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    公开号:WO1985003942A1
    申请号:PCT/JP1984/000305
    申请日:1984-06-12
    公开日:1985-09-12
    发明作者:Kazuhiko Yamanishi；Akinori Shintani；Satoru Okajima；Toshiro Hanada
    申请人:Wako Pure Chemical Industries Ltd.；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 ·
    [0002] ト リ フ エ - ルメ タ ン誘導体及び該化合物を発色成分とする酸化 性物質の定量法
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 5 本発明は、 ト リ フ X ニ ルメ タ ン誘導体、 該化合物を発色成分と する酸化性物質の定量法及び呈色妨害物質の影響を回避した酸化 性物質の定量法並びに発色感度の調節を可能と した酸化性物質の 定量法に関するものである。 '
    [0005] 背 景 技 術
    [0006] 10 血液や尿 どの体液成分を測定することは、 その変動が疾病と 大き く関連しているため、 疾患の診断、 病態の解明、 治療経過の 判定を行 う上で、 重要なものと ¾つている。 例えば、 血液中の コ レステ ロ ール、 卜 リ ク ' リ セ ラ イ ド、 グルコ ース、 尿酸、 モノ ア ミ ンォキ シダーゼ、 胆汁酸などを始め、 非常に多種類の微量成分 の測定法が開発されてお 、 疾病の診断上役立っていることは周 知の通 である。
    [0007] 現在、 血清成分の測定法と しては、 目的成分に特異的に作用す る酵素を用いて酵素反応を行 い、 これによる生成物を測定して 目的成分量を求める、 いわゆる "酵素法"が一般に広く普及して ∞いる。 例えば被酸化性呈色試薬をペルォキシダーゼ様物質と酸化 性物質とで酸化させて発色系に導く方法、 なかでも、 H202 生成 酵素、 例えば、 才キ シダーゼを働かせて目的成分量に枏当する、 H202 を生成させ、 これをペルォキシダーゼと発色成分である被 酸化性呈色試藥を用いて発色系に導き、 比色定量することによ5 目的成分量を求める方法が、 被酸化性呈色試薬の開発と相まって 増力!！しつつある。 例えば、 コ レ ス テ ロ ー ル一コ レ ス テ ロ ー ルォキ シダーゼ、 グルコ ース一グルコ ースォキシダ一ゼ、 ト リ グ リ セ ラ ィ ドーリポプロティ ンリパーゼーグリ セロールォキシダーゼ、 尿 酸ーゥ リ 力一ゼなどの組合せによ D発生する H20 2 を、 ペルォキ シダーゼと被漦化性呈色試薬とを用いて発色系に導き、 その呈色 を光度計を用いて測定することによ 目的成分量を求める方法で ある。 血清中のこれらの成分濃度は、 当然のことながら成分の種 類によ 異¾ ため、 酵素反 ISによ 生成する H202 量もさまざ まである。 したがって、 夫々 目的に応じた感度の被酸化性呈色試 藥が開発され、 使用されている。 例えば、 コ レステ ロ ール、 ト リ グリ セ ラ イ ド、 グルコ ース、 尿酸等の測定に於いては、 4一 T ミ ノ アンチ ピ リ ン と、 フ エ ノ ール系化合物若しくは N ， N—ジアル キルァニリ ン系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬が一般に用 いられている。
    [0008] —方体液成分の中には、 モノアミ ンォキシダーゼゃ胆汁酸のよ t うに、 正常血清中には極く微量しか含まれてい ¾いものもある。 即ち、 モノ ア ミ ンォキシダーゼは、 モノ ア ミ ン化合物に作用して、 H20 2 とアルデヒ ドとを生成させる酵素であるが、 血清中の濃度 が超微量であるため、 生成する H 202 も超微量とな！）、 これを定 量するには、 上記の如き組合せの被酸化性呈色試薬では感度不足 であるので、 よ！）高感度の被酸化性呈色試薬が必要とされている。 しかして現在、 高感度の被酸化性呈色試薬と してロイコメチレン ブル一誘導体を用いる測定法が開発され、 商品化されているが、 このロイ コ色素は、 溶液状態での安定性に問題があ 、 これを含 む発色試薬は、 保存中に徐々に着色が進行してくるという欠点を 有している。
    [0009] また他に、 同様の目的で、 本発明と同じ ト リ フ エ ニ ルメ タ ン系 ロ イ コ色素であるロ イ コ ク リ ス タ ル ノ ィ ォ レツ トゃロ イ コ マ ラ カ ィ トグリー ン等も、 高感度被酸化性呈色試薬と して研究されてい るカ^ これらはいずれも中性付近では水に難溶であ ] 、 所望の濃 度に溶解させるのが困難 為、 微量成分の測定には適さ い。
    [0010] また、 この欠点を改良したロイ コ色素として、 ビス （ 4 —ジェ チルァ ミ ノ フ エ -ル） 一 2 —スルホ フ エ - ルメ タ ン （以後、
    [0011] B S P Mと略称する） が提案されている （特開昭 5 6— 2 6 1 9 9号 公報） が、 これとて水に対する溶解性は必ずしも充分であるとは いえ い。
    [0012] 従って本発明は、 中性付近での水に対する溶解性に優れ、 しか も水溶液が長時間安定であ Ϊ)、 また発色の感度が高く且つ呈色が 安定であると共に、 更にはよ ] 長波長側に吸収を有する呈色を示 し、 そのため血清成分の影響を受けにくい新規発色試薬を提供す ることを目的とするものである。
    [0013] また本発明は、 この発色試薬を使用する酸化性物質の定量法を 提供することを目的にしている。
    [0014] 更に本発明は、 呈色妨害物質の影響を回避した酸化性物質の定 量法を提供することを目的と している。
    [0015] 本発明は、 他に発色感度の調節を可能と した酸化性物質の定量 法を提供することを目的とする。
    [0016] :発 明 の 開 示
    [0017] 本発明は下記一般式〔 I 〕 ：
    [0018] ΟΜΡΓ c I 〕
    [0019] 〔式中、 R»i 、 R2 、 R3 及び E>4 は低級アルキル基を表わし、 夫々同じであっても異なっていても よ く、 Xi 及び X2 はどちら も一 0 (CH2)nS03M (但し、 Mは水素原子、 アルカ リ金属イ オン または NH4 + を示し、 nは 2〜4の整数を示す。 ） を表わすか、 またはどちらか一方が一 0 (CH nSOsM (伹し、 Μ、 ηは前記と 同じ） を表わし、 他方が水素原子を表わす。〕で表わされる新規ト リ フ エ -ノレメ タ ン誘導体及び該化合物を発色成分とする酸化性物 質の定量法の発明である。
    [0020] 上記一般式〔 I 〕で表わされる本発明の ト リ フ X ニルメ タ ン誘 導体に於いて、 Β 〜！ は、 メ チル、 ェチル、 プロ ピル等の低 級ァルキル基を表わし、 夫々同じであっても異¾つていてもよ く、
    [0021] Xi 、 2 で表わされる一 0(CH2)nS03M に於ける Mは水素原 子または Na+、 K+、 Li+ 等のアルカ リ金属ィオンまたは NH4 + で あ ] 、 nは 2、 3または 4である。
    [0022] 上記一般式〔 I 〕で表わされる本発明の ト リ フ ヱ ニルメ タ ン誘 導体は、 文献未記載の新規化合物であると信じられているが、 一 般に次の方法によって製造することができる。
    [0023] 即ち、 例えばビス （ 4— N ， N—ジェチルァ ミ ノ フ エ -ノレ ） 一 3 ， 4ージソ ジゥ ムスルホプロボキシフ エ ニルメ タ ンの場合、 ブ 口 ト カテキユ ア ノレデヒ ドとブロ ノ ンサル ト ンとを、 メ チノレセ ロ ソ ルブまたはェチルセ口ソルブ等の有機溶媒中、 苛性ソーダま ナ ト リ ゥ ム アルコ ラ一 卜等のアル力 リの存在下で加熱反応させ、 反応終了後、 冷却、 晶析、 溶媒注人、 濾取、 洗浄等の通常の後処 理操作を行ない、 要すれば力 ラ ムクロマ 卜グラ フィ等によ ] 精製 して、 3 , 4 -ジソ ジゥム スルホ ブロボキ シベ ンズァルデヒ ドを得、 次いで、 これと N ， N—ジェチルァ - リ ンとをメチルセ口 ソ ルブ またはェチルセ 口 ソ ルブ等の有機溶媒中、 塩化亜鉛等の触媒の存 在下に加熱反応させた後常法によ 後処理を行ない、 カ ラ ムクロ マ トグラ フィ 一等によ ] 精製して目的物を得る。 一般式〔 I 〕に 含まれる他の化合物についても同様にして製造することができる。
    [0024] 上記一般式〔 I 〕 で表わされる本発明の ト リ フヱ -ルメ タ ン系 ロ イ コ色素は、 公知の ト リ フ ヱ ニルメ タ ン系口 ィ コ色素である口 イ コ マ ラ カ イ ト グ リ ー ン、 ロ イ コ ク リ ス タ ルバイ オ レ ッ ト等の欠 点である中性付近での水に対する溶解性を改善する目的で、 本発 明者らが新たに創造したも のであ ] 、 可溶基と して一 0(CH2)nS(¾M (但し、 M、 nは前記と同じ） る基を導人した点に大きな特徴 を有する。
    [0025] 即ち、 前記従来技術の B S P Mは、 卜 リ フ エニルメ タ ン系ロイ コ色素の水に対する溶解性を改善する目的で、 ベンゼン核にス ル ホ ン基を 1つ導人した ト リ フ ヱ ニ ルメ タ ン誘導体であるが、 pH 7. 2に於ける溶解度が 0. 5 m Mと未だ中性付近での水に対する溶 解性が十分であるとはいえず、 また、 ベンゼン核にス ルホ ン基を一 2つ導人したビス （ 4 —ジェチルァ ミ ノ フ エ ニ ル） 一 2 ， 4ージ ス ルホ フ エ - ルメ タ ンの場合は、 水に対する容解性は明らかに改 善されるが、 酸化還元電位が高い為、 ' H20 2 — P 0 D (ペルォキ シダーゼ） 系では酸化されず、 それ故呈色し い。 従って、 酵素 を用いて H202を生成させこれを発色系に導く ことによ 、 巨的 成分の測定を行 う体液成分の測定法には、 この化合物は使用し 得ない。
    [0026] これに対し、 本発明の ト リ フ ヱ -ルメ タ ン誘導体は、" 0(p¾ S(¾M 5 (但し、 M、 nは前記と同じ） で表わされる基が 1つついたもの、 例えば、 ビス （4— N ， N—ジェチノレア ミ ノ フ エ 二ノレ） 一 4—ソ ジゥム スルホプロボキシメ タ ン （以後 B S p r 0 P Mと略称する） でも、 中性付近 （PH 7.2) での水に対する溶解度が前記
    [0027] の 1 0倍の 5 mMであ ] 、 2つついたもの、 例えば、 ビ ス （4一0 " ， N—ジェチルァ ミ ノ フ エ -ノレ） ― 3 ， 4ージソ ジゥ ム スルホ ブロポキシ フヱ -ルメ タ ン （以後 B S d i p r o PMと略称する） では、 更に溶解性が良好とな ]9、 3 0倍以上 （ 1 5 mM以上） も の溶解度を示す。 しかも一 0(CH2 )nSO3M (但し M、 nは前記 と同じ） で表わされる基が 2つついた本発明の ト リ フ ヱ -ルメ タ sン誘導体は、 極めて意外ることに、 ス ルホ ン基がベンゼン核に直 接 2つついた ト リ フ ニルメ タ ン誘導体の場合と異 、 H202 -P 0 D系での酸化呈色が極めて良好であり、 所期の巨的に充分 使用し得る。
    [0028] 本発明のロイ コ色素は、 溶液状態でも極めて安定であ ）、 従来
    [0029] 20のロイ コメチ レンブルー誘導体の水溶液が、 室温では数時間で使 用不能と ¾るのに対し、 本発明の口ィ コ色素の水溶液は、 2 4時 間保存後も何ら変化を受けず、 発色成分として極めて有用である。
