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    公开号:WO1983004311A1
    申请号:PCT/JP1983/000169
    申请日:1983-05-28
    公开日:1983-12-08
    发明作者:Teruo Miyauchi；Suguru Yonezawa；Taku Chiba；Setsuzo Tejima；Masayuki Ozawa；Eiichi Sato；Takashi Muramatsu
    申请人:Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.；
    IPC主号:C07H21-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 害
    [0002] フ コ ー ス抗原とこれを識別する抗体 との製造、 これらを利用 した癌関連糖鎖の測定及び該測 定のためのキッ 卜 技 術 分 野
    [0003] . 、本発明はフ コ ース抗原と これを識別する抗体との製造技 術、 詳し く 特定の糖鎖をハプテン と して含有 した糖抗原 を製造する方法及びこれに よ り 得 られる唁抗原か ら 、 消化 • -器.癌等の癌钥胞、 殊に ヒ 卜大腸癌韌胞及びマ ウス テ ラ 卜 カ ルシノ ーマ細胞 と特異反応性を有する抗体を製造する方 法 に関する 。 ま た 、 本発明 は上記抗体に見 られる如き特定 糖鎮を特異的に認識できる抗体を用 いて癌関連糖鎮を測定 する技術及びこれに利用する癌診断用キッ 卜 にも関 してい る 。
    [0004] 最近細胞分化のある段階において 、 哺乳動物細胞表面上 に特異な糖抗原が表現され、 かかる糖抗原と反応性を有す る抗体と して 、 全細胞をィ ムノ ーゲン と して用いた細胞 ¾ 合技術によ り得ら れるモノ ク ロ ナール抗体 〔 C elし V oに 14 , 775 - 783 ( 1978 ) 、 P ro . N atl . , A cad. , U S A , V ol.75, Ν 0.11, 5565-5569 ( 1978) 及び Ν ature V 01.292 , 156-158 ( 1981 ) 〕 及びある患者の血清中に存在 す る抗体 〔 E xp. C ei l R es. , 131 , 185-195 ( 1981 ) 〕 が 提案さ れた 。 本発明者 ら は上記各報告に 関連 し て 、 独自 に 研究を重ねる過程 に おいて 、 特定の糖鎖を有機合成 し 、 こ れをハプテ ン と し て糖抗原を作成する に成功 し 、 ま た該糖 抗原か ら 消化器癌等の癌細胞特 に ヒ 卜 大腸癌及びマ ウ ス
    [0005] テ ラ 卜 カ ルシノ ー マ細胞 と特異選択的に 反応する抗体を製 造す る に 成功 し た 。 更に 該抗体の利用 に よ れば癌細胞の認 識 、 測定等及びこ れに よ る癌の診断が行ない得る と い う 新 し い知見を得た 。 本発明 は こ れ ら の知見を基礎 と し て 完成 さ れた ものである 。
    [0006] 発 明 の 開 示
    [0007] 本発明 は ひ — フ コ ピ ラ ノ シル一 （ 1 → 3 ) — 、 - ( 1 →
    [0008] 4 ) 一 又 は — （ 1 → 6 ) — ガ ラ ク 卜 ビラ ノ シル基を含有す る 才 リ ゴ糖をハプテ ン と し 、 こ れをキ ャ リ ア ー蛋 白 と 反応 さ せ て糖抗原を得る こ と を特徴 と するフ コ ー ス抗原の製造 法 に 係る 。
    [0009] ま た 、 本発明 は ひ ー フ コ ピ ラ ノ シル一 （ 1 → 3 ) ―、
    [0010] 一 ( 1 → 4 ) 一 又 は 一 （ 1 → 6 ) — ガ ラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基 を含有 す る オ リ ゴ糖 と キャ リ ア ー 蛋 白 と の複合体か ら な る 糖抗原を哺乳動物 に 投与 し 、 生成する抗体を採取 する こ と を特徴 と する フ コ ー ス抗原を識別 する抗体 の製造法 に係る c
    [0011] 更に 、 本発明 は 《 — フ コ ピ ラ ノ シルー （ 1 → 3 ) — 、
    [0012] - ( 1 → 4 ) 一 又 は — （ Ί → 6 ) — ガラ ク 卜 ピ ラ ノ シル基 を特異的に 認識で き る抗体を用 い 、 免疫反応 に よ り ひ ー フ
    [0013] '：ム ΤΓ し. 1FI― コ ピラ ノ シル一— ( 1 → 3 ) ―、 一 ( 1 → 4 ) 一 又は— （ 1
    [0014] → 6 ) 一 ガ ラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を有する癌関連糖鎮を測定 する こ とを特徴 と する癌関連糖鎖の測定法を提供するちの であ ■& 。
    [0015] 加 えて 、 本発明 は α — フ コ ピラ ノ シル一 （ 1 → 3 ) - 、 一 ( 1 → 4 ) - 又は 一 （ 1 → 6 ) — ガラ ク 卜 ビラ ノ シル基 を特異的に認識できる抗体を含有する癌診断用 キッ 卜 を 提供するち のであ る 。
    [0016] 以下本発明 における フ コ ー ス抗原の製造、 該抗原か ら の in ¼の製造並びに該抗体を含む癌診断用 キッ 卜 、 その利用 に よ る癌関連糖鎮の測定乃至癌の診新法につき頭次説明す る 。
    [0017] 本発明 に 係る フ コ ー ス抗原の製造に おいて は 、 八プテ ン と し て α—フ コ ピラ ノ シル一 （ 1 → 3 ) — 、 一 （ 1 → 4 ) 一又 は 一 （ 1 → 6 ) ー ガ ラ ク 卜 ピ ラ ノ シル基を含有す る 才 リ ゴ糖を用 いる こ と を必須 と す る 。 上記才 リ ゴ糖の必須構 成糖 と する フ コ ピ ラ ノ ー ス と ガラ ク 卜 ビラ ノ ー ス と の結合 は 、 ^ → 3 、 a 1 → 4 又 は α 1 → 6 結合を示 し 、 特に ひ Ί → 3 ¾«□が好ま し い 。 ま た上記 才 リ ゴ糖 はそのガラ ク 卜 ピ ラ ノ シル基に更に他の糖鎮が結合 し て いて ち ょ く 、 該他 の糖韓を構成する糖 と し て は代表的に は榥えぱグルコ ビラ ノ 一 スを挙げる こ と がで きる 。 該ガラ ク 卜 ピ ラ ノ 一 ス と グ ル コ ピラ ノ ー ス と の結合 は 、 又 は 3 のいずれでち ょ い 。 ま た 、 上記各構成糖 は 、 D体又 は L体の いず れで あっ て も よ い。
    [0018] 本発明 に好適な オ リ ゴ糖の具体例 と し て は 、 例えば以下 の ものを例示できる 。
    [0019] ♦ 0— ひ一 L—フ コ ピラ ノ シルー （ Ί → 3 ) - 0 - S - D—ガ ラ ク 卜 ピ ラ ノ シル 一 （ 1 → 4 ) 一 a — D—ダル コ ピラ ノ ー ス （ 3 一 一ひ 一 L ー フ コ ビ ラ ノ シル一 ひ 一 ラ ク 卜 ー ス ）
    [0020] ♦ 0 — ひ — L —フ コ ピラ ノ シル ー （ 1 → 4 ) — 0 — 3 — D—ガ ラ ク 卜 ピ ラ ノ シル ー （ 1 → 4 ) — ひ 一 D — ダル コ ピ ラ ノ ー ス （ 4 一 一ひ 一 L—フ コ ピ ラ ノ シルー ひ一 ラ ク 卜 一 ス ）
    [0021] ♦ 0 — ひ 一 L — フ コ ピラ ノ シル ー （ Ί → 6 ) — 0 — β - D — ガ ラ ク 卜 ビ ラ ノ シル ー （ Ί → 4 ) — cc — D — グル コ ピ ラ ノ ー ス （ 6 一 一 《 — L — フ コ ビ ラ ノ シル 一 α — ラ ク 卜 ー ス ）
    [0022] 上記 才 リ ゴ糖 は公知で あ る か ま た は公知 の各種方法 に よ り 容易 に 製造す る こ と がで き る （ C fiem . P harm. B ul l . 29 ( 4 ) 1076 - 1082 ( 1981 ) 及び第 3 回糖質 シ ンポジ ウ ム 講演要旨集第 90〜 91頁、 演題 43 「 人乳 才 リ ゴ糖の合成 」 、 昭和 55年 8月 參照 〕 。
