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    公开号:WO1981002294A1
    申请号:PCT/CH1981/000014
    申请日:1981-02-06
    公开日:1981-08-20
    发明作者:L Svendsen
    申请人:Pentapharm Ag；L Svendsen；
    IPC主号:C07K5-00
    专利说明:
    [0001] Tripeptidderivate und deren Verwendung zur Bestimmung von Enzymen
    [0002] Technisches Gebiet Die vorliegende Erfindung betrifft Tripeptidderivate, die von gewisäen Enzymen der Enzymklasse 3.4.21., insbesondere Faktor Xa, sehr leicht gespalten werden. Die neuen Tripeptidderivate werden deshalb als Substrate zur quantitativen Bestimmung der genannten Enzyme, besonders Faktor Xa, verwendet.
    [0003] Zugrundeliegender Stand der Technik Der Faktor Xa ist ein proteolytisches Enzym, das in der Blutgerinnungskaskade durch Aktivierung des Proenzyms Faktor X entsteht und zusammen mit Phospholipid und Calciumionen den Faktor II (Prothrombin) an zwei Stellen der Peptidkette proteolytisch spaltet und in Faktor Ha (Thrombin) überführt, welcher letztlich die Gerinnung bewirkt. Bei gewissen pathologischen Zuständen, z.B. bei Leberkrankheiten, Vitaminmangel, usw., und bei der Dicumarol-Therapie ist die Bildung des Faktors X herabgesetzt. Selbstverständlich ist bei erblichen Störungen der Synthese des Faktors X auch die Bildung des Faktors Xa entsprechend vermindert. Es ist deshalb wichtig, über eine direkte enzymatische Bestimmungsmethode zu verfügen, welche es erlaubt, Faktor Xa auf einfache und genaue Weise photometrisch im Blutplasma zu bestimmen. Die wichtigsten Methoden zur Bestimmung von Faktor Xa sind die folgenden: a) Biologische Bestimmungsmethode (siehe "Thrombosis and Bleeding Disorders", Nils U. Bang, Georg Thieme Verlag, S. 196 (1971 ): Faktor X wird mittels Gift der Russel-Viper und Calciumionen zu Faktor Xa aktiviert. In einer einstufigen Operation wird Prothrombin in Gegenwart von Faktor V und Phospholipiden durch Faktor Xa zu Thrombin aktiviert, welches Indikatorfibrinogen in Fibrin überführt. Es wird die Gerinnungszeit gemessen. Die benötigten Faktoren II und V und Fibrinogen werden mittels eines Substrats, das frei von Faktor X ist, zugeführt. Die Gerinnungszeit wird durch den Aktivierungsgrad des Faktors X beeinflusst. Der Aktivierungsgrad ist unter sonst gleichbleibenden Bedingungen eine Funktion der Konzentration an Faktor X in der Probe. Diese biologische Methode erlaubt nur eine grobe Bestimmung, weil die Gerinnungszeit durch den Experimentator subjektiv abgelesen wird. Ueberdies benötigt man ein manipuliertes Plasma, bei dessen Herstellung Fehler auftreten können. Ferner wird das als Indikator wirkende Fibrinogen nicht direkt, sondern über das aktivierte Thrombin gebildet (indirekte Methode). b) Biochemische Methode (siehe "Thrombosis and Bleeding Disorders", Nils U. Bang, Georg Thieme Verlag, S. 196/7 [1971]): Wenn die zu untersuchenden Faktor-X-Präparate genügend rein sind, kann man eine genauere Bestimmungsmethode anwenden. Esnouf und Williams (1962) haben nachgewiesen, dass Faktor Xa eine Esteraseaktivität aufweist und synthetische Aminosäureester spaltet. Für diese Bestimmung sind jedoch 50 bis 100 μg Faktor X erforderlich. Man kann allerdings noch niedrigere Konzentrationen an Faktor Xa bestimmen, wenn man Carhobenzoxy-phenylalanin-p-nitrophenylester verwendet und die pro Zeiteinheit freigesetzte Menge p-Nitrophenol misst. Diese BeStimmungsmethode ist mit den folgenden Nachteilen behaftet: Der verwendete Ester unterliegt bei dem verwendeten pH 8 einer Selbsthydrolyse und ist im übrigen nicht spezi fisch für Fakt or Xa , da er auch auf viele andere Enzyme anspricht . Der Ester ist in Wasser unlöslich , so dass man gezwungen ist , Aceton zu verwenden . Alle die se Nachteile führen dazu , dass die B estimmungsmethode ungenau und aufwendig ist . c) In der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 25 52 570 sind Tetrapeptidderivate beschrieben, die als Substrate zur Bestimmung des Faktors Xa verwendet werden sollen. Als Beispiel ist das Tetrapeptidderivat Bz-IleGlu-Gly-Arg-pNA.HCl offenbart, das durch Faktor Xa unter Bildung von p-Nitroanilin gespalten wird. Die Bildung des p-Nitroanilins kann spektrophotometrisch verfolgt werden. Diese Bestimmungsmethode für Faktor Xa ist bereits genauer als die oben beschriebenen biologischen und biochemischen Bestimmungsmethoden.
    [0004] Die in der DE-OS Nr. 25 52 570 beschriebenen Tetrapeptidderivate sind in wässrigen Medien nicht genügend löslich, um die Bestimmung des Faktors Xa bei Substratsättigung durchführen zu können. Wenn man extrem niedrige Konzentrationen an Faktor Xa bestimmen muss, z.B. in pathologischem Plasma, so ist die Empfindlichkeit der genannten Tetrapeptidderivate nicht genügend, um vernünftig genaue Messwerte zu erzielen. Wollte man die zu messende Menge an Faktor Xa durch Zugabe von zusätzlichem Plasma erhöhen, so würde unter dem Einfluss der Plasmaproteine eine Ausfällung des Tetrapeptidsubstrates stattfinden, wodurch die Enzymbestimmung verunmδglicht würde.
    [0005] Offenbarung der Erfindung
    [0006] Es wurden nun neue Tripeptidderivate gefunden, die in wässrigen Medien sehr gut löslich sind und gegenüber Faktor Xa eine erstaunlich hohe Empfindlichkeit aufweisen. Die erfindungsgemässen Tripeptidderivate entsprechen der allgemeinen Formel
    [0007]
    in welcher
    [0008] R1 eine gegebenenfalls in ω -Stellung eine Aminogruppe tragende Alkanoylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Phenylalkanoylgruppe, die 2 bis 4 Kohlenstoffatome im Alkanoyl enthält und deren Phenylrest gegebenenfalls in p-Stellung mit einer Aminogruppe substituiert ist, eine gegebenenfalls in 4-Stellung mit einem Aminomethylrest substituierte Cyclohexylcarbonylgruppe, eine gegebenenfalls in o- oder p-Stellung mit Methyl, Amino oder Halogen, z.B. Cl oder Br, substituierte Benzoylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen in der Alkoxygruppe, eine gegebenenfalls in p-Stellung mit Methoxy, Methyl oder Chlor substituierte Benzyloxycarbonylgruppe, eine Alkansulfonylgruppe mit 1 bis 4 KohlenStoffatomen, eine gegebenenfalls in p-Stellung methylierte Phenylsulfonylgruppe oder eine α- oder ß-Naphthylsulfonylgruppe darstellt, R2 einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, Kohlenstoffatomen, einen Hydroxyalkylrest mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, einen Alkoxyalkylrest mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen im Alkyl und 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkoxy, einen Benzyloxyalkylrest mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen im Alkyl, einen ω -Carboxyalkyl- oder ω-Alkoxycarbonylalkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkyl, wobei die Alkoxygruppe geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, oder einω -Benzyloxycarbonylalkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkyl, oder einen Cyclohexyl-, Cyclohexylmethyl-, 4-Hydroxycyclohexylmethyl-, Phenyl-, Benzyl-, 4-Hydroxybenzyl- oder Imidazolyl-(4)-methylrest darstellt, R3 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, R4 Wasserstoff oder einen Methyl- oder Aethylrest darstellt und R5 eine mit aromatischen oder heterocyclischen Resten substituierte Aminogruppe, welche hydrolytisch unter Bildung einer farbigen oder fluoreszierenden Verbindüng H - R5 abspaltbar ist, darstellt.
