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    公开号:WO1984003717A1
    申请号:PCT/DE1984/000051
    申请日:1984-03-09
    公开日:1984-09-27
    发明作者:Manfred Renz
    申请人:Europ Lab Molekularbiolog；
    IPC主号:C07H21-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur Durchführung von Hybridisierungsreaktionen
    [0002] Die Erfindung betrifft ein Verfahren, zur Durchführung von Hybridisierungsreaktionen und ein für dieses Ver¬ fahren geeignetes Nachweismittel.
    [0003] Die Hybridisierung ist ein Mittel zum Feststellen der Identitä.t von Basensequenzen bei zwei verschiedenen Polynukleotidketten. Zwei DNA-Ketten mit komplementären-. Basensequenzen bilden eine Doppelstrangstruktur mit¬ einander bei der Abkühlung in Lösung und genauso erhalten. sich eine DNA-Kette und eine RNA-Kette mit komplementärer Struktur unter Bildung eines DNA-RNA- Hybrids. Durch Hybridisierung lassen sich daher zahl¬ reiche Probleme der Nukleotidchemie lösen, beispiels¬ weise die'Auffindung und Isolierung bestimmter.Gene oder Genbruchstücke, die Kartierung von Gensequenzen und dergleichen. Insbesondere im Rahmen der Gentechno¬ logie spielt die Auffindung bestimmter gesuchter Gene eine entscheidende Rolle und Hybridisierung ermöglicht dies.
    [0004] Zur Durchführung der Hybridisierungsreaktion verwendet man zweckmäßig eine Nukleinsäurekette mit der zur gesuchten Nukleinsäure komplementären Struktur, welche in geeigneter Weise für die Wiederauffindung markiert ist. üblicherweise erfolgt diese Markierung bisher durch enzymatische Einführung von Radioisotopen-tragen¬ den Nukleotidtriphosphaten in die für die Suche verwen¬ dete komplementäre Nukleinsäure. Ein.erheblicher Nach¬ teil dieses Verfahrens besteht in der Notwendigkeit/ mit radioaktiven Substanzen zu arbeiten, was sowohl um¬ fangreiche Sicherheitsvorkehrungen erfordert als auch aufwendige Apparaturen voraussetzt. Man hat daher bereits Versuche unternommen, die radio¬ aktive Markierung durch andere Markierungen zu ersetzen.
    [0005] So wurden neuerdings Nukleotidanaloge synthetisiert, die kovalent verknüpftes Biotin an einem Pyrimidin- oder Purinring enthalten. Diese Nukleotidderivate sind Substrate für RNS- und DNS-Polymerasen und die unter der Einwirkung dieser Enzyme gebildeten Polynukleotide hybridisieren spezifisch mit ihren
    [0006] Komplementärsequenzen. In Verbindung mit einem Af initäts- (z. B. Avidin-Peroxidase) oder einem immunologischen (z. B. Biotin-Antikδrper in Verbindung mit einem zweiten Peroxidase tragenden Antikörper) NachweisSystem können diese Proben als Alternative zu radioaktiv markierten Nukleinsäuren verwendet werden. Auch wurden schon Biotinreste mit RNS über Cytochrom C verknüpft und die Hybridisierungen elektronenmikroskopisch mit dem Avidin-Nachweissystem lokalisiert (Chro osoma/Berl. 53, 107-117 (1975)).
    [0007] Dieses Verfahren ist jedoch immer noch relativ aufwen¬ dig, da es mehrere Syntheseschritte erfordert. Es be¬ steht daher unverändert ein Bedarf nach einem einfache¬ ren Hybridisierungsverfahren und einem Hybridisierungs- reagenz, welches sich als Probe eignet und einf ch her¬ gestellt werden kann und die Empfindlichkeit der Hybri- disierungstechnik erhöht.
    [0008] Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein derartiges Ver¬ fahren und Mittel zu schaffen.
    [0009] Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Durchführung von Hybridisierungsreaktionen durch Komplexbildung zwischen einem Polynukleotid und
    [0010] O PI einer bestimmbaren Substanz und Anwendung- des so gebil¬ deten Komplexes für Hybridisierungsreaktionen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein einzelsträngi- ges Polynukleotid und ein positiv geladenes Nuklein- säure-bindendes nachweisbares Protein oder Polyamin in Lösung umsetzt und den entstandenen Komplex mit einem Vernetzungsmittel kovalent verbindet und die erhaltene Polynukleotid-Verbindung als Marker in Hybridisierungs- experimenten bei der Suche nach Komplementärsequenzen in fremden Polynukleotiden verwendet.
    [0011] Als poritio geladene Proteine oder Polyamine werden im Rahmen der Erfindung solche verstanden, die entweder diese Eigenschaft an sich besitzen oder, falls sie negativ geladen oder neutral sind, mit einem entsprechend positiv geladenen Protein oder Polyamin modifiziert wurden. Hieraus ergibt sich auch die überraschend aufgefundene Tatsache, daß sich jedes beliebige Protein in ein' DNA-bindendes Protein überführen läßt, indem man es mit einem positiv geladenen Protein oder Polyamin modifiziert.
