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    公开号:WO1983003763A1
    申请号:PCT/JP1983/000126
    申请日:1983-04-21
    公开日:1983-11-10
    发明作者:Masao Nambu
    申请人:Nippon Oil Company, Limited；
    IPC主号:C12N11-00
    专利说明:
    [0001] 钥 細 雩
    [0002] 白血病治療用^ -ァスバラギナ一ゼ固定化剤の製造法 ；
    [0003] 〔技 術 分 野〕
    [0004] 本発與は白血病治療用 -ァスパラギナーゼ固定化剤の製造法 に係 、 特に抗血栓柱と機械的強度に優れた高含永柱ケ'ル中に、 白血病治療闱餑素ァスパラギナーゼ（ -ァスパラギナーゼ、 L - asparaginase)を包埋（固定化）する、 白血病の酵素療法剤の 製造法に関する。
    [0005] 〔背 景 技 銜〕
    [0006] 白血病細胞の増殖にァスパラギンが不可欠（必須アミノ漦）で あることは古くから指摘されて 、 正常細胞に必ずしも必要で い (非必須）了ミノ漦であるァスバラギンを血液中から除去す る白血病の治療法は、 正常細胞 ¾損傷しな 白血病治療法として 期待され、 多くの研究努力が重ねられた（ I . T et al.f Bioe em. Biophys. Ess, Comnivn, , 12^ 50 (1963) ) 0正常細 胞に いては、 ァスパラギン合成餑素ァスパラギンシンセターゼ
    [0007] C Asparagine synthetase )によ！ 、 ァスパラギン漦塩またはそ のエステルからァスバラギン ¾·生成じうるため、 ァスバラギンを 必須アミノ漦として要求し いのに反し、 白血病細胞に^ては、 腫瘍化によ] 、'こ'のァスパラギン合成活拄を夂如しているため、 細胞内に けるァスバラギンの生成が不可能で、 血漿中にわずか に存在するァスパラギンを利用しつつ、 蛋白合成を行るう。 した がって、 この治療法の原理は、 ァスパラギナーゼを患.者の J&流へ 注入することによ 1 、 血液中のァスパラギンを分锊（ァスバラギ
    [0008] _0 ' PI ν'Ιίϋ ン夂乏状態を達成 ·維持）し、 白血病細胞を蛋白合成（増殖）不 能に:^とし入れることにある。
    [0009] 各種のァスパラギナ一ゼが、急柱リンパ住白血病を初めとする 若干種の白血病 よび固形 βに有用であることが確められてい る。 この治療法は、 正常弒飽に障害を与えること^:く、 白血病細 胞の増殖を狗制 C阻止 )する特異 、 きわめて好ましい治療理念 に基づくとして注目され（ E.M rqvardt , Ar^n vm ttelforsh. , IS^ 1380 C1 68) )、 更に、 主に大腸菌 ( Escherichia coli ) 起篛のァスパラギナーゼを用いる臨 試験が重ねられてきた ΟΒ· Η· Adams on ei al . t Cancer O emother. Bep. , (l) 521 617 (1968)) oその結果、 この酵素を単に人 に投与する場合、 異種 蛋白'である とに都乡惹起される抗原抗侔^ δ c 反応 ) i) 点として指摘され、 嘔吐、 気、 食欲不接、 発熱、 体重滅少、 肝 機能低下、 す 炎、 ヘモグロビン续少、 尿毒症、 フイブ!；ノーゲ ン渎少、 脳機能低下、 発瘆、 下痢、 ひょう疽、 貧血、 白血球渎少、 血小钣減少、 アナフィラキシー往ショック死、 頃痛、 血管痛、 m 祎不安定、 痙攣 ¾どの副作用が明らかにされたため（Ρ. Ιαδό^- re r, Fathol . Biol . Ci¾ri«), 17, 885 (1969) )、 この治療法 は、 正常造血雜跑への障害が少¾いものの、その実用価値は低い とされ、 ブレド ソン、 ビンクリスチン、 メ ト トレキサ一、 6 - メルカブトブリン、 シタラビン、 シクロホスフアミ ド¾どの ib^ 療法剤 よび故射籙照射療¾ との多種係用 '例か^試みられて いるにすぎず、 当初の期待を大きく裏 ·§}る結果を招 ている。 し かし、 この場合、 饭！)に、 この異種蛋白投与による免疫反 ίδを回 避する手段が提供されるならば、 この治療法に再び大き 期待の られることは十分予見されるところである。 この解^:策とし て、 血液を一時的に体外へ導き、 これを固定化ァスパラギナーゼ C酵素を結合または包埋した高分子材 )と接鲑させることによ 2 、 血液中の溶存ァスパラギンを固定化酵素によ] 分 し、 しかる後、 この血流.を体内へ戻す方式（体外循環方式） （ D* Samp s on etal " Trans. Am- Soc. Artif. Intern, Organs, 18, 54(1972)) が提案されて る。 この場合、 適切 ¾酵素固定化法を採ることに よ 、 異種蛋白（餑素）に因る免疫反応は大镉に整滅（または消 失 するが ( D. Sampson et al . t Trans. Am. Soc. Artif .
    [0010] Intern. Organs, 18, 54(1972))、 循環血液流と酵素固定化材 (高分子材）との接触による ¾現象が、 新たる難点として^ している（ H. E≠en, Arzneimforsk. , 21, 1671(1971) )。
    [0011] 公知の酵素固定化用高分子村はいずれも抗 栓性に乏しいため、 やむを得ず、 便法として、 へパリンなどの凝血阻止剤を血流へ添 加する方法が採られるが、 へバリン どの医薬を大量に長時間併 周すること自侔、 生理学上好ましくるい。 したがって、 ァスバラ ギナーゼを確実に固定化 ·保持すると'ともに、 その酵素に因る免 疫反 ίδを回避し、 しかも血液流と接鲑しても血拴を生じることの い新た ¾高分子材が望まれている。
    [0012] 本発明は上記の要望に応えうる抗血拴の餑素固定化用高分子材 を新たに提供する。
    [0013] 合成高分子または天然高分子を医^材科として用いる場合、 こ れらと血液との接蝕面に いて、 血拴または血液成分の沈着する 現象は、 人工弁、 Λ 血管、 人工腎朦、 カテーテル等の開発上、 克服すべき重要課題として古くから認讒され、 血液に対する異物 として挙動し難い材科、 すなわち、 血液被壊による血 成を来 it い材料を求める努力が続けられてき？ o
    [0014] 医用村料と血液との接餽面に ける凝血を防止するには、生体 - 内全域（循環血液）に凝血剤を含有させるに及ば いとの考えの もとに、 医甩材料の表面に徵量の抗 Mi剤 させる試みが多 案され、 例えば、 抗凝血剤（へパリン、 ヒルジン、 アンチト ロンビン）、 血小板凝集抑制剤（了デニールサイクラーゼ、 プロ スタグランジン^、 メチルキサンチン）、 線溶活性剤（ ゥロキナ ーゼ、 ストレブトキナーゼ） どを、 医用材料表面に塗布するか、 イオン結合性官能基を介し吸着させる方^:、 あるいは、 これらを 医用材料表面へ、 共有結合によ ] 固定化する手法が知られている c しかし、 この場合、 塗布、 吸着法に いては、 抗疑血剤等が脱離 し易く、 有効時間カ い'難点がある。 一方、 共有結合法に いて は、 化学反応を施すことに因る抗髮血剤の損傷をしばしば俘うほ か、 新たに共有結合性官能基を導入することによる生体への影饗 も懸念され、 しかも、 共有結合によ 固定された抗薆 J&剤の劫杲 を十分に期待 き ¾ ことから、 やは！ 有用な手法とは認められ ( if. T nz wa et aし, rans. Am. Soc. Artif. Inter ^ Organs 19, 188(1973) )。
    [0015] これらの難点を回避する方式として、 抗凝血剤を医用 料中に 混合、 包楚する試みがある ί JS. な wな et σί· , Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 19， 188(1973) )。 しかし、 化学
    [0016] ¾Ό 結合による固定化（捕捉）処理の施されていない抗凝血剤は、 短 期間内に流出（放出）し尽すことがしばしば指摘され、 '有効期間 としては 5〜8 ¾、 もしくは、 たかだか 5日程度とされ、 新たに、 抗血拴の優れた材料か められている。
    [0017] 本発明は、 機械的強度の優れたヒドロゲルから -る抗血栓性の 高い医用材料を初めて提供する。
    [0018] 本発明は、 特定の抗血栓性ヒドロゲルに、 ァスパラギナ一ゼを 包埕することによる抗血拴性の優れた固定化餑素剤の製造法を提 供する。
    [0019] 本発明は、 常法のよう 化学試薬または放射線による化学結合 操作を全く実施することるく、 したがって、 固定化対象とする i -ァスパラギナ一ゼ ¾:¾んら損傷すること く、 これを医用ヒ ド 口ゲル中に強固に包埋し、 その活性を発撣させうる固定化餑素剤 を提供する。
    [0020] 本発明は、 抗血栓性ヒ'ド口ゲル合成原料として、 ボリビニルァ ルコ ールを用いる。 もっとも、 ボリビ ルアルコールのゲル化法
    [0021] ( ヒドロゲル合成法）については、 既に多くの処法が提案されて いる。 しかし、 下記に要釣すると 、 ずれにも、 操作上また は生成物の性状に難がある。
    [0022] (1) ボリビ-ルアルコ ール永溶液を風乾することによ 2 、 湿潤皮 膜または乾燥皮膜^ #られるが、 これらは酎永性に劣！？、 水中 に ける劚直性を全く有しない軟弱 フィルムにすぎず、 限ら れた用途に用いられるにすぎるい（日本特公昭 40- 9523 ) o (2) ボリ ビ-ルアルコ一ルとテトラエチルシリケートを含む懸濁 永溶液に漦を加 乾する方法によっても、 やは] 、 上^ (1)と
