专利摘要:

公开号:WO1985002188A1
申请号:PCT/JP1984/000120
申请日:1984-03-23
公开日:1985-05-23
发明作者:Toshitada Takahashi;Ryuzo Ueda;Kazuo Ohta
申请人:Toshitada Takahashi;
IPC主号:G01N33-00
专利说明:
[0001] 明 細 書 新 規 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体
[0002] 技 術 分 野
[0003] 本発明はヒ ト白血球に存在する抗原を検出するモノ クローナル抗体 およびその製造法に関する。
[0004] 背 景 技 術
[0005] ヒ ト リ ンパ球 T細胞, B細胞および各々のサブセッ トに対するモノ クローナル抗体が最近の細胞工学の手法を用いることにより作製可能 となり、 各々の細胞群が次第に明確になってきた 〔Reinherz, B. L.
[0006] e —―t ■ a—l : Cell — 19―, 821 (1980), Ροοπ, Κ. A. — e—t a―l : Blood 6一0一,
[0007] 1 (1982)〕 0
[0008] 即ち、 これらサブセッ トを認識するモノ ク口ーナル抗体を用いるこ とにより、 ヒ ト リ ンパ球の機能的細胞亜群がより明確となり、 各種疾 患におけるこれらの異常が明らかにされつつある。
[0009] 発 明 の 開 示
[0010] 本発明者らは、 各種造血器疾患の診断等に使用できるモノ クローナ ル抗体を見出すベく研究を重ねた結果、 白血球に存在する抗原および 成人 T細胞白血病 (以下 A T Lと略記する) に対するモノ クローナル 抗体を見出し、 本発明を完成するに至った。
[0011] 以下本発明を詳細に説明する。
[0012] 本発明は、 白血球に存在する抗原および A T Lウ ィ ルス (以下 A T L Vと略記する) に対するモノ ク口 ーナル抗体を提供する。
[0013] 本発明のモノ ク口ーナル抗体は、 具体的には、 T p w 4 0 , T p 1 0 T a 6 0 a , T a 6 0 b , T a 6 0 c , T s 6 0 , T s w 3 2 , T s A , T s B , T s l 4 5 , L p 9 5 , L s 7 0 , し s A, A T V 1 9 a , A T V 1 9 bと命名されたものがあげられる。
[0014] T a 6 0 a , T a S O bおよび T a 6 0 cは正常人未稍血 T細胞分 画, 穽 T ( B ) 細胞分画, 単球, 顆粒球, 胸腺細胞などの正常血液細 胞とは反応せず、 T細胞群をィ ンターロイキン— 2 〔 I L - 2 , パイ ォテス ト社 (西独) 〕 , フイ トへマグルチニン 〔P H A, ディフコ社 (米国) 〕 , コンカナバリ ン A 〔 ConA, B. T. 钍 (米国) 〕 , ポーク ウィードマイ トジヱン 〔P W M, ギブコ社 (米国) 〕 などのマイ トジ ンゃァロ B細胞などで刺激することにより得られたいわゆる活性化 T細胞に反応することを特徴としている (実施例 8参照) 。 すなわち、 対照としてマイ トジェンを舍まない培養液のみの培養条件では発現し てこないことを特徴としている。
[0015] 本発明のモノ ク口ーナル抗体のうち T a 6 0 a , T a 6 0 bは、 固 型腫瘍由来の細胞とは反応しない造血器腫瘍細胞に対しては、 T細胞 由来のうちでも A T Lの全例に陽性を示し、 A T L以外の T細胞由来 悪性疾患に関してほとんど全ての症例で陰性である。 このことは臨床 上鑑別困難な症例群を明確に区別するために本発明のモノ クローナル 抗体が使用できることを示している。
[0016] また本発明のモノ クローナル抗体は、 T細胞由来以外の腫瘍細胞と して、 B— C L L ( B細胞性慢性リ ンパ性白血病) や B - M L ( B細 胞性悪性リ ンパ腫) の一部症例に弱陽性に反応し、 骨髄性細胞由来の A M L (急性骨髄性白血病) の一部症例にも弱陽性に反応することも 特徵としている。
[0017] T p w 4 0および T p 1 2 0は、 末棺血リ ンパ球 T細胞分画の大部 分の細胞と反応し、 いわゆる T細胞 ( pan T ) 抗原を検出する。
[0018] T s 6 0 , T s w 3 2 , T s A , T s Bおよび T s l 4 5の 5抗体 は、 T細胞分画の一部分の細胞に存在する抗原, T亜分画 (サブセッ ト ) 抗原を検出する。 T s 6 0は、 T a 6 0 と同じ抗原分子量を示す が、 血清学的特異性は異なり、 活性化 T細胞とは反応せず、 T細胞株 の一部とのみ反応を示す。
[0019] L p 9 5は、 全ての白血球細胞と反応を示す白血球 (Pan leukocyte) 抗原を検出し、 一方 L s 7 0および L s Aは、 単球およびその他の白 血球細胞の一部と反応を示し、 白血球亜分画 ( leukocyte subset) 抗 原を認識する。
[0020] T p w 4 0 , T p l 2 0は、 ともに p a n T抗原を検出しているが, T p w 4 0は、 T細胞腫瘍のうち比較的未熟な T細胞型急性リ ンパ性 白血病 ( T - A L L ) およびリ ンパ芽球腫 ( L L ) に反応を示し、 一 方 T p 1 2 0は、 成熟型 T細胞腫である T 2 リ ンパ腫および A T Lに 反応を示す。 また、 T p 1 2 0は B細胞型慢性リ ンパ性白血病 ( B - C L L ) にも反応を示す。 (第 6表)
[0021] T s w 3 2は、 T— A L Lおよび L Lに反応を示し、 T s Aはこの 両 T細胞腫瘍とともに T2 リ ンパ腫, A T L等の成熟型 Τ細胞腫とも 反応を示した。
[0022] T s Bは、 成熟型 T細胞腫である T 2 リ ンパ腫, A T Lに高率に反 応した。 T s Bは、 B - C L Lとも反応を示した。
[0023] これら、 T細胞分化抗原を検出する抗体は、 T細胞腫瘍の鑑別診断 に有用でめる。
[0024] T s 1 4 5は、 末稍リ ンパ球にはほとんど反応を示さず、 I L - 2 存在下で長期培養されている T細胞株に特異的に反応を示すという特 徴を持つ。
[0025] L p 9 5は、 白血球の大部分と反応を示し、 また、 ほぼ全ての白血 病およびリ ンパ腫とも反応を示す。
[0026] L s 7 0は、 単球および他の白血球の一部に存在し、 T細胞リ ンパ 腫中 T2 リ ンパ腫および A T Lに反応し、 また B - C L Lとも反応す る
