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    公开号:WO1986000925A1
    申请号:PCT/JP1985/000409
    申请日:1985-07-19
    公开日:1986-02-13
    发明作者:Masahiro Nakao；Sumio Asami；Takaharu Tanaka；Kyoichi Ogura；Teruo Amachi；Hajime Yoshizumi；Hiroshi Ishigooka
    申请人:Suntory Limited；
    IPC主号:C12P7-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] リ パーゼの製造方法 技 術 分 野
    [0003] 本発明は、 新規リパーゼの製造法に関するものである。 さ らに詳し く は、 スタ フ イ ロ コ ッ カス ♦ キ ヤ ビテ イ ス
    [0004] ( S taphy l ococcus ca p i t i s ) に属する微生物による ト リ グリ セリ ドから遊離脂肪酸およびグリ セリ ンを生じせしめる新規 リパーゼの製造法に関するものである。 背 景 技 術
    [0005] 微生物、 と く にバクテリ アを用いる リパーゼの製造法とし ては、 シユー ドモナス属、 ク ロモバクテリ ウム属、 ァク ロモ パクター属、 コ リ ネバクテリ ゥム属などに属する菌を利用す る方法が知られている。 しかしながら、 これらの微生物に由 来する リバーゼを用いて油脂類、 特に ト リ グリ セ リ ドを分解 した場合、 脂肪酸及びグリ セ リ ンのほかにかなり の量のモノ グリ セリ ド及びジグリ セリ ドが生成する。 これは、 一旦分解 生成した脂肪酸とグリ セ リ ンがリパーゼの作用により再度結 合するか、 又はリパーゼによ 分解がモノ グリ セ リ ドもし く はジグリ セリ ドの段階で停止するためである と考えられる。 従って、 このような従来から知られている リパーゼを用いて 油脂を分解するこ とによつて脂肪酸を製造する方法は、 技術 的にも経済的にも欠点を有していた。
    [0006] ¾ 5 発明の開示
    [0007] 従ってこの発明は、 ト リ グリセリ ドを完全に分解して脂肪 酸及びグリセリ ンを生成せしめ^ k モノグリセリ ド及びジグ リセリ ドを実質上生成せしめ Λ、 油脂の酵素的分解による脂肪 酸の工業的製造に使用することができるリパー を提供する ものである。
    [0008] このようなリ ノ、 ·一ゼがスタフイ ロコ ッカス · キヤビテイ ス (Staphylococcus capi tis) によって 生 eれ ·¾>こと 3、本発 明者等によって見出され、 そして純粋に分離精製された。 0 従って、 この発明は、 スタフイ ロコ ッカス · キヤビテイ ス
    [0009] (Staphylococcus capitis) に属し、 新規リ ノヽ ·ーゼ生産能を 有する微生物を培養培地に培養し、 培養液中 該リパ―ゼを 蓄積せしめ、 該培養液から該リパー を採取することを特徴 とする新規リバーゼの製造方法を提供する。 このリパーゼは 5 ト リ グリセリ ドを実質上完全に脂肪酸とグリ セリ ンとに分解 し、 有意量のモノグリ セリ ド及びジグリセリ ドを生成せしめ ない。 図面の簡単な説明
    [0010] 0 第 1図はオリ ーブ油を基質とした場合の活性を 100%とし て、 この発明のリパーゼの各種基質に対する相対活性を示す 第 2図は ト リオレイ ンを基質とした場合の活性を 100%と し、 この発明のリバーゼの各種基質に対する相対活性を示す 第 3図はこの癸明のリパーゼの活性に対する p Hの影響を 5 示す。 図中 -参 -は 0. 1 M酢酸緩衝液を使用して測定した活 性を示し、 -〇 -は 0. 1 M燐酸緩衝液を使用して測定した活 性を示し、 そして—口 -は 0. 1 Mグリ シン— NaOH緩衝液を使 用して測定した活性を示す。