    [0023] 同様の皮膜力 られるにすぎ 。 この場合、 懸i永 液に漦
    [0024] を加え、 凍結 *乾燥する提案もあるが、 生成する皮膜の強度は
    [0025] かえって低下し、 ほとんど成型不能である（日本特公昭 55 - 30358、 日本特公昭 55 - 11311 )o '
    [0026] (3) ボリビ-ルアルコール水溶液へ、 コパルト 60 (ァ線）を照
    [0027] 射するゲル化法が周知である。 しかしこの場合、 特珠 旌設
    [0028] (放射線照射旎設 )を不可欠とするうえ、 照射経費もかさみ、
    [0029] しかも得られるゲルが軟弱で、 しばしば他の硬化手段（ 2次的
    [0030] 硬化処理）を要する。 したがって、 この方法で得られるゲルは、
    [0031] Λ 竊子侔（限球內充てん液） どの、 高粘柱液（または軟質
    [0032] ゲル）力 まれる 珠用途 外には利^し雞ぃ（ · Material
    [0033] 1974, 1815,日本特開昭 50 - 55647 )o
    [0034] (4) ボリビニルアルコール永溶液へホゥ漦（またはホゥ酸^液）
    [0035] ある はホウ^ (またはホウ 水溶液） （注：ホウ砂 =四ホウ
    [0036] 酸ナト ウム十水和 ¾7 ) ¾加えると.、 即座にグル化することも
    [0037] 古くから著名である。 しかし、 得られるゲルは、 款弱で、 流勳
    [0038] 拄¾有し、 しかも単に指先でつま ことによ 直ちに千切れる
    [0039] ため、 成型後の彤態は保持され難い（ J. An Ckem. Soc" 60,
    [0040] 1045(1938)、フランス特許 743942(1933))0
    [0041] またこのホウ砂グルはアルカリ性雾 S気下では存在しうるが、
    [0042] 下では容易に崩壊する。 したがって医用 #科には利用 く、 価値に乏し 。
    [0043] (5) フエノー 、 ナフトール、 コンゴ一· レッ ド等のフエノール ' 、£
    [0044] G:,ri
    [0045] Ί70 ' 類またはアミノ化^、 あるいはチタン、 クロム、 ジルコニゥ ム等の金属化合物によるボリ ビニルアルコールのゲル'化法も多
    [0046] ^^案されているが、 いずれも上 §¾4)と同様の蕖点がある（日 本特公昭 4 0 - S 5 2 3、 日本特公昭 4 0 - 2 3 2 0 4 )。 (6) アルデヒ ド、 ジアルデヒ ド、 不麁和-ト リル、 ジイソシアナ —ト、 ト リメチロールメラミン、 ェビクロロヒ ドリ ンゝ ビス一 ( ヒ ドロキシェチル）スルホン、 ホ · {；アクリル酸、 ジメチ 口ール尿素、 無水マレイン酸等の架檬剤または共重合成分によ るボリ ビ-ルアルコールのゲル化も周知であるが、 いずれも化 学試菜を用いる操作を要するほか、 高含永性の強固 ¾ゲルは得 難い（ Te tile Res. J. t {3 189 (1962)、英国特許 7 42,9 0 0 C i 958 ) ) 0
    [0047] (7) ボリビ-ルアルコール永溶液を 4 0で以下、 特に 5〜： 1 8 C 下の低温に故置することによ] ゲル化させる手法も古くから 著名である。
    [0048] しかし、 室温付近に いて生成するゲルは寒天、 力ラグナン のようにもろく、 しかも、 これは単に漦しくかきまぜるか、 水 を加えてかきまぜるか、 あるいは 干¾めることによ] 溶解す のボリ ビ-： ^アルコール永溶液の故冷ダルを得るのに、 低 温が好まし ことも周知で、 例えば I 8 ：、 更には 0 Cあるい は 0 C«¾下の低温で実施する例も知られている（ ymeTム，
    [0049] しかし、 ずれにしても、 得られるグルは、 寒天、 カラゲナ ン、 ゼリー様の軟弱品（または粘液）であ] 、 漦し べトツキ (粘着 ）を示すうえ、 酎永性に乏しく、 永中では著しく膨滴 し、 更に軟化すると共に、 一部は水中に溶出し、 残部は糊拔と 化す。 また、 水中ある は 4 0〜5 O Cの温永中では、 更に迅 速に形くずれし、 永中に分散 ·溶释する ¾どの舞点を有し、 医 用材料としての価値を認め難い。
    [0050] {8) ボリビ-ルアルコールをホルマール化して得られるスポンジ
    [0051] 状生成物も古くから著名であるが、 生体内で ではなく、 分
    [0052] 、 変質に俘 、 有害作用を周囲に及ぽすため、 近年その用途 はきわめて限定されるに到っている J* IL iois, Plastic & Be constructive Surgery, 35, 51 (1965) J Q
    [0053] (9) ゲル化能を有する永溶性高分子、 例えばァガロース、 寒天、
    [0054] アルブミン、 アルギン酸塩、 カードラン、 カラダナン、 カゼィ ン、 CMC、 ファーセレラン、 ゼラチン、 メチルセルロース、 ベクチン、 瀑教、 タマリンドガム、 ザンタンガム、 トラガント ガム、 グァーガム等の永溶液へ少量のボリビニ^アルコールを 添加後、 これを放冷するか、 ケ'ル化剤含有浴（凝固浴）へ浸漬 するか、 あるいはこれを凍結 する手法も知られているが
    [0055] 日本特公昭 5 8 - 2 5 2 1 0 , 2 5 2 1 1 ) ^ このよう 手 法によっても、 やは] 軟弱で酎水性の乏しい粘液または非流動 Sゲル、 あるいはパサパサした水溶性の乾燥粉末（凍結 · 乾漦 粉） られるにすぎな 。
    [0056] 本発明者は、 ボリビュルアルコールを利用して、 接械的諸特 倥にすぐれた永不溶の抗血桎性高含永固定化薛素剤を、 安俪且つ
    [0057] C ？ I ' .：. 9 ； 安定に製造する方法を開発すベく検討した結果、 特定条件のもと に、 ボリビ-ルアルコールと酵素とを含む水溶液を一 1 よ 低い温度で冷却 ·固化 ·成型した後、 これを融解させること く, 部分的に真空脱水することによ] 、 含水率 4 5〜9 2wi多の高含 水性の、 酵素包埕ゲルが得られることを先に発見, (米国特許出 願第 3 4 4 0 0 6号）、 これをさらに展開さ^:発明を完成した。
    [0058] 本発明で得られるヒドロゲルはゲル化の遏程るらびにその前 ^理 工程に いて、 従来、 合成高分子水溶液のゲル化あるいは酵素の 固定化に常用されている漦、 アルカリ、 ラジカル篛、 放射鏢、 有 接溶媒、 反応試薬および永 外の無機溶媒 どを全く必要とせず、 従って L -ァスパラギナーゼを損傷することが い。 しかも本発 明で得られるゲルは、 含水率が高く、 ゴム状の彈柱と、 すぐれた 接械的強度をも兼備している。 また、 本発 §iのゲルは、 永または 温水に不溶で、 粘着性を示さず、 の点に いても、 前記のボリ ビュルアルコール永溶液の放冷ゲルとは全く異なる。するわち、 本発钥は、 来のボリビ-ルアルコール水溶液の故冷ゲル化、 あ るいは 来知られたボリビュルアルコール水溶液の化学的処理に よるゲル化 どに関する知見とは全く異なる新規抗血栓住ゲルを 用いる -ァスパラギナーゼ固定化剤の製造法を提供するもので
    [0059] ¾)る。
    [0060] 本発明は、 ボリビ-ルアルコールとァスバラギナーゼとを含む 水溶液から、 特定条件のもとに得られる冷却。固化体を融 させ ることるく、 これに部分的脱永処理を施すことによ]？、 抗血栓性 の優れた高含水グルが得られ、 しかも、 ァスパラギナーゼがこの
    [0061] く ひ ん .— 高含永ゲル中に包埕（捕捉）され、 ここへ血液を供給することに よ] 、 ゲル表面に血辁を生じることなく血流中のァスバラギンを 分薛 ·除去しうることを見いだした事実に基つ'く。
    [0062] 〔発 明 の 開 示〕
    [0063] 本発明は、 けん化度 9 7モル多以上、 粘度平均— 合度 1, 8 0 0 上のボリビ-ルアルコールを 以上含有し、 しかも、 ァス バラギン分解（加永分解）酵素としての ァスパラギナーゼ (ァスパラギナーゼ、 1/ -ァスパラギン アミ ドヒドロラーゼ（1/ - sjxtragine aviidohydrol se ) )を含む永溶液を、 任意^^:の 容器または成型 ¾誇型へ注入後、 これを一 1 5 Cよ 低い ¾度で 冷却 ·固化♦成型し、 しかる後、 この成型体を ®摂させること ¾ く、 脱水率（冷却 ·固化 ·成型体の重量減少率） 5 i 以上に到 達するまで、 部分的に脱永し、 必要に応じ水中に ¾»することに よ] 、 含水率 4 5〜9 2¾ ί多（湿潤体基準）に到達させることを 特铵とする抗血栓性の、 '白血病治療用固定化酵素剤の製造法にあ る G
    [0064] 〔発钥を実施するための最良の形態〕
    [0065] 本発明に用いるボリビュルアルコールのけん化度は、 9 7モル 多以上、 好ましくは 9 8モル 以上を要する。 けん化度 80〜88 モル 、 特に 8 5 ¾ル 下のボリビ ルアルコールを ても、 軟弱 ケ 'ル ^!られるにすぎず、 本発明の目的は違成されるい。 本発明に招 るボリビ-ルアルコールの重合度は、 1，8 G 0 上を要する。 重合度 3 0 0〜： 1,5 0 0未潢、 特に 1, 4 0 0议下では 钻穉液または軟弱ケ'ル^^成するにすぎ 。车¾¾に ては、 ：. . .· '— i . .
