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    本發明提供一種黃病毒科病毒感染之檢測方法，包括提供一生物樣本，其含有一複合物，複合物至少包含非結構性蛋白1與凝血酶二蛋白質、或非結構性蛋白1與凝血酶原二蛋白質；提供一捕獲抗體，其係結合二蛋白質其中之一；提供一檢測抗體，其係結合上述二蛋白質其中另一；以及當捕獲抗體及檢測抗體與複合物之結合後，透過檢測抗體之反應判斷結果。本發明亦提供另一種黃病毒科病毒感染之檢測方法。
    公开号:TW201321753A
    申请号:TW100142951
    申请日:2011-11-23
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Trai-Ming Yeh；Yung-Chun Chuang；Shi-Wei Lin
    申请人:Univ Nat Cheng Kung；
    IPC主号:Y02A50-00
    专利说明:
    黃病毒科病毒感染之檢測方法
    本發明係關於一種病毒感染之檢測方法，特別關於一種黃病毒科病毒感染之檢測方法。
    在我國，黃病毒科成員一直是專家擔心注意的對象，蓋因該些成員會造成腦炎、腦脊髓炎、登革熱及其他全身性感染，影響公共衛生甚鉅。
    登革病毒(Dengue virus，簡稱DENV)是屬於黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的一種病毒，又依其抗原性的不同可分為四個血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3及DENV-4。
    受到登革病毒感染會出現登革出血熱/休克症候群(Dengue hemorrhage fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)或登革熱(Dengue fever,DF)等症狀。登革出血熱/休克症候群的臨床症狀包括體液流失、血比容上升、血小板減少以及低血容性休克。雖然造成登革出血熱/休克症候群的致病機轉尚未被研究清楚，但目前已有許多證據指出這種DHF病人的出血現象是與血小板減少、凝血系統缺失、以及內皮系統病變等因素有關。
    登革病毒約含有1,100個鹼基對，依其編碼發現，主要有結構蛋白3個、鞘蛋白C(capsid protein C)、膜蛋白M(membrane protein M)、外套膜蛋白E(envelope protein E)，以及另外7個非結構蛋白(nonstructural protein，簡稱NS)：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b及NS5。又依據目前研究已知，NS1不但是登革病毒感染機轉中的重要蛋白，對於登革熱所引起的症狀如DHF等亦有密切關聯。
    NS1為一個46～50 kDa的醣基化蛋白質，由於受感染之哺乳類動物體內皆可以發現有膜聯型及分泌型的NS1蛋白，是以，在檢測病患是否受到登革病毒的感染時，偵測病患體內是否存在NS1蛋白是一個相當有效的標的。
    目前市售的登革病毒感染檢測技術或套組皆係單獨地利用NS1專一性抗體(anti-NS1 antibody)，並透過免疫方式進行檢測。然而，習知技術中不論是將病毒自患者體內分離，或是操作RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)判斷感染之病毒類型，都是極為耗時、高成本，且高度仰賴實驗室器材才能進行的檢測手段，應用範圍相當狹隘。
    除此之外，上述檢測方法還必須在條件嚴謹的環境下操作，以免稍有不慎造成汙染，影響診斷結果。更重要的是，僅單獨以NS1為檢測標的先天上就存有靈敏度不足的問題，對於感染初期或輕微感染的患者，大多無法提供高準確率之檢測結果，往往造成誤診或延誤較佳治療期間等嚴重後果。
    因此，如何針對包括登革病毒在內之黃病毒科病毒之感染，提供一種高靈敏度及高準確率檢測的檢測方法，已成為醫療與公共衛生領域的重要課題之一。
    有鑑於上述課題，本發明之目的為提供一種高靈敏度、高準確率及快速檢測黃病毒科病毒之檢測方法，特別係登革病毒之檢測方法。
    感染黃病毒科病毒之生物體或細胞中，普遍存在有非結構性蛋白1(NS1)蛋白，且經本發明實驗例證實，NS1有極高的比例會與血液中之凝血因子如凝血酶(thrombin)或凝血酶原(prothrombin)結合，因此認為以NS1與凝血酶、或NS1與凝血酶原的結合作為檢測患者之黃病毒科病毒感染的對象是為有效的手段。於是本發明係藉由NS1與凝血酶或凝血酶原結合的特性，提供一種黃病毒科病毒感染之檢測方法。