    [0030] 本発明のロイ コ色素は、 その発色感度がいずれも 8 0，0 0 0以 上と高く、 また一様に長波長側、 即ち 6 0 0〜7 0 0 n mにス max を有しているため、 ヘモグロ ビ ン、 ピリ ルビ ン等の妨害を受けに
    [0031] OMPI くい。
    [0032] また、 本発明色素による呈色は極めて安定であ] 、 褪色は殆ど 認められない。
    [0033] 本発明のト リ フ - ニルメタン誘導体は、 上記したように多くの 利点を有しているので、 H2 02 のよ う 酸化性物質とペルォキシ ダーゼ若しくはへモグロ ビンのようなペルォキ シダーゼ様物質と で該ト リ フ エ -ルメタン誘導体を酸化し発色系に導く ことによ ] 目的成分を定量する公知の方法例えば、 血液や尿などの体液成分 の酵素法（ H202 生成系）による測定や血清中のへモグロ ビンを H202 若しくは過硼素酸ナ ト リ ウ ムのよ うな酸化性物質を用いて 測定する場合 ¾どに、 極めて有効に用いることができる。
    [0034] 一般に、 ト リ フ ヱ ニルメ タ ン系の被酸化性呈色試薬（ ト リ フ ヱ -ルメ タ ン系ロ イ コ色素）は、 尿酸及びタ ンパクによる呈色阻害 を受けるが、 本発明者等は、 本発明の実施に際して、 この内の尿 酸の影響はゥ リ カーゼを共存させることによ 回避でき （ この場 合、 尿酸は H202 の生成を伴わずに分解できる ）、 また、 タ ンパ クの影響は金属キレ ー トや特定の界面活性剤の添加によって回避 できることを見出し、 呈色阻害物質の影響を回避した酸化性物質 の測定法の発明を完成した。
    [0035] それ故、 本発明のロ イ コ色素は、 酸ゃタンパクを含む血清や尿
    [0036] ¾どの体液中の化学的成分の酵素法（ H202 生成系） による測定 に於 ても、 全く支障なく使用できる。
    [0037] 本発明の ト リ フ - -ルメ タ ン系ロ イ コ色素を発色成分と して用 いた酵素法（ H202 生成系） による測定に於いて、 測定可能 体 液中の化学的成分と しては、 例えばグルコ ー ス、 遊離コ レ ステロ —ル、 総コレ ステロ一 ノレ、 H D L (高比重リ ポタ ンパ ク） ー コ レ ステロール、 L D L (低比重リポ タ ンパク） 一コレステロ一ノレ、 卜 リ グリ セラ イ ド、 リ ン脂質、 尿酸、 モノアミ ンォキシダーゼ等、 従来酵素法 （H202生成系） で測定されている項目はすべて挙げ られる （但し、 尿酸については、 あらかじめ尿酸にゥ リ カ ーゼを 作用させて H202を生成させた後、 本発明の発色成分をペルォキ シタ'ーゼと共に添加し、 呈色させる必要がある） が、 就中、 モノ アミ ノ キ シダーゼや胆汁酸等、 体液中に極ぐ微量しか含まれてい
    [0038] い成分の測定や血清中のへモグロ ビ ンを H202を用いて測定す る場合るどに特に適している。
    [0039] 本発明の方法を血清'について実施する場合は、 本発明に係る ト リ フ エニルメ タン系被酸化性呈色試薬の濃度は 0.0 1 mMW上で あれば使用可能であるが、 通常は 0.0 2〜 0.3 mMの濃度が好ま しく用いられる。
    [0040] 本発明に於いて用いられる、 タ ンパクの妨害を除く効果のある 界面活性剤と しては、 一般にァニオン系界面活性剤、 特に次式 〔 I 〕 ：
    [0041] R5 V— 0 (CH2CH20)k SO3M5 〔 I 〕 または次式〔 n 〕 ：
    [0042] R60 (CH2OT20 S03M6 I ]
    [0043] (式中 R5 は炭素原子数 8または 9のアルキル基を表わし、 R6 は炭素原子数 8〜 1 8のアルキル基を表わし、 M5 及び M6 は夫 夫アルカ リ金属イ オ ン、 ア ンモ- ゥ ム イ オンまたは第 4級アンモ ニ ゥ ム イ オンを表わし、 そして k及び は夫々 1〜 6の整数を表 わす。 ） で表わされるァニオン系界面活性剤が有効である。 この
    [0044] OMPI よ う ものの具体例と しては、 一般式 [Π]に該当するものと して、 エ マ ー ル N C (ホ。 リ 才キ シエチ レンァ ノレキノレ フ ェ ニ ル エ ー テ ル硫 酸ナ ト リ ウム ：花王石鹼㈱の商品名） 、 ニッ コ ー ル 5 6 0 S F (ボ リ 才キシエチ レン ノ ルフ エ 二 ルェ —テル硫酸ア ンモニ ゥ ム ： 日 本乳化剤㈱の商品名） 、 ニ ッ コ ー ル S N P— 4 T (ポ リ オキ シェ チ レンノ エルフ エ ニルエーテル硫酸ト リ エ タ ノ ールア ミ ン ： 日本 乳化剤㈱の商品名） 等が、 一般式 onに該当するものと して、 エマ ール 2 0 C (ポ リ オキシエチ レンアルキ ルエーテル硫驟ナ 卜 リ ゥ ム ：花王石鹼㈱の商品名） 、 サンノ ー ル 6 0 5 D (ポ リ オキシェ チ レンアルキルエ ーテル硫酸ナ ト リ ゥ 厶 ： ラ イ オン の商品名）、 ニ ッ コ ール N E S— 3 0 3 (ポ リ オキシエチ レンアルキルエーテ ル硫酸ト リ エ タノ ールァ ミ ン ： 日光ケ ミ カ ルズ㈱の商品名） 等が 挙げられるが、 これらに限定されないことはいうまでもるい。 こ れら界面活性剤は通常、 発色試液中正味 0. 0 1 〜 1 0 の濃度に るる量で闬いられる。
    [0045] また、 タ ンパ クの妨害を除く効果のある金属キ レー ト化合物と しては、 一般に金属一 E D T A (エチ レンジァミ ン四酢酸） キ レ 一 卜が有効に用いられる。 このよ う ¾ものと しては、 例えば F e ( I ) 一 E D T A、 M n ( I ) — E D T A、 N i ( Π ) - EDTA 等が挙げられるが、 これらに限られず、 通常市販されている金属
    [0046] E D T Aキレ ー トは全て使用できる。 これら金属キレ ー ト化合物 の添加量は 0. 0 0 5 %以上であれば効果が認められるが、 通常は 0. 0 1 〜 0. 5 %が好ま しく用いられる。
    [0047] —方、 本発明に於いて、 尿酸の妨害を回避する為に用いるゥ リ 力一ゼは、 尿酸の酸化酵素であって、 通常、 尿酸に作用してこれ をアラ ン ト ィ ンと過酸化水素と炭酸ガス とに変えるが、 本発明に 於いては、 ト リ フ エニルメ タ ン誘導体及びペ ルォキシダ一ゼの存 在下尿酸にゥ リ 力ーゼを作用させることによ ] 3、 過酸化水素の生 成を伴わずにこれを分解することができる。 そのため、 ト リ フエ-ルメ タ ン系ロ イ コ色素が尿酸の分解によって生ずる過酸化水素 によ ] 酸化されて発色することは全くる く、 妨害物質である屎酸 を極めて容易に且つ効果的に除く ことができる。 ゥ リ カーゼの添 加量は、 一般に 5 0 以上であればよいが、 通常は 1 0 0 〜 5 0 0 U Z ^の範囲が好ましく用いられる。 即ち、 尿酸の妨害を 除くには、 尿酸.を含有する試料に、 例えば ΡΗ 6 〜 8の緩衝液中 にト リ フエニ ルメ タ ン系ロイ コ色素 0. 0 1 〜 0. 3 m mo l ^ 、 ゥ リ カーゼ 5 〜 5 0 0 U Z 、 ペ ルォキシダーゼ 1 0 0 〜
    [0048] 1 0, 0 0 0 U / ^及び要すれば適当量の界面活性剤を含む試液を 加えれば、 尿酸は直ちに分解される。 しかもその際過酸化水素は 生成せず、 従って、 それによる ト リ フ - ルメ タ ン系ロイ コ色素 の発色も全く ¾い。 分解された尿酸は、 ァロキサンまたはその分 解生成物と尿酸に変っていることが推測される力 、 いずれにして も、 このよ うに H 20 .2の発生を伴わずに尿酸がゥ リ カーゼによ ] 分解されるという よ うな文献記載はこれまでには見出されていな い。 かかる現象は他の被酸化性呈色試案には全く認められず、 卜 リ フヱ二ノレメ タ ン系ロイ コ色素に特有の効杲であることを本発明 者らが初めて見出したのであるが、 通常のゥ リ カーゼの尿酸に対 する酵素作用とは全ぐ異なった働きをゥ リ カーゼに誘起させるも のであ 全く予想外のことである。
    [0049] 通常、 血清中にはタ ンパクと尿酸の両方が存在しているので、 血清中の成分を ト リ フ エ ニルメ タ ン系ロイ コ色素を発色剤と して 酵素法 （H202— P O D系） によ 測定する場合や、 血清中のへ モグロ ビ ンを H202系で測定する場合などは、 本発明に係るァ- ォ ン系界面活性剤または金属キ レート化合物と ゥ リ カ ーゼの両者 を併用することによ 、 タ ンパ ク及び尿酸のいずれの妨害をも回 避でき、 よ 正確な測定値を容易に得ることができる。
    [0050] 本発明の呈色阻害物質の影響を回避した定量法の発明に於いて、 発色剤と して用いられる ト リ フエニルメ タ ン系ロイ コ色素は、 前 記一般式 Π]で表わされる化合物に限られず、 発色剤と して用い得 る殆ど ての ト リ フ エニルメ タ ン系口 ィ コ色素が使用可能である が、 通常、 次式〔 IV 〕 ：
    [0051] 〔 IV 〕
    [0052] 〔式中、 Ri 、 R2 、 R3 及び R4 は、 水素または低級アルキ ル基を表わし、 夫々同じであっても異なっていてもよ く、 X 及 び X は水素、 一 S03M 、 - — 0(CH2)m'S03M 、 -0 (CH2)n /COOM4 / または一 N (R5) (R ) (但し、 Μ^ Μ Μ3'及び Μ は水素原子、 アルカ リ金属ィ オ ンまたは ΝΗ4 + を示 し、 及び は互いに独立して水素原子または低級アルキル 基を示し、 及び は夫々 2〜 4 の整数を示す。 ） を表わし、 夫 々同じであっても異なっていても よい。 〕で表わされる化合物が 多く用いられる。
    [0053] このよ う ものの具体例と しては、 例えばロイ コク リ ス タ ルハ
    [0054] OMPI
    [0055] , い ィ ォ レ ッ ト、ロ イ コ マ ラ カ イ トグリー ンや前記 B S P M、 B S pro P M、 B S dipro Ρ Μ ¾どが挙げられる。
    [0056] 本発明の呈色妨害物質の影響を回避 た定量法の発明は、 ト リ フ エ -ルメ タ ン系ロイ コ色素を発色剤と して用いる酵素法
    [0057] 5 ( H 20 2— P 0 D系） による体液成分の定量、 例えば体液中のグ ルコ ース、 コ レステ ロ ール、 ト リグリ セ ラ イ ド、 リ ン月旨質、 コ リ ン、 ク レアチ ン、 ク レアチュ ン、 胆汁酸等の基質の定量ゃモノ ア ミ ンォキシダーゼ等の酵素活性の測定に於いて、 並びに H 20 2を 用いた体液中のペ ルォキシダ一ゼ様物質、 例えばへモグロ ビン等
    [0058] 10の定量に於いて、 ト リ フ エ ニ ルメ タ ン系ロイ コ色素の酸化発色を 妨害する物質の影響を回避し、 よ ]9正確 ¾測定値が容易に得られ る方法を提供するものである。
    [0059] 本発明の一般式 Iで表わされる呈色試薬は高感度であることを 特徵とするものであるが、 高感度である為に、 却ってそれが実用 上障害になる場合もある。 即ち、 高感度である為に、 例えば、 4 —ァ ミ ノ アンチビリ ン一フ ヱ ノ 一ル系程度の感度で十分であるよ う 過酸化水素濃度試料の測定では、 試料採取量を超微量 （例え ば 1 0 & 以下） にしなければ ら¾いので計量誤差が大き く ]9測定値のバラツキの原因とるった 、 また、 試料採取誤差を小
    [0060] 20さ くするためには試料を予め希釈する操作を行う必要がある等実 用上の問題点を有する。