    [0066] 例えば重合度 1，8 0 0〜3.3 0 0程度のボリ ビニルアルコールが使 招できるが、 通常市販されている高重合度品（重合度 1,'8 0 0〜
    [0067] 2, 6 0 0 )をそのまま用いるのが良い。
    [0068] 本発明では、 まずボリビュルアルコール滠度 6« ί 以上の水溶 液を調合する。 したがって、 ボリビュルアルコー の饞度として は、 例えば 6〜2 5wi とすることができる。 この ¾度を更にた とえば 9 0 程度まで高めることもできるが、 常温に ける水溶 液の粘度が 1 0,0 0 0 c P以上にも達し、 また貯蔵中に粘度上昇あ るいはケ'ル化をきたすこともあ] 、 若干、.取扱い難い。 この震度 を例えぱ 5wi よ 低くすることもできるが、 後述の脱水所要時 間が長ひ :き、 経費 C脱水動力費）がかさむ。
    [0069] ¾ 、 この永溶液に、 好ましくは、 了スパラギナーゼ用の緩衝 液成分として、 公知の、 例ぇぱ3 ^ 7〜8.5の、 ト リス （ ヒ ドロ キシメチル）ァミノメタンまたはリ ン酸塩 ¾どを、 常法ど ] 添 加するのが良い o
    [0070] 本発钥に いては、 上記ボリビ-ルアルコール水溶液へ酵素を 添加するに先立ち、 必要に応じ、 ボリビュルアルコール永溶液を 狨茵する。 镔菌処理条件としては、 1001C X 5 で目的を達する 場合もあるが、 耐熱性菌に汚染されている場合は、 たとえば、 120TC X 1 5 〜'6 の高圧 ·蒸気钹菌を施す。 紫外線照射镔菌 法も使用できるが、 その有効性が照射表面に限られる とから、 前記の加熱滅菌法と併用するのが望まし 。 いずれにしても、 こ れらの処理によ] 、 本発明に用いる資材が変質することはなく、 本発 §§の実施に んら支障をきたさるい。 狻菌された永溶液は、 次に、 固定化対象とする酵素と混合され る。 酵素としては、 通常市販のェシェリチア 'コ》J B^EC - 2 型ァスパラギナーゼをそのまま用いることができる。 この他、 セ ラチ了 ·マルセセンス ( 5¾ττα·έΐな ma ;escetsリ系、 ブロテウス · ブルガリス（ Proteus vulgaris 、 パク亍リ ウム ·カデべリ ス ( Bacter nm cadaverts j系、 ェルビ-ァ ·ァロイデアェ
    [0071] ( Erw m rotde e )糸、 エルビニ了 *カロトボラ ET inia c rotovor )系さらにはモルモット血清系のァスパラギナーゼ を用 ることも差支え ¾ 。 これらのァスパラギナ一ゼは、 いず れも、 白血病に対する治療効果が既に報告されて ！？（ L. T. M shb m et l . f Bioc em. Bio-phys - Ees. CoTitnwn. , 12, 50 (1963) , Arch. Biochef Bio≠,ys.t 105, 450 (1964) , J. D. Broome, Nitwes 191, 1114 (1961), J. Β&φ. Med" 118 , 99, 121 (1963) )、本発明のヒドロダルへ包埋することによ！ 、 それらの免疫反応を抑え、 副作用を伴うこと く治療に役立てる ことができる。
    [0072] 前逮の、 白血病に有効る酵素として、 現在主に、 ェシエリチヤ ' コリ B系 EC - 2型が市販されて ! 、 凍結乾燥粉末ある は 50 グリ セリン水溶液の状態で入手することができ、 その す れをも、 本発明に用 る とができる。 この薛素を、 ボリビ-ル アルコール水溶液へ添那する操作は、 例えば 70 以下で実 す ることもできるが、 この餑素の熱劣化镇向に配慮し、 3 7C い し常温に て実 j|するの： ^良 。
    [0073] 餑素の添加量としては、 永溶液中のボリ ビ ルアルコ ールの 7 倍重量 下（酵素凍結乾燥粉末重量基箄表示）にとどめるのが、 酵素の大部分を固定化する観点から好ましく、 この場合、 後述の ゲル化工程を経ることによ 1 、 薛素の約 8 5¾;ί 以上を捕捉でき 本発明に いては、 ボリビュルアルコ ール自侔7 ^強力 ¾酵素保 護作用を有することを、 本発明者は確認して 、 したがって、 この他に、 酵素保護剤としてのグリセリン、 ァスパラギン酸、 ァ スパラギン酸塩、 カゼイン ¾どを特に必要としるいが、 2：れら公 知の保護剤を更に添加することも差支え 。
    [0074] 本発明に ては、 このようにして得られたボリビ-ルアルコ ールとァスパラギナ'ーゼの双方を含有する永溶液を、 任意形拔の 容器または所望の成型用铸型へ注入し、 冷却 ·固化 ·成型する。
    [0075] ここで成型 ffi篛型とは、 最終用途の形软のものが望ましいが、 後 に裁新等の変形処理を加えることを意図したうえの任意形状の篛 型でも良く、 これらも、 本発明の成型用篛型に包含される。
    [0076] 冷却，固化 ·成型 の冷却剤としては、 例えば、 余塩-氷（23 ： 7 7 ) ( — 2 1 C )、 塩化カルシウム-永（ 3 0 : 7 0 ) -5 5 C ) ¾どの寒剤、 あるいはドライアイ -メチルアルコール (一 7 2 C ) N 液体窒素（一 196TC ) ¾どを用い、 一 6でよ] 低 温 度に冷却し、 固化'成型する。 冷却が不十分であると、 後逑する 乾燥工程を経て得られるダルの形状が、 当初予期した形態すなわ ち、 ボリビュルアルコ ール永溶液注入容器または成型甩篛型の形 状と合致し難いほか、 ダルの檨核的強度に劣る。 液体 リゥムを 甩 れぱ、 — 2 S 9Cまで冷却できるが、 実用上はフレオン冷凍接
    [0077] ΟΙ.ίΡΙ
    [0078] / YV ir U を用い、 例えば一 3 以下に冷却するのが良 。 この冷却'固化 •成型を省略するときは、 永中に て剛直性を全く欠く、 単 る、 従来公知の酵素含有ボリビュルアルコ ールフィルムある は 軟弱ゲルが生成するにすぎず、 本発明の殍拄に富む 含水住の、 耐永性で抗血栓法のゴム 薛素剤（ ヒドロゲル） 得られる^
    [0079] 本発明による冷却 ·固化♦成型に ては、 ボリビュルアルコ —ル水溶液は任意の形状の篛型内で固化 ·成型され、 しかる後、 銬型に上面力パーまたは下面カバ一（あるいはその双方）がある 場合は、 それらの一方又は双方を取] はずし、 成型体の形 を保 持しつつ、 後述の脱永処理を施すことができる。 したがって、 本 発明のゲルの形抆 しては、 固定化餑素の反 ί5に好都合 ¾、 基質
    [0080] よび反応生成物の 散を考慮し、 任意の大きさと形抆を違定す ることができる。 好ましい成型体の形状としては、 既に化学工業 に いて、 蒸留塔またはガス吸驭塔などに用いられているラシヒ リング、 多孔 、 テラレット、 インターロック 'サドル、 ポール リングなどの成型 ffi篛型及び、 これらの充 物を収めるための充 損用カラム成型用篛型あるいは体外血液循環流路としてのパイブ 成型用鏡型 よることができる o また'米国特許 ffi願第 3 4 4 0 0 S 号に記載した突起を有する平板又は齒板^の籙型を用 ることも できる。 これらの 型用篛型を用 て得られる本発明の固定化餑 素剤（ケ'ル）は、 固定化餑素の活動に必要な基質との接餒、 質 移動の点 て優れ、 また、 体外循環血液流の圧力損失の低い 点に いても、単 る粒拔品、 寂牧品、 獏状品または锾細径の球 欤品 どに比し優れている。 もちろん粒拭品等も本発 ¾に含まれ
    [0081] C PI るし、 板状体を得て後に切断する等の方法も本発明に含まれる。
    [0082] 前述の冷却 ·固化 ·成型を目的とする冷却操作の冷却速'度として は、 0. 1〜 7 TC Z 程度の緩慢冷却でも差支えなく、 また、 7〜 1,000 C Z の急速冷却によることもできる。
    [0083] 本発明に ては、 前述の容器または篛型へ注久されたボリビ