[0027] L s Aは、 単球および T細胞と主に反応し、 T細胞リ ンパ腫とはま つたく反応を示さない。 また、 単球性白血病には高率に反応を示す。
[0028] A T V 1 9 aおよび A T V 1 9 b抗体は、 A T L V構成蛋白中の P 1 9成分に対するモノ ク口ーナル抗体であり、 M T - 1 , M T - 2 ¾ どの A T L由来の培養株ならびに A T L白血病細胞の I L - 2存在下 の短期培養した細胞にも存在する抗原を検出することを特徴とする。
[0029] A T V 1 9 aおよび A T V 1 9 bは、 ウイルスの粒子構成蛋白で、 分子量 1 9 X 1 03 のぺプチ ドを認識しており、 A T Lの診断に有用 、め O 0
[0030] 本発明モノ クローナル抗体の生物学的活性は実施例 6〜 1 3に示し た。 実施例中に用いたマウス混合血球吸着試験 〔 Mouse - mixed hemadsorption assay , Μ - Μ Η A ] 法は下記の方法に従い、 マイク 口プレー ト 〔Palcon社, 3 0 4 0〕 に単層細胞培養または浮遊細胞を 付着させた標的細胞への措示細胞の付着の有無で観察する。 措示細胞 としては、 ヒッジ赤血球とマウス抗ヒッジ赤血球抗体を反応させた後、 さらに家兎抗マウスィムノ グロブリ ン血清を反応させたものを用いる。
[0031] マウス混合血球吸着試験 〔M - M H A〕 :
[0032] M - M H Aは Espmarkと Pagreus の原法 ( Acta. Pathol. Microbiol. Scond. Suppl. 154 258-262, 1962 ) を改良して行う。
[0033] 指示赤血球の作製法は以下の通りである。
[0034] 洗濮羊赤血球 2 %浮遊液と等量の 1, 0 0 0倍希釈マウス抗羊赤血球 抗体 ( B A L B / cマウスに羊赤血球を過免疫して作製) とを 2 4で にて 45分間反応させ洗濮後再び 2 %浮遊液として等量の 2 0 0倍稀 釈家兎抗マウスィムノ グロブリ ン ( C a p p e 1社, 米国) を 2 4で にて 4 5分間反応させた後、 2回洗鲦後再び 2 %浮遊液としたものを、 いわゆる M - M H Aの措示赤血球として用いる。
[0035] - H A検査法の手法としては、 被検索細胞は、 ハイプリ ドーマ 細胞, 培養上清またはハイブリ ドーマ細胞接種 B A L B / cマウスも しくは B A L B / c由来ヌードマウス腹水と 2 4でにて 4 5分間反応 させ、 抗体を洗髌除去後、 0.2 %指示羊赤血球と 2 4 にて 4 5分間 反応させ、 餒く一度リ ン酸緩衝液生理食塩水 ( P B S ) で洗濾後光学 的顕微鏡下、 指示赤血球のロゼッ ト形成の有無にて判定する。 また実施例中において用いた間接螢光抗体法 〔細胞質螢光抗体法
[0036] ( C y - I F ) または膜螢光抗体法 ( M - I F ) は下記方法で行った。 細胞質螢光抗体法 :
[0037] 1〜 5 X 1 04 の標的細胞を、 スライ ドグラス上に 9 5 %アセ ト ン で 1 0分間固定し、 - 7 0 :に保存しておいたものを標的細胞として 用 ヽる
[0038] 第 1次抗体として、 ハイブリ ドーマ細胞培養上清またはハイブリ ド 一マ細胞接種 B A L B / cマウスもしく は B A L B / c由来ヌー ドマ ウス腹水 2 5 ^を用いて 4でまたは 2 5 にて 3 0分間反応させる。 P B Sで洗濮後 2次抗体として、 2 0〜 4 0倍稀釈螢光標識家兎マウ スィ 厶ノグロブリ ン G A M ( G A M - F I T C , コール * タ一社, 米 国) を 2 5でにて 3 0分間反応させる。 反応は螢光顕微鏡下で螢光の 有無にて判定する。
[0039] 膜螢光抗体法 :
[0040] 5 x 1 0 s 個/ mlの標的細胞 5 0 " と、 第 1次抗体としてハイブ リ ドーマ細胞培養上清またはハイブリ ドーマ細胞接種 B A L B / cマ ウスもしく は B A L B / c由来ヌードマウス腹水 5 0 £とを用いて、 4 または 2 5でにて 3 0分間反応させる。 P B Sで洗滌後、 2次抗 体として 2 0〜4 0倍稀釈螢光標識家兎マウスィ ムノ グロブ リ ン G A ( G A M— F I T C, コ ール · タ一社, 米国) を 2 5でにて 3 0分 間反応させる。 反応は螢光顕微鏡下で螢光の有無にて判定する。
[0041] 本発明のモノ クローナル抗体はマウスを A T L細胞, A T L V産性 株 M T— 2細胞または M T - 2より分離した A T Lウ ィ ルス ( A T L V ) , 混合培養、)ンパ球, プロテ イ ン A ( P A ) 活性化リ ンパ球など で免疫し、 脾細胞を取り出し、 これとマウス ミ エローマ細胞とを融合 して得たハイプリ ドーマを培養することによって製造することができ る
[0042] このハイ プリ ドーマ製造に際しては Kohler と Milstein の方法 "。 [ Nature 256, 495- 497 (1975)] を改良した U e d a らの方法
[0043] 〔 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5122- 5126 ( 1981) 〕 に従って 行えばよい。
[0044] 免疫用マウスとしては、 B A L B / c系マウス, B A LB / c系マ ゥスと他系マウスとの F 1マウスなどが用いられる。
[0045] 免疫はマウス 1匹 ( 4〜 8週令, 2 0〜 3 0 g ) に対して細胞 1 0 7~8 個またはウィ ルス 5 0〜 5 0 Q M Sを用いて 2〜 5週間ごとに 2〜 3 回行う。 マウスの飼育および、 脾細胞の採取は常法に従う。
[0046] ミ エ口一マ細胞としては、 M O P C — 2 1 N S / 1 C Nature, 256, 495 - 497 ( 1975 ) 〕 、 S P 2 / 0 - A g l 4 〔 Nature, 277, 131 - 133 ( 1979 ) 〕 、 S 1 9 4 / 5、 X X O . B U . l 〔 《J. Exp. Med. 1 8^ 313 - 328 ( 1978 ) 〕 などが用いられる。 脾細胞とミ エ口 一マ細胞は 1対 1〜 1 0対 1の割合で混合し、 融合は、 N a C (約 0. 8 5 % ) 、 ジメ チルスルホキシ ド 〔 1 0〜 2 0 % ( V / V ) 〕 およ び分子量 1, 000〜6, 000 のポリエチレングリ コ一ルを舍むリ ン酸緩衝 液 ( p H 7. 2〜7. 4 ) 中で行う。