    [0012] Die Erfindung liefert somit ein einfaches Verfahren zur Erzeugung von Hydridisierungsproben, das es erlaubt, auch große Proteinmoleküle als Markierungen einzufüh¬ ren. Das Verfahren baut auf der Tatsache auf, daß ein positiv geladenes Protein oder Polyamin durch elektro¬ statische Wechselwirkungen an eine Nukleinsäure bei geringer Ionenstärke bindet und somit Vernetzungsreak¬ tionen zwischen Nukleinsäure und Protein oder Polyamin begünstigt. Vorzugsweise wird einzelsträngige DNS und ein Lysin-reiches DNS-bindendes chromosomales Protein, wie z. B. Histon Hl, benutzt. Der hohe Lysin-Gehalt derartiger Proteine erfüllt zwei Anforderungen: - -r -
    [0013] Es wird eine sehr enge Bindung zu Nukleinsäuren erhalten und daher eine sehr wirksame Vernetzung mit geringen Konzentrationen an Vernetzungsmittel wie z.. B. Glutaraldehyd innerhalb kurzer Reaktions¬ zeiten ermöglicht. So hergestellte Protein-Nuklein- säure-Verbindungen (Proben) sind nicht einzelsträn- gige DNS markiert mit Protein, sondern stellen kovalent verbundene Einzelstrang-DNS-Protein-Ein¬ heiten dar mit einem Protein: DNS-Massenverhältnis von nahezu 1. Nach Hydridisierung kann man jetzt die Komplementärsequenzen nachweisen durch Suche nach dem Protein (z. B. mit einem Antikörper) .
    [0014] Proteine oder Polyamine können chemisch einfach modifiziert werden. Im Falle des bevorzugten Histon Hl erfolgt die Modifizierung z. B. an der
    [0015] -Aminogruppe der Lysinreste. Dabei können Mar¬ kierungsgruppen oder -Verbindungen direkt oder über Brüσkenbildnerverbindungen wie z. B. cycli- sche N-Succinimidester an die Aminogruppe fixiert werden. Eine Markierung der L sin-Aminogruppe hat wenig Einfluß auf die Nukleinsäure-bindende Eigenschaft des Proteins, da nicht alle Lysinreste für starke Nukleinsäure-Proteinwechselwirkungen benötigt werden. Mit dieser Methode kann man viele Histon Hl-Moleküle (jetzt markiert) mit Einzel¬ strang-DNS vernetzen und Marker mit einer großen Zahl von Markierungen erhalten, die nach Hybridi¬ sierung mit einem Affinitäts- oder immunologischen Nachweissystem leicht zu bestimmen sind. In Blot Hybridisierungsexperimenten kann gezeigt werden, daß unter identischen Reaktionsbedingungen mar¬ kierte Proben entsprechend der erfindungsgemäßen Methode mit ihren Komplementär-Sequenzen mit hoher Spezifität reagieren und hierin nicht unterscheid¬ bar sind von Nick-translatierten oder endmarkierten Proben.
    [0016] Als positiv geladene, mit Nukleinsäuren-bindenden Proteine eignen sich im Rahmen der Erfindung prin¬ zipiell alle positiv geladenen Polymeren und Oligomeren von Aminosäuren, natürlichen oder synthetischen Ursprungs, wie beispielsweise Poly- lysin, chromosomale Proteine einschließlich der Histone, einzelstrangspezifisch bindende Proteine wie z. B. Gen-32-Protein. Ebenfalls geeignet sind Polyamine. Bevorzugt werden unter diesen die natürlich vorkommenden sogenannten "Polyamine"- -wie Spermidin, Spermin, Putrescin und dergleichen, die teilweise eigentlich Oligoamine darstellen. Geeignet sind aber auch synthetische Polyamine.
    [0017] Das einzelsträngige Polynukleotid kann ebenfalls natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein, vorzugsweise handelt es sich um eine DNS oder RNS. Als Hybridisierungsreaktionspartner kommen eben¬ falls DNS und RNS in Frage, so daß die Hybridisie- rungsreaktion selbst DNS mit DNS, DNS mit RNS und • RNS mit RNS betreffen kann.
    [0018] Die Vernetzung des gebildeten Komplexes aus einzelsträngigem Polynukleotid und dem positiv geladenen Nukleinsäure bindenden Protein oder Polyamin erfolgt mit üblichen Vernetzungsmitteln, welche die funktioneilen Gruppen des Proteins mit den funktioneilen Gruppen der Polynukleinsäure zu verbinden vermögen. Besonders geeignet sind
    [0019] OMPI difunktionelle Vernetzungsmittel wie Dialdehyde, beispielsweise Glutaraldehyd, Diepoxide und generell Verbindungen, welche zwei zur Alkylierung in wässriger Lösung geeignete funktioneile Gruppen tragen. Typische hierfür geeignete Gruppen sind aktivierte Carboxylgruppen wie Säureσhloride, Säurebromide, Säureanhydride, durch benachbarte Doppelbindungen aktivierte Halogenatome und der¬ gleichen.