    [0061] この よ うな問題点は、 前記一般式〔 W 〕で表わされる ト リフ エ - - ルメ タ ン誘導体を発色成分と して用いる酸化性物質の定量法に 於いて、 ァジ化物を感度調節剤として用いる本発明方法によ 、 或いは、 前記一般式〔 17 3で表わされる化合物をシ ク πデキス 卜 リ ン （以下 C Dと略称する） または修飾シ クロデキス 卜 リ ン （以 下修飾 C Dと略称する） を用いて包接させることによる本発明方 法によ 解消される。 - ァジ化物、 特にアジ化ナ 卜 リ ゥムは一般に防腐剤と して用いら れてお ] 、 また、 カ タ ラ ーゼ、 ペルォキシダーゼ、 ラ ッ カーゼ等 の重金属酵素に対する阻害剤と しても有名である。
    [0062] しかしながら、 本発明に於ては、 卜 リ フ ヱ ニ ルメ タ ン誘導体と ァジ化物とを併用することによ ] 、 従来了ジ化物に於て知られて いなかった効果、 即ち、 ト リ フ ヱ ニ ルメ タ ン誘導体の発色感度を 調節する効果が得られることを新たに見出し、 それによ ] 卜 リ フ ェ ニ ル メ タ ン誘導体の使用範囲が超微量物質の定量に限定される ことな く、 その被酸化性発色試案と して優れた特性、 即ち呈色波 長が長波長側にあ Ϊ)、 且つ呈色後の経時的褪色が殆ど ¾ぃ¾どの 特性を生かして幅広い用途への応用を可能 ¾らしめたのである。
    [0063] アジ化物としてはアジ化水素のアル カ リ塩、 ア ルカ リ土類金属 塩、 その他の金属塩のいずれでも よいが、 通常はアジ化ナ 卜 リ ウ ムが好ま しく用いられる。 その濃度は発色試液中 0. 0 0 1 以上 であれば発色感度低下の効果が認められる力 、 通常は 0. 0 1〜 0. 5 ^が好ま しく用いられる。 例えば、 B S d i pro P Mではその 発色試液中にアジ化ナ ト リ ゥ ム 0. 2 を添加することによ ！）発色 感度は最高 1 6. 5 まで低下し、 しかも検量線は原点を通る直線 とるる。 又、 本発明に於てはアジ化物の添加量を適宜選択するこ とによ 、 発色感度を好ま しい程度に適宜調節することが可能で ¾>る。
    [0064] —方、 C D又は修飾 C Dは、 一般に水溶液中で有機化合物と混 合すると速やかに包接体を形成し、 製剤の安定化、 溶解性の調節、 液状薬品の粉末化、 刺漦性ゃ悪臭などのマ スク 或いは揮発性の 調節等に優れた効果を有することが知られてお ]？、 これらの用途 に広く利用されている。 又、 呈色剤に C D又は修飾 C Dを添加す
    [0065] 5ると、 通常は溶解性の向上等の効果によ D発色感度の増加がおこ ると考えられるので、 かかる目的での使用例も多い。
    [0066] しかしながら、 本発明によれば、 ト リ フ エニ ルメ タ ン誘導体を C Dは修飾 C Dで包接することによ D全く意外ることに発色感度 を逆に低下させることができ、 その結果、 ト リ フ エ - ノレメ タ ン誘
    [0067] 10導体の使用範囲が超微量物質の定量に限定されることなく、 その 優れた 性を生かして幅広い用途への 用が可能となった。
    [0068] 又、 卜 リ フ エ - ルメ タ ン誘導^の 1つであ 、 呈色試藥として 公知の化合物 （特開昭 5 6 — 2 6 1 9 9号公報） であるビ ス （ p ージェチノレア ミ ノ フ エ - ル） 2 — ス ルホ フ ェ ニ ルメ タ ン （ BSPM) は、 血清中の微量成分の酵素的測定法 （H 2 0 2生成系） において 通常用いられる PH 6 〜 8の緩衝液には、 0. 0 1 m Mの濃度でも 完溶しない程溶解し難い為 （通常は一且酸性側で溶解し、 然る後
    [0069] H を中性付近に調整するが、 それでもせいぜい 0. 5 tn M程度で ある。 ) 、 これまでその方面の用途での実用化は困難であったが、
    [0070] 20本発明の方法、 即ち、 C D又は修飾 C Dを用いて包接することに
    [0071] よ ]7溶解性が増大し、 2 0 m Mまたはこれ以上の濃度にも可溶と な 、 実用化が可能となつ-た。
    [0072] . 又、 本発明に用いられる C Dは、 a , β ， r ， δ ¾どいずれの
    [0073] タィブでも使用できる。 修飾 C Dとしては例えば次式 （V ) ：
    [0074] 25 — C D (— OH) 2 1—m„ (― OZ 1 )!!!,, ( V )
    [0075] OMPI
    [0076] 、 WIPO (式中 C Dはシク ロデキス 卜 リ ン残基を表わし ； Z1は一 N02、 一 PO3H、 一 S03Hまたは次式 ： 一（CH2)n,,Z2 で表わされる基を表わし ；
    [0077] Z2 は一 S03Hまたは一 C02Hを表わし ；
    [0078] n'f は 1 いし 4の整数を表わし ；
    [0079] そして m〃 は 1 ないし 5の数を表わす。 ） で表わされる化合 物または次式 （Ή) ：
    [0080] ^-CD (-OH)21_k/(-OCH3)k/ (1)
    [0081] (式中 kは 0 < ≤ 2 1の範囲の数を表わす。 ） で表わされる 化合物が挙げられる。
    [0082] このよ う ¾ ^一シク ロ デキス ト リ ン誘導体の代表的なものを列 挙すれば、 次の通 である ：
    [0083] ー CD (-OH)19 (-ONO 2)2
    [0084] -CD (― OH)192 (― OP03H)18
    [0085] CD (― OH)19(-OS03H)2
    [0086] -CD (-0 H)l 85 (-0-CH 2 -C 02 H) 2<5
    [0087] — CD (— OH)193 (-0-CH 2 CH 2 CH 2 -S O 3 R
    [0088] -CD (— OH)185 (-0-CH 2 CH a CH 2 -S O 3 H)25
    [0089] ^-CD (— ΟΗ)18·0 (-0-CH 2 CH 2 CH 2 -S 03 H)3>0
    [0090] ^一 CD (-OH)7 (一 OCH3)14
    [0091] -CD (一 OCH3)21
    [0092] しかし がら、 本発明の修飾 C Dはこれら具体例に限定されな い。 これら修飾 C Dは文献に記載の一般的製造方法によ！）容易に 製造することができる。 例えば有機合成化学第 3 5巻第 2号 123 ( 4 1 ) 〜； 1 2 4 ( 4 2 ) 頁 （ 1 9 7 7 ) を参照。
    [0093] OMPI ϋ C D又は修飾 C Dを用いて包接するには、 C D又は修飾 C Dを 水又は緩衝液に溶かした溶液中にト リ フ エ - ノレメ タ ン誘導体を加 えて溶解させればよい。 このよ うにして、， 水又は緩衝液に難溶る B S P Mも短時間で簡単に溶解させることができる。 ト リ フ エ二
    [0094] 5 ルメ タ ン誘導体に対する C D又は修飾 C Dの量はト リ フ エ -ルメ タ ン誘導体に対し等モ ル以上であればよいが、 通常は 1 0 〜1，000 倍モルが好ま しく用いられる。 C D又は修飾 C Dを用いて包接す ることによ ] 発色感,変は、 例えば B S P Mではな一 C D包接で最 高 5 5. 2 程度 , β _ D包接で最高 3 7. 4 程度まで低下し、
    [0095] 10 B S dipro P Mでは α— C D包接で最高 3 8. 7 %程度 ， 一 C D 包接で最高 2 9 0 %程度まで低下し、 又 B S pro P Mではな一 CD 包接で最高 5 3. 7 %程度 , β — D包接で最高 3 8. 8 程度まで 低下する。
    [0096] 前記一般式〔 W 〕で表わされる本発明に用いられる ト リ フエ二 ルメ タ ン誘導体としては例えば、 ロ イ コ色素と して従来から公知 の ロ イ コ マ ラ カ イ ト グ リ ー ン、 ロ イ コ ク リ ス. タ ノレヴァ イ オ レッ ト、
    [0097] B S P M、 B S pro P M及び B S d ipro P M ¾どが挙げられるが これらに限定されるもので いことは勿論である。
    [0098] 本発明に於て、 アジ化物、 C D又は修飾 C Dを用いることによ
    [0099] 20る発色速度への影響は全く い。
    [0100] 本発明の方法は、 従来酵素法 （H 20 2生成系） で測定されてい るすべての測定項目及び H 20 2を用いるペルォキ シダーゼ様物質 の測定に適用可能であ ] 、 例えば体液中のコ レステロール、 リ ン 脂質、 グノレコース、 ク レアチン、 ト リ グ リ セラ ィ ド、 尿酸等の基
    [0101] 25質の測定や、 血清酵素の活性測定及び血清中のへモグロ ビ ンの定 量等に使用し得る。 但し、 尿酸について C D若しくは修飾 C Dを 使用する場合は、 あらかじめ尿酸にゥ リ カーゼを作用させて ¾¾ を生成させた後、 C D若しくは修飾 C Dで包接したト リ フ エニ ル メ タ ン誘導体をペ ルォキシダーゼと共に添加し、 呈色させる必要 5 ^ある。
    [0102] 図 面 の 簡 単 る 説 明
    [0103] ― 第 1図は、 実施例 3.に於て得られた検量線を表わし、 横軸の各 モノアミ ンォキシダーゼ活性 （ I U ） について得られた吸光 度 （0 D ) を、 縦軸に沿ってプロ ッ ト した点を結んだものである。
    [0104] 0 第 2図は、 実施例 4.及び参考例 2.に於て得られた検量線 （図中、 •—— ·は実施例 4.の検量線を、 X一一 Xは参考例 2.の検量線を示 す。 ） を表わし、 横軸の各コ レ ス テ ロ ー ル濃度 W / d につい て得られた吸光度 （0 D ) を、 縦軸に沿ってプロ ッ ト した点を結 んだものである。
    [0105] s 第 3図は、 実施例 5.に於て得られた検量線を表わし、 横軸の各 過酸化水素澳変 ( Pm ) について得られた吸光度 （0 D ) を、 縦軸 に沿ってブロッ ト した点を結んだものである。
    [0106] 第 4図は、 実施例 6.に於て得られた検量線を表わし、 横軸の各 過酸化水素濃度 （P 0 について得られた吸光度 （0 D ) を、 縦軸 <)に沿ってプロ ッ ト した点を結んだものである。
    [0107] 第 5図は、 実施例 8に於て、 第 5表の結果を図示したものであ 、 横軸の各 Η 20 2標準液濃度（ppm)について得られた吸光度 （0 を、 縦軸に沿ってプ口 ッ ト した点を結んだものである。
    [0108] 図中、 一 X— X—は尿酸標準液濃度が 0 Ζ （水） 、 一 · 一5 ， 一 2 5 / & 、 — ο—。一は 5 0 Ζ ^、 ー厶ー厶ーは 7 5
    [0109] O PI ' Z ^及び一□—□一は 1 0 0 fl^ノ ^の場合 ¾夫々表わす。
    [0110] 第 6図は、 実施例 1 0に於て得られた検量線 ¾表わし、 横軸の 各モノアミンォキ シダーゼ活性（： i j £ )につ て得られた吸 光度（ 0 D ) ¾、 縦軸に 、つてプロッ ト した点 ¾結んだものであ る。
    [0111] 第 7図は、 実施例 1 1及び実施例 1 2に於て得られた検量線を 表わし、 図中、 一 X — X—は実施例 1 1の、 一 ·—— · _は実施例 .1 2の場合を夫々表わす π 夫々横軸のへモグロ ビン濃度 ^/ Ά ) につ て得られた吸光度（ O D ) ¾、 縦軸に 、つてプロッ ト した 点 ¾結んだものである。
    [0112] 第 8図は、 実施例 1 3及び実施例 1 に於て得られた検量線を 表わし、 横軸の各 Η202濃度（ W/ Ά ：)につ て得られた吸光度 ( 0 D ) ¾、 縦軸に 、つてプロッ ト した点 ¾結んだものである。 図中、 一 X — X—は実施例 1 3、 一。一。一は実施例 1 4 ¾表わす。