[0047] 融合は両細胞を 3 5〜 3 7 :で 1〜 3分簡ィ ンキュペー トすることに よつて行う。
[0048] 融合細胞 (ハイ プリ ドーマ) の選択は、 ヒポキサンチン ( 1. 3〜1. 4 mg / dH ) , ァミ ノ プテ リ ン ( 1 8〜2 0 Ag /^) , チ ミ ジン ( 3 7 5 〜 4 0 0 i g / ^ ) , ス ト レプ トマイ シン ( 5 0〜 1 0 0 ;ti g / ml) , ぺニシ リ ン ( 5 0 〜 : L 0 0単位) , グルタ ミ ン ( 3. 5〜4· ΰ g / & ) , 牛胎児血清 ( 1 0〜 2 0 % ) を舍む基礎培地を用い、 生育してく る細 胞として選択する。
[0049] 基礎培地としては、 動物細胞の培養に一般に使用されている R P M I 1 6 4 0培地, E a g 1 eの M E M培地などが用いられる。
[0050] 融合細胞 (ハイブリ ドーマ) のクローン化は限界希釈法にて少なく とも 3回繰返して行う。 ハイブリ ドーマを通常の動物細胞の培養と同様にして培養すれば、 培地中に本発明の抗体が生産される。 例えば 2〜 5 X 1 06 のハイブ リ ド一マ細胞をス ト レプトマイ シン ( 5 0〜 1 0 0〃 g /ml) , ぺニ シ リ ン ( 5 0〜 1 0 0単位/ ml) , グルタ ミ ン ( 3.5〜4. O g / ^ ) , 牛胎児血清 ( 1 0〜 2 0 % ) を含む R P M I 1 6 4 0培地 1 0〜 2 0 mlを用い、 フ ラスコ内で 9 5 % C 02 - 5 % 02 存在下、 3 5〜 3 7 , 3〜 7日間培養することによって培養液中に抗体が分泌、 蓄積さ る
[0051] またハイ ブリ ドーマ細胞をプリ スタ ン(Pristane)処理のヌー ドマウ スまたは B A L B / cマウスの腹腔内に移植して増殖することにより 腹水中に本発明の抗体を蓄積させることができる。 すなわち、 これら のマウス腹腔内にプリスタ ン ( Pristane, 2, 6, 10, 14 tetramethyl pentadecane, 米国アルド リ ッチ社製) 0.5〜 1 ml注射し、 その後 2 〜 3週目に腹腔に 5〜 1 0 X 1 06 個のハイブリ ドーマ細胞を移植す る。 通常?〜 1 0日後に腹水が貯溜し、 これを採取する。
[0052] 本発明においては、 A T L由来細胞株 M T - 2を免疫原として用い てモノ ク ロ ーナル抗体 T a 6 0 b , T a 6 0 cおよび T s 6 0を得、 A T L Vを免疫原として用いてモノ ク ロ ーナル抗体 T a 6 0 a , A T V I 9 aおよび A T V I 9 bを得た。
[0053] A T L細胞を免疫原として T s Aを得、 混合リ ンパ球培養細胞を免 疫原として T p w 4 0 , T 1 2 0 , T s 3 2 , L p 9 5, L s 7 0 , L s Aを得、 P A活性化リ ンパ球を免疫原として T s Bおよび T s l 4 5 を得た。
[0054] これらモノ ク ロ 一ナル抗体の抗原特異性は実施例 6〜 1 3に示した 方法により確認した。
[0055] 本発明のモノ ク口ーナル抗体の抗体クラスは、 T p 1 2 0および
[0056] L p 9 5が I g G 2 a , T s Aが I g Mで、 他はすべて I g G 1に分 類される。 また 〔 3H〕 -ダルコサミ ン標識による下記免疫沈降反応 による分子量測定では、 T a 6 0 a, T a 6 Q b , T a 6 0 cおよび T s 6 0抗原は Μ Τ - 2または Μ Τ - 1細胞において 60, 000 ダルト ン ( g p 6 0 T - 2 ) を示し、 H U T 1 0 2細胞においては 53, 000 ダルト ン ( g p 5 3 H U T 1 0 2 ) であり、 これら 4抗原はほぼ同 一分子量を示した。
[0057] また、 T p 1 2 0抗原は、 H U T 1 0 2細胞においては 120, 000ダ ルト ンであった。 また 125 I標識による免疫沈降反応による分子量測 定では、 T s 1 4 5抗原および L s 7 0抗原は NK3.3細胞において それぞれ 145, 000ダルト ン, 70, 000ダルト ンであった。
[0058] 35Sメチォニン標識による分子量測定では、 L p 9 5抗原は、 H U T 1.0 2細胞において 95, 000ダルト ンを示した。
[0059] ィ厶ノブロッティ ング法による分子量測定では、 A T V 1 9 aおよ び A T V 1 9 bは、 ともに A T L Vの 19, 000 ダルト ンのウイルス粒 子構成成分と同じ分子量を示した。
[0060] 他の 5つの抗原 ( T p w 4 0 , T s w 3 2 , T s A , T s B, L s A ) の分子量は、 現在のところ不明である。
[0061] 免疫沈降反応 :
[0062] 標的細胞 ( M T - 2, MT— 1および H U T 1 0 2 ) は !: 3H〕 ― グルコサミ. ンを用いて標識する。 1 5 C i / ml 3H -グルコサミ ン ( 38 Curies/ramoU Amersham 米国) を含んだ R P M I 1 6 4 0培養 液 (曰水製薬社製) にて 3 5〜 4 0時間培養して標識する。
[0063] 標的細胞 H U T 1 0 2は35 Sメチォニンを用いて標識した 5 0 0;" C i /ml35Sメチォニンを含んだ R P M I 1 6 4 0培養液にて 8時間 培養して標識する。 また N K 3.3標的細胞は、 5 X 1 07 細胞を 2 0 0 a gのアイォ ドゲン存在下で 0.5 m C iの N a 125 Iで標識する。
[0064] これら標識した細胞を 0.1〜: L % ( V / V ) N P - 4 0を用いて可 溶化し、 その細胞抽出物 ( 1〜 : L 0 X 1 05 c p m ) をモノ クローナ ル抗体 ( 1〜 1 0 £ ) と 4でにて 6〜 1 2時間反応させ、 第 2次抗
[0065] O PI 体として 5〜 2 0 £の家兎抗マウスィ ムノ グロブリ ン ( Cappel 社, 米国) と 4 で 3 0分間反応させ、 さらに 4 :で 1時間スタフイ ロコ ッ カス ♦ ァゥ レウス ( Cowan l株) と反応させ免疫沈降物を作製し、 S D S -ポリアク リルァミ ド ·ゲル電気泳動により解折する。
[0066] ィ ムノ ブロ ッ テイ ング法 ( Towin, H. ら, Proc. Natl. Acad. Sci.
