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    公开号:WO1986001225A1
    申请号:PCT/JP1985/000446
    申请日:1985-08-09
    公开日:1986-02-27
    发明作者:Keiichiro Okabe；Yasuo Kawai
    申请人:Kabushiki Kaisha Advance Kaihatsu Kenkyujo；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 明の名称
    [0002] 細胞加工方法
    [0003] 技術分野 .
    [0004] 本発明は動植物細胞、 藻類細胞、 各種微生物細胞等の細胞 内代謝過程を陚活するための新規細胞工学的方法に関する。 本発明はまた高等植物、 特に ト マ ト、 タバコ、 ホウ レ ンソ ゥ、 ダイ ズ、 イ ネ、 コムギなど C 3型光合成を行う植物の光 合成能を向上させる方法に係り、 光合成組織で光合成を行つ ていると き の C 0 2 移送過程 （外界から葉緑体内の C 0 2 固 定部位までの） 律速部位である細胞質 （細胞膜を舍む） に、 カーボ二 ク ア ンヒ ドラ一ゼ活性を導入させるこ とによ 'り、 C 0 2 移送過程が改良され光合成 C 0 2 固定能力の向上をも たらすことができるという新しい細胞内加工方法に関する'。
    [0005] 背景技術
    [0006] 地球上における食糧の供袷の基礎をなす植物の光合成 C 0 2 固定反応を調べると、 大気中の炭酸ガス濃度が律速因子の一 つとなっていることがわかる。 すなわち、 空気中の炭酸ガス 濃度 （通常 0. 03 % ) が上昇すると植物の光合成炭酸固定速度 も增加するこ とから、 光合成の基質と して炭酸ガス C ◦ 2 は 飽和レベル以下であるこ とがわかる。 実際に、 トマ トの施設 栽培では C 0 2 施肥と して光合成を高める工夫が成され、 高 成續を上げている。
    [0007] 発明の開示
    [0008] 従って、 本発明は動植物細胞、 藻類細胞、 各種微生物細胞 などの細胞質及びノ又は細胞膜へカ ー ボニ ッ ク ア ン ヒ ド ラ一 ゼ活性を導入し、 それら細胞の C 02 固定能力を増大させる 方法を提供するこ とを目的とする ものである。
    [0009] 即ち、 本発明によれば、 生細胞の細胞質 （ cytosol ) 及び 又ば細胞膜 （ cy tomembrane) に酵素カ 二ボニ ッ ク アンヒ ドラ —ゼ （ carbonic anhydrase) ( EC 4.2.1.1. 〕 活性を導 入し、 その C 02 固定能力を増大せしめた細胞加工方法が提 供される。
    [0010] 図面の簡単な説明
    [0011] 第 1 図及び第 2図は、 それぞれ、 C 3植物及び改良型 C 3 植物の光合成時の光合成基質の濃度勾配を示す模式図であり、 第 3図は実施例 1 における C A捕捉リ ポゾー ム導入及び非 .導入のプ口 トプラス トの反応の経時変化を示す,グラフ図であ り 、
    [0012] 第 4図は実施例 1 における C A捕捉及び非捕捉リ ポゾ二 ム を導入した子葉プロ トプラス トの光合成効率を示すグラ フ図 であり、
    [0013] 第 5図は実施例 1 における C A捕捉リ ボゾー ムを導入した 子葉プロ トプラス トの光合成活性の增強度を示すグラフ図で ある。
    [0014] 第 6図は実施例 2 における C A捕捉及び非捕捉リ ポ 'ー ム 処理した成葉プロ トプラス トの 合成速度を示すグラフ図で あり、
    [0015] 第 7図は実施例 2 における C A捕捉リ ボゾー ム処理した成 葉プロ トプラス トの光合成促進効果を示^すグラ フ図である。
    [0016] 明を実施するため'の好適な態榛 '
    [0017] 一般のフ ィ ール ドにおける有用植物の光合成 C 02 固定能 力を上げるためには、 外界の C 02 濃度レベルを上昇させる 方法以外に、 C 02 を低レベルの伏態と したままで、 植物の C 02 に対する親和性を増すこ と、 換言すれば、 外界から光 合成組織 （葉） 内の C 02 固定反応部位までの、 C 02 供袷、 移送過程のパイ ブ拡張 （ C 0 -2 移送抵抗の低下） を植物体内 で行う方法が考えられる。