    [0011] 第 4図はこの発明のリバーゼの P Hに対する安定性を示す。 図中の記号は第 3図のそれと同じ意味を有する。
    [0012] 第 5図はこの発明のリバ—ゼの活性に対する温度の影響を 示す。
    [0013] 第 6図はこの発明のリバーゼの温度に対する安定性を示す。 第 7図はこの発明のリパーゼと従来技術のリバ一ゼとを反 応生成物に関して比較した薄層クロマ トグラムである。
    [0014] 第 8図は各種のォレイ ン酸グリ セリ ドに対するこの発明の リパーゼの活性を示す薄層ク ロマ トグラムである。
    [0015] 第 9図及び第 1 0図はこの発明の種々の酵素液 （菌株を異 にする） により ト リオ イ ンを分解した場合の生成物を示す 薄層クロマ トグラムである。 発明を実施するための最良の形態
    [0016] リパ一ゼ生産菌
    [0017] この発明において使用する リパーゼ生産菌はスタフィ ロコ ッカ ス ' キ ヤ ビテ イ ス属に属し、 リパーゼ生産能を有する細 菌である。 このような性質を有する細菌であればいずれもこ の発明の方法において使用することができる。 例えばァメ リ カ ン · タ イ プ ' 力 レチャ一 ' コ レク シ ョ ン（American Type C ul ture Col lection) 〔12301 ノヽ'一クラウ ン ' ドライ ブ '.ロ ッ ク ビル ' メ リ ー ラ ン ド 20852 · 米国； （12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U. S. A. ) ) に保存されてお ヽ 容易に入手することができるスタフィ ロコ ッカス · キヤビテ イ スを使用することができる。 このような菌として例えばス タ フ イ ロコ ッ カス · キ ヤ ビテイ ス ATCC 27840 , ATCC 27841 , ATCC 27842 ,.及び ATCC 27843を挙げることができる。
    [0018] さらに、 この発明の方法においては、 本発明者等がヒ トの 頭皮から初めて分離したスタ フ イ ロコ ッ カス · キ ヤ ビテ イ ス T一 1 一 1株（SAM 0001)を使用することができる。 この菌株 は次のような菌学的諸性質を有する。
    [0019] ( A) 形 態
    [0020] (1) 大きさ ； 直径 0. 8〜： I. 2 mの球菌、 2 〜 4偭集つ て存在。 .
    [0021] (2) 運動性 ； なし。
    [0022] (3) 胞子形成 ； 観察されず。
    [0023] (4) グラム染色性 ； 陽性。
    [0024] (5) 抗酸性 ； なし。
    [0025] ( B ) 生育状態
    [0026] (1) 肉汁寒天平板培養 ； やや凸状、 円形、 表面平滑、 不 透明白色のコロニーを形成。 コロニーは小さ く 、 径 1 〜 3 m/m である。
    [0027] (2) 肉汁液体培養 ； 生育良好、 液全体が混濁。
    [0028] (3) 肉汁ゼラチン穿刺培養 ； ゼラチンを液化せず、 線状 に生育。
    [0029] (4) 肉汁寒天斜面培養 ； やや凸状、 表面平滑。 不透明白 色。 生育良好。 (5) リ ト マス ミ ルク ； 色調変化せず。 凝固又は液化を認 めず。
    [0030] (6) メ チルレ ッ ド （M R) テス ト ； 陽性。
    [0031] (7) フォ ーゲス ' プロスカ ウエル （ V P ) テス ト ； 陽性 <
    [0032] (8) イ ン ドール生成 ； なし。
    [0033] (9) 硫化水素生成 ； なし。
    [0034] (10) デンプン分解能 ； なし。
    [0035] (11) クェン酸利用能 ； コーザ一 ' ク リ ステンセン反応陽 性。
    [0036] (12) 無機窒素源利用能 ； 硝酸塩を利用するが、 ア ンモニ ゥム塩を利用せず。
