330 μ. M dCTP、 dATP、 dGTP, dTTP) 20 l 中、 T4DNAボ リ メ ラ 一 ゼ 2.8ϋ と 37で で 15分間反応させた。 フ ノ ー ル処理後、 エ タ ノ ー ル沈殿を行い、 沈殿物を緩街液（10邐 M Tris- HC JI pH8.0 、 7aM MgCA 2 、 lOOoM NaCA , 2aN /3 - メ ルカプ ト エ タ ノ ール） 20 中、 i 3 H I 30Uと 30°Cで 3 時間反応さ せた。 1.2%ァガロ ー スゲル電気泳動を行い、 約 1500塩基対 の DNA断片を 回収 した。
    [0449] 一方、 pYTU3 ブラ ス ミ ド 5 ;t g を緩街液（10aM Tris- HC 1 pH7.5 、 7o MgC £ 2 、 150BM NaG£ 、 0.2aM EDTA、 7aM β 一 メ ル カ プ ト エ タ ノ ール） 20 u £ 中、 20Uと 37°Cで 3 時間反応させた。 エ タ ノ ール沈殿後、 沈殿物を緩衝液（50層)！ CH3C00Na, 200aM NaC 1 , laM ZnS04 , 0.5%グ リ セ ロ ー レ） 100 /t il 中 、 S1ヌ ク レ ア 一ゼ 10Uと 37°Cで 15分間反応 させ た。 フ エ ノ ー ル処理後、 エタ ノ ール沈殿を行い、 沈殿物を緩 衝液（10BM Tris- HC pH8.0、 7a MgC£2、 lOOoM NaG£ 、 2oM /3 — メ ルカプ ト エ タ ノ ール） 20 μ^ Α 中、 H I 30ϋ と 30°Gで 3 時間反応させた。 1.2%ァガ口 一 ス ゲル電気泳動を 行い、 約 3800塩基対の DNA断片を回収 した。
    [0450] 前記約 1500塩基対の DNA断片 0.5 t g と 約 3800塩基対の DNA 断片 l.O ii g と を緩衝液 （88aM Tris-HC 1 PH7.6, 6.6 BM MgC Jl 2 lOaM DTT、 laM ATP) 20 A 中、 T4DNAリ ガーゼ 2.5Uと 15°C で 15時間反応させた。 反応物を用いて、 ェ シユ リ シ ャ · コ リ HB101株を形質転換させ、 ア ン ビ シ リ ン耐性菌の 中か ら 、 第 7 図に示した pYTP301 プラ ス ミ ド を単憝 した。
    [0451] PYTP301 ブ ラ ス ミ ド 2 ^ g を緩街液（10層)！ Tris- HC£ pH 7.5 、 7πΜ M CJi2 7aM /S — メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ル） 20 ^ £ 中、 l2 I 5ϋ と 37°Cで 3時間反応させた。 エ タ ノ ール沈殿 後、 沈殿物を緩衝液（87iM Tris- HCA pH8.8、 6.7aM MgCA2, lOaM β - メ ル カ ブ ト エ タ ノ 一 ル 、 8.7aM EDTA. 16.6BM (NH4)2S04 、 330 }L M dCTP、 dATP、 dGTP, dTTP) 20 il 中、 T4DNA ボ リ メ ラ 一ゼ 2.8ϋ と 37°Cで 15分間反応させた。 フ エ ノ ー ル処理後、 エ タ ノ ール沈殿を行い、 殿物と 、 市販のュ 二バー サル * ト ラ ン ス レ ー シ ョ ン * タ 一 ミ ネ 一 タ ー · ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （ フ ア ルマ シ ア P-L バ イ オ ケ ミ カ ル販売） 0.5 L g を T4ボ リ ヌ ク レ オチ ドギナーゼで処理 し て 5'末端を リ ン 酸化 し た も の と を緩衝液 （ 88aM Tri s-HC il pH7.8、 6.6BN MgC il 2 、 lOaMDTT 、 loM ATP ) 20 A 中、 T4DNAリ ガ一ゼ 2.5Uと 15°C で 15時間反応させた。 こ の反応物を用いて、 ェ シ ヱ リ シャ · コ リ HB101 秩を形質耘換させ、 ア ン ビ シ リ ン酣 性菌の中か ら、 第 7 図に示 した PYTP301Kプ ラ ス ミ ド を単繽し た。 次いで、 慣用の方法に従い、 ェシヱ リ シ ャ · コ リ C800 秩を PYTP301I (プラ ス ミ ドを用いて、 形質転換させ、 ェ シエ リ シ ャ · コ リ C800/PYTP301Kを単藩した。 実施例 11 VP1 融合蛋白質の製造
    [0452] PHTP31プラ ス ミ ドを保持する ェシ Λ リ シ ャ · コ リ C800秩を