[0067] USA 76, 4350, 1979 ) :
[0068] ポリアク リルァミ ド ·ゲル電気泳動法により展開し、 二 トロセル口 ース膜に各ぺプチ ドを転移させ、 その後モノ クローナル抗体と反応さ せ、 さらに 2次抗体である 131 I標識抗マウス免疫グロブリ ン抗体と 反応せしめ、 その後、 フルォログラフィ一で観察する。
[0069] なお、 本発明のモノ クローナル抗体は、 昭和 5 8年 9月 2 5 曰発行 の日本癌学会第 4 2回総会記事 〔日本癌学会発行〕 1 0 0頁の 2 9 0 審およびシンポジゥム VI 2 3の 2番に記載があり、 該記事中、 T A - 5 3 c , T A - 5 3 b , T A - 5 3 a , T S - 5 3 , A Τ V - W 2 6 aおよび A T V - W 2 6 bは、 それぞれ本明細書における T a 6 0 a , T a 6 0 b , T a 6 0 c , T s 6 0 , A T V 1 9 aおよび A T V 1 9 bに相当する。 また昭和 5 8年 1 1月 1 0 曰発行の日本免疫学会要旨 集で発表のあった T P - W 4 0 , L P — 9 4 , T P — W 6 7および T P - 1 2 0はそれぞれ本明細書における T p w 4 0 , L p 9 5 , T s Aおよび T p 1 2 0に相当する。
[0070] 発明を実施するための最良の形態
[0071] 実施例 1 .
[0072] T a 6 0 a , T a 6 0 c , A T V 1 9 aおよび A T V 1 9 bモノ ク ローナル抗体の製造:
[0073] A T L由来培養株 M T - 2 〔 Gann 71, 155 ( 1980 ) 〕 の培養上清 より採取分離した 〔Yoshida, H. et al : Primary and tertiary structure of nucleic acids and cancer research, M. Miwa et al. (EDS, Japan. Sci. Soc. Press, Tokyo, PP 255-294, 1982 〕 ウ ィ ル ス粒子蛋白分画を免疫原として用いた。
[0074] 上記蛋白分画 (蛋白量 0.4 5mg) を免疫直前瞬時にドライ アイ ス舍 有エチルアルコール中にて凍結し、 再び 3 7で恆温槽にて融解せしめ る凍結融解過程を 6回行った後、 完全フロイ ン トアジュバント 0.0 2 mlと混合し、 B A L B / cマウス ( 8週令, 2 4 g ) CCharles River, Inc., Atsugi, Japan より購入〕 1匹の背面に皮下接種することによ り免疫した。 この免疫を 4週ごとに 4回行い、 最終免疫 4曰目にマウ スを殺し、 脾臓を摘出し、 常法により浮遊細胞を得た。
[0075] この脾臓浮遊細胞 1 08 個と、 マウス ミ エローマ M O P C— 2 1 N S / 1細胞 2 X 1 07 個とを、 4 2 % ( W / V ) ポ リ エチレングライ コ - ) V ( . W. 4, 000, Koch-Light, Bucks, 英国) および 1 5 % ( V / V ) ジメ チルスルホキシ ド (Merck, Darmstadt, 西独) をふくむリ ン酸緩衝液生理食塩水 ( P B S ) 0.2 ml中で Ueda らの方法 〔 Pro Natl. Acad. Sci. USA 78, 5122-5126 (1981) 〕 に従って融合させた。 融合細胞は、 H A T培地 〔ヒポキサンチン 1.3 6mg/^, アミ ノプ テ リ ン 1 9. l i g /^, チ ミ ジン 3 8 7 f g /^, ス ト レプ トマイ シ ン 1 0 0 i g /ml, ペニシ リ ン 1 0 0単位 / ml, グルタ ミ ン 2 m Mお よび牛胎児血清 1 0 %を含む R P M I 1 6 4 0培地 ( p H 7.2 ) 〕 を 用いて常法 〔前記 U e d aらの方法〕 に従い選択した。
[0076] 得られた融合細胞 3個を限界希釈法を 3回鑤返すことによりクロー ン化した。 得られたクローン ( 3個) を、 下記の方法で培養して、 A T L関連抗原に対して特異的に反応するモノ クローナル抗体を著量生 産する株を得た。 すなわち、 5 X 1 06 のハイプリ ドーマ細胞をス ト レプ ト マイ シン 1 0 0 / g /ml, ペニシ リ ン 1 0 0単位/ ml, グルタ ミ ン 3.8 gゾ £ , 牛胎児血清 1 0 %を舍む R P M I 1 6 4 0培地 1 5 mlを用い、 1 5 0 cnfのフ ラスコ内で 9 5 % C 02 - 5 % 02 の存在下、 3 7でで 7日間培養した。
[0077] 得られた細胞株 T a 6 0 a , T a 6 0 c , A T V 1 9 aおよび A T V 1 9 bが生産するモノ ク口ーナル抗体をそれぞれ T a 6 0 a , T a 6 0 c , A T V 1 9 aおよび A T V 1 9 bとした。
[0078] この細胞株をマウスの腹腔内に投与する下記の方法で培養すると
[0079] T a 6 0 a , T a 6 0 c , A T V 1 9 aおよび A T V 1 9 bがそれぞ れ 3〜 1 0 mg/ ·δ生成した。 すなわちマウス腹腔内にプリスタ ン 0.5 ml注射し、 その後 3週目の腹腔に 5 X 1 06 個のハイプリ ドーマ細胞 を移植し、 1 0 曰後に腹水を採取した。
[0080] 実施例 2 .
