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    公开号:WO1983003946A1
    申请号:PCT/HU1983/000023
    申请日:1983-05-19
    公开日:1983-11-24
    发明作者:Gábor VIDA；István GYURJÁN；Anna Hafiek；László KASSAY
    申请人:Mezo^"Gazdasági És Élelmiszeripari Szervezo^" Váll；
    IPC主号:G01N27-00
    专利说明:
    Verfahren und Einrichtung zur genetischen Charakterisierung und Qualifizierung von Pflanzen, insbesondere von gezüchteten KulturpflanzensortenTechnisches Gebiet Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur genetischen Charakterisierung und Qualifizierung von Pflanzen, insbesondere von gezüchteten Kulturpflanzensortensowie eine Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Stand der TechnikZur Charakterisierung und Qualifizierung von gezüchteten Pflanzensorten verwenden die sich mit Veredelung der Pflanzen bzw. mit der Oualifizierung von Saatgut beschäftigenden Fachleute praktisch ausschliesslichmorfologische und zytologische Merkmale,die sortenspezifische Charakteristikder einzelnen Pflanzen bzw. deren Homogenität oder Vermischtheit (infolge einer fremden Bestäubung) wird also durch einen Vergleich der äusseren Erscheinungsformen bzw. des Chromosomenbestandesfestgestellt Eine Methode zur Analyse dieser Probleme auf dem Niveau der Gene und Enzyme war bisher nicht belcannt. Ein grundsätzlicher Nachteil der zur Zeit angewandten Methoden besteht darin, dass zur Anfertigung einer morfologischen oder zytologischen Charakterisierung zuerst der Samen der untersuchten Pflanze gesäet und die Pflanze bis zur Blütezeit bzw. zur Erntezeit aufgezogen werden muss, damit der Fachmann überhaupt irgendwelche Angaben gewinnen kann. Diese Methode ist ausserordentlich zeitaufwendig, nachdem sie eine volle Generationszeit (imallgemeinen ein Jahr) in Anspruch nimmt, und zwar möglichst bei optimalen agrotechnischen Bedingungen und die so gewonnenen Schlussfolgerungen und Parameter könnenauch unter diesen Umständen nur als annähernde Angaben betrachtet werden, wobei mit einer beträchtlicher Streuung gerechnet werden muss. Neben dem Zeitverlust besteht ein weiterer Nachteil der erläuterten Methode in dem bedeutenden Arbeits- und Kostenaufwand sowie darin, dass die Untersuchungsergebnissedurch die Züchtungsbedingungen stark beeinflusst werden. Neben den Gesagten soll auch der Nachteil erwähnt werden1 dass die ausserordentlich kleinen Chromosomen von bestimmten Pflanzensorten nur ein ganz enges Identifizierungsspektrum zulassen. Der Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie eine Einrichtung zur genetischen Cha rakteri-sierung und Oualifizierungvon Pflanzen, insbesondere von gezüchteten-lCulturpflanzensortenzu schaffen, die die Durchführung der Untersuchung jederzeit, in einigen Tagen oder in einer noch kürzeren Zeit ermöglichen, eine Methode also, die nicht an die Vegetationsperiode gebunden ist, die die kostspielige agrotechnische Vorbereitung und Pflege von Versuchsparzellen nicht benötigt und bei welcher die Züchtungsbedingungen die Untersuchungsergebnisse nicht beeinflussen, so dass man wesentlich eindeutigere und zuverlässigere Informationen erhält, als durch die früheren Methoden. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die gestellte Aufgabe durch die unmittelbare Genproduktanalysevon entsprechend vorbereiteten und behandelten Samen, Embryonen oder Keimpflanzen gelöst werden kann, wobei die gewonnenen Angaben bzw. die gezogenen Schlussfolgerungen jede mögliche Nebenwirkung ausschliessend eindeutig für den Genotyp und Fenotyp der untersuchten Sorte kenn-zeichnend sind.¯¯¯¯¯¯¯ Darstellung der Erfindung Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäss durch ein Verfahren gelöst, bei welchem dem untersuchten Pflanzenmuster, das vorzugsweise Samen, Embryo oder l < eimpflan-ze ist, eine zur Extrahierung von lösbaren Eiweissen geeignete, einen stabilen pH-Bereich gewährleistende, Antioxydante enthaltende Pufferlösung zugegeben wird, bei dem so behandelten Muster wird durch Homogenisierung in einer Reibschale und/oder durch Gefrier-Zerstörung eine Zellenaufschliessung durchgeführt, wonach die gelösten und ungelösten Komponenten durch gekühlteZentrifugierung voneinander getrennt werden, dann die die gelösten Eiweisse enthaltende flüssige Phase einer Gelelektroforesis ausgesetzt wird, wobei die gelösten Eiweisse nach der Grösse ihrer Ladung und ihres Molekulargewichtes in einem Gelfilter voneinander separiert werden, wonach die an bestimmten Stellen des Gelfilters erscheinenden Eiweisse durch enzymspezifische Farbe/n/ und gegebenfalls durch eiweissspezifische Farbe/n/ behandelt werden und die genetische Charakterisierung und oualifizierungdes untersuchten Pflanzenmusters aufgrund des erhaltenen farbigen Streifenmusters visuell durchgeführt wird. Falls das Pflanzenmuster eine aus Samen zum Keimengebrachte Keimpflanzeist, wird das Pflanzenmuster während des Keimvorgangeseiner geregelten Beleuchtung und Temperatur ausgesetzt, vorzugsweise in einem Fitotron. Die Einrichtung zur Durchführung des erfindungsgembssenVerfahrens besteht aus einem eine Pufferlösung dosierenden Apparat, einer Reibschale und/oder einer gefriertzerstörenden Pressvorrichtung, einer kühlbaren preparativen Zentrifuge sowie einer Gelelektroforesis-Anlagemit einem Gelfilter sowie mit einem stabilisierten elektrischen Speisegleichrichter.Diese Einrichtung ist notwendigerfalls mit einem Fitotron oder einer ähnlichen Anlage zur Regelung der Beleuchtung und der Temperatur ergänzt. Weitere Einzelheiten der Erfindung werden aufgrund der Zeichnung bzw. eines Ausführungsbeispiels ausführlicher erläutert. KurzeBeschreibung der Zeichnung Die einzige Figur der Zeichnung zeigt das Arbeitsschema des erfindungsgemässen Verfahrens. Bevorzugte Ausführungsbeispiele Wie es aus der Zeichnung ersichtlich ist, kann als Aus gangsmaterialfür die Pflanzen-Untersuchung der Samen 1, der Embryo 2 oder die aus dem Samen 1 in einem Keimge- fäss3 zum Keimen gebrachte und in einem Fitotron oder einer Züchtkammer 4 bei geregelter Temperatur durch Lichtröhren 5 geregelt beleuchtete eimpflanze6 der untersuchten Pflanze oder deren Sprosse (Blätter) 7 bzw. Wurzeln 8 der Keimpflanze6 verwendet werden. Die geregelte Temperatur bedeutet praktisch eine Zimmertemperatur von 25 + 2 00,während die Beleuchtung zweckmässigerweisemit Hilfe von rotes Licht ausstrahlenden Licht röhren 5 mit einer Lichtatärkevon 1000 bis 10 000 Lux erfolgt, vorzugsweise