    [0020] Um "das Hybridisierungsprodukt sichtbar zu machen, muß das darin enthaltene Protein bestimmbar sein, z. B. durch eine Markierung.
    [0021] Die Markierung des Proteins bzw. Polyamins kann entweder schon vor Durchführung der Komplexbildungs¬ reaktion erfolgen oder am bereits gebildeten und gegebenenfalls auch bereits vernetzten Komplex durchgeführt werden. Die Durchführung der Markie¬ rung erfolgt nach den hierfür bekannten Methoden der Proteinchemie, die dem Fachmann geläufig sind und hier nicht näher erläutert werden müssen. Als Markierungssystem kommt sowohl eine radioaktive Markierung als auch eine Markierung mit Farbstof¬ fen, Farbstoffkomponenten oder biologisch aktiven Proteinen wie z. B. Enzymen in Betracht.
    [0022] Anstelle einer Markierung des für die Komplexbil¬ dung verwendeten positiv geladenen Nukleinsäure- bindenden Proteins oder Polyamins ist es auch möglich, das Protein oder Polyamin durch eine immunologische Reaktion nachzuweisen, wobei der Immunreaktionspartner in diesem Falle markiert sein, muß oder mit einem zweiten Antikörper nach¬ gewiesen wird. Die bestimmbaren Gruppen als solche können entweder direkt Bestimmbar sein wie bei radioaktiven- oder Farbstoffmarkierungen, oder indirekt, z. B. aufgrund ihrer enzymatischen Akti¬ vität, wie dies aus dem Enzym-Immuno-Assay-Verfah¬ ren bekannt ist.
    [0023] Die Lösung für die Durchführung der Komplexbildungs¬ reaktion zwischen Protein oder Polyamin und einzelsträngigem Polynukleotid soll eine geringe Ionenaktivität aufweisen. Vorzugsweise soll die Ionenstärke niedriger als 50 mM sein.
    [0024] Die Hybridisierungsreaktion selbst erfolgt nach den hierfür bekannten Methoden durch einfaches Zusammengeben des erfindungsgemäß erhaltenen kovalent vernetzten Komplexes aus dem einzelsträn- gigen Polynukleotid und dem positiv geladenen Nukleinsäure-bindenden Protein oder Polyamin mit einer Lösung, welche die gesuchte komplementäre Nukleinsäure enthält und Inkubation, zweckmäßig bei etwas erhöhter Temperatur. Die Sichtbarmachung und Isolierung der gebildeten Hybride erfolgt ebenfalls nach dem Fachmann hierfür bekannten Methoden.
    [0025] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Durchführung von Hybridisierungsreak¬ tionen, welches aus einem kovalent vernetzten Komplex aus einem einzelsträngigen Polynukleotid und einem positiv geladenen Nukleinsäure-bindenden nachweisbaren Protein oder Polyamin besteht oder
    [0026] OMPI
    [0027] ^ IPO dieses enthält. Vorzugsweise enthält das Reagenz als Proteinkomponente Histon Hl. Ebenfalls bevor¬ zugt ist ein Massenverhältnis von Protein und Nukleinsäure von etwa 1:1.
    [0028] Durch die Erfindung wird ein Verfahren und ein Reagenz für die Durchführung von Hybridisierungs¬ reaktionen zur Verfügung gestellt, welches als Probe eine chemisch hergestellte Verbindung verwendet, die mit hoher Ausbeute (mehr als 90 %) anfällt, keine Polymerasen zu ihrer Herstellung benötigt und die Abtrennung von Vorläufern und Endprodukten überflüssig macht. Der Zeitaufwand ist sehr gering, die Polynukleotide für die Probenbereitung müssen nicht im hochreinen Zustand eingesetzt werden. Die dem Fachmann bekannten Standardmethoden für die Blot-Hybridisierung können unverändert benutzt werden.
    [0029] Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der Erfindung unter Verwendung von markierten Polynukleotid- Histon Hl-Verbindungen als Proben für Hybridisierungs¬ reaktionen.
    [0030] B e i s p i e l
    [0031] A) Histon Hl-Isolierunq
    [0032] Histon Hl (21 Kd) wurde durch Perchlorsäure-Extraktion aus Kalberthymuskernen isoliert wie bereits beschrieben in BBA Band 62, Seite 608 bis 609, 1962. Lyophilisiertes Histon Hl wurde in Wasser gelöst (5 mg/ml) und bei -20°C aufbewahrt. Biotin-Markierung
    [0033] Biotinyl-N-hydroxysuccinimidester (BHSE) wurde hergestellt wie beschrieben in Methods Enzymology, Band 62, Seite 308 bis 315, 1979. 250 mg Biotin (Merck), 250 μ Ci (1,4 μg) 3H-Biothin (NEN) , 150 mg N-Hydroxysuccinimid (Merck) werden in 3 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und 200 -mg Dicyσlo- hexylcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wird 16 Stunden bei 20 °C gerührt. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wird mit Äther gewaschen, aus Isopropanol umkristallisiert und so für die Biotinmarkierung eingesetzt.