    [0009] Die stark basische Guanidinogruppe des Arginins ist vorzugsweise stabilisiert, z.B. durch Protonisierung mit einer Mineralsäure, wie HC1, HBr, H2S04 oder H3PO4, oder einer organischen Säure, wie Ameisen-, Essig-, Propion-, Milch-, Zitronen-, Oxal-, Wein-, Benzoe-, Phthal-, Trichloressig- oder Trifluoressigsäure. Die Art der Protonisierung hat auf die Spaltbarkeit, d.h. die Empfindlichkeit (Suszeptibilität), des Tripeptidsubstrates gegenüber den Enzymen überhaupt keinen Einfluss. Die in der allgemeinen Formel I mit R5 bezeichnete abspaltbare chromogene Gruppe kann z.B. eine p-Nitrophenyl-amino-, l-Carboxy-2-nitro-phenyl-(5)-amino-, l-Sulfo-2-nitrophenyl-(5)-amino-, ß-Naphthylamino-, 4-Methoxy-ß-naphthylamino-, 5-Nitro-α-naphthylamino-, Chinonyl-(5)-amino-, 8-Nitro-chinonyl-(5)-amino-, 4-Methyl-cumaryl-(7)-amino- oder 1 ,3-Di(methoxycarbonyl) -phenyl-(5)-amino-Gruppe (abgeleitet von 5-Amino-isophthalsäure-dimethylester) sein.
    [0010] Die Tripeptidderivate der Formel I können nach den im folgenden beschriebenen an sich bekannten Methoden hergestellt werden: 1) Die chromogene Gruppe R5 wird an die Carboxygruppe des C-terminalen Arginins angehängt, wobei dessen α-Aminogruppe durch eine Schutzgruppe, z.B. eine Carbobenzoxy- oder tert. -Butoxycarbonylgruppe, und die δ-Guanidylgruppe des Arginins durch Protonisierung, z.B. mit HC1, Nitrierung oder Tosylierung geschützt werden. Die C-terminale Gruppe R5 - dient während des stufenweisen Aufbaus der Peptidkette ebenfalls als Schutzgruppe. Die anderen
    [0011] Schutzgruppen können je nach Bedarf selektiv abgespalten werden, um die .weiteren Aminosäurederivate anzuknüpfen, bis die gewünschte Peptidkette vollständig aufgebaut ist.
    [0012] Zum Schluss können die verbleibenden Schutzgruppen voll ständig abgespalten werden, ohne dass die Gruppe R5 - in Mitleidenschaft gezogen wird (siehe z.B. Miklos Bodansky et al., "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, S. 163-165, 1966).
    [0013] 2) Zuerst wird die Peptidkette (nach Bodansky, loc.cit.) aufgebaut, wobei jedoch die C-terminale Carboxylgruppe des Arginins mit einer üblichen Estergruppe, z.B. einer Methoxy-, Aethoxy- oder Benzylpxygruppe, geschützt wird. Die Estergruppen können durch alkalische Hydrolyse abgespalten werden, mit Ausnahme der tert.-Butoxygruppe, die selektiv mittels Trifluoressigsaure abgespalten werden muss. Falls die δ-Guanidylgruppe des Arginins protonisiert ist, wird die genannte Estergruppe mittels Trypsin abgespalten, wobei keine Racemisierung eintritt. Hierauf wird die chromogene Gruppe R5 - angeknüpf V/enn die δ-Guanidinogruppe des Arginins durch eine Nitrooder Tosylgruppe und die N-terminale α-Aminogruppe des Tripeptidderivates durch eine Carbobenzoxygruppe oder eine p-Methyl-, p-Methoxy- oder p-Chlor-benzyloxycarbonylgruppe oder eine tert.-Butoxygruppe geschützt sind, so werden diese Schutzgruppen gleichzeitig abgespalten. Die Abspaltung kann durch Behandlung des geschützten Tripeptidderivats mit wasserfreiem HF bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wobei alle oben genannten Amino- bzw. δ-GuanidinoSchutzgruppen abgespalten werden. Die Abspaltung kann auch durch Behandlung mit 2N HBr in Eisessig bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wenn das geschützte Tripeptidderivat keine Nitro- oder Tosyl-Schutzgruppe enthält.
    [0014] Die Tripeptidderivate der Formel I sind in Wasser wesentlich leichter löslich als die in der DE-OS Nr. 25 52 570 beschriebenen Tetrapeptidderivate, so dass mit diesen Tripeptidderivaten die Enzymbestimmungen bei der zur Erzielung zuverlässiger Messresultate erforderlichen Substratsättigung durchgeführt werden können. Die Tripeptidsubstrate der Formel I sind ferner signifikant empfindlieher als die in der DE-0S Nr. 25 52 570 beschriebenen Tetrapeptidderivate und können deshalb auch zur Bestimmung extrem kleiner Konzentrationen an Faktor Xa verwendet werden.
    [0015] In der niederländischen OS Nr. 76 07 433 sind Tripeptidderivate der allgemeinen Formel H - D - A-1 - A2 - A3 - NH - R (A1, A2, A3 = Aminosäurereste) beschrieben, die eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Enzymen der Enzymklasse E.C. 3.4.21., z.B. Thrombin und Plasmin, besitzen. Diese hohe Empfindlichkeit wird darauf zurückgeführt, dass die N-terminale D-Aminosäure an der α-Amiήogruppe unsubstituiert ist. Wird nämlich die α-Aminogruppe der N-terminalen D-Aminosäure substituiert, d.h. der Wasserstoff in der Formel durch eine Schutz- oder Blockierungsgruppe, z.B. durch Benzoyl oder Carbobenzoxy, ersetzt, so sinkt die Empfindlichkeit des Tripeptidderivates gegenüber Enzymen der Enzymklasse 3.4.21. in drastischem Ausmass. Auf Grund dieses Befundes hätte man erwarten können, dass die neuen Tripeptidderivate der Formel I, in welchen die α-Aminogruppe der N-terminalen D-Aminosäure eine Schutz- oder Blockierungsgruppe trägt, von Enzymen der Enzymklasse E.C. 3-4.21. nicht oder nur geringfügig gespalten würden. Ganz im Gegenteil weisen die neuen Tripeptidsubstrate gegenüber Faktor Xa unerwarteterweise eine sehr hohe Empfindlichkeit auf.
    [0016] Ein weiterer Vorteil, den die erfindungsgemässen Tripeptidsubstrate gegenüber den in der DE-OS Nr.25 52 570 beschriebenen Tetrapeptidderivaten besitzen, besteht darin, dass deren Synthese einfacher und weniger kostspielig ist.
    [0017] Die erfindungsgemässen Tripeptidsubstrate können zur quantitativen Bestimmung von gewissen Enzymen der Enzymklasse E.C. 3.4-21. (siehe "Enzyme Nomenclature" , Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, 1973, S. 238 u-f.), z.B. von Faktor Xa in Blutplasma und über die Bestimmung von Faktor Xa auch zur quantitativen Bestimmung von anderen biologisch wichtigen Faktoren, z.B. Faktor X (Proenzym des Faktors Xa), Antifaktor Xa (= Antithrombin III oder Heparincofaktor) oder Heparin in Blutplasma, verwendet werden. Diese verschiedenen Bestimmungen können in der nachfolgend beschriebenen Weise durchgeführt werden:
    [0018] 1) Bestimmung von Faktor Xa und Faktor X:
    [0019] Man verwendet menschliches Citratplasma, das man zuerst mit Gift der Russel-Viper (RVV = Rüssel viper venom) aktiviert, um den im Plasma enthaltenen Faktor X in Faktor Xa überzuführen. Man verwendet die folgenden Reagenzien: Puffer TRIS-Imidazol-Puffer, pH 8,4, Ionenstärke 0,3; RVV Gefriergetrocknetes Russel-Viper-Giftpräparat der Firma Laboratoire Stago, 92600 Asnieres s/Seine, Frankreich; gelöst in 2 ml Puffer, der CaCl2 in 0,015-molarer Konzentration enthält;
    [0020] Substrat Cbo-D-Leu-Sar-Arg-pNA.AcOH, gelöst in dest. H2O, Konzentration: 2 x 10 -3-molar. In eine Testküvette werden 0,2 ml auf 37°C erwärmtes RVV-Reagens und dann 0,02 ml menschliches Citratplasm gegeben. Die beiden Komponenten werden sofort gemischt und dann während 60 Sekunden bei 37°C inkubiert. Das erhaltene
    [0021] Aktivierungsgemisch wird mit 1,6 ml Puffer von 37°C verdünnt und mit 0,2 ml 2 x 10-3-molarer Sύbstratlδsung gemischt.
    [0022] Hierauf misst man spektrophotometrisch die durch das freigesetzte p-Nitroanilin bewirkte Aenderung der optischen Dichte des Gemisches bei einer Wellenlänge von 405 nm. Die gemessene Zunahme der optischen Dichte pro Minute ist der im aktivierten Plasma vorhandenen Menge an Faktor Xa direkt proportional. Die gemessene Zunahme der optischen Dichte in 1 Minute ist zugleich ein Mass für die im Ausgangsplasma vorhandene Menge an Faktor X, da bei der Aktivierung eine gegebene Menge Faktor X stöchiometrisch in die entsprechede Menge Faktor Xa umgewandelt wird.