    [0023] 上記 才 リ ゴ糖をハプテ ン と し 、 こ れに 結合 さ れる キ ヤ リ ァ 一 蛋 白 と し て は 、 通常抗原 の作成に 当 り ^用 さ れる 高分 子の天然あ し く は合成の蛋白質を広く 使用でさる。 例えぱ 馬血清アルブミ ン、 牛血清アルプミ ン （ B S A ) 、 ゥサギ 血清アルブミ ン、 ヒ 卜血清アルブミ ン、 ヒ ッジ血清アルブ ミ ン、 卵白 アルブミ ン等の動物のアルブミ ン類 ： 馬血清グ ロブ リ ン、 牛血清グロブリ ン、 ゥサギ血清グロブ リ ン、 ヒ 卜血清グロブ リ ン、 ヒ ッジ血清グロブリ ン、 卵グ口ブ リ ン 等の動物のグロプリ ン類 ： 馬チログロプリ ン、 牛チログ口 ブ リ ン、 ゥサギチロ グ口プ リ ン、 ヒ 卜 チロ グロブ リ ン、 ヒ ッジチロ グロブ リ ン等の動物のチログロブリ ン類 ： 馬へモ グ ロプ リ ン、 牛へモグ口 プ リ ン、 ゥサギへモグロ ブ リ ン、 ヒ 卜へモグロプリ ン、 ヒ ッジぺモグロブ リ ン等の動物のへ モグロプ リ ン類 ： 動物のへモシァニン類 ； 回虫よ り抽出さ れた蛋白質 （ ァス カ 一 リ ス抽出物、 特開昭 5 6一
    [0024] Ί 6 4 1 4号参照 ） 、 ェデスチン ( edest i n ) 、 ポ リ リ ジ ン、 ポ リ グルタ ミ ン駿、 リ ジン一グルタ ミ ン餒共重合体、 リ ジン又はオル二チンを含む共重合体等を挙げる.こ とがで ぎる 。
    [0025] 上記ハプテン ( オ リ ゴ糖 ） とキャ リ ア一蛋白 との反応は 公知の各種方法例えば （ A ) イ ソチ才シァネ一 卜 カツプ リ ング法、 （ B ) ジァゾカ ップ リ ング法、 （ C ) ア ミ ド結合 法、 （ D ) 還元的ァ ミ ノ化法、 （ E ) グァニジンカ ツプ リ ング法等に従い実施す るこ とができる 〔 A dvances i n
    [0026] C arbohydrate C hem！ s t ry and B iochemistry, V oL37, ら
    [0027] P225 - 281 ( 1980 ) 、 M ethods in E nzymo I ogy, V o 11 ,
    [0028] C omplex C arbohyd rates. P art 〇 ， p155-175 ( 1978 ) 蛋 白 質核酸酵素 V OI .25, N 0.8, P707-724 ( 1980 ) 及び
    [0029] A rchives of B io- chemistry and B iophysics,
    [0030] V ol.205, N 0.2 , P338-395 ( 1980 ) 〕 。
    [0031] 上記イ ソ チ才 シ ァネ 一 卜 カ ップ リ ング法 （ 法 ） は 、
    [0032] 元的ァ ミ ノ 化反応 （ 例えぱハプテ ン に /s — ( p — ア ミ ノ フ ェニル ） ェチルァ ミ ン等の ジ ァ ミ ン誘導体及び N a B H A
    [0033] N a B H 3 C NI等の還元剤を反応させる ） に よ り 製造さ れ る化合物 に 、 チ才 フ ォスゲンを反応さ せ た のち 、 得 ら れる イ ソ チ才 シ ァネ ー 卜 体 に キ ャ リ ア 一 蛋 白 を カ ップ リ ング ^ 応さ せ る こ と に よ り 実施さ れる 。 上記還元的 ァ ミ ノ 化反応 は 、 適当な不活性溶媒例えば 0 . 2 モ ル リ ン酸 カ ルシ ウ ム
    [0034] ( p H = 8 ) 等の緩衝液、 水、 生理食塩水又 はメ タ ノ ール エ タ ノ ー ル等の アルコ ー ル中 、 〇 〜 4 0で に て 3 時間〜 3 日 間で好適に進行する 。 ま た還元 的 ァ ミ ノ 化反応 に よ り 得 ら れる化合物 と チ才 フ ォスゲ ン と の反応は 、 適当 な不活性 溶媒例え ば水、 0 . 1 モル炭酸水素ナ ト リ ウム水溶液
    [0035] ( p H = 8 ) 又 は生理食塩水中 — 1 0 ^〜室混 に て 3 0分
    [0036] 〜 2 時間で好適 に進行す る 。 更 に イ ソ チ才 シ ァネ ー 卜 休 と キ ャ リ ア ー蛋 白 と の反応は 、 適当な，不活性溶媒例え ば水 、 生理食塩水又 は 0 . Ί モル炭酸水素 ナ ト リ ウ ム水溶液
    [0037] ( H = 9 . 5 ) 中で 一 1 0 ^〜室 ¾ に て 1 5 〜 2 0時 間
    [0038] ― 1一二
    [0039] -、: 0 ン で好適に進行する 。
    [0040] ジ ァゾカ ップ リ ング法 （ B法 ） は、 例えば上記 A法の還 元的ァ ミ ノ 化反応に よ り 製造さ れた化合物 に 、 亜硝酸ナ 卜 リ ゥ ム と塩酸又は硫酸等のジァゾ化剤 とを反応させて製造
    [0041] 5 さ れるジ ァゾ化合物 に 、 キャ リ ア ー蛋白 を カ ップ リ ング反 応さ せる こ と に よ り 実施される 。 上記ジァゾ化反応は、 適 当な不活性溶媒例えば水 、 生理食塩水又は塩酸水溶液等の 鉱酸水溶液中 、 一 1 0〜 一 2 0 )にて 1 0〜 60分で好適 に 進行する 。 ま た ジ ァゾ化合物 と キャ リ ア一蛋白 と の カ ツ lo プ リ ング反応は — 1 0〜 2 0で に て 2〜 6時簡で好適に進 行する 。
    [0042] ア ミ ド結合法 （ G法 ） は例えばハプテ ンの アルデ ヒ ド基 を酸化銀等の酸化剤で酸化 し て 糖 カ ルボ ン酸 と し たの ち 、 該糖 カ ルボ ン酸 と キャ リ ア ー蛋 白の ァ ミ ノ 基 と をア ミ ド桔
    [0043] 15 合反応さ せる こ と に よ り 実施さ れる 。 ア ミ ド結合反応 は 、 通常のぺプタ イ ドの ア ミ ド結合生成反応に よ り 、 例え ば 1 一 ェ チル 一 3 — ( ジメ チルァ ミ ノ プ ロ ピル ） 一 カ ルポ ジ ィ ミ ド等の脱水剤を用 いた脱水縮合反応に よ り 実施できる 。 こ の脱水縮合反応は 、 適当 な不活性溶媒例えば 1 モル酢酸 20 ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ ρ Η = 5· . 5 ) 等の ^衝液中 、 0 〜 室温に て 3〜 1 2時間で好適に進行す る 。
    [0044] 還元 的ア ミ ノ 化法 （ D法 ） は例 えぱハプテ ンに キ ャ リ ア 一 蛋白及び N Β Η 4 、 N a B H 3 C N等の還元剤 を反応
    [0045] し させ る こ と に よ り 実施さ れる 。 還元 的ァ ミ ノ 化反応の条件 と し て は 、 前記 A 法の遠元 的 ァ ミ ノ 化反応の条件を採用 で ぎる 。
    [0046] 上記 A 〜 D 法に おいて各試薬の使用量 は 、 通常原料 に対 し て 少な く と も等モル量程度、 好 ま し く は過剰量 と さ れる のが よ い 。
    [0047] か く し て 才 リ ゴ糖 とキャ リ ア ー蛋 白 と が結合 し た所望の 糖抗原 （ フ コ ー ス抗原 ） を製造できる 。 反応終了後得 ら れ る糖抗原は常法 に従い 、 例え ば透析法 、 ゲル濾過法、 分別 沈源等に よ り 容易 に 単離精製で きる 。 上記の ご と く し て 得 ら れる糖抗原の う ちで は 、 特 に キ ャ リ ア ー蛋 白 1 モルに 対 し て オ リ ゴ糖が平均 2 0 〜 2 5 モル結合 し た も のが好適で める 。
    [0048] 上記で得 られる糖抗原に よる抗体の作成は 、 通常の方法 に 従い該抗原を哺乳動物 に投与 し 、 生休内 に 産生 さ れる抗 体を採取 す る方法 に よ り 行なわれる 。 抗体の製造に供さ れ る哺乳動物 と し て は 、 特に 制 限 はな く 例えばゥ サギ 、 モル モ ッ ト 、 マ ウ ス 、 ヒ ッ ジ 、 ャ ギ 、 ゥ シ 、 ゥマ等を例示でき る 。 抗体の産生 は例えば上記抗原の所定量を生理食塩水で 適当濃度に 希轵 し 、 こ れ に 必要 に応 じ て フ ロ イ ン ドの不 完 全 ア ジ ュパ ン 卜 又 は フ ロ イ ン ドの完全 ア ジュパ ン 卜 等の ァ ジ ュバ ン 卜 を混合 し 、 得 ら れる懸濁 液を投与 す る こ と に よ り 行なわ れる 。 上記投与 は皮下 、 筋注 、 腹腔内 、 静 ^内 、 経口等、 好ま し く は皮下、 腹腔内 、 静脈内経路で行なわれ る。 投与回数、 投与量等は常法に従い適宜に決定できる 。 例えばゥサギ に上記懸濁液を皮内注射 （ 抗原の量 と して