    [0034] Histon Hl wurde in verschiedener Weise mit steigenden Mengen an BHSE biotinyliert. Je 5 μg BHSE (gelöst in 10 μl DMF) , 25 μg BHSE (in 10 μl DMF) und 250 μg (in 10 μl DMF) werden zu einer die gleiche Menge Histon Hl (je 1 mg in 300 μl 50 M NaHCO.,) enthaltenen Lösung zugegeben und 1 Stunde bei 20 °C inkubiert. Nach Dialyse gegen 5 mM Natriumphosphat (pH 6,8) werden die drei Proben bei -20°C aufbewahrt. Die Konzentrationen der Biotin markierten Histon Hl-Lösungen werden durch Vergleich mit nicht modifiziertem Histon Hl durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt. Die Zahl der Biotinreste in den drei Präparationen wurde durch den in BHSE enthaltenen Tritium-Marker abgeschätzt und ergab 2,7 bzw. 20 pro Histon Hl Molekül.
    [0035] OMPl - 4θ -
    [0036] C) Polynukleotid-Histon Hl-Komplexbildung
    [0037] Zirkuläre DNS (Plasmide) wie auch große lineare DNS- Moleküle (Phage-Lamda DNS) wurden mit Restriktions- endonukleasen linearisiert oder gespalten zu einer Durchschnittsgrδße von ungefähr 4 kb. Im Verlauf der Untersuchung wurde festgestellt, daß kleinere DNS- Fragmente stärkere Hybridisierungssignale ergeben. Daher wurde die DNS mit Enzymen wie SAU 3 A oder Hae III gespalten. Die gespaltene DNS wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. 1 μg DNS (in nicht mehr als 20 μl Spaltpuffer) wurde mit 180 μl frisch bereitetem 5 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) verdünnt, durch Hitze denaturiert (100 °C, 3 Minuten) und 3 Minuten im Eisbad abgekühlt. Zuerst wurde Histon Hl (zwischen 0,8 und 1,0 μg in ungefähr 5 μl Phosphatpuffer) zugegeben und danach 20 μl einer 2,5 %igen Glutaraldehydlösung. Die Probe wurde 10 Minuten bei 30 °C inkubiert und direkt in das das Nitrocellulosepapier und die Hybridisierungslösung enthaltene Hybridisierungsgefäß gegeben.
    [0038] D) Hybridisierung
    [0039] Die zu untersuchende DNS wurde mit Restriktionsendo- nukleasen gespalten, durch Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert und nach der Southern-Methode (J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1975) auf Nitrocellulose¬ papier übertragen. Die Papiere werden 1 Stunde bei 37°C in 10 x Denhardts-Lösung (BBA, 23, 641 bis 645, 1966), 4 x SET (lx SET = 0,15 M NaCl, 0,03 M Tris x HC1, pH 8, 1 M EDTA) eingeweicht und in Plastikwannen überführt, die zwischen 10 und 20 ml reiner Hybridisierungsmischung (50 % deionisiertes
    [0040] - WIPO tS> - 1-4 -
    [0041] - Formamid, 2 x Denhardts-Lösung, 4 x SET, 0,1 % SDS und 20 μg/ml Hefe T-RNS) enthalten, für eine Stunde bei 37 °C inkubiert und dann nach Zugabe der Probe 16 bis 20 Stunden bei 37 °C leicht geschwenkt.
    [0042] Die Nitrocellulose-Papiere wurden dann 60 Minuten bei 37°C mit zwei Wechseln einer 50 % Formamid-, 0,2 % SDS und 5 x SSC (einmal SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumeitrat) enthaltenen Lösung und 40 Minuten bei 20 °C mit zwei Wechseln einer zweimal SSC enthaltenen Lösung gewaschen. Die Filter wurden getrocknet und mit einem Biotin-Nachweissystem entwickelt.