    [0453] L培地 （ ア ン ビ シ リ ン濃度 25 g /a£ ) 5a Jl の入った試験 管中、 28で で 1夜捩盪培養させた。 培養液の OD850 が 0.8に な っ た時点で、 直ち に 42での恒溘槽に移 し、 振盪培養させ た。 その後、 エツペ ン ドル フチューブに培養液 1，ϋ を移し、 遠心分維 した。 上清を除き 、 沈穀菌体に 1·ϋ の 10邐)！ Tris- HC £ pH 7.5 、 laM DTT 、 23 M ノヽ *ラ メ チル スルホ ン酸フ ッ 化物 （以下 r PMSFj という） 溶液を加え、 氷上で超音波処理 に よ り 菌体を破碎した。 破砕液を分離し、 上清を除いた後、 尿素溶液 20 il を加え、 よ く攪拌した。 30分間氷浴上で静 置し、 遠心分難した。
    [0454] 上清に等量の電気泳動用サ ン プルバ ッ フ ァ ー （最終的に 10 mM Tr i s-HCil pH8.0, loH EDTA、 10%シ 3糖、 40aM DTT、 1 % SDS)を加え、 SDS-ボリ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （以下
    [0455] Γ SDS-PAGEJ とい う） にかけた。 PHTP31プラ ス ミ ドを保持し ないェ シ ヱ リ シ ャ · コ リ C600株について も 、 同様の操作を 行 っ た。 次い で、 ク マ シ 一ブル一染色及び酵素抗体染色を 行つ た と こ ろ、 0800ノ？11で？31秩にっぃて分子量約 29，000ダル ト ン の VP 1 融合蛋白質と考えられるバ ン ド が検出 された。 プ ラ ス ミ ド を も たない C800株では、 こ のバ ン ドは検出されな かっ た。 また、 酵素杭体染色を行い、 こ の蛋白質が、 Sabin
    [0456] 1 型ゥ ィ ル ス に対する抗体と反応する こ と を確認 した。 デ ンシ ト メ 一ターによ り 、 VP 1 融合蛋白質の舍有量を酒定 した と ころ、 24.8%であ った。 これを、 培養液 1J あたり の 発現量に换箕する と 13.4agになる。
    [0457] 実施^ 12 VP1 融合蛋白質の製造
    [0458] 実旌^ 11と同じ条件下で培養した形質転換株エ シ リ シャ • コ リ C800Z PHTP31の培養液 lnil を遠心分離後、 塩化 リ ゾ チー ム （卵白） 及び Triton X100 で処理し （ 日 *生化学会編 Γ生化学実験講座第 5巻 酵素研究法 （上） 」 東京化学同 人） 、 菌体を破碎した。 遠心分離後の沈殿物に 尿素溶液を 加え、 よ く 攪拌した後、 30分問永浴上で静置 し、 遠心分肇し た。 上清に等量の電気泳動用サ ン プルバ ッ フ ァ 一を加え、 SDS-PAGEにかけた。 次いで、 酵素抗侓染色を行っ た。
    [0459] デ ンシ ト メ 一タ ーによ り 、 VP 1 融合蛋白質の含有量を酒定 した と ころ、 14.5%であった。 これを、 培養液 lil あたり の 発現量に換算する と 10.2agになる。
    [0460] 実施例 13 VP 1 融合蛋白質の製造
    [0461] pYTPllプ ラ ス ミ ド又は ρΥΤΡΙΟΟ プラ ス ミ ド をそれぞれ保持 する形質転換株エ シ リ シャ * コ リ C800株について、 実施例 11と同様の方法で、 超音波処理後の沈殿物から 8M尿素溶液に よ り VP1 融合蛋白質を抽出 し、 SDS-PAGEを行った。
    [0462] CSOOZpYTPllでは、 分子量約 48, 000を最長と し てい く つか の蛋白質が検出された。 また、 G800ZPYTP100 では、 分子量 約 63，000を最長 と し てい く つかの蛋白質が検出された。 更 に 、 酵素抗体染色を行い、 これ らの蛋白質が Sabin l 型ウ イ ル ス に対する抗体と反応するこ とを確認した。
    [0463] デ ン シ ト メ 一ター によ り 、 VP1 融合蛋白質の含有量を a定 した と こ ろ、 それぞれ 28.9%及ぴ 15.5%であ った。 これを、 培養液 1 ϋ あたり の発現量に换箕する と、 それぞれ 22.8薦 g及 び 12. lagに なる。
    [0464] 実施例 14 VP1 融合蛋白質の製造