    [0018] C 3 植物に関し植物体内光合成細胞に入った C 02 力く C 02 固定反応部位 （リ ブロースジ リ ン酸カルボキシラーゼ） まで 移行する過程に関したこれまでの知見を分圻する と、 以下の 通り となる。 即ち、 細胞外から細胞膜を通過して細胞質に入 る時、 炭酸ガスは a c o2 " の化学種で入り 、 細胞質の中に pHに依存した割合で a H C 03" " イ オ ン型あるいは " C 02 " 型と して溶け込む。 両炭酸ガス存在型は、 C 02 の消費地で ある葉緑体に向けて濃度勾配に従い拡散する。 葉綠体は二層 膜から構成されているが、 葉緑体膜を通過する時は tt C 02 " 型であり、 葉緣体内に入ると pHに依存した割合で a H C 03 _ B イ オ ン型と " C 02 。 型になる。 炭酸固定酵素リ ブロースジ リ ン酸カルボキシラーゼは、 基質と して H C 03~ 3 イ オン ではな く β C 〇 2 s を用いる。 光合成を行っているときの pH は葉綠体が約 8. 0 、 細胞質が約 7. 0 と推定されており、 ヘン ダーソ ン ヽ ッセ レ Henderson— Hasselbach) の式力、 ら、 C 02 と H C O rTイ オ ン との存在比は葉緑体で約 40、 細 胞質で約 4 と考えられ、 と く に葉緣体では大部分が " H C 03— 型と して存在している。 C 02 + H 2 0 H C 〇 3— + H + の 平衡化速度が光合成炭酸固定速度をはるかに下まわっている 通常の光合成条件下ではこ の反応を触媒するカ ーボ二 'ン ク ァ ンヒ ドラ—ゼ活性が十分でないと光合成炭酸固定酵素リ ブ口 — スジ リ ン酸カルボキシラ ーゼの基質 C 02 の供袷が不足し、 これが反応の大きな律速要因となる。 幸にしてカーボニ ッ ク ア ンヒ ドラ一ゼ活性の細胞内分布をしらべてみると C 3植物 では葉緣体にほとんど局在し、 実際の細胞では、 葉渌体内に 入った C 02 はカ ーボニ ッ クア ンヒ ドラ一ゼの璣能により直 ちに H C 03 と C O 2 型に平衡化し、 葉緣体内 C 02 レベル を下げ、 内外 C 02 レベル差を大き く し、 拡散'促進をしてお り、 これに加えて R u B Pカルボキシラーゼに対-する基質 C 02 の供袷が最大限に維持できるよう になつている 〔 0kabe K .et al： FEBS Lett.114 , 142- 144 ( 1980) 〕 。 とこ ろが 細胞質にはカ ーボニ ッ クア ンヒ ドラーゼ活性がほとんど検出 できないこ とから葉緑体膜通過型である " C 02 " の細胞質 における " H C 03~ " イ オンからの供袷過稈と、 外界から細 胞質へ " C 02 " がとけ込んだあとの 1 " C ·〇 2 " レベルの . K H C 03~ 3 イ オ ン.への平衡がゆるやかとなり、 内外 C 02 レベルの差が小さ く 拡散速度が低下する結果となっている。 従って細胞質層が光合成炭酸移送過程において決定的な律速 過程となっていると結論される。
    [0019] 添付第 1 図は上記詳述した C 3 の植物の光合成時における " C 02 " および " H C 03_ " の濃度勾配に関した模式図で あり 、 図中、 Caはカーボニッ ク ア ンヒ ドラーゼを示す。
    [0020] 従って、 細胞質 （細胞膜を含む） 中に当該薛素活性を導入 し得れば細胞の C 02 固定能力の飛躍的向上が達成され得る
    [0021] (― if口 § H ' 0
    [0022] 上記知見に基づき、 本癸明者らは鋭意研究の^果、 ·細胞内 にあって C 02 の外界から C 02 固定部位までの C 02 供袷、 移送過程で C 02 の輸送に関係すると考えられるカ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼを実験科学的に細胞質 （細胞膜を含む） δ
    [0023] 内へ導入してやるこ とで律速部位の改善を導く こ とができた。 すなわち、 まずカ ーボニ ッ ク ア ン ヒ ド ラーゼを リ ボゾーム に入れ、 この リ ボゾームをプロ トブラス 卜に導入して光合成 速度を測定したところ、 大気 C 0 2 分圧に対応する低 C 0 2 領域で大きなカ ーボニ ッ ク ア ン ヒ ド ラ 一ゼ導入効果が得ら れた。 この実験において リ ボゾーム導入後、 カーボニ ッ ク ア ン ヒ ド ラ ーゼの細胞内分布を調べると、 細胞質及びプロ ト プラス ト膜分画に高い取込み活性がみとめられた。 こ のこ と から C 3植物の光合成炭酸固定反応における律速部位は細胞 質層 （細胞膜を含む） にあるこ とが実証され、 第 2図に示さ れるよう なカーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼの導入により C 0 2 移送における全 C 0 2 レベルの上昇がもたらされたと説明で さる。 '
    [0024] 以上のこ とから C 3植物細胞質 （細胞膜を含む） へカーボ ニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼを導入する方法により、 光合成特性 の改善を行う こ とができ、 C 3植物の育種応用における重大 なる可能性がひらかれた。 すなわち第 2図は改良型 C 3植物 の光合成時における光合成基質 - C 0 2 " 及び " H C 0 3~ " 濃度勾配に関した模式図であり代謝陚活の璣作は次の通り で ある。