    [0043] Visualisierung der Proben mit Avidin-Peroxidase
    [0044] Die Nitrocellulosepapiere wurden zuerst 20 Minuten mit einer 10 μg/ml Poly-1-Lysin HBR, MW 220.000
    [0045] (Sigma) , 0,1 M Tris HC1 (pH 7,5) enthaltenen Lösung und dann mit einer 3 % Rinderserumalbumin
    [0046] (BSA) , 0,1 M Tris HC1 (pH 7,4) enthaltenen Lösung 50 Minuten inkubiert und nachfolgend 60 Minuten lang mit der Avidin-Peroxidase-Lösung (1 M NaCl, 0,1 M Tris HC1, pH 7,4, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % BSA und 1 μg/ml Avidin-Peroxidase, E. Y. Labora¬ tories, California) . Nach 20 Minuten Waschen mit zwei Wechseln einer 1 M NaCl, 0,1 M Tris HC1, pH 7,4, 0,1 % BSA und 0,1 % Triton X-100 enthaltenen Lösung, wurden die Papiere mit der Färbelösung (10 ml 0,1 M Tris HC1, pH 7,4, 2 ml.Äthanol in den 6 mg 3,3'-Dianisidin gelöst wurden, 6 μl 30 % H-O-) inkubiert. Die Farbentwicklung (braune Banden) findet in 5 bis 10 Minuten statt. Alle Inkubations¬ schritte wurden bei 20 °C unter leichtem Schwenken ausgeführt. B e i s p i e l
    [0047] Es wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, je¬ doch wurde anstelle einer Biotin-Markierung eine Mar- kierung mit 125J angewendet. Die Markierung von Histon
    [0048] Hl wurde wie folgt vorgenommen:
    [0049] Bei 0°C wurden zu lmCi festem Mono-j do
    [0050] 12=5 ( J)-Bolton-Hunter Reagenz (2000 Ci/mMol) (NEN) 60 μl einer zwischen 120 und 150 μg Histon Hl und 100 mM
    [0051] Natriumborat (pH 8,9) enthaltenen Lösung zugegeben und für eine Stunde stehen gelassen. Danach wurden 10 μl 1
    [0052] M Glycin in 0,5 M Natriumborat zugegeben. Die Lösung wurde durch eine mit 50 μg Histon Hl konditionierten
    [0053] Säule (silanisierte Pasteurpipette) gelfiltriert
    [0054] (Sephadex G 100: Molekularsiebmat. auf Basis von vernetztem Dextran) in 5 mM Natriumphosphat, pH 6,8.
    [0055] 125 J-Histon Hl enthaltene Fraktionen wurden bei -20°C aufbewahrt.
    [0056] B e i s p i e l 3
    [0057] Für Genkartierung wurde ein Drosophila virilis Insert tragender Λ.-Clon mit verschiedenen Restriktionsendo- nukleasen gespalten, nach Größe getrennt, auf
    [0058] Nitrocellulosepapier übertragen und gleichzeitig mit einem erfmdungsgemäßen Reagenz aus ΛrDNS und 125J-
    [0059] Histon Hl und einem erfindungsgemäßen Reagenz aus einem
    [0060] Plasmid (das Drosophila virilis Sequenzen des ^-Clones enthält) und Biotin-Histon Hl hybridisiert. Als Restrik- tionsendonukleasen wurden Eco Rl, Bam Hl, Hind III und
    [0061] Sal I verwendet. Durch Belichtung eines Röntgenfilmes und anschließende Entwicklung mit einem Biotin-Nachweis- System konnten die einzelnen Bruchstücke, die mit den verschiedenen Enzymen erhalten worden waren, identifi¬ ziert werden, welche jeweils die komplementäre Poly- nukleinsäure enthielten. Auf diese Weise war eine rasche Kartierung des Gens möglich.
    [0062] B e i s p i e l 4
    [0063] 20 mg (5x103 Einheiten) Meerrettichperoxidase (Grad 1 Boehringer Mannheim) wurden in 220 μl von 90 mM Natriumphosphat, pH 6,0 gelöst und dann mit 60 μl einer Lösung enthaltend 30 mg p-Benzochinon in 1 ml Ethanol versetzt. Die Mischung wurde .eine Stunde bei 37°C im Dunklen reagieren gelassen. Peroxidase mit kovalent gebundenen Benzochinonmolekülen wurde von nicht umge¬ setztem Benzochinon durch Gelfiltration abgetrennt unter Verwendung einer 6 ml Säule Sephadex G 100 in 0,15 M NaCl ohne Puffer. Die braungefärbten Fraktionen (etwa 1,8 ml) wurden vereinigt und die Kupplungsreaktion in Gang gesetzt durch Anhebung des pH-Wertes durch Zusatz von 180 μl 1 M NaHC03 und Zusatz von 2,7μl (133 μg) einer Polyethyleni inlösung (Polymin G 35 BASF) . Die Reaktionsmischung wurde 14 Stunden bei 37°C im Dunkeln gehalten und dann gegen 5 mM Natriumphosphat, pH 6,8, dialysiert und bei 3°C gelagert (Lösung A) . Die Proteinkonzentration der Lösung A betrug ca. 7μg/μl. Während dreimonatiger Lagerung wurde kein Aktivitäts¬ verlust beobachtet.