    [0023] 2) Bestimmung von Antifaktor Xa:
    [0024] Man stellt eine Testprobe dar, indem man menschliches Citratplasma mit TRIS-Imidazol-Puffer im Verhältnis von 1:10 verdünnt. Man gibt 100 μl einer Heparinlδsung in TRIS-Imidazol-Puffer (enthaltend 3 USP-Einheiten Heparin pro ml Puffer) zu 100 μl des verdünnten Plasmas und Inkubiert die Mischung während 2 Minuten bei 37°C. Man setzt dem Inkubat 100 μl einer 8,5 Einheiten Faktor Xa pro ml enthaltenden Lösung des Faktor Xa-Präparates "Diagen" (Lieferant: Diägnostic Reagents, Thame, Grossbritannien) zu. Die Mischung wird während 3 Minuten bei 37°C inkubiert. Das Inkubat wird mit 0,6 ml TRIS-Imidazol-Puffer von 37°C verdünnt und sofort mit 100 μl einer auf 37°C erwärmten 2 x 10-3-molaren Lösung von Cbo-D-Leu-Sar-Arg-pNA. AcOH (Substrat) in dest. Wasser gemischt.
    [0025] In einem Parallelversuch wird eine Blindprobe in der gleichen Weise hergestellt, indem jedoch anstelle des verdünnten Plasmas die gleiche Volumenmenge Puffer verwendet wird.
    [0026] Für beide Proben (Testprobe und Blindprobe) wird die Zunahme der optischen Dichte bei 405 nm spektrophotometrisch gemessen. Die Differenz zwischen der Zunahme der optischen Dichte der Blindprobe pro Minute (ΔODBlind/Min.) und der Zunahme der optischen Dichte der Testprobe pro Minute (ΔODTest/Min.) ist ein Mass für die Menge des durch den Antifaktor-Xa-Heparin-Komplex gehemmten Faktors Xa und entsprechend ein Mass für die im Plasma vorhandene Menge Aritifaktor Xa (= Antithrombin III).
    [0027] 3) Bestimmung von Heparin in Blutplasma: Man stellt eine Testprobe dar, Indem man Plasma eines mit Heparin behandelten Patienten mit TRIS-Imidazol Puffer im Verhältnis von 1:10 verdünnt. Das verdünnte Plasma wird während 1 bis 2 Minuten bei 37°C inkubiert. Zu 200 μl des Inkubats gibt man 100 μl einer 8,5 Einheiten Faktor Xa pro ml enthaltenden Lösung des Faktor-Xa-Präparates "Diagen" (Lieferant: Diägnostic Reagents, Thame, Grossbritannien) und inkubiert die Mischung während 3 Minuten bei 37°C. Das Inkubat wird mit 0,6 ml TRIS-Imidazol
    [0028] Puffer von 37°C verdünnt und sofort mit 100 μl einer 2 x 10 -3-molaren Lösung von Cbo-D-Leu-Sar-Arg-pNA.AcOH (Substrat) in dest; Wasser gemischt. In einem Parallelversuch wird eine Blindprobe in der gleichen Weise hergestellt, indem jedoch anstelle des verdünnten heparinhaltigen Plasmas die gleiche Menge von entsprechend verdünntem Normalplasma (heparinfrei) verwendet wird.
    [0029] Für beide Proben wird die Zunahme der optischen Dichte pro Minute bei 405 nm spektrophotometrisch gemessen. Die Differenz zwischen der Zunahme der optischen Dichte der Blindprobe pro Minute (ΔODBlind/Min.) und der Zunahme der optischen Dichte der Testprobe pro Minute (ΔODTest/Min.) ist ein Mass für die Hemmwirkung des an Heparin-Cofaktor (Antithrombin III) gebundenen Heparins.
    [0030] Antifaktor Xa (= Heparincofaktor oder Antithrombin III) allein hemmt Faktor Xa nur langsam, so dass bei einer kurzen Inkubationszeit (z.B. 3 Min.) nur geringe
    [0031] Mengen Faktor Xa gehemmt werden. Wenn aber Antifaktor Xa mit Heparin in Verbindung tritt, so bildet sich zwischen den beiden Komponenten ein Komplex, der ein schneller Hemmer für Faktor Xa ist und innerhalb einer kurzen Inkubationszeit (z.B. 3 Min.) sich vollständig mit Faktor Xa verbindet. Da die Hemmung des Faktors Xa der Menge des vorhandenen Heparins proportional ist, so lange genügend Antifaktor Xa vorhanden ist, kann man anhand einer Eichkurve, die mit Normalplasma und steigenden Mengen Heparin aufgestellt wird, auf Grund der potenzierenden Wirkung des zugesetzten Heparins die Menge des im Patientenplasma vorhandenen Heparins ermitteln.
    [0032] Bei der Messung der bei der Umsetzung des Faktors Xa mit den erfindungsgemässen Tripeptidderivaten (Substraten) freigesetzten Menge des farbigen Spaltproduktes H - R5 (p-Nitroanilin) wird von der Tatsache Gebrauch gemacht, dass das Spaltprodukt ein UV-Spektrum aufweist, welches von demjenigen des Substrats verschieden und gegen höhere Wellenlängen verschoben ist. Die erfindungsgemässen Substrate besitzen ein Absorptionsmaximum bei etwa 310 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von etwa 13'000. Die Absorption des Substrates ist bei 405 nm praktisch Null. Das durch die enzymatische Hydrolyse des Substrates gebildete Spaltprodukt H - R5 , d.h. p-Nitroanilin, weist ein
    [0033] Absorptionsmaximum bei 380 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von etwa 13 '200 auf. Bei 405 nm ist der Extinktionskoeffizient nur massig, d.h. auf etwa 10'400, reduziert.
    [0034] Für Substrate, die als chromogene Gruppe eine ß-Naphthylamino-, 4-Methoxy-ß-naphthylamino-, Cumaryl-(7)-amino- oder Isophthalylaminogruppe enthalten, wird die Menge des durch den Faktor Xa abgespaltenen Produktes H - R5 durch Fluoreszenzspektrophotometrie gemessen. In einem aus Faktor Xa, Puffer und Substrat bestehenden Testsystem misst man kontinuierlich das energieärmere emittierte Licht bei 400 bis 470 nm, nachdem man das fluoreszierende Spaltprodukt mit energiereicherem Licht von 300 bis 400 nm kontinuierlich angeregt hat. Die pro Zeiteinheit gebildete Menge des Spaltproduktes ist ein Mass für die vorhandene Faktor Xa-Aktivität. 1 μMol des pro Minute gebildeten Spaltproduktes entspricht definitionsgemäss 1 Enzymeinheit Faktor Xa, bezogen auf ein gegebenes Substrat.
    [0035] Die Empfindlichkeit der oben beschriebenen Bestimmungsmethoden kann noch erhöht werden, indem man das Spaltprcdukt H - R5 , wenn R5 eine p-Nitrophenylamino- , 1-Carboxy-2-nitro-phenyl - ( 5 ) -amino- , l-Sulfo-2-nitro-phenyl- ( 5) -amino- , 5-Nitro-α-naphthylamino- od er 8-Nitro-chinonyl- ( 5 ) -aminogruppe ist , vor d er Me ssung dur ch Kupplung mit einer Diazoverbindung in eine intensiver gefärbte Verbindung überführt..
    [0036] Bester Weg zur Dur chführung der Erfindung In den nachfolgenden Aus führungsb eispielen ist die
    [0037] Herstellung der erfindungsgemässen Tripeptidderivate ausführlicher beschrieben . Temperatur en sind in Celsius graden angegeb en.
    [0038] Die Analysen der gemäss den Beispielen erhaltenen Eluate und Produkte wurden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von mit Siliciumdioxydgel überzogenen Glasplatten (Merck, F 254) durchgeführt. Die Dünnschic chromatogramme wurden mittels des folgenden Lösungsmit systems entwickelt: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:1:1) . Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
    [0039] D-Aadi = D-α-Amino-adipinsäure
    [0040] Ac = Acetyl
    [0041] Ac2O = Acetanhydrid
    [0042] AcOH = Essigsäure
    [0043] Ala = L-Alanin
    [0044] D-Ala = D-Alanin
    [0045] AOA = D-α-Amino-octansäure
    [0046] Arg = L-Arginin
    [0047] D-Asp = D-Asparaginsäure
    [0048] BOC = tert -Butoxycarbonyl
    [0049] Bu = Butyl
    [0050] But = L-2-Aminobuttersäure
    [0051] D-But = D-2-Aminobuttersäure
    [0052] Bz = Benzoyl
    [0053] Bzl = Benzyl
    [0054] Bz2O = Benzoesäureanhydrid
    [0055] ChA = Chinonylamid
    [0056] D-CHA = D-3-Cyclohexylalanin
    [0057] D-CHG = D-2-Cyclohexylglycin
    [0058] D-CHT = D-3-(4-Hydroxycyclohexyl)alanin = kern hydriertes Tyrosin
    [0059] Cbo = Carbobenzoxy
    [0060] DMF = Dimethylformamid
    [0061] DPA = 5-Amido-isophthalsäure-dimethylester
    [0062] DSC = Dunnschichtchromatόgramm bzw.