    [0037] (13) 色素産生能 ； なし。
    [0038] (14) ゥレアーゼ反応 ； 陰性。
    [0039] (15) ォキ シダーゼ反応 ； 陰性。
    [0040] (16) 力タ ラ ーゼ反応 ； 陽性。
    [0041] (17) 生育範囲 ； PH 5 〜 9、 温度 20で 〜 40で最適生育温度 32で 〜35 。
    [0042] (18) 酸素要求性 ； 通性嫌気性。
    [0043] (19) 糖利用能 ；
    [0044] 酸生成 （ + ) ； D—グルコ ース、 D—フ ラ ク トース、
    [0045] D—マ ンノ ース、 シユ ーク ロ ース、 グ リ セ リ ン。
    [0046] 酸、 ガス生成 （―） ； D—ガラ ク トース、 D—キ シロ ース、 L ーァ ラ ビノ ース、 マル ト ース、 ラ ク ト ース、 ト レノヽロ ース、 D—ソノレビ ッ ト、 イ ノ シ ッ ト、 デンプン。
    [0047] D—ダルコースから乳酸を生成。
    [0048] (20) 耐塩性 ； あり （10〜20%の食塩水中生育） 。
    [0049] (21) リバーゼ活性 ； あり。
    [0050] (22) レシチナーゼ活性 ； あり。
    [0051] (23) コアダラーゼ活性 ； なし。
    [0052] (24) フォ スファターゼ活性 ； なし。
    [0053] (25) デォキシリ ボヌク レアーゼ活性 ； あり。
    [0054] この微生物スタフイ ロコ ッカス ' キヤ ピテイ ス T— 1 — 1
    [0055] (SAM 0001)は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
    [0056] (茨城県筑波郡谷田部町東 1丁目 1番 3.号） 〔 Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology Minis try of International Trade and Indus try (1-1-3 Ya tabe- cho H i gash i , Tsukuba- gun , Ibaraki-ken,
    [0057] Japan)に、 微ェ研菌寄第 7723号 （FERM P-7723)として寄託さ れている。 なお、 この微生物は、 1985年 7月 1 1 日に微ェ研 条寄第 834号（FEBM BP-834) としてブタぺス ト条約に基く国 際寄託に移管された。
    [0058] 本発明を実施するにあたっては、 上記のスタフイ ロコ ッカ ス . キヤビテイ スに属する リパ一ゼ生産菌を培地に培養する。 この培養のためには、 この微生物が良好に生育することがで きる任意の培地を使用することができる。 炭素源としてはグ ルコース、 シュ—クロース、 糖蜜、 油脂などを単独で又は組 合わせて使用することができる。 窒素源としては、 各種ぺプ ト ン、 大豆粉、 コ ー ンステ ィ ープリ カ一、 酵母エキス等を単 独で又は組合わせて使用することができる。 また、 M g 2 + , C a z + , N a + 等の塩類や各種ビタ ミ ン類、 また培養に即し て消泡剤を培地に添加することもできる。
    [0059] 本発明においては、 液体培養でも固体培養でも使用するこ とができるが、 通常は好気的液体培養が好ましい。 振とう培 養、 又は通気攪拌培養により好気的条件を達成することがで きる。 本発明における培養条件は使用する菌株、 培地組成に より多少異なり、 目的物である リパーゼの生産に最も有利な 条件を選択する。 本菌株のう ち T— 1 — 1株は好ましく は、 20〜 40で、 と く に好ましく は 30〜 37で の温度、 及び p H 5〜 9、 特に好ましく は p H 6〜 7 において培養され、 良好なリ パ一ゼ生産が行なわれる。