    [0465] PYTP200プラ ス ミ ド、又は PYTP300ブラ ス ミ ドをそれぞれ保 持する形質転換株ヱシェ リ シャ · コ リ C800株について、 実旌 例 11と 同様の方法で、 超音波 ¾理後の沈駸物から 尿素溶液 によ り VP1 融合蛋白質を ¾出 し、 SDS-PAGEを行った。
    [0466] C600 / PYTP200 では、 分子量約 52 , 000の蛋白質が検出され た。 また、 C800ZPYTP300 では、 分子量約 40， 000を最長と し てい く つかの蛋白質が検出された。 更に、 酵素抗体染色を行 い 、 こ れ ら の蛋白質が抗体と反応する こ と を確認 した。
    [0467] デ ン シ ト メ 一タ一に よ り 、 VP 1 融合蛋白質の含有畺を澜定 した と ころ、 それぞれ 14.9%及び 5.0 %であ った。 これを、 培養液 1 あた り の発現量に換箕する とそれぞれ 11.7ag及び 3.9ag に な る 。
    [0468] 実旛^ 15 VP1 融合蛋白質の製造
    [0469] PHTP31プラ ス ミ ドを保持する形質転換株ェ シ ェ リ シ ャ · コ リ C800株を 、 L培地 （ア ン ビ シ リ ン濃度 25 it g /ail ) l Jl の 入っ た 2 £ 培養フ ラ ス コ中、 30°Cで捩通培養 し、 培養液の OD650 が 0.8 になった時点で、 直ちに °Cの恒溘槽に移し、 3時間振通培養をつづけた。 所定時間後、 遠心分離によ り 、 菌体を収集 し 、 lOaM Tr i s-HC SL pH7.5、 laM DTT 、 23 PMSF溶液 100a A を加え、 超音波 ¾理によ り 、 菌体を破碎 し た。
    [0470] 遠心分 後、 沈殿物に 8M尿素溶液 10»Α を加え、 よ く撹拌 し、 30分間氷浴上で静置した。 更に、 遠心後、 上清溶液を 50 倍量の 10靂 M Tris-HC pH7.5 、 ΙαΜ EDTA、 ΙαΝ DTT 溶液で 4 回透析を繰 り 返し、 SDS-PAGEを行った。
    [0471] デ ンシ ト メ 一ターによ り 、 VP 1 融合蛋白質の含有量を a定 した と ころ、 28.1%であった。 これを、 培養液 ΙΑ あた り の 発現量に換算する と 2し 6透 gになる。
    [0472] 実旌例 18 PSL PKI の作製
    [0473] PBB2ブ ラ ス ミ ド を 120 μ« £ の反応液 （ 10 aM Tri s- HCA pH8.0、 7aM MgC Ji 2 ^ 0.1M NaC Jl 、 2αΜ β - メ ルカ ブ ト ヱ タ ノ ー ル） 中、 j H I 100ϋと 30°Cで 5 時間反応させ た。 反応液を分離用 0.7%ァガロ ー スゲル電気泳勖にかけ、 慣用手段に従って 2500塩基対の DNA 新片を抽出 し、 水 20 £ に溶解 した。 こ の溶液 18 £ に 、 緩衝液（100邐) i Tris-HC£ pH8 - 4 、 1M NaCil、 60aM MgCil 2 、 60αΜ β ， メ ル カ ブ ト ェ タ ノ 一 ル） 5 ^ £ 、 水 27 it £及び I 2 iL ϋ (20U) を加え、 85¾で 3.5時間反応させた。 反応液を分離用 0.7%ァガロー スゲル電気泳動にかけ、 約 700塩基対の DNA 断片を抽出 し、 水 8 il に溶解 した。
    [0474] pSLMKlプ ラ ス ミ ド 5.5 ^ g を 100 ^ £ の反応液（8BM Tris- HC 3. pH7.9、 150oM NaCA , 6BM MgCil 2 、 6mM β - メ ルカ ブ ト エ タ ノ ー ル） 中、 20Uと 37°C で 3 時間反応 させ た後、 反応液 を分難用 0.7%ァガ ロ ー ス ゲル電気泳勖にか け、 3200塩基対.の0 断片を油出 し、 水 に溶解 した。 こ の溶液 に、 緩衝液（500扇 M Tris-HCil pH7.2、 lOOaM
    [0475] MgCA 2 、 laM DTT) 2.5 A 、 2iM dNTP 1 /t il 、 水 10.5 ϋ 及び DMA ボ リ メ ラ 一ゼ I ク レ ノ ウ断片 1 ^ il (5.2U)を加え、 22°C で 30分間反応させた。 反応液を 70°Cで 5 分間加熱処理 し た。 放冷後、 こ の溶液を 25 JI に、 5'末端が リ ン酸化された