    [0049] 0 . 0 5 〜 5 mg /回 ） し 、 以後 2 週間毎に 1 〜 1 0 ヶ月 、 好ま し く は 1 〜 3 ヶ月 間投与 し免疫化させれぱょ い。 抗体 の採取は 、 上記懸濁液の最終投与後抗体が多量産生される 畤期 、 通常上記最終投与の 1 〜 2 週間轻過後、 免疫化さ れ た動物か ら採血 し 、 こ れを遠心分離後血清を分離採取する こ と に よ り 行われる 。 ま た上記血清は更に塭析、 吸収法 、 ァ フ ィ 二テ イ ク 口マ 卜 グラ フ ィ 一等の通常の精製手段に よ り 精製 してお よ い
    [0050] か く して精製さ れた抗体 は 、 ひ ー フ コ ピ ラ ノ シル一 （ 1
    [0051] → 3 ) 一 、 一 （ 1 → 4 ) — 又は 一 （ 1 → 6 ) — ガ ラ ク 卜 ピ ラ ノ シル基を特異的に認識できる抗体である 。 特に本発明 に おいて八プテン と し て 3 一 一 ひ 一 L — フ コ ピラ ノ シルー ひ ー ラ ク 卜 ースを用 いた 時 に は 、 0 — ひ 一 L — フ コ ピラ ノ シルー ( 1 → 3 ) - 0 - β - D — ガラ ク 卜 ビラ ノ シル基を きる特異性の高い抗体が、 ゾプテ ン と し て 4 , — oc 一 し 一 フ コ ピラ ノ シル一 α: — ラ ク 卜 ースを用 いた 時に は 、 0 - a 一 し ー フ =1 ビラ ノ シル - ( 1 → 4 ) - 0 - β - D - ガラ ク 卜 ピ ラ ノ シル基を認識できる特異抗体が、 ま た 八プ テ ン と し て 6 一 一 ひ 一 し ー フ コ ピラ ノ シル 一 《 — ラ ク 卜 一 スを用い た 時 に は、 0 — oc — L — フ コ ピラ ノ シル一 （ 1 → 6 ) 一 0— — D— ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を認識でき る特 異抗体が各々製造できる 。
    [0052] 上記本発明方法に よ り 製造さ れた抗体は 、 消化器癌等の 癌細胞例え ぱ ヒ 卜 大腸癌細胞及びマ ウス テ ラ 卜 カ ルシ ノ 一マ幹細胞 と は結合するが 、 正常組織例え ば大腸粘膜 、 肝 臓、 胆囊 、 脬臓、 肺臓、 甲状線、 胸腺、 リ ンパ節、 筋肉 、 結合組織、 血管等の ヒ 卜 正常組織や小腸 、 大腸、 肝臓、 腎 臓、 副睾丸、 卵巣等のマ ウ ス正常組織等 と は結合 し ない特 徴を有 し て いる.。
    [0053] 更に 本発明者 ら の研究 に よ れば、 消化器癌等の癌細胞特 に大腸癌細胞 に よ っ て 、 α— フ コ ピラ ノ シル ー （ 1 → 3 ) 一 、 （ 1 → 4 ) —又 は 一 （ 1 → 6 ) —ガ ラ ク 卜 ビ ラ ノ シル 基を有す る癌関連糖鎖が産生 さ れ、 かつ 癌患者の体液中 に も こ れが存在 する こ と が見出 さ れた 。 従っ て ひ ー フ コ ピラ ノ シル 一 （ 1 → 3 ) ― 、 一 ( 1 → 4 ) 一 又 は 一 （ 1 → 6 ) 一 ガラ ク 卜 ビラ ノ シル基を特異的に 認識できる抗体の利用 に よ れば、 癌細胞も し く は癌組織上の又 は体液中 の癌関連 糖鎖を免疫反応 （ 抗原抗体反応 ） に よ り 測定 す る こ と がで き 、 こ れに よ り 癌の診新を す る こ と がで き る。 本発明 はか かる癌関連糖鎖の測定方法乃至癌の診断方法及びこ れ ら に 利用 する癌診断用 キッ 卜 をも提供す る も の である 。
    [0054] 本発明の上記癌関連糖鎖の測定及び癌の診断に利用 さ れ る抗体 と し て は 、 前記 の ご と く し て 得 ら れる抗体即 ち ひ — フ コ ピラ ノ シルー （ 1 → 3 ) —、 一 ( 1 → 4 ) — 又は一 ( 1 → 6 ) 一ガラ ク 卜 ビラ ノ シル基を特異的に認識で きる 抗体をいずれも使用できる 。 具体的に は 0— α — し 一 フ =1 ピラ ノ シルー （ 1 → 3 ) — 0 — /3 — D—ガラ ク 卜 ピラ ノ シ ル基を認識する抗体 （以下 「抗体一 I J と する ） 、 0 - ct
    [0055] — L一フ コ ピラ ノ シルー （ 1 → 4 ) — 0 — ） 3 一 D—ガラク 卜 ビラノ シル基を認識する抗体 （ 以下 「抗体 - I J とする ） 、 0— : — L—フ コ ピラ ノ シルー （ 1 → 6 ) - 0 - β - D 一ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を認識する抗体 （ 以下 「抗体一 BU と する ） を挙げる こ とができる 。 こ れ ら の う ちでは抗体一 I が.好 ま しい 。 ま た癌関連糖鎖 と は、 α—フ コ ピ ラ ノ シル 一 ( 1 → 3 ) 一 、 一 ( 1 → 4 ) — 又は 一 （ 1 → 6 ) ー ガラ ク 卜 ビラ ノ シル基を有する糖蛋白及び Ζ又は糖脂質を挙げ る こ とがでぎる 。
    [0056] 本発明の癌関連糖鎖の測定 は 、 通常の方法に従い 、 例え ば具体的に は以下の如 く し て行なわれる 。 即ち測定材料 と し て細胞及び Ζ又 は耝織片を使用 する場合は 、 通常の間接 免疫法に従い行われる 。 こ の方法に よ れば、 生理食塩水又 は通常の リ ン酸塩緩衝液 （ P B S ) 等の緩衝液中 に浮遊 し た細胞に 、 又はガラススライ ド上に 固定化 し た組鑌切片に 本発明の抗体を免疫反応さ せ 、 細胞又は耝鏺片 を上記緩衝 液で充分 に 洗浄後、 常法通 り に標識抗体法に よ り 、 又は標 翳プ ロ テイ ン Α の使用 に よ り 、 翊胞又は組識片に結合 し た
    [0057] - 本発明抗体の有無を調べれば よ い 。
    [0058] 標識抗体法 に お いて は 、 本発明 の抗体を製造 し た 動物種 の抗原 （ 免疫グ ロ ブ リ ン ） に対する標識抗体、 例えば標識 抗ゥサギ免疫グ ロ プ リ ン G抗体 、 周抗マ ウ ス免疫グ ロ プ リ ン G抗体 、 同抗ャ ギ免疫グ ロ ブ リ ン G抗体等を適宜選択 し て使用 する こ と ができる 。 上記標識抗体及び標識プ ロ ティ ン Αの標識剤 と し て は 、 各種の螢光標識物質又 は酵素標識 物質を利用でき る 。 代表的螢光物質 と し て は 、 例 え ば フ ル 才 レツ セ イ ン · イ ソ チ 才 シ ア ナ一 卜 （ F I T C ) 、 テ 卜 ラ メ チル ロ ー ダ ミ ン · イ ソ チ才 シ ア ナ 一 卜 （ T R I T C； ) 、 置換 ロ ー ダミ ン · イ ソ チ才 シ ア ナ一 卜 （ X R I T G ) 、 口 ー ダ ミ ン B * イ ソ チ才 シ ア ナ一 卜 、 ジ ク ロ ロ 卜 リ ア ジ ン フ ル才 レツ セ イ ン （ D T A F ) 等を 、 酵素標識物質 と し て は 、 例えばパ ー 才キ シダーゼ （ P 0 X ) 、 マ イ ク ロ パ ー 才 キ シ ダ ー ゼ 、 キ モ 卜 リ プシ ノ ー ゲ ン 、 プ ロ カ ルボキ シぺプチダ ー ゼ 、 グ リ セ 口 アルデ ヒ ド 一 3 — リ ン 酸脱水素酵素 、 ア ミ ラ ー ゼ 、 ホ ス ホ リ ラ 一 ゼ 、 D— N a s e 、 P - N ase 等をそ れぞれ挙げる こ と ができ る 。 こ れ ら で標識化さ れ た抗体又 はプ ロ テ イ ン A と し て は 、 市販のも の又 は常法 に 従 っ て作 成 し た も ののいずれを使用 し て も よ い C A cta .