    [0060] 本発明に従い、 スタ フ ィ ロ コ ッ カス · キ ヤ ビテ イ スに属す る リパーゼ生産菌を培地に培養して新規リパーゼを製造する 場合、 培地にォリ ーブ油等の油脂、 又はレシチ ン等のリ ン脂 質を添加するこ とによ り生産性が著し く増加する。 これらの 脂質の添加量は通常、 培地に対し 0 . 01〜 2 %が適当である。 培養期間は菌株により異なり、 1〜 3 日においてリバーゼ生 産は完了する。
    [0061] リパーゼの採取 . 精製
    [0062] 本新規リパーゼは菌体外に生産されるためリパーゼを舍有 する液を通常の遠心法あるいは濾過法により菌体から容易に 分離することができる。 さらに精製を行なうためには、 酵素 の採取精製に通常用いられる手法、 例えば、 硫酸ア ンモニゥ ム等を用いる塩折、 エタノ ール、 ァセ ト ン等を用いた溶媒沈 讖、 等電点沈殺、 活性炭、 リ ン酸カルシウム等を用いた物理 吸着、 イオン交換クロマ トグラフィ ー、 ゲル濾過法やァフィ 二ティ一クロマ トグラフィ 一などのひとつ、 あるいは複数の 組み合わせにより各々の使用百的に応じた種々の純度の酵素 標品を得ることができる。
    [0063] 精製方法の具体例を示すと次の如くである。 本発明の方法 により得られた培養液を濾過または遠心分離することにより 透明な酵素液が得られる。 この酵素液を濃縮し、 2 0 πι Μ Tris - E C U 緩衝液 （ p H 7. 0 ) で透折後、 透圻された濃縮 液を、 同緩衝液で平衡化した DEAE -セル口ースに吸着させ、 NaC£ でグラジェン ト溶出する。 本リパーゼは NaC 濃度 0. 4 〜 0. 5 M付近で溶出される。 適宜濃縮後 lOOmM NaC£ 舍有 100m MTris— H C 緩衝液 （ p H 8. 0 ) 'で平衡化した ウルトロゲル A c A 3 4 ( L K B製） を用いてゲル濾過を行 う ことにより電気泳動的に単一な標品を得ることができる。 これに代る方法として、 上記培養液を限外濾過膜により濃縮 し、 その濃縮液を希塩酸を用いて P H 3. 9 〜 4, 0 に調整し、 低温 （ 4 でが好ましい） に数時間保持した後、 遠心分離また は濾過することにより沈殺物を回収し、 凍結乾燥することに より酵素標品を得ることができる。
    [0064] リ パーゼの性質
    [0065] こう して精製された本リパーゼの諸性質は次の通りである (1) 基質特異性
    [0066] 広範西の油脂、 例えばォリ ーブ油、 ヤシ油、 ヒマシ油 などの植物油、 牛脂などの動物油脂、 および ト リ プチリ ン等水溶性脂質を加水分解する。
    [0067] 種々の油脂を基質として使用した場合の本酵素のリパ ーゼ活性を、 オリ ーブ油を基質として使用した場合のリ バーゼ活性（100 % ) に対する相対活性として第 1図に示 し、 種々のグリセライ ドを基質として使用した場合の本 酵素のリバーゼ活性を、 ト リ オ レイ ンを基質として使用 した場合のリパーゼ活性（100 % ) に対する相対活性とし て第 2図に示す。
    [0068] (2) 至適 p Hおよび安定 p H範囲
    [0069] 本リパーゼは第 3図に示す通り ρ H 4. 5 〜 10 . 5の範囲 で活性を示し、 至適 P Hは 7. 5 〜 8. 0 と弱アルカリ側で ある。
    [0070] 種々の緩衝液中で 4 で、 2 4時間保持したときの残存 リパーゼ活性を第 4図に示す。 本酵素は p H 4より酸性 側および P H 1 1以上のアルカ リ側で不活性化され、 P H 5 〜 ρ Η 1 0の範囲では安定に維持される。
    [0071] (3) 至適温度および安定温度範囲
    [0072] 本リパ一ゼは第 5図に示す通り、 20〜45 'cの範囲で活 性を示し、 至適温度は 30〜35でである。
    [0073] 各温度で 3 0分間処理したときの残存リパーゼ活性は 第 6図に示す通りである。 3 0分間処理では 4 5 でまで 安定である。