    [0113] 第 9図は、 実施例 1 5及び実 ¾例 1 6に於て得られた検量線を 表わし、 横軸の各コレステ口一ル濃度〔 / di )につ て得られ た吸光変（ 0 D ) ¾¾ 縦軸に «つてプロッ ト した点 ¾結んだもの である。 図中、 一 X— X—は実施例 1 5、 - o - o—は実施例 1 6 ¾表わす。
    [0114] 第 1 0図は、 B S P M¾発色剤とした実施例 1 7 ，実施洌 1 8 , 実施例 1 9に於ける H202の検量線である。 図中，一 X — X—は 実施例 1 7、 一 ·一 ·一は実施例 1 8、 一。一。一は実施例 1 9 ¾表わす。
    [0115] 第 1 1図は、 B S dipro P M を発色剤とした実施例 2 0，，実 施例 2 1 , 実施例 2 2に於ける H202の検量線である。 図中、 一
    [0116] 一 OMPI X — X—は実施例 2 0 、 一 ·一 一は実施例 2 O ― O一は 実施例 2 2 ¾表わす。
    [0117] 第 1 2図は、 B S pro P M¾発色剤とした実施例 2 3 、実施例 2 4 、実施例 2 5に於ける H202 の検量線である。 図中、 一 X — X—は実施例 2 3 、 一 · 一 ·一は実施例 2 4 - o - o—は実施 例 2 5 ¾表わす。
    [0118] 第 1 3図は、 B S dipro PM ¾発色剤とした実施例 2 6及び 実施例 2 7に於ける総コレステロ— ル定量用の検量線である。 図 中、 一 X — X—は実旎例 2 6 、 一。一 。一は実施例 2 7を表わす。 第 1 4図は、 B S dipro PM ¾発色剤とした実施例 2 7及び 実施例 2 8に於ける総コレステロ— ル定量用の検量線である。 図 中、 一 X — X—は実施例 2 7、 一 o— 。一は実施例 2 8 ¾表わす。
    [0119] 第 1 5図は、 B S dipro PM ¾発色剤とした実施例 2 8、 実 施例 2 9 於ける ト リグリ セライ ド定量用の検量線である。 図中、 — X — X —は実施例 2 8、 一 。一 。一は実施例 2 9 ¾表わす。
    [0120] 尚、 上記測定のセ ル層厚は 1 0 である。
    [0121] 発明を実施するための最良の形態
    [0122] 実施例 1 ： B S dipro PMの合成
    [0123] OMPI
    [0124] ト - WIPO ,^ν -2 θ-
    [0125] (ϊ) 3 ， 4—ジソ ジゥ ム ス ルホ ブ口ポキシベンズアルデヒ ドの合 成
    [0126] ブロ ト カテキユアルデヒ ド 2 7.6 9- ( 0.2 mo ） をメ タ ノール 2 0 0 に溶解させ、 これに 2 8 ナ ト リ ウム メ チラー ト 9 2.4 9 ( 0.4 8 mo ） を加えて濃縮乾固する。 この乾固物にメチルセ 口ソルブ 4 0 0 /^を加えて攪拌下で溶解させ、 これにプロパンサ ル ト ン 5 8.8 ^ ( 0.4 8 mo をメチルセ口ソ ルブ 5 0 ^に溶解 させた液を 9 5〜 1 0 0でで滴下し、 癍下後同温度で 1時間攪拌 反応させる。 反応液を^却後アセ ト ンを加えて結晶を分散させ、 この結晶を^取し、 乾爆.して粗晶 8 8 （収率 1 0 3.2 を得 る。 これをカ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ （O D S逆相カ ラム、 AcOH 5 を含む 2 0 %メ タノール水溶液)によ 精製して精晶 4 3.5 ^ (通算収率 5 1.0 を得る。 T L C 1 スポッ ト 。 I R (KBr) ： ジ = 1 0 5 5 (- O' ， ー 0— R)、 1 1 9 0〜： L 2 2 0 (— SO $ζί-0— R)、 1 6 7 0 era" 1 ( -CHO ) Q
    [0127] (ii)ビス （4一 N ， N—ジェチルァ ミ ノ フ エ 二ル)一 3 ， 4ージソ ジゥ ム スルホ ブ口ポキシフ エ -ルメ タ ン （ B S d ipro P M ) の合 成
    [0128] ( i)で得た 3 ， 4—ジソ ジゥ ム スルホ プ ロ ポキシベンズァルデヒ ド 7.0 ^ ( 1 6.4 m mo ^ )、 N ， N—ジェチルァ二リ ン 7, 3 ^
    [0129] C 4 9.2 mmo^ )及び塩化亜鉛 .5 ^をメチルセ口ソ ルブ 1 4 0 に懸濁させた後、 内温 1 2 5 °Cで 2 8時間加熱反応させる。 反 応中、 生成した水分を留去する。 反応終了後、 ジメ チルス ルホキ シ ド 3 ひ 0 ^を加えて反 生成物を溶解させた後、 不溶物を^去 する。 2
    [0130] れを^取し、 この結晶を水 1 5 に溶解させる。 これをカ ラ ム ク 口マ トグラ フィ （担体 Wakogel® C— 2 0 0 ) で精製した後、 溶 離液を留去し、 残留物を水に溶解させて脱色^過し、 ^液を濃縮後 了セトンを加えて結晶化させ、 これを 取して目的とする微青色結 5晶 2.6 8 ^ (収率 2 3.2 %) を得る。
    [0131] C元素分析値〕
    [0132] H C N
    [0133] 理論値 (？ S) 6.2 7 5 6.0 8 3.9 6
    [0134] 実測値 ） 6.4 6 5 6.0 6 4.1 4
    [0135] 10 U V ( 0.1 M ト リ ス緩衝液 ， pH - 7.5 ) ： m a x ( e )
    [0136] • = 6 2 0 n m ( 1 6 6, 3 0 0 ) 0
    [0137] I R (K B r ) ： ジ = 1 0 2 0〜 ： L 0 3 0 (-SO . R)、
    [0138] 1 8 0 1 2 0 0 (-SO ø —0—R)、 l 3 8 0 (— N(C2H5)2)、
    [0139] 2 9 5 0 COT一1 ( -C 2H5) o
    [0140] 実施例 2 ： B S pro P Mの合成
    [0141] ρ—ヒ ドロ キシベンズアルデヒ ドとブロ ノヽ。 ンサル ト ン と力 ら、 実施例 1.のい）と同様にして得た 4ーソ ジゥム ス ルホプロボキシべ ンズアルデヒ ド 2.5 ^を使用し、 実施例 1.の（ii)に準じて、 塩化亜 鉗 2.4 ^の存在下、 メチルセ口ソ ルブ 5 0 ^中、 N ， N—ジェチ
    [0142] 20 ルァ - リ ン 3.4 ^ と反応させ、 実施例 1.の（ii)と同様に処理してビ ス （ 4一 N ， N—ジェチルァ ミ ノ フ エ -ノレ） 一 4一ソ ジ ゥ ム スル ホ プ口 ポキシ フヱ -ルメ タ ン （ B S pro P M ) の淡青色結晶 0.7 9 (収率 1 3.6 を得る。
    [0143] 〔元素分析値〕
    [0144] 25
    [0145] OMPI H c
    [0146] 理論値^) 7. 1 9 6 5.9 1 5.1 2
    [0147] 実測値 ( 7. 3 3 6 5. 9 4 5.2 8
    [0148] U V ( 0。 1 M ト リス緩衝液 ， pH = 7. 5 ) ： Xm ax (ε) = 6 2 0n m ( 1 2 1, 8 0 0 ) ο
    [0149] 実施例 3 ：血清モノ ァ ミ ンォキシダーゼの活性測定
    [0150] 2 0 m Mリ ン酸緩衝液 （pH = 7. 0 ) に、 基質としてァリノレア ミ ン 1 5 mMを用い、 ゥ リ カ一ゼ 2 0 0' UZ 、 B S dipro P M 0. 0 3 mM、 エ マ ール N C (花王 翁)商品名） 5 及び
    [0151] P O D 3 0 0 0 UZ の濃度に る量加えて溶解させ、これを基質 発色試液とする。
    [0152] ジェチルジチォカルバミ ン酸ナ 卜 リ ゥ ム 8.9 mMの水溶液を調 製し、 反応停止液とする。
    [0153] 血清 5 0 ί^ をと ] 、 上記基質発色試液 3 を加え、 3 7での 恒温槽中で、 3 0分加温後、 反応停止液 5 0 ββ を加えて混和し た後、 試薬ブラ ンクを対照として波長 6 2 0 n mに於ける吸光度 を測定する。
    [0154] シグマ社製牛由来モノアミ ンォキシダーゼを用いて、 5 IUZ、 1 0 IU/^、 2 0 Ιϋ/^の標準液を調製し、 これを用いて血清と 同様に操作して吸光度を測定し、 検量線を作成する。 第 1図に検 里 zj 。
    [0155] この検量線から試料中のモノァ ミ ンォキシダーゼ活性を求める。 参考例 1 ：従来の呈色試案を用いた Η202の測定
    [0156] 〔緩衝液〕
    [0157] 2 5 m Μの pH 6.7 5のグッ ド緩衝液に、 了リ ルア ミ ン 3 OmM,
    [0158] Ο ΡΓ フ エ ノ ール 0.5 3 mM及び界面活性剤を加'えて緩衝液を調製する。 〔第 1試液〕
    [0159] リ ポブロティ ン リ パーゼ 1 7 0 uni t、 ァ ス コ ルビン酸ォキシダ ーゼ 4 2 5 unit. ペルォキシダーゼ 2 5 5 unit 及び安定化剤を、 5前記緩衝液 8 5 ^に溶解させ、 これを第 1試液とする。 第 2試液〕
    [0160] 1 0 — N—メチルカ ノレノ モイ ルー 3 ， 7—ジメ チルア ミ ノー 10 H—フ ヱノチアジン （MC D P) 7.3 rniole及び安定化剤を、 前 記緩衝液 8 5？ ^に溶解させ、 これを第 2試液とする。 10 用時、 第 1試液と第 2試液とを等容量混合して、 発色試液とす る 0
    [0161] ジェチ ルジチォカ ルバミ ン酸ナ 卜 リ ゥ ム 8.9 m Mの水溶液を調 製し、 反応停止液とする。
    [0162] 上記発色試液 3.07 ^をと ] 、 3 7 °Cの恒温槽中で約 5分間予備 加温後、 これに血清 5 0 を加え、 3 7でで 3 0分間加温する。 ついで反 IS停止液 5 0 β£ を加えて混和した後、 水を対照として 波^ 6 6 0 n mに於ける吸光度 （Es ) を測定する。 血清の代 に、 夫々モノアミ ンォキシダーゼ標準液 （実施例 3. で用いたもの） 5 0 « 、 精製水 5 0 i H を用いて、 上記操作と ∞同様に操作して得た吸光度を Estd、 ： EBと し、 次式よ モノアミ ンォ キシダ一ゼ活性値を算出する。
    [0163] 一 p p
    [0164] モノ ア ミ ンォキシダーゼ活性値 （ Ιϋ/^) -Estd- EB x標準 酵素単位
    [0165] 第 1表に、 実施例 3.と参考例 1.で調製した発色試液の保存 （15 25°Cで保存） 中の着色変化の試験結果を示す。
    [0166] OMPI
    [0167] 、 .ゝ ，, 0 保^ 実施例 3. 参考例 1。
    [0168] 0 0 λ 0 0 0 2 7
    [0169] 2 0. 0 3 0 0. 0 1
    [0170] 5 0. 0 2 9 0. 1 2 4
    [0171] 7 0. 0 3 0 0. 1 7 2
    [0172] 2 4 0. 0 3 1 測定不能 第 1表に示すとお] 、 参考例 1.の発色試液は、 保存中に試薬の 着色が増し、 試薬ブラ ンクが経時的に上昇するため、 発色試液は 用時調製の必要があるが、 本発明に於ける発色試液は、 2 4時間 後も何ら変化がみられ い。
    [0173] 第 2表に、 実施例 3.及び参考例 1.による測定結果の比較を示す。
    [0174] 5Rr 2 血 清 Να 実施例 3. 1.