    [0064] Größe und Zusammensetzung der Peroxidasekonjugate wurde durch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese unter Verwen- düng von 125-I-Polyethylenimin (markiert mit Bolton- Hunter-Reagenz) und durch Vergleich von Coomassie-blau- gefärbten Gelen mit den entsprechenden Autoradiogrammen bestimmt. Dabei ergab sich, daß alle Peroxidasemoleküle modifiziert vorlagen. Die Konjugate hatten folgende Größen: 50 kDa 10%; 100 kDa 60 %; 150 kDa 20 %; 200 kDa 5 %; 250 kDa 2 %. Alle Konjugate wiesen ein Molverhält¬ nis Peroxidase : Polyethylenimin von 1 auf.
    [0065] Herstellung der Sonde
    [0066] Zirkulare, doppelsträngige DNA-Moleküle wurden mit einer Res'triktionsendonuklease linearisiert und ohne weitere Reinigung verwendet. 1 μg DNA in 20 μl 5 mM Natriumphosphat pH 6,8 wurde hitzedenaturiert (100°C, 3 Minuten) und 3 Minuten auf Eis abgekühlt. Zuerst wurden 20 μl Lösung A zugesetzt, danach 6 μl einer 5%igen Glutardialdehydlösung. Die Probe wurde 10 min bei 37°C inkubiert und dann entweder direkt der Hybri- disierungsreaktion zugesetzt, welche Nitrocellulose- papier und Hybridisierungslösung enthielt oder durch Zugabe von 28^ μl einer Lösung, welche 40 % Poly- ethy/lenglykol 8000 (Sigma) enthielt, gefällt. Die Mischung wurde 6 Minuten zentrifugiert und der Nieder¬ schlag in 10 μl 1,5 M L-Lysin in 5 mM Natriumphosphat, pH 6,8 aufgelöst und für die Hybridisierung eingesetzt. DNA-Bindungsuntersuchungen mit Gelfiltrationssäulen (Sepharose CL-6B) zeigten, daß etwa 25 % der Peroxidase- aktivität kovalent an die DNA gebunden war, was einem Protein:DNA Massenverhältnis von etwa 30 entspricht.
    [0067] Hybridisierung und Visualisierung der Sonden
    [0068] Nitrocellulosepapiere (Schleicher & Schüll) mit immobilisierter DNA wurden eine Stunde bei 38°C einge¬ weicht in lOx Denhardt's Lösung, 4x SET (lx SET ist 0,15 M NaCl, 0,03 M Tris-HCl, pH 8 , 1 mM EDTA) und 0,1% SDS und dann in Kunststoffbehälter überführt, welche zwischen 2 und 20 ml Blank Hybridisierungsmischung ent¬ hielten (50 % Formamid, 2x Denhardt's Lösung, 4x SET, 0,1 % SDS und 30 μg/ml Hefe tRNA) , unter Schütteln eine Stunde bei 38°C inkubiert und dann nach Zugabe der Sonde 2 bis 16 Stunden bei 38°C weiterinkubiert. Für die Analyse von Hühnchen- und Human-Einfachkopie-Gen- sequenzen erfolgte die Hybridisierung in Gegenwart von Polyethylenglykol 8000. Die Hybridisierungsmischung wurde modifiziert durch Verwendung von 12% (Gewicht/Volu¬ men) Polyethylenglykollösung in Formamid anstelle von Formamid alleine. Die Nitrocellulosepapiere wurden 60 Minuten bei 38°C mit zweimaligem Austausch einer Lösung enthaltend 50 % Formamid, 0,4 % SDS und 0,5x SSC (Ix SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumeitrat) und 20 Minuten bei 20°C mit zweimaligem Austausch einer Lösung enthaltend 2x SSC gewaschen. Dann wurden die Filter bei 20°C im Dunklen mit Färbelösung inkubiert. Peroxidase wurde visualisiert mit 10 ml einer Lösung von 100 'mM Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 10 mM Imidazol, 2 ml Ethanol, in welchem 6 mg 3,3'-Dianisidin aufgelöst worden waren und 10 μl 30% H-O,-,. Nach dem Anfärben wurden die Filter gewaschen und in Tris-HCl-Imidazol- puffer aufbewahrt.
    [0069] In Fig. 1 zeigt Tafel a ein Agarosegel-Elektrophoreto- gramm (mit Ethidiumbromid angefärbt) von pHBV 14.1 DNA, die mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen gespal¬ ten worden war und zwar von links nach rechts mit: Ba HI, Bglll, Aval, Hpall, Pstl. Jeder Auftrag enthielt 100 ng DNA. Die Spalte ganz rechts enthält Größenmar¬ kierungen folgender Längen in kb: 23,1, 9,4, 6,6, 4,4, 2,3, 2,2, 2,0, 1,1, 0,75, 0,56, 0,38. (Beispiel 6)
    [0070] ΓB.EA ( IΪO • Tafel b zeigt ein Nitrocellulosepapier nach Transfer der in Tafel a gezeigten DNA und Hybridisierung mit 0,5μg von mit EcoRI gespaltener pBR322 DNA, die mit Peroxidase- (10 μl von Lösung A) gekuppelt und mit Anisidin-H-O- gefärbt wurde. (Beispiel 7)
    [0071] Tafel c zeigt ein Replikafilter, welches mit HBV DNA-Sequenzen hybridisiert wurde, die mit Peroxidase markiert waren. Das Insert (3,2 kb Länge) von pHBV 14yl wurde nach Spaltung mit PstI der Agarosegel-Elektro¬ phorese unterzogen und eluiert . 0,5 μg so erhaltener Insert DNA wurde mit Peroxidase markiert (10 μl von Lösung A) . (Beispiel 8)
    [0072] Tafel d zeigt ein Replikafilter, welches mit HBV DNA (mit Peroxidase markiert) und mit pBR322 DNA (mit alkalischer Phosphatase markiert) hybridisiert worden war. 0,5 μg der Insert HBV DNA wurden mit Peroxidase gekuppelt (10 μl Lösung A) und 0,5 μg linearisierte pBR322 DNA wurde mit alkalischer Phosphatase markiert (10 μl Lösung B gemäß Beispiel 5) .