    [0025] (1) 細胞質にカ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼ活性が存在する こ とにより、 光照射条件では P Hに依存して （約 p H 7. 0 ) 細胞 外から入った C 0 2 ( H C 0 3_ではない） は直ちに H C 〇 3一 と平衡化する。 このため細胞膜内の C 〇 2 レベルはカ ーボ二 ' ッ ク ア ンヒ ドラーゼ活性不在、 又は存在していても活性の 低い在来 C 3植物に比べ低く なり、 内外の C 0 2 レベル差は 大き く なり C 0 2 のとり込み速度は增大する。 (2) 細胞質にカ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラ一ゼ活性が十分高く 存在するこ とによ り 、 葉緑体にとり込まれる C 0 2 ( H C 0 3 ではない） の細胞質からの供給が増す。 すなわち全 C 0 2
    [0026] ( H C 0 3" + C 0 2 ) の供給が加速される。
    [0027] (3) かく して、 上記 (1)及び (2)の理由により、 炭酸固定反応部 位である葉緑体体内の基質 C 0 2 レベルの上昇が確保される。 尚、 第 2図において Caはカーボニッ ク アンヒ ドラ一ゼを示 す。
    [0028] 尚、 上記詳述の細胞工学的方法は、 酵素力 —ポニッ ク ァ ンヒ ドラーゼをリ ポゾ一ムにつつみこれを細胞壁を酵素的に 溶解したプロ トプラス ト （ pro top l as t) と培養して、 プロ ト ブラ ス ト内へ融合取り込ませる工程及び細胞の固定化工程よ り成るものであるが.、 育種等を目-的とする場合は周知の遺伝 子細胞工学的方法により 当該酵素活性の細胞内発現が容易に 達成され得る.。
    [0029] すなわち、 本発明方法は、 植物、 動物、 藻類又はバタテリ ァから単離精製した酵素力一ポニッ ク ア ンヒ ドラ—ゼの活 性を示すのに必要なァ ミ ノ酸配列及び活性癸現に必須な遺伝 情報 D N Aをプロ トプラス ト、 培養細胞又は生； ί点細胞に導 入し、 さ らに培養した後、 再生、 生县してきた C 3植物の光 合成を行う各細胞の細胞質 （細胞膜を舍む） にカ ーボ二 'ン ク アンヒ ド ラ —ゼ活性が遺伝学的に発現しう るよう にする遺伝 子細胞工学的方法をも包舍する。
    [0030] 当該方法に ·つき典型例に関しより詳細に 明すれば下記の 通りである。
    [0031] 1 . カ ーボ二 ッ ク ア ン ヒ ドラ ーゼ遺伝子のク ロ ー ニ ングェ稈 C 3植物であるダイ ズのカ ーボニッ ク ア ンヒ ドラ一ゼは 葉緣体タ ンパク でありながら、 核 D N Aに遺伝情報をもち、 細胞質で前駆体を形成したのち葉緣体に入ってプロセスされ、 分子量の小さなサブュニッ ト となり成熟型となる。 この活性 はダイ ズ黃化葉に光照射することで緑化がおこるとと もに誘 導されて く るが、 こ の時、 メ ッ セ ンジャ ー R N A レベルも上 昇するので、 これに対する相補的 D N A ( c D N A ) をハイ デ ッ カ ー とメ ス ンク'の方法 C Heidecker , G. & J. Messung, Nucleic Acids ResearchH, 4891- 4906 ( 1983) 〕 を利用し、 p U C系プラス ミ ドの中にク ロ ー ン化し、 この c D N A ライ ブラ リ ーの中から、 形質転換株でカーボリ ッ クァ シ ヒ ドラー ゼのぺプチ ドを生産したものを、 二 ト ロ セルロース フ ィ ルタ 一上に、 一次抗体とバーオキ シダーゼ結合二次抗体を用い選 択した。 これらの株の持つ組換プラス ミ ド （ p S C A系） 中 で力 一ポニ ッ ク ア ンヒ ド ラ ーゼ活性を示すのに十分なサイ ズの塩基配列を選び、 植物宿主ベク ターへの導入遺伝子とす る。
    [0032] また、 染色体 D N Aの制限酵素断片バンク から当該酵素遣 伝子をもつコ 口二 -を上記ク ロー ン化 c D N Aプローブで特 定し、 この遣伝子を植物宿主べク タ—への導入遺伝子とする こ とができる。
    [0033] ただし、 以上の工程で得られる当該酵素遺伝子は葉緑体導 入に必要なぺプチ ドをコ一 ドした D Ν Α配列を欠損した加工 をしてお く こ とが必要である。
    [0034] ② 一方、 当該酵素遣伝子あるいは c D N Aを渌藻ク ラ ミ ドモナスからのものとするときは、 薛素活性の大半が細胞表 層に存在するこ とと、 こ の遺伝情報が核 D N Aにコ ー ドされ て（/ヽる C Toguri , Yang, Okabe, Miyachi ： FEBS し ett,170 ： 117 - 120 ( 1984) 〕 ので細胞質で合成され表層に移行すると考 えられ、 そのまま導入遺伝子とすることができ る。