    [0084] -ルアルコールと酵素との混合水溶液が冷却 ·固化されたことを 確認後、 これに真空脱水を施す。 この場合、 冷凍室から冷却 ·固 化 ·成型侔を取 ] 出し、 これを真空乾燥室へ移し、 直ちに吸引 · 脱永するならば、 永分の除去（昇華）に伴るい、 試料が冷却され るので、 特に外部冷却を施さ くとも、 固化 ·成型体が融解する ことは ¾い。 冷却 ·固化 ·成型 が融解し い程度に加熱するこ とは差支え く、 これによ] 脱水を促進することができる。つま 脱水工程の温度としては、 冷却 ·固化 ·成型侔を融解させ
    [0085] かぎ] 、 特に制限は く、 これがケ'ルの品位に特に影饗すること は い。 この脱水工程に いては、 脱水率を 5wi 以上とし、 た とえばゲルの含水率を 2 0〜9 2 、 好ましくは 6 0〜9 0wt ^>
    [0086] (湿潤体基犟）に到達させる。 含水率を 2 0多以下とすることも できるが、 この場合においても後述 るように、 永中に浸漬させ ることによ 含水率 5 G〜9 Owi に到達させることができる。
    [0087] 本発明に ては、 ポリビ ルアルコールの濃度のいかんにか かわらず、 冷却 ·固化 ·成型体に若干の脱永処理（真空乾燥）を 施す。 この場合、 脱永率（冷却 ·固化 ·成型侔の重量渎少率）と しては、 5wi多以上、 よ j 好ましくは 1 5w i 以上が採用される。
    [0088] す ¾わち、 脱水が進行するとともにダル強度が著しく高ま i 、 し
    [0089] O PI
    [0090] , VvirO かも非粘着性、 尉永性 ¾どの諸性 が著しく改善されることから、 この部分説水処理は本発明にと] 不可欠である。 もっとも、 本発 明に いては、 注射萘液の渌結乾燥あるいはコーヒー、 ミルク、 杲汁、 めん類等の含水食品の凍結乾燥に見られる十分なる脱永
    [0091] (乾燥）処理を行う必要はなく、 上述のとお の部分脱水処理に よ D、 十分本発明の目的が達成され、 上記のと 、 ^水が進行 するに伴いケ'ル強度が著しく高まることから、 所望のゲル強^に
    [0092] - ί5じ、 脱永量を選定することができる。
    [0093] いずれにしても、 この部分的脱水処理は本癸明に不可欠で、 き わめて重大'： 意義を有するため、 これを省略するとき、 本発明に 述べる非流動性、非粘着性、 かつ高含永性で、 しかも機械的強度 に優れる ¾j&拴性ヒドロゲルは決して得られる 。 また、 冷却 · 固化状態を維持すること く、 冷却 *固化 *成型体を融解後、 渎 圧脱永する方式によるときは、 泡立ちが漦しく、 ほとんど、 操作 続行不可能であるうえ、 たとえ長時間を費して脱永しても、 弾性 に乏し 白濁ゲル力 成する すぎ ¾ 。
    [0094] 本発明に ける真空脱水の真空度は冷却 ·固化永分が鋭永しう るものであればいずれでもよく、 たとえば、 1 0 if &下、 好 ましくは 以下、 さらに好ましくは 0.1 T3SJS ^以下が通常 招 られる。 *
    [0095] 本 明に ては、 次に、 冷却 ·固化 *成型 ·部分脱水侔を、 例えば常 ®:置し、 齄漭させることによ 、 弾性に富むグル^ られる。 ^度としては l〜3 CZs5の緩慢齄 、 または 3〜
    [0096] OO の急遠敏解のいずれによることも差支え ¾ 。 ボリ
    [0097] WHO ビ-ルアルコール永溶液を、 0〜3 0 C程度で放置（貯蔵）する 場合に得られるゲルの融点が 1 5〜2 9 C前後であるのに反し、 本発明のゲルの融点は 以上に及ぶため、 温水または温風に よる急速齄解も差支え ¾いが、 本発明のゲルも熱湯中では溶解す ること、 6 0 C以上では表面に硬質皮膜が急速に^生すること どから、 .高温融解は避け ¾ければならず、 4 0〜5 0 C以下て融 解させるのか" ましい。
    [0098] この融辯操作後、 容器または篛型の支持部から、 ゲルを容易に 取] はずすことができる。 これは弒菌氷または滅菌生理食塩水中 に いて吸水し、 1〜6 ¾で含永率 5 0〜9 2wi （湿潤体基準） に達するが、 お強固 弾柱体である。 本発明のゲルはこのよう に多量の水分を含むにかかわらず、 強固な彈性を示し、 堅く握] しめても、 一時的に変形するが、 直ちに元の形状に復し、 形くず れしる 。 また、 本発明の、 含水率 8 8多の板状ゲル上へ成人が 片足または両足によ 直立しても、 やは] —時的変形をきたすも のの、 直ちに元の形状に復し、 形くずれしるい。 高含水 と機械 的強度とは、 従来から医用高分子 TOを開発するうえで、 両立し 難い難題とされているが、 本発明のケルは、 上述の高含水性と強 度とを有し、 従来のボリビ-ルアルコール水溶液を風乾して得ら れる皮膜あるいは前途のボリビ ルアルコール水溶液を単に 0〜
    [0099] 3 0 C以下に貯蔵する場合に生成する水溶性ゲルとは全く異なる 新規ケ'ルである。 .
    [0100] 本発明のゲルに圧力を加えても、 含有水分の浸出はほとんど見 られず、 例えば、 含永率 9 0 έ多のゲルに 4 /^の圧 US力を
    [0101] CMFI 課しても浸出（流出）水量は、 含有永の 1〜2 にすぎ い。 こ のように、 多量の水分を強固に保持することからも明らかなと
    [0102] i？、 このケ'ルの見かけ比重は、 ほぼ水と同程度であ！ 、 永中で辛 うじて沈降するにすぎ い。
    [0103] 本発 のゲルには、 粘着性がない。板状 ( 8 s« 8爾 X 2 «s )、 円筒 .（内径 3 、 外径 6 «s、 長さ 6 ） 、 球状（直径 等 に成型したゲル約 1 0 を、 5 の滅菌水中で 4 0日間かきま ぜても、 相互付着、 形くずれ等の現象は全く認められ ¾い。 、 生理食塩水中に 1年間浸清したが、 溶解せず、 弾性 よび強度も 変ら い（これは、 例えばこんにゃくを数日間永道永に浸漬した 場合、 漦しい彩くずれが起るのと、 きわめて対照的である。 また、 ポリビ-ルアルコール永溶液の単なる放冷ダル (凍結ゲル )が著 し 粘着柱を示し、 しばしば流動性粘液状あるいは、 たかだかゼ
    [0104] リー、 ブリン、 寒天拔で、 しかも耐水性に乏しく、 水中で分散 · mmしゃすいのときわめて対照的である）。
    [0105] 本発明に いては、 ボリビニルアルコール水溶液の注入容器ま たは鏡型の形状を任意に選定し、 所望の形状（粒状、 膜牧、 塊 、 板状、 円筒拔その他任意形杖）の湿 ゲルとすることができる。
    [0106] 最終目的物の形 に合わせて成型してもよいし、 一且得た成型体 を切削等によ] 別の形に成型してもよ 。
    [0107] 本発钥のダルは多量の永を包埕し、 永または生理食塩永に 1〜
    [0108] 6時間浸漬することによ j 含水率 5 0〜9 2wi にまで容易に 到達する。 特に、 本発 §9に ける原科永溶液のボリビ-ルアルコ
    [0109] 一 ¾度を S〜 2 0w に違定して凍結 *成塱 ·部分銳永を旃し、
    [0110] 、Ί— VvI O ' 更に永または生理食塩永に浸漬して得られるゲルの含永率は 7 0 〜9 2ίϋέ にも及ぶ。 したがって、 本発明の高含水ゲルは、 前述 の優れた機械的強度を有するゴム状弾性体であるにもかかわらず、 化学的 ¾らびに生化学的には、 しばしば、 単 る氷（または生理 食塩永）同然の挙動を示し、 生侔との反応柱はき めて輊徴であ i？、 血液に対しても、 優れた 栓牲を示す。 す わち、 ガラス、 ナイ ロン、 ボリスチレン、 ポリエステル、 ボリエチレン、 ボリ ウ レタン； オーム等に いては血液はきわめて容易に凝固し、 テフ ロン、 シリ コーン、 ボリ ビ-ルビ口 リ ドン等に いても、 血液凝 固が起きるのに反し、 本発明の高含永ゲルは、 ボリビ-ルピロリ ドン、 シリコーン、 テフロン等に血栓形成が認められる条件のも とに いても、 :^:血栓注を示す。