in aus 12 Stunden Beleuchtung und 12 Stunden Dunkelheit bestehenden Beleuchtungszylen.Das geprüfte Muster wird zwecks Zellenaufschliessung in einer Reibschale 9 bei 0 bis 5 oCdurch Zerreibung homogenisiert und/oder in einer Pressvorrichtung zwischen -40 und -100C,vorzugsweise bei -60 Or,bei einem Druck von 15 bis 35 MPa, vorzugsweise 27 MPa (der gegebenfalls durch einen Luftverdichter 12 erzeugt wird) gefriert zerstört. In der Pressvorrichtung 11 wird das geprüfte, durch Trockeneis gefrierte Muster im festen Zustand durch eine Öffnung von 2 mm ,unter hohem Druckhindurchgepresst, wobei die Zellen in der Weise zerstört werden, dass die zu untersuchenden Komponentendabei keineschädliche Wir kungerleiden. Unmittelbar vor der Zellenaufschliessung wird dem untersuchten Muster aus einem Pufferlösung dosierenden Apparat 10 eine zur Extrahierung der lösbaren Eiweisse geeignete und einen stabilen pH-Bereich - zweckmässigerweise zwischen 5 und 8 pH - gewährleistende, Antioxydante enthaltende Pufferlösung zugegeben. Nach der Zellenaufschliessung werden die lösbaren und unlösbaren Komponenten in einer kühlbaren preparativenZentrifuge 13 getrennt, zweckmässigerweisedurch eine 20 Minuten lang auf einer Temperatur von 0 bis 5 Cdurchgeführte Zentrifugierung. Die so erhaltene flüssige Phase wird einer Geleletroforesis-Anlage14 zugeführt, die aus einer einen Gelfilter enthaltenden Elektroforesiszelle 15 und einem stabilisierten elektrischen Speisegleichrichter 16 besteht. In der Gelelektroforesis-Anlage 14 werden die Eiweisse in Abhängigkeit vom gewählten Material des Gelfilters in einem elektrischen Kraftfeldnach der Grösse ihrer Ladung und ihres Moleltulargewich-tes voneinander separiert. Als Gelfilter wird im allgemeinen Polyacrylamid verwendet, aber zur Gelelektrofo kussierung,d.h. zur Trennung der Eiweisse nur nach der Grösse ihrer Ladung wird ein Gelfilter aus einem einen pH-Gradient erzeugenden Material eingesetzt. Die auf dem Gelfilter getrennten Eiweissgruppen, die in der Zeichnung mit der Nummer 17 bezeichnet sind, sind farblos. Um diese sichtbar zu machen bieten sich zwei Möglichkeiten: einerseits die Behandlung mit eiweissspezifischen Farben, was mit dem Bezugszeichen 19 symbolisiert ist und andererseits die mit dem Bezugszeichen 18 symbolisierte enzymspezifische Färbung. Die eiweissspezifi sche Färbung wird in erster Linie als Ergänzung der enzymspezifischen Färbung verwendet, zur Unterstützung oder Ergänzung der Ergebnisse der enzymspezifischen Färbung. Es sei erwähnt werden, dass sich mit kupferhaltigen Farben praktisch alle Eiweissgruppen färben lassen. Die Mehrzahl der Eiweisse hat eine enzymatische Funktion. Wenn diesen ihr natürliches oder künstliches Substrat zugegeben wird, üben sie ihre Aktivität auch sichtbar aus. Auf dieser Erscheinung beruht eigentlich die enzymspezifische Färbung. Die Enzymtätigkeit kann durch die Farbenreaktionen der Reaktionsprodukte an der entsprechenden Stelle des Enzymeiweisses im Gelfilter nachgewiesen werden. Ciegenetische Charakterisierung und Qualifizierung des geprüften Pflanzenmusters kann durch die visuelle Auswertung des entstandenen. farbigen Streifenmustersdurchgeführt werden. Die