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    本發明提供包含重組人類NaGlu蛋白質之分離混合物之組合物，其中該混合物中之大量該等NaGlu蛋白質具有增加量之磷酸化甘露糖，其使該等蛋白質有效內化至人類細胞中。本發明亦提供產生NaGlu蛋白質之該混合物之方法、用於基因轉殖及表現之載體、具有該等載體之宿主細胞及分離並純化NaGlu蛋白質之該混合物之方法。本發明另外提供治療NaGlu相關疾病之方法。
    公开号:TW201321515A
    申请号:TW101137865
    申请日:2012-10-12
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Anthony Quinn；Markley C Leavitt；Zhinan Xia；Joseph Victor Rutkowski
    申请人:Synageva Biopharma Corp；
    IPC主号:A61K38-00
    专利说明:
    重組人類NAGLU蛋白質及其用途相關申請案之交叉參考
    本申請案係關於2011年10月12日申請之美國臨時申請案第61/546,248號且主張其優先權，其全部內容係以此引用方式明確併入本文中。
    聖菲利柏氏症候群B(Sanfilippo Syndrome B)係由稱作N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶(NaGlu)之溶酶體酶中之缺陷引起之體染色體隱性溶酶體儲存症(LSD)。作為溶酶體中糖胺聚糖(GAG)之逐步分解之一部分之硫酸乙醯肝素之降解需要NaGlu。NaGlu之缺陷或不存在導致硫酸乙醯肝素之積累及尿液排泄。迄今已確定聖菲利柏氏症候群B有超過70處不同突變，其展現廣泛分子及遺傳異質性。
    約200,000名新生兒中有1名患有聖菲利柏氏症候群B且該缺陷主要表現在幼兒中。在初始無症狀期後，患有聖菲利柏氏症候群B之患者通常呈現心智發展減慢及行為問題，之後智慧逐漸衰退，從而引起嚴重的心智遲滯、癡呆及運動疾病。語言之習得緩慢且不完整。受影響嚴重之患者可早在2歲即呈現心理動作及語言發育延遲。該疾病之進展通常會增強行為障礙及睡眠障礙。儘管臨床特徵主要係神經學的，但患者經常出現腹瀉、齲齒、肝脾腫大、關節僵硬、多毛及/或粗毛且可展現凝血問題。在疾病之最後期中，患者變得不能動且反應遲鈍且出現吞嚥困難及癲癇發作。患兒之壽命通常不超過十八、九歲至二十歲出頭。
    人們已嘗試不同方法來為患者提供缺少之酶。為產生用於酶補充療法(ERT)之NaGlu，已在各種哺乳動物細胞培養系統中表現人類NaGlu。然而，與在細胞內運輸至溶酶體之天然NaGlu相反，人們發現自哺乳動物細胞產生及分泌之重組NaGlu蛋白質不含或僅含有痕量之甘露糖6-磷酸(M6P)。已知經分泌NaGlu中M6P部分之不存在或缺少可阻止其有效內化至靶細胞(例如，人類皮膚纖維母細胞)中，該等靶細胞在其質膜表面上具有M6P受體(參見，Zhao等人，Protein Expression and Purification,19：202-211(2000)；及Weber等人，Protein Expression and Purification,21：251-259(2001))。在CHO細胞中表現之經分泌小鼠NaGlu、HeLa細胞中表現之經分泌人類NaGlu、人類纖維母細胞中表現之經分泌人類NaGlu及人類胚腎(HEK)細胞系293中表現之經分泌人類NaGlu中觀察到低磷酸化程度(參見，Zhao等人，Protein Expression and Purification,19：202-211(2000)；Yogalingam等人，Biochim Biophys.Acta 1502：415-425；及Weber等人，Protein Expression and Purification,21：251-259(2001))。自哺乳動物細胞分泌之NaGlu蛋白質中N-聚糖之無或弱磷酸化已成為研發適合酶補充療法之重組人類NaGlu蛋白質之巨大障礙，此乃因上文所提及之所有嘗試皆無法產生可被靶細胞有效吸收之酶，其中內化蛋白質之濃度(若確實可檢測到)幾乎係野生型含量之千分之一(參見，Zhao等人，Protein Expression and Purification,19：202-211(2000))。迄今為止，尚未獲得經批准用於治療聖菲利柏氏症候群B之產品。
    已嘗試將哺乳動物細胞產生之具有天然胺基酸序列之重組人類NaGlu蛋白質(rhNaGlu)直接投與至NaGlu缺陷小鼠之中樞神經系統(CNS)中(例如，鞘內投與至腦脊髓液(CSF)中)，但由於蛋白質在腦室之室管膜內襯上之過度積累以及缺少有效細胞攝取必需的M6P殘基，未能顯示酶至腦中之成功生物分佈。類似地，全身投與(即，靜脈內(IV)注射)哺乳動物細胞產生之具有天然胺基酸序列之rhNaGlu亦未能顯示蛋白質至腦中之成功定位。除與高度侵入性鞘內投與相關之已知風險外，將rhNaGlu靶向腦中之該等障礙已成為獲得治療聖菲利柏氏症候群B之有效療法之極大挑戰。
    因此，業內需要提供穩定NaGlu蛋白質，其具有酶促活性且其物理性質容許該蛋白質跨越血腦障壁(BBB)且容許將該蛋白質有效內化至靶細胞之溶酶體中。業內亦需要具有高表現性及穩健蛋白質產生之平臺，其可提供有效跨越血腦障壁且有效內化至人類靶細胞中之重組人類NaGlu。
    本發明係關於包含可用於(例如)治療聖菲利柏氏症候群B之療法中之重組人類NaGlu蛋白質(rhNaGlu)之組合物。本發明係基於以下令人驚訝之意外發現：本文所述rhNaGlu具有一或多種糖基化模式，該等模式容許rhNaGlu有效跨越血腦障壁(BBB)且吸收至缺陷該酶之動物之中樞神經系統(CNS)內之細胞中，從而顯著增強腦中之α-N-乙醯基葡萄糖胺酶活性且降低受質含量。此外，本文所述rhNaGlu可有效吸收至哺乳動物細胞(例如，人類細胞)中，從而使得與自未經設計以產生特異性糖基化之未修飾哺乳動物細胞產生並分泌之NaGlu蛋白質相比增強酶活性。促進NaGlu蛋白質之細胞攝取亦因使對增加劑量之數量及頻率的需要降至最低，且由此顯著降低免疫原性之潛在風險而有益於用於對患有聖菲利柏氏症候群B之人類患者之酶補充療法。
    本文所述rhNaGlu蛋白質含有足量寡糖(例如，甘露糖及磷酸化甘露糖(即，M6P))以容許經由甘露糖及/或M6P受體介導之胞吞作用進行有效細胞攝取且正確靶向至人類細胞中。在一實施例中，rhNaGlu含有至少1莫耳蛋白質，例如1、2、3、4、5或6莫耳M6P/莫耳蛋白質。在一實施例中，rhNaGlu可內化至NaGlu缺陷人類細胞中，從而使得內化蛋白質完全(100%或更高)恢復NaGlu缺陷細胞中NaGlu活性之正常程度(即，野生型程度)。
    本文亦揭示產生表現受益於甘露糖磷酸化之rhNaGlu之轉基因禽類之方法。具體而言，在輸卵管細胞中表現rhNaGlu蛋白質，將其分泌至輸卵管管腔中且將蛋白質貯存至卵白中之轉基因禽類。本發明亦包括含有該rhNaGlu之禽類卵。
    本發明亦涵蓋含有編碼rhNaGlu之轉基因之載體及宿主細胞以及欲用於該rhNaGlu治療聖菲利柏氏症候群B之應用中之包含rhNaGlu之醫藥組合物。
    在一態樣中，本發明提供包含重組人類N-乙醯基-α-D-葡萄糖胺酶(rhNaGlu)之分離混合物之組合物，該rhNaGlu包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列24-743，其中該混合物中至少10%之rhNaGlu包含至少一種具有甘露糖-6-磷酸(M6P)之聚糖結構。在一實施例中，具有M6P之rhNaGlu能被吸收至NaGlu缺陷之哺乳動物細胞中，從而使得內化rhNaGlu恢復在相同類型之野生型哺乳動物細胞中觀察到之正常NaGlu活性之至少50%、60%、70%、80%、90%或100%。在另一實施例中，聚糖結構係N-連接聚糖。
    在一實施例中，rhNaGlu含有至少1莫耳M6P/莫耳蛋白質。在另一實施例中，rhNaGlu含有介於約1與約6莫耳之間之M6P/莫耳蛋白質。在另一實施例中，rhNaGlu含有約2莫耳M6P/莫耳蛋白質。在另一實施例中，rhNaGlu含有約3莫耳M6P/莫耳蛋白質。在另一實施例中，rhNaGlu含有約4莫耳M6P/莫耳蛋白質。在另一實施例中，rhNaGlu含有約5莫耳M6P/莫耳蛋白質。在另一實施例中，rhNaGlu含有約6莫耳M6P/莫耳蛋白質。
    在一實施例中，NaGlu缺陷之哺乳動物細胞係人類細胞。在另一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係皮膚纖維母細胞、肝細胞或巨噬細胞。在一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係神經元細胞。
    在一實施例中，rhNaGlu在全身投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。在一特定實施例中，rhNaGlu在靜脈內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。在一實施例中，rhNaGlu在鞘內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    在一實施例中，具有M6P之rhNaGlu由NaGlu缺陷細胞內化且恢復活體內正常NaGlu活性之至少100%。在一實施例中，具有M6P之rhNaGlu含有至少25莫耳甘露糖/莫耳蛋白質。
    在一實施例中，混合物中至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%之rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少20%之rhNaGlu含有至少一個M6P。在另一實施例中，混合物中至少30%之rhNaGlu含有至少一個M6P。在另一實施例中，混合物中至少40%之rhNaGlu含有至少一個M6P。在另一實施例中，混合物中至少50%之rhNaGlu含有至少一個M6P。在另一實施例中，混合物中至少60%之rhNaGlu含有至少一個M6P。
    在另一態樣中，本發明提供包含重組人類N-乙醯基-α-D-葡萄糖胺酶(rhNaGlu)之分離混合物之組合物，該rhNaGlu包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列24-743，其中該混合物包含足量含有一或多種包含甘露糖-6-磷酸(M6P)之聚糖結構之rhNaGlu，從而使得含有M6P之rhNaGlu經由M6P受體介導之胞吞作用內化至具有NaGlu缺陷之哺乳動物細胞中且恢復在表現內源NaGlu之相同類型之野生型細胞中觀察到之NaGlu活性的至少50%。在一實施例中，rhNaGlu經N-連接糖基化。在另一實施例中，rhNaGlu經O-連接糖基化。
    在一實施例中，rhNaGlu包含至少1莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。在另一實施例中，rhNaGlu包含約1、2、3、4、5或6莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。在另一實施例中，rhNaGlu包含約3莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。在另一實施例中，rhNaGlu包含約4莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。
    在一實施例中，rhNaGlu包含甘露糖。在另一實施例中，rhNaGlu包含N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)。在另一實施例中，rhNaGlu包含半乳糖。在另一實施例中，rhNaGlu包含N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。在另一實施例中，rhNaGlu不含岩藻糖。在另一實施例中，rhNaGlu不含葡萄糖。在一實施例中，rhNaGlu恢復正常NaGlu酶活性之至少60%、70%、80%、90%、95%或100%。
    在另一實施例中，rhNaGlu在全身投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。在一實施例中，rhNaGlu在靜脈內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。在另一實施例中，rhNaGlu在鞘內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    在一實施例中，NaGlu缺陷之哺乳動物細胞係人類細胞。在另一實施例中，人類細胞係皮膚纖維母細胞、肝細胞或巨噬細胞。在一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係神經元細胞。
    在一實施例中，rhNaGlu係包含第二部分之融合蛋白。在一實施例中，第二部分係多肽。在另一實施例中，多肽選自由以下組成之群：運鐵蛋白受體配體(TfRL)、胰島素樣生長因數受體(IGF2R)配體、低密度脂蛋白(LDL)受體配體及酸性胺基酸(AAA)殘基。