    [0074] (4) 阻害および活性化
    [0075] 2価金属イ オ ン、 S H試薬、 及び界面活性剤のリ パー ゼ活性に及ぼす影響を、 処理後の残存リパーゼ活性を測 定して求めた阻害度により調べた。 1 0 mMの Ca2+ , Mn2+ , Mg2+ , Cu2+ , Zn2+ ' 及び l mMの Fe2 + などではいずれも阻害はみ.られない。 Ca2+ の存在によ り リバーゼ活性は 3〜 5倍程度活性化される。
    [0076] また 2 mMラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウム （ S D S ) 、 2 m M ョ ー ドアセ トア ミ ド、 0. 1 %のッウ ィ ー ン 2 0、 0. 1 % ッウ ィ ー ン 8 0、 0. 1 % ト ラ イ ト ン X — 100 によ り リ ノ、' ーゼ活性が 9 0 %以上阻害される。
    [0077] (5) 分子量
    [0078] S D S —ボリアク リ ルア ミ ドゲル電気泳動法およびゲ ル濾過法により求めた分子量は約 128, 000 である。
    [0079] (6) 等電点
    [0080] キ ャ リ アーア ンホ ラ イ ン （ L K B製） を用いた等電点 電気泳動法により求めた等電点は 3. 9 ± 0. 1 ある。
    [0081] (7) ァ ミ ノ酸組成
    [0082] 次の表の通りである。
    [0083] ア ミノ酸 モル比 残基数
    [0084] A s 1 3. 3 1 5 5
    [0085] T h r 6. 6 7 7
    [0086] S e r 8. 0 9 3
    [0087] G 1 u 1 2. 5 1 6
    [0088] G 1 y 7. 5 8 8
    [0089] A 1 a 7. 3 8 5
    [0090] V a 1 8. 2 9 6
    [0091] M e t 1. 8 2 1
    [0092] I 1 e 7. 7 9 0
    [0093] L e u 4. 6 5 4
    [0094] T y r 1. 1 1 3
    [0095] P h e 4. 8 5 6.
    [0096] L y s 1 1. 6 1 3 5
    [0097] H i s 1. 2 1 4
    [0098] A r g 1. 5 1 7
    [0099] P r o 2. 0 2 3
    [0100] ½ Cys 0. 4 5
    [0101] T r p 1. 1 2
    [0102] (8) リ ボプロティ ン リ ノ、'ーゼ活性
    [0103] リパーゼ活性を有すると同時にリ ポプロティ ン リパ ゼ活性をも有する。
    [0104] リバーゼ活性の測定法
    [0105] 次にリバーゼ活性の測定法は次の通りである。 試験管 （ 25 x 200mra)中 2 5 m M Tris- H C & 緩衝液
    [0106] ( pH 8. 0 ) / 1 0 m M CaC SL 2 5 m J2 の反応媒体にォ リ ーブ油 1 m を添加し、 ミキサーで激しく攪拌し、 酵 素液 0. 5 m£ を加える。 この試験管を毎分 300回転の速 度で往復振とう しながら 3 0 'C にて 3 0分間反応を行う。 その後、 2 0 m のエタノ ールを加えて反応を止め、 生 成脂肪酸を 0.05 N水酸化ナ ト リ ウム水溶液で滴定する。 比較値は上記組成の反応液にエタノ ールを加えた後に酵 素液を加えたものを同様に滴定して求める。
    [0107] リパーゼ活性の単位（Uni t)は、 国際生化学連合（I.U.B.) の酵素委員会の提案に従い、 上記の反応条件で 1分間に 1 moleの脂肪酸を遊離する活性を 1 Unitと定める。
    [0108] 次に、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
    [0109] 実施例 1.