    [0035] ③ また、 細胞質に当該酵素活性の大部分をもつ C 4植物 (例えば ト ウモロコ シ） から、 当該酵素遗伝子あるいは c D N Aをク ロー ン化し、 利用するときは、 上記②と同じ理由か ら、 そのまま導入遺伝子とするこ とができる。
    [0036] 2 . 植物細胞への当該酵素遺伝子の導入工程
    [0037] ① ァグ Nクテ リ ウム、 チュメ フエ シエ ンス （ Agrobac - terium tumefaciens ) の T i プラス ミ ド系を用いた植物ゲ ノ ムへの当該遺伝子の導入は常法に従い、 中間ベクタ ーへの 導入、 中間ベクターの T i プラス ミ ドとの組み換え、 組み換 えプラス ミ ドを持つァグロパクテリ ゥムの植物細胞への導入 としヽぅ ステツフ*からなる。 〔し.. H.errera - Es trel 1 a ef a 1：
    [0038] Nature3105115- 120 ( 1984) 〕 〔し. Herrera - Es tre 11 a et al ： Nature 303, 209-213 ( 1983) 〕
    [0039] ② 中間べクタ —への当該遣伝子の導入は、 宿主範囲の広 いプラス ミ ド 〔例えば p R K 290 Di tta et al . pro N AS. USA. 77： 7347- 7351 ( 1980) 〕 を中間ベクターと して選び、 この 中に導入に用いる T i プラスミ ドの T領域を切り 出し、 揷入 し、 マーカ ー遺伝子と して抗生物質耐性遣伝子と当該遺伝子 を各々植物体で発現しう るプロモーター とタ ー ミ ネーターと ポリ （ A ) R N Aシグナルを前後に連結したものとノ 'リ ン 合成酵素の遣伝子 （T - D N Aの右端配列を含む） を導入す る。
    [0040] ③ 中間べクタ一の T i プラス ミ ドへの導入
    [0041] 上記中間ベクターをォク ト ビ ン型 T i プラス ミ ド （例え ば P T i 36S 3 ) をもつァグ Nクテリ ゥムにへルバ一プラ ス ミ ドの手助けで導入し、 中間ベク タ ーの T領域を利用した 相補的組換体を選択する。
    [0042] ④ 組み換えブラス ミ ドをもつァグロパク テ リ ゥムの植物 細胞への導入
    [0043] このァグロバクテリ ウムを宿主植物の培養細胞あるいは プロ トブラス トあるいは葉 · 茎組織へ直接感染させて T - D N Aを導入する。 形質転換の選択は抗生物質耐性と当該酵素 活性で行なう。
    [0044] 以上の工程を通して、 当該酵素活性を細胞質 （細胞膜を舍 む） に発現しう る形質転換が選択される。 T i プラズミ ツ ド あるいはその誘導体の特性でこ の再生体は花を得、 種子と し て遣伝させるこ とができるので、 本発明方法は育種分野に於 いても極めて有用なものと云い得る。
    [0045] 以上、 本発明方法につき C 3植物を典型例として詳述した が、 本発明はこれらに限定されるものでな く 前記各種細胞に 於ける H C ひ 3" レベルを律速とする各種代謝サイ ク ルを賦活 し得、 従って固定化細胞 （バイ オ リ アク タ） によるア ミ ノ酸 等の二次代謝産物生産に関与する C 1 、 C 3 カルボキシ レー シ ョ ンを触媒する フ ォ スフ ォ エノ 一ルビルビ ン酸カルボキ シ ラーゼへの基質 H C 0 3_イ オ ン供袷を高めるのでその增収等 にも直ちに利用可能なものと云い得る。
    [0046] 実施例
    [0047] 次の実験例により本癸明をさ らに具体的に説明するが、 本 発明の範囲をこれらの実施例に限定する ものでないこ とはい う まて'もない。
    [0048] 実施例 1
    [0049] ト マ ト子葉プロ トプラ ス トの光合成炭酸固定に及ぼすカーボ ニ ッ ク ア ンヒ ド ラ 一ゼの促進効果。
    [0050] C 3 植物の リ コ ペ リ シコ ン エス ク レ ンタ ム （し ycopersicon esculentum) の子葉ブロ ト プラ ス トを表 1 に示すフ ロ ーチヤ ー トに従い調製し、 ジパルメ ト イ ルリ ン酸コ リ ンとステア リ ルァ ミ ンを用いてカ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼを捕捉した あるいは捕捉しない リ ボゾームを表 2 の方法で調製し、 両者 を表 3 の方法で反応させ、 カ ーボニッ ク ア ンヒ ドラーゼを 捕捉したあるいは浦捉しないプロ トプラス ト標品を得た。 こ のときの反応の経時変化は第 3図に示すごと く すみやかな融 合取り込み過程であるこ とがわかる。