    在一實施例中，rhNaGlu係自轉基因禽類產生。在一實施例中，轉基因禽類係雞、火雞、鴨或鵪鶉。在一實施例中，轉基因禽類係雞。在一實施例中，rhNaGlu係自輸卵管細胞產生。
    在另一態樣中，本發明提供包含分離重組人類N-乙醯基-α-D-葡萄糖胺酶(rhNaGlu)之組合物，該rhNaGlu包含一或多種具有足量甘露糖-6-磷酸(M6P)之聚糖結構，此容許rhNaGlu經由M6P受體介導之胞吞作用內化至具有NaGlu缺陷之哺乳動物細胞中，從而使得在活體內內化時，rhNaGlu恢復在表現內源NaGlu之相同類型之野生型細胞中觀察到之NaGlu活性的至少50%。
    在一實施例中，rhNaGlu蛋白質經N-連接糖基化。在另一實施例中，rhNaGlu蛋白質經O-連接糖基化。在一實施例中，rhNaGlu包含約2、3、4、5或6莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。
    在一實施例中，rhNaGlu在全身投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。在另一實施例中，rhNaGlu在靜脈內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。在另一實施例中，rhNaGlu在鞘內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    在另一態樣中，本發明提供包含轉基因之轉基因禽類，該轉基因含有與編碼重組人類NaGlu(rhNaGlu)之核酸序列可操作連接之啟動子，其中該轉基因含於該轉基因禽類之基因組中且在輸卵管細胞中表現，從而使得rhNaGlu在轉基因禽類之輸卵管細胞中糖基化，分泌至輸卵管管腔中且貯存於轉基因禽類卵之卵白中。
    在一實施例中，rhNaGlu包含約2、3、4或6莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。在另一實施例中，啟動子組件係輸卵管特異性啟動子。在另一實施例中，輸卵管特異性啟動子係卵白蛋白啟動子。在另一實施例中，轉基因禽類選自由以下組成之群：雞、火雞、鴨及鵪鶉。
    在另一態樣中，本發明提供由本發明轉基因禽類生產之卵。
    在另一態樣中，本發明提供產生重組人類NaGlu(rhNaGlu)之方法，其包含：a)產生包含轉基因之轉基因禽類，該轉基因具有與編碼SEQ ID NO：1之24-743中所述rhNaGlu之核酸序列可操作連接之啟動子組件，其中該轉基因含於該轉基因禽類之基因組中且在輸卵管細胞中表現，從而使得rhNaGlu在該轉基因禽類之輸卵管細胞中糖基化，分泌至輸卵管管腔中且貯存於該轉基因禽類所產卵之卵白中；及b)自卵白分離rhNaGlu。
    在一實施例中，啟動子組件係輸卵管特異性啟動子。在另一實施例中，輸卵管特異性啟動子係卵白蛋白啟動子。在一實施例中，禽類選自由以下組成之群：雞、火雞、鴨及鵪鶉。在一實施例中，禽類係雞。
    在另一態樣中，本發明提供包含編碼人類NaGlu且與卵白蛋白啟動子可操作連接之核苷酸序列之載體。在另一態樣中，本發明提供包含本發明載體之宿主細胞。在另一態樣中，本發明提供包含SEQ ID NO：4中5232-10248之核酸序列之分離核酸。
    在一態樣中，本發明提供包含本發明組合物與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合之醫藥調配物。
    在另一態樣中，本發明提供包含重組人類NaGlu蛋白質之組合物，該重組人類NaGlu蛋白質在靜脈內投與時跨越具有NaGlu缺陷之哺乳動物之血腦障壁。
    在另一態樣中，本發明提供治療具有NaGlu缺陷之個體之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本發明組合物。
    在另一態樣中，本發明提供將重組人類NaGlu蛋白質遞送至具有NaGlu缺陷之個體腦中之方法，該方法包含將重組人類NaGlu蛋白質靜脈內投與該個體。
    在另一態樣中，本發明提供將重組人類NaGlu蛋白質以治療有效量自循環運輸跨越血腦障壁之方法，該方法包含將重組人類NaGlu蛋白質靜脈內投與具有NaGlu缺陷之個體。
    在一實施例中，NaGlu缺陷係聖菲利柏氏症候群B。在另一實施例中，個體係人類。
    在另一實施例中，將重組人類NaGlu蛋白質以約0.5至約50 mg/kg體重之劑量靜脈內投與個體。在另一實施例中，將重組人類NaGlu蛋白質以約1至約30 mg/kg體重之劑量靜脈內投與個體。在另一實施例中，將重組人類NaGlu蛋白質以約6至約27 mg/kg體重之劑量靜脈內投與個體。
    在另一實施例中，將重組人類NaGlu蛋白質鞘內投與個體。在一實施例中，重組人類NaGlu蛋白質係以至少約0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9 mg/kg體重之劑量鞘內投與。在另一實施例中，重組人類NaGlu蛋白質係以約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg體重之劑量鞘內投與。在另一實施例中，重組人類NaGlu蛋白質係以約10至約30 mg/kg體重之劑量鞘內投與。
    在另一實施例中，治療有效量係有效降低個體腦、腎或肝中之硫酸乙醯肝素含量之量。在另一實施例中，治療有效量係有效增強個體腦或肝中之NaGlu活性之量。
    在另一實施例中，該方法進一步包含投與第二治療劑。在一實施例中，第二治療劑係免疫抑制劑。
    本發明提供包含重組人類NaGlu蛋白質(rhNaGlu)之組合物，其可用於(例如)治療NaGlu相關疾病(例如，聖菲利柏氏症候群B)之療法中。本發明係基於以下發現：本文所述rhNaGlu蛋白質含有足量寡糖(例如，甘露糖及磷酸化甘露糖(即，M6P))以容許經由甘露糖及/或M6P受體介導之胞吞作用進行有效細胞攝取且正確靶向至人類細胞中。由於本發明rhNaGlu更有效地吸收至人類細胞中，本發明rhNaGlu展現與自未經設計以產生特異性糖基化之未修飾哺乳動物細胞產生並分泌之NaGlu蛋白質相比增強之酶活性。另外，本文所述rhNaGlu具有一或多種糖基化模式，其容許rhNaGlu在靜脈內投與時有效跨越血腦障壁(BBB)。本發明rhNaGlu蛋白質之增強之細胞攝取可使對量大且頻繁的投藥的需要降至最低，由此顯著降低免疫原性之潛在風險。
    本文所用一些定義及縮寫包括以下內容：aa，胺基酸；bp，鹼基對；CDS，編碼序列；cDNA，與RNA互補之DNA；GalNac，N-乙醯基半乳糖胺；Gal，半乳糖；GlcNac，N-乙醯基葡萄糖胺；nt，核苷酸；kb，1,000個鹼基對；μg，微克；mL，毫升；ng，奈克；及nt，核苷酸。
    本文中闡述某些定義以闡釋並界定用於在本文中描述本發明之各個術語之含義及範圍。
    本文所用術語「禽類」係指分類種類鳥(ava)之生物體之任何物種、亞種或品系，例如(但不限於)雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀、鷹、鴉及平胸鳥(包括鴕鳥、鴯鶓及鶴駝)。該術語包括原雞(Gallus gallus)或雞之各種已知品系(例如，白色來亨雞(White Leghorn)、棕色來亨雞(Brown Leghorn)、棒岩雞(Barred-Rock)、蘇賽克斯雞(Sussex)、新罕布夏雞(New Hampshire)、洛島雞(Rhode Island)、澳洲黑雞(Ausstralorp)、米諾卡雞(Minorca)、艾姆洛克雞(Amrox)、加州灰雞(California Gray)、義大利鷓鴣彩雞(Italian Partridge-colored))以及以下之品系：火雞、雉、鵪鶉、鴨、鴕鳥及其他一般以工業規模飼養之家禽。
    片語「基於...」及「源自...」通常意指完全或部分得自...。舉例而言，反轉錄病毒載體基於或源自特定反轉錄病毒或基於特定反轉錄病毒之核苷酸序列意指，該反轉錄病毒載體之基因組含有該特定反轉錄病毒之基因組核苷酸序列中之大部分。該大部分可為特定基因或核苷酸序列，例如編碼gag、pol及/或env蛋白之核苷酸序列或病毒基因組之其他結構性或功能性核苷酸序列，例如編碼長末端重複序列(LTR)之序列或可為實質上完整的反轉錄病毒基因組(例如反轉錄病毒基因組之大部分(例如，超過60%或超過70%或超過80%或超過90%)或全部)之序列，如根據熟習此項技術者之知識自說明書上下文可瞭解。基於或源自反轉錄病毒之反轉錄病毒載體之實例係源自禽類白血病反轉錄病毒(「ALV」)之NL反轉錄病毒載體(例如，NLB)，如Cosset等人，Journal of Virology(1991)第65卷，第3388-3394頁中所揭示。
    本文所用術語「編碼序列」及「編碼區」係指編碼用於合成RNA、蛋白質或RNA或蛋白質之任一部分之遺傳資訊之核苷酸序列及核酸序列(包括RNA及DNA二者)。
    並非特定生物體基因組之天然部分或在該生物體基因組中之非天然位點引入之核苷酸序列稱作「外來」核苷酸序列、「異源」核苷酸序列、「重組」核苷酸序列或「外源」核苷酸序列。另外，已分離且之後再次引入相同類型(例如，相同物種)生物體中之核苷酸序列並不視為特定生物體基因組之天然部分且因此視為外源或異源的。「異源蛋白質」或「外源蛋白質」可係由外來、異源或外源核苷酸序列編碼之蛋白質且因此通常並非在宿主生物體細胞中天然表現。
    本文所用涉及核酸(例如DNA及RNA)之術語「外源」、「異源」及「外來」可互換使用且係指並非作為染色體、基因組或細胞之一部分天然存在之核酸，其中其存在或被發現之位置及/或數量不同於其在自然界中存在之位置及/或數量。其可係基因組、染色體或細胞之非內源核酸，且已自外源引入該基因組、染色體或細胞中。異源DNA之實例包括(但不限於)編碼所關注基因產物之DNA，例如用於產生所編碼蛋白質之DNA。異源DNA之實例包括(但不限於)編碼可追蹤標記蛋白質之DNA、編碼治療性蛋白質之DNA。術語「異源」及「外源」可係指諸如核酸或蛋白質等生物分子，其通常並非發現於生物體所產生之某一細胞、組織或物質中，或通常並非以與所發現天然存在相同之數量或位置發現於生物體所產生之某一細胞、組織或物質中。舉例而言，卵之異源或外源蛋白質係通常並非發現於卵中之蛋白質。
    本文所用術語「構築體」係指已自一個以上已自天然來源分離或已化學合成或其組合之核苷酸序列區段組裝之線形或環形核苷酸序列(例如DNA)。
    本文所用術語「互補」係指兩個可與彼此形成特殊相互作用之核酸分子。在特殊相互作用中，在兩個核酸鏈呈相反極性時，一個核酸鏈內之腺嘌呤鹼基可與另一核酸鏈內之胸腺嘧啶形成兩個氫鍵。同樣在特殊相互作用中，在兩個核酸鏈呈相反極性時，一個核酸鏈內之鳥嘌呤鹼基可與另一核酸鏈內之胞嘧啶形成三個氫鍵。本文中所提及之互補核酸可進一步包含經修飾鹼基，其中經修飾腺嘌呤可與胸腺嘧啶或經修飾胸腺嘧啶形成氫鍵，且經修飾胞嘧啶可與鳥嘌呤或經修飾鳥嘌呤形成氫鍵。
    本文所用術語「經表現」或「表現」係指轉錄編碼序列以產生與編碼序列之兩個核酸鏈中一者之區域至少部分互補之RNA分子。本文所用術語「經表現」或「表現」亦可係指轉譯mRNA以產生蛋白質或肽。
    本文所用術語「表現載體」係指包含與編碼至少一種多肽之核苷酸序列可操作連接之基因表現控制區(例如啟動子或啟動子組件)之核酸載體。
    本文所用術語「片段」可係指(例如)核酸中長至少約10、20、50、75、100、150、200、250、300、500、1000、2000、5000、6,000、8,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000或60,000個核苷酸之部分，其係以人工方式(例如，藉由化學合成或藉由使用限制內切酶或機械剪切將天然產物裂解為多個碎片)或酶促方式(例如，藉由PCR或業內已知之任何其他聚合技術)來構築；或藉由熟習此項技術者已知之重組核酸技術在宿主細胞中表現。本文所用術語「片段」亦可係指(例如)比NaGlu之全長胺基酸序列(即，SEQ ID NO：1之胺基酸序列24-743)短至少約5、10、15、20、25、30、40或50個胺基酸殘基之部分，該部分係藉由至少一種蛋白酶之蛋白分解裂解自天然胺基酸序列所裂解，或係藉由化學方法或使用熟習此項技術者已知之重組DNA技術(例如，自編碼天然胺基酸序列之核苷酸序列之一部分表現)合成之天然胺基酸序列之一部分。「片段」亦可係指(例如)特定核苷酸序列或胺基酸序列之約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或約99%之部分。
    「功能性部分」與「功能性片段」可互換使用且在用於本文中時意指整體中能完全或部分實施該整體之功能之部分或片段。舉例而言，分子之生物功能性部分意指分子中實施整體或完整分子之生物功能之部分。功能性部分可具有任一可用大小。舉例而言，功能性片段之大小可在約20個鹼基之長度至等於指定序列之全長減去一個核苷酸之長度之範圍內。在另一實例中，功能性片段之大小可在約50個鹼基之長度至等於指定序列之全長減去一個核苷酸之長度之範圍內。在另一實例中，功能性片段之大小可在約50個鹼基之長度至約20 kb之長度之範圍內。在另一實例中，功能性片段之大小可在約500個鹼基之長度至約20 kb之長度之範圍內。在另一實例中，功能性片段之大小可在約1 kb之長度至約20 kb之長度之範圍內。在另一實例中，功能性片段之大小可在約0.1 kb之長度至約10 kb之長度之範圍內。在另一實例中，功能性片段之大小可在約20個鹼基kb之長度至約10 kb之長度之範圍內。