    [0476] Cla I リ ン カ 一 [d(CATCGATG)] 10 ^ 1 ( 0.005 OD)、 緩衝液' (860mM Tr is-HCil PH7.8 、 660M MgC J 2 、 50π DTT, lOmH ATP) i f Ji 及ぴ T4DNAリ ガ一ゼ 1 il (2.8ϋ)を加え、 22°Cで 6 時間反応 させた。 反応後、 フ エ ノ ール抽出、 エ タ ノ ール沈 殿を行 っ た後、 沈殿物を水 30 ^ il に溶解 した。 こ の溶液に、 緩衝液 ( 60mM Tris-HCl pH7.9 、 60QH HgG3.2^ 500nM NaC 1 ) lO ^t il 及び 5J I 4 μ. (20U) を加えて、 37°C で 4 時間反応 さ せた 。 反応後、 0.25M EDTA 4 A を加えて反応を停止 さ せ 、 フ ヱ ノ ー ル抽出及びエ タ ノ ー ル沈殿を行っ た後、 分離 用 0.7%ァガ ロー スゲル電気 ¾動にかけ、 2500塩基対の1^ 断 片 を 油 出 し水 20 it Ji に 溶解 し た。 こ の DN A 断片溶液 18 に 、 緩衝液（500道 Ji Tris-HCl pH9.0 、 10πΜ MgC 2^ loH 4
    [0477] ZnCJl2、 ΙΟα スペル ミ ジ ン） 5 μ« Α及びアル 力 リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ （ゥ シ腸） 1Uを加え、 37°Cで 30分間反応させた。 反応後、 反応液に 0.25M EDTA 1 ^ £ を加えて反応を停止させた後、 フ エ ノ ール抽出及びエ タ ノ ール沈殿を行った後、 沈殿物を TE 緩衝液（PH8.0)2 /t A に溶解した。 こ の溶液 に、 前述し た pBB2プ ラ ス ミ ドか ら得られた 1^ 1 断片 4 it A 、 緩衝液 ( 660BM Tris-HCil pH7.6 、 88遺 M MgCJl2、 50邐 M DTT、 10邐)！ ATP) 1 μ. 1 , 水 2 ^ Jl及び T4DNAリ ガーゼ 1 ^ A (2.8U)を加え、 12°Cでー晚反応させた。 反応後、 こ の溶液を用いてェシエ リ シ ャ · コ リ RB1 株を形質転換し、 ア ンビシ リ ン耐性を指標に してコ ロ ニ ーをス ク リ ーニングし、 慣用手段に従い第 8図に 示される よ う な PSLMPKI プラ ス ミ ドを単建 した。
    [0478] 実施例 17 VP1 融合蛋白質の製造
    [0479] PSLMPK1 プ ラ ス ミ ドを保持するェシ ェ リ シ ャ · コ リ C800株 を 、 L培地 （ア ン ピ シ リ ン濃度 25 ^ g/m i ) Sail の入っ た 試験管中、 37°Cで振盪培養し、 培養液の OD850 が 0.8になつ た時点で、 直 ち に ヱ ッ ペン ド ル フ チュー ブに培養液 1重 A を 移 し、 遠心分蕙 した。 以下、 実 ¾例 11と同様の操作を行つ た。
    [0480] SDS-PAGEに よ り 、 分子量約 80， 000ダル ト ン の VP1 融合蛋白 質と考えられるバ ン ドが検出された。 また、 酵素抗体染色に よ り 、 該蛋白質と Sab in 1型ウ ィ ル スに対する抗体とが反応 する こ とが確認された。 次いで、 デンシ ト メ一ターによ り 、 VP1 融合蛋白質の舍有 量を ¾定 した と ころ、 24.1%であった。 これを、 培養液 lil あた り の発現量に换箕する と 18.8薦 gになる。
    [0481] 実旄例 18 VP1 非融合蛋白質の製造
    [0482] pYTP 102P プラ ス ミ ドを保持する ェシ ヱ リ シ ャ · コ リ C800 株を L培地 （ア ン ビシ リ ン潼度 25 ^ g /iA ) laA の入つた試 験管中、 28°Cで一夜捩通培養させた。 培養液の OD850 が 0.8 にな っ た時点で、 直ちに 42°Cの恒瘙槽に移 し、 3 睁閭擴盪培 養させた。 遠心分離後、 上清を除き、 沈殿菌体に 100震 A の 10 oM Tri s-HC <l pH7.5、 loM EDTA溶液を加え、 2 °Cで超音波； ¾ 理に よ り 菌体を破碎 した。 破砕液を分 し、 上清を除いた 後、 6M尿素溶液 10 ail を加え、 よ く 攪拌 じた。 30分間氷浴 上で静置 し、 遠心分離した。 更に上清溶液を 100倍量の 10鵬 M Tr is-HCil pH7.5、 laHDTA溶液で 3回透析 した。