[0081] T a 6 0 bおよび T s 6 0モノ ク ローナル抗体の製造 :
[0082] A T L由来培養株 M T - 2 C iyoshi et aj_ : Gann 71, 155 (1980)] を 1 07 個マウス皮下に初回免疫し、 その 3週後に 2回目の免疫を同 様に行い、 さらに 3回目の免疫を 1 07 個腹腔内に注射した。 その後
[0083] 4 日目に、 免疫マウスを殺し、 脾臓細胞を採取し、 細胞融合を行った。 以下は実施例 1 と同様に行い、 T a 6 0 bおよび T s 6 0モノ クロー ナル抗体を得た。
[0084] '実施例 3 .
[0085] T s Aモノ ク ローナル抗体の製造 :
[0086] A T L患者末梢血より分離した A T L細胞を 1 07 個, マウス皮下 に初回免疫し、 その 3週後に 2回目の免疫を同様に行い、 さらに 3回 目の免疫を 1 07 個腹腔内に注射した。 その後 4曰目に免疫マウスを 殺し、 脾臓細胞を採取し細胞融合を行った。 以下は実施例 1 と同様に 行い、 T s Aモノ ク ロ ーナル抗体を得た。
[0087] 実施例 4 .
[0088] T p w 4 0 , T 1 2 0 , T s w 3 2 , L p 9 5 , L s 7 0および
[0089] L s Aモノ ク ローナル抗体の製造 :
[0090] 混合培養 4 曰目のリ ンパ球を採取し、 洗濮後 5 X 1 06 個の細胞を マウス皮下に初回免疫し、 その 3週間後に 2回目の免疫を同様に行い、 さらに 3回目の免疫を 1 07 個腹腔内に注射した。 その後 4 日目^ 疫マウスを殺し、 脾臓細胞を探取し細胞融合を行った。 以下は実施例 1と同様に行い、 標記モノ クローナル抗体を得た。
[0091] 実施例 5.
[0092] T s Bおよび T s 1 4 5モノ クローナル抗体の製造:
[0093] プロテイ ン A ( P A ) 1 0 * g / mlの存在下で、 末稍血リ ンパ球を 3曰間培養後、 活性化リ ンパ球を採取し、 洗濮後 5 X 1 08 個の細胞 をマウス皮下に初回免疫し、 その 3週後に 2回目の免疫を同様に行い, さらに 3回目の免疫を 1 07 個腹腔内に注射した。 その後 4曰目に免 疫マウスを殺し、 脾臓細胞を採取し、 細胞融合を行った。 以下は実施 例 1と同様に行い、 T s Bおよび T s 1 4 5モノ ク ローナル抗体を得 実施例 6 .
[0094] モノ ク ローナル抗体 T a 6 0 a , T a 6 0 b , T s 6 0および A T V 1 9 aの各種培養株細胞ならびにヒ ト正常血液細胞成分に対する反 応性 :
[0095] 細胞表面抗原と標記モノ クローナル抗体との反応を調べる為に、 マ ウス混合血球吸着試験 〔M - M H A〕 〔前記〕 および細胞質内抗原と 抗体との反応を検索する目的での間接螢光抗体法 〔前記〕 を行った。 結果を第 1表に示す。
[0096] o
[0097] >2 細胞表面抗原 (M-MHA 検査法) 細胞質内抗原 (Cy- IP-検査法 ) Ta60a Ta60b Ts60 ATV19a Ta60a Ta60b Ts60 ATV19a
[0098] ATL 闋連
[0099] MT-2 +++ +++ +++ 一 +++ +++ +++ +++ T-1 十 ++ +++ 一 一 +++ * +++ 土 +++ *
[0100] HUT102 +++ +++ +++ 一 +++ +++ +++ +++
[0101] HUT78 - +++ - - - +++ -
[0102] ATN-1 +++ +++ 一 一 +++ +++ 土 +++
[0103] T細胞
[0104] RP I8402 - 一 ― - — — ―
[0105] HPB-ALL
[0106] MOLT - 3
[0107] Jurkat 一 +++
[0108] IL - 2依存
[0109] NO.3 +++ +++ - - N. D. N. D. N. D. N. D.