    術語「完全轉基因」或「種系轉基因」係指諸如禽類等動物在其基本上所有細胞中皆含有至少一個轉基因拷貝。
    本文所用術語「基因表現控制區」係指與編碼序列相關且完全或部分調節編碼序列之表現(例如完全或部分調節編碼序列之轉錄)之核苷酸序列。基因表現控制區可自天然來源分離或可經化學合成且可將其納入核酸載體以使得能在適當細胞中調節轉錄。「基因表現控制區」可位於核酸序列中在可轉錄為mRNA之編碼序列末端之5'區域中之區域之前，但不限於位於其之前。
    本文所用「宿主細胞」係指具有使用重組DNA技術構築且編碼至少一種異源基因之載體之細胞。
    本文所用術語「分離核酸」涵蓋(例如)(a)DNA，其具有天然基因組分子中一部分之序列，但並未側接與天然存在其之物種之基因組中該分子之該部分側接之序列中之至少一者；(b)核酸，其已納入載體中或納入原核生物或真核生物之基因組DNA中且納入方式使所得載體或基因組DNA與自其獲得該核酸之天然DNA不一致；(c)單獨分子，例如cDNA、基因組片段、藉由聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)或化學合成產生之片段或限制性片段；(d)重組核苷酸序列，其係雜種基因(即編碼融合蛋白之基因)之一部分，及(e)重組核苷酸序列，其係非天然雜種序列之一部分。本發明之分離核酸分子可包括(例如)天然等位基因變體以及藉由核苷酸缺失、插入、倒位或取代修飾之核酸分子。
    本文所用術語「核酸」係指核苷酸及核苷之任何線性或連續陣列，例如cDNA、基因組DNA、mRNA、tRNA、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。為便於論述，非天然核酸在本文中可稱作構築體。核酸可包括細菌質粒載體，包括表現、選殖、黏粒及轉化載體，例如動物病毒載體，例如(但不限於)經修飾腺病毒、流感病毒、小兒麻痺病毒、痘病毒、反轉錄病毒(例如禽類白血病病毒(ALV)反轉錄病毒載體、鼠類白血病病毒(MLV)反轉錄病毒載體及慢病毒載體)及諸如此類及其片段。另外，核酸可係禽類白血病病毒(ALV)反轉錄病毒載體、鼠類白血病病毒(MLV)反轉錄病毒載體或慢病毒載體之LTR及其片段。核酸亦可包括NL載體(例如NLB、NLD及NLA及其片段)及合成寡核苷酸(例如化學合成之DNA或RNA)。核酸可包括經修飾或經衍生之核苷酸及核苷，例如(但不限於)鹵化核苷酸(例如(但不僅係)5-溴尿嘧啶)及經衍生核苷酸(例如經生物素標記之核苷酸)。
    本文所用術語「聚糖」、「聚糖結構」、「聚糖部分」、「寡糖」、「寡糖結構」、「糖基化模式」、「糖基化譜」及「糖基化結構」具有基本上相同之含義且各自係指一或多種自糖殘基形成且附接至糖基化蛋白質(例如人類NaGlu)之結構。舉例而言，「N-聚糖」或「N-連接聚糖」係指附接至糖基化蛋白質之天冬醯胺或精胺酸側鏈中之氮之聚糖結構。「O-聚糖」或「O-連接聚糖」係指附接至糖基化蛋白質之絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、羥離胺酸或羥脯胺酸側鏈中之羥基氧之聚糖結構。
    本文所用術語「載體」及「核酸載體」係指天然或合成之單鏈或雙鏈質粒或病毒核酸分子，可將其轉染或轉化至細胞中並獨立於宿主細胞基因組複製或在宿主細胞基因組內複製。環形雙鏈載體可藉由基於該載體之核苷酸序列用適當限制酶處理來線性化。如業內所理解，可藉由用限制酶切割載體並將所需碎片連接在一起來將核酸插入載體中。典型載體可包括以下以適當距離可操作連接之元件以容許功能性基因表現：複製起點、啟動子、增強子、5' mRNA前導序列、核糖體結合位點、核酸盒、終止及多腺苷酸化位點及可選標記序列。在具體應用中，可省略該等元件中之一或多者。核酸盒可包括限制位點以供插入欲表現之核酸序列。在功能性載體中，核酸盒含有欲表現之核酸序列，包括轉譯起始及終止位點。內含子可視情況包括於構築體中，例如位於編碼序列之5'處。構築載體以使得特定編碼序列定位於具有適當調節序列之載體中，編碼序列相對於控制序列之位置及取向應使得編碼序列係在控制或調節序列之「控制」下轉錄。可能期望修飾編碼所關注特定蛋白質之序列以達成此目的。舉例而言，在一些情形中，可能需要修飾序列以使得可將其以適當取向附接至控制序列，或可能需要維持讀框。可將控制序列及其他調節序列在插入載體之前連接至編碼序列。或者，可將編碼序列直接選殖至已含有控制序列及適當限制位點之表現載體中，該限制位點位於具有控制序列之調節控制或處於該控制下之讀框中。
    術語「可操作連接」係指如此闡述之組件經組態以實施其常用功能之元件排列。可操作連接至編碼序列之基因表現控制區或啟動子(例如，啟動子組件)能實現編碼序列之表現。控制序列或啟動子不需要與編碼序列鄰接，只要其發揮引導該編碼序列之表現之功能即可。因此，例如，在啟動子序列與編碼序列之間可存在雖然轉錄但不轉譯之間插序列，且啟動子序列仍可視為「可操作連接」至編碼序列。
    本文所用「過表現」係指基因產物在轉基因生物體中之產量超過了在正常或非轉化生物體中之產量。
    術語「輸卵管」或「輸卵管組織」係指禽類輸卵管組織，例如膨大部，例如管狀腺細胞，其中產生具有N-連接寡糖之蛋白質，該等N-連接寡糖含有相對於在禽類其他組織(例如肝或腎組織)中產生之蛋白質增加量之甘露糖及甘露糖-6-磷酸(M6P)以及顯著減少量之半乳糖及/或唾液酸。
    本文所用術語「輸卵管特異性啟動子」係指啟動子及啟動子組件，其很大程度上、例如主要(即，在動物中藉由特定啟動子類型產生之轉錄產物，超過50%係在輸卵管細胞中產生)或僅在鳥之輸卵管細胞中發揮功能(即提供編碼序列之轉錄)。輸卵管特異性啟動子之實例包括(但不限於)卵白蛋白啟動子、類卵黏蛋白啟動子、卵抑制劑啟動子、溶菌酶啟動子及卵運鐵蛋白啟動子以及該等啟動子之功能性部分(例如啟動子組件)。藉由使用輸卵管特異性啟動子將NaGlu蛋白質之表現限制於膨大部，可使由於該等酶在鳥之其他組織中之表現而對鳥有害之生理效應降至最低。
    術語「序列一致性百分比」、「一致性百分比」、「一致性%」、「序列同源性百分比」、「同源性百分比」、「同源性%」及「序列相似性百分比」可各自係指兩個核酸序列或兩個胺基酸序列之間序列匹配之程度。該序列匹配可使用Karlin及Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：2264-2268之演算法來測定，如在Karlin及Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：5873-5877中所修改。此一演算法納入Altschul等人(1990)T.Mol.Biol.Q15：403-410之NBLAST及XBLAST程式中。使用NBLAST程式實施BLAST核苷酸搜索(得分=100，字長=12)，以獲得與本發明核酸分子同源之核苷酸序列。使用XBLAST程式實施BLAST蛋白質搜索(得分=50，字長=3)，以獲得與參照胺基酸序列同源之胺基酸序列。為獲得加空位比對用於比較目的，如Altschul等人(1997)Nucl.Acids Res.25：3389-3402所述利用加空位BLAST。在利用BLAST及加空位BLAST程式時，使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之內定參數。其他演算法、程式及內定設置亦可能適宜，例如(但不僅係)英國人類基因組測序計劃資源中心(U.K.Human Genome Mapping Project Resource Centre)之GCG序列分析包，其包括用於核苷酸或胺基酸序列比較之程式。一序列可與另一序列(例如本文所鑑別之NaGlu蛋白質序列)具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性。
    術語「禽類源」係指由鳥、家禽或禽類產生或自其獲得之組合物或物質。「禽類」係指可作為家畜飼養之鳥，包括(但不限於)雞、鴨、火雞、鵪鶉及平胸鳥。舉例而言，「禽類源」可係指雞源、火雞源及/或鵪鶉源。
    術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」、「核苷酸序列」及「核酸序列」在本文中可互換使用且包括(但不限於)編碼序列，即在處於適當調節或控制序列之控制下時在活體外或活體內轉錄並轉譯為多肽之多核苷酸或核酸序列；控制序列，例如轉譯起始及終止密碼子、啟動子序列、核糖體結合位點、多腺苷酸化信號、轉錄因數結合位點、轉錄終止序列、上游及下游調節結構域、增強子、沉默子、與轉錄因數結合並正向(誘導)或負向(抑制)改變基因啟動子之活性之DNA序列及諸如此類。本文所述該等術語不表示對長度或對合成起點之限制。
    本文所用術語「多肽」及「蛋白質」係指胺基酸(例如三個或更多個胺基酸)經由肽鍵連接之呈連續陣列之聚合物。術語「多肽」包括蛋白質、蛋白質片段、蛋白質類似物、寡肽及諸如此類。術語「多肽」包括如上文所定義由核酸編碼、經由重組技術(例如，自轉基因鳥分離)產生或經合成之多肽。術語「多肽」進一步涵蓋如上文所定義包括經化學修飾胺基酸或共價或非共價連接至標記配體之胺基酸之多肽。
    本文所用術語「啟動子」係指可用於在禽類細胞中藉由RNA聚合酶起始轉錄之DNA序列。「啟動子組件」係可自身或與其他DNA序列組合實現或促進轉錄之DNA序列。啟動子組件可係啟動子之功能性片段。
    本文所用術語「重組核酸」及「重組DNA」係指至少兩個核酸序列之組合，其並非天然發現於真核或原核細胞中。核酸序列可包括(但不限於)核酸載體、基因表現調節元件、複製起點、在表現時賦予抗生素抗性之適宜基因序列、蛋白質編碼序列及諸如此類。術語「重組多肽」意欲包括藉由重組DNA技術產生而使得其位置、純度或結構與天然多肽不同之多肽。一般而言，此一重組多肽將以與通常在自然界中所觀察到者不同之量存於細胞中。
    本文所用術語「調節」序列或元件包括啟動子、增強子、終止子、終止密碼子及其他可控制基因表現之元件。
    「反轉錄病毒」、「反轉錄病毒顆粒」、「轉導性顆粒」或「轉導顆粒」係指能將非病毒DNA或RNA轉導至細胞中之複製缺陷或複製勝任病毒。
    「SIN載體」係指自滅活載體。具體而言，SIN載體係反轉錄病毒載體，其具有經改變基因組以使得在整合至靶細胞(例如，禽類胚細胞)之基因組DNA後，經整合反轉錄病毒載體之5' LTR將不發揮啟動子功能。舉例而言，反轉錄病毒載體中在整合後形成反轉錄病毒載體5' LTR之U3區域之核苷酸序列之一部分或全部可缺失或改變以降低或消除5' LTR之啟動子活性。在某些實例中，如業內所理解，自5' LTR之U3缺失CAAT盒及/或TAATA盒可產生SIN載體。
    本文所用術語「有義鏈」係指基因組DNA中可轉錄為RNA並轉譯為基因之天然多肽產物之單鏈DNA分子。本文所用術語「反義鏈」係指基因組DNA中與基因之有義鏈互補之單鏈DNA分子。
    「治療性蛋白質」或「醫藥蛋白質」係完全或部分構成藥物之物質。具體而言，「治療性蛋白質」及「醫藥蛋白質」包括完全或部分構成藥物之胺基酸序列。
    本文所用術語「啟動子」、「轉錄調節序列」及「啟動子組件」係指調節編碼序列之轉錄表現之核苷酸。實例性轉錄調節序列包括增強子元件、激素反應元件、類固醇反應元件、負向調節元件及諸如此類。可分離「轉錄調節序列」並將其納入載體中以容許在適當細胞中調節載體DNA之部分之轉錄。「轉錄調節序列」可位於核酸序列中在轉錄為mRNA之蛋白質編碼序列末端之5'區域中之區域之前，但不限於位於其之前。轉錄調節序列亦可位於蛋白質編碼區內，例如位於基因中鑑別為「內含子」區域之區域中。
    本文所用術語「轉化」及「轉染」係指將核酸插入宿主之過程。熟習此項技術者熟知多種技術可促進將核酸轉化或轉染至原核或真核生物體中。該等方法涉及多種技術，例如用某些濃度之鹽(例如(但不限於)鈣鹽或鎂鹽)處理細胞，或使細胞暴露於電場、清潔劑或脂質體材料中，從而使宿主細胞勝任攝取核酸分子。
    本文所用「轉基因動物」係任何非人類動物，例如禽類物種，包括雞，其中該動物之一或多個細胞含有藉助人類幹預(例如藉由業內已知之轉基因技術(例如，參見2007年10月18日公開之美國專利公開案第2007/0243165號，其揭示內容係全文以引用方式併入本文中)，包括彼等本文所揭示者)引入之異源核酸。核酸係藉由藉助謹慎的遺傳操作引入細胞(例如，卵或胚細胞)來直接或間接引入動物中，例如藉由顯微注射或藉由用重組病毒感染來引入。術語遺傳操作不包括傳統雜交配種或活體外受精，而是涉及引入重組DNA分子。此分子可在染色體內整合，或其可在染色體外複製DNA。在典型轉基因動物中，轉基因可使細胞表現重組形式之靶蛋白或多肽。本文所用術語「嵌合動物」或「鑲嵌動物」係指在動物之一些但並非所有細胞中發現轉基因或表現重組核苷酸序列之動物。種系嵌合動物在其生殖細胞中含有轉基因且可產生後代轉基因動物，其中後代之大部分或所有細胞皆將含有該轉基因。
    本文所用術語「轉基因」意指核酸序列(例如，編碼人類NaGlu蛋白質)，其對引入其之動物或細胞係部分或完全異源(即外來)，或對引入其之轉基因動物或細胞之內源基因係部分或完全同源，但其經設計以可改變插入其之生物體基因組之方式插入(或已插入)動物或細胞基因組中(例如，將其插入不同於天然基因之位置或其插入導致剔除)。