    [0111] 徒来、 医用材料として注目されているヒド πゲル、 す わち、 ボリ （ 2 -ヒドロキシェチルメタクリレート）の含永率は通常 38 〜4 Owi多であ] 、 しかも機械的強度に劣る（ S. D. Bmck,
    [0112] Biomed. Mater. 7 , 389 (1973) ) D その含水率を 6 (Ησέ
    [0113] ^程度まで高めることも提案されたが、 含水率が向上するととも 接械的強度は更に低下する難点があ'る（ J. D. ndrade Ced^、 * Hydrogels for Medical and Related Appl cattons " p. 23
    [0114] 1976 ^ACS Syinp. Ssr. 。
    [0115] これに反し、 本発明に いては、 通常含永率 7 0〜9 2wt ^
    [0116] 更には 8 0〜9 2 i の高含永ゲルが容易に得られるうえ、 接械 的強度にも優れることから、 従来の非親水注および親水性、 含永 拄医屈材料のいずれにも勝る抗血 ¾性村料としての価値を有する。
    [0117] fO REA 一 ΟΜΠ 、 WiFO 本発明のゲル素材は、 ァスバラギン（分子量 132 )、 ァスバラ ギン漦（分子量 133 )、 永漦化アンモ-ゥム（分子量 3 5 .)、 ブ ドウ糖（分子量 180 )、 グリセリン（分子量 9 2 ) どの低分子 量物質を容易に透過せしめるのに反し、 分子量 1 0万程度の酵素 は、 ほとんど透過させず、 また、 分子量 3 0万程度以上の酵素は 全く透過させるい。 したがって、 本発明のゲル内に包埕された L
    [0118] -ァスパラギナーゼ（分子量 1 0〜1 7万）は、 ダル外へほとん ど漏 せず、 しかもゲル外部から、 血液中の 跑 よび高分子蛋 白質が、 餑素包埕部分の内部へ侵入し ため、 血流中の抗体
    [0119] ( リンパ球、 免疫グロブリン（分子量 1 6〜8 9万）、 、 異種 蛋白^:してのァスパラギナ一ゼと 0.1 以内に接近することに よ] ひき起こされる抗原抗体反応は回避される。
    [0120] もっとも、 本発明のゲルの生成後、 これを生理食塩永に浸漬す ることによ j？、 当初は、 ^の餑素が遊難される。 しかし、 その 後は、 たとえ長時間浸 » (または洗浄）を統けても、 もはや酵素 の遊難現象は認められず、 その後は、 異種蛋白遊籙を懸念するこ と く、 連続（または反復）便 Sできる。 上記の浸 Λ当初に遊籙 される餑素損失量は、 本発明のゲル生'成に先立ち便用された薛素 量の 1 0〜1 5 程度であるが、 本発明に いても、 既に公知の 餑素の遊離阻止処理を俘^することによ] 、 この餑素損失を回避 することができる。 するわち、 酵素の固定化（または包垣固^ ί匕） にあた 、 多少とも餑素が遊 ΪΙするのを抑制すること ¾どを 的 として、 固定化餑素剤をグルタルアルデヒド永溶液に浸 »する^ 理法が、 しばしば採用されるが（ T. M. S. Chang, Bizyms, 14.
    [0121] O FI 95 ( 1972 ) , G. Brovn et な ）、 この周知処法を、 本発明に いて得られる固定化酵素剤へ適 ffiすることによ！)、 前記酵素遊離 損失量は著しく低下し、 もとの薛素使用量の 1〜2 にまで改善 される。 ^のグルタルアルデヒド水溶液への浸漬操作は、 この永 溶液の滅菌作用に基づき、 固定化酵素剤の消毒を ¾ねうることか らも、 本発明のダルにと] 好ましい。
    [0122] 本発明のヒド πゲルは、 生体組緣と直接接触した場合の生侔組 織との間の反応が見られ い点に て、 生体への有害性のきわ めて少 ¾ぃ林料である。すなわち、 本発明のヒドロゲル（ 1 X 1 X 1 ^ ) ¾：, 例えば家ゥサギの背皮下に 1〜3力月埕植後、 解剖 した場合、 このゲルは生体組鐵に われて密着し、 カブセル状 と化しているが、 この生体組織を切開すると、 ダルの周囲全面が 一様に薄膜によ！ われて ] 、 この薄膜の一部にメスを入れ、 この皮膜を容易に剝離することができる。 この皮膜及びその他生 体組織に、 細胞浸潤はほとんど認められず、 炎症反応は欠如して いる。 このように、 本発明のヒド グルの生体適合性の優れるこ とから、 旧来の、 遊離ァスパラギナーゼを腹腔内へ（ intmpe- Htmeal ly ) 投与する治療法（ J. G. Kidd, J. cp. Μ&ά
    [0123] 98 , 565, 582 (1953) )に替え、 本発明のァスパラギナーゼ包埋 固定化酵素剤を腹腔内に留置することもできる。
    [0124] 既に述べたと IK 本発明のヒドロゲルは、 優れた抗血辁性を 示す高含水ダルであることから、 血液の体外循環回路を構成する 固定化薛素剤として用いることもできる。 もっとも、 本発钥のヒ ドロゲルは、 のように優れた抗血拴性を示すが、 かに高含水 ゲルと言えども、 永または生理食塩水と完全に同一の挙動を保証 するものではる 。 材料の含水率を高めることが抗血 ¾性の向上 に寄与するとの思考に不合理は ¾いが、 医用材料（するわち構造 物）を前提とするかぎ] (接械的強度を確保する必要上:）含水率 を無制限に高めることは不可能である。 本発 のヒドロゲルは、 従来提案されたボリビニルアルコール · ダルタルアルデヒド系ぁ るいはボリ （ 2 -ヒドロキシェチルメタクリ レート ）系のヒドロ ケ'ルの含水率上限値（ 6 0〜 8 0 ） E. W. Merrill et al. t ACS Polymer Preprint , 13^ 513 (1972))を、 はるかに超える ことができるが、 更に含永率 9 2ι ^多を超えると、 やは] 、 ケ'ル の機械的強度低下につ がる。
    [0125] 本発明のダルの含永率を 4 5〜 9 2wi多にとどめ、 しかも更に 十分 抗血栓倥を長期間にわた! 確保する目的から、 本発明に ては、 本発 §9のゲル内へ抗血拴剤（凝血阻止剤 )を包垣させる ことができる。
    [0126] この ¾ J0L检剤としては、 へパリン Cへパリン漦、 へパリンナト ゥム、 ンカリ ゥム、 ンカルシゥム、 ンマダ ネシゥム）が有効である。本発明の抗血拴柱高含永ゲルに、 上記 抗血桎剤を包埕し、 その抗血栓性を更に確実に、 長期間にわた] 確保するには、 前述の、 本発明の原料永溶液、 す わち、 ボリビ -ルアルコールと餑素を含む永溶液へ、 へバ lj ン粉末、 へバリン 永溶液、 へパリン懸镉永溶液の ずれかを添加 ·浸：合する操^を 実旎する。 この場合、 へバリン錢袞としては 1 0¾^ 以下に違定 することができる。へパリンを更に多量添加し、 永溶液中に一部 懸濁させることももちろ 支え いが、 本発明のヒドロゲルに 包埕されたへパリ ンは、 短期間内に流失すること く、 '長期にわ た] 包埋 '狳放されるため、 特に大量のへパリンをボリビニルァ ルコール永溶液へ添加することは通常必要で い。
    [0127] 本発明に いては、 かくして得られるボリビュルアルコール * 酵素 *へパリンの永溶液に、 前述の冷却 '固化 ·成型 ·部分脱水 処理を施すことによ ？、 水溶液中のへパリ ンの 9 9 以上をグル 内に均一に分散'包埕させることができる。 これは前述したと
    [0128] U、 好ましくは、 公知のグルタルアルデヒド処理を施した後、 渎 菌永または滅菌済み生理食塩水に 1〜ら k浸漬することによ]？、 含水率 5 0〜9 2w t多の、 ^吸水状態に近い湿潤ゲルとして、 その形状を安定化させたのち用 ることができる。 もっとも、 こ の浸漬操作中に、 ヒ ドロゲルからへパリ ンがわずか がら流出す
    [0129] るが、 その損失量は、 通常、 全包埋量の 0.5〜1多程度にすぎず、 本発明のヒドロダルの抗血栓性は、 これによ j 左右されるもので