    為達上述目的，本發明提供一種黃病毒科病毒感染之檢測方法，包括提供一生物樣本，其含有一複合物，複合物至少包含非結構性蛋白1與凝血酶二蛋白質、或非結構性蛋白1與凝血酶原二蛋白質；提供一捕獲抗體(capture antibody)，其係結合二蛋白質其中之一；提供一檢測抗體(detection antibody)，其係結合二蛋白質其中另一；以及當捕獲抗體及檢測抗體與複合物結合後，透過檢測抗體之反應判斷結果。
    本發明另提供一種黃病毒科病毒感染之檢測方法，包括提供一生物樣本，其含有非結構性蛋白1；提供一凝血酶或一凝血酶原，以形成一至少包括非結構性蛋白1與凝血酶二蛋白質、或非結構性蛋白1與凝血酶原二蛋白質之複合物；提供一捕獲抗體，其係結合二蛋白質其中之一；提供一檢測抗體，其係結合二蛋白質其中另一；以及當捕獲抗體及檢測抗體與複合物結合後，透過檢測抗體之反應判斷結果。
    在本發明實施例中，非結構性蛋白1與凝血酶或非結構性蛋白1與凝血酶原係相互嵌合。
    在本發明實施例中，生物樣本係取自哺乳動物。
    在本發明實施例中，生物樣本係取自人類。
    在本發明實施例中，非結構性蛋白1係為分泌型蛋白或膜聯型蛋白。
    在本發明實施例中，捕獲抗體係為單株抗體或多株抗體。
    在本發明實施例中，檢測抗體係為單株抗體或多株抗體。
    在本發明中，所稱之「黃病毒科病毒」主要係能表現非結構性蛋白1(NS1)之病毒；較佳地，係為黃病毒屬(Flavivirus)及瘟病毒屬(pestivims)之病毒；又較佳地，係為黃病毒屬之病毒，如黃熱病毒(Yellow fever virus)或登革病毒(Dengue virus,DENV)。在一實施例中，黃病毒科病毒係為登革病毒，並包括各種血清型如DENV-1、DENV-2、DENV-3及DENV-4。
    在本發明中，所稱之生物樣本之「生物」主要係包括可被黃病毒科病毒感染之動物宿主，較佳是包括哺乳類動物如人類、猴、鼠、牛、羊、狗、貓、或豬等。在一實施例中，生物是指人類。
    在本發明中，所稱之「生物樣本」可以具有任何形式，主要係黃病毒科病毒在個體內可影響之範圍，具體包括血液、血漿、尿液、或淋巴液等，或是血液、血漿、尿液、或淋巴液流經的附近組織或細胞等。生物樣本較佳係含有能被黃病毒科病毒感染之細胞，種類則至少包含神經細胞、肌肉細胞、肝臟細胞、內皮細胞、血球細胞、或淋巴細胞；較佳地，生物樣本含有哺乳動物之內皮細胞或血球細胞。生物樣本可以為新鮮、經組織培養、或經冷藏或冷凍之樣本。再者，生物樣本可以為經過純化、離心、萃取、或濃縮等方法進一步提升NS1與凝血酶或NS1與凝血酶原二蛋白之濃度或比例者。
    綜上所述，本發明所提供之黃病毒科病毒感染之檢測方法，藉由抗體結合生物樣本中包括NS1與凝血酶或凝血酶原二蛋白之複合物，除能有效檢測出是否受到黃病毒科病毒感染外，更重要的是，相較於習知技術單獨以NS1作為檢測標的而言，本發明之檢測方法能提供更高之靈敏度及準確性。
    以下將參照相關圖式，說明依本發明提供之一種高靈敏度及高準確率檢測黃病毒科病毒之檢測方法。
    本發明提供之一種黃病毒科病毒感染之檢測方法之步驟係如圖1所示，包括提供一生物樣本，其含有一複合物，複合物至少包含非結構性蛋白1(nonstructural protein 1)與凝血酶(thrombin)二蛋白質、或非結構性蛋白1與凝血酶原(prothrombin)二蛋白質(步驟S11)；提供一捕獲抗體，其係結合二蛋白質其中之一(步驟S12)；提供一檢測抗體，其係結合二蛋白質其中另一(步驟S13)；以及當捕獲抗體及檢測抗體與複合物結合後，透過檢測抗體之反應判斷結果(步驟S14)。
    本實施例之步驟S11中，首先係自疑似受到黃病毒科病毒感染之個體中取得一生物樣本，若該個體確實受到感染，則生物樣本中含有一複合物，此複合物係至少包含二蛋白質，其可以為NS1與凝血酶，或者是為NS1與凝血酶原。在本實施例中，複合物中的兩種蛋白質係相互嵌合，也就是兩者結構上具有能相互配合或共價鍵結的部位。而在其他實施例中，兩種蛋白質亦可透過其他分子間接結合。當然，複合物可以同時包括NS1與凝血酶以及NS1與凝血酶原，且不論NS1、凝血酶、或凝血酶原的數目均無限制，彼此結合的關係亦可以為一個NS1與兩個凝血酶或凝血酶原結合，或是兩個以上之NS1與一個凝血酶或凝血酶原相互嵌合，本發明在此不限。
    在本實施例中，生物樣本係為人類血清，且同時具有多個複合物，其中部分包含NS1與凝血酶，部分包含NS1與凝血酶原。另外，需特別說明的是，NS1並不限其形式，可為一種分泌至細胞外之分泌型(secreted)蛋白或結合在宿主細胞表面之膜聯型(membrane-associated)蛋白，且NS1可為不經轉譯後修飾(Post-translational modification)或經轉譯後修飾如醣基化(glycosyation)、或磷酸化(phosphorylation)等之形式，本發明在此不限。