    本文所用術語「酶補充療法(ERT)」係指藉由向個體投與缺少之酶來矯正個體之酶缺陷之治療策略。為使溶酶體酶補充療法有效，必須將治療性酶遞送至表現儲存缺陷之組織之適當細胞中之溶酶體中。在一實施例中，可將酶靜脈內、鞘內、大腦內、室內或實質內投與個體。在一實施例中，酶能跨越血腦障壁(BBB)。不欲受限於機制，人們相信，在血液灌注患者組織時，酶被細胞吸收且運輸至溶酶體，其中該酶用於消除溶酶體中因酶缺陷而積累之物質。 I. NaGlu之組合物
    本發明提供具有賦予增強之細胞攝取及增強之亞細胞活性之糖基化模式的重組人類NaGlu(rhNaGlu或NaGlu)(SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列24-743)之新穎組合物，該等組合物尤其可用於(例如)治療聖菲利柏氏症候群B(黏多糖貯積症(MPS)IIIB)之療法中。
    在一些態樣中，組合物可係包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列24-743之rhNaGlu之分離混合物。在一實施例中，混合物含有足量的具有至少一種含有磷酸化甘露糖(例如，M6P)或甘露糖之聚糖結構之rhNaGlu，從而使得含有M6P或甘露糖之rhNaGlu內化至NaGlu缺陷之人類細胞中且恢復在活躍表現內源NaGlu之相同類型的野生型人類細胞中觀察到之NaGlu活性之至少50%。在一態樣中，混合物中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%94%、95%、96%、97%、98%或99%之rhNaGlu含有至少一種具有磷酸化甘露糖及/或甘露糖之聚糖結構。在一實施例中，混合物中至少10%之rhNaGlu含有至少一種具有磷酸化甘露糖及/或甘露糖之聚糖結構。在一實施例中，混合物中至少20%之rhNaGlu含有至少一種具有磷酸化甘露糖及/或甘露糖之聚糖結構。在一實施例中，混合物中至少30%之rhNaGlu含有至少一種具有磷酸化甘露糖及/或甘露糖之聚糖結構。在一實施例中，混合物中至少30%之rhNaGlu含有至少一種具有磷酸化甘露糖及/或甘露糖之聚糖結構。在一實施例中，混合物中至少40%之rhNaGlu含有至少一種具有磷酸化甘露糖及/或甘露糖之聚糖結構。在一實施例中，混合物中至少50%之rhNaGlu含有至少一種具有磷酸化甘露糖及/或甘露糖之聚糖結構。在一實施例中，混合物中至少60%之rhNaGlu含有至少一種具有磷酸化甘露糖及/或甘露糖之聚糖結構。
    在一些態樣中，NaGlu含有一或多種N-連接聚糖結構。NaGlu含有至少一種磷酸化甘露糖(例如，M6P或雙M6P)，其容許該蛋白質經甘露糖6-磷酸受體(M6P受體)識別，且隨後經由M6P受體介導之胞吞作用吸收至人類細胞(包括(但不限於)皮膚纖維母細胞、內皮細胞、神經元細胞、肝細胞、巨噬細胞或任何在細胞表面上表現M6P受體之細胞)中。在一實施例中，NaGlu含有至少一種甘露糖(Man)。在另一實施例中，NaGlu含有至少一種N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)。
    在一些態樣中，NaGlu含有包含磷酸化甘露糖(M6P)之聚糖結構。本文所用M6P可涵蓋任何磷酸化甘露糖殘基且包括單-及雙磷酸化甘露糖。在一實施例中，M6P係以約1、約2、約3、約4、約5或約6莫耳/莫耳蛋白質之濃度存在。在一實施例中，NaGlu含有M6P以約2、約3、約4或約5莫耳/莫耳蛋白質之濃度存在。在一實施例中，NaGlu以約2莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有M6P。在一實施例中，NaGlu以約3莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有M6P。在一實施例中，NaGlu以約4莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有M6P。在一實施例中，NaGlu以約5莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有M6P。在一實施例中，NaGlu以約6莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有M6P。
    在一些態樣中，rhNaGlu含有足量M6P以用於經由M6P受體介導之胞吞作用細胞攝取至在細胞表面具有M6P受體之人類細胞中。在一實施例中，用於攝取至人類細胞中之M6P之足量係約1、2、3、4、5或6莫耳/莫耳蛋白質。rhNaGlu可內化至NaGlu缺陷之人類細胞以使得內化蛋白質完全(100%或更高)恢復NaGlu缺陷之人類細胞中之NaGlu活性之正常程度。在一實施例中，內化rhNaGlu蛋白質以至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0 μg/mL之濃度完全恢復人類細胞中之NaGlu活性之正常程度。在一實施例中，內化蛋白質以至少2、3、4、5、6、7、8、9或10 μg/mL之濃度完全恢復NaGlu缺陷之人類細胞中之NaGlu活性之正常程度。在一實施例中，內化蛋白質以至少20、30、40、50、60、70、80、90或100 μg/mL之濃度完全恢復人類細胞中之NaGlu活性之正常程度。本文所用NaGlu活性之正常程度係在活躍表現正常NaGlu酶之相同類型之野生型人類細胞中量測之NaGlu活性程度。
    在一些態樣中，rhNaGlu可內化至NaGlu缺陷之人類細胞中以使得該蛋白質恢復相同類型之正常人類細胞之至少約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%之NaGlu活性。在一些實施例中，rhNaGlu可內化至NaGlu缺陷之人類細胞中以使得內化rhNaGlu提供在相同類型之正常人類細胞中所觀察到的更高之酶活性。在一實施例中，rhNaGlu內化至NaGlu缺陷之人類細胞中以使得內化rhNaGlu提供係在相同類型之正常人類細胞中所觀察到的約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9及約10倍之活性。在一實施例中，rhNaGlu內化至NaGlu缺陷之人類細胞中以使得內化rhNaGlu提供係在正常人類細胞中所觀察到的約15、約20、約25、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90或約100倍之活性。
    在一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係在細胞表面上表現一或多種M6P受體之任一NaGlu缺陷之人類細胞。在一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係積累硫酸乙醯肝素之人類黏多糖貯積症(MPS)IIIB纖維母細胞。在一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係肝細胞。在一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係神經元細胞。在一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係內皮細胞。在一實施例中，NaGlu缺陷之人類細胞係巨噬細胞。
    在一些態樣中，將rhNaGlu攝取至人類細胞中受約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10 mM之競爭性M6P單糖之存在的抑制。在一些態樣中，rhNaGlu之細胞攝取受約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9或約1.0 mM之M6P單糖之存在的抑制。在一實施例中，rhNaGlu之細胞攝取受約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08或約0.09 mM之M6P單糖之存在的抑制。
    在一些態樣中，rhNaGlu在其聚糖結構中以約17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有甘露糖。在一實施例中，rhNaGlu以約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有甘露糖。rhNaGlu以約22、23、24、25、26、27或28莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有甘露糖。rhNaGlu以約24莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有甘露糖。rhNaGlu蛋白質以約25莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有甘露糖。rhNaGlu以約26莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有甘露糖。rhNaGlu以約27莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有甘露糖。在一實施例中，rhNaGlu以介於約20與約30莫耳/莫耳蛋白質之間之濃度含有甘露糖。
    在一些態樣中，rhNaGlu包含N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)。在一實施例中，rhNaGlu以介於約28與約42莫耳/莫耳蛋白質之間之濃度含有GlcNAc。在一實施例中，NaGlu蛋白質以介於約30與約40莫耳/莫耳蛋白質之間之濃度含有GlcNAc。在一實施例中，NaGlu蛋白質以介於約32與約38莫耳/莫耳蛋白質之間之濃度包含GlcNAc。在一實施例中，NaGlu蛋白質以介於約34與約36莫耳/莫耳蛋白質之間之濃度包含GlcNAc。在一實施例中，NaGlu蛋白質以約35莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有GlcNAc。在一實施例中，rhNaGlu蛋白質以約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有GlcNAc。
    在一些態樣中，rhNaGlu含有N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)及/或半乳糖(Gal)。GalNAc及Gal之存在通常表明，NaGlu可含有一或多種在高爾基室中添加至蛋白質之O-連接聚糖結構。因此，本發明視情況包括包含重組人類NaGlu之組合物，該重組人類NaGlu含有一或多種O-連接聚糖結構。
    在一實施例中，rhNaGlu以約1、2、3、4、5、6或7莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有半乳糖。在一實施例中，rhNaGlu以約2、3、4、5或6莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有半乳糖。在一實施例中，rhNaGlu以約3莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有半乳糖。在一實施例中，rhNaGlu以約4莫耳/莫耳蛋白質之濃度含有半乳糖。
    在一實施例中，NaGlu包含至少一個GalNAc分子/莫耳蛋白質。在一實施例中，NaGlu以約1或2莫耳/莫耳蛋白質之濃度包含GalNAc。
    在一實施例中，NaGlu不含岩藻糖。在另一實施例中，NaGlu不含葡萄糖。在另一實施例中，rhNaGlu既不含岩藻糖亦不含葡萄糖。
    本發明亦涵蓋自rhNaGlu之經修飾核酸序列產生之經修飾rhNaGlu蛋白質之組合物。經修飾核酸序列包括不同核苷酸之缺失、插入或取代，從而產生編碼功能等效多核苷酸或多肽之多核苷酸。所編碼蛋白質亦可含有胺基酸殘基之缺失、插入或取代，其產生沉默變化且產生功能等效蛋白質或多肽。可基於殘基之極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性進行謹慎的胺基酸取代，只要保留NaGlu之生物活性即可。舉例而言，帶負電荷之胺基酸可包括天冬胺酸及麩胺酸；帶正電荷之胺基酸可包括離胺酸及精胺酸；且具有不帶電荷之極性頭基(具有類似親水性值)之胺基酸可包括白胺酸、異白胺酸及纈胺酸；甘胺酸及丙胺酸；天冬醯胺及麩醯胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；苯丙胺酸及酪胺酸。
    在其他態樣中，rhNaGlu可經修飾以使得其含有另一部分或第二肽。儘管未經修飾之NaGlu蛋白質可以高血清濃度跨越血腦障壁，但可對蛋白質進行修飾以提高靶向中樞神經系統(CNS)之效率。在一實施例中，可將運鐵蛋白受體配體(TfRL)在NaGlu蛋白質之N-或C-末端附接至人類NaGlu。TrRL之非限制性實例係THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：5)。在一實施例中，可將運鐵蛋白受體配體在NaGlu蛋白質之C-末端附接至人類NaGlu。在另一實施例中，將人類NaGlu在NaGlu蛋白質之N-或C-末端融合至胰島素樣生長因數受體(IGF2R)配體。在另一實施例中，將NaGlu蛋白質在NaGlu蛋白質之N-或C-末端融合至低密度脂蛋白(LDL)受體配體。在一實施例中，將NaGlu蛋白質融合至5至10個連續酸性胺基酸殘基之鏈段。酸性胺基酸殘基可包括天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)。