    [0059] E ndocrinol . S uppl . , 168, 206 ( 1972 ) 及び P roc. N at. A cad. S ci . , U S A , 5J_, 713 ( 1967 ) 参 照 ] 。 本法 に お い て は 、 前記本発明の抗体で 処理 し た ¾胞又 は組 ^片に 、 前
    [0060] Vr'ii-O 記 と 同様の緩衝液で予め希釈 し た標 ¾ iJl体ある い は標識プ □ テイ ン A を反応さ せ 、 m 5G と同様に し て細胞又 は耝織片 を充分に洗浄後、 細胞又は組織片上に存在する標識活性 ( 螢光活性又 は酵素活性 ） を常法に従い測定する
    [0061] 測定材料 と し て体液を使用 する場合あ ま た常法に従 し と がでぎる こで体液と し て は例ぇぱ血液、 細胞耝織液 リ ンパ液、 胸水 、 腹水 、 羊水、 胃液 、 尿、 脬液、 髄液、 唾 液等又は前記の細胞又 は組織片の可溶化後の遠心上清等を 使用 する こ と がでぎる o _t E2 ^胞又は钽耩片の可溶化後の 心上清 は 、 通常の方法例えぱ ジネ ー 卜 法や可溶化剤 を用いる可溶化の後 、 こ れを遠心分離 し て上清を採取する こ と に よ り 得る こ と がで ぎ る 。 ま た血液を使用する場合は 通常血清又は血漿 と し て 使用 するのが好 ま し い 。 測定 に用 い ら れる体液の量は 0 . 1 〜 1 0 m δ 程度採取す れぱよ い 上記各種体液を測定材料 と する本発明方法 は、 通常の競 合法に よ る ラジ 才ィ ム ノ アソ セ ィ 法 ( R I A ) 又 は酵素免 疫測定法 （ E I A ) に よ り 行 う のが好 ま しい 。 こ れ ら方法 の操作、 手 m等は通常の方法に従う こ と ができる 。 即 ち通 常の溶媒中 定量の標準抗原、 標謹抗原及び抗体を競合 反応さ せ 、 次いで抗原抗体結合物 （ 免疫複合体 ） 及び非結 合抗原を分 . し 、 そ の いずれか一方の標識活性を測定 し 、 既知濃度の標準抗原 に対す る標準曲 を作成する 。 周様 に 標準抗原の代 り に 未知 の被 試料 ( 休液 ) を使用 し て そ の標識活性を測定 し 、 前記標準曲線 よ り 被検試料 中の使 用 し た抗体 に対す る免疫感受性物質 （ 癌関連糖鎖 ） 量を定 量する こ と ができ る 。
    [0062] 標準抗原 と し て は 、 使用 する抗体 に免疫感受性を有する 物質 （ 抗原乃至そ のハ プテ ン ） を使用 す る こ とがで きる。 該ハプテ ン と し て は 、 例えば抗体一 I を使用 する場合に は
    [0063] 3 一 一 ひ一 L一フ コ ピ ラ ノ シル ー α—ラ ク 卜 ー スを 、 抗体 — Π を使用 する場合に は 、 4 "* 一 a— L—フ コ ビ ラ ノ シル — ひ ー ラ ク 卜 ー ス を 、 抗体一 ΙΠ を使用 す る場合 に は 、 6 一 — α— L—フ コ ピ ラ ノ シル ー ひ — ラ ク 卜 ー ス を例示できる ま た抗原 と し て は上記各ハプテ ン に対応する抗原 、 具体的 に は後記す る抗原の製造例で得 ら れる如き上記ハプテ ン と キ ャ リ ア 一 蛋 白 、 例え ば P I P— B S A と の桔合物 を例示 する こ と がでぎる 。
    [0064] 標識抗原 と し て は 、 標準抗原を例 えば ， 2 5 I も し く は
    [0065] 3 H 等の放射性物質又 は前述 し た各種酵素標識物 質等で標 識化 し た ちの を使用 すれば よ い 。 標準抗原に 上記放射性 ョ ー ド を導入 し て 標識化する 場合は 、 例えば前記抗原の製造 に お い て説明 し た イ ソ チオ シ ァネ ー 卜 体 （ ハプテ ン 一 イ ソ チ才 シ ァネ 一 卜 結合物 ） 又 は こ れ と キ ャ リ ア ー 蛋 白 と の桔 合物 、 具体的に は後記する抗原の製造例で得 ら れる如き
    [0066] 3 " - . 4 一 一又 は 6 ー 一 α— L —フ コ ビラ ノ シル一 《 — ラ ク 卜 一 ス ー P I P 、 又 は こ れ と B S A と の桔合物を 、 ポ ル 卜 ン 一 ハ ン タ ー （ B o on — H unter ) 試薬 を用いて 常 法通 り に標識化す る こ と ができる 〔 J . B iol . C hem. , 254 9349— 9351 ( 1979 ) 参照 〕 。 ま た ク ロ ラ ミ ン Τを用 いる酸 化的 ョ ー ド化法 〔 N ature, 194, 495頁 ( 1962 ) 、 B iochem J . 89, 114頁 （ 1963) 〕 に よ っ て ョ ー ド化さ れたチロ シ ン 基を前記のイ ソ チオシァネー 卜 カ ップ リ ング法に よ り前記 P I P基に結合させたもの、 あるい は B S A基のチロ シン 残基を周様に ョ ー ド化 し たも のを使用 する こ ともできる 。
    [0067] ま た 、 3 Hを導入する場合も常法に従い 、 前記標準抗原を 例え ば N a B 3 H 4 を用 いた還元反応に付す こ と に よ り 又 は （ G 3 H 3 C 0 ) 2 0に よ り ァ セチル化する こ と に よ り 標識化さ れた標識抗原を得る こ と ができる 。 前記測定系の 溶媒と し て は 、 免疫反応に悪影響を与えないもの 、 例えば 水、 生理食塩水、 0. "1 モル 卜 リ ス塩酸緩衝液 （ P H =
    [0068] 7 . 5 ) 、 0. 1 モル リ ン酸塩緩衝液 （ P H = 7. 4 ) 等 の P Hが 6〜 7 . 8の緩衝液が好ま し い 。 上記免疫反応は 常法に従い 4 51； 以下、 好 ま し く は 4〜 4 0で 、 1 〜 4 0 時間程度で行われる 。 反応に よっ て生成 した免疫複合体 と 非結合抗原と の分離は、 公知の方法に よっ て例え ばデキス 卜 ラ ン一 活性炭法の後、 あ るい は前記抗体に対する第 2抗 体例えば上記方法に おい て ゥ サギ抗体を使用 する場合 は ャ ギ抗 ゥ サ ギ I g G抗体等を反応さ せ た後、 遠心分離法 に よ つ て 分 ^す ればよ い 。
    [0069] 、ん Λ "「-¾ -.--.0'<· 0、 以下、 上記測定法の一具体例を挙げて 更 に 詳述する 。 後記抗原の製造例で得 ら れる 3 " 一ひ — L — フ コ ピ ラ ノ シル— ひ一ラ ク 卜 ー ス ー P I Pの 5〜 1 0 / g を ポル 卜 ンハ ン タ ー 試薬を用 い 1 2 5 I で標識 し て （ 室温 、 約 6 0 秒 ） 標識抗原を製造する 。 標準抗原 と し て 3 一 一ひ一 L一 フ コ ピ ラ ノ シル一 ひ ー ラ ク 卜 ー ス を 、 ま た抗体 と し て 抗体 一 I を使用 する 。 0 . 5 96 B S A及び 0 . 0 2 % N a N 3 を含む 0 . 1 M リ ン酸塩緩衝液 （ P H = 7 ) 0 . 2 ml、 上 記標識抗原 0 . 1 ml ( 約 10000c pm ) 、 適当濃度の抗体一 I の 0 . 1 ml及び各種濃度の標準抗原 0 . 1 mlを 4 で 、 2 4 時間 イ ンキュベ ー ト する 。 次いで 、 0 . 1 ml正常ブ タ 血清及び 0 . 5 mlデキ ス ト ラ ン一活性炭懸濁液を加 え て 4 で 下 3 0分放置後遠心分離 ( 3000 rpm 、 3 0分 ） す る かあ る い は 、 適当濃度の ャ ギ抗 ゥ サギ 1 9 G抗体 0 . 1 mlを加 え 4 °C、 2 4 時 間 イ ンキ ュ ベ ー ト 後同様 に し て 遠心分離 し て 、 免疫複合体及び非結合抗原を分離 し 、 その放射活性を 測定 する 。 標準抗原の各濃度 に対 し て そ の放射 活性を求 め る か 、 あ る い は用 い た 抗体の力 価 に 相 当 す る抗体 と 標準抗 原 と の結合率 （ B o ) を 1 0 0 %と し た と きの抗体 と 標識 抗原 と の結合体 （ B ) の百分率を求め 、 標準曲綜 を作成す る 。 ま た 濃度未知の試料を標準抗原の代 り に 使用 し て周様 に し て 放射活性又 は百分率を求め 、 こ の 値か ら 前記標準曲 諒 を利用 し て 、 試料 中 の癌 関連 3鎖の定 ffiを行な う こ と が でぎる 。 ま た上記方法に よつ て 、 体液中の 3 ー 一 ひ — し 一