    [0051] すなわち、 第 3図はリ ボゾームのプロ トプラス トへの捕捉 過程を示すものであり、 当該酵素を含むリ ボゾームをプロ ト プラス トに導入処理し、 洗浄後のプロ トプラス トに於ける当 該酵素活性をリ ボゾーム処理時間に ¾してプロ ッ ト したもの である。 洗浄後プロ トプラス トあたり 472 個のリ ボゾームに 相当するカ ーボニ ッ ク ア ン ヒ ド ラ —ゼ活性が測定され、 上 澄には活性は測定できなつた。 リ ボゾームを取り込んだプロ ト ブラ ス トを葉緑体と等張と して 20m のナイ ロ ンメ 'ッ シュ を通過させパンク させたとこ ろ細胞質分画 （上澄） に 26%の カ ーボニッ ク ア ン ヒ ドラ一ゼ活性が回収された。 葉緑体お よびプロ トプラス ト膜を含む沈澱分画には 74%であった。 こ のと き、 プロ ト ブラ ス ト がも と も と もつカ ーボニ ッ ク ア ン ヒ ド ラ —ゼ活性の 120 倍が回収されていた。 （表 4参照） 上 記により調製したプロ トプラス トの光飽和条件における
    [0052] ( 10, 000LUX.) 光合成炭酸固定活性を NaH^COs を用いて測 定した。 このさい、 両プロ トプラス ト膜表面への C 〇 2 の供 袷が律速にならぬよ う 0. 5 ノ ^の濃度でカーボニ ッ ク ァ ン ヒ ドラーゼを反応液に添加し、 容量が 0.25 、 重曹 NaHC03 が最終獾度 0.36m M、 1.25m M . あるいは 9 m M レベルを用 いた。 前照射 10分後、 重曹の添加で反応を開始、 30秒後、 酢 酸を添加して反応をとめ、 固定された C の量を液体シ ンチ レ イ シヨ ンカ ウ ンタ一にて測定した。 第 4·図及び第 5図に示す ごと く 、 低い炭酸濃度領域になるほどカ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラ ーゼをもつリ ボゾー ムを処理した方が光合成は促進して いた。 これは光合成を律速している C 02 濃度域での C 02 取込み効率が上昇したこ とを示し、 取込んだカーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼが分解されて失活するまでプロ ト プラス ト細 胞の光合成能率を髙めさせるこ とができ るこ とを意味する。
    [0053] すなわち、 第 4乃至第 5図は当該酵素含有リ ボゾームをプ 口 ト プラ ス トに導入し光'合成効率 （相対比） 及び光合成活性 の增強度 （相対比） を iNaHC03 濯度に対してプロ ッ ト したも のであり、 プロ トプラス ト内の差だけの効果を測定し得るよ うにして行なったものである。
    [0054] 表 1 子葉プロ ト プラ ス ト の調製手順
    [0055] 1 . バ― ミ イ ク ユ ラィ ト上にて連続螢光灯光 （ 3, 0001ux) に て発芽成育させた ト マ ト子葉を 14日 目に集める。
    [0056] 2. 滅菌水で洗浄。
    [0057] 3 . 0, 4 Mマンニ ト ール液につけ、 力 ミ ソ リ で切断。
    [0058] 4. 細胞壁分解酵素液 （ 0. 4 Mマ ンニ ト ール、 1 %セル 一 ゼ、 0.25%マセ ロザィ ム） にて 4時間処理、 58m ナ イ ロ ンメ ッ シ ュをとう し、 そのろ液を集める。
    [0059] 5 . 遠心 .（ 2, OOOrpm, 5分） にて沈穀分画をとり 、 Ι πώの
    [0060] 0. 4 Μマ ンニ ト ール き液に懸垂し、 等張にしたフ イ コ ー ル 400 の 10、 20、 30%ステ ッ プワ イ ズ湲度勾配に上層し、 2, 000 rpm, 5分の遠心分離を行い、 ブロ トプラス トの ノ ン ドを回収。
    [0061] 6 . 0. 4 Mマ ンニ ト ー ル ¾液にて希釈、 800rpm, 5 分遠心に てプロ トブラ ス トを回収。
    [0062] 7 . 同上溶液にて洗浄を く り返し、 .プロ ト プラ ス トを精製。 8 , 氷中にて保存。
    [0063] 表 2 リ ボゾ一ム調製手順
    [0064] 1 . 2. 5 ragジノヽ 'ノレ ミ ト イ ノレリ ン酸コ リ ン、 0.27 ステア リ ル ア ミ ンを 1 πιβのク ロ 口ホルムにと き、 20mfi滅菌ナス フ ラ ス コにうつし、 窒素気流中で留去。
    [0065] 2. 氷令ェチルエーテル （ 0. 6 πώ) に溶かし、 こ の中へカ ー ボニ ッ ク ア ンヒ ドラ 一ゼ溶液 （ 8 ノ 0.15 0. 5 Μソ ルビ ト ール、 1 / 10P B S ( ρΗ7. 8 ) ) を添加混合。 対 照用と してカーボニックアンヒ ドラ一ゼを舍まぬ溶液を 用いる。
    [0066] 3 . 窒素気中で超音波究生装置をつかいこの 液を乳化 （逆 ミ セルの生成） 。
    [0067] 4. 氷中で静置の後、 窒素気流中でエ ーテルを留去 （大きな 逆ミ セル融合体の生成） 。