    [0130] はない。 例えば、 ボリビ-ルアルコール水溶液にへバリンナト リ ゥムを 多溶解後、 本発明の処法を適用して得られるゲル 5 f
    [0131] (全表面積 5 0 ^ ,へバリン包埕量： , 8 0 0単位（ 3 0 ） 1
    [0132] を 5 の生理食塩永に 6 h浸漬した場合、 へパリンの流失 失） は約 0， 6多で、'その後、 少るくとも 2 8日間、 生 内の血液流に
    [0133] 接しても、 、 ヒドロゲル表面にへパリンが存在する。 ボリビ
    [0134] -ルアルコールのアルデヒ ド架橋ゲル等に包埕されたへパリ ンは
    [0135] 通常 5〜8 、 もしくはたかだか 5日程 Kで全量流岀することか
    [0136] ら、 本発^に ける包垣へパリ ンの長期徐放効杲は特異であ 、 WIPO V 医用 料としてきわめて好ましいことが明らかである。本発明の ゲルは、 任意形牧の戚型品として容易に得られ、 例えば g径 2〜 6 s»の、 ヒド ηグル♦ノくィブまたはへバリン包垣ヒドロゲル · ζ イブを製作し、 血液の侔外循環流路とすることができる。 現用の ボリエステルまたはテフ口ン製の人工血管では れも血栓形成 が漦しく、 直径 5 以下の細動脈代替には難があるほか、 血液流 速の小さ 静脤部には適甩し難いが、 本発钥のヒドロゲル ·パイ ブまたはへバリン包垣ヒド口グル ·バィブは、 直径 2〜 5 の流 路、 にお ても、 少¾くとも 4週間にわた])血栓を生じず、 この 間に、 本発明のヒ ドロゲルパイブまたはへパリン包埕ヒドロゲル
    [0137] •パイブの全表面にわた 、 生体組铙（蛋白質）が薄く密着し、 生体適合性が十分に達成される。
    [0138] 本発钥に いては、 単 、 公知の後 ¾理に用いるグルタルアル デヒド未反応分の洗淨 ·除去に留意するかぎ 、本 ¾ のヒドロ ダル (またはへバリン包埕ヒド Πグル )の有害物随伴を懸念する 必要が ¾ 。 従来の代表的抗血 材としてのポリウレタン 'ジメ チルシロキサンが、 常に、 テトラヒ ドロフラン、 ジォキサン、 薛 酸等を隨俘する危険を俘い、 しかも、 Tきわめて容易に^菌室内の ほこ] を吸着するため、 通常の手術室とは異 る特殊る清淨室に お て取扱わねば ¾ら のに反し、 本発明のヒドロゲル及びへ パリン包迤ヒドロゲルの取扱 は容易で る。
    [0139] 本発^ て、 ボリビュルアルコールの永溶液を冷却 ·固化 '成型'部分脱永することによ ] 、 従来公知のボリビニルアルコ —ル系ダルとは全く具 る、 機玆的強度の優れた拜注に富む抗血
    [0140] REA
    [0141] O PI - . 」 o
    [0142] 栓性高含水ヒドロゲルの得られる理由は明らかで いが、 冷却 · 固化'成型 らびに、 これに続く部分的脱永処理時に、 'ボリビ- ルアルコ ールの分子内;^よび分子間にきわめて多数の水素結合が 形成され、 特に、 部分脱永時に、 グル組織の結晶化度が高ま] 、
    [0143] 5 機械的強度と弾拄の向上をきたすことに因ると推察される。
    [0144] いずれにしても、 この種の抗虛栓柱の、 ボリ ビニルアルコール の冷却 ·固化 ·部分脱永による固定化酵素剤及びその製法は、 本 発明者が初めて見いだしたものである。 ·，
    [0145] 本発明の固定化酵素剤は、 リンパ性白血病、 骨髓性白血病、 特
    [0146] 10 に急性リンパ性白血病に寛薛率が高いが、 急性骨髄性白血病、 m 性被毛上皮腫 どの、 従来の遊離ァスパラギナ一ゼ投与効杲の認 められた各種白血病（または白血病類檨疾患、 黒色腫 どの固形 腫瘍）へ適用できる。本発明の固定化酵素剤に いては、 前記の ように免疫反応が回避される 7tめ、 副作用を懸念すること く、 15 これを用 て寛辫の導入'、 更には寛解の維持 ·強化に努めること ができる。
    [0147] 本発明の固定化酵素剤は、 3 7 Cの血流中に いて、 1週間程 度違続使用されることによ！ 、 そのゲスパラギン分解活性は当初 の 8 0〜 9 0 へ低下し、 また 1力月程度の連続使用によ] 、 活
    [0148] 20 性力浮減することから、 症秋の回復状況によっては、 固定化酵素 剤の更新を要する場合もあるが、 高懾 薛素を多量に（例えば佯 重 5 0 あた] 1万単位、 約 7 日：、 しかも 4〜2 8日間 の長期にわた 、 違日または隔日に反復点滴静注（使い捨て）す る従来法に比し、 固定化酵素剤を血流と接 させたまま長時間敖 置しうる本発明の方式が、 操作上るらびに轻済性の点 て^ れている。
    [0149] また、 この餑素剤は、 製造後 0〜1 G Cに保存するかぎ] 、 約
    [0150] 6力月安定で、 この間の活性低下は i 0 以下であることから、 取扱いも比較的容易である。 -:'
    [0151] 次に実 例に基づき、 本発 §§を説钥する。
    [0152] 実旌例 - 1.
    [0153] 市販ボリビ-ルアルコール（けん化度 99.4モル 、 粘度平均 重合度 2,600、 4多水溶液の粘度（ 20 C ) 66cP )の粉末
    [0154] 3 8 ^ (含永率 8.5¾ί多 ）を、 ρ丑 8のトリス（ヒ ドロキシメ チル）ァミノメタン ·塩酸（ 50τηΜ- 0.2 TOM)水溶液 201 に 溶解して、 1 3 i 永溶液とし、 これに、 高圧水蒸気钹茵処理
    [0155] ( 120CX25 ）を施す o この永溶 25 へ、 1 -了スパラ ギナ一ゼ（市厥品、 50多グリセリン永溶液、 290¾aii/^)O 溶液 6.6 を室 に て混合することによ] 、 ボリ ビュルアル コール 1 Qv>t<^、 グリセリン（市展品餑素溶液の溶媒） 1 Qwt^、 酵素 0· 0 の永溶液 i HS を得た。
    [0156] 内径 1OT、 外径 3 、 長さ 1 »の イブ成型用篛型を、 高圧水 蒸気铰菌後、 上記のボリビ-ルアルコール . ァスパラギナーゼ永 溶液 を法入し、 一 4 で 4 冷却する。 しかる後、 篛型 の上面力パーを取] はずし、 冷却 ·固化 ·成型体を ¾薛させるこ となく、 ら hの真空銳:^を施す。 次に真空を孩 ] 、 成型 Cパィ ブ拔ケ 'ル）を取] 出し、 齄 させたところ、 5.3 （鋭永率 15 wt^、含液率 8 Swi p、 、 内径 外径 2.7 のパイブを得 f O PI た。 とれを、 Ϊ グル^ルアルデヒ ド水溶液に、 室温に いて 15 、 更に 5 C いて 1晚浸漬後、 食塩 0. 9wi を含む p if 7. 5 のトリス（ヒ ドロキシメチル）ァミノメタン-塩漦（ 4 7 ττ Μ - G.3 w ^i )水溶液 3 C弒菌済み）による浣淨操作を 1 0回反 復し、 5.7 （含液率 8 9wi ）のヒドロゲル 'パイブを得た。
    [0157] ¾ 、 上記洗 液には 当初、 多量のアルデヒ ドとこん跡量の蛋 白質が検出されたが、 洗浄操作終了時の洗液には、 これらのいず れも検出され い。
    [0158] あらかじめブロビレンォキシド ·ガスによる弒茵（室温 X 1 0
    [0159] %：)を施し、 しかる後、 残留ガスを真空脱気したボリエチレン製 バッグへ 前記ヒ ドロゲル 'パイブを収め、 密封する。
    [0160] 体重 6 のビーグル犬の右後肢の大腿部動脈と、 左後肢大腿部 赘脈に設けた体外シャント間に、 前記ボリエチレン製バッグから 取] 出したァスパラギナ一ゼ包 パイブを接続し、 自然血流 CL5G
    [0161] ）のもとに放置したところ、 動脈血流中のァスパラギン ¾ 度は、 当初の 3 J6 475i )w)から、 4 後 0.5 / ( 6. 6
    [0162] ： pjm へ低下し、 5 後には、 もはや検出され いまで（ Ipjm 以下） 漠少した。
    [0163] 実施例 2.