    [0483] 上清の一部に等量の電気 ¾動用サ ン プルバ ッ フ ァ 一 （最終 的に 10aM Tr i s-HCil pH8.0、 IB EDTA, 10%シ 3耱、 40aM DTT 、 % SDS)を加え、 SDS-ボリ ア ク リ ルア ミ ドゲ ル電気泳 動にかけた。 次いで、 ク マシ一ブル一染色を行っ た と ころ、 分子量約 39，000ダル ト ンの VP1 蛋白質と考え られるバ ン ドが 検出 された。
    [0484] デ ン シ ト メ — タ —によ リ 、 VP1 非融合蛋白質の含有量を ¾ 定 した と こ ろ、 20.3%であった。 これを、 培養液 あたり の発現量に换箕する と 3.8ag になる。 なお、 薛素抗体染色に ょ リ 、 こ の蛋白質が Sabin 1型ウ ィ ルスに対する抗体と反応 する こ と を確認した。
    [0485] ェ シ エ リ シ ャ · コ リ C600/PYTP102K, 0600/ pYTP201N, C600/PYTP301K についても同様の操作を行い、 それぞれ、 分 子畺 25 , 500， 23 , 000 , 25 , 500の VP1 非融合蛋白質が得 られ た。 これ ら は、 酵素抗体染色にょ リ 、 それぞれ Sabin l 型 ウ ィ ル ス、 Sab in 2型ウ ィ ルス、 Sab in 3型ウ ィ ル ス に対す る抗体と反応するこ とが確認された。 超音波逃理後の沈殿物 を 8M尿素溶液で抽出 した溶液中の VP1 蛋白質の含有量と培養 液 1 il あた り の発現量とを以下の表に示す。
    [0486]
    [0487] [産業上の利用可能性]
    [0488] 末発明に よれば、 ポ リ オウ イ ルスギヤ プシ ド蛋白 VP1 の抗 原決定部位を有する蛋白質を融合蛋白質と して又は非融合の 形で大量に供給する こ とができる。 こ う して得られる活性蛋 白質は、 ポ リ オウ イ ルス抗体の検出試薬と して、 例えばラジ オイ ム ノ ア ッ セ ィ用に用いるこ とができる。 また、 喃乳類勖 物に非経 口 的に投与する こ と によ リ ボ リ ォ ゥ ィ ル ス ギヤ プシ ド V P 1 蛋白質に対する抗体を産生させる こ と がで き る のでボ リ オ ウ ィ ル ス ワ ク チ ン用に有用である。 また、 生 ワ ク チ ン投 与のための予備免疫に用いて生ヮ ク チンの副作用を減少させ る こ と ができ る。
    [0489] 書式 2 寄託受託拒否通知
    [0490] 通知番号 60微寄文 第 270 号 通知年月日 昭和 60年 3 月 9 日 財団法人 相模中规学研 9»
    [0491] 代表者 & 他 5名
    [0492] 内訳別紙のとおり
    [0493] ノ , -■一-' I 工業技術院微生物工業技術研究!^ . :; JI
    [0494] 大 山 次 貴 より申請のあった寄託の微生物については， 下記の理由により受託できませんの で， その旨通知します。'
    [0495] 1. 申請書年月日 昭和 6' 0 年 2 月 27 B
    [0496] 2. 微生物の ϋ別のための表示 ェシェリシャ*コリ （Escherichia coli)〇60〇Zp YTP102K
    [0497] 3. 受託拒否理由 受託できる微生物の範囲外であるため 財団法人 相模中 ^(ヒ学研究所 代表者 聖
    [0498] セン卜ラル硝子铢式会社 取締役社長 伊藤三良
    [0499] 谷化学工業珠式会社 取締役^ 藤岡賢一
    [0500] 日本曹^^会社
    [0501] 取締役社長 三宮武夫 日産化学工業珠式会社 取纖社長 草野操
    [0502] 東洋曹達工業珠式会社 取締役 ¾:長 山ロ敏明
    [0503] 書式 2 寄託受託拒否通知
    [0504] 通知番号： 60微寄文 第 271 号 逼知年月日 ： 昭和 60年 3 月 9 日 財団法人 相模中央化学研究所
    [0505] 代表者 mm 他 5名
    [0506] 内訳別紙のとおり
    [0507] 貴殿より申請のあった寄託の微生物については， 下記の理由により 託できませんの で， その旨通知します。 '
    [0508] E
    [0509] 1. 申請書年月日 昭和 Q 0 年 2 月 27 日
    [0510] 2. 微生物の識別のための表示 ェシエリシャ？コリ （Escherichia coli) C600/P YTP102P
    [0511] 3. 受託拒否理由 受託できる微生物の範囲外であるため 別 羝 財団法人 相模中央化学研 所
    [0512] 代表者 聖
    [0513] セン卜ラル硝子 会社
    [0514] 取廳土長 伊蘆三良 .