    [0073] Nach der Hybridisierung wurde das Filterpapier zuerst mit der Substratlösung für Phosphatase inkubiert, was in einer blauen Färbung resultierte und dann mit Anisidin für die Sichtbarmachung der Peroxidase (braune Banden) . Die Hybridisierungsvolumina und -zeiten betrugen jeweils 15 ml bzw. 3 Stunden. (Beispiel 9)
    [0074] In Fig. 2 zeigt Tafel a das Ergebnis folgenden Versuchs: pDvl, ein pBR322 Plasmid, welches ein Insert von D. virilis enthält, wurde mit EcoRI und PvuII gespalten, wobei vier Fragmente gebildet wurden: 2 D. virilis Fragmente (2,8 und 2,4 kb lang) und 2 pBR322 Fragmente (2,3 und 2,06 kb lang). Serienverdünnungen (500, 100 und 20 pg je Auftrag) wurden elektrophoriert, geblotted und hybridisiert mit 0,5 μg von mit EcoRI linearisier- tem pBR322, welches mit Peroxidase (10 μl von Lösung A) 16 Stunden in einem Volumen von 2,0 ml hybridisiert worden war. Die zwei Banden in der mittleren Spur . enthalten 24 bzw. 21 pg DNA. Die Fragmente in den beiden Banden sind 2,3 bzw. 2,06 kb lang. (Beispiel 10)
    [0075] Tafel b) zeigt ein Nitrocellulosepapier nach Transfer von 0,75 μg von mit EcoRI gespaltener und elektrophore- tisch aufgetrennter DNA aus D. elanogaster Kc Zellen und dreistündige Hybridisierung in einem Volumen von 5ml mit 0,5 μg eines mit Pst I linearisierten pBR322 Clons mit einem 4,8 kb Insert, welcher das Alkohol- dehydrogenasegen trug und mit Peroxidase (10 μl von Lösung A) gekuppelt war. Die DNA-Fragmente in der Bande sind 4,8 kb lang. (Beispiel 11)
    [0076] Tafel c) zeigt die Ergebnisse eines Titrationsexperi¬ ments ähnlich a) , hier wurde die Hybridisierung jedoch in Gegenwart von 6 % Polyethylenglykol vorgenommen. Die zwei Banden in der ganz rechten Reihe enthalten 4,7 bzw. 4,1 pg DNA. (Beispiel 12)
    [0077] Tafel d) zeigt die Ergebnisse eines Versuchs, bei dem lOμg von Hühnerembryo-DNA mit Sacl gespalten, der Agarosegel-Elektrophorese unterworfen und dann auf ein Nitrocellulosefilterpapier übertragen worden waren. Die Hybridisierung wurde mit 2,5 μg von mit EcoRI lineari- siertem pBR322 Plasmid, enthaltend 2,5 kb codierende
    [0078] OMPI
    [0079] ^ NAτQ i s
    [0080] Sequenzen für erb A und erb B von Hühnererythroblastose- virus, welches mit Peroxidase (50 μl von Lösung A) ge¬ kuppelt worden war, durchgeführt. Die Hybridisierungs- dauer betrug 14 Stunden, das Volumen 5 ml. Die Hybridi¬ sierungsmischung enthielt 6 % Polyethylenglykol. Die Banden entsprechen folgenden Größen in kb: 8,1, 7,5, 5,0, 3,0, 2,5. (Beispiel 13)
    [0081] Tafel e) zeigt die Ergebnisse eines Versuchs, bei dem 15μg menschlicher DNA aus HeLa-Zellen mit Hind III gespalten, durch Agarosegel-Elektrophorese der Größe nach aufgetrennt und auf ein Nitrocellulosefilterpapier übertragen und 15 Stunden (in einem Volumen von 5 ml) hybridisiert worden waren unter Verwendung von 2,5 μg eines mit EcoRI linearisierten pKT218-Plasmids, welches die codierenden Regionen des Albumingens (2 kb) enthielt und mit Peroxidase (50 μl Lösung A) gekuppelt war. Die Hybridisierungsmischung enthielt 6 % Polyethylenglykol. Die erhaltenen Banden entsprechen den folgenden Größen in kb: 6,2, 4,2, 1,8. (Beispiel 14)
    [0082] In der beigefügten Zeichnung sind die erfindungsgemäß erhaltenen Ergebnisse der Beispiele 6 bis 14 anhand der erhaltenen Elektrophoretogramme näher erläutert. In der Zeichnung stellen dar:
    [0083] Fig. 1 die Ergebnisse von Blot Hybridisierungsver- suchen unter Verwendung erfindungsgemäß mar¬ kierter Sonden.