    [0068] 5 . 0. 5 Μソルビ ト ールにと き、 4 'C で 16,000rpm, 4分の遠 、にかける。
    [0069] 6 . この操作を 3 回以上繰り返し、 洗浄上澄からカーボニッ クア ンヒ ド ラ一ゼ活性が除まされることを確認。
    [0070] 7 . 1 の 0. 5 Mソルビ ト ールに懸濁し、 氷中にて保存。
    [0071] 表 3 プロ ト プラ ス トへの リ ポゾ—ム融合取り込み手順
    [0072] 1 . 表 i の手順で調製したブラ トプラス ト懸垂液のプ π トプ ラス ト数の 20倍量に相当する表 2 により調製'したリ ポゾ 一ムを添加混合する。
    [0073] 室温にて静置。
    [0074] 2, OOOrpm, 5分の遠心にてプロ ト プラス トを回収。
    [0075] 0. 4 Mマ ンニ トール （ pH 7. 0 ) にて 3 回の洗浄遠心を行 い、 同液に懸濁。 氷中にて保存。
    [0076] (以下余白）
    [0077] 表 4 プロ ト プラ ス ト に取り込まれたカ ーボニ ッ ク ア ン ヒ ドラ ーゼ細胞内分布 カ ーボニ ッ ク ア ンヒ ド ラ ーゼ活性 ク ロ ロ フ ィ ル
    [0078] ( U Zm0抽出液） （ g Zn^抽出液） プロ ト プラス ト のみ
    [0079] 上澄分画 0. 0
    [0080] (細胞質)
    [0081] 沈澱分画 0.5 2 6.9 . (主に葉緑体） プロ トプラ ス ト + リ ボゾーム （対照）
    [0082] 上澄分画 · 0. 0
    [0083] (細胞質）
    [0084] 沈澱分画 0. 5 3 0.6
    [0085] (主に葉渌体） プロ ト プラ ス ト + リ ボゾ ム （カ ーボニ ッ ク ア ン ヒ ド ラ ーゼ）
    [0086] 上澄分画 1 8.7 1.5
    [0087] (細胞質)
    [0088] 沈藏分画 4 0. 6 1 9. 1
    [0089] (主に葉緑体） 実施例 2
    [0090] トマ ト成葉プロ ト プラス ト の光合成酸素発生に及ぼす力 ボニ ッ ク ' ア ンヒ ドラ ーゼの促進効果 C 3植物の リ コ ペ リ シコ ン エスク レ ンタ ム （し ycopersicon esculentum) 、 トマ 卜の光合成能の高い成葉ブロ トプラス ト を表 5 に示すフ ロ ーチヤ一 ト に従い調製し、 ホス フ ァ チジ リ ルコ リ ンとステア リ ルア ミ ンを用いて、 牛血液から精製した カ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼを捕捉したあるいは捕捉しな い リ ボゾームを表 6 に示すフ ロ ーチヤ一 ト に従い調製し、 両 者を表 7 の方法で融合反応させたカーボニッ ク ア ンヒ ドラ —ゼを捕捉したあるいは捕捉しない成葉プロ トプラス ト標品 を得た。 こ のときの各成棻プロ ト プラ ス ト標品の当該酵素活 性はリ ボゾーム処理しなかった対照の成葉プロ トプラス ト
    [0091] ( 2 · 33U / 3 105 成葉プロ トプラス ト） 及びカーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼを捕捉しないリ ボゾームを処理した対照 の成葉プロ トプラス トに比べ、 カ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラー ゼを捕捉したリ ボゾームを処理した対照の成葉プロ トブラス トにおいて 2倍 （ 4 · 63U / 3 105 成葉プロ ト プラ ス ト） であった。 この条件では平均して 2倍から 4倍レベル高い当 該酵素導入が得られた。
    [0092] この条件でえられた成葉プロ トプラス ト標品の光合成特性 を基質重曹に対する酸素発生能の変化について表 8 に示すフ ロー チャ ー トに従い酸素電極 （ラ ンク 、 ブラザ一社製） を用 いて測定した。
    [0093] C 02 をのぞいた緩衝液に再懸垂し、 両成葉プロ トブラス ト膜表面への C 02 の供袷が律速にならぬよう 42U Zm 1 の 濯度でカ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼを反応液に添加し酸素 電極槽中で光照射を行った。 ほぼ大気酸素分圧 （ 21% 02 ) レベルで C 02 依存性酸素癸生がな く なったところで、 既知 の港度^なるよ う基質重曹を添加し、 こ のと きの最大光合成 酸素発生速度を定量比較した。 光合成速度と基質重曹蘧度と の関係を示す第 6図のごと く 、 基質重曹濃度に依存した光合 成酸素発生がみられたが、 と く に低い基質重曹溪度域におい て、 カーボニッ ク アンヒ ドラーゼを捕捉した リ ボゾームを 処理した対照の成葉プロ トブラス トの方がその酵素を捕捉し な '、 リ ボゾームを処理した対照の成葉プロ トプラス トに比し 髙ぃ光合成能を示した。 この当該酵素による光合成酸素発生 促進効果は第 7 図に示されるごと く 低濃度域ほど大きなもの であった。