    [0063] Dünnschichtchromatographie
    [0064] Et = Aethyl
    [0065] Et3N = Triäthylamin
    [0066] Gly = Glycin
    [0067] D-Glu = D-Glutaminsäure D-His = D-Histidin
    [0068] HMPTA = N ,N ,N ' ,N ' ,N" ,N"-Hexylmethylphosphor säuretriamid D-Ile = D-Isoleucin
    [0069] D-Leu = D-Leucin
    [0070] LMS = Lösungsmittelsystem
    [0071] MCA = 7-Amido-4-methylcumarin MeO = Methoxy
    [0072] MeOH = Methanol
    [0073] NA = Naphthylamid
    [0074] D-Nleu = D-Norleucin
    [0075] D-Nval = D-Norvalin OtBu = tert.-Butoxy
    [0076] OpNP = p-Nitrophenoxy pNA = p-Nitroanilid
    [0077] Pr = Propyl
    [0078] D-Ph'Gly = D-2-Phenylglycin D-Phe = D-Phenylalanin
    [0079] Sar = Sarkosin = N-Methylglycin
    [0080] D-Ser = D-Serin
    [0081] TFA = Trifluoressigsäure
    [0082] THF = Tetrahydrofuran D-Thr = D-Threonin
    [0083] Tos = p-Toluolsulfonyl
    [0084] D-Tyr = D-Tyrosin
    [0085] D-Val = D-Valin
    [0086] Wenn nichts anderes vermerkt ist, weisen die Aminosäuren die L-Form auf.
    [0087] Beispiel 1 Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.HBr la. Cbo-Arg-pNA.HCl
    [0088] In einem Dreihalsrundkolben von 250 ml Inhalt wurden 16,0 g (47,0 mMol) über P2O5 im Vakuum getrocknetes Cbo-Arg-OH.HCl in 90 ml abs. HMPTA unter Feuchtigkeitsausschluss bei 20° gelöst. Bei Zimmertemperatur wurden der erhaltenen Lösung zuerst eine Lösung von 4,74 g (47,0 mMol) Et3N in 10 ml HMPTA und dann 16,4 g (100 mMol) p-Nitrophenylisocyanat (100%iger Ueberschuss) portionenweise zugesetzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit bei 20° wurde das HMPTA im Vakuum grδsstenteils abdestilliert. Der Rückstand wurde mehrmals mit 30%iger AcOH extrahiert. Der Rückstand wurde verworfen. Die vereinigten AcOH-Extrakte wurden zur weiteren Reinigung auf eine mit 30%iger AcOH äquilibrierte "Sephadex"-G-15-Säule aufgetragen und mit 30%iger AcOH eluiert. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde gefriergetrocknet. Man erhielt 12,6 g eines amorphen Pulvers das im DSC im LMS einheitlieh war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C20H25N6O5Cl ergaben die folgenden Werte: C = 51,29% (51,67%), H = 5,48% (5,42%), N = 17 ,92% (18,08%), Cl = 7,50% (7,63%). Die eingeklammerten Werte sind berechnet. Ib. 2HBr.H-Arg-pNA
    [0089] Unter Feuchtigkeitsausschluss wurden 4,65 g (10 mMol) der Verbindung la mit 40 ml 2N HBr in Eisessig unter Rühren 45 Min. bei 20° behandelt. Das Aminosäurederivat löste sich dabei unter CO2-Entwicklung. Die Reaktionslösύng wurde unter intensivem Rühren zu 250 ml abs. Aether zugetropft, wobei 2HBr.H-Arg-pNA ausfiel. Die Aetherphase wurde abgesaugt, worauf die feste Phase noch viermal mit je 100 ml abs. Aether gewaschen wurde, um das als Nebenprodukt gebildete Benzylbromid sowie den Ueberschuss an HBr und AcOH weitgehend zu entfernen. Der Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst, mit EtgN auf pH 4,5 eingestellt und zur Trocknung im Vakuum bei 30° eingeengt. Dieses so erhaltene Produkt wurde in 75 ml MeOH gelöst und durch eine mit MeOH äquilibrierte Säule von "Sephadex" LH-20 (vernetztes Dextrangel) laufen gelassen. Aus einer Fraktion des Eluates erhielt man Α ,18 g (91,6% der Theorie) der amorphen Verbindung lb, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C12H20N6O3Br2 ergaben die folgenden Werte: c = 31,15% (31,60%), H = 4,35% (4,42%), N = 18,84% (18,43%) und Br = 34,81% (35,03%). lc Cbo-Gly-Arg-pNA.HBr
    [0090] 4,56 g (10 mMol) der Verbindung lb wurden in 30 ml frisch destilliertem DMF gelost und nach Kühlung auf -10° unter Rühren mit 1,40 ml (10 mMol) Et3N versetzt. Das ge bildete Et3N.HBr wurde abfiltriert und mit wenig kaltem DMF gewaschen. Man gab dem Filtrat unter Rühren bei -10° 3,65 g (11 mMol) Cbo-Gly-OpNP zu und liess das Gemisch unter Feuchtigkeitsausschluss 2-3 Stunden lang reagieren, wobei die Temperatur der Reaktionslösung allmählich auf etwa 20° stieg. Die Lösung wurde wieder auf -10° gekühlt und mit 0,70 ml (5 mMol) Et3N gepuffert. Man liess die Reaktions lösung etwa 2 Stunden bei -10° und 3 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Diese Prozedur wurde nochmals mit 0,70 ml Et3N wiederholt, und nach weiteren 16 Stunden wurde die Reaktionslösung im Vakuum bei 50° zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 75 ml 50%iger AcOH gelost und durch Gelfiltration auf einer mit 50%iger AcOH äquilibrierten Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypεinbehandlung unter Frei setzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 150 ml MeOH gelöst und nochmals zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des erhaltenen Rückstandes im Vakuumtrocken schrank bei 60° über P2O5 erhielt man 5,85 g (88,3% der Theorie) der amorphen Verbindung lc, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C22H28N7O6Br ergaben die folgenden Werte: C = 46,33% (46,65%), H = 5,04% (4,98%), N = 17,88% (17,31%) und Br = 14,20% (14,11%). Id. 2HBr.H-Gly-Arg-pNA
    [0091] 4,56 g (8 mMol) der Verbindung lc wurden unter .Feuchtigkeitsausschluss mit 32 ml 2N HBr in Eisessig unter Rühren 40 Min. lang bei 20° behandelt. Das Dlpeptidderivat löste sich dabei allmählich unter CO2-Entwicklung. Die Re aktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 250 ml abs. Aether zύgetropft, wobei 2HBr.H-Gly-Arg-pNA ausfiel. Die Aetherphase wurde abgesaugt, worauf die feste Phase noch viermal mit je 100 ml abs. Aether gewaschen wurde, um das als Nebenprodukt gebildete Benzylbromid sowie den Ueberschuss an HBr und AcOH weitgehend zu entfernen. Der Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst. Nach Einstellung des pH auf 4,5 mit Et3N wurde die Lösung im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst und auf einer mit MeOH äquilibrierten Säul von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des erhaltenen Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 3,78 g (92,1% der Theorie) der amorphen Verbindung Id, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel
    [0092] C14H23N7O4Br2 ergaben die folgenden Werte: C = 32,31% (32,77%), H = 4,59% (4,52%), N = 19,47% (19,11%) und Br = 30,78% (31,14%). le. Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.HBr 2,57 g (5 mMol) der Verbindung ld wurden in 20 ml frisch destilliertem DMF gelöst und nach Kühlung auf -10° unter Rühren mit 0,70 ml (5 mMol) Et3N versetzt. Das gebildete Et3N.HBr wurde abfiltriert und mit wenig kaltem DMF nachgewaschen. Zum Filtrat wurden unter Rühren bei -10° 2,13 g (5,5 mMol) Cbo-D-Leu-OpNP gegeben. Man liess das Reaktionsgemisch unter Feuchtigkeitsausschluss 2-3 Stunden lang reagieren, worauf die Temperatur- der Reaktionslδsung allmählich auf etwa 20° stieg. Die Lösung wurde wieder auf -10° gekühlt und mit 0,35 ml (2,5 mMol) Et3N gepuffert. Man liess die Reaktionslösung etwa 2 Stunden bei -20° und weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Diese Prozedur wurde nochmals mit 0,35 ml Et3N wiederholt, und nach weiteren 16 Stunden wurde die Reaktionslösung im Vakuum bei 50° zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml 50%iger AcOH gelöst und durch Gelfiltrierung auf einer mit 50%iger AcOH äquilibrierten Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml MeOH gelöst, worauf die Lösung nochmals zur Trockne eingeengt wurde. Nach Trocknung des erhaltenen Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2O5 erhielt m an 3,08 g (90,6% der Theorie) der amorphen Verbindung le, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H39N8O7Br ergaben die folgendenWerte: C = 49,06% (49,49%) , H = 5,82% (5,78%) , N = 16,85% (16,49%) und Br = 11,59% (11,76%).