    在一實施例中，rhNaGlu係在含有編碼NaGlu蛋白質之轉基因之轉基因禽類中產生。在一實施例中，rhNaGlu係在轉基因禽類(例如，雞(chicken、Gallus))之輸卵管細胞(例如，管狀腺細胞)中產生。在一實施例中，rhNaGlu係在轉基因禽類之輸卵管細胞(例如，管狀腺細胞)中糖基化。在一實施例中，rhNaGlu之糖基化模式源自在轉基因禽類之輸卵管細胞中產生之rhNaGlu。在一實施例中，rhNaGlu可自轉基因禽類所產硬殼卵之內含物分離並純化。在一實施例中，rhNaGlu可自轉基因禽類之卵白分離並純化。
    本發明亦包括NaGlu蛋白質之分離混合物(例如一或多個片段及全長rhNaGlu(例如，SEQ ID NO：1中所示之24-743)之混合物)之組合物。在一實施例中，混合物之大部分含有磷酸化M6P。在一實施例中，混合物中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%之rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少50%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少60%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少70%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少80%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少90%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少95%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少96%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少97%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少98%之分離rhNaGlu含有M6P。在另一實施例中，混合物中至少99%之分離rhNaGlu含有M6P。
    視情況，自禽類或哺乳動物表現系統(例如，CHO、HEK293或人類皮膚纖維母細胞細胞系)產生之rhNaGlu蛋白質可進一步經修飾以達成對細胞攝取有利之糖基化模式(即，增加量之M6P)同時保留生物活性。可藉由應用於其他水解酶之一般方法將另一末端M6P引入rhNaGlu中，如美國專利第6,679,165號、美國專利第7,138,262號或美國公開案第2009/0022702號中所揭示，該等專利中每一者之全部教示內容以引用方式併入本文中。舉例而言，高度磷酸化之吡喃甘露糖苷寡糖化合物可經含有羰基反應基團之化學化合物衍生，之後氧化rhNaGlu蛋白質以在蛋白質之一個聚糖結構上生成羰基(醛)基團，且使經氧化NaGlu蛋白質與具有經衍生高度磷酸化吡喃甘露糖苷寡糖化合物之聚糖反應以形成具有肼鍵之新化合物。 II.載體
    可使用熟習此項技術者熟知之方法來構築表現載體，其含有編碼NaGlu之序列及適當轉錄及轉譯控制元件。該等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內遺傳重組。該等技術闡述於(例如)以下文獻中：Sambrook,J.等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.；及Ausubel,F.M.等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.，其全部教示內容係以引用方式併入本文中。
    可利用多種表現載體/宿主系統來表現編碼rhNaGlu之核酸序列。該等系統包括(但不限於)微生物，例如經重組噬菌體、質粒或黏粒DNA表現載體轉化之細菌；經酵母表現載體轉化之酵母；經病毒表現載體(例如，桿狀病毒)或經細菌表現載體(例如，Ti或pBR322質粒)感染之昆蟲細胞系統；或哺乳動物細胞培養系統(例如，pTT22載體)。含有與編碼酸性胺基酸殘基及TfRL之核酸序列融合之人類NaGlu cDNA之pTT22載體之非限制性實例展示於圖11及12中。
    本發明多核苷酸及核酸編碼區可與編碼引導由本發明多核苷酸編碼之多肽之分泌之分泌或信號肽的其他編碼區相連。根據信號假說，脊椎動物(例如，禽類或哺乳動物)細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，其在生長蛋白質鏈開始跨越粗糙內質網(ER)排出後自成熟蛋白質裂解。彼等熟習此項技術者已知，脊椎動物細胞ER中產生之多肽一般具有與多肽N-末端融合之信號肽，其自完整或「全長」多肽裂解以產生多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，使用天然信號肽(例如人類NaGlu之MEAVAVAAAVGVLLLAGAGGAAG(SEQ ID NO：1中之1-23)信號肽)，或該序列之保留引導與其可操作連接之多肽分泌之能力的功能性衍生物。或者，可使用異源信號肽(例如，異源哺乳動物或禽類信號肽)或其功能性衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經(例如)人類組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶之前導序列取代。
    控制元件或調節序列可包括彼等載體增強子之非轉譯區、啟動子、與宿主細胞蛋白質相互作用以實施轉錄及轉譯之5'及3'非轉譯區。該等元件之強度及特異性可有所不同。端視所用載體系統及宿主細胞而定，可使用任一數目之適宜轉錄及轉譯元件。舉例而言，當在細菌系統中選殖時，可使用誘導型啟動子，例如BluescriptTM噬菌粒(Stratagene,LaJolla,California)或pSport1TM質粒(Gibco BRL)之雜種lac-Z啟動子及諸如此類。在哺乳動物細胞系統中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒之啟動子較佳。若需要生成含有編碼NaGlu之序列之多個拷貝的細胞系，亦可使用基於SV40或EBV且具有適當可選標記(例如嘌呤黴素(puromycin)及胺苄青黴素(ampicillin))之載體(例如，參見圖11及12)。
    當在轉基因禽類中產生rhNaGlu時，本發明涵蓋將rhNaGlu序列置於啟動子下游，從而使得可在轉基因禽類中以組織特異性方式表現編碼rhNaGlu之序列。舉例而言，啟動子可係主要但並非完全為膨大部特異性之輸卵管特異性啟動子，例如輸卵管特異性啟動子，包括(但不限於)卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白、類卵黏蛋白、類卵黏蛋白、卵黏蛋白及卵運鐵蛋白啟動子。在一實施例中，啟動子係卵白蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、伴白蛋白啟動子、類卵黏蛋白啟動子、卵黏蛋白啟動子及/或卵運鐵蛋白啟動子或其任何功能性部分。
    或者，可使用組成型啟動子在禽類中表現人類NaGlu之編碼序列。在此情形下，表現並不限於膨大部；表現亦在禽類內之其他組織(例如，血液)中發生。此一轉基因(其包括組成型啟動子及NaGlu之編碼序列)之使用亦適於實現或驅動在輸卵管中表現蛋白質及隨後將蛋白質分泌至卵中。在一實施例中，組成型啟動子可係(例如)細胞巨大病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(rous-sarcoma virus，RSV)啟動子、鼠類白血病病毒(MLV)啟動子及β-肌動蛋白啟動子。在一實施例中，啟動子係CMV啟動子、MDOT啟動子、RSV啟動子、MLV啟動子或小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子或其任何功能性部分。
    本發明亦涵蓋本文所述啟動子之任何可用片段或組件。啟動子可係啟動子區之至少一個區段、片段或組件，例如卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白、類卵黏蛋白、卵黏蛋白、卵運鐵蛋白、CMV、RSV或MLV啟動子區之區段。在一較佳實施例中，啟動子係輸卵管特異性啟動子區之區段，其含有引導在管狀腺細胞中表現編碼序列之必需元件。舉例而言，本發明範圍中包括輸卵管特異性啟動子之區段、部分或片段及/或濃縮輸卵管特異性啟動子之關鍵調節元件，從而使得其保留在輸卵管膨大部之管狀腺細胞中表現所需之序列。在一實施例中，使用卵白蛋白啟動子區之區段。此區段包含卵白蛋白基因之5'-側接區域。
    可使用含有人類NaGlu之編碼序列之載體來轉染禽類胚盤細胞或哺乳動物細胞，以將其穩定整合至禽類或哺乳動物基因組中並產生種系轉基因禽類或哺乳動物細胞系。該載體之非限制性實例展示於圖4A-D及5中。在禽類表現系統中，人類NaGlu編碼序列以位置關係可操作連接至啟動子以在轉基因禽類中、尤其在禽類輸卵管膨大部之管狀腺細胞中表現編碼序列，從而使得重組人類NaGlu蛋白質表現並貯存於轉基因禽類所產硬殼卵之卵白中。其他適宜載體及製備用於在禽類系統中表現rhNaGlu之載體之方法亦揭示於以下文獻中：美國專利第6,730,822號；美國專利第6,825,396號；美國專利第6,875,588號；美國專利第7,294,507號；美國專利第7,521,591號；美國專利第7,534,929號；美國公開案第2008/0064862A1號；及美國專利公開案第2006/0185024號，其全部教示內容係以引用方式併入本文中。亦可用於本發明中之其他啟動子之非限制性實例包括Pol III啟動子(例如，1型、2型及3型Pol III啟動子)，例如H1啟動子、U6啟動子、tRNA啟動子、RNase MPR啟動子及該等啟動子中每一者之功能性部分。通常，根據所用啟動子選擇功能性終止子序列用於本發明。
    在一實施例中，載體係反轉錄病毒載體，其中編碼序列及啟動子二者皆定位於反轉錄病毒載體之5'與3' LTR之間。在一可用實施例中，LTR或反轉錄病毒載體源自禽類白血病病毒(ALV)、鼠類白血病病毒(MLV)或慢病毒。一種可用於將轉基因隨機引入禽類基因組中之反轉錄病毒係複製缺陷ALV、複製缺陷MLV或複製缺陷慢病毒。
    本發明亦涵蓋使用自滅活(SIN)載體。SIN載體可用於增加在轉基因禽類輸卵管中產生之人類NaGlu之量。在SIN載體不含任何具有功能性啟動子之可選標記盒時(SIN/SC陰性啟動子)，此效應可進一步加強。在一實施例中，SIN載體係具有經改變基因組而使得經整合反轉錄病毒載體之5' LTR無法用作啟動子之反轉錄病毒載體。在一特定實施例中，反轉錄病毒載體中在整合後形成反轉錄病毒載體5' LTR之U3區域之核苷酸序列之一部分或全部可缺失或改變以降低或消除5' LTR之啟動子活性。含有與人類rhNaGlu之編碼序列融合之卵白蛋白啟動子區之SIN載體之非限制性實例展示於圖4A-D及5中。載體之功能性組件亦列於表1中。
    本文所述任一載體可包括編碼信號肽之序列，該信號肽引導載體之編碼序列表現之蛋白質自(例如)禽類輸卵管之管狀腺細胞分泌。倘若重組人類NaGlu蛋白質原本不會被分泌，則含有編碼序列之載體經修飾以包含具有約60 bp之編碼來自(例如)溶菌酶基因之信號肽之DNA序列。將編碼信號肽之DNA序列插入載體中以使得其定位於該DNA編碼之rhNaGlu蛋白質之N-末端。
    此外，本發明任一方法中使用之載體之編碼序列可提供有3'非轉譯區(3' UTR)以賦予所產生RNA以穩定性。在將3' UTR添加至反轉錄病毒載體時，啟動子、編碼序列及3' UTR之取向較佳相對於3' UTR之方向逆轉，從而使得所添加3' UTR不幹擾全長基因組RNA之轉錄。在一實施例中，3' UTR可係卵白蛋白基因之3' UTR、溶菌酶基因之3' UTR或在膨大部細胞中、即在SV40晚期區域中發揮功能之任一3' UTR。 III.轉基因禽類
    可將本文所述轉基因引入禽類胎部胚盤細胞中以產生在其種系組織基因組中載有編碼重組人類NaGlu之轉基因之轉基因雞、轉基因火雞、轉基因鵪鶉及其他禽類物種。在本發明之一態樣中，產生rhNaGlu之轉基因禽類係藉由用在反轉錄病毒載體之5'與3' LTR之間載有轉基因之複製缺陷或複製勝任反轉錄病毒顆粒轉導胎部胚盤細胞來產生。例如，可使用禽類白血病病毒(ALV)反轉錄病毒載體或鼠類白血病病毒(MLV)反轉錄病毒載體。可使用包裝至病毒顆粒中之經修飾反轉錄病毒載體之RNA拷貝來感染發育為轉基因禽類之胎部胚盤。
    藉由本發明方法，可將轉基因引入各種禽類物種之胎部胚盤細胞中。舉例而言，可應用該等方法來產生在其種系組織基因組中載有轉基因以產生本發明蛋白質之轉基因雞、轉基因火雞、轉基因鵪鶉、轉基因鴨及其他禽類物種。胚盤細胞通常係如Eyal-Giladi及Kochav(1976)中所定義之VII-XII期細胞或其等效細胞。在一較佳實施例中，胚盤細胞處於或接近X期。