    [0094] この条件で得られたカーボニック ア ンヒ ドラーゼを捕捉 した リ ボゾーム処理をした成葉プロ トプラス トのプロ トプラ ス ト內当該酵素活性分布をしらべると細胞質画分に葉緣体及 び膜画分に匹敲する レベルの分布が得られたが、 対照のリ ポ ゾーム処理をしなかった成葉プロ トプラス ト及びカーボニ ッ ク アンヒ ドラーゼを捕捉しないリ ボゾーム処理した成葉プ ロ ト プラス トの細胞質画分には当該酵素活性がきわめて低か つた。
    [0095] 以上のことから、 大気条件における光合成の C 0 2 利用効 率を上げる目的で、 C 3植物の細胞質 （膜表面をふ く む） 層 に当該酵素活性を現在より高いレベルに発現させるという本 細胞加工法の有劫性が明らかである。
    [0096] 表 5 成葉ブロ トブラス トの調製手順
    [0097] 1 . ノ 一 ミ キユ ラィ ト とビーナスライ トを入れたボ ッ ト上に て明期 （ 2500 - 6000 1 u X ) 14時間と暗期 10時間の周期で 発芽生育させた トマ トの成葉を 1 5日 目に採集し、 裏表皮 をはぎ、 0. 5 Mマ ンニ ト ール上にうかべ室温で原形質分 離を行う。 2 . 葉を細胞壁分鮮酵素液 （ i %セルラ ーゼ R — 10、 0.01% ぺク ト リ ア一ゼ Y — 23, 0.5Mマ ンニ ト ール、 ρΗ7· 0 ) 上 に移す。 37'c 、 2 時間暗所静置し、 成葉プ π トプラス ト をえる。
    [0098] 3 . 62m ナイ ロ ンメ ッ シュをと う し、 そのろ液を集める。 4. 100 X g 、 3分間の遠心にて酵素液を除き、 0. 5 Mマン 二 ト ール溶液に懸垂し、 20% ( w / w) ショ 糖液に上層 し、 上記の遠心を く りかえし、 20% ( / w ) ショ 糖液 層の上にバン ド伏に成葉プロ トブラス トを得る。
    [0099] 5 . ノ、'スツールピペッ トで成葉プロ トプラス トを回収し、
    [0100] 0. 5 Mマ ンニ ト ール溶液にて洗浄を 3 回 く りかえし、 成 葉プロ トプラス トを精製し氷中にて保存。
    [0101] 表 6 リ ボゾーム調製手順
    [0102] 1 . 25 ホスフ ァ チジルコ リ ン （シグマ社製、 タ イ プ V — E ) と 2. 7 ステア リ ノレア ミ ンを 3 πιβのク ロ 口ホルムに と き、
    [0103] 50mfiナスフ ラスコにうつし、 窒素気流中で留去。
    [0104] 2 . 氷冷ェチルエーテル （ 3 ) にと力、し、 こ の中へカ ーボ ニ ッ ク ア ン ヒ ド ラ ーゼ溶液 （ 10 カ ー ボニ ッ ク ア ン ヒ ドラ ーゼ、 0. 5 Μマ ンニ ト ール、 0. 1 M H E P E S、 ρΗ6. 2、 0.09 NaCl) を 1. 5 mfi加える （対照リ ボゾーム はカーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼを賒いた溶液にて作製）
    [0105] 3 . 窒素気中で超音波癸生装置をつかいこの溶液を乳化 （逆 ミ セルの生成） 。
    [0106] 4. 氷中で 30分間静置の後、 フ ラ ス コを口—タ リ —エバポ レ —ターに装備し吸引減圧、 150rpmで 10分間回し、 エ ーテ ルを留去し、 ミ セルの融合体を得る。
    [0107] "5 . 0. 5 Mマ ンニ ト ール溶液を加え、 δ πι ナ イ ロ ンメ ッ シ ュ及び 1 ニュ ーク リ ポアメ ンブレ ンでろ過。
    [0108] . ろ液を 10'cにて、 100,000 x g、 10分間の超遠心にかけ る。
    [0109] . この沈癜を 0. 5 Mマ ンニ ト ールにて洗浄後、 同液に懸垂 し氷中保存。
    [0110] . 6の上清にたいして、 10'cにて 160,000 x g、 3時間の 超遠心を行う、 その沈澱を 0. 5 Mマ ンニ トールにて洗浄 後、 同液に懸垂し氷中保存。
    [0111] . 7或いは 8 で得られた沈澱 （リ ボゾーム） を成葉プロ ト プラス 卜 との融合に用いる。
    [0112] 表 Ί 成葉プ口 トプラス トへのリポゾーム融合取り込み手順
    [0113] . 成葉プロ ト プラス トを 0. 5 Mマ ンニ ト ール、 10m M H
    [0114] E P E S ( pH6. 2 ) に懸垂し （ 10S / mH) 、 0. 5 Mマン 二 トール溶液に懸垂したリ ボゾーム （ +—カーボニック アンヒ ドラーゼ） （脂質 0. 1 m M ) を 1 ： i の割合でプ ラスチック シャ一レ上で少量ずつ静かに ¾合融合する。 対照にはリボゾームのかわりに 0. 5 Mマ ンニ ト ールだけ ¾：使用。 ·