    [0515] 谷化学工業 会社
    [0516] 取締役ネ ±M 藤岡賢一 取繊ネ土長 三宫武夫
    [0517] 日産化学ェ 式会社
    [0518] 取締役社長 草野搡
    [0519] エ^ s、会社
    [0520] 取締役 長 山ロ敏明
    [0521] 書式 2 寄託受託拒否通知
    [0522] 通知番号： 60微寄文 第 272 号 通知年月日 ： 昭和 60年 3 月 9 日 財団法人 相模中央化学研究所
    [0523] 代表者 ism 他 5名 E
    [0524] 内訳別紙のとおり
    [0525]
    [0526] 貴愛より申請のあつ 寄託の微生物については， 下記の理由により受託できませんの で， その旨通知します c
    [0527] 1. 申請書年月日 昭和 60 年 2 月 2 7 曰
    [0528] 2. 微生物の識別のための表示 ェシェリシャ*コリ （Escherichia co!i) C600 P YTP201
    [0529] 3. 受託拒否理由 受託できる微生物の範囲外であるため 別 紙 財団法人 相模中央化学研究所
    [0530] 代表者 ΈΜ 聖
    [0531] セン卜ラル硝子株式会社
    [0532] 取締撒長 伊藤 Ξ良
    [0533] 谷化学工^^式会 ¾:
    [0534] 取締役 藤岡賢一
    [0535] 日本曹，! ^会 ¾
    [0536] m 三≤武夫
    [0537] 曰産化学工^ ^会社
    [0538] 取締役ネ is
    [0539] 杲 f羊曹遅工^ ^式会社
    [0540] 取締役 長 山ロ敏明
    [0541] 書式 2 寄託受託拒否通知
    [0542] 通知番号： 60微寄文 第 273 号 通知年月 B ： 昭和 60年 3 月 9 曰 財団法人 相模中央化学研究所
    [0543] 代表者 jsmm 他 5名
    [0544] 内訳別組のとおり
    [0545] 貴殿より申請のあった寄託の微生物については， 下記の理由により受託できませんの で， その旨逼知します。 ·
    [0546] E
    [0547] 1. 申請書年月日 昭和 60 年 2 月 27 a
    [0548] 2. 微生物の識別のための表示 ェシエリシャ♦コリ （Escherichia cofi.) C600/D YTP301 K
    [0549] 3. 受託拒否理由 受託できる微生物の範囲外であるため 別 紙 財団法人 相模中央化学層 J
    [0550] 代表者 ΈΜ 聖
    [0551] セン卜ラル硝子棕式会社
    [0552] 取締役ネ土長 伊 Ξ良
    [0553] 谷化学工業珠式会
    [0554] 取締役 ¾^ 蘆岡賢一
    [0555] 曰 曹 OT、会社
    [0556] 取締役ネ土長 三言^
    [0557] 日産化学工^ S会社
    [0558] 取締役 長 草野搡 取締役 ¾M 山口敏^
    权利要求:
    Claims求 の
    1. 高発現プロ モータ 一 ， オペ レータ 一 と 、 そ の支 ¾を受 ける 下流領域に位置する メ タ ピロ カテカーゼ遣伝子の SDS列 を含む メ タ ピ α カテカーゼ遺伝子のァ ミ ノ 基末端部分をコー ドす る DNA 領域と、 それに続 く ポ リ オウ イ ル ス弱毒株 Sab in
    省
    1 型、 Sab in 2型又は Sab i n 3型のギ ヤ プシ ド蛋白 VP 1 の少 な く と も ァ ミ ノ 酸番号 32〜 105 に相当する ぺ プチ ド を コ一 ド する DNA部分 と を含むこ と を特徵とする環状二重鎖 DNA 。
    2. 高発現プロモー タ一 · オペ レ ー タ ー の 5'側上流に逆向 き に位置 し 、 そ の活性をネ ガテ ィ ブに制御す る瘟度感受性遺 伝子部分を含む請求の範囲第 1 項記載の環状二重鎖 DNA 。
    3. 温度感 受性遣伝子部分の下流にア ン ピ シ リ ン耐性を コ — ド す る 部分 を含む請求の範囲第 2 項記載の瑷状二重鎖 DNA o
    4. 高発現プ ロ モー タ 一 · オペ レー タ ーが PLプ ロ モー タ 一 • オ ペ レ ー タ 一 、 ]_ UV5 プ ロ モー タ ー ， オペ レ ー タ 一 、 t r プ ロ モ ー タ ー · ォペ レ 一 タ ー又は 1^2 プ ロ モ ー タ ー · オ ペ レ ー タ 一 で あ る 請求の 範囲第 1 項記載の環状二重鎖 DNA β
    5. 高発現プロモー タ一 · オペ レー タ 一が PLプ α モー タ 一 • オ ペ レ ー タ 一 で あ る請求の範囲第 2 項記載の環状二重鎖 DNA .