    [0110] グルコ ース 0. 1 %、 酵母エキス 0. 5 %、 ボリ ペプ ト ン 1 %
    [0111] (ペプ ト ン ： 武田薬品製） 及び NaC 0. 5 %から成る液体培 地 （ p H 7. 0 ) にスタ フ イ ロ コ ッ カ ス ' キ ヤ ビテ イ ス T — 1 - 1株 （FEBM P - 7723) を接種し、 3 0 'c にて 1 8時間振と う培養して種菌とした。
    [0112] A F F ペプ ト ン （大豆蛋白加水分解物 ； 味の素 K . K . 製）
    [0113] 1 0 %及び NaC 0. 5 %から成る液体培地 （ p H 6. 3 ) lOOm^ を 500 m g 容坂ロフ ラスコ に分注し、 滅菌し、 この培地に、 1容量％の前記種菌を接種し、 3 0 'C にて 300回ノ分の往復 振とう機を用いて 2 日間振とう培養した。
    [0114] 培養液を集め、 遠心分離によって菌体を除去し、 上澄液を 得た。 この上澄液のリバーゼ活性を測定したところ 10.3 U Z mil であった。 この酵素液 1360πι£ について硫安塩折を行な い、 生じた沈殺区分を遠心分離することにより集め、 2 0 m MTris— H C 緩衝液 （ p H 7. 0 ) .中で一夜透圻を行った後、 同緩衝液で平衡化した DEAE—セルロ ース力ラムを用いてクロ マ トグラフィ ー （ワ ッ トマン製 ； 036 X 210mm)に付し 0 Mか ら 1 Mまでの NaC グラジェン ト溶出を行った。 0. 4 〜 0. 5 NaC£ で本リパーゼが溶出された。 活性画分を適当に濃縮 後、 lOOmMTris— H C 緩衝液 （ p H 8. 0 ) / 100m M NaC£ で平衡化した Ultrogel AcA 34力 ラムク ロマ ト グラ フ ィ ー
    [0115] ( L K B製 ； ø 25 X 440mm)に付し、 再ク ロマ ト グラ フ ィ ーを 行う ことにより電気泳動的に単一な酵素標品を得ることがで きた。 上記精製過程での比活性 （m g蛋白質当りの活性） は 136.2 U/m gであり、 回収率は 3 4 %であった。
    [0116] 実施例 2.
    [0117] 実施例 1 に示したのと同様にして得た、 培養物の上澄液を 限外濾過 （日本ミ リ ポア製、 ペリ コ ンラボカセ ッ ト ； 分子量 10, 000限外濾過膜 PTGC 0LC 05) により濃縮した後、 濃縮液 を 2 0 -m MTris— H C 緩衝液 （ p H 7. 0 ) で平衡化した DEAE—セルロースカラムを用いるク ロマ トグラフィ 一に付し、 以下実施例 1 に示した方法で精製を行い電気泳動的に単一な 酵素標品を得ることができた。
    [0118] 実施例 3.
    [0119] A F F ペプ ト ン 5 %、 及び NaC 0. 5 %から成る液体培地 ( p H 6. 3 ) 7 £を 1 4 容ジャ ーフ ア ーメ ンタ一 〔ニュ ー ' ブルンスウ イ ッ ク · サイ ェ ンティ フ ィ フ ク （NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC) 社製〕 に入れて殺菌し、 培地を調製した。
    [0120] 実施例 1 の場合と同様にして培養した種菌 〔スタフイ ロコ ッ カス · キ ヤ ビテイ ス T — 1 — 1 (FERM P-7723) 〕 200 m& を上記の培地に接種し、 培養温度 3 0 で、 攪拌数 300r.p.nt.、 通気量 2. 0 v.v.m にて 2 4時間培養を行った。 培養液を遠心 分離して菌体を除き、 限外濾過 （日本ミ リ ボア製、 ペリ コ ン ラボカセ ッ ト分子量 10, 000限外濾過膜、 PTGC 0LC 05)によ り 4倍濃縮し、 この濃縮液を塩酸を用いて P H 3. 9に調整し、 坻温 （ 4でが好ましい） に 2時間放置した後、 生じた沈緵物 を遠心分離または濾過により回収し溶解した後凍結乾燥する こ とによ り精製酵素寧品を得た。 上記精製過程での比活性 (mg蛋白質当りの活性） は 87.0 Uノ m gであり、 回収率は 2 8 %であった。
    [0121] 実施例 4.