    [0175] 1 1. 5 1. 7
    [0176] 2 7. 8 7. 2
    [0177] 3 2. 3 2. 3
    [0178] 4 1. 1 1.
    [0179] 5 4. 2 3. 9
    [0180] 6 1. 6 1. 6
    [0181] 7 5. 1 4. 8
    [0182] 8 1 2. 7 1 3. 0
    [0183] 9 0. 9 1. 1
    [0184] 1 0 1. 2 1. 0
    [0185] 平 均 3. 8 4 3. 8 0
    [0186] ϋ¾Ε Ο ΡΙ 第 2表に示されるよ うに、 実施例 3.の値と、 参考例 1.の値とは よい相関を示し、 その間に有意差は認められ い。 r = 0.9 9 7 実施例 4. ： 血清中の遊離コ レステロー ルの定量
    [0187] 0.0 5 Mリ ン酸緩衝液 （ pH 7.0 ) に、 B S dipro P M 0.05 5 mM、 ゥ リ カーゼ 3 0 0 UZ 、 コ レステ ロ ノレォキシダーゼ 100 、 ペルォキシダーゼ 3 0 0 0 UZ 、 ト リ ト ン X— 1 0 0 0.1 5 %、 エ マ ール N C 0.0 5 %の濃度になるよ うに溶解させ、 これを発色試液とする。
    [0188] 血清 1 0 をと 、 これに上記発色試液 3 を加え、 3 7 °C 10の恒温槽中で、 1 0分間加温後、 試藥ブラ ンクを対照と して波長 6 2 0 n mに於ける吸光度を測定する。
    [0189] Jに、 コ レステ ロ ールを各々 2 5、 5 0、 1 0 0、 1 5 0及び 2 0 0 ^ノ の濃度に るよ うに調製したコ レ ステロ一ル標準液 を用いて、 血清と同様に操作して吸光度を測定し、 これから検量 線を作成する。 第 2図に検量線を示す。 この検量線から血清中のコ レステロー ル濃度を求める。
    [0190] 参考例 2 ：従来の呈色試藥を用いた血清中の遊離コ レス テ ロ ール の定量
    [0191] 0.0 5 Mリ ン酸緩衝液 （ pH = 7.0 ) に、 4—アミ ノアンチビ 0 リ ン 0.0 1 %、 フ エ ノ ー ル 0.1 %、 コ レステ ロ ールォキシダーゼ 1 0 0 U / 、 ぺ.'レオキシダーゼ 3 0 0 0 U ^及びト リ ト ン X - 100 0.1 の濃度にるる量を溶解させ、 これを発色試液とする。 . 血清 5 0 ^ をと j？、 これに上記発色試液 3 を加え、 3 7 °C の恒温槽中で、 1 0分間加温後、 試薬ブラ ンクを対照と して波長55 0 5 n mに於ける吸光度を測定する。
    [0192] C PI
    [0193] i o 別にコレ ステロー ル標準液 （実施例 4.で用いたもの） を用いて、 上記操作と同じ操作で呈色させ吸光度を測定して作成した検量線 から、 血清中のコ レス テ ロ ー ル濃度を求める。 第 2図に検量線を 示す。
    [0194] 第 3表に、 実施例 4.及び参考例 2.による測定結果の比較を示 Τ。
    [0195] 3 ¾ζ
    [0196] 水 1 ： 「ゥ リ カーゼ無し」 は、 実施例 4.の発色試液組成のうち、
    [0197] ゥ リ カーセ'だけを除いた発色試液を調製し、 これを実施例
    [0198] 4.に従い測定したものである。
    [0199] * 2 ： 「尿酸値」 は、 Uri c Ac i d B~Tes t wako (和光純藥工業餽
    [0200] 製） を用いて測定した尿酸濃度を示す。
    [0201] 実施例 4.と参考例 2.の測定値間の有意差の有無を、 t検定を用 いて調べたところ、 有意水準 5 で、 両測定値間に差は認めら 1L
    [0202] OMPI 一 2 —
    [0203] るかった。 「ゥ リ カーゼ無し」 の場合は、 血清中の尿酸量によ 測定値は大幅る低値を示し、 これよ i 尿酸による負の影響が明ら 力 である。
    [0204] 実施例 5 ：過酸化水素の定量
    [0205] 0.0 5 Mリ ン酸緩衝液 （ pH = 7.0 ) に、 B S dipro P Μθ.05 mM、 ペ ルォキダーゼ 3 0 0 0 及び ト リ ト ン X— 100 0.05 の饞度に ¾る量に溶解させこれを発色試液とする。
    [0206] H202 1〜 6 0 PPmを含む試料 2 0 をと 、 これに発色試液 を加え、 3 7 °Cの恒温槽中で、 1 0分間加温後、 試藥ブラ ン クを対照と して波長 6 2 ひ n mに於ける吸光度を測定する。
    [0207] 別に、 過酸化水素を各々 1 5、 3 0、 4 5及び 6 0 Pmの濃度に るるよ うに調製した過酸化水素標準液を用いて、 試料と同様に操 作して吸光度を測定し、 検量線を作成する。 第 3図に検量線を示 す。
    [0208] この検量線から、 試料中の過酸化水素濃度を求める。
    [0209] 実施例 6 ：過酸化水素の定量
    [0210] 0.0 5 Mリ ン酸緩衝液 （ pH = 7.0 ) に、 B S pro P M 0.0 5 mM、 ペルォキシターゼ 3 0 0 O UZ^及び ト リ ト ン X-1 0 0 0.0 5 の濃度になるよ うに溶解させ、 これを発色試液とする。 実施例 5.と同様にして、 試料の吸光度を測定し、 別に過酸化水 素標準液 （実施例 5.に用いたもの） を用いて作成した検量線から、 試科中の過酸化水素濃度を求める。
    [0211] 第 4図に検量線を示す。
    [0212] 実施例 7 ：呈色妨害防止剤存在下での H202の定量
    [0213] (1)試藥の調製 ①発色試液
    [0214] 0.0 5 Mリ ン酸緩衝液 （ pH 7.0 ) 中に B S dipro P M 0.0 5 mmo / £ , P 0 D 3, 0 0 0 ϋ 及び呈色妨害防止剤として、 界面活性剤の場合は 2 、 金属キ レー トの場合は 0.2 %を含むよ うに調製し、 夫々 これを発色試液とする。
    [0215] ②ア ブ ミ ン溶液 '
    [0216] 人アルブミ ン (S i.g.ma社製 b um i α , Hum a n Fraction V 9 6〜 9 9 .5 をと 、 これに蒸留水を加えて全量 1 0 0 ^とする。
    [0217] ③尿酸標準液
    [0218] 常法に従い尿酸 1 5 0 ^/ の水溶液を調製する。
    [0219] ④ H202標準液
    [0220] Η2Ό2を夫々 3 0 ΡΡ ， 6 0 PPi含む水溶液を調製し、 H202標準 液 I ， IIとする。
    [0221] (2)測定操作
    [0222] 試料と して、 水 ， ア ルブミ ン溶液及び尿酸標準液各 5 0 を と！）、 これに発色試液 3 ^を加えて混合したのち、 H202標準液 I又は I 2 0 を加えて 3 7 aCの恒温槽中 1 0分間放置したの ち試薬ブランクを対照として、 波長 6 2 0 n mにおける吸光度を 測定する。 、
    [0223] 結果を第 4表に示す。
    [0224] 一 》
    [0225] OMPI 4
    [0226] 10 第 4表よ 1 明らか よ うに、 本発明に係るァニオ ン系界面活性 剤又は金属キレー トを用いることによ アルブミ ンによる呈色妨 害は回避することができる。 しかし、 これによ ] 尿酸の妨害を回 避することはでき い。
    [0227] 実施例 8 ：呈色妨害防止剤不在下での H202の定量 (1)試薬の調製
    [0228] ①発色の試液
    [0229] 実施例 7に同じ。 (呈色妨害防止剤含まず。 ）
    [0230] ②尿酸標準液
    [0231] 0 常法に従い尿酸 0 2 5、 5 0、 7 5及び 1 0 0 の水溶 液を調製する。
    [0232] ③ H202標準液
    [0233] H202を夫々 1 5 3 0、 4 5及び 6 0 ppm含む水溶液を調製す O
    [0234] 5 (2)測定操作
    [0235] O PI
    [0236] 、 IPO · 実施例 7に従い試科として尿酸標準液を甩いて操作し吸光度を 測定する。
    [0237] 結果を第 5表及び第 5図に示す。
    [0238] 第 5 表
    [0239] 10 第 5表及び第 5図から明らか ¾よ うに尿酸の存在によ ])負の誤 差を生じ、 検量線は湾曲し原点を通らない。 負誤差は尿酸の量が 増えるに従い大き く ¾るが比例はし い。
    [0240] 実施例 9 ：呈色妨害防止剤存在下での H20 2の定量
    [0241] (1)試薬の調製
    [0242] ①発色試液
    [0243] 実施例 7に同じ。 （呈色妨害防止剤含まず。 ）