    在一種轉染胚盤細胞之方法中，可使用經包裝之基於反轉錄病毒之載體來將載體遞送至胎部胚盤細胞中，從而使該載體整合至禽類基因組中。該等病毒顆粒(即，轉導顆粒)經產生用於載體且對其進行滴定以確定可用於注射胚胎之適當濃度。在一實施例中，根據美國專利第5,897,998號(其揭示內容係全文以引用方式併入本文中)中所述之程式將禽類卵開窗，且向卵注射處於或接近X期之轉導性顆粒。
    本發明產生rhNaGlu之轉基因禽類係自已引入載體之胚盤細胞發育而來。使所得胚胎發育且使雞成熟。在此階段，自胚盤細胞產生之轉基因禽類稱為首建體(founder)且相對於載有轉基因之細胞為嵌合體且稱作G0。G0首建體禽類通常為每一插入轉基因之嵌合體。亦即，G0轉基因鳥之細胞中僅一些細胞含有轉基因。一些首建體在其輸卵管膨大部中之管狀腺細胞中載有轉基因。該等禽類表現由其輸卵管中之轉基因編碼之rhNaGlu蛋白質。NaGlu蛋白質亦可在除輸卵管以外之其他組織(例如，血液)中表現。一些首建體係種系首建體，其在種系組織基因組中載有轉基因，且亦可在表現外源蛋白之輸卵管膨大部管狀腺細胞中載有轉基因。
    轉基因禽類可在其種系中載有轉基因，從而將外源轉基因以孟德爾(Mendelian)方式穩定傳遞至禽類後代。G0世代通常係編碼rhNaGlu之轉基因之半合體。可將G0世代與非轉基因動物配種以產生G1轉基因後代，其亦係轉基因之半合體且在基本上全部鳥細胞中含有轉基因。可將G1半合體後代與非轉基因動物配種從而產生G2半合體後代，或可將其配種在一起以產生轉基因之純合G2後代。源自G1後代之轉基因為陽性之禽類的實質上全部細胞皆含有轉基因。在一實施例中，可將來自相同品系之半合G2後代配種以產生轉基因之純合G3後代。在另一實施例中，可將(例如)半合體G0或G1動物配種在一起以產生在動物之每一細胞中皆含有轉基因之兩個拷貝之純合G1後代。該等方法僅係某些可用配種方法之實例，且本發明涵蓋利用任何可用配種方法，例如彼等為熟習此項技術者已知者。 IV. rhNaGlu之產生
    rhNaGlu可使用在基因組中含有編碼rhNaGlu之轉基因之轉基因禽類來產生。在一實施例中，轉基因禽類係種系轉基因雞、鵪鶉、鴨或火雞。在一尤其可用實施例中，本發明係關於產生可在雞輸卵管中產生之NaGlu。
    在禽類系統中(例如，在禽類輸卵管中)進行或不進行修飾之rhNaGlu之產生在本發明範圍內。在一實施例中，未經修飾之rhNaGlu包含野生型胺基酸序列(SEQ ID NO：1中之24-743)及使得能被人類細胞有效攝取之糖基化結構(即，M6P)。在另一實施例中，經修飾蛋白質可係糖基化模式(即，M6P)使得可被人類細胞有效攝取之rhNaGlu融合蛋白。
    如本文所述將含有編碼NaGlu蛋白質且可操作連接至在雞輸卵管中驅動編碼序列表現之組織特異性或組成型啟動子之核酸序列之適宜禽類載體引入處於或接近X期之雞胚胎細胞中。在有助於孵化活雞之條件下培育經轉化胚胎細胞。將活雞養育成成熟嵌合雞，使其與非轉基因雞以自然方式或經由人工授精交配。藉由篩選種系納入蛋白質編碼序列之後代來鑑別轉基因雞。可使轉基因後代與另一轉基因或非轉基因雞交配以產生產卵之完全種系轉基因母雞。
    rhNaGlu可以組織特異性方式來產生。舉例而言，rhNaGlu可在轉基因禽類之輸卵管、血液及/或其他細胞或組織中表現。在一實施例中，NaGlu係在轉基因禽類之輸卵管膨大部之管狀腺細胞中表現，分泌至輸卵管管腔中且貯存於卵白中。在一實施例中，收穫含有rhNaGlu之卵白且將其散裝儲存在介於4℃至-20℃範圍內之溫度下。然後使用業內已知之各種方法自卵之內含物分離並純化NaGlu。
    本發明之一態樣係關於含有rhNaGlu蛋白質之禽類硬殼卵(例如，雞硬殼卵)。將轉基因禽類產生及分泌之rhNaGlu以有利於人類細胞進行細胞攝取之方式糖基化。該蛋白質可以任一可用量存在。在一實施例中，蛋白質係以介於約0.01 μg/硬殼卵與約1克/硬殼卵之間之範圍之量存在。在另一實施例中，蛋白質係以介於約1 μg/硬殼卵與約1克/硬殼卵之間之範圍之量存在。舉例而言，蛋白質可以介於約10 μg/硬殼卵與約1克/硬殼卵之間之範圍(例如，介於約10 μg/硬殼卵與約400毫克/硬殼卵之間之範圍)之量存在。
    在一實施例中，rhNaGlu存於卵之卵白中。在一實施例中，rhNaGlu係以介於約1 ng/毫升卵白與約0.2克/毫升卵白之間之範圍之量存在。舉例而言，rhNaGlu可以介於約0.1 μg/毫升卵白與約0.2克/毫升卵白之間之範圍之量存在(例如，rhNaGlu可以介於約1 μg/毫升卵白與約100毫克/毫升卵白之間之範圍之量存在)。在一實施例中，rhNaGlu係以介於約1 μg/毫升卵白與約50毫克/毫升卵白之間之範圍之量存在。舉例而言，rhNaGlu可以介於約1 μg/毫升卵白與約10毫克/毫升卵白之間之範圍之量存在(例如，rhNaGlu可以介於約1 μg/毫升卵白與約1毫克/毫升卵白之間之範圍之量存在)。在一實施例中，rhNaGlu係以高於0.1 μg/毫升卵白之量存在。在一實施例中，rhNaGlu係以高於0.5 μg/毫升卵白之量存在。在一實施例中，rhNaGlu係以高於1 μg/毫升卵白之量存在。在一實施例中，蛋白質係以高於1.5 μg/毫升卵白之量存在。在一實施例中，rhNaGlu係以高於0.5 μg/毫升卵白之量存在。在一實施例中，蛋白質係以高於0.1 μg/毫升卵白之量存在。
    在一實施例中，rhNaGlu係以以下量存在：20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、130 mg/L、140 mg/L、150 mg/L、160 mg/L、170 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L、900 mg/L或1,000 mg/L卵白。在一實施例中，rhNaGlu係以約100 mg/L卵白之量存在。在一實施例中，rhNaGlu係以約200 mg/L卵白之量存在。 V.宿主細胞
    本發明亦涵蓋在任一可用蛋白質表現系統中產生之rhNaGlu，該系統包括(但不限於)細胞培養物(例如，禽類細胞、CHO細胞、HEK293細胞及COS細胞)、酵母、細菌及植物。
    宿主細胞品系可針對其調節插入序列之表現或以期望方式加工所表現NaGlu之能力來選擇。對NaGlu之多肽之該等修飾包括(但不限於)糖基化、磷酸化或脂化。可選擇具有用於該等轉譯後活動之特定細胞機器及特徵性機構之不同宿主細胞(例如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293及W138)以確保對本發明融合蛋白之正確修飾及加工。亦涵蓋禽類腫瘤細胞系作為表現本發明多肽之宿主細胞。可用禽類細胞系之實例(例如，禽類輸卵管腫瘤細胞系)闡述於美國專利公開案第2009/0253176號中，其全部教示內容係以引用方式併入本文中。 VI.醫藥組合物
    本發明亦以醫藥組合物為特徵，其包含經分離且實質上經純化之rhNaGlu或其醫藥上可接受之鹽。重組人類NaGlu蛋白質可使用一或多種載劑作為(例如)醫藥調配物之一部分來投與，或不使用載劑。載劑必須為「可接受的」，意指其與調配物中之其他成份相容且對其接受者無害。包含該等載劑(包括複合分子)之組合物係藉由熟知之習用方法來調配(例如，參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第14版，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，其全部教示內容係以引用方式併入本文中)。載劑可包含稀釋劑。在一實施例中，醫藥載劑可為液體且蛋白質可呈溶液形式。醫藥載劑可為蠟、脂肪或醇。在另一實施例中，醫藥上可接受之載劑可為呈粉劑、凍乾粉劑或錠劑形式之固體。在一實施例中，載劑可包含脂質體或微膠囊。
    在一些實施例中，包含重組人類NaGlu蛋白質之醫藥組合物進一步包含緩衝劑。實例性緩衝劑包括乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽及麩胺酸鹽緩衝劑。實例性緩衝劑亦包括檸檬酸鋰、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸鈣、乳酸鋰、乳酸鈉、乳酸鉀、乳酸鈣、磷酸鋰、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈣、馬來酸鋰、馬來酸鈉、馬來酸鉀、馬來酸鈣、酒石酸鋰、酒石酸鈉、酒石酸鉀、酒石酸鈣、琥珀酸鋰、琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鈣、乙酸鋰、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸鈣及其混合物。在一些實施例中，緩衝劑係檸檬酸三鈉二水合物。在一些實施例中，緩衝劑係檸檬酸一水合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含檸檬酸三鈉二水合物及檸檬酸一水合物。
    在一些實施例中，包含重組人類NaGlu蛋白質之醫藥組合物進一步包含穩定劑。實例性穩定劑包括白蛋白、海藻糖、糖、胺基酸、多元醇、環糊精、鹽(例如氯化鈉、氯化鎂及氯化鈣)、凍乾保護劑及其混合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含人類血清白蛋白。
    在一些實施例中，可期望向醫藥組合物添加表面活性劑。實例性表面活性劑包括非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如，泊洛沙姆188)；曲拉通(Triton)；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻油基-或硬脂醯基-磺基甜菜鹼；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻油基-或硬脂醯基-肌胺酸；亞麻油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯胺基丙基-、椰子醯胺基丙基-、亞麻油醯胺基丙基-、肉豆蔻醯胺基丙基-、棕櫚油醯胺基丙基-或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(例如，月桂醯胺基丙基)；肉豆蔻醯胺基丙基-、棕櫚油醯胺基丙基-或異硬脂醯胺基丙基-二甲胺；甲基椰油基牛黃酸鈉或甲基油基牛磺酸二鈉；及MONAQUATTM系列(Mona Industries公司，Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇與丙二醇之共聚物(例如，Pluronics,PF68等)。通常，所添加表面活性劑之量應使得其可降低蛋白質之凝集反應且使微粒或起泡之形成降至最低。舉例而言，表面活性劑可以約0.001%-0.5%(例如，約0.005%-0.05%或0.005%-0.01%)之濃度存於調配物中。具體而言，表面活性劑可以約0.005%、0.01%、0.02%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%或0.5%等之濃度存於調配物中。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，本發明之適宜醫藥組合物可進一步包括一或多種尤其用於凍乾調配物中之增積劑。「增積劑」係向凍乾混合物增加質量且有助於凍乾餅之物理結構之化合物。舉例而言，增積劑可改良凍乾餅之外觀(例如，基本上均勻之凍乾餅)。適宜增積劑包括(但不限於)氯化鈉、乳糖、甘露醇、甘胺酸、蔗糖、海藻糖、羥乙基澱粉。增積劑之實例性濃度係約1%至約10%(例如，1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%及10.0%)。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。醫藥組合物可呈在用稀釋劑重構後注射之無菌凍乾粉劑形式。稀釋劑可為注射用水、注射用抑菌水或無菌鹽水。凍乾粉劑可藉由將融合蛋白溶液冷凍乾燥以產生呈乾燥形式之蛋白質來產生。如業內所知，凍乾蛋白質一般具有與蛋白質液體溶液相比增強之穩定性及更長貯存期限。
    醫藥調配物包括彼等適於經口、經直腸、經鼻、局部(包括經頰及舌下)、經陰道或非經腸投與者。較佳地，本發明醫藥調配物包括彼等適於注射投與(包括鞘內、實質內、大腦內、室內、肌內、皮下及靜脈內投與)者。在一實施例中，本發明調配物適於靜脈內投與。在另一實施例中，本發明調配物適於鞘內投與。本發明醫藥調配物亦包括彼等適於藉由吸入或吹入投與者。若適當，調配物可便捷地存於離散劑量單位中，且可藉由製藥業熟知之任一方法來製備。產生醫藥調配物之方法通常包括使治療性蛋白質與液體載劑或精細固體載劑或二者結合且隨後(若需要)使產物成型為期望調配物之步驟。
    本發明重組人類NaGlu蛋白質亦可經調配用於非經腸投與(例如，注射投與，例如濃注或連續輸注)且可以單位劑型存於安瓿、預填充注射器、小體積輸注中或存於添加有防腐劑之多劑量容器中。治療性蛋白質可藉由(例如)皮下注射、肌內注射、鞘內注射、大腦內注射、實質內注射、室內注射及靜脈內(IV)輸注或注射來注射。