    [0122] 2 5 m MTris - E C £ 緩衝液 （ p H 8. 0 ) ノ 1 0 m M CaC & z 2 £ に基質ト リ オ レイ ン （ 9 9 %純度、 半并化学） 1 0 μ & を加え、 これに酵素を総活性として 3 Uとなるよう に実施例 1で得られた酵素標品を添加し、 3 0 'C にて反応を 行った。 また、 比較のため市販のリ ゾプス · アルヒズス
    [0123] (Rhizopus arrhizus)由来の リ パ—ゼ、 キ ャ ンディ ダ · シ リ ン ドラセ一（Candida cyl indracea) 由来のリ ノ、'ーゼ、 及び ー ドモナス · sp> (Pseudomonas sp,)由来のリ ノ、'一セを用 いて同様の反応を行った。
    [0124] 反応中、 1 0分、 3 0分、 6 0分、 及び 120分後にサ ンプ ルを 100 ^ " 採取し、 クロ口ホルム 100 £ により生成物を 抽出し、 そして抽出液 1 μ Ά をシリ カゲル薄層ク ロマ トグラ フィ 一により分折し反応生成物を同定した。
    [0125] この薄層ク ロマ トグラフ系は次の通り とした。
    [0126] 溶媒系 ： ク ロロホルムノアセ ト ン （ 9 6 : 4 ) 。
    [0127] 発 色 ： 1 % C e( S 0 *)ノ 1 0 % H2S04.加熱。
    [0128] 薄層扳 ： シリ カゲル Kieselgel 60 F 254 (Merk社製） 。
    [0129] この結果を第 7図に示す。 この図から明らかな通り、 リゾ ブス （糸状菌） 由来のリパーゼ、 キャ ンディダ （酵母） 由来 のリノ、'ーゼ、 及びシユー ドモナス （細菌） 由来のリバーゼを 用いた場合には、 いずれの反応時間においてもジグリ セリ ド である 1 , 3 —ジォレイ ン及び 1 , 2 — ( 2 , 3 ) -ジォレ イ ン、 並びにモノ ダリ セリ ドであるモノ ォ レイ ンが生成し、 これらは反応時間の経過と共にむしろ増加する傾向を示した, 他方本発明のリパーゼを用いた場合には、 全反応時間にわた つてモノ ォレイ ン及びジォ レイ ンは検出されず、 ォ レイ ン酸 のみが生成した。
    [0130] 実施例 5.
    [0131] 実施例 1 で得られた酵素標品を用いて ト リ オ レイ ン、 ジォ レイ ン及びモノ ォレイ ンを基質として酵素反応を行い、 その 反応生成物をシリ カゲル薄層ク ロマ トグラフ ィ ーで同定した この同定においては、 I m i の 2 5 m MTris - H C £ 緩衝液 ( P H 8. 0 ) ノ 1 0 m M CaC & 2 から成る 3つの反応媒体に それぞれ 7. の ト リ オ レイ ン （ 9 9 %純度） 、 5 £ の ジォ レイ ン （ 9 9 %純度） 、 及び 3 のモノォ レイ ン ( 9 9 %純度） を加え、 次に、 それぞれの媒体に酵素液を加 えて総活性を 3 Uとした。 3 0 'cにて 6 0分間同条件で反応 させた後、 クロ口ホルムにより抽出し、 この抽出液を、 実施 例 4の場合と同様にしてシリ カゲル薄層クロマ トグラフィ ー に付した。 この結果を第 8図に示す。 図から明らかな通り、 いずれの基質からもォレイ ン酸のみが生じた。
    [0132] 実施例 6.