[0110] B細胞
[0111] Daudl
[0112] Raji ++ ++ -
[0113] RPMI1788 ++ ++ 一 - 士
[0114] RP I8226
[0115] SK-MBL-37 一 ++ —
[0116] SK-MEL-33
[0117] 正常造血器細胞
[0118] 胸腺細胞
[0119] 末梢白血球
[0120] 単球
[0121] 顆粒球
[0122] 骨髄細胞
[0123] 107 , ++ : > 10 5 , + : > 10: #+++ : > 10
[0124] + , * pos 111 ve cells ·· 1-5X この結果、 T a 6 0 a , T a 6 0 bは同一反応性を示し、 これら両 抗原は特に T細胞由来株のうち A T L Vまた H T L Vに関係ある ( A T L -闋連) 細胞に存在するのみで他の T細胞には存在しておらず、 R P I 8 4 0 2 , H P B - A L L , M O L T - 3 , J u r k a tお よび I L - 2依存性の N K 3.3株細胞には陰性であった。 但し、 B細 胞株に対しては、 M - M H Aで R a j i , R P M I 1 7 8 8の 2細胞
[0125] OWPI
[0126] 、¾ ' 株に陽性であった。 固型腫瘍細胞由来株は第 1表に示したメ ラノ ーマ 株 ( S K - M E L— 3 7 , S K - M E L - 3 3 ) ならびに、 肺痛, 腎 癌, 胃癌, 脳腫瘍株などはすべて陰性であった。 正常血液細胞に闋し ては、 胸腺, 末棺白血球, 単球, 顆粒球, 骨髄細胞を含めてすべて陰 性であった。
[0127] T s 6 0は、 A T L関連細胞 ( M T _ 2, H U T 1 0 2 , H U T 7 8 ) に存在するほかは、 例外的に T細胞由来の J u r k a t細胞に存在し たのみで、 他の培養株細胞, 正常細胞には存在していない。 興味ある ことに、 細胞質内抗原に対する螢光抗体法による結果からは、 Jurkat は陰性で、 固型腫瘍の S K - M E L - 3 7に陽性であり、 細胞膜抗原 と存在の様式を異にしている。
[0128] A T V 1 9 aは、 細胞質内抗原で、 A T L -闋連細胞である M T - 2 , M T— 1 , H U T 1 0 2および A T N— 1に存在するが、 他の細 胞にはすべて陰性であった。
[0129] 実施例 7.
[0130] T a 6 0 b , T s 6 0抗体の各種細胞に対する抗体価の比較 ( M - M H A法による) :
[0131] T A 6 0 bの抗体価を 5 0 %陽性値で比較すると、 M T - 2, H U T 1 0 2 , M T— 1 , R P M I 1 7 8 8 , R a j iの順で、 H U T? 8 , J u r k a tは陰性であつた。
[0132] M T— 2 , H U T 1 0 2 0 7 8
[0133] M T - 1 1 07
[0134] R P M I 1788, R a i 1 06
[0135] T s 6 0は、 M T - 2 , H U T 7 8 , J u r k a t , H U T 1 0 2 に陽性で、 M T - 1 , R P M I 1788, R a j iには陰性であった。
[0136] M T - 2 0 7〜8
[0137] HUT78, Jurkat, HUT102 1 06
[0138] MT-1, PMI1788, Raji 陰 性 実施例 8 .
[0139] 本発明モノ ク口ーナル抗体の正常血液細胞に対する反応性 ( M -
[0140] M H A法による) :
[0141] 第 2表に示すごとく T a 6 0 a , T a 6 0 bは、 ともに無処理の末 梢血液成分には全く反応しないが、 下記のマイ トジェンを舍有する培 養液で培養するとこれら両抗原が陽性となる。
[0142] I ) I L - 2 10〜25% ( Biotest 社, 西独)
[0143] H ) フ イ ト へムァグルチニン(PHA) 20〜50〃g/ml (GIBC0 社)
[0144] ) コ ンカナパリ ン A (ConA) 20〜25 «g/ml (GIBC0 社) 一方、 T s 6 0は、 いかなる条件下でも陰性であった。
[0145] M- HA 検査法
[0146] 試 験 陽性症例数
[0147] 細胞群 症例数 Ta60a Ta60b Ts60 末棺白血球
[0148] 新 鮮 12 0 0 0 培養対照 ψ 10 0 0 0
[0149] 11-2 7 6 6 0
[0150] PHA 5 5 5 0
[0151] ConA 5 5 5 0 単 球
[0152] 新 鮮 3 0 0 ND 顆粒球
[0153] 新 鮮 2 0 0 0 胸腺細胞
[0154] 新 鮮 6 0 0 0 培養対照 3 0 0 0 骨髄細胞
[0155] 新 鮮 1 0 0 0 脾細胞
[0156] 新 鮮 2 0 0 0
[0157] * 10% F C S含有 R P M I 1 6 4 0
[0158] 一 ― 実施例 9 .
[0159] 本発明モノ ク口ーナル抗体の造血器腫瘍細胞に対する反応性 ( M - M H A法) :
[0160] 造血器腫瘍 7 9症例検索の結果を第 3表に示す。
[0161] 3
[0162] -MHA 検査法
[0163] p¾
[0164] s3£ τ tat跌 陽性症例数
[0165] 細 群 症例数 1 aoua I abUu I sou
[0166] A T L :
[0167] 新 鲜 16" 10(5) 8(8) 0 培 養 * 14 9(5) 7(7) 0
[0168] T - C L L
[0169] 新 鮮 1 0(1) ND
[0170] T - A L L :
[0171] 新 鮮 7 0 0 0
[0172] T - L :
[0173] 12 0 0(1) 0
[0174] 2 0 0 0
[0175] B— C L L :
[0176] 新 鮮 9 0(4) 0(3) 0
[0177] 5 0(2) 0(2) 0
[0178] B - M L :
[0179] 新 鮮 10 0(4) 3(1) 0
[0180] Nul l-ALL:
[0181] 新 鮮 11 1 1(1) 0
[0182] A M L :
[0183] 新 鲜 4 2 2 0
[0184] A M 0 L :
[0185] 新 鲜 6 0 0 0
[0186] C L-BC:
[0187] 3 0(1) 1(1) ND
[0188] * 1 0 % F C S含有 ? P M I 1 6 4 0 第 3表中カツコで示した抗体価 1 0 5 以下の弱陽性例を含めると、 , T a 6 0 a , T a 6 0 b両抗体とも A T L症例全例に陽性で、 他ので 細胞由来症例には全て陰性であった。 T - C L Lの 1例が陽性である が、 この症例は既にプロバイ ラル ( prov iral ) D N Aを有しており、 臨床診断は T - C L Lであるが、 A T Lとも考えられる。 即ち、 この 両抗原は A T Lと鑑別診断上問題となる T由来細胞の悪性造血器疾患 に陰性であり、 これら抗体は診断上有用である。 なお、 これらの抗体 は、 B細胞由来の B - C L L, B - M L ( B細胞悪性リ ンパ腫) の一 部症例とも反応し、 また骨髄性白血病 ( A M C ) の一部症例にも弱陽 性ながら反応去示した。
[0189] 一方、 T s 6 0はすべての造血器疾患に陰性であった。
[0190] 実施例 1 0 .