    [0093] Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Gly : 1,00 - D-Leu : 0,99 - Arg : 0,97. Beispiel 2
    [0094] Cbo-D-Leu-Gly-Arg-MCA.HBr 2b. 2HBr.H-Arg-MCA
    [0095] 13,0 g (25,9 mMol) käufliches Cbo-Arg-MCA.HCl wurden mit 104 ml (208 mMol) einer Lösung von 2N HBr in Eisessig gemäss Beispiel lb deblockiert. Der trockene Rückstand wurde in 400 ml MeOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methyl-7-amino-cumarin spalten liess, wurde im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des erhaltenen Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 11,2 g (87,7% der Theorie) der amorphen Verbindung 2b, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C16H23N5O3Br2 ergaben diefolgenden Werte: C = 39,40% (38,96%), H = 4,61% (4,70%), N = 14,48% (14,20%) und Br = 31,90% (32,40%). 2c. Cbo-Gly-Arg-MCA.HBr
    [0096] 4,93 g (10 mMol) der Verbindung 2b .und 3,65 g (11 mMol) Cbo-Gly-OpNP wurden zu 75 ml frisch destilliertem DMF gegeben. Nach Kühlung auf -10° wurden unter Rühren zuerst 1,40 ml (10 mMol) und anschliessend 0,70 ml (5 mMol) Et3N zugegeben. Man liess das Gemisch unter Feuchtigkeitsausschluss zuerst 3 Stunden bei -10° und dann weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren : Die Reaktionslösung wurde erneut auf -10° gekühlt, mit 0,70 ml Et3N gepuffert und über Nacht bei 20° gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum bei 50° zur Trockne eingeengt, worauf der Rückstand in 200 ml 50%iger AcOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt wurde. Diejenige Fraktion des AcOHEluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methyl-7-amino-curaarin spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des erhaltenen Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2O5 erhielt man 4,98 g (82,5% der Theorie) der amorphen Verbindung 2c, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C26H31N6O6Br ergaben die folgenden Werte: C = 51,48% (51,75%),Η = 5,24%: (5,18%), N = 13,70% (13,93%) und Br = 13,14% (13,24%). 2d. 2HBr.H-Gly-Arg-MCA
    [0097] 4,83 g (8 mMol) der Verbindung 2c wurden gemäss Beispiel Id mit 32 ml 2N HBr in Eisessig deblockiert. Das erhaltene Rohprodukt wurde in 100 ml MeOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methyl-7-amino-cumarin spalten liess wurde im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des erhaltenen Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 4,05 g (92,0% der Theorie) der amorphen Verbindung 2d, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der BruttoformelC18H26N6O4Br2 ergaben die folgenden Werte : C = 39,02% (39,29%), H = 4,78% (4,76%), N = 15,39% (15,27%) und Br = 28,72% (29,04%). 2e. Cbo-D-Leu-Gly-Arg-MCA.HBr.
    [0098] 2,75 g (5 mMol) der Verbindung 2d wurden gemäss Beispiel le mit 2,13 g (5,5 mMol) Cbo-D-Leu-OpNP umgesetzt Das erhaltene Rohprodukt wurde in 75 ml 50%iger AcOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Die jenige Fraktion des AcOH-Eluates , die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methyl-7-amino-cumarin spalten liess , wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt . Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2O5 erhielt man 2 , 91 g ( 81 ,2% der Theorie ) der amorphen Verbindung 2e , die im DSC im LMS einheitlich war . Elementar analyse und Berechnung aus der Bruttoformel C32H 42N7O7Br ergaben die folgenden Werte : C = 53 ,13% ( 53 , 63%) , H = 6 , 01% ( 5 , 91%) , N = 13 , 91% ( 13 , 68%) und Br = 10 , 88% (11 ,15%) .
    [0099] Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im ri chtigen Verhältnis : Gly : 1 ,00 - Leu : 1 ,02 - Arg : 0 , 98.
    [0100] Beispiel 3 Cbo-D-Leu-Gly-Arg-DPA.HBr
    [0101] 3a. Cbo-Arg-DPA.HCl
    [0102] In einem Dreihalsrundkolben von 1000 ml Inhalt wurden 34,48 g (0,1 Mol) getrocknetes Cbo-Arg-OH.HCl in einem Gemisch von 150 ml frisch destilliertem wasserfreiem DMF und 300 ml abs. THF bei 20° gelöst. Der auf -10° gekühlten Lösung wurden unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluss 10,2 g (0,1 Mol) Et3N zugesetzt. Dann wurde dem Gemisch innerhalb von 20 Minuten eine Lösung von 13,65 g (0,1 Mol) Chlorameisensäure-isobutylester in 50 ml THF tropfenweise zugesetzt, wobei man die Reaktionstemperatur nie über -5° steigen liess. Nach, einer zusätzlichen Reaktionszeit von 10 Minuten bei einer Temperatur von -10° bis -5° wurde dem Reaktionsgemisch eine Lösung von 20,92 g (0,1 Mol) 5-Aminoisophthalsäure-dimethylester in 75 ml DMF innerhalb von 30Minuten tropfenweise zugesetzt, wobei man die Reaktionstemperatur immer unterhalb -5° hielt. Man liess das Reaktionsgemisch noch 1 Stunde bei -5° weiterreagieren. Dann wurde es über Nacht bei 20° gerührt und dann auf -15° gekühlt, um das Et3N.HC.l auakristallisieren zu lassen. Das gebildeteEt3N.HCl wurde abfiltriert und mit wenig kaltem DMF nachgewaschen. Das Filtrat wurde zusammen mit der Waschlösung im Vakuum bei 50° zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 1000 ml 50%iger AcOH gelöst und durch Gelfiltrierung auf einer mit 50%iger AcOH äquilibrierten Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 5-Amino-isophthalsäure-dimethylester spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 50° über P2O5 erhielt man 24,6 g (45,9% der Theorie) der amorphen Verbindung 3a, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C24H30N5O7cl ergaben die folgenden Werte: C = 53,21% (53,78%) , H = 5,71% (5,64%), N = 13,20% (13,07%) und Cl = 6,52% (6,62%). 3b. 2HBr.H-Arg-DPA
    [0103] 21,44 g (40 mMol) der Verbindung 3a wurden gemäss Beispiel lb deblockiert. Nach Aufarbeitung wurde das erhaltene Rohprodukt in 250 ml MeOH gelöst und durch Gelfiltrierung auf einer Säule von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 5-Amino-isophthalsäure -dimethylester spalten liess, wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 19,63 g (93,1% der Theorie) der amorphen Verbindung 3b, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementar analyse und Berechnung aus der Bruttoformel C16H25N5O5Br2 ergaben die folgenden Werte: C = 36,82% (36,45%), H = 4,67% (4,78%), N = 13,45% (13,28%) und Br = 29,85% (30,31%). 3c. Cbo-Gly- Arg-DPA.HBr
    [0104] 5,27 g (10 mMol) der Verbindung 3b wurden gemäss Beispiel lc mit 3,65 g (11 mMol) Cbo-Gly-OpNP umgesetzt. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 200 ml 50%iger AcOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Diejenige Fraktion des AcOH-Elύates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 5-Amino-isophthalsaure-dimethylester spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° 'zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2 O5 erhielt man 5,29 g (83,0% der Theorie) der amorphen Verbindung 3c, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C26H33N6O8Br ergaben die folgenden Werte: C = 48, 50% (48 ,99%), H = 5,28% (5,22%), N = 12,92% (13,18%) und Br = 12,33% (12,53%). 3d. 2HBr.H-Gly-Arg-DPA
    [0105] 5,10 g (8 mMol) der Verbindung 3c wurden gemäss Beispiel ld mit 32 ml 2N HBr in Eisessig deblockiert. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 100 ml MeOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 5-Amino-isophthalsäure-dimethylester spalten liess, wurde im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 4,25 g (90,9% der Theorie) der amorphen Verbindung 3d, die im DSC im LMS einheitlich war. Element aranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C18 H28N6 O2Br2 ergaben die folgenden Werte: C = 36,85% (37,00%), H = 4,90% (4,83%) , N = 14,72% (14,38%) und Br = 26,95% (27,35%). 3e. Cbo-D-Leu-Gly-Arg-DPA.HBr
    [0106] 2,92 g (5 mMol) der Verbindung 3d wurden gemäss Beispiel le mit 2,13 g (5,5 mMol) Cbo-D-Leu-OpNP umgesetzt. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 100 ml 50%iger AcOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 5-Amino-isophthalsäure-dimethylester spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2 O5 erhielt man 3,11 g (82,9% der Theorie) der amorphen Verbindung 3e, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C32H44N7O9Br ergaben folgenden Werte: C =.50,88% (51,20%) , H = 5,99% (5,91%) , N = 13,26% (13,06%) und Br = 10,48% (10,64%). Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Gly : 1,00 - Leu : 1,00 - Arg : 0,97.