    接著，本實施例之檢測方法提供一捕獲抗體(capture antibody)(如圖1之步驟S12)及一檢測抗體(detection antibody)(如圖1之步驟S13)，分別與上述複合物中二蛋白質其中之一結合，也就是當複合物中包含NS1及凝血酶時，捕獲抗體會與NS1或凝血酶其中一個結合，而檢測抗體會與另一個蛋白質結合。至於複合物包含NS1及凝血酶原時亦同。
    捕獲抗體及檢測抗體可以為單株抗體或是多株抗體，在本發明實驗例中係為多株抗體。為便於檢測之操作，捕獲抗體較佳係先固定在一固體基材上，如以尼龍、聚苯乙烯(polystyrene)、聚氯乙烯(polyvinylchloride)、或硝化纖維(nitrocellulose)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)等材料所製成之基材，且基材可具有例如孔盤、管柱、或試紙等不同形式。然而，捕獲抗體與生物樣本中之複合物亦可以係在一懸浮液中結合，端視後續與複合物結合之捕獲抗體與未與複合物結合之捕獲抗體的分離方式及使用者操作便利與否作為選擇的依據，本發明在此不限。
    在本實施例中，生物樣本較佳係先與捕獲抗體接觸作用後，再加入檢測抗體進行作用。具體而言，在本實施例中，捕獲抗體為抗NS1抗體，而檢測抗體為抗凝血酶或抗凝血酶原抗體，當生物樣本加入固定有捕獲抗體之基材後，捕獲抗體先與NS1專一性地結合，而後再加入檢測抗體，以與凝血酶或凝血酶原結合。當然，本發明之捕獲抗體也可以係為抗凝血酶或抗凝血酶原抗體，而捕獲抗體係為抗NS1抗體，或是在懸浮液中操作時，可以三者同時進行結合。
    為便於後續之偵測及分析，檢測抗體較佳係另接合一具有提示功能的物質，舉例來說，可具有一接合物(conjugate)，例如可與受質反應而產生螢光或冷光之酵素，如螢火蟲螢光酶、細菌發光酶、鹼性磷酸酶、過氧化氫酶、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)、β-半乳糖苷酶、尿酸酶、或乳過氧化酶等，或螢光染料及標記物如FITC(fluorescein isothiocynate)、5-羧基螢光素(5-carboxyfluorescein)、6-羧基螢光素(6-carboxyfluorescein)、花青素(anthocyanin)、或藻紅素(phycoerythrin)、或玫瑰紅(rhodamine)等，或是用以放射線偵測之放射線同位素如H3、C11、C14、P32、S35、I123、I124、I125、I131、Tc111、或Lu177等，或是可利用結合捕獲之分子如生物素(biotin)等；在本發明實驗例中，係以HRP作為檢測抗體的接合物。而關於接合物接合至抗體及反應發光的相關技術，係為本領域具有通常知識者所能理解者，故不再贅述。然而，檢測抗體也可不具有接合物，而係藉由提供另一抗體，其能與本發明之檢測抗體專一性地結合，同時該抗體也帶有接合物以作為訊號提供者，當本發明之檢測抗體與複合物接合後，此一抗體便結合至檢測抗體上以進行分析，本發明在此不限。
    在步驟S14中，當捕獲抗體及檢測抗體與複合物結合後，可透過檢測抗體之反應判斷檢測結果。詳細而言，由於僅捕獲抗體固定於基材上，且檢測抗體係透過複合物與捕獲抗體結合，故生物樣本中若未含有檢測標的，即具有NS1與凝血酶、或NS1與凝血酶原之複合物，則在移除步驟後，就不會有可被偵測的訊號。是以，藉由訊號之有無或其強弱，可加以判別生物樣本中是否具有黃病毒科病毒之NS1蛋白，以及其含量之高低，來確認該個體是否受到黃病毒科病毒的感染。
    上述發明原理可應用於酵素連結免疫吸附法(ELISA)或點漬法(Dot blotting)，較佳係三明治酵素連結免疫吸附法(sandwich ELISA)。
    除此之外，本發明亦提供另一種黃病毒科病毒感染之檢測方法，如圖2所示，其步驟包括提供一生物樣本，其含有非結構性蛋白1(步驟S21)；提供一凝血酶或一凝血酶原，以形成一至少包括非結構性蛋白1與凝血酶二蛋白質、或非結構性蛋白1與凝血酶原二蛋白質之複合物(步驟S22)；提供一捕獲抗體，其係結合二蛋白質其中之一(步驟S23)；提供一檢測抗體，其係結合二蛋白質其中另一(步驟S24)；以及當捕獲抗體及檢測抗體與複合物結合後，透過檢測抗體之反應判斷結果(步驟S25)。