[0191] 本発明モノ クローナル抗体の I L - 2依存性細胞に対する反応性 : I L - 2依存細胞株であるクローン化 T細胞 4 E 8 〔ッペルク リ ン 陽性健常者の末稍血と P P D (結核菌細胞膜抗原の一種) 抗原とを試 験管内で反応させ、 長期培養した T細胞株〕 を 9 6穴平底培養用プレ 一ト 〔 Falcon 社製〕 に、 各ゥ ル宛 2 x 1 04 / 0.2 ml培養液 ( 1 0 % F C S含有 R P M I 1 6 4 0培地) で播き、 室温で 3 0分間各種濃 度の抗体で反応させた。
[0192] その後 I L - 2を最終濃度 5 % ( V/V)になるように加えて 5 % C 02 - 9 5 % 02 , 3 7でで 7 2時間培養後、 0.4〃 C iの 3H メ チル -チ ミ ジンの 4時間の取り込みを見て、 I L - 2依存性細胞増殖阻止 を観察した。
[0193] その結果、 T a 6 0 aは 1 0— 2〜 1 0 4濃度まで 7 5 %〜 9 5 %の 阻止率を、 また T a 6 0 bは 1 0 -2〜 1 0—4まで 6 0 %以上の阻止率 を示した。 一方 T s 6 0は、 なんら細胞増殖阻止効果を有していなか つ ο
[0194] 実施例 1 1 .
[0195] 本発明モノ ク口一ナル抗体 A T V 1 9 aの正常および悪性造血器細 胞に対する反応性 ( M - M H A法による) を調べた結果を第 4表に示 す。 4
[0196] 感正末 A A C
[0197] 稍 L M M - M— I F検査法 細 胞培新培新新新新染単新白C LL o L, I I 群 試験症例数 陽性症例数
[0198] A T L養養常血 LL L L::
[0199] :
[0200] 新 対対性核球 L B--:鮮 20 0 培養対照照鮮鮮鮮照鮮鲜鮮 C 22: * 9 7 I L - 2 9 7
[0201] T - C L L :
[0202] 新 鮮 0 培養対照 0 I L - 2 0 T一 cel l lymphoma
[0203] 新 鮮 5 0 培養对照 3 0 I L - 2 3 0 B— ce l l lymphoma
[0204] 6 0 3 0 2 0
[0205] B
[0206] A
[0207] 7 0 2 0 2 0
[0208] 2 0
[0209] 2 0
[0210] 1 0
[0211] 3 0 培養対照 10 0
[0212] I L - 2 10 0 単 球
[0213] 新 鮮 2 0 粒 球
[0214] 新 鮮 2 0 小 板
[0215] 新 鮮 2 0
[0216] * 3日間培養 実施例 1 2 .
[0217] ヒ ト白血球分化抗原を検出する 9抗体の正常造血器細胞に射する反 応性 :
[0218] 第 5表に示すごとく、 T p w 4 0 , T p 1 2 0抗体は、 末梢血 T細 胞の 6 0〜8 0 %に反応を示すが、 B細胞, 単球, 顆粒球等には反応 を示さない。
[0219] T p w 4 0抗体は、 胸腺細胞の大部分と反応を示すが、 T p 1 2 0 抗体は、 胸腺細胞の 3 0〜4 0 %のみと反応を示し、 ともに p a n T 細胞抗原を検出しているが、 その特異性においては、 差異が見られた
[0220] T s w 3 2 , T s A , T s Bおよび T s l 4 5の 4抗体は、 末稍血 T細胞のある一分画に反応を示したが、 B細胞, 単球, 顆粒球には反 応を示さず、 いわゆる、 T細胞サブセッ ト抗原を検出していた。 胸腺 細胞に対する反応性は、 抗体間で異なっており、 T s w 3 2は 8 0〜 9 0 %の胸腺細胞に反応を示したが、 T s B, T s 1 4 5抗体は、 ご く一部の細胞に反応を示したのみであった。
[0221] L p 9 5抗体は、 ほぼすベての白血球細胞群と反応を示し、 p a n 白血球抗原を検出すると考えられた。
[0222] L s 7 0および L s A抗体はともに単球およびその他の白血球と反 応を示し、 白血球の一部の細胞に存在する抗原を検出していた。
[0223] ヒト白血球分化抗原を検出する 9抗体の正常造血器細胞に対する反応性 膜螢光抗体法による陽性細胞率(%)
[0224] 標的細胞
[0225] 検体数 TPW40 TP120 Tsw32 TsA TsB Tsl45 LP95 LS70 LSA 胸腺細胞 90く 30-40 80-90 20-40 0 -20 0 -10 60-80 0 -10 0 -10 末 梢 血
[0226] T 細 胞 10 60-70 70-80 25-35 50-70 40-60 10-30 60-80 10-20 20-30 非 Τ (Β) 細胞 10 0 - 5 0 - 5 0 - 5 0 - 5 0 - 10 0 -10 60-80 10-20 50-60 単 球 4 0 - 5 0 - 5 0 - 5 0 - 5 0 - 5 0 - 5 80-90 90< 50-60 顆 粒 球 4 0 - 5 0 - 5 0 - 5 0 - 5 0 - 5 0 - 5 90く 20-30 0 - 5 脾 細 胞 3 50-60 50-60 40-50 30-40 10-20 10-20 60-70 20-30 40-50 活性化リ ンパ球
[0227] Ρ Η Α 8 70-90 30-40 40-70 50-70 50-70 10-30 70-80 40-60 10-30
[0228] C 0 n A 8 85-95 60-80 40-70 60-80 60-80 15-35 70-90 20-40 5 -15 混合培養リ ンパ球 8 60-70 60-70 20-30 50-70 30-50 20-40 70-80 20-40 10-20 混合培養リンパ球 4 60-70 60-70 30-40 50-70 40-50 50-60 40-50 40-50 30-40 の長期培養
[0229] 実施例 1 3.