    [0070] フ コ ビラ ノ シル一 α — ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を有する癌関 連糖鎖の測定が可能である 。 更に上記に おいて抗体一 I 又 は抗体一 II を使用 し 、 対応する抗原系 （ 標識抗原及び標準 5 抗原 ） を使用 して同様に して測定する こ と に よ り 、 体液中
    [0071] の r 一 α - L ー フ コ ビラ ノ シルー α — ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シ ル基又は 6 ' 一 α — し ー フ コ ピラ ノ シル一 ひ 一 ガラ ク 卜 ピ ラ ノ シル基を有する癌関連糖鎮を測定できる 。
    [0072] 本発明の上記測定法を実施するの に特に便利な方法は 、 l O 血槳ゃ血清の よ う な体液中の癌関連糖鎮量を決定する ため
    [0073] のキッ 卜 を使用 する方法であ る 。 こ の よ う なキッ 卜 に'は 、 癌関連糖鎮 と特異的に 抗原抗体反応をす る抗体 ΕΠち ひ ー フ コ ピラノ シル一 ( 1 → 3 ) ― 、 一 ( → 4 ) 一又は 一 （ Ί
    [0074] → 6 ) - ガ ラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を特異的に認識で きる抗体
    [0075] 15 を含有せ し め る こ と が重要である 。 この抗体試薬 に は 、 グ
    [0076] リ セ 口 — ルゃ ゥ シ血清蛋白 の よ う な安定化剤及び Ζ又 は保 存剤を添加する こ と ができる 。 好 ま し く は 、 こ の抗体試薬 は凍結乾燥 したものであ り 、 キッ 卜 に は水溶性も し く は水 と 混和 し う る溶媒を含有させる こ と ができる 。 更に こ の抗
    [0077] 20 体試薬 に は 、 再構成さ れた試薬系を一定の Ρ Η に保っ た め
    [0078] の緩衝液及び /又 は使用前に試料 が悪化するのを防 ぐた め の保存剤及び Ζ又 は安定剤 を添加 す る こ とができ る 。 緩衝 液 はキッ 卜 試薬の必須成分 と は考え ら れないが 、 本発明の : tr
    [0079] Oソ -H 測定法を実施す る際に 、 P H を 6 〜 7 . 8 と す るものを用 いるのが好 ま し い 。 ま た再構成剤 は好 ま し く は水を含 ん だ ものであるが、 水の一部又 は全部を水 と混和 し う る溶媒で 置き換える こ と もできる 。 水 と 混和 し う る溶媒は当業者に
    [0080] 5 周知であ り 、 例え ばグ リ セ リ ン 、 アルコ ール類、 グ リ コ ー ル類、 グ リ コ ールエ ー テル類等を使用 できるが 、 も ち ろん こ れ ら に 限定 さ れない。
    [0081] か く し て本発明 キッ 卜 の利用 に よ れば癌関連糖鎖を有利 に 測定す る こ と ができ る 。 測定 さ れた癌関連糖鎖 レベルを l O 健康人の 当該 レベル と比較す る こ と に よ り 、 被検者 に お け る初期か ら末期の消化器等の癌腫 、 特に大腸癌を診断す る こ と がで きる 。 従っ て 本方法 は特に 癌の早期発見に 極め て 有用 である 。
    [0082] 以下本発明を更 に 詳 し く 説明するた め糖抗原 （ フ コ ー ス 5 抗原 ） 及び抗体の製造例 を挙げる 。
    [0083] 抗原の製造例 1
    [0084] ( 1 ) 3 一 一 a — L—フ コ ピ ラ ノ シルー ひ 一 ラ ク 卜 ー ス 一 フ エネ チル ァ ミ ン誘導体の製造
    [0085] 3 一 一 ひ一 L—フ コ ピ ラ ノ シル ー ひ 一 ラ ク 卜 — ス 0 . 1 0 ミ リ モル及び jS — ( p — ァ ミ ノ フ エ ニル ） ェ チルァ ミ ン
    [0086] 3 . 5 ミ リ モルを密閉容器 に入れ 、 室温で Ί 5 時 間撹拌 し て 反応さ せた 。 純 エ タ ノ ール 0 . 5 in3を反応混合液 に加 え 、 次い で水素化ホ ウ素ナ ト リ ウム 1 2 ns gを 濁 さ せ た ^エ タ re A ノ ール 1 m3を加え室温で 5 時間撩拌 し た 。 次いで水 4 m3を 加えて希釈 し 、 永冷下に水酢酸を滴下 して p H 5 . 6 に調 整 し た 。 減圧下に エ タ ノ ー ルを留ま後水を加えて 5 m3と し た反応混合液をセ フ アデッ ク ス G— 1 0カ ラム （ 2 . 5 X 1 0 0 cm) に通 し 、 1 M S酸 — ピ リ ジン緩衝液 （ P H = 5 . 0 ) で溶出 した 。 溶出液を 5 ϋΐδづっ分画 して 、 各画分 にっ きフ エ ノ ール硫酸反応に よ る中性糖の測定及び
    [0087] 0 D a 8 5 での吸光度測定を行ない 、 それぞれの ピ ー ク がー致する画分を集め て凍結乾燥 した 。
    [0088] 凍結試料を 2 m M酢酸 一 ピ リ ジ ン緩衝液 （ P H 5 . 0 ) に溶解 し 、 ヮ ッ 卜マ ン G M 5 2 カ ラ ム （ 0. 5 X 2 0 cm) に通じ 、 周緩衝液で未反応原料 （ 3 一 — ひ— L — フ コ ビ ラ ノ シル一 ひ 一 ラ ク 卜 ー ス ） を溶出後、 0. 1 N! ア ンモニ ア 水で溶出 し た 。 溶出液を 2 0滴 （ 約 0. 6 ms ) づっ分画 し 各画分につ ぎ上記 と 同様 に し て 中性糖測定及び 0 D 2 8 5 nmでの吸光度測定 を行ない 、 ピ ー ク が一致する画分を採取 し凍結乾燥 し た 。
    [0089] か く し て 3 一 一 α— し 一 フ コ ピラ ノ シルー ひ ー ラ ク 卜 一 スー フ エネチルァ ミ ン誘導体を得た 。 こ の ものの糖組成は ガス ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一 〔 B iochem. B iophys. A cta. , 222 , 339-347 ( 1970 ) ) 及び高速液体ク ロ マ ト グラ フ ィ ー ( D evelopmental B iology, 90^, 441 -444 { 1982 ) ) に よ り 砬認できた 。
    [0090] ^ 2θ
    [0091] ( 2 ) 3 一 一ひ 一 L—フ コ ビ ラ ノ シル一 α:—ラ ク 卜 ー ス ー
    [0092] Ρ — イ ソ チ才 シ ァネ 一 卜 ー フ エネ チル ァ ミ ン誘導体