    [0244] 20 ②尿酸標準液
    [0245] 上記参考例に同じ。
    [0246] ③ H 20 2標準液
    [0247] 上記実施例 8に同じ。
    [0248] (2)測定操作
    [0249] 25 発色試液にゥ リ カーゼを 2 0 0 ϋ Ζ ^の濃度になるよ うに添加
    [0250] OMPI 一 3 l—
    [0251] し、 それを用いて実施例 8 と同様に操作して吸光度を測定する 結果を第 6表に示す。
    [0252] 第 6
    [0253] 第 6表から明らか ¾よ うに、 ゥ リ カーゼを用いることによ 尿 酸の影響は全く消失するが、 Η2ϋ 2の測定値には全く影響を与え い。
    [0254] 実施例 1 0 ： 血清モノァミ ンォキシダーゼの活性測定 (1)試薬の調製
    [0255] ①基質発色試液
    [0256] 2 0 m Mリ ン酸緩衝液 （pH 7, 0 ) に、 基質と してァリ ルァミ ン 1 5 mmo Z 、 ゥ リ カーゼ 2 0 0 U/¾、 B S dipro Ρ Μθ.03 m mo / エマール N C (花王石鹼㈱商品名） 5 % P O D 3000 U/ の濃度に ¾るよ うに溶解させ、 これを基質発色試液とする。
    [0257] ②反応停止液
    [0258] ジェチルジチォカルパミ ン酸ナ 卜 リ ゥ ム 8.9 m m 0 Z の水溶 液を調製する。
    [0259] ③モノ ア ミ ンォキシダ一ゼ溶液
    [0260] OMPI
    [0261] 、L IPO 、 ό· 0 Sigma社製牛由来モノ ア ミ ンォキシダ一ゼを用いて、 5 1 TV^ 1 0 I U ^、 2 0 I UZ^の水溶液を調製する。
    [0262] (2)測定操作
    [0263] 血清 5 0 をと ])、 これに基質発色試液 3 を加え、 37での 恒温槽中で 3 0分間加温後、 反 停止液 5 0 を加えて混和し たのち、 試案ブラ ンクを対照として波長 6 2 0 n mにおける吸光 度を測定する。
    [0264] モノアミ ンォキシダーゼ溶液を用いて血清と同様に操作して吸 光度を測定し、 検量線を作成する。
    [0265] 第 6図に検量線を示す。 - 検量線から試料中のモノ ア ミ ンォキシダーゼ活性を求める。
    [0266] 実施例 1 1 ：呈色妨害防止剤存在下での血清中の微量へモグロ ビ
    [0267] ンの定量
    [0268] (1)試案の調製
    [0269] ①試液 I ： ロイ コマ ラカイ トグリ ー ン 2 ^を酢酸 3容と水 1容 の混液 1 0 Οπ に溶解させる。
    [0270] ②試液 H ： グ リ シン 3 0 、 尿素 2 0 0 ^を水約 9 0 0 ^に溶 解後塩酸で pH 4.5に調整し、 エマール N C 3 0 ^を加えたのち 水で全量 1， 0 0 0 とする。
    [0271] ③試液 I ： 3 0 H2021 J^に水を加えて 1 0 0 ^とする。
    [0272] ④ゥ リ カーゼ溶液
    [0273] 0.0 5 Mリ ン酸緩衝液 （ pH 7.0 ) に、 ゥ リ カ一ゼを 2 0 0
    [0274] .ϋノ^の濃度になるよ うに溶解させる。
    [0275] ⑤血清
    [0276] ヘモグロ ビ ン不含のブール血清 （尿酸 5 0 ^ノ^を含有） にへ
    [0277] ' ΟΜΡΓ
    [0278] 1, Lf Office j¾ ^¾a^g奢 s brevets
    [0279]
    [0280] en
    [0281] ¾rin<ii|¾ de
    [0282]
    [0283] , CMPI
    [0284] 、 . マo m m o Z _^ぺノレォキシダーゼ 3, 0 0 0 U 、 アジ ίヒナ ト リ ゥム 0.2 の濃度になるよ うに溶解させて発色試液とする。
    [0285] ② Η202標準液
    [0286] 各々 1 5^Ζ^、 3 0 /^、 4 5 ι ダ^、 6 0^Ζ_^及び 7 5 Ψ £の濃度の Η202水溶液を調製する β
    [0287] (2)測定操作
    [0288] 各濃度の Η202標準液を夫々 2 0 i と 、これに発色試液 3 を加えて 3 7 °Cの恒温槽中で 1 0分間加温後、 試案ブランクを対 照と して 6 2 0 n mにおける吸光度を測定する。
    [0289] 検量線を第 8図に示す。 検量線は原点を通る直線であ ] 、 H202 濃度 1 5 '£のときの吸光度は、 アジ化ナ ト リ ウ ムを用い い 実施例 1 4に於ける対応する値の 1 6.5 である。
    [0290] 実施例 1 4 ： アジ化ナ ト リ ウム不在下での H202の定量
    [0291] (1)試薬の調製
    [0292] ①発色試液
    [0293] 実施例 1 2の発色試液組成に於て、 ァジ化ナ ト リ ゥムを除いた 組成の発色試液を調製する。
    [0294] ② Η202標準液
    [0295] 実施例 1 3に同じ。 .
    [0296] (2)測定操作
    [0297] 実施例 1 3 と同様にして吸光度を測定する。
    [0298] 検量線を第 8図に示す。
    [0299] 実施例 1 5 ·· アジ化ナ ト リ ウム存在下での総コレ ステロ一ルの定 里
    [0300] (1)試藥の調製 page 30
    [0301] 一 35—
    [0302] ① ¾fes ¾i^s CQ ont contribue de fa on eff icace a ameliorer la
    [0303]
    [0304] Prix Deming en 1980, se termine par ces mots ：
    [0305] ペル才キ ^ダ、一ゼ 3 0 0 U Z 、 ア^化ナ ト リ ウ ム 0· 2 、 卜
    [0306] " ... arace a oue丄 gues xdees excellentes emanant des membres de 11 equipe et se pose dans not re travail,"
    [0307] する。
    [0308] 2·φ^Ρ gy^ej 6 r es-s g^s^(^ (Teian Seido)
    [0309]
    [0310] chez des societes d'accueil ou le systeme peu e re e uaie rec emen .
    [0311]
    [0312] y enquete portant sur 1977, 1.070.000 salaries de 244 societes ■fait 5.740,000 suggestions, c 'est - έ一 dire 5,36 par membre du personnel pendant 1 * annee . La Matsushita Electrical Company, a elle seule, a en^^l^試敏 000 suggestions. Ensuite, venaient dans 11 ordre Hitachi
    [0313] Corporation, Toshiba Corporation, Sumitomo Steel, Fuji Electrical Company,
    [0314] ^"鼓 t ^ampa^y^ ^ st igteressant e noter que ces memes soc etes es
    [0315] ^ΟΜΡΓ ②コ レステロ一ル標準液
    [0316] 実施例 1 5に同じ。
    [0317] (2)測定操作
    [0318] 実施例 1 5 と同様にして吸光度を測定する。 検量線を第 9図に 示す。 検量線は原点を通る直線になるが、 コレステロー ル濃度
    [0319] 2 0 0 Ζί¾で吸光度 0.7 3 1 と高値であ ] 、 対数目盛を用いた、 通常の光度計では精度が悪くなる。
    [0320] 実施例 1 7 ： ^— C D存在下での Η202の定量
    [0321] (1)試薬の調製
    [0322] ①発色試液
    [0323] 0.1 Μト リ ス一塩酸緩衝液 （ρΗ 7.5 ) に/ 一 C D 0.2 %、 ぺ ノレォキシダーゼ 6,0 0 θ ϋΖ^の濃度に るよ うに溶解させ、 こ れに B S P Mを 0. I mMの濃度にるるよ うに溶解させる。
    [0324] ② H202標準液
    [0325] 各々 1 5 ψΖ 、 、 4 5 ι ん 6 0 Ζ 及び
    [0326] 7 5 ^ノ の濃度の Η202水溶液を調製する。
    [0327] (2)測定操作 ' .