    6. 高発現プ ロ モー タ ー · オペ レー タ ー と 、 そ の支配を受 ける下流領域に位置する SD配列と、 翻訳開始コ ド シ と 、 これ に読取枠の一致する よ うに直接接続された、 ポ リ オ ウ イ ル ス 弱毒株 Sabin l 型、 Sabin2型又は Sab i n 3 型のギ ヤ プシ ド 蛋白 VP1 の少な く と もア ミ ノ酸番号 32〜 105 に相当するべプ チ ドを コ一 ドする DNA 部分と、 それに続 く 翻訳終結コ ド ン と を含む こ と を特徵とする環状二重鎖 DNA 。
    7. SDK列がメ タ ビロカテカ一ゼ遺伝子の SD配列である請 求の範囲第 6 項記載の環状二重鎖 DNA 。
    8. 高発現プロモータ一 · オペ レータ一が PLプロ モータ一 • オペ レー タ ーであ り 、 その 5'側上流に、 その活性を制街す る温度感受性遺伝子部分を含むプラ ス ミ ドである請求の範囲 第 6項又は第 7項記載め環状二重鎖 DNA 。
    9. 高発現プロモータ一 · オペ レータ一 と 、 そ の支配を受 ける下流領域に位置する SDK列と、 翻訳開始コ ド ン と 、 これ に読取枠の一致する よ うに直接接続された、 ポ リ オ ウ イ ル ス 弱毒株 Sabin l 型、 Sab in 2型又は Sab i n 3 型のギ ヤ プシ ド 蛋白 VP1 の少な く と もア ミ ノ酸番号 92〜 105 に相当するぺプ チ ドを コー ドする DNA 部分と、 それに続 く 翻訳終結コ ド ン と を含む こ と を特徴とする環状二重鎖 DNA の製造法において、 高発現プロ モータ一 · オペ レータ一 と、 そ の支配を受ける下 流領域に位置する SDK列と、 翻訳開始コ ド ン と を含む DNA の 該翻訳開始コ ド ンの後ろの適当な制限酵素切断部位を該制限 酵素で切新処理 し 、 その後、 必要に応 じて平滑末端化 ¾理 し、 該翻訳開始コ ド ンの後ろにポ リ オ ウ イ ル ス弱毒株 Sabin 1 型、 Sab in 2型又は Sab i n 3型のギ ヤ ブシ ド蛋白 VP 1 の少 な く と も ア ミ ノ酸番号 32〜 105 に相当するペ プチ ドをコー ド する DNA 断片を挿入するこ とを特徵とする製造法。
    10. SDK列がメ タ ビロカテカ一ゼ遺伝子の SD配列である請 求の範囲第 9 項記載の製造法。
    11. 高癸現プロモータ一 · オペ レータ一 と 、 その支配を受 ける下流領域に位置する SD配列と、 翻訳開始コ ド ン と、 これ に読取枠の一致するよ うに直接接続された、 ポ リ オ ウ イ ルス 弱毒株 Sab in 1 型、 Sab in 2型又は Sab ί n 3型のキ ヤ プシ ド 蛋白 VP1 の少な く と もア ミソ酸番号 32〜 105 に相当するぺブ チ ドをコ一 ドする DNA 部分と、 それに続 く 翻訳終結コ ド ン と を舍む こ と を特徴とする環状二重鎖 DNA の製造法において、 ボ リ ォゥ ィ ル ス弱毒株 Sab in 1型、 Sab in 2型又は Sab in 3 型のギ ヤ プシ ド蛋白 VP 1 の少な く と もア ミ ノ 酸番号 92〜 105 に相当するペプチ ドをコー ドする DNA 断片の適当な制限酵素 切断部位に、 三つの フ レー ム に翻訳終結コ ド ンが配置される よ う に設計 されたオ リ'ゴヌ ク レ オチ ドを挿入する こ と に よ リ 、 カルボ ギ シル基末端に翻訳終結コ ド ンを付与 し、 これ を、 高発現プロモータ一 · オペ レータ一と 、 その支 Sを受け る下流領域に位置する SD¾列 と、 翻訳開始コ ド ン と を含む DNA の該翻訳開始コ ド ンの後ろの適当な制限酵素切断部位を 該制限酵素で切断処理し、 その後、 必要に応 じて平滑末端化 処理 し て得た DNA断片の該翻訳開始コ ド ン の後ろ に挿入する こ と を特徴 と する製造法。
    12. SD配列がメ タ ビ α カテ力一ゼ遺伝子の SDS列である請 求の範囲第 11項記載の製造法。
    13. PLプ ロ モータ ー ， オペ レータ 一 と 、 そ の支配を受ける 下流領域に位置する メ タ ピロ カテ力一ゼ遺伝子の SD配列を合 む メ タ ビロ カテカ一ゼ遺伝子のァ ミ ノ 基末端部分を コー ドす る DNA 領域 と 、 それに続 く ポ リ オ ウ イ ル ス弱毒株 Sabin l 型、 Sabin 2 型又は Sabin3 型の ギ ヤ プシ ド蛋白 VP1 の少 な く と も ア ミ ノ 酸番号 32〜 105 に相当するペ プチ ドを コー ド す る DN A部分 と を含む瓖状二重鎖 DN A を、 プラ ス ミ ド と し て合む こ と を 特徵 と する ェ シ ヱ リ シ ャ (Escherichia) 属細 菌。
    14. 高発現プロモー タ一 · ォペ レ 一タ ー と 、 そ の支配を受 け る下流領域に位置する SD配列と、 翻訳開始コ ド ン と 、 これ に読取枠の一致する よ ラ に直接接続された、 ボ リ ォ ゥ ィ ル ス 弱毒秩 Sabin l 型、 Sab in 2型又は Sab i n 3 型の ギ ヤ プシ ド 蛋白 VP'l の少な く と もア ミ ノ 酸番号 32〜 105 に相当するべブ チ ド を コ ー ドする DNA 部分と、 それに続 く 翻訳終結コ ド ン と を合む環状二重鎖 DNA を保持する こ と を特徵 と する ェシエ リ シ ャ （ Escher icbi a ) 属細菌。