molekularen Eigenheiten der Eiweisse (Enzyme) sind mit den genetischen Eigenheiten des geprüften Pflanzenmusters in Korrelation.Die durch das e rfindungsgemässeVerfahren entstehenden farbigen Streifenmuster sind kennzeichnend sowohl für die Art als auch für die Sorte oder für die gezüchteten Hybriden. In den Hybriden kann die Anwesenheit des Genoms (d.h. die Gesamtheit der Gene einer gegebenen Pflanzenzelle) der sie bildenden Arten oder Sorten aufgrund der (von den Eltern schon bekannten) Streifenmuster nachgewiesen werden. Ein nicht einheitlicher genetischer Hintergrund zeigt sich in der Heterogenität der Eiweisskomponenten (d.h. in der Abweichung der Streifenmuster). Der Erbvorgang von vorteilhaften Eigenschaften kann durch die Anwesenheit von in bestimmter Weise bezeichneten Eiweissen (Enzymen), d.h. durch die Anwesenheit von auf diese Eiweisse typischen Streifen von Generation auf Generation nachgefolgt werden. Ahnliche rweise kann auch der genetische Hintergrund einer Sortendegeneration oder die genetische Reinheit von gezüchteten Hybridlinien nachgewiesen werden. Die Menge der zu prüfenden Muster kann beim erfindungsgemässen Verfahren das Mehrfache davon sein, als was bei der Analyse von in Versuchsparzellen aufgezogenen Pflanzen möglich war. Aufggund der Obengesagten ist die erfindungsgemässe Lösung äusserst geeignet für die Qualifizierung vom Saatgut und von pflanzlichen Vermehrungsmaterialien, nachdem sie kontinuierlich eine genaue und zuverlässige Information über den Genotypund Fenotyp der fraglichen Pflanze sowohl für den Vertreiber als auch für den Käuferdes Saatgutes zur Verfügung stellen kann. Zum Schluss soll ein praktisches Anwendungsbeispiel für das erfindungsgemässe Verfahren vorgestellt werden. Die Aufgabe besteht in der Feststellung der Sortenidentität eines hybriden -Sonnenblumen-Saatgutesbzw. die Einschätzung der Wahrscheinlichkeit einer illegitimen Be stäubungaufgrund einer Isoenzym-Untersuchung nach der Erfindung. Die Untersuchungen wurden aus trocl < enenSamen bzw. aus Keimpflanzenblätternausgehend durchgeführt, wobei das untersuchte Muster auf der schon beschriebenen Weise unter Zugabe einer Pufferlösung in einer Reibschale zerrieben und dann zentrifugiert wurde und die so gewonnenen Eiweissextraktionen einer Gelelektroforesis bzw. einer Gelelektrofokussierung unterworfen wurden. Dabei wurde 1.)die spezifische Färbung von Dehydrogenasen nach einer Gelelektroforesis, 2.) die spezifische Färbung von Dehydrogenasen nach einer Gelelektrofokussierung, und3.) die spezifische Färbung von Peroxydasen nach einer Gelelektroforesisdurchgeführt. Aufgrund der farbigen Streifenmusterwurde die Vergleichsauswertung zwischen den Elternlinien,den eindeutig isolier ten bzw. den fraglichen Hybriden sowie dem vorausgesetzten Bestäuberdurchgeführt. Aus dem Vergleich bzw. Auswertung der Streifenmuster konn te die folgende Schlussfolgerung gezogen werden:1.) Die sich aus der fremden Bestäubung ergebende Hetero genität beträgt 4,2 %.(ionder Norm ist die zulässige Heterogenität10 %. )2.) Der Isolationsabstand ist überflüssig gross und ein wesentlich geringer Abstand könnte auch noch eine befrie digende Reinheit des Saatgutes gewährleisten.