    [0328] 各濃度の Η2ϋ 2標準液を夫々 2 0 ί と 、 各々に凳色試液 3 ^を加えて 3 7 °Cの恒温槽中で 1 0分間加温後、 試薬ブラ ンクを 対照として 6 3 0 n mにおける吸光度を測定する。
    [0329] 縦軸に吸光度、 横軸に H202濃度をとつた検量線を第 1 0図に 示す。 検量線は原点を通る直線であ 、 Η202 1 5 £のとき .の吸光度は B S Ρ Μを包接せずにそのまま用いた実施例 1 9に於 ける対応する値の 3 7.4 %である。
    [0330] 実施例 1 8 ： α— C D存在下での H2t)2の定量
    [0331] ΟλίΡΙ (1)試薬の調製
    [0332] ①発色試液
    [0333] 実施例 1 7の発色試液組成の ^一 C D 0.2 を 一 C D l ¾¾に 置きかえた発色試液を調製する。
    [0334] ② H202標準液
    [0335] 実施例 1 7に同じ。
    [0336] (2)測定操作
    [0337] 実施例 1 7 と同様にして吸光度を測定する。
    [0338] 検量線を第 1 0図に示すが、 検量線は原点を通る直線であ ] 、 H 202 1 5 ^Z のときの吸光度は実施例 1 9の対応する値の
    [0339] 5 5.2 である。
    [0340] 実施例 1 9 ： C D不在下での H202の定量 -
    [0341] (1)試薬の調製
    [0342] ①発色試液
    [0343] 0.1 M 卜 リ ス一塩酸緩衝液 （ pH 7.5 ) にペ ルォキシダーゼ
    [0344] 6， 0 0 0 Uノ^、 B S P Mを 0. I mMの濃度に ¾るよ うに加え、 攪拌下に溶解させる。 このとき、 B S P Mは完溶しるいので、 約 1 0分間攪拌後不溶分は^去し、 ^液を発色試液とする。
    [0345] ② H202標準液
    [0346] 実施例 1 7に同じ。
    [0347] (2)測定操作
    [0348] 実施例 1 7と同様にして吸光度を測定する。 検量線を第 1 0図 に示すが、 B S P Mの溶解度が低い為発色剤不足を来し、 そのた め検量線は直線に らない。
    [0349] 実施例 2 0 ： 一 C D存在下での H202の定量 (1)試薬の調製
    [0350] ①発色試液
    [0351] 0.1 M ト リ ス一塩酸緩衝液 （ pH 7.5 ) に B S dipro P M 0, 1 mM、 ^一 C D 0.2 及びペルォキシダーゼ 6， 0 0 0 U Z の濃
    [0352] 5度になる量加えて溶解させる。
    [0353] ② H202標準液
    [0354] 実施例 1 7に同じ。
    [0355] (2)測定操作
    [0356] 実施例 1 7 と同一橾作によ j 波長 6 2 0 n mの吸光度を測定す 10 る。 検量線を第 1 1図に示す。 検量線は原点を通る直線であ D、
    [0357] H202 1 5 Z のときの吸光度は B S dipro P Mを包接せずに そのまま用いた実施例 2 2の対 ISする値の 2 9.0 %である。
    [0358] 実施例 2 1 ： a - C D存在下での H202の定量
    [0359] (1)試薬の調製 is ①発色試液
    [0360] 実施例 2 0の発色試液組成の を α— C D 1 に 置きかえた発色試液を調製する。
    [0361] ② Η2ϋ2標準液
    [0362] 実施例 1 7に同じ。
    [0363] 20 (2)測定操作
    [0364] 実施例 2 0 と同様にして吸光度を測定する。 検量線を第 1 1図 に示す。 検量線は原点を通る直線であ 、 Η202 1 5 ^ノ^のと .きの吸光度は実施例 2 2の対応する値の 3 8.7 である。
    [0365] 実施例 2 2 ： C D不在下での H202の定量法 )試薬の調製
    [0366] ΟΜΗ Λ WIPO ①発色試液
    [0367] 実施例 2 0の発色試液組成に於て、 ^一 C Dを除いた組成の発 色試液を調製する。
    [0368] ② H202標準液
    [0369] 実施例 1 7に同じ。
    [0370] (2)測定操作 - 実施例 2 0 と同様にして吸光度を測定する。 検量線を第 1 1 図 に示す。 検量線は原点を通る直線となる。
    [0371] 実施例 2 3 ： 5>— C D存在下での H202の定量
    [0372] (1)試薬の調製
    [0373] ①発色試液 ' 0.1 M ト リ ス一塩酸緩衝液 （ pH 7.5 ) に、 B S pro PM 0.1 mM、 - C D 0.2 及びべノレォキシダーゼ 6,0 0 O UZ^の濃 度になる量加えて溶解させる。
    [0374] ② H 202標準液
    [0375] 実施例 1 7に同じ。
    [0376] (2)測定操作
    [0377] 実施例 2 0 と同様にして吸光度を測定する。 検量線を第 1 2図 に示す。 検量線は原点を通る直線であ 、 H202 1 5 9 / Ά Dヒ きの吸光度は B S pro PMを包接せずにそのまま用いた実施例 2 5の対応する値の 3 8.8 %である。
    [0378] 実施例 2 4 ： a—C D存在下での H202の定量
    [0379] (1)試藥の調製
    [0380] ①発色試液
    [0381] 実施例 2 3の発色試液組成に於て、 — C D 0.2 %を i に置きかえた発色試液を調製する。
    [0382] ② Η202標準液
    [0383] 実施例 1 7に同じ。
    [0384] (2)測定操作
    [0385] 5 実施例 2 0 と同様にして吸光度を測定する。 検量線を第 1 2図 に示す。 検量線は原点を通る直線であ ] 、 Η202 1 5 / と きの吸光度は実施例 2 5の対応する値の 5 3.7 である。
    [0386] 実施例 2 5 ： C D不在下での Η202の定量
    [0387] (1)試薬の調製
    [0388] 10 ①発色試液
    [0389] 実施例 2 3の発色試液組成に於て、 一 C Dを除いた組成の発 色試液を調製する。
    [0390] ② Η202標準液
    [0391] 実施例 1 7に同じ。
    [0392] (2)測定操作
    [0393] 実施例 2 0 と同様にして吸光度を測定する。 検量線を第 1 2図 に示す。 検量線は原点を通る直線になる。
    [0394] 実施例 2 6 ： — C D存在下での総コ レステロ ールの定量 は)試薬の調製
    [0395] 20 ①凳色試液
    [0396] 0.1 Μ ト リ ス一塩酸緩衝液 （ ρΗ 7. 0 ) に、 B S dipro P M 0.0 5 mM、 ゥ リ カーゼ 3 0 0 U ^ コ レステロ ー ルォキシダ ーゼ 1 5 0 U / 、 ペルォキシダーゼ 3, 0 0 0 UZ^、 C D 0.2 %及びト リ ト ン X— 1 0 0 0. 1 5 ^になる量加えて溶解さ
    [0397] 25せ、 これを発色試液とする。 ②コレステロ一ル標準液
    [0398] 各々 1 0 0 τ /、(Β、 2 0 0 τ / Μ、 3 0 0 τ / dt、 4 0 0 di 及び 5 0 0 Ζίί の濃度のコ レステ ロ ールのィ ソブロハ 'ノ ール溶 液を調製する。
    [0399] (2)測定操作
    [0400] 各濃度のコ レス テ ロ ール標準液を夫々 2 0 と ] 、 これに発 色試液 3 を加えて 3 7 °Cの恒温槽中で 1 0分間加温後、 試藥ブ ラ ンクを対照と して波長 6 2 0 a mにおける吸光度を測定し検量 線を作成する。 検量線を第 1 3図に示す。 検量線は原点を通る直 線と 、 コ レステロ一ル濃度 2 0 0 τ / d で 0.2 1 0の通常の 光度計による測定に適した吸光度を示した。
    [0401] 実施例 2 7 ：修飾^一 C D存在下での総コ レステロ ールの定量
    [0402] (1)試薬の調製 .
    [0403] ①発色試液
    [0404] 0.1 M ト リス一塩酸緩衝液 （ pH 7.0 ) に B S dipro P Μθ.05 mM、 ゥ リ カーゼ 3 0 0 UZ 、 コ レステロ ールォキシダーゼ 1 5 0 UZ 、 ペルォキシダーゼ 3， 0 0 0 U // 、 へブタ キス ( 2 ， 6—ジ一 0—メチル） 一^一シクロデキス ト リ ン 0.3 %及 びト リ ト ン X— 100 0.15 %になる量加えて溶解させ、 これを発 色試液とする。
    [0405] ②コ レステロ ール標準液
    [0406] 実施例 2 6に同じ。
    [0407] (2)測定操作
    [0408] 実施例 2 6の測定法に従い、 波長 6 2 0 n mに於ける吸光度を 測定し検量線を作成する。 検量線を第 1 4図に示す。 検量線は原 点を通る直線と ！？、 コ レステ ロ ー ル濃度 2 0 0 ^ ^で 0.220 の通常の光度計による測定に適した吸光度を示した。
    [0409] 実施例 2 8 — C D不在下での総コ レステ ロ ールの定量
    [0410] (1)試薬の調製
    [0411] ①発色試液
    [0412] 実施例 2 6の発色試液組成に於て、 — C Dを除いた組成の発 色試液を調製する。
    [0413] ②コレステロ一ル標準液
    [0414] 実施例 2 6に同じ。
    [0415] (2)測定操作
    [0416] 実施例 2 6 と同様にして吸光度を測定する。 検量線を第 1 3図 (第 1 4図） に示す。 検量線は原点を通る直線になるが、 コレス テ口ー ル濃度 2 0 0 ^ ^ で吸光度 0.7 3 1 と高値と ¾ j 、 その ため対数目盛を用いた光度計では精度が悪くなる。
    [0417] 実施例 2 9 ： j& - C D存在下での ト リ セラ ィ ドの定量
    [0418] (1)試薬の調製
    [0419] ①発色試液
    [0420] 0.0 5 Mト リ ス一塩酸緩衝液 （ pH 7. 5 ) に B S dipro P M 0.0 5 m M、 ゥ リ カーゼ 3 0 0 Ό / £ リ ポプロ テイ ン リ バ一ゼ 5,ひ 0 0 ϋ ^、 グリ セロキナーゼ 4， 0 0 0 ϋ ^、 グリ セロ ー ルー 3—ひ ン酸ォキシダーゼ 1， 0 0 0 U ^ 、 ペ ルォキシダ一ゼ 3, 0 0 0 Ό / , ー C D 0.2 %、 A T P 1, 0 0 0 / ^ . 塩化 マグネシウム 5 m Μ、卜 リ ト ン X— 4 0 5 0. 1 及びエマー ル N C (花王石鹼㈱商品名） 1. 0 %を含む溶液を調製する。
    [0421] ②グリ セリ ン標準液 各々 1 Z c 、 2 0. 8 wZd£、 3 1.2 / di^ 4 1.6 w di^ 5 2.0 / di び 6 2.4 ^ノ^の濃度のグリ セ リ ン水溶液を調製 する （但し、 ト リ オ レイ ンと して夫々 1 0 0 wZde、 2 0 0 £、 3 0 0 4 0 0 τ Z d 5 0 0 τ / d 及び 6 0 0 / di
    [0422] 5の濃度に相当する。 λ
    [0423] (2)測定操作
    [0424] 血清 2 0 ^^ をと ] 、 これに発色試液 3 ^を加えて 3 7 °Cの恒 温槽中で 1 0分間加温後、 試薬盲検を対照と して波長 6 2 0 ti m の吸光度を測定する。
    [0425] 10 又、 各濃度のグリ セリ ン標準液を夫々 2 0 , " と 、 これに発 色試液 3 ^を加えて、 血清の場合と同一の操作によ ！）、 吸光度を 測定し検量線を作成する。 検量線を第 1 5図に示す。 検量線は原 点を通る直線と ¾ j？、 ト リグリ セライ ド濃度 2 0 0？^ノ で 0ュ85 の通常の光度計による測定に適した吸光度を示した。
    [0426] 実施例 3 0 ： — C D不在下での ドリグリ セライ ドの定量
    [0427] (1)試薬の調製
    [0428] ①発色試液
    [0429] 実施例 2 9の発色試液から、 一 C Dを除いた組成の発色試液 を調製する。
    [0430] 20 ②グリ セリ ン標準液
    [0431] 実施例 2 9に同じ。
    [0432] (2)測定操作
    [0433] 実施例 2 9 と同様にして各濃度のグリ セリ ン標準液を発色させ、 その吸光度を測定し、 これから検量線を作成する。 検量線を第
    [0434] 25 1 5図に示す。 検量線は原点を通る直線と ¾るが、 ト リ グ リ セ ィ ド濃度 3 0 0 での吸光度が 0. 9 5 1 と高値と ¾ )、 その ため対数目盛を用いた光度計では精度が悪くなる。
    [0435] 実施例 2 9 と実施例 3 0 による血清ト リグリ セライ ド測定値の 比較を次表に示す。
    [0436] 第 7 表 .