    此檢測方法與前述檢測方法大致相同，詳細說明可參考前述，但與前述方法不同的是，步驟S21中，生物樣本係包含NS1蛋白，該NS1蛋白可係為已與凝血酶或凝血酶原結合的蛋白，或尚未與凝血酶或凝血酶原結合的一獨立的蛋白。接著步驟S22中，提供相對過量之凝血酶或凝血酶原，使NS1與凝血酶或凝血酶原形成一複合物，以作為檢測標的。如此，能使得生物樣本中未接觸到體內之凝血酶或凝血酶原之NS1蛋白均有效地被檢測到，或更加強原本複合物被檢測的能力。另外，提供之凝血酶或凝血酶原可以係自生物體中所分離或純化出來的，也可以係為藉由人工合成的一功能性蛋白質，而此些技術方法係為本領域具有通常知識者所能理解者。
    以下，本發明將提供多個以登革病毒為代表的實驗例，針對本發明之一種黃病毒科病毒感染之檢測方法進行說明，並且證明本發明之檢測方法能有效提升檢測之靈敏度及準確性。 實驗例一：登革病毒之NS1蛋白能與凝血酶或凝血酶原結合
    製備重組NS1蛋白(recombinant NS1,rNS1)針對第二血清型之登革病毒(PL046病毒株)，以正向引子(forward primer)：CATATGGTGTCACTAGTATTGGTGGG及反向引子(reverse primer)：CTCGAGTCCGGCTGTGACCAAGGA放大NS1之DNA全長(full-length)序列，並接合至pET-43.1a(+)載體(Novagen,Madison,WI)中構築成一重組質體。再將此重組質體轉型(transformation)至E. coli(Rosetta菌株)中，於濃度1 mM之異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)的誘導下，使E. coli表現(His)6 tag-rNS1融合蛋白質(fusion protein)。接著，以瓊脂醣凝膠(sepharose,GE Healthcare,Sweden，以濃度500 mM之氯化鈷螯合)進行純化。最後再以BCA(bicinchoninic acid)方法(Thermo Scientific,Rockford,IL)定量rNS1蛋白濃度。上述方法之其他流程細節係為本領域具有通常知識者所能理解者，故不再贅述。 ELISA測定rNS1與凝血酶或凝血酶原之結合
    含有牛凝血酶(bovine thrombin,2 NIH units/ml)、人類凝血酶原(prothrombin,2 μg/ml)(Haematologic Technologies,VT,USA)、或控制組蛋白α-酪蛋白(α-casein,10μg/ml,sigma-Aldrich,CA,USA)的碳酸鹽/重碳酸鹽覆蓋緩衝液(carbonate/bicarbonate coating buffer,0.5 M,pH9.6)分別取50 μl覆蓋(coating)至96孔ELISA盤(GeneDireX,Las Vegas,NV)，放置於溫度4℃環境中隔夜。以含有牛血清蛋白(BSA)1%之磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)阻斷(blocked)。純化後之NS1蛋白利用ImmunoProbTM Biotinylation Kit(Sigma-Aldrich,CA,USA)進行接合生物素(biotin)，取不同濃度之NS1接合-生物素重組蛋白(biotinylated rNS1)加至孔洞中，於溫度37℃環境下作用1小時，再加入稀釋200倍之鏈抗生物素蛋白-辣根過氧化酶(steptavidin-HRP,R&D Systems,Minneapolis,MN)作用。最後以3,3’,5,5’-tetramethylbenzedine(TMB)受質進行呈色10分鐘，以濃度2N硫酸終止呈色反應，測定450 nm波長的吸光值(OD450)。
    結果如圖3所示，相較於α-酪蛋白，加有凝血酶及凝血酶原的孔洞，可測得較高的OD450數值，表示凝血酶及凝血酶原能與rNS1結合，且隨著rNS1濃度的增加，而結合上越多凝血酶及凝血酶原。故證實，rNS1能與凝血酶及凝血酶原相互結合而形成複合物。 實驗例二：本發明檢測方法檢測黃病毒科病毒感染之靈敏度試驗 受試血清
    取得80個受登革病毒感染患者之血清，其中32個患者係受DENV-2感染，48個患者係受DENV-3感染。另取得22個C型肝炎(HCV)患者及12個健康個體的血清作為對照組。 非結合態(unbound)NS1以及NS1-凝血酶複合物測定比較
    各取含有濃度為2 NIH units/ml的牛凝血酶(bovine thrombin)或作為控制組的蛋白α-酪蛋白(α-casein,10 μg/ml,sigma-Aldrich,CA,USA)的碳酸鹽/重碳酸鹽覆蓋緩衝液(carbonate/bicarbonate coating buffer,0.5 M,pH9.6)55 μl，分別加至96孔ELISA盤(GeneDireX,Las Vegas,NV)中，並放置於溫度4℃環境下至隔夜。孔盤以溶於PBS且濃度為0.25%的明膠(gelatin)於37℃進行阻斷(blocked)，反應1小時後以PBST清洗3次。