    在一實施例中，重組人類NaGlu蛋白質係藉由任一可用方法藉由IV輸注來靜脈內投與。在一實例中，重組人類NaGlu蛋白質可經由週邊管路藉由靜脈內輸注來投與。在另一實例中，重組人類NaGlu蛋白質可經由週邊插入之中心導管藉由靜脈內輸注來投與。在另一實例中，重組人類NaGlu蛋白質可藉由附接至靜脈血管輸液埠(venous vascular access port)之移動式輸注機輔助之靜脈內輸注來投與。在靜脈內輸注之一實施例中，如熟練醫師所確定，端視欲輸注藥劑之量及患者先前之輸注相關反應史經1至8小時時間投與藥劑。在另一實施例中，重組人類NaGlu蛋白質係藉由IV注射靜脈內投與。在另一實施例中，重組人類NaGlu蛋白質可經由腹膜內或鞘內注射來投與。
    在一些實施例中，治療性蛋白質係藉由輸注來投與，且輸注可進行延長時間段，例如30分鐘至10小時。因此，可經(例如)約1小時、約2小時、約3小時、約4小時或約5小時時間進行輸注。亦可以不同速率進行輸注。因此，例如，輸注速率可為約1 mL/小時至約20 mL/小時。在一些實施例中，輸注速率係5 mL至10 mL/小時。在一實施例中，輸注速率係1,2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 mL/小時。在一實施例中，輸注速率係0.1至5 mg/kg/hr。在一實施例中，輸注速率係約0.1、約0.2、約0.3、約0.5、約1.0、約1.5、約2.0或約3 mg/kg/hr。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    治療性蛋白質可呈諸如存於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液等形式，且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑等調配劑。重組人類NaGlu蛋白質可呈藉由無菌分離無菌固體或藉由溶液凍乾獲得之粉劑形式，其在使用前經適宜媒劑(例如無菌無熱原水)構造。
    可基於以下來評價本發明調配物：產物品質分析、重構時間(若凍乾)、重構品質(若凍乾)、高分子量、濕度及玻璃轉換溫度。通常，蛋白質品質及產物分析包括使用包括(但不限於)以下之方法進行的產物降解速率分析：大小排阻HPLC(SE-HPLC)、陽離子交換-HPLC(CEX-HPLC)、X射線繞射(XRD)、調幅式微差掃描熱分析法(mDSC)、反相HPLC(RP-HPLC)、多角度光散射(MALS)、螢光、紫外吸收、濁度測定法、毛細管電泳(CE)、SDS-PAGE及其組合。在一些實施例中，對本發明產物之評估可包括評估外觀(液體或餅外觀)之步驟。
    一般而言，可將調配物(凍乾或水性)在室溫下儲存延長時間段。儲存溫度通常可介於0℃至45℃範圍內(例如，4℃、20℃、25℃或45℃)。可將調配物儲存數月時間至數年時間。儲存時間一般可為24個月、12個月、6個月、4.5個月、3個月、2個月或1個月。可取消轉移步驟，將調配物直接儲存於用於投與之容器中。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    可取消轉移步驟，將調配物直接儲存於亦可用作重構器皿之凍乾容器中(若凍乾)。或者，可將凍乾產物調配物量測為較小藥包(increment)以供儲存。儲存一般應避免引起蛋白質降解之環境，包括(但不限於)暴露於陽光、UV輻射、其他形式之電磁輻射、過熱或過冷、快速熱衝擊及機械衝擊。本發明醫藥組合物亦可含有其他活性成份，例如免疫抑制劑、抗微生物劑或防腐劑，其更詳細地論述於下文中。 VII.治療方法
    本發明亦提供治療NaGlu相關疾病(例如聖菲利柏氏症候群B)之方法。根據本發明採用之重組NaGlu包括可在任一可用蛋白質表現系統中產生之重組NaGlu，該系統包括(但不限於)細胞培養物(例如，CHO細胞、COS細胞)、細菌(例如大腸桿菌(E.coli))、轉基因動物(例如哺乳動物及禽類(例如，雞、鴨及火雞))及植物系統(例如，浮萍及煙草植物)。在一實施例中，重組NaGlu係在轉基因動物、例如禽類中產生。
    在一實施例中，該方法包含以足以治療(例如，降低、改善)或預防NaGlu缺陷或NaGlu相關疾病之一或多種症狀之量向個體投與重組人類NaGlu蛋白質(rhNaGlu)，例如含有足量寡糖(例如，甘露糖及磷酸化甘露糖(即，M6P))之重組人類NaGlu蛋白質。重組人類NaGlu蛋白質可以治療性方式或以預防性方式或以兩種方式投與。可將重組人類NaGlu蛋白質(rhNaGlu)單獨或與本文所述其他治療方式組合投與個體。
    術語「治療(treat)」、「治療(treating)」及「治療(treatment)」係指用於以下之方法：減輕、減退或改善疾病或症狀，預防額外症狀，改善或預防症狀之潛在病因，抑制疾病或病況，阻礙疾病或病況發展，緩解疾病或病況，引起疾病或病況消退，緩解疾病或病況引起之病況，或預防性地及/或在症狀已出現後終止疾病或病況之症狀。
    本文所用「治療有效劑量」係指藥物產生既定治療反應(例如，在靶組織中降低硫酸乙醯肝素含量及/或增強NaGlu活性)所需之劑量(例如，數量及/或間隔)。治療有效劑量係指與未接受此一劑量之相應個體相比，導致疾病、病症或副作用之改良的治療、治癒、預防或改善，或降低疾病或病症之發病或進展速率之劑量。該術語在其範圍內亦包括有效增強生理功能之劑量。
    本文所用術語「個體」或「患者」意欲包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，例如非人類靈長類、綿羊、犬、貓、牛、馬、雞、兩棲動物及爬行動物。較佳個體包括患有NaGlu缺陷或NaGlu相關疾病之人類個體。
    本文所用「NaGlu相關疾病」係由NaGlu活性介導或與異常NaGlu表現或活性相關之疾病或病況。NaGlu相關疾病之實例包括(但不限於)NaGlu缺陷，例如聖菲利柏氏症候群B(亦稱作IIIB型黏多糖貯積症)。
    本發明治療方法涵蓋有助於將重組人類NaGlu蛋白質攝取或運輸至有關器官及組織中之任何投與途徑。在一實施例中，本發明方法包括將本發明重組人類NaGlu蛋白質遞送至個體之CNS(中樞神經系統)、腎或肝中以供治療NaGlu相關疾病(例如，NaGlu缺陷)。舉例而言，可將重組人類NaGlu蛋白質靜脈內(例如，經由靜脈內注射或靜脈內輸注)投與患者且令人驚訝地跨越具有NaGlu缺陷之個體之血腦障壁(BBB)。在本發明另一實施例中，將重組人類NaGlu蛋白質經鞘內投與患者。
    A.用於鞘內遞送之裝置
    可使用各種裝置進行本發明之鞘內遞送。在一些實施例中，鞘內投與用裝置含有輸液埠(例如，可注射埠)；空心體(例如，導管)，其具有與輸液埠流體連通之第一流動孔口及經組態以插入脊髓中之第二流動孔口；及用於緊固空心體於脊髓中之插入之緊固機構。作為非限制性實例，適宜緊固機構含有一或多個安裝在空心體表面上之頭及可在一或多個頭上調節之縫合環，以防止空心體(例如，導管)滑出脊髓。在各個實施例中，輸液埠包含儲器。在一些實施例中，輸液埠包含機械幫浦(例如，輸注幫浦)。在一些實施例中，所植入導管連接至儲器(例如，用於濃注遞送)或輸注幫浦。輸液埠可為植入輸液埠或外部輸液埠。
    在一些實施例中，鞘內投與可藉由腰椎穿刺(即，緩慢濃注)或經由埠-導管遞送系統(即，輸注或濃注)來實施。在一些實施例中，將導管插入腰椎板之間，且尖端向上穿入鞘間隙至期望節段(一般L3-L4)。
    相對於靜脈內投與，適於鞘內投與之單劑量體積通常較小。通常，本發明鞘內遞送維持CSF組成之平衡以及個體之顱內壓。在一些實施例中，在實施鞘內遞送時未自個體移除相應CSF。在一些實施例中，適宜單劑量體積可為(例如)小於約10 mL、8 mL、6 mL、5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1.5 mL、1 mL或0.5 mL。在一些實施例中，適宜單劑量體積可為約0.5-5 mL、0.5-4 mL、0.5-3 mL、0.5-2 mL、0.5-1 mL、1-3 mL、1-5 mL、1.5-3 mL、1-4 mL或0.5-1.5 mL。在一些實施例中，本發明鞘內遞送涉及首先移除合意量之CSF之步驟。在一些實施例中，在鞘內投與前首先移除小於約10 mL(例如，小於約9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL)之CSF。在彼等情形下，適宜單劑量體積可為(例如)大於約3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、10 mL、15 mL或20 mL。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    可使用各種其他裝置來實現治療組合物之鞘內投與。舉例而言，可使用常用於鞘內投與腦膜癌病藥物之歐馬亞儲器(Ommaya reservoir)來給予含有期望酶之調配物(Lancet 2：983-84,1963)。更具體而言，在此方法中，將室管插入在前角中形成之孔洞且將其連接至安裝在頭皮下之歐馬亞儲器，且將儲器皮下穿刺以鞘內遞送注射至儲器中之所補充特定酶。用於將治療組合物或調配物鞘內投與個體之其他裝置闡述於美國專利第6,217,552號中，其中與該等裝置有關之全部內容係以引用方式併入本文中。或者，可藉由(例如)單次注射或連續輸注鞘內給予藥物。應理解，劑量治療可呈單劑量投與或多劑量形式。
    對於注射，可在液體溶液中調配本發明調配物。另外，可將NaGlu酶調配為固體形式且在即將使用前再次溶解或懸浮。亦包括凍乾形式。注射可呈(例如)NaGlu酶之濃注或連續輸注(例如，使用輸注幫浦)形式。
    在本發明之一實施例中，NaGlu酶係藉由側腦室注射投與至個體腦中。注射可經由(例如)在個體顱骨上製造之鑽孔來進行。在另一實施例中，酶及/或其他醫藥調配物係經由手術插入之分流器投與至個體之腦室中。舉例而言，可注射至較大側腦室中。在一些實施例中，亦可注射至較小之第三及第四腦室中。
    在另一實施例中，本發明中所用醫藥組合物係藉由注射投與至個體之腦部大池或腰區中。
    在本發明方法之另一實施例中，在將醫藥上可接受之調配物投與個體後，醫藥上可接受之調配物將本發明中所用酶或其他醫藥組合物向個體持續遞送(例如，「緩慢釋放」)至少一週、兩週、三週、四週或更長時間段。
    本文所用術語「持續遞送」係指在投與後經一段時間(較佳至少數天、一週或數週)活體內連續遞送本發明醫藥調配物。組合物之持續遞送可藉由(例如)酶隨時間之連續治療效應來顯示(例如，酶之持續遞送可藉由個體中儲存粒之量連續降低來顯示)。或者，酶之持續遞送可藉由隨時間檢測酶在活體內之存在來顯示。
    B.靜脈內遞送
    如上文所論述，本發明之一個令人驚訝的特徵係，本發明重組人類NaGlu蛋白質在靜脈內投與時能有效且廣泛地跨越血腦障壁(BBB)及腦表面擴散並透過腦之各個層或區域(包括深部腦區域)。本發明方法將rhNaGlu蛋白質有效遞送至中樞神經系統(CNS)之藉由現有CNS遞送方法難以靶向之各個組織、神經元或細胞中。此外，本發明方法將足量重組人類NaGlu蛋白質遞送至血流及各個週邊器官及組織中。
    「靜脈內注射」在醫學上通常稱作IV推注或濃注，其係指將注射器連接至IV輸液裝置且通常快速且不定時(若其可能引起靜脈刺激或過快效應，則長達15分鐘時間)地直接注射藥劑之投與途徑。在將藥劑注射至IV管路之流體流中後，必須有某一構件確保患者可自該管路獲得該藥劑。此通常係藉由容許流體流正常流動且由此將藥劑載至血流中來完成。然而，在一些情形中，在第一注射後使用第二流體注射(有時稱作「沖刷」)來幫助藥劑進入血流。
    「靜脈內輸注」係指投與途徑，其中經延長時間段遞送藥劑。舉例而言，可經介於1小時與8小時之間之時間段將藥劑遞送至患者。亦可經約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7或約8小時之時間將藥劑遞送至患者。為完成靜脈內輸注，可使用IV重力點滴或IV幫浦。當患者僅在某些時刻需要藥劑且不需要其他靜脈內流體(例如，可含有鈉、氯化物、葡萄糖或其任一組合之水溶液，例如彼等恢復電解質、血糖及水損失者)時，通常使用IV輸注。
    C.靶組織
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至個體之中樞神經系統(CNS)。在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至腦、脊髓及/或週邊器官中之一或多種靶組織。本文所用術語「靶組織」係指受欲治療之NaGlu相關疾病影響之任何組織或正常表現缺陷NaGlu之任何組織。在一些實施例中，靶組織包括在患有或易患NaGlu相關疾病之患者中，彼等有可檢測量或異常大量之酶受質儲存於(例如)組織之細胞溶酶體中之組織。在一些實施例中，靶組織包括彼等顯示疾病相關病狀、症狀或特徵之組織。在一些實施例中，靶組織包括彼等以升高量正常表現缺陷NaGlu之組織。本文所用靶組織可係腦靶組織、脊髓靶組織及/或週邊靶組織。實例性靶組織詳細闡述於下文中。
    D.腦靶組織
    一般而言，可將腦分為不同區域、層及組織。舉例而言，腦膜組織係包封中樞神經系統(包括腦)之膜系統。腦膜含有三個層，包括硬腦膜、蛛網膜及軟腦膜。一般而言，腦膜及腦脊髓液之主要功能係保護中樞神經系統。在一些實施例中，將本發明治療性蛋白質遞送至腦膜之一或多個層。
    腦具有三個主要分部，包括大腦、小腦及腦幹。大腦半球位於大部分其他腦結構上方且經皮質層覆蓋。腦幹位於大腦下方，其類似於附接有大腦之柄。小腦位於腦後部，大腦下方及腦幹後。