    [0093] ( 3 ' — ひ 一 し一フ コ ピラ ノ シルー ひ一ラ ク 卜 ー ス ー Ρ I Ρ ) の製造
    [0094] 上記 （ 1 ) で得 た 3 一 一ひ 一 Lー フ コ ビラ ノ シル — ひ — ラ ク 卜 一 ス ― フ エネチルァ ミ ン誘導体の モルを 、 0. 1 Μ炭酸水素ナ 卜 リ ウ ム水溶液 （ Ρ Η = 8. 0 ) 2 me に 溶解 し て 、 チ才ホスゲン 6 5 X モルを含むク ロ 口 ホルム 2. 5 πιδ上に重層 し 、 1 時間激 し く 撹拌 し た 。 反応混合物 を遠沈管 に 移 し 、 ク ロ 口 ホルム 2 ιδで 2回抽出 し 、 過剰 の チ 才 ホスゲンを除去 し 、 水層を集め 、 窒素ガ スを通 し て 残 存す る ク ロ 口 ホルム を 除去 し た 。
    [0095] か く し て 3 一 一 ひ 一 L— フ コ ビ ラ ノ シル一 ひ 一 ラ ク 卜一 ス 一 Ρ — イ ソ チ才 シ ァ ネ ー 卜 一 フ エネ チルァ ミ ン誘導体を 水性液 と し て 収得 し た 。
    [0096] ( 3 ) 3 一 一 ひ 一 し 一 フ コ ビラ ノ シル 一 ひ 一 ラ ク 卜 ー ス ー
    [0097] Ρ — イ ソ チ 才 シ ァネ ー 卜 ー フ エネ チルァ ミ ン誘導体 と 牛血清アルブ ミ ン と の カ ップ リ ング反応に よ る 糖 抗原 （ 3 一 一 ひ 一 L—フ コ ピ ラ ノ シルー ひ 一 ラ ク 卜 ー ス ー P I P— B S A ) の製造
    [0098] 上記 （ 2 ) で得 た 水性液を 、 牛 血清 アルブ ミ ン （ B S A ) 0. 2 JW モルを含む 0. 5 M塩化 ナ 卜 リ ウ ム ー 0. 炭 酸水素 ナ 卜 リ ウ ム水溶液 （ P H - 9 . 5 ) に 加 え 、 室潟 で 1 8 時間搅拌 して反応させた。 反応混合液をダルべッコ ー 処理の P B S ( — ） （ 生理食塩水一リ ン酸塩緩衝液） 2 e に対 して透析 して 、 未反応の 3 一 一 α:— L—フ コ ピラノシ ル一 ーラク 卜 — ス ー ρ 一イ ソ チオシァネー 卜一フエネチ ルァミ ン誘導体を除去 した。 透析液を 1 2 時間毎に 3 回交
    [0099] - 換後、 透析された液につき、 口 一 リ ー法及ぴフエノ ール硫
    [0100] 酸反応を行ない、 それぞれの蛋白量及び中性糖の定量を行 なつた。 その結果得られた糖抗原は、 牛血清ァルブミ ン
    [0101] ( B S A ) 1 モルに対 して 3 ^ — ひ 一 し 一 フ コ ビラノ シル 糖鎮が約 2 0 モル結合していた 。
    [0102] か く して 目 的 とする糖抗原液を得た。 これを凍結保存 し た ( これを 「抗原— 1 J とする ） 。
    [0103] 抗原の製造例 2
    [0104] 記抗原の製造例 Ί において、 3 一 — a— L ー フコ ビラ ノ シルー α—ラク 卜 一スに変えて 4 一 一 a — L ー フ コ ビラ ノ シルー ひ 一 ラ ク 卜 一スを用いて同様に して 目的とする糖 抗原液を得た 。 これを凍結保存 した （ これを 「抗原一 2 」 と する ） 。
    [0105] しの糖抗原は、 牛血清アルブミ ン （ B S A ) 1 モルに対 して 4 " " 一ひ 一 し ー フ コ ビラノ シル糖鎖が約 2 5 モル結合 していた 。
    [0106] 抗原の製造例 3
    [0107] 刖記抗原の製造例 Ί において 、 3 一 _ α — し ー フ コ ビラ
    [0108] ：-：
    [0109] 、 ， ノ シル ー ひ 一 ラ ク 卜 ー ス に 変え て 6 — ひ 一 L— フ コ ビラ ノ シル 一 ひ 一 ラ ク 卜 一 スを用 い て同様 に し て 目 的 と す る糖 糖原液を得た 。 こ れを凍結保存 し た （ こ れを 「抗原 一 3 J と する ） 。
    [0110] こ の糖抗原は 、 牛血清 アルブミ ン （ B S A ) 1 モルに対 し て 6 ' — ひ — L— フ コ ビ ラ ノ シル糖鎖が約 2 3モル結合 し て い た 。
    [0111] 抗体の製造例 1
    [0112] ニ ュ ー ジ ー ラ ン ド 白 兎の フ ッ ト パ ッ ド （ foot pads ) に 上記抗原の製造例 1 で得た抗原 一 1 の 0. 4 mgを含む フ ロ イ ン ド 完全補助液. Ι ιηδを注射 し た 。 3週間後同量の抗原— 1 含有 フ ロ イ ン ド完全補助液 を注射 し 、 こ の操作を 2週間 毎 に 3回繰 り 返 し た 。 第 3回 目 （ 最終 ） の注射 か ら 1 0 曰 後 に 、 試験動物か ら 採血 し 、 遠心分離 し て抗血清を採取 し て 目 的の抗体を得 た 。 こ れを 「抗体 — 1 」 と す る 。 抗体 一
    [0113] 1 は — 7 0 eCに保存さ れる 。 ま た上記で得 ら れた 抗血清を 凍結乾燥 し て抗体 一 1 の乾燥品 を得た 。
    [0114] 抗体の製造例 2
    [0115] 前記抗原の製造例 2で得 た 抗原— 2を用 い 、 抗体の製造 例 1 と 同様に し て 目 的の抗体 （ 抗血清 ） を得た 。 こ れを 「 抗体 一 2 J と す る 。
    [0116] 抗体の製造例 3
    [0117] 前記抗原の製造例 3で得 た 抗原 一 3を用 い 、 抗体 の製造 例 1 と周様 に し て 目 的の抗体 （ 抗血清 〉 を得た れを
    [0118] 「抗体一 3 」 と する
    [0119] 以下、 抗体の特異性試験例 につき詳述する
    [0120] 〈 抗体の特異性試験 I >
    [0121] ( 1 ) 各種細胞を ¾ 'し、分 ( 5 0 0 X 9 ) し 、 リ ン酸塩
    [0122] 緩衝生理食塩水 （ 力 ルシゥムイ オ ン及びマグネシ ゥムィ 才
    [0123] ン含有、 H = 7 . 2 ) の 5 0倍量で 2 回洗浄する。 得 ら
    [0124] れる細胞を上記 リ ン酸塩緩衝生理食塩水に 1 % ( V Z V )
    [0125] 濃度 となる よ う に懸濁させ 、 こ の懸濁液 5 0 I に 、 抗体
    [0126] の製造例 Ί 〜 3 で得た抗体 ( 体一 1 〜一 3 ) のそ れぞれ
    [0127] を予め リ ン酸塩緩衝生理食塩水 （ カ ルシ ゥ ムィ 才 ン及びマ
    [0128] グネシゥ ム ィ オン含有 ） で 2 0 容積倍に希釈 し た もの 、 又
    [0129] は対照 と し て同様 に ^された正常兎血清を混合 し 、 各混
    [0130] 合液を 4 下 1 時間イ ンキュベ ー 卜 する 。 その後各細胞を
    [0131] リ ン酸塩緩衝生理食塩水 （ カ ルシ ゥ ムィ 才 ン及びマグネ シ
    [0132] ゥ ムィ オ ン含有、 P H = 7 . 2 ) の Ί 0 0 倍量で洗浄 し 、
    [0133] 次 に F I T Cが共有 し た羊抗兎 I 9 G 〔 マイ ノレス — イ エ 一
    [0134] ダ （ M ！ I e s - Y e d a ) 社製 〕 の 1 Z 1 0 希釈液を用 いて 4
    [0135] Ό下 1 時間ィ ンキュベ ー 卜 す る 。 引 き続ぎ、 上記 リ ン酸塩