    [0133] 1 0 % A F Fペプ ト ン培地 （実施例 1参照のこと） に 1 % のオリ ーブ油を加え、 次の菌株を接種して 3 0 でにて、 3 日 間振とう培養した。
    [0134] (1) スタ フ イ ロ コ ッ カス （ S t . ) キ ヤ ビテ イ ス
    [0135] ATCC 27840
    [0136] (2) S t .キ ヤ ビテ イ ス ATCC 27841
    [0137] (3) S t .キ ヤ ピテ イ ス ATCC 27842
    [0138] (4) S t .キ ヤ ビテ イ ス ATCC 27843
    [0139] (5) S t .キ ヤ ビテ イ ス T - 1 - 1 FE il P 77.23
    [0140] (FERM BP - 834) 培養後、 遠心分離により菌体を除去し、 上澄液を得、 これ を酵素液として使用した の酵素液のリパーゼカ価は次の 通りであった。
    [0141] Να 菌 株 リバ一ゼ活性（U/m )
    [0142] 1 スタフ ·ί πηクカス ·キヤビテイス 1 1. 7
    [0143] ATCC 27840
    [0144] 2 " A TCC 27841 1 3. 5
    [0145] 3 〃 ATCC 27842 4. 6
    [0146] 4 〃 ATCC 27843 1 2. 4
    [0147] 5 " T - 1 - 1 6. 1 この酵素液を、 Tr i s— H C 緩衝液 （ p H 8. 0 、 / 1 0 mM CaC & z ) により、 リ ノヽ'ーゼカ価が 3 Uノ m £ となるように 稀釈した溶液 l m に、 ト リ オ レイ ン 1 0 β Ά / & を加え て 3 0 'C にて振とう し、 0分、 1 0分、 3 0分、 6 0分、 及 び 120分後に 100 // ずつサ ンプルを採取し、 これをクロ口 ホルム 100 £ で抽出し、 クロ口ホルム層 2 £ を例 3に記 載した薄層クロマ トグラフィ ーにより分折した。 この結果を 第 9図に示す。 図から明らかな通り、 いずれの菌株に由来す る酵素液を使用した場合にも、 反応液中にモノォレイ ン及び ジォレイ ンは検出されなかった。 産業上の利用可能性
    [0148] この発明は ト リ グリ セライ ドを実質上完全に脂肪酸とグリ セリ ンに分解する リバーゼを工業的に製造するために有用で あり、 このリバ―ゼは油脂類を加水分解して経済的に脂肪酸 を製造するために有用である。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1. スタ フ イ ロコ ッ カス . キ ヤ ビテ イ ス (Staphylococcus capitis) に属し、 リバーゼ生産能を有する微生物を培養培 地に培養し、 培地中に該リバーゼを蓄積せしめ、 該培地から 該リパーゼを採取することを特徴とする新規リパーゼの製造 方法。
    2. 前記リパーゼが微アルカ リ域に至適 P Hを有し、 ト リ' グリセリ ドを実質上完全に脂肪酸およびグリセリ ンに変換す る酵素である請求の範囲第 1項記載の製造方法。
    3. 前記スタ フイ ロコ ッカス ♦ キ ヤ ピテ ィ.ス (Staphyloco- ccus capitis) 力 スタ フ ィ ロ コ ッカス · キ ヤ ビテ イ ス
    (Staphylococcus capitis) T— 1 — 1 (SAM 0001) (FERM P- 7723) (FERM BP-834)である請求の範囲第 1項記載の方法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0187869A1|1986-07-23|
    EP0187869A4|1988-07-14|
    JPS6128387A|1986-02-08|
    US4791059A|1988-12-13|
    JPH0480676B2|1992-12-21|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-02-13| AK| Designated states|Designated state(s): US |
    1986-02-13| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1986-03-14| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1985903698 Country of ref document: EP |
    1986-07-23| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1985903698 Country of ref document: EP |
    1990-11-15| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1985903698 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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