    [0115] . 15分後、' CaCl2 ( 0. 5 Mマ ンニ ト ール） を添加し、 静か に混合、 さらに 5分後に同液を添加混合。
    [0116] . その後、 25% ( w / w ) ショ糖液に上層し、 100. X g、
    [0117] 3分間の遠心を行い、 25% ( / w ) ショ糖液層上にバ ' ン ド状の成葉プロ トプラス トを得る。
    [0118] . 成葉プ口 トプラス トをパスツールピぺ ッ トで画収し同液 に再度懸垂し、 ェ毪 3. を 3回く ¾かえし、 プロ トプラ ス トを洗浄する。 表 8 光合成酸素発生能の測定法
    [0119] 1 . 2 - 3 X 105 の成葉プロ ト プラス トを 100 X g、 3分間 の遠心で集め、 氷上で弱光の下 （ 2801ux以下） に置く 。 ( 1 時間以內）
    [0120] 2 . この成葉プロ トプラ トを 1. 2 の C 02 を除いた測定 溶液 （ 0. 5 Mマ ンニ ト ール、 50m M H E P E S、 pH8. 2、 42U カ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラ ーゼ） に懸 垂し、 ク ラーク型酸素電極容器 （ラ ンク 、 ブラザ一社製） にいれ、 25°c約 10,0001ux 白色光のもとで、 微量溶存 C 02 に依存する酸素発生がとま ったと こ ろで、 重曹が
    [0121] 0. 2、 0. 5、 2, 0、 4. 0 m Mとなるよう に、 順次マイ ク π シ リ ンジで加え、 各濃度での定常酸素発生速度をよむ。
    [0122] 3 . 暗所での酸素吸収速度をもとめ、 工程 2 . で得た値に加 え、 真の光合成酸素発生速度を求める。 .
    [0123] 4. ク ロ ロ フ ィ ル量を 80%アセ ト ンで抽出、 分光学的に定量 し、 ク ロ ロ フ ィ ルあたり の光合成速度を求める。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1 . 生細胞の細胞質 ( cytosol ) 及びノ又は細胞膜 （cyto membrane) に酵素カ ーボニッ ク ア ンヒ ドラ一ゼ （carbonic anhydrase ) C EC 4.2.1.1. 〕 活性を導入してその生細胞の
    C 02 固定能力を増大せしめることを特徵とする細胞加工法。
    2 . 酵素カーボニッ ク ア ンヒ ドラーゼをリ ボゾームにつ つみ、 細胞壁を薛素的に溶！？したプロ トプラス ト （ protoplast ) と培養して、 プロ トプラス ト内へ融合取り込ませる 請求の範囲第 1項に記載の細胞加工方法。
    3. 植物、 動物、 藻類又はバクテリ アから単離精製した酵 素カ ーボニ ッ ク ア ンヒ ドラーゼの活性を示すのに必要なァ ミ ノ酸及び活性発現に必須な遺伝情報 D N Aをプロ トプラス ト、 培養細胞又は生县点細胞に導入し、 さらに培養した後、 再生、 生县してきた C 3植物の光合成を行う各細胞の細胞質 及びノ又は細胞膜にカーボニッ ク アンヒ ドラ一ゼ活性が遺 伝学的に癸現しう るようにする遺伝子細胞工学的過程を含む 請求の範囲第 1 項に記載の細胞加工方法。 .
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    公开号 | 公开日
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-02-27| AK| Designated states|Designated state(s): US |
    1986-02-27| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): DE FR GB IT NL |
    1986-04-07| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1985904019 Country of ref document: EP |
    1986-08-13| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1985904019 Country of ref document: EP |
    1992-04-22| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1985904019 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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