    [0164] 実旌例 1と同様 操作によ] 得たァスパラギナーゼ包埕パイブ の新片（長さ 7 ^ )に 5 Zedの 張 j 荷重を課したが、 切新さ れ¾い とを知った。
    [0165] 同じく断片（長さ 4 ^， 0.2 5 f ：)を切] 開いて得られる薄板 に 4 :の荷重を謀したが、 永分浸岀による重量泜下は 2 に
    [0166] CMFI O すさ った o
    [0167] 同じく新片（長さ 9 )を、 ィヌ（体重 7 の頸静脈に挿入 する。 す わち、 ラボナール静脈麻粋と揷管謂節呼吸のもとに、 無菌的に頸静脈を露出させて外膜を剝離し、 1 キシロカインを s 滴下後、 血管綏軸方向に 5 «切開するとともに、 切開部の中枢側
    [0168] とま梢^にそれぞれ、 一時的に糸をかけ、 血流を逡断する。直ち に、 静脈内腔を渎菌済生理食塩永を用 て洗浄し、 しかる後、 血 管内膜を傷つけ いよぅ資意しつつ、 上記パイブ新片（ リング） を末梢僩に揷入し、 次 で、 これを中枢側に^、 切開籙とリン0 グ中央部の位置とが合致するよう調整後、 エチレンォキシドによ
    [0169] る钹茵を したカツトグ一ト（ cdiffut ,直径 0. 1 8 »s.) ¾用いて 切開線を縫合し、 血流を再開するとともに、 リング挿入中央部に
    [0170] いて結紮した。 2週間を経て、 上記の部分を再び切開した結果、 Vング全面に薄皮が認められるものの、 血铨は認められるかった。
    [0171] 5 シリ コーンゴム製リングとテフロン製リングについても同様に、 体重 7〜 1 5 ¾のィヌを S 比較検討したが、 2週間後には ¾に、 いずれも著しい血 ¾を生じ、 血管はほとんど ¾拔態に達するこ とから、 本発明の酵素包 ¾ヒ ド πグ の ¾J0L拴 の優れて るこ とを知った。
    [0172] S 比敦 ii 1. '
    [0173] 実旌^ 11のボリビュル了ルコ一ルとァスノ ラギナーゼを含む永 灘 3 0 を、 6 X S eの底面の角彭容器へ注ぎ、 常温で 2日間 放置した結果 ^色透明の敦弱 »膜を得た。 この膜を永道永
    [0174] 浸¾したが、 k中に一薄溶 するうえ、 膜自侔粘着 ¾を示 οι.ί ι_ -。 To実施例 1の場合のよう ゴム^グルは全く生成し 。
    [0175] す わち、 ボリビュルアルコ ールと薛素を含む永溶液'を単に乾 燥させても、 本発明のゴム^高含水性餑素含有ゲルは得られ ¾ぃ。 比較例 2.
    [0176] 実施例 1のボリビュルアルコ ールのかわ] に、 ん化度 7 8, 5 モル 、 粘度平均重合度 1, 8 0 0、 4 永溶液の粘度（ 2 0 ） 36 cPの市扱ボリビュルアルコールを用い、 同様に操作した。 冷 却'固化 ·成型'脱氷体 5.7 f (脱永率 1 ( oi多 )を得たが、 融 . 解後は 5 に いても軟弱化し、 少量のゲル層のほかに、 多量の ボリビニルアルコール浸厚永溶液が層分離するのを認めた。
    [0177] す ¾わち、 けん化度の低いボリビュルアルコ ールを甩 ても、 本発明の酎永性酵素包埕ケ'ルは得られる 。
    [0178] 比較例 3.
    [0179] 実旎例 1のボリビュルアルコ ールのかわ！)に、 けん化度 9 9.2 モル多、 粘度平均重合度 500、 4 水溶液の粘度（ 2 0 C ) 5.6 <; J3の TfJ販ボリビ-ルアルコ ールを用い、 同様に操作したが、 寒 天に似たもろいゲル 5. 7 f (脱永率 1 Owi ；)が得られたにすぎ ず、 ほとんど弾性は認められ いこと'を知った。
    [0180] す ¾おち、 重合度の低 ボリど-ルアルコ ールを用いても、 本 発 の機械的強度の優れたゴム状の、 酵素含有弾性ゲルは得られ い。
    [0181] 比較夠 4.
    [0182] 実 に いて、 ポリビュルアルコ ール -酵素の永溶液を一 4 0 Cに て 6 A冷却'固化.成型後、 常温に て 3 放置 した。 ¾祜¾ -任グル ^ jlが生腐したが、 汪に乏しく、 引張 ]3強度としては、 わずかに 0. 3 Z ^で既に切新された。 ま た、 このゲル 1 を永 に浸 ¾したところ、 約 2 0 で形くず れし、 永層は濁 ]5、 ボリビ ルアルコールがかる] 溶 したこと を知った。 - このよう 、 たとえ、 ボリビ-ルアルコール *酵素の永溶液に 冷却 ·固化 ·成型を施しても融解後、 強度が低く酎永控の乏し 粘着倥ゲルが得られるにすぎず、 本発明に従い、 冷却 *固化'成 型後、 齄辯させずに部分脱永する操作を施さ ¾ かぎ 1 本発钥 に述べる強度の高い] I†永 Sの餑素包埕ケ 'ルは生成し 。
    [0183] 実施例 1で得られるヒドロゲルパイブ（長さ l )を 4 OTごと - に切新し、 それらにつき、 セリ シン（ seWci»：)溶出処理済みの 編み絹糸（ JIS M. 1 ，直径 0. 1 « , 120C X 3 0 钹茵済 )、 カグ トダート（ c ί^ίί , 腸線、 直径 0. 1 8 as、 エチレンォキシ ド 茵済）、 デキソン糸（ボリダリ コール蒙糸、 直径 0. 1 8 «、
    [0184] 120 X 3 0 該菌済） ¾らびに ta.per cut針を使招して、 たが いに物合し、 糸間陽 1. 5： ^として縫合試験を行う。
    [0185] ずれの種類の籙合糸の場合にも、 '本¾ ^の餑素含有ヒドログ ルバイブは容易に縫合され、 錢目に ける 損 く生じるかつ たことから、 生体血管への.後合にも、 十分 えうると見 ¾された。 またこのヒドロゲルパイブについて実 饲 2と同様の抗血卷注 試験を行 ¾つた結 発生はほとんど見られなかつた。
    [0186] 実^例 3.
    [0187] 市 ボリビニルアルコール Cけん化変 7モル ，轱変平均重
    [0188] C FI 合度 1,800、 4 水溶液の粘度（ 20 C ) 28cJ° )の粉末 86
    [0189] (含水率 7wi多）を、 piT7.5のトリス緩衝液 914fに溶解し、 8.Qwi^とした。
    [0190] この水溶液 41 を、 実施例 1に準じ弒菌し、 この永溶液へ、
    [0191] L -ァスパラギナーゼ（凍結乾燥粉末 lyo≠ylize!d powder 250 wiit 82¾¥を、 33 Cに いて混合した。底面 7 X 7 の 角形ボリエチレン製容器へ、 上記水溶液 40 ^を注入し、 一 50 Cで 6 冷却する。 しかる後、 これを 解させる^と ¾く、 6 h の真空脱水を施す o 次に真空を破 、 成型体（厚さ約 7»)を取 ])出し、 ^解したところ、 33 （脱永率 1 8wi多、 含水率 90 wt^の白色不透明ゲルを得た。
    [0192] このヒ.ドロゲルから、 20i«X 13 «X 5 «の断片を切取] 、 生体内埋入試験試料とする。
    [0193] 家兎（体重 2.5 ¾ )の背部皮膚を剃毛し、 ク 口へキシジンの 0.5 ェテ ア コール溶液を塗布し、 さらに.70 ェチルアル コールを用 そ消毒後、 皮膚を約 L 5 切開し、 ェチルアルコー ルによる消毒を施した上記試験試料を埕入 、 皮虜を鐽合した。
    [0194] この場合、 皮膚切開線が埋入試料上に位置し いよう留意した。
    [0195] 24 後の所見としては、 皮膚 とわずか 腫腸を認め、
    [0196] 試料を皮虜面上かち指触すると、 試料は、 皮下組織の剝離部分を 移動する。 3日後、 腫腸と発赤は消失し、 6日後抜糸した。 8日 後、 試料は既に固定され、 指蝕しても移動しない。 その後 1力月 間、 埋入局所に変化 く、 全身にわた i ¾んらの症状.も焦い。 30 日後、 皮下組緣をも含めて、 試料を摘出したが、 試料は袪包組織
    [0197] OMPI WIPO一 に包まれて 、 稆互間の癒着は認められ ¾ が、 密着抆態を呈 していた。 この被包組緣を 1 0 56ホルマリ ン処理（固定）後、 ッ エロィジンに包埋し、 へマトキシリン、 ェォジン重染色とワンギ 一ソン氏染色を実施して観察したところ、 偽好酸球と円形化組緣 球が少数認められるものの、 細胞浸潤はきわめて軽度で、 炎症反 応はほとんど欠如している。
    [0198] —方、 縫合糸として用いた c fl^i の周囲には、 抜糸後も強度 の異畅性組綠反応が認められた。 また、 比較のため前記と同様の
    [0199] 2 O ffl» 1 3 asX 5 «の海綿を、 同様に家兎背部皮下に埋入した 場合、 ¾ ^と腫腸の消失に 1 4日を要し、 1力月後の摘出所見に よれば、海綿の寸法が 1 0 程度滅少して ] 、 海綿周辺部に強 度の細胞浸潤と多数の異物性巨細胞を認め、 膿瘍化している。 メ チルメタクリレート樹脂についても、 同様に比較試験したが、 発 赤と腫腸の消失に 1週間を要し、 偽好酸球の浸潤も著しい。す わち、 本発明のヒドロゲルのほうが生体適合性の点に いて、 は るかに優れることを知った。
    [0200] 実施例 4.