    [0437] 血清ト リグリセライ ド測定値比較表 '
    [0438]
    [0439] r = 0. 9 9 9 第 7表に示す通 ]7実施例 2 9 と実施例 3 0は、 r = 0. 9 9 9 と 良い相関を示す。
    [0440] 産 蓁上 の 利 甩 可 能 性
    [0441] 以上述べた如く、 本発明の新規発色試薬は高感度であ！）、 しか も本発明によれば呈色を妨害する物質の影響を効果的に回避する ことができるので、 生体試料特に血液や尿るどの体液中の微量成 分の定量に適しているとともに、 更に本発明によれば発色感度を 適宜調節することができるので、 本発明の新規発色試案の使用範 囲を微量成分の定量に限らず、 その優れた特性、 即ち呈色波長が 長波長側にあ Ό、 且つ呈色後の経時的褪色が殆ど ¾いなどの特性 を生かして臨床化学分析等の幅広い用途への応用が可能である
    [0442] 、 iリ Λ γ7
    权利要求:
    Claims
    請 求 の 範 囲-
    C I 〕
    〔式中、 , B,2 , Rs 及び R4 は低級アルキル基を表わし, 夫々同じであっても異つていても良く、 Xi 及び X2 はどちらも 一 0(CH2)n S03M (但し、 Mは水素原子、 アルカ リ金属イ オン 又は ΝΗ^を示し、 tiは 2〜4の整数を示す。）を表わすか、 又はど ちらか一方が一 0(CH2 )nS03M (但し、 M ， riは前記と同じ） を表わし、 他方が水素原子を表わす。〕 で表わされる ト リ フ エ - メ タ ン誘導体。
    (2) 式〔 I 〕において、
    Xi 及び X2 がどちらも一 0(CH2 )nS03Mを表わす請求の範 囲第 1項に記載の化合物。
    (3) 式〔 I 〕にお て、
    Xi 及び X2 のいずれか一方が一 （OCH2)nS03Mを表わし、 他方が水素原子を表わす請求の範囲第 1項に記載の化合物。
    (4) ビス （4— N ， N—ジェ チルァ ミ ノ フ エ - ル ） 一 4ーソ ジ ゥムスルホブロボキシフ エ ニルメ タ ンまたはビス （ 4— N ， N— ジェ チルァ ミ ノ フ エ 二ル ） 一 3 ， 4ージソ ジゥ ム スルホ ブロ ポキ シフ ヱ ニルメ タ ンである請求の範囲第 1項に記載の化合物。
    (5) 次式〔 【 〕 ：
    OMPI
    s 〔式中、 、 R2 、 R3 及び R4 は低級アルキル基を表わし、 夫々同じであっても異つていても良く、 Xi 及び X2 はどちらも -0(CH2 )n SO3M (但し、 Mは水素原子、 アルカ リ金属イ オン 又は NH4+ を示し、 nは 2〜 4の整数を示す。）を表わすか、 又は どちらか一方が一 0(CH2)nS03M (但し、 M ， πは前記と同じ） を表わし、 他方が水素原子を表わす。 〕で表わされる ト リ フ エ二 ルメ タ ン誘導体を発色成分と して用いる酸化性物質の定量法。
    (6) ペルォキシダーゼの存在下、 発色成分を酸化発色させてそ の呈色を比色定量する請求の範囲第 5項に記載の酸化性物質の定
    (7) 酸化性物質が過酸化水素であ ] 、 該過酸化水素が酵素反応 によ！）生成する過酸化水素である請求の範囲第 6項に記載の酸化 性物質の定量法。
    (8) 過酸化水素が、 生体試料中の微量成分の定量に於て酵素反 応によ ] 生成する過酸化水素である請求の範囲第 7項に記載の酸 化性物質の定量法。
    (9) 生体試料中の微量成分の定量が、 基質、 又は酵素反 iSによ )生成した物質に酸化酵素を作用させ生成する過酸化水素を定量 することによ 行う生体試料中の基質又は酵素活性の定量である 請求の範囲第 8項に記載の酸化性物質の定量法。
    (1 0)次式〔 I 〕 ： 〔 W 〕
    X 〔式中、 R 、 R 、 R 及び R は、 水素または低級ァノレキ ル基を表わし、 夫々同じであっても異 っていても よく、 x 及
    び X2 は水素、 一 SO sM^ —COOM2、 一 O CH m'SO sM^ 一 0 (CH2 ) COOI ^または一N ( R ） (R ) (但し、 M 、 、 M3 及び M4 は水素原子、 アルカ リ金属イ オンまたは NH:を示し、 R5 及び R6 は互いに独立して水素原子または低級アルキル基を
    示し、 m ' 及び ri¾夫々 2〜 4の整数を示す。 ） を表わし、 夫々 同じであっても異なっていても良 。 〕で表わされる 卜 リ フ エ - ノレメ タ ン系ロ イ コ色素を発色剤と して用いる酸化性物質の定量法
    に於いて、 （i)ゥ リ カーゼ、 （ii)ァ-オン系界面活性剤及び金属キ レ
    一ト化合物のうちの少く とも 1種を用いることを特徵とする呈色
    妨害物質の影響を回避した酸化性物質の定量法。
    (11)酸化性物質が基質、 又は酵素反応によ D生成した物質に酸
    化酵素を作用させ、 生成する過酸化水素である請求の範囲第 1 0
    項に記載の酸化性物質の定量法。
    (12)ペルォキシダ一ゼの存在下、 発色剤を酸化発色させ、 その
    呈色を比色定量することによ 過酸化水素を定量する請求の範囲
    第 1 1項に記載の酸化性物質の定量法。
    .
    (13)過酸化水素を定量することによって、 グルコース、 コ レス テ ロ ール、 ト リ グ リ セ ラ イ ド、 リ ン S旨質、 コ リ ン、 ク レアチン、 ク レアチュン、 胆汁酸及びモノ ア ミ ンォキシダ一ゼの群から選ば
    - £
    CMPI
    ；: 、 VVIPO .V 、： ^ΝΑΊΙ ^ れる体液成分を定量する請求の範囲第 1 1 に記載の酸化性物質 の定量法。
    (1 4) 過酸化水素を定量することによって体液中のペルォキシ ダ—.ゼ様物質を定量する請求の範囲第 1 0項に記載の酸化性物質
    5の定量法。
    (15) ペルォキシダーゼ様物質がへモグロ ビ ン又はその他のへ ム化合物である請求の範囲第 1 4項に記載の酸化性物質の定量法。
    (1 6) 呈色妨害物質が尿酸であ 、 ゥ ひカーゼを用いてこれの 影響を回避する請求の範囲第 1 0項〜第 1 5項のいずれか 1項に
    10記載の酸化性物質の定量法。
    (17) 呈色妨害物質がタ ンパクであ ' ァ - オ ン系界面活性剤 を用いてこれの影響を回避する請求の範囲第 1 0項〜第 1 5項の いずれか 1項に記載の酸化性物質の定量法。
    (1 8) 呈色妨害物質がタ ンパクであ ] 、 金属キ レー 卜化合物を 用いてこれの影響を回避する請求の範囲第 1 0項〜第 1 5項のい ずれか 1項に記載の酸化性物質の定量法。
    (1 9) 呈色妨害物質が尿酸及びタ ンパクであ！）、 ゥ リ カーゼを 用いて尿酸の影響を回避し、 ァニオ ン系界面活性剤を用いてタ ン パクの影響を回避する請求の範囲第 1 0項〜第 1 5項のいずれか0 1項に記載の酸化性物質の定量法。
    (20) 呈色妨害物質が尿酸及びタ ンパクであ ])、 ゥ リ カーゼを 用いて尿酸の影響を回避し、 金属キレー ト化合物を用いてタ ンパ クの影響を回避する請求の範囲第 1 0項〜第 1 5項のいずれか 1 項に記載の酸化性物質の定量法。
    5
    (21) —般式〔 Π 〕 R5 0(CH2CH2Q)k SQ3M5 C Π ] 又は一般式〔 I 〕
    R60(CH2CH20)^ S03M6 C I
    〔式中、 R5 は炭素原子数 8〜 9のアルキル基を表わし、 H6 は炭素原子数 8〜 1 8のアルキル基を表わし、 M5 及び M6 は夫 夫アルカ リ金属イ オン、 アンモ -ゥ ム イ オ ン又は第 4級アンモ - ゥ ムイ オンを表わし、 k及び は夫々 1〜 6の整数を表わす。 〕で 表わされるァニオン系界面活性剤を用いる請求の範囲第 1 7項に 記載の酸化性物質の定量法。
    (22) 金属キ レー ト化合物が金属一 E D T A (エチレン -： アミ ン四酢酸） キレー トである請求の範囲第 1 8項に記載の酸化性物 質の定量法。
    (23) 下記一般式〔 ΙΓ〕で表わされる 卜 リ フ エ-ルメ タ ン誘導 体を発色成分と して用いる酸化性物質の定量法に於て、 感度を調 節する目的でアジ化物を用いることを特徵とする酸化性物質の定 量方法。
    R5 〔 〕
    〔式中、 、 R2 、 及び R4 は、 水素または低級アルキ ル基を表わし、 夫々同じであっても異なっていても よ く、 X 及 び Χ2 は水素、 -S03Mi 、 一 COOM2、一ひ（CH2 )m' S03M3 一 0(CH2 )χ COOM または一 N (R ) "( S') (但し、 M 、 M 、 M 及び M は水素原子、 アル力 リ金属ィオンまたは NH を示し、 R5 及び R6 は互いに独立して水素原子または低級アル キル基を示し、 m' 及び は夫々 2〜 4の整数を示す。 ） を表わ 5 し、 夫々同じであっても異 っていても よい。 〕
    (24) ァジ化物がアジ化ナ ト リ ゥムである請求の範囲第 2 3項 に記載の酸化性物質の定量方法。
    (25) ペルォキシタ'ーゼの存在下、 発色成分を酸化発色させ、 その呈色を比色定量する請求の範囲第 2 3項に記載の酸化性物質 10の定量方法。
    (26) 酸化性物質が過酸化水素であ 、 該過酸化水素が、 酵素 反応によ D生成する過酸化水素である請求の範囲第 2 5項に記載 の酸化性物質の定量方法。
    (27) 過酸化水素が、 生体試料中の微量成分の定量に於ける酵 素反応によ 生成する過酸化水素である請求の範囲第 2 6項に記 載の酸化性物質の定量方法。
    (28) 生体試料中の微量成分の定量が、 基質、 又は酵素反応に よ 生成した物質に酸化酵素を作用させ、 生成する過酸化水素を 定量することによ 行う生体試料中の基質又は酵素活性の定量で 0ある請求の範囲第 2 7項に記載の酸化性物質の定量方法。
    (29) シク ロデキス ト リ ン又は修飾シク ロ デキス ト リ ンを用い て包接した一般式〔 IV 〕 ：
    〔式中、 R 、 B 、 R 及び R は、 永素または低級アルキ ル基を表わし、 夫々同じであっても異なっていても よく、 X 及 び Χ2' は水素、 一 S03 Μ 、 一 COOM2'、 一 0(CH2)m'S03M3'、
    —0(CH2 )n COOM または一N(R5') (R ) (但し、 M 、 M 2
    M3' 及び M /は水素原子、 アル力 リ金属ィオンまたは ΝΗί を示 し、 1^ 5 及び は互いに独立して水素原子または低級アルキ
    基を示し、 rn^及び は夫々 2〜 4の整数を示す。 ) を表わし、 夫 々同じであっても異 っていても よい。 〕 で表わされる ト リ フエ ニ ルメ タ ン誘導体を発色成分と して用いる酸化性物質の定量法。
    (30) ペルォキシダーゼの存在下、 発色成分を酸化発色させ、 その呈色を比色定量する 請求の範囲第 2 9項に記載の酸化性 物質の定量法。
    (31) 酸化性物質が過酸化水素であ j？、 過酸化水素が、 酵素反 応.によ j 生成する過駿化水素である 請求の範囲第 2 9項に記 載の酸化性物質の定量法。
    (32) 過酸化水素が、 生体試料中の微量成分の定量に於て酵素 反応によ！）生成する過酸化水素である 請求の範囲第 3 1項に 記載の酸化性物質の定量法。
    (33) 生体試料中の微量成分の定量が、 基質、 又は酵素反 に よ 生成した物質に酸化酵素を作用させ生成する過酸化水素を定 量することによ！)行う生体試料中の基質又は酵素活性の定量であ る 請求の範囲第 3 2項に記載の酸化性物質の定量法。
    、 WIPO
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