    另以本發明之檢測方法個別檢測患者血清中之NS1-凝血酶複合物。將96孔EKISA盤先覆蓋作為捕捉抗體之的兔子抗凝血酶多株抗體(rabbit anti-thrombin polyclonal antibody,GeneTex,2 μg/ml,San Antonio,TX)。接著，加入前述所使用之血清進行反應。再加入老鼠抗NS1血清(mouse anti-NS1 serum,稀釋1000倍)，清洗後加入作為檢測抗體之辣根過氧化酶接合山羊抗老鼠免疫球蛋白G抗體(HRP-conjugated goat anti mouse IgG antibody，稀釋5000倍，Zymed,San Francisco,CA)，並進行如實驗例一之呈色及判讀。
    登革患者之血清及控制組血清分別以PBST稀釋10倍後，加入孔洞中，於溫度37℃環境下作用1小時。接著，加入兔子抗NS1多株抗體(rabbit anti-NS1 polyclonal antibody，稀釋1000倍，GeneTex,San Antonio,TX)，再於37℃環境下作用1小時。其後，加入辣根過氧化酶接合山羊抗兔子免疫球蛋白G抗體(HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody，稀釋5000倍，Zymed,San Francisco,CA)反應。反應後進行清洗，之後再加入50 μl之3,3’,5,5’-tetramethylbenzedine(TMB)受質進行呈色，並以測吸光值儀器VersaMax microplate reader(Molecular Devices,Crawley,West Sussex,UK)判讀OD450數值。
    將檢測結果進行統計，當中係以健康個體的血清測得之數值取平均值±2SD(standard deviation)為閥值。圖4A為患者血清中NS1-凝血酶複合物與非結合態之NS1之檢測數據統計表。如圖4A所示，約有30%的登革患者其血清可以被測出具有非結合態之NS1蛋白，但利用本發明方法，則有78.8%的登革患者血清可測得具有NS1-凝血酶複合物，另外，僅有低於18%的患者血清無法測出非結合態之NS1蛋白以及NS1-凝血酶複合物。 本發明檢測方法與商品化套組的檢測結果比較
    另取59個登革患者之血清，以商品化套組PlateliaTM Dengue NS1 Ag ELISA(Biorad Laboratories,Marnes-La-Coquette,France)對血清中之NS1進行檢測。此套組係採三明治ELISA方法，以一單株抗體捕捉NS1進行測定。而本發明之檢測方法係如上所述。
    同時以本發明之檢測方法及商品化套組進行感染檢測及統計結果係如圖4B之統計表所示。其中，判別標準為健康個體的血清測得之數值取平均值±2SD(standard deviation)。結果顯示，在這59個患者的血清中，利用本發明方法可在約80%的登革患者血清中檢測出具有NS1-凝血酶複合物；對照商品化套組針對僅檢測出約42%的登革患者血清中具有NS1蛋白的存在可知，本發明之檢測方法相較於習知技術具有較佳之靈敏度及準確性。各圖中***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05。
    綜上所述，本發明所提供之黃病毒科病毒感染之檢測方法，藉由抗體結合生物樣本中包括NS1與凝血酶或凝血酶原二蛋白之複合物，除能有效檢測出是否受到黃病毒科病毒感染外，更重要的是，相較於習知技術單獨以NS1作為檢測標的而言，本發明之檢測方法能提供更高之靈敏度及準確性。
    以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
    S11~S14、S21~S25．．．步驟
    圖1為本發明之一黃病毒科病毒之檢測方法流程圖；
    圖2為本發明之另一黃病毒科病毒之檢測方法流程圖；
    圖3為本發明一實驗例中rNS1與凝血酶或凝血酶原結合之數據圖；
    圖4A為以本發明之檢測方法測得血清中NS1-凝血酶複合物與檢測未結合態NS1之統計表；以及
    圖4B時以本發明之檢測方法及商品化套組PlateliaTM Dengue NS1 Ag ELISA檢測登革患者血清之統計表。
    S11~S14．．．步驟
    权利要求:
    Claims (20)