[0230] ヒ ト白血球分化抗原を検出する 9抗体の各種造血器腫瘍に対する反 ibfe:
[0231] 各種造血器腫瘍 6 0症例に対する反応性を検索し、 第 6表に示した。 p a n白血球抗原を検出する L p 9 5抗体は、 ほとんどの造血器腫 瘍細胞と反応を示した。 P a n T抗原を認識する T p w 4 0 , T p 1 2 0 抗钵は反応性を異にしており、 T p w 4 0はより未熟な T細胞リ ンパ 腫である T - A L L , L Lに反応を示し、 また、 l a抗原陰性の N u l l - A L Lとも反応を示した。 一方 T p 1 2 0抗体は、 成熟型 Τ細胞リ ンパ腫である Τ2 リ ンパ腫および A T Lに高率に反応した。 この抗体 は、 また B— C L Lとも反応を示した。
[0232] T亜分画抗原を認識する T s w 3 2および T s A抗体は、 ともに T - A L Lおよび L Lには反応を示し、 T s A抗体は、 さらに T2 リ ン パ腫, A T Lとも反応性を示した。
[0233] T亜分画抗原を認識する T s B抗体は T 2 リ ンパ腫 A T Lらの成熟 T細胞リ ンパ腫と主に反応を示した。 また、 この抗体は B - C L Lと も反応を示した。 T s 1 4 5抗体は、 いずれの T細胞リ ンパ腫とも高 率の反応は示さなかった。 白血球の一部に存在する抗原を認識する L s 7 0抗体は成熟 T細胞リ ンパ腫および B - C L Lに反応を示した。
[0234] L s A抗体は、 正常単球細胞に反応を示すが、 急性単球性白血球と も反応を示した。 この抗体は、 T細胞リ ンパ腫 B - C L Lらとはまつ たく反応を示さなかった。 ヒト白血球分化抗原を検出する 9抗体の各種造血器腫瘍に対する反応性 膜螢光抗体法による陽性症例数
[0235] 造血器腫瘍
[0236] 試験症例数 LP95 TPW40 Tsw32 TsA TP120 TSB LS70 TS145 LSA
[0237] Nu l l型急性リンパ型白血病
[0238] (Null- ALL)
[0239] I a抗原陽性 6 2 1 0 0 0 0 0 1 0
[0240] I a抗原陰性 4 3 3 0 0 0 0 0 0 0
[0241] T細胞型急性リンパ性白血病 7 7 7 5 5 3 2 0 1 0
[0242] (Τ一 ALし)
[0243] リンパ芽球腫 ( L L ) 5 5 5 4 4 4 1 0 2 0 成熟 Τ細胞リンパ腫 8 8 3 3 8 6 8 7 2 0
[0244] (Τ2 リンパ腫)
[0245] 成人 Τ細胞白血病(AT L) 11 10 3 1 10 9 9 8 3 0
[0246] B細胞型慢性リンパ性白血病 8 6 0 0 5 8 8 8 3 0
[0247] (B-CLL)
[0248] 急性骨髄性白血病(AM L) 6 4 1 0 0 0 0 2 0 2 急性単球性白血病(AMOL) 5 5 0 0 1 2 2 4 1 4
权利要求:
Claims請 求 の 範 囲
1. ヒ ト白血球に存在する抗原を検出するモノ クローナル抗体。
2. ヒ ト T細胞に対する特許請求の範囲第 1項のモノ ク ローナル抗 体。
3. 成人 T細胞白血病 (以下 A T Lと略記する) 闋連抗原に対する 特許請求の範囲第 2項のモノ クローナル抗体。
4. g p 6 0 〔 M T - 2〕 抗原を認識することを特徴とする特許請 求の範囲第 3項記載のモノ クローナル抗体。
5. 活性化 T細胞および A T L細胞に特異的に反応する特許請求の '範囲第 3項記載のモノ ク ローナル抗体。
6. A T L関連培養細胞のみに反応することを特徴とする特許請求 の範囲第 3項記載のモノ ク 口 ーナル抗体。
7. A T Lウィルス (以下 A T L Vと略記する) 産生株細胞のみに 反応することを特徵とする特許請求の範囲第 3項記載のモノ ク口 ーナル抗体。
8. T a 6 0 a , T a 6 0 bまたは T a 6 0 c と命名した特許請求 の範囲第 3〜 6項のいずれかに記載のモノ ク口ーナル抗体。
9. T s 6 0 と命名した特許請求の範囲第 3 , 4または 6項記載の モノ ク ローナル抗体。
10. A T V 1 9 aまたは A T V 1 9 bと命名した特許請求の範囲第 3, 6または 7項記載のモノ ク口ーナル抗体。
11. 末稍血 T細胞の大部分に存在する T細胞分化抗原 ( pan T抗原) に対する特許請求の範囲第 1項のモノ クローナル抗体。
12. T p w 4 0または T p 1 2 0 と命名した特許請求の範囲第 1 1 項のモノ ク口一ナル抗体。
13. T細胞の亜分画に存在する抗原 ( T細胞サブセッ ト抗原) に対 する特許請求の範囲第 1項のモノ クローナル抗体。
14. T s w 3 2 , T s A , T s Bまたは T s 1 4 5と命名した特許 請求の範囲第 1 3項のモノ ク ローナル抗体。
15. T細胞および他の白血球に存在する抗原に対する特許請求の範 囲第 1項のモノクローナル抗体。
16. L p 9 5 , L s 7 0または L s Aと命名した特許請求の範西第 1 5項のモノクローナル抗体。
17. ヒ ト白血球細胞抗原に対するモノ ク口ーナル抗体を生産する能 力を有するハイブリ ドーマを培養し、 培養液中に該モノ クローナ ル抗体を分泌、 蓄積せしめ、 該培養液から該モノ ク ローナル抗体 を採取することを待黴とするヒ ト白血球細胞抗原に対するモノ ク ローナル抗体の製造法。
18. 該ハイブリ ドーマが、 A T L V産生株または A T L Vおよび活 性化リ ンパ球で免疫したマウス脾細胞とマウスのミエ口一マ細胞 とを融合させたハイブリ ドーマであることを特徵とする特許請求 の範囲第 1 7項記載のモノ ク口ーナル抗体の製造法。
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优先权:
申请号 | 申请日 | 专利标题
JP58/210381||1983-11-09||
JP58210381A|JPH0340B2|1983-11-09|1983-11-09||GB8517441A| GB2163178B|1983-11-09|1984-03-23|Novel monoclonal antibody|
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