    [0136] 緩衝生理食塩水 （ P H = 7 ， 2 ) の " I 0 0 倍量で 2 回洗淨
    [0137] 後 、 各颍胞を落射螢光顕微 ( 才 リ ンパスモデル B H - R F し— L B 、 才 リ ンゾ° ス光学社製 ） で観察 し 、 富 ± カ ラ
    [0138] ー フ ィ ルム A S A 1 0 0 ( 富士 フ イ ルム社製 ） で摄影する
    [0139] I . ：
    [0140] V'TiO 、 ' ' ( 2 ) 癌又 は正常組糍を迅速 に凍結 し 、 ク リ オ ス タ ツ 卜
    [0141] ( A mer i can O ptical社製 ） に よ り 、 超薄切片を得る 。
    [0142] こ れをガラ スス ライ ド上に ァ セ 卜 ンで Ί 分間 固定 し て検体 と し 、 更に F I T G—羊抗兎 1 9 Gの代 り に F I T C—羊 抗兎 I g G - F ( ab) ' 2 ( C appel 社製 ） を使用 し て 、 上記 と同様に し て 試験す る 。
    [0143] 上記 （ 1 ) 及び （ 2 ) に おい て 、 用 いた各細胞又は'組織 片 と 抗体— 1 〜一 3 と の反応性を調 べた結果を各抗体毎に 下記第 1 表 に示す 。 第 Ί 表 に おけ る各反応性につ いて の評 価記号 は 、 そ れぞれ次の こ と を示す 。
    [0144] + ·· ·， 染色像が認め ら れる 。
    [0145] 一 ·· ·· 染色像が認め ら れない 。
    [0146] 第 1 表
    [0147] 試験例 （ 1 ) の
    [0148] 抗体一 Ί 抗体 — 2 抗体一 3
    [0149] 正常細胞
    [0150] マ ウ ス赤血球
    [0151] マウス リ ンパ球
    [0152] マ ウス脾細胞
    [0153] マ ウス胸腺細胞
    [0154] ヒ 卜 赤血球
    [0155] ( タ イ プ H )
    [0156] ( タ イ プ L ea)
    [0157] OM I
    [0158] 4 v' λ/ΐίθ 、 、 マウ ス—テラ _卜 カ ルシ ノ 7
    [0159] F— 9 + 一
    [0160] S S T - + + +
    [0161] 試験例 （ 2 〉 の結果
    [0162] 抗体一 1 抗体一 2 抗体一 3
    [0163] ヒ 卜 正常細胞
    [0164] 十二指腸.
    [0165] 肝 臓
    [0166] 胆の う
    [0167] 脬 朦
    [0168] 肺 藏
    [0169] 甲状線
    [0170] 胸 腺
    [0171] リ ンパ節
    [0172] 筋 肉
    [0173] 結合組織
    [0174] 血 管
    [0175] 癌 細 胞
    [0176] ヒ 卜 大腸 アデノ
    [0177] カ ルシ ノ ー マ + + +
    [0178] ( 手術片 》 尚上記 に おい て抗体 3 の代 り に対照 と し て 使用
    [0179] θ¾ し し た 正常兎 ώ清の場合 は 、 す べ て 染色像 は認め ら れなかつ
    [0180] ( 3 ) 上記 （ 2 ) の試験で染色像が認め ら れた ヒ 卜 大腸 アデノ カ ルシ ノ ー マ （ 手術片 ） を検体 と し て 、 抗体一 1 を 使用 し 、 第一反応時に 0. 2 Μ 3 —ひ一 L—フ コ ピ ラ ノ シル一 《 — ラ ク 卜 ー ス 、 0. 2 Μラ ク 卜 ー ス 、 0. 2 Μフ コ ー ス又は l O mg/mS B S Aを存在させ 、 上記 （ 2 ) と同 様 に し て 試験 し た 。 その結果、 染色像 は 3 一 — a— L —フ コ ピ ラ ノ シルー ひ ー ラ ク 卜 ー ス に よ り 減弱さ れるが 、 ラ ク 卜 ー ス 、 フ コ ー ス及び B S Aで は染色像 に 変化は認め ら れ なかっ た 。
    [0181] 〈 抗体の特異性試験 I 〉
    [0182] 才 ― チテ ロ ニ イ （ O uchterlony) 二重拡散分析法に よ り 抗体一 1 〜抗体— 3の特異性を以下の通 り 調べた 。 即 ち 、 1 %寒天ゲル （ ◦ . 0 1 モル 卜 リ ス塩酸緩衝液 （ P H = 7. 6 ) 中 に 2 % 卜 リ 卜 ン X— 100、 0. 1 5 M - N a C e 、 フ エ二ルメ チルスルホ ニルフ ル才 ラ イ ド 5 0 g Zm2及び 0. 0 5 % N a N 3 を含む寒天ゲル ） を ス ラ イ ド グラス上に積層 し 、 そ の 中央 に抗体を置き 、 周辺に そ れ ぞれ 2 0 jw g の 、 3 — ひ一 L—フ コ ビ ラ ノ シル 一 ひ ー ラ ク 卜 ー ス ー P I P— B S A、 4 一 一 a— L—フ コ ピラ ノ シ ル ー ひ 一 ラ ク 卜 ー ス ー P I P— B S A、 6 一 一 ひ 一 し ー フ コ ピ ラ ノ シル一 ひ ー ラ ク 卜 一 ス ー P I P— B S A、 《—ラ
    [0183] CMPI
    [0184] V.'IPO ク 卜 — ス — P I P - B S A及び B S Aを含む水溶液を置き 拡散試験を行なっ た 。
    [0185] 果を第 1 図〜第 3図に示す。 第 1 図は抗体一 1 の拡散 状態を示す図であ り 、 第 2図 は抗体一 2の拡散状態を示す 図であ り 、 ま た第 3 図 は ίτι体一 3の拡散状態を示す図であ る 。 各図に おいて （ a ) は 3 一 一 ot— し ー フ コ ビラ ノ シル 一 ー ラク 卜 ー ス ー P I P一 B S A、 ( b ) は 4 ' - a - し一フ 3 ピ ラ ノ シルー a—ラ ク 卜 ー ス ー P I P - B S A ,
    [0186] ( c ) は 6 一 一.ひ — L — フ コ ビラ ノ シル - -ラ ク 卜 一ス 一 P I P一 B S A、 ( d ) は a—ラ ク 卜 ースー P I P - B
    [0187] S A及び （ e ) は B S Aをそれぞれ示す 。 各図 よ り次の こ とが判る 。 即ち 、 抗体— 1 は 、 3 — a 一 し一フ コ ピラ ノ シル - -ラ ク 卜 ー ス一 P I P - B S Aと は沈降鎳を形成 するが、 他の抗原 と は沈降線を形成 しない。 抗体一 2 は 、
    [0188] 4 " - - し ー フ =1 ピラ ノ シル — ー ラ ク 卜 ー ス — P I P 一 B S Aと は沈降線を形成するが 、 他の抗原 と は沈降線を 形成 しない o 体 — o は、 6 一 一 ひ 一 し ー フ =1 ビラ ノ シル 一 ー ラ ク 卜 ースー P I P一 B S A と は沈降綜を形成す る が 、 他の抗原と は沈降線を形成 しない 。 尚上 δ己試験におい て 、 体一 2 は前記抗体の製造例で得 ら れた も の " 1 πώ当 り
    [0189] 0 . 4 mgの B S Aを加えて 4で 、 一晩放置後遠心分離 し て 上清を探取 し 、 抗 B S A抗体を除去 し た後に 、 上記試験に 使用 した 。
    [0190] 、 . ,
    权利要求:
    Claims
    83/0431】 Γ(:Τ/.)Γ«3/()0169
    28 請 求 の 範 囲