    权利要求:
    Claims
    Patentansprüche
    1. Verfahren zur genetischen Charakterisierung und Qualifizierung von Pflanzen, insbesondere von gezüchteten Kulturpflanzensorten,dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass dem untersuchten Pflanzenmuster eine zur Extrahierung von lösbaren Eiweissen geeignete, einen stabilen pH-Bereich gewährleistende, Antioxydante enthaltende Pufferlösung zugegeben wird, bei dem so behandelten Muster durch Homogenisierung in einer Reibschale und/oder durch Gefrier-Zerstörung eine Zellenaufschliessung durchgeführt wird, wonach die gelösten und ungelösten Komponentendurch gel < ühlteZentrifugierung voneinander getrennt werden, dann die die gelösten Eiweisseenthaltende flüssige Phase einer Gelelektroforesis ausgesetzt wird,
    wobei die gelösten Eiweisse nach der Grösse ihrer Ladung und ihres Molekulargewichtes in einem Gelfilter unter der Wirkung eines elektrischen Kraftfeldes voneinander separiert werden, wonach die an bestimmten Stellen des Gelfilters erscheinenden Eiweisse durch enzymspezifische Farbe/n/ und gegebenfalls durch eiweisaspezifischeFarbe/n/ behandelt werden und die genetische Charakterisierung und Qualifizierung des untersuchten Pflanzenmusters aufgrund des erhaltenen farbigen Streifenmusters visuell durchgeführt wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e 1 < e n n z e i c h n e t , dass als untersuchtes Pflanzenmuster Samen verwendet sind.
    3.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass als untersuchtes Pflanzenmuster pflanzlicher Embryo verwendet wird, 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e 1 < e n n z e i c h n e t , dass als untersuchtes Pflanzenmuster eine aus pflanzlichem Samen bei einer geregelten Beleuchtung und Temperatur zum Keimen gebrachte eim-pflanze oder deren Sprosse bzw. Wurzeln verwendet werden.
    5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die Samen auf Zimmertemperatur, unter Verwendung von rotes Licht ausstrahlenden Lichtröhren mit einer Lichtstärke von 1000 bis 10 000 lux und mit einem vorgegebenen Beleuchtungszyklus zum Keimen gebracht werden.
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch g e ke n n z e i c h n e t ,dass der pH-Bereich der Pufferlösung zwischen 5 und 8 pH eingestellt wird.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die Homogenisierung durch die Zerreibung des untersuchten Pflanzenmusters in einer Reibschale bei einer Temperatur von 0 bis 5 OCdurchgeführt wird.
    8. Verfahrennach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass die Gefrier-Zerstörung des untersuchten Pflanzenmusters auf einer Temperatur von -40 bis -100C,vorzugsweise auf -60C,und bei einem Druck von 15 bis 35 MPa, vorzugsweise bei 27 MPa in einer Pressvorrichtung durchgeführt wird.
    9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass nach der Zellenaufschliessung das durch die Pufferlösung behandelte Pflanzenmuster 20 Minuten lang bei einer Temperatur von 0 bis 5 C zentrifugiert wird.
    10, Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass während der Gelelektroforesis ein Gelfilter aus Polyacrylamid verwendet sind, 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch g e ke n n z e i c h n e t , dass während der Gelelektroforesis ein Gelfilter aus einem einen pH-Gradient erzeugenden Material verwendet wird.
    12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch g e I < e n n z e i c h n e t ,dass zur enzymspezifischen Färbung der Eiweisse den Eiweissen deren Aktivität zur Erscheinung bringende natürliche oder künstliche Substrate zugegeben werden.
    13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch g e< e n n z e i c h n e t , dass als eiweissspezifische Farbe kupferhaltigeFarben verwendet werden.
    14. Einrichtung zur genetischen Charakterisierung und Oualifizierung von Pflanzen, insbesondere von gezüchteten Kulturpflanzensorten, dadurch g e k e n n z e i c h n e t dass sie einen Pufferlösung dosierenden Apparat (10), eine Reibschale (9) und/oder eine gefriert zerstörende Pressvorrichtung (11), eine kühlbare preparative Zentrifuge (13) sowie eine Gelelektroforesis-Anlage (14) mit einem in einer Elektroforesiszelle (15) angeordneten Gelfilter sowie mit einem stabilisierten elektrischen Speisegleichrichter (15) aufweist.
    15. Einrichtung nach Anspruch 14, dadurch g e 1 < e n n z e i c h n e t , dass sie mit einem eine geregelte Temperatur und Beleuchtung gewährleistenden, mit Lichtröhren (5) regelbarer Wellenlänge und Lichtsttrkeausgerüsteten Fitotron (4) versehen ist.
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    引用文献:
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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