    [0107] Beispiel 4 Cbo-D-Leu-Sar-Arg-2-NA.HBr
    [0108] 4b. 2HBr.H-Arg-2-NA
    [0109] 9,40 g (20 mMol) käufliches Cbo-Arg-2-NA.HCl wurden gemäss Beispiel 1b mit einer Lösung von 80 ml 2N HBr in Eisessig deblockiert. Das nach Aufarbeitung erhaltene Produkt wurde in 150 ml MeOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 2-Naphthylamin spalten liess, wurde im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 8,60 g (93,2% der Theorie) der amorphen Verbindung 4b, die im .DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C16H23N5OBr2 ergaben die folgenden Werte:- C = 42,08% (41,67%), H = 5,12% (5,03%), N = 14,68% (15,19%) und Br = 33,96% (34,65%). 4c. Cbo-Sar-Arg-2-NA.HBr
    [0110] 4,6 g (10 mMo.1) der Verbindung 4b wurden gemäss Beispiel lc mit 3,80 g (11 mMol) Cbo-Sar-OpNP umgesetzt. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 150 ml 50%iger AcOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" G-15gereinigt. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 2-Naphthylamin spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2O5 erhielt man 4,95 g (84,5% der Theorie) der amorphen Verbindung 4c, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H33N6O4Br ergaben die folgenden Werte: C = 55,72% (55,39%), H = 6,73% (5,68%), N = 14,68% (14,35%) und Br = 13,42% (13,65%). 4d. 2HBr .H-Sar-Arg-2-NA 4,68 g (8 mMol) der Verbindung 4c wurden gemäss Beispiel ld mit 28 ml 2N HBr in Eisessig deblockiert. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 100 ml MeOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 2-Naphthylamin spalten liess, wurde im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrokkenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 4,08 g (95,8% der Theorie) der amorphen Verbindung 4d, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C19H28N6O2Br2 ergaben die folgenden Werte: C = 43,9% (42,87%), H = 5,32% (5,30%), N = 16,02% (15,79%) und Br = 29,68% (30,02%). 4e. Cbo-D-Leu-Sar-Arg-2-NA.HBr
    [0111] 2,66 g (5 mMol) der Verbindung 4d wurden gemäss Beispiel le mit 2,13 g (5,5 mMol) Cbo-D-Leu-OpNP umgesetzt. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 100 ml 50%iger AcOH gelost und auf einer Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Die erste Hauptfraktion des AcOH Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 2-Naphthylamin spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt und dann im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2O5 getrocknet. Man erhielt 3,01 g (86,2% der Theorie) der amorphen Verbindung 4e, die Im DSC im LMS einheitlich war. Elementar an alyse und Berechnung aus der Bruttoformel C33H44N7O5Br ergaben die folgenden Werte: C = 57,05% (56,73%) , H = 6,40% (6,35%), N = 14,30% (14,03%) und Br = 11,12% (11,44%). Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden
    [0112] Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Sar : 1,00 - Leu : 1,02 - Arg : 0,97.
    [0113] Beispiel 5 Cb o-D -Leu-Sar-Arg-4-Me0-2-NA.HBr 5b. 2HBr.H-Arg-4-MeO-2-NA
    [0114] 10,0 g (20 mMol) käufliches Cbo-Arg-4-MeO-2-NA.HCl wurden gemäss Beispiel lb mit 80 ml 2N HBr in Eisessig deblockiert. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 150 ml MeOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Die Hauptfraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten liess, wurde im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 8,98 g (91,4% der Theorie) der amorphen Verbindüng 5b, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C17H25N5O2Br2 ergaben die folgenden Werte: C = 41,22% (41,57%), H = 5,19% (5,13%), N = 14,40% (14,26%) und Br = 32,01% (32,53%). 5c. Cbo-Sar-Arg-4-Me0-2-NA.HBr
    [0115] 4,91 g (10 mMol) der Verbindung 5b wurden gemäs Beispiel lc mit 3,80 g (11 mMol) Cbo-Sar-OpNP umgesetzt. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 150 ml 50%iger AcOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Die erste Hauptfraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4 Methoxy-2-naphthylamin spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne, eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandesim Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2O5 erhielt man 4,86 g (79,0% der Theorie) der amorphen Verbindung 5c, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H35N6O5Br ergaben die folgenden Werte: C = 54,38% (54,64%) , H = 5,81% (5,73%), N = 13,93% (13,65%) und Br = 12,75% (12,98%). 5d. 2HBr.H-Saf-Arg-4-Me0-2-NA
    [0116] 4,31 g (7 mMol) der Verbindung 5c wurden gemäss Beispiel ld mit 28 ml 2N HBr in Eisessig deblockiert. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 100 ml MeOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" LH-20 gereinigt. Die Hauptfraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Bildung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten liess, wurde im Vakuum bei 30° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 3,74 g (95,0% der Theorie) der amorphen Verbindung 5d, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C20H30N6O3Br2 ergaben die folgenden Werte: C = 43,01% (42,72%), H = 5,44% (5,38%), N = 15,25% (14,95%) und Br = 28,03% (28,42%).
    [0117] Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Sar : 1,00 - Leu : 1,01 - Arg : 0,98. 5e. Cbo-D-Leu-Sar-Arg-4-Me0-2-NA.HBr
    [0118] 2,81 g (5 mMol) der Verbindung 5d wurden gemäss Beispiel le mit 2,13 g (5,5 mMol) Cbo-D-Leu-OpNP umgesetzt. Das nach Aufarbeitung erhaltene Rohprodukt wurde in 125 ml 50%iger AcOH gelöst und auf einer Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Die erste Hauptfraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2O5 erhielt man 2,98 g (81,8% der Theorie) der amorphen Verbindung 5e, die im DSC im LMS einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H46N7O6Br ergaben die folgenden Werte: C = 56,28% (56,04%), H = 6,34% (6,36%), N = 13,75% (13,46%) und Br = 10,68% (10,97%).
    [0119] Beispiel 6 Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.AcOH 6,80 g (10 mMol) Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA-HBr (hergestellt gemäss Beispiel 1) wurden in 75 ml 60%igem wässrigem MeOH gelöst. Die Lösung wurde auf eine Säule von "Amberlite" JRA-401 in der Acetatform gegeben. Die Säule wurde mittels 60%igem wässrigem MeOH eluiert, wobei durch Ionenaustausch HBr durch AcOH ersetzt wurde. Das Eluat wurde im Vakuum bei- 40° zur Trockne eingeengt. Nach dem Trocknen im Vakuumtrockenschrank bei 40° über P2O5 erhielt man 6,62 g bromidfreies Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.AcOH (99,0% der Theorie). Nach dieser Methode kann man aus dem oben genanten Tripeptidderivat entsprechend andere Salze mit organischen Säuren, z.B. Ameisen-, Propion-, Oxal-, Wein-, Zitronen-, Milch-, Benzoe-, Chlorbenzoe-, Salicyl.- oder Phthalsäure, herstellen. Man kann als Ionenaustauscher z.B. "Amberlite" JRA-401 in der Hydrochloridform verwenden und in die gewünschte Säuresalzform überführen, indem man den genannten Ionenaustauscher durch Behandlung mit Natronlauge in die basische OH-Form überführt und dann mit einer Lösung eines l:l-Gemisches der gewünschten organischen Säure und deren Natriumsalz in 60%igem wässrigem MeOH behandelt.
    [0120] Beispiel 7 Tos-D-Leu-Gly-Arg-pNA.HBr 6,26 g (10 mMol) 2HBr.H-D-Leu-Gly-Arg-pNA (hergestellt gemäss Beispiel 7f, siehe Tabelle 3) wurden in 30 ml destilliertem DMF gelöst. Nach Kühlung auf -15° wurden der Lösung unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluss zuerst 2,80 ml (20 mMol) Et3N und gleich anschliessend 1,91 g (10 mMol) Tosylchlorid zugesetzt. Nach einer Reaktionszeit von etwa 2 bis 3 Stunden bei -15° liess man das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur weiterreagieren. Das Reaktionsgemisch wurde wieder auf -15° gekühlt. Das ausgeschiedene Gemisch von Et3N.HBr und Et3N.HCl wurde abfiltriert und mit einer kleinen Menge gekühltem DMF nachgewaschen. Filtrat und Waschlösung wurden vereinigt und im Vakuum bei 50° zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 75 ml 50%iger AcOH gelöst. Die Lösung wurde auf einer mit 50%iger AcOH äquilibrierten Säule von "Sephadex" G-15 gereinigt. Diejenige Hauptfraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde im Vakuum bei 40° zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml MeOH gelöst, worauf die Lösung nochmals zur Trockne eingeengt wurde. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuumtrockenschrank bei 60° über P2O5 erhielt man 6,65 g (95,0% der Theorie) der amorphen Verbindung Tos-D-Leu-Gly-Arg-pNA. HBr, die im DSC im LMS einheitlich war. Element aranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C27H39N8SO7Br ergaben die folgenden Werte: C = 46,85% (46,35%), H = 5,66% (5,62%), N = 16,28% (16,02%), S = 4,43% (4,58%) und Br = 11,22% (11,42%).