    ① ひ 一 フ コ ビ ラ ノ シル一 （ 1 → 3 〉 ー 、 ー （ 1 → 4 ) — 又 は 一 （ Ί → 6 ) — ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を含有する 才 リ ゴ糖をハプテ ン と し 、 こ れをキ ャ リ アー 蛋 白 と 反応さ せて 糖抗原を得る こ と を特遨 と する フ コ ー ス抗原の製造 法。
    ② ハプテ ン と する オ リ ゴ糖が 3 一 一 ひ 一 L—フ コ ピ ラ ノ シル一 α—ラ ク 卜 ー ス 、 4 — α — L—フ コ ビ ラ ノ シル — α—ラ ク 卜 ー ス及び 6 ' - - し 一 フ コ ピラ ノ シル一 ひ — ラ ク 卜 一 ス か ら 選ばれる 請求の範固第 1 項 に記載の 力 法 。
    ③ ひ 一 フ コ ピ ラ ノ シル一 （ 1 → 3 ) ―、 一 ( 1 → 4 ) 一 又 は 一 （ Ί → 6 ) — ガ ラ ク 卜 ピ ラ ノ シル基を含有す る 才 リ ゴ糖 と キ ヤ リ ァ ー蛋 白 と の複合体か ら なる糖抗原を哺 乳動物 に 投与 し 、 生成す る抗体を採取す る こ と を特徴 と す る フ コ ー ス抗原を識別 す る抗体の製造法 。
    ④ 才 リ ゴ糖が 3 一 一 ひ一 L— フ コ ピ ラ ノ シル ー α —ラ ク 卜 一 ス 、 4 一 一 ひ 一 L—フ コ ピ ラ ノ シノレ一 α—ラ ク 卜 一 ス及び 6 一 一ひ 一 L—フ コ ビ ラ ノ シル一 ひ ー ラ ク 卜 ー ス か ら選 ばれる請求の範囲第 3項に 記載の方法 。
    ⑤ 3 ' — ひ 一 し ー フ コ ビ ラ ノ シル一 α—ラ ク 卜一ス を ィ ソ チ 才 シ ァネ ー 卜 カ ップ リ ング法 に よ り 牛 ώ 清 アルプ ミ ン に結合さ せ て 得 ら れる糖抗原を ゥ サギ に 投与 す る こ と
    .vot ii PCT/jr83/00169
    :9 か ら なる請求の範囲第 3項に 記載の方法 。
    ⑥ 4 ' 一 ひ 一 L 一 フ コ ピラ ノ シルー ひ 一 ラ ク 卜一スをィ
    ソ チ才シァネ ー 卜 カ ツプ リ ング法に よ り 牛血清アルブミ ン に結合させて得 ら れる糖抗原を ゥサギに投与する こ と か ら なる請求の範囲第 3 項に記載の方法。
    ⑦ 6 一 一 a — L 一 フ コ ピ ラ ノ シルー α — ラ ク 卜一スをィ
    ソ チ才シ ァネー 卜 カ ップ リ ング法に よ り 牛血清 アルプミ ン に結合さ せて得 ら れる糖抗原を ゥサギ に投与する こ と か ら なる請求の範囲第 3 項に 記載の方法。
    ⑧ 0： — フ コ ビ ラ ノ シル ー （ 1 → 3 ) — 、 一 （ 1 → 4 》 - 又 は 一 ( 1 → 6 ) 一 ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を特異的に認 識できる抗体を用 い 、 免疫反応に よ り ひ 一 フ コ ピ ラ ノ シ ル一 ( 1 → 3 ) 一 、 - ( 1 → 4 ) 一又 は — （ 1 → 6 ) — ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を有する癌関連糖鎖を測定する こ と を特徴 と する癌関連糖鎖の測定法。
    ⑨ 抗体が 0 — ひ 一 L — フ コ ピラ ノ シルー （ Ί 3 ) 一 0
    一 3 — D — ガラ ク 卜 ビラ ノ シル基、 0 — « — L — フ コ ピ ラ ノ シル ー （ 1 → 4 ) — 0 — 一 D — ガラ ク 卜 ピラノ シ ル基及び 0 — a — L — フ コ ピラ ノ シルー （ Ί → 6 ) - 0
    一 β — D — ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基から選ばれる基を ¾識 す るも のであ る請求の範囲第 8 項に記载の方法。
    ⑩ ひ — フ コ ビラ ノ シルー （ 1 → 3 ) ―、 - ( 1 → 4 ) 一
    又 は 一 ( 1 -→ 6 ) 一 ガ ラ ク 卜 ビ ラ ノ シル基を特異的 に 認 : Αひ κ Γ(;Τ/.|1·83/ϋϋ169
    3 Ο 識できる抗体を含有す る癌診断用 キ ッ 卜 。
    © 抗体が 0— ひ 一 L — フ コ ビ ラ ノ シル — （ 1 → 3 ) — 0
    - /5 — D— ガ ラ ク 卜 ビラ ノ シル基 、 0— α — し — フ コ ピ ラ ノ シル ー （ 1 → 4 ) — 0— /3 — D — ガラ ク 卜 ビ ラ ノ シ ル基及び 0— ひ 一 し ー フ コ ピラ ノ シル— （ 1 → 6 ) — 0 — β — D 一 ガ ラ ク ト ピラ ノ シル基か ら選ばれる基を認識 す るものであ る請求の範囲第 1 0項に 記載のキッ 卜 。
    ―― "： i'O 7V- 、
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    EP0111005A1|1984-06-20|
    CA1194793A1||
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1983-12-08| AK| Designated states|Designated state(s): US |
    1983-12-08| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): DE FR GB SE |
    1984-01-31| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1983901633 Country of ref document: EP |
    1984-06-20| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1983901633 Country of ref document: EP |
    1988-04-20| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1983901633 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP57095789A|JPH0337713B2|1982-06-03|1982-06-03||
    JP57/95789||1982-06-03||
    JP57095788A|JPH0477266B2|1982-06-03|1982-06-03||
    JP57/95788||1982-06-03||
    JP57/95787||1982-06-03||
    JP57095787A|JPH0477265B2|1982-06-03|1982-06-03||DE19833376360| DE3376360D1|1982-06-03|1983-05-28|Fucosyl antigens, a process for their preparation and antibodies for recognising them, a cancer diagnosing kit containing the fucosyl antigens and a method for determination of cancer associated carbohydrate linkages|
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