    '15. SDK列がメ タ ビロ カテカ一ゼ遺伝子の SD配列であ る請 求の範囲第 U項記載の細菌。
    16. 高癸現 プロ モー タ一 · オペ レ ー タ 一 が PLプ ロ モー タ ー • オペ レー タ 一であ リ 、 その 5'側上流に、 その活性を制御す る温度感受性遺伝子部分を舍む環状二重鎖 DNA を保持する請 求の範囲第 U項又は第 15項記載の細菌。
    17. 高発現プロモータ一 · オペ レーター と 、 その支配を受 ける下流領域に位置する メ タ ビロカテカーゼ遺伝子の SDK ¾ を合む メ タ ビロカテカーゼ遺伝子のァ ミ ノ 基末端部分をコ一 ドする DNA 領域と、 それに続く ポリ オウ イ ルス弱毒株 Sab in 1 型、 Sab in 2型又は Sab in 3型のキヤ プシ ド蛋白 VP 1 の少 な く と もア ミ ノ酸番号 32〜 105 に相当するペプチ ドをコー ド する DNA部分 ど、 その上浣に位置する ア ン ビシ リ ン耐性を コ 一 ドする部分を合むプ ラ ス ミ ドで形質転換 したェ シ ェ リ シ ャ (Esher ichia) 属細菌を栄養培地に培養 して、 菌体内に蓄 積 した融合蛋白質を採取する こ とを特镊とするボ リ ォウ ィ ル スギ ヤ プシ ド蛋白 VP 1 の抗原決定部位を有する蛋白質の製造 法。
    18 . 高発現プロモータ一 * ォペ レ一ターが PLプ ロ モーター • オ ペ レ ー タ 一 、 lac UV5 プ ロ モ ー タ ー ， オペ レ ー タ 一 、 trp プ ロ モ ー タ ー · オペ レ ー タ 一又は プ ロ モ ー タ 一 · ォ ベ レ ー タ 一である請求の範囲第 17項記载の製造法。
    13 . プ ラ ス ミ ドが、 高発現プロ モー タ 一 · オペ レ ー タ ー と ア ン ビ シ リ ン耐性をコ 一 ドする部分の間に該プロ モー ター · オペ レータ —の活性をネガテ ィ ブに制御する温度感受性遺伝 子部分を合む請求の範囲第 Π項記載の製造法。
    20. 高発現プロモータ一 · オペ レータ一が PLプロモータ一 • オペ レー タ 一である請求の範囲第 13項記載の製造法。
    21 . 高発現プロモータ一 · オペ レーター と 、 そ の支配を受 ける下流領域に位置する SD配列と、 翻訳開始コ ド ン と 、 これ に読取枠の一致す る よ う に直接接铳された、 ボ リ ォゥ ィ ル ス弱毒株 Sab in l 型、 Sabin 2型又は Sabin 3 型のキ ヤ ブ シ ド蛋 白 VP 1 の少な く と も ア ミ ノ 酸番号 92〜 105 に相当す る ペ プチ ド を コ ー ドする DNA 部分 と 、 それに続 く 翻訳終結 コ ド ン と を 含 む ブ ラ ス ミ ド、 で形質転換 したェ シ ヱ リ シ ャ
    (Esheric ia) 属細菌を栄養培地に培養して、 菌体内に蓄積 した VP 1 蛋白質を揉取する こ とを特徴とする ポ リ オ'ウ ィ ルス ギ ヤ プ シ ド蛋 白 VP 1 の抗原決定部位を有する蛋白質の製造 法。
    22. SD配列がメ タ ビロカテカ一ゼ遺伝子の SD配列である請 求の範囲第 21項記載の製造法。
    23. 高発現プロモータ一 · オペ レータ一が PLプロ モータ一 • オペ レー ダ一であ リ 、 その 5'側上流に、 その活性を制御す る瘟度感受性遺伝子部分を合む請求の範囲第 21項又は第 22項 記載の製造法。
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    同族专利:
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    AU4866485A|1986-04-08|
    EP0195087A1|1986-09-24|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-03-27| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU BB BG BR DK FI HU KR LK MC MG MW NO RO SD SU US |
    1986-03-27| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CF CG CH CM DE FR GA GB IT LU ML MR NL SE SN TD TG |
    1986-05-16| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1985904851 Country of ref document: EP |
    1986-09-24| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1985904851 Country of ref document: EP |
    1990-09-21| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1985904851 Country of ref document: EP |
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