    [0121] Anstelle des Tosylchlorids als Acylierungsmittel kann man auch entsprechende Mengen Acetylchlorid, Butyrylchlorid, Octanoylchlorid, Benzoesäurechlorid, p-Methylbenzoesäurechlorid, 2-Chlorbenzoesäurechlorid, Methansulf onylchlorid, n-Butansulfonyl chlorid, Benzolsulf onylchlorid, α-Naphthalinsulf onylchlorid, Chlorameisensäuremethylester, Chlorameisensäure-isobutylester, Chlorameisensäure-octylester, Benzoesäureanhydrid, Essigsäureanhydrid, Phenylessigsäure-OpNP, Phenylpropionsäure-OpNP, Cyclohexylcarbonsäure-OpNP, N-Cbo-4-Aminomethylcyclohexylcarbonsäure-OpNP, N-Cbo-ω-Amino-n-buttersäure-OpNP, N-Cboω -Aminόoctansäure-OpNP oder N-Cbo-4-Aminomethylbenzoesäure-.OpNP verwenden.
    [0122]
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    [0140]
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    [0142]
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    [0144]
    [0145]
    [0146] Die Empfindlichkeit der erfindungsgemässen Tripeptidderivate gegenüber Faktor Xa ist in der nachfolgen den Tabelle 4 zahlenmässig angegeben und mit derjenigen des vorbekannten Substrates Bz-Ile-Glu(Y-OH)-Gly-Arg- pNA.HC1 verglichen.
    [0147] Tabelle 4
    [0148] Aktivität von 1 ml wässriger Losung von bovinem Faktor Xa und von durch Aktivierung von Faktor X in 1 ml menschlif chem Normalplasma mittels RVV erzeugtem Faktor Xa, ausge drückt in Nanomol des pro Min. freigesetzten Spaltproduk tes H - R5 tor
    [0149]
    [0150] * Bz-Ile-Glu(Y-OH) -Gly-Arg-pNA .HC1 (beschrieben in der DE-OS 25 52 570)
    [0151] Die in Tabelle 4 angegebenen Werte der Faktor-Xa- Aktivität wurden experimentell wie folgt ermittelt :
    [0152] Zur Bestimmung der Aktivität von bovinem Faktor Xa wurde 1 , 8 ml TRIS-Imidazol-Puffer mit pH 8 ,4 und Ionen stärke 0 ,3 bei 37° mit 0 ,025 ml einer wässrigen Lösung des Faktor-Xa-Präparates "Diagen" (Lieferant: Diägnostic Reagents Ltd ., Thame , Grossbritannien) , welche durch Lösen des Inhalts einer Ampulle in 0 , 5 ml W asser erhalten wurde , gut gemischt. Der Mischung "wurde 0.,2 ml einer 2 x 10 -3 molaren wässrigen Lösung eines erfindungsgemässen Substrates zugesetzt. Dann wurde die pro Minute freigesetzte Men ge des Spaltproduktes H - R5 in Nanomol ermittelt und auf
    [0153] 1 ml Faktor-Xa-Lδsung umgerechnet.
    [0154] Zur Bestimmung der Aktivität von humanem Faktor Xa wurde 0,01 ml Normalcitratplasma mit 0,20 ml einer Lö sung von Russel-Viper-Gift in TRIS-Imidazol-Puffer mit pH 8,4 und Ionenstärke 0,3, welche 15 mMol CaCl2 pro ml enthielt, gemischt. Die Mischung wurde während 75 Sekunden bei 37°C inkubiert, um den im Plasma enthaltenen Faktor X zu aktivieren und vollständig in Faktor Xa überzuführen. Dem Inkubat wurden zuerst 1,40 ml TRIS-Imidäzol-Puffer
    [0155] (pH 8,4, Ionenstärke 0,3) von 37° und dann 0,40 ml einer
    [0156] 2 x 10 -3-molaren wässrigen Lösung eines erfindungsgemässen
    [0157] Substrats zugesetzt. Dann wurde die pro Minute freigesetzte Menge des Spaltproduktes H - R5 in Nanomol ermittelt und auf 1 ml Citratplasma umgerechnet.
    权利要求:
    ClaimsPatentansprüche
    1. Tripeptidderivate der Formel
    in welcher R1 eine gegebenenfalls in ω-Stellung eine Amino gruppe tragende Alkanoylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Phenyla.lkanoylgruppe, die 2 bis 4 Kohlenstoffatome im Alkanoyl enthält und deren Phenylrest gegebenenfalls in p-Stellung mit einer Aminogruppe substituiert ist, eine gegebenenfalls in 4-Stellung mit einem Aminomethylrest substituierte Cyclohexylcarbonylgruppe, eine gegebenenfalls in o- oder 'p-Stellung mit Methyl, Amino oder Halogen substituierte Benzoylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen in der Alkoxygruppe, eine gege benenfalls in p-Stellung mit Methoxy, Kethyl oder Chlor substituierte Benzyloxycarbonylgruppe, eine Alkansulfonylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine gegebenenfalls in p-Stellung methylierte Phenylsulfonylgruppe oder eine α- oder ß-Naphthylsulfonylgruppe darstellt, R2 einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Hydroxyalkylrest mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, einen Alkoxyalkylrest mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen im Alkyl und 1 bis 4 Kohlenstoff atomen im Alkoxy, einen Benzyloxyalkylrest mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen im Alkyl, einen ω-Carboxyalkyl- oder ω -Alkoxycarbonylalkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkyl, wobei die Alkoxygruppe geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 4 Kohlenstoffatoπe enthält, oder einen ω -Benzyloxycarbonylalkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffato men im Alkyl, oder einen Cyclohexyl-, Cyclohexylmethyl-, 4-Hydroxycyclohexylmethyl-, Phenyl-, Benzyl-, 4-Hydroxy benzyl- oder Imidazolyl-(4)-methylrest darstellt, R3 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, R4 Wasserstoff oder einen Methyl- oder Aethylrest darstellt, und R5 eine mit aromatischen oder heterocyclischen Resten substituierte Aminogruppe, welche hydrolytisch unter
    Bildung einer farbigen oder fluoreszierenden Verbindung H-R.5 abspaltbar ist, darstellt, und Salze davon mit Säuren.
    2. Tripeptidderivate nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R5 eine p-Nitrophenylamino-, 1-Carboxy-2-nitro-phenyl-(5)-amino-, 1-Sulfo-2-nitro-phenyl- (5) -amino-, ß-Naphthylamino-, 4-Methoxy-ß-naphthylamino-,
    5-Nitro-α-naphthylamino-, Chinonyl-(5)-amino-, 8-Nitrochinonyl-(5)-amino-, 4-Methyl-cumaryl-(7)-amino oder 1,3- Di(methoxycarbonyl)-phenyl-(5)-amino-Gruppe (abgeleitet von 5-Amino-isophthalsäure-dimethylester) ist.
    3. Tripeptidderivate nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die stark basische Guanidinogruppe des Arginins durch Protonisierung mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure stabilisiert ist.
    4. Tripeptidderivate nach Patentanspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Guanidinogruppe des Arginins durch Protonisierung mit Essigsäure stabilisiert ist.
    5. Tripeptidderivate nach Patentanspruch 1: Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-Leu-Sar-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-Ph'Gly-Gly-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-Nleu-Gly-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-Nleu-Sar-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-Nval-Gly-A.rg-pNA.AcOH, Cbo-D-CHA-Gly-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-CHA-Sar-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-CHT-Gly-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-CHT-Sar-Arg-pNA.AcOH, Cbo-D-CHG-Gly-Arg-pNA.AcOH, CH3S02-D-Nleu-Gly-Arg-pNA.AcOH, iso-Butoxy-CO-D-Nleu-Gly-Arg-pNA.AcOH, BOC-D-Leu-Gly-Arg-pNA. HBr, 4-MeO-Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.HBr, CHgO-CO-D-CHA-Gly-Arg-pNA.AcOH, C2H5-O-CO-D-CHA-Gly-Arg-pNA.AcOH,- CH3SO2-D- CHA-Gly-Arg-pNA . AcOH , 4-Me-Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA .AcOH , 4-Cl-Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA . AcOH , BOC-D- ( α) -AOA-Gly-Arg-pNA . AcOH .