    [0084] Fig. 2 die Ergebnisse von Titrations- und Genom-Blot- Experimenten. B e i s p i e l 5
    [0085] Wie im Beispiel 4 beschrieben, wurde ein Konjugat von alkalischer Phosphatase und Polyethylenimid hergestellt. Hierzu wurden 3 mg (350 μl) alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (Grad 1, Boehringer Mannheim) gegen 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,0 dialysiert. 90 μl der p-Benzo- chinonlösung, wie im Beispiel 4, wurden zugesetzt und im Dunkeln eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Gel¬ chromatographie (6 ml Kolonne Sephadex G 25) wurden die Phosphatase enthaltenden Fraktionen vereinigt (etwa 900μl) und mit 100 μl 1 M NaHCO., und 20 μg Polyethylen- imin versetzt. Die Mischung wurde 18 Stunden bei 37°C im Dunkeln inkubiert, gegen 5 mM Natriumphosphat pH 6,8 dialysiert und bei 3°C gelagert (Lösung B) .
    [0086] Die Herstellung der Sonde erfolgte, wie im Beispiel 4 beschrieben, unter Verwendung von Lösung B anstelle von Lösung A. Auch die Hybridisierung erfolgte wie im Bei¬ spiel 4 beschrieben.
    [0087] Die alkalische Phosphatase wurde visualisiert durch Zu¬ satz von 15 ml einer Lösung, welche Nitroblau-Tetrazolin (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-phosphat-4-toluidin- Salz (BCIP) enthielt und wie folgt hergestellt worden war: 5 mg NBT wurden in 5 ml 0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl« (Puffer A) suspendiert, eine Minute heftig gerührt und kurz zentrifugiert. Der Überstand wurde in 10 ml Puffer A abdekantiert, der auf 37°C vor¬ gewärmt worden war. Dann wurden 2,5 mg BCIP in 50 μl Dimethylformamid gelöst und unter Rühren in die NBT- Lösung eingetropft. Nach der Farbentwicklung wurden die Filter gewaschen und in 100 mM Tris-HCl pH 7,4, ent¬ haltend 5 mM EDTA, gelagert.
    权利要求:
    Claims P a t e n t a n s p r ü c h e
    1. Verfahren zur Durchführung von Hybridisierungsreak¬ tionen durch Komplexbildung zwischen einem Poly¬ nukleotid und einer bestimmbaren Substanz und Anwendung des so gebildeten Komplexes für Hybridi¬ sierungsreaktionen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man ein einzelsträngiges Polynukleotid und ein positiv ge¬ ladenes Nukleinsäure-bindendes nachweisbares Protein oder Polyamin in Lösung umsetzt und den entstandenen Komplex mit einem Vernetzungsmittel kovalent verbindet und die erhaltene Polynukleotid- Verbindung als Marker in Hybridisierungsexperimen- ten bei der Suche nach KomplementärSequenzen in fremden Polynukleotiden verwendet.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man Histon Hl als Nukleinsäure-bindendes Protein verwendet, mit denaturierter Nukleinsäure komplexiert und mit bifunktionellen Vernetzungs- Reagenzien vernetzt.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man den Protein- oder Polyaminanteil entweder vor oder nach der Komplexbildung markiert.
    4. Verfahren nach Anspruch 2, . d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man gleiche Massen an Nukleinsäure und Histon Hl mit Glutaraldehyd in Pufferlösung, pH 5 bis 8 vernetzt.
    5. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es aus einem..kovalent vernetzten Komplex aus einem einzelsträngigen Polynukleotid und einem positiv geladenen, Nukleinsäure-bindenden bestimmbaren Protein oder Polyamin besteht oder diesen enthält.
    6. Reagenz nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es als Protein Histon Hl enthält.
    7. Reagenz nach Anspruch 6 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es Protein und Nukleinsäure im Massenverhält¬ nis 0,1 bis 1,5 enthält.
    8. Reagenz nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es als Polyamin Polyethylenimin enthält.
    9. Reagenz nach Anspruch 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es eine Polyethylenimin-Enzym-Verbindung und Nukleinsäure im Molverhältnis von 1 bis 30:1 enthält.
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    法律状态:
    1984-09-27| AK| Designated states|Designated state(s): JP US |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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