    [1] 一種黃病毒科病毒感染之檢測方法，包括：提供一生物樣本，其含有一複合物，該複合物至少包含非結構性蛋白1與凝血酶二蛋白質、或非結構性蛋白1與凝血酶原二蛋白質；提供一捕獲抗體，其係結合該二蛋白質其中之一；提供一檢測抗體，其係結合該二蛋白質其中另一；以及當該捕獲抗體及該檢測抗體與該複合物之結合後，透過該檢測抗體之反應判斷結果。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，其中該非結構性蛋白1與該凝血酶或該非結構性蛋白1與該凝血酶原係相互嵌合。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，該黃病毒科病毒係為黃病毒屬。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，該黃病毒科病毒係為登革病毒。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，其中該生物樣本係取自哺乳動物。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，其中該生物樣本係取自人類。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，其中該非結構性蛋白1係為分泌型蛋白或膜聯型蛋白。
    [8] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，其中該捕獲抗體係為單株抗體或多株抗體。
    [9] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，其中該檢測抗體係為單株抗體或多株抗體。
    [10] 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法，其中該生物樣本包括血液、尿液、或淋巴液。
    [11] 一種黃病毒科病毒感染之檢測方法，包括：提供一生物樣本，其含有非結構性蛋白1；提供一凝血酶或一凝血酶原，以形成一至少包括該非結構性蛋白1與該凝血酶二蛋白質、或該非結構性蛋白1與該凝血酶原二蛋白質之複合物；提供一捕獲抗體，其係結合該二蛋白質其中之一；提供一檢測抗體，其係結合該二蛋白質其中另一；以及當該捕獲抗體及該檢測抗體與該複合物結合後，透過該檢測抗體之反應判斷結果。
    [12] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，其中該非結構性蛋白1與該凝血酶或該非結構性蛋白1與該凝血酶原係相互嵌合。
    [13] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，該黃病毒科病毒係為黃病毒屬。
    [14] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，該黃病毒科病毒係為登革病毒。
    [15] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，其中該生物樣本係取自哺乳動物。
    [16] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，其中該生物樣本係取自人類。
    [17] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，其中該非結構性蛋白1係為分泌型蛋白或膜聯型蛋白。
    [18] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，其中該捕獲抗體係為單株抗體或多株抗體。
    [19] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，其中該檢測抗體係為單株抗體或多株抗體。
    [20] 如申請專利範圍第11項所述之檢測方法，其中該生物樣本包括血液、尿液、或淋巴液。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    TWI428598B|2014-03-01|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    TW100142951A|TWI428598B|2011-11-23|2011-11-23|黃病毒科病毒感染之檢測方法|TW100142951A| TWI428598B|2011-11-23|2011-11-23|黃病毒科病毒感染之檢測方法|
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