    6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Faktor Xa in einem Medium, welches Faktor Xa enthält oder in welchem Faktor Xa entsteht oder verbraucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass man das genannte Medium mit einem Tripeptidderivat gemäss Patentanspruch 1 zur Reaktion bringt und die durch die katalytische hydrolytische Wirkung des Faktors Xa auf das Tripeptidderivat pro Zeiteinheit freigesetzte Menge des farbigen oder fluoreszierenden Spaltproduktes H-R5 durch photometrische, spektrophotometrische, fluoreszenzspektrophotometrische oder elektrochemische Methoden misst.
    7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Blutplasma von Menschen oder Warmblütlern mit einem Aktivator behandelt, um den im Plasma enthaltenen inaktiven Faktor X quantitativ in den aktiven Faktor Xa überzuführen, das aktivierte Plasma in einem Puffersystem mit dem genannten Tripeptidderivat zur Reaktion bringt und die durch Einwirkung des Kaktors Xa auf das Tripeptidderivat pro Zeiteinheit freigesetzte Menge des Spaltproduktes H - R5 bestimmt.
    8. Verfahren nach Patentanspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aktivator Gift der Russel Viper (RVV) oder ein Thromboplastin-Reagens verwendet.
    9. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Heparin über Faktor Xa in heparinisiertem Blutplasma, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem Puffersystem eine bekannte Menge Faktor Xa mit dem Blutplasma inkubiert, die Menge des nicht neutralisierten Faktors Xa durch Umsetzung desselben mit einem Tripeptidderivat gemäss Patentanspruch 1 und Bestimmung der pro Zeiteinheit freigesetzten Menge des Spaltproduktes H-R5 misst und aus der Differenz zwisehen der eingesetzten Menge Faktor Xa und der Restmenge Faktor Xa die Heparinmenge ermittelt.
    10. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von An tifaktor Xa in menschlichem Blutplasma über Faktor Xa, dadurch gekennzeichnet, dass man einerseits eine Testprobe herstellt, indem man menschliches Citratplasma mit einer Pufferlösung verdünnt, der verdünnten Lösung Heparin und dann Faktor Xa beimischt und der Mischung ein Tripeptidderivat gemäss Patentanspruch 1 zugibt, dass man andererseits eine Blindprobe in der gleichen Weise herstellt, indem man jedoch anstelle des verdünnten Plasmas die gleiche Volumenmenge Puffer verwendet, und dass man für beide Proben die durch Bildung des Spaltproduktes H-R5 bewirkte Zunahme der optischen Dichte pro Minute bestimmt und aus der Differenz zwischen der Zunahme der optischen Dichte der Blindprobe pro Minute und der Zunahme der optischen Dichte der Testprobe pro Minute die Menge des durch den Antifaktor-Xa-Heparin-Komplex gehemmten Faktors Xa und daraus die im Plasma vorhandene Menge Antifaktor Xa ermittelt.
    11. Verfahren nach Patentanspruch 6, 7, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass man das Spaltprodukt H- R5 , wenn R5 eine p-Nitrophenylamino-, l-Carboxy-2-nitro-phenyl(5) -amino-, l-Sulfo-2-nitro-phenyl-(5)-amino-, 5-Nitro-α-naphthyl-amino- oder 8-Nitro-chinonyl-(5)-amino-Gruppe ist, vor der Messung durch Kupplung mit einer Diazoverbindung in eine intensiver gefärbte Verbindung überführt.
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    CA1145698A|1983-05-03|Semi-synthesis of insulin
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    CA1161432A|1984-01-31|
    DE3160903D1|1983-10-27|
    IL62096D0|1981-03-31|
    ES8302780A1|1983-01-16|
    NO151787C|1985-06-05|
    NO813418L|1981-10-09|
    DK154221B|1988-10-24|
    JPS56501849A|1981-12-17|
    ES499343A0|1983-01-16|
    US4440678A|1984-04-03|
    CA1161432A1||
    US4480030A|1984-10-30|
    AT4702T|1983-10-15|
    AU581050B2|1989-02-09|
    DK154221C|1989-05-22|
    JPH0253040B2|1990-11-15|
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    JPS63300A|1988-01-05|
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    IL62096A|1986-09-30|
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    DE3311287A1|1983-03-28|1984-10-04|Behringwerke Ag|Verfahren zur fotometrischen bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit und reagenz dazu|
    DE3484912D1|1983-06-03|1991-09-19|Pentapharm Ag|Peptidderivate und deren verwendung als substrate zur quantitativen bestimmung von enzymen.|
    JPH0411199B2|1984-05-16|1992-02-27|||
    DE3504405A1|1985-02-08|1986-08-14|Boehringer Mannheim Gmbh|Bestimmung von prokallikrein|
    GB8504522D0|1985-02-21|1985-03-27|Genetics Int Inc|Electrochemistry of mediators|
    FI860043A|1986-01-06|1987-07-07|Orion Yhtymae Oy|Peptidsubstrat samt foerfarande foer kvantitativ analys av endotoxin.|
    SE461494B|1986-03-21|1990-02-19|Thorsman & Co Ab|Faestanordning foer en elektrisk kopplingsdosa|
    SE8601327D0|1986-03-21|1986-03-21|Kabivitrum Ab|Nya peptidderivat|
    DE3783966D1|1986-07-29|1993-03-18|Sunstar Inc|Reagens zur pruefung von periodentalen erkrankungen.|
    DE3629175A1|1986-08-28|1988-03-17|Behringwerke Ag|Chromogene verbindungen, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung|
    US5110727A|1987-04-03|1992-05-05|Cardiovascular Diagnostics, Inc.|Method for performing coagulation assays accurately, rapidly and simply, using dry chemical reagents and paramagnetic particles|
    US5115099A|1988-06-14|1992-05-19|Nitto Boseki Co., Ltd.|Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates|
    JPH06104079B2|1988-07-14|1994-12-21|日東紡績株式会社|新規な酵素活性測定用基質|
    JPH04501460A|1988-09-30|1992-03-12|||
    US5320945A|1989-07-14|1994-06-14|Boehringer Mannheim Gmbh|Method and reagent for the determination of antithrombin III|
    EP0440775B1|1989-08-17|1995-08-30|Dade Produktions AG|Faktor-ix chromogenisches assay|
    US6348570B1|1991-08-16|2002-02-19|Merck & Co., Inc.|Chromophore containing compounds and their use in determining interleukin-1β convertase activity|
    US5308756A|1991-11-20|1994-05-03|Baxter Diagnostics Inc.|Protein S chromogenic assay|
    DK0937158T3|1996-10-31|2001-03-05|Roche Diagnostics Gmbh|Fremgangsmåde til bestemmelse af den katalytiske aktivitet af Faktor IXa|
    US6297024B1|1998-10-15|2001-10-02|Cell Activation, Inc.|Methods for assessing complement activation|
    US6235494B1|1999-02-08|2001-05-22|The Scripps Research Institute|Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates|
    IL144839D0|1999-02-23|2002-06-30|Pentapharm Ag|Oligopeptide derivatives for the electrochemical measurement of protease activity|
    AT505479T|2001-09-10|2011-04-15|Novel Science Internat Gmbh|Organische verbindungen mit biologischer wirkung als thrombinhemmer und ihre verwendung|
    DE102005003145B4|2005-01-21|2006-10-19|Dade Behring Marburg Gmbh|Stablies, chromogenes Flüssigreagenz und dessen Verwendung in gerinnungsdiagnostischen Tests|
    US8941631B2|2007-11-16|2015-01-27|Qualcomm Mems Technologies, Inc.|Simultaneous light collection and illumination on an active display|
    EP2333555A1|2009-12-09|2011-06-15|Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH|Heterogener Gerinnungstest|
    EP2465941A1|2010-12-20|2012-06-20|Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH|Verfahren zur simultanen Bestimmung mehrerer Gerinnungsproteasen|
    EP2484775A1|2011-02-07|2012-08-08|Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH|Heparin-insensitives Verfahren zur Bestimmung von direkten Gerinnungsfaktorinhibitoren|
    EP2843416A1|2013-09-02|2015-03-04|Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH|Kontroll- und Kalibratormaterial für die Bestimmung von direkten Antikoagulanzien|
    EP3348649A1|2017-01-16|2018-07-18|Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH|Universales kontrollmaterial für gerinnungsfaktorinhibitor-teste|
    法律状态:
    1981-08-20| AK| Designated states|Designated state(s): AU DK JP NO US |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    CH1130/80||1980-02-12||
    CH113080||1980-02-12||AU67747/81A| AU6774781A|1980-01-08|1981-02-06|Tripeptidic derivatives and use thereof for enzyme determination|
    DK451981A| DK154221C|1980-02-12|1981-10-12|Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma|
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