    [0201] 実施飼 3で得たヒドロゲルの切断片 1 3 X 1 3 X 1.5 «を、 室 瘟に いて 2w グルタルアルデヒド水溶液へ 1 5 « 更に
    [0202] に いて 8 浸漬 ¾ p iT 7. 5のトリス緩衝液 1 0 による洗淨を
    [0203] 1 0回反復することによ] 、 生体 SA試験片を作成した。家兎
    [0204] (体重 2.5 K )の膝関節内側を縦方向に 3 切開し、 四頭股筋の 内側を縦切して膝蓋骨を外僩へ脱臼させ、 膝関節を屈 ®させて関 節前部の脂肪組籙を切除し、 交叉靱帯を切断後、 後関節蓑以外の
    [0205] OMPI WIFO 関節蓑 よび半月板を切除する。 次に、 大腿骨関節軟骨を削除し、 この軟骨に代えて、 上記試料を大腿骨関節面に挿入 ·固定後、 膝 闋節 150度屈曲位に いて、 大腿上部から足部までギプス包帯を 施し、 3週間後にこれを除いた。 この時点に いて、 関節には軽 度の腫腸を認めるが発赤局所熱感は無く、 一次性癒合も良好で、 分泌液は見られず、 膝関節は約 120 曲位をと 2 保護 ¾ίϊを 示す。他動的可動範囲は 1 5 0〜9 0° であった。組緣標本につき、 ホルマリン固定パラフィン包埋、 へマトキシリン、 ェォジン染色、 マロリ一染色を施し鏡検の結果、 大腿骨造形関節面は結合組緣に よ] 被覆されてお 1 、 揷入試料による反応住骨質増殖と骨髄腔内 炎症性反応はいずれも認められ ¾い。
    [0206] 一方、 同じく 1· 5 β»の厚みのメチルメタクリレート樹脂につき、 同様の比較試験を実施したところ、 3週間後の所見として、 関節 に腫腸のほか、 局所熱感を認め、 膝盖上部に波動を触知した。 ギ ブス包帯除去後の膝関節^:は、 他動的にわずか 9可動性を認める が、 自動的にはほとんど関節運勦が認められ ¾い。 また、 大腿骨 関節面には、 炎症性細胞浸潤と線維性癥«Μ纔とが認められた。
    [0207] すなわち、 これらの.所見から、 本発明の酵素含有ヒドロゲルは生 体適合性の良 ことカ^ il明した。
    [0208] 実施例 5. '
    [0209] 実施例 に いて得たヒ ドロゲルの切新片 1 3 X 1 3 X 1. 5 » 8枚を、 同様にダルタルアルデヒ ド^ S後、 淨した。 6 C 3丑 EDリンパ肉腫細胞（ J' G. dd, · Εχρ· Mfid. , 98, 565, 582 (1953), J. D. Brooms , J, Bcp. Med. , 118, 99, 121 (1963) )
    [0210] Οί·ίΡΙ
    [0211] ~ -r 600,000個を、 肋骨下方の足の付け根の剃毛部に皮下注射して
    [0212] 水胞を形成させたマウスの腹腔内へ上記切新片 8枚を埋植したと
    [0213] ころ、 30日を経ても、 肉腫は、 肉眼によ 認めえず、 触診の結
    [0214] 杲も、 んら異常を認めなかった。 この間、 血漿中のァスバラギ
    [0215] ン癀度は、 当初の 30 M( 400p3 )から、 翌日には (L2w
    [0216] Jlf( 33)jw»)へ低下し、 その後も、 この状態が持続した。
    [0217] 比較例 5.
    [0218] 実施例 5に て 63 C EDVンパ肉腫細跑を皮下注射した
    [0219] マウスの腹腔内へ、 単るる生理食塩水（ sa n* )2 を注射した
    [0220] ところ、 7'日後、 皮下注射部の皮膚に、 直径 2〜 3 «の丘抆隆起
    [0221] したリンパ肉腫（ twm wr )が見られた。即ち、 上記実
    [0222] 施例におけるァスパラギナーゼの腫疡 ^阻止劫果が明白である。
    [0223] 比較例 6.
    [0224] 比較例 5に ける生理食塩水の代] に、 ァスパラギナーゼ粉末
    [0225] を溶解し: ^理食塩水（酵素 2 « 500 vnit Tsl ) 2 を、
    [0226] 同様に腹腔内へ注射したところ、 11日後に、 リンパ肉腫（直径
    [0227] 3«ι)が^した 0
    [0228] とのように、遊離のァスパラギナーゼを投与しても、 ""^にそ
    [0229] の有効持続期 の短いことは既に指摘されると 1 で、 この異種
    [0230] 蛋白力性体内の蛋&質分解酵素の攻擎を受け、 比較的早期に消镔
    [0231] するためと考えられてお 、 したがって、 通常、 多量のァスパラ
    [0232] ギナーゼを、 6あごとに、 ある は隔日に反復投与する試みが採
    [0233] られ - Mts bum et l.t Biochem. JBiofhys . Res. Commr vn, , 12， 50 (1963), R* H. Mamson et al.r Cancer Oie ther.
    [0234] 、 i¾p. , (l) 52, 617 (1968))、 これによ！ 、 しばしば漦しい副作用 を招く。 これに対し、 実施例 5に述べた本発明の固定化'酵素剤の 持続有効性が明白である。
    [0235] 実施例 6.
    [0236] 下顎部に 3 0 X 3 0 »«の浮腫を有し、 食欲不提、' 扁桃腺肥大、 軟口蓋の肥大と炎症などの症状を呈するビーグル犬（メス， 5歳、 6 ）が、 生体細胞検査によ 、 リンパ腫と された。
    [0237] 実施例 5の方法によ 得られたァスパラギナーゼ固定化ヒドロゲ ル新片 8枚を、 このィヌの腹腔へ埕入した。翌日、 ィヌの食欲が 回復し、 2'日後には、 リンバ瘤は軟化し、 しかも 3 X 3 ssに縮小 し顕徵鏡観察によ 、 退化リンパ芽細胞が観察された。 更に 2日 後には、 リンパ瘤は消失し、 5 0日後も異常を認めるかった。
    [0238] 実施例 7.
    [0239] 下顎下方に 3 0 X 3 5 の表在性リンパ肉腫を有し、 食欲不提 と昏睡拔態にある 6歳のィヌ .オ : 2. 9 4 ¾ )のリンパ瘤を生体 細胞検査し、 リンパ肉腫症 診新さ^れた。
    [0240] 実施例 5の方法によ 1 得られたァスパラギナーゼ固定化ヒ ドロ ダル切断片 8枚を、 このィヌの Jgj^埋植したところ、 2.日後に 食欲は回復し、 触診によ] 、 リンパ瘤の軟化が確認された。
    [0241] 更に 2日後、'リンパ瘤は 2 X 2 anへ縮小し、 ィヌの様態は好転 した。
    [0242] 更に、 2日後、 リンパ瘤はほぽ消失し、 生体細胞検査によ 、 皮質（ coriea ) には多数の壊死部分と有糸分裂状状態の未分化 リンパ芽細胞島が見られた。 お 3日後には、 リンパ芽細胞が検 出され いまでに回復した。
    [0243] 実施例 8.
    [0244] ひかがみ popliteal )部に 4 0 x 3 5 «の表在拄リンバ瘤を 有し、 しばしば嘔吐を反復し、 リンパ節瘤炎症、 脾肥大、 扁栊腺 肥大、 陰囊浮腫を示す 5歳のシェパード犬（ 3.4 K )に、 嘔 阻 止の目的でアトロビンを投与後、 その腹腔へ、 実旌例 5の方法に よ 得られるァスパラギナーゼ固定化ヒドロゲル断片 8枚を埋植 した結果、 3日後、 ィヌの食欲と体力は回復し、 リンバ瘤は 2 X 2 «まで綜小し、 脾肥大と扁桃腺肥大も著しく輊渎され、 «の 浮腫は 失した。血清尿酸と血中尿素窒素分、 赤血球数、 白 数はいずれも異常なく、 更に 3日後にリンパ癀も消失した。
    权利要求:
    Claims

    〔請 求 の 範 囲〕
    1, けん化度 9 7モル 以上、 粘度平均重合度 1, 8 0 0以上のボ
    リ ビ -ルアルコールを 6wi 以上含み、 しかも、 白血病治療用
    ァスパラギナーゼを含む水溶液を、 任意形状の容器または成型 用鴒型へ注入し、 とれを一 1 5 Cよ 低い温度で冷却 *固化 · 成型した後、 この成型体を、 融解させることるく、 脱水率 5wi
    多以上に到達するまで、 部分的に脱水し、 しかる後、 含水率 45 〜 9 2w に到達させることを特徵とする白血病治療用 I -ァ
    スパラギナーゼ固定化剤の製造法。
    2. 水溶 にへパリ ンを することを特徴とする請求の範囲第
    I項に記載の方法。
    3. 水溶液中のボリビ-ルアルコールの漫度が 6〜2 5wi多であ
    ることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の方法。
    4. 冷却 ·固化 ·成型温度が一 3 5 C以下であることを特徵とす
    る請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の方法。
    5. 部分脱永における脱永率が 1 5wi 上であることを特徵と
    する請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれ に記載の方法。
    6， 部分脱水が真空乾燥によって行 ¾われることを特徵とする請
    求の範囲第 1,項〜第 5項のいずれかに記載の方法。
    7. 部分脱永の後 ^得られたゲルを永に浸漬することを特徵とす
    る請求の範园第 1項〜第 6項のいずれかに記載の方法。
    C:.'FI wiro .
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    US4617271A|1986-10-14|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1983-11-10| AK| Designated states|Designated state(s): CH NL US |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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