    間腦位於腦中線附近及中腦上方，其含有丘腦、丘腦後部、丘腦下部、丘腦上部、丘腦前部(prethalamus)及前頂蓋。中腦亦稱作中腦(midbrain)，其含有頂蓋、被蓋、腦室中腦水管(ventricular mesocoelia)及大腦腳、紅核及腦神經III核。中腦與視覺、聽覺、運動控制、睡眠/覺醒、警覺性及溫度調節有關。
    中樞神經系統(包括腦)中之組織區域可基於組織深度來表徵。舉例而言，CNS(例如，腦)組織可描述為表面或淺部組織、中等深度組織及/或深部組織。
    根據本發明，可將本發明rhNaGlu遞送至個體中與欲治療之特定疾病有關之任一適當腦靶組織。在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至表面或淺部腦靶組織。在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至中等深度腦靶組織。在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至深部腦靶組織。在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至表面或淺部腦靶組織、中等深度腦靶組織及/或深部腦靶組織之組合。在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至在腦外表面下方(或向內)至少4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10 mm或更深之深部腦組織。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至大腦之一或多種表面或淺部組織。在一些實施例中，所靶向之大腦表面或淺部組織位於自大腦表面起4 mm內。在一些實施例中，所靶向之大腦表面或淺部組織選自軟腦膜組織、大腦皮質帶組織、海馬回、魏-羅二氏隙(Virchow Robin space)、VR隙內之血管、海馬回、丘腦下部位元元於腦下表面上之部分、視神經及視束、嗅球及嗅突起及其組合。
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至大腦之一或多種深部組織。在一些實施例中，所靶向之大腦表面或淺部組織位於大腦表面下方(或向內)至少4 mm(例如，5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm或10 mm)處。在一些實施例中，所靶向之大腦深部組織包括大腦皮質帶。在一些實施例中，所靶向之大腦深部組織包括以下中之一或多者：間腦(例如，丘腦下部、丘腦、丘腦前部或丘腦底部)、後腦、豆狀核、基底神經節、尾狀核、被殼、杏仁核、蒼白球及其組合。
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至一或多種小腦組織。在某些實施例中，所靶向之一或多種小腦組織選自由以下組成之群：分子層之組織、柏金氏細胞層(Purkinje cell layer)之組織、顆粒細胞層之組織、小腦腳及其組合。在一些實施例中，將治療劑(例如，酶)遞送至一或多種小腦深部組織，包括(但不限於)柏金氏細胞層之組織、顆粒細胞層之組織、深部大腦白質組織(例如，相對於顆粒細胞層之深部組織)及深部小腦核組織。
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至一或多種腦幹組織。在一些實施例中，所靶向之一或多種腦幹組織包括腦幹白質組織及/或腦幹核組織。
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至各種腦組織，包括(但不限於)灰質、白質、室週區域、軟腦膜-蛛網膜、腦膜、新皮質、小腦、大腦皮質中之深部組織、分子層、尾狀核/被殼區域、中腦、橋腦或髓質及其組合。
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至腦中之各種細胞，包括(但不限於)神經元、神經膠細胞、血管週細胞及/或腦膜細胞。在一些實施例中，將治療性蛋白質遞送至深部白質之寡樹突細胞。
    E.脊髓靶組織
    一般而言，可基於組織之深度來表徵脊髓之區域或組織。舉例而言，脊髓組織可描述為表面或淺部組織、中等深度組織及/或深部組織。
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至一或多種脊髓表面或淺部組織。在一些實施例中，所靶向之脊髓表面或淺部組織位於自脊髓表面起4 mm內。在一些實施例中，所靶向之脊髓表面或淺部組織含有軟腦膜及/或白質束。
    在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至一或多種脊髓深部組織。在一些實施例中，所靶向之脊髓深部組織位於自脊髓表面向內4 mm。在一些實施例中，所靶向之脊髓深部組織含有脊髓灰質及/或室管膜細胞。
    在一些實施例中，將補充酶(例如，NaGlu融合蛋白)遞送至脊髓神經元。
    F.週邊靶組織
    本文所用週邊器官或組織係指並非中樞神經系統(CNS)之一部分之任何器官或組織。週邊靶組織可包括(但不限於)血液系統、肝、腎、心臟、內皮、骨髓及骨髓源細胞、脾、肺、淋巴結、骨、軟骨、卵巢及畢丸。在一些實施例中，將本發明rhNaGlu遞送至一或多種週邊靶組織。
    G.生物分佈及生物利用度
    在各個實施例中，在被遞送至靶組織後，本發明rhNaGlu定位於細胞內。舉例而言，本發明rhNaGlu可定位至靶細胞之外顯子、軸突、溶酶體、線粒體或空泡(例如，神經元，例如柏金氏細胞)。舉例而言，在一些實施例中，本發明rhNaGlu顯示易位動力學，從而使得rhNaGlu在血管週隙內移動(例如，藉由脈動輔助之對流機制)。另外，與所投與蛋白質或酶與神經絲之關聯有關之主動軸突運輸機制亦可促進或以其他方式幫助本發明rhNaGlu蛋白質分佈至中樞神經系統之較深組織中。
    在一些實施例中，根據本發明遞送之本發明rhNaGlu可在本文所述各種靶組織中達成治療或臨床有效含量或活性。本文所用治療或臨床有效含量或活性係足以在靶組織中賦予治療效應之含量或活性。治療效應可為客觀效應(即，可藉由某一測試或標記來量測)或主觀效應(即，個體給出效應之跡象或感覺到效應)。舉例而言，治療或臨床有效量或活性可係足以改善靶組織中之疾病相關症狀(例如，GAG儲存)之酶含量或活性。
    在一些實施例中，根據本發明遞送之本發明rhNaGlu可在靶組織中達成係相應NaGlu酶之正常含量或活性之至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之酶含量或活性。在一些實施例中，根據本發明遞送之本發明rhNaGlu可達成與對照(例如，未經治療之內源含量或活性)相比增加至至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍之酶含量或活性。在一些實施例中，根據本發明遞送之rhNaGlu可在靶組織中達成至少約10 nmol/hr/mg、20 nmol/hr/mg、40 nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60 nmol/hr/mg、70 nmol/hr/mg、80 nmol/hr/mg、90 nmol/hr/mg、100 nmol/hr/mg、150 nmol/hr/mg、200 nmol/hr/mg、250 nmol/hr/mg、300 nmol/hr/mg、350 nmol/hr/mg、400 nmol/hr/mg、450 nmol/hr/mg、500 nmol/hr/mg、550 nmol/hr/mg或600 nmol/hr/mg之增加之酶含量或活性。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，本發明之發明性方法尤其可用於靶向腰區。在一些實施例中，根據本發明遞送之rhNaGlu可在腰區中達成至少約500 nmol/hr/mg、600 nmol/hr/mg、700 nmol/hr/mg、800 nmol/hr/mg、900 nmol/hr/mg、1000 nmol/hr/mg、1500 nmol/hr/mg、2000 nmol/hr/mg、3000 nmol/hr/mg、4000 nmol/hr/mg、5000 nmol/hr/mg、6000 nmol/hr/mg、7000 nmol/hr/mg、8000 nmol/hr/mg、9000 nmol/hr/mg或10,000 nmol/hr/mg之增加之酶含量或活性。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    一般而言，根據本發明遞送之治療劑(例如，rhNaGlu)在腦之CSF及靶組織、脊髓及週邊器官中具有足夠長半衰期。在一些實施例中，根據本發明遞送之rhNaGlu可具有至少約30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、16小時、18小時、20小時、25小時、30小時、35小時、40小時、至多3天、至多7天、至多14天、至多21天或至多1個月之半衰期。在一些實施例中，在一些實施例中，根據本發明遞送之rhNaGlu可在投與後12小時、24小時、30小時、36小時、42小時、48小時、54小時、60小時、66小時、72小時、78小時、84小時、90小時、96小時、102小時或1週後，在CSF或血流中保留可檢測之含量或活性。可檢測之含量或活性可使用業內已知之各種方法來測定。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在某些實施例中，根據本發明遞送之rhNaGlu在投與後(例如，在將醫藥組合物投與個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間)，在個體之CNS組織及細胞中達成至少30 μg/mL之濃度。在某些實施例中，根據本發明遞送之rhNaGlu在投與個體後(例如，在將該等醫藥組合物投與個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間)，在該個體之所靶向組織或細胞(例如，腦組織或神經元)中達成至少2 μg/mL、至少15 μg/mL、至少1 μg/mL、至少7 μg/mL、至少5 μg/mL、至少2 μg/mL、至少1 μg/mL或至少0.5 μg/mL之濃度。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    H.聖菲利柏氏症候群之治療
    聖菲利波症候群或黏多糖貯積症III(MPS III)係罕見遺傳病症，其特徵在於參與糖胺聚糖(GAG)降解之酶之缺陷。在不存在酶時，部分降解之GAG分子無法自體內清除且在各種組織之溶酶體中積累，從而造成進行性泛發性體功能障礙(Neufeld及Muenzer，2001)。
    已確定四種不同形式之MPS III，命名為MPS IIIA、B、C及D。每一形式代表四種參與GAG硫酸乙醯肝素降解之酶中之一者之缺陷。所有形式皆包括不同程度之相同臨床症狀，包括粗糙面部特徵、肝脾腫大、角膜混濁及骨骼畸形。然而，最應注意的是認知能力之嚴重進行性損失，其不僅與硫酸乙醯肝素在神經元中之積累有關，且亦與初級GAG積累造成之神經節苷脂GM2、GM3及GD2之隨後升高有關(Walkley 1998)。
    IIIB型黏多糖貯積症(MPS IIIB；聖菲利波症候群B)係體染色體隱性病症，其特徵在於酶α-N-乙醯基-葡萄糖胺酶(NaGlu)之缺陷。在不存在此酶時，GAG硫酸乙醯肝素在神經元及神經膠細胞之溶酶體中積累，且在腦外有較少積累。
    此病症之定義性臨床特徵係中樞神經系統(CNS)退化，其導致喪失或無法達成主要發育里程碑。進行性認知衰退在癡呆及早發性死亡中達到頂點。該疾病通常在幼兒中自身表現，且患病個體之壽命通常不超過十八、九歲至二十歲出頭。
    本發明組合物及方法可用於有效治療患有或易患聖菲利柏氏症候群B之個體。本文所用術語「治療(treat)」或「治療(treatment)」係指改善一或多種疾病相關症狀，預防或延遲疾病之一或多種症狀之發作，及/或降低疾病之一或多種症狀之嚴重度或頻率。
    在一些實施例中，治療係指部分或完全減輕、改善、緩解、抑制聖菲利柏氏症候群B患者中之神經損害，延遲其發作，降低其嚴重度及/或發生率。本文所用術語「神經損害」包括與中樞神經系統(例如腦及脊髓)損害有關之各種症狀。神經損害之症狀尤其可包括(例如)發育遲緩、進行性認知損傷、聽力損失、語言發育受損、運動技能缺陷、活動過度、智力遲鈍、攻擊性及/或睡眠紊亂。
    因此，在一些實施例中，治療係指減少各種組織中之溶酶體儲存(例如，GAG之儲存)。在一些實施例中，治療係指減少腦靶組織、脊髓神經元及/或週邊靶組織中之溶酶體儲存。在某些實施例中，溶酶體儲存與對照相比減少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。在一些實施例中，溶酶體儲存與對照相比減少到至多1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10。在一些實施例中，溶酶體儲存係藉由LAMP-1染色來測定。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，治療係指減少神經元(例如，含有柏金氏細胞之神經元)中之空泡形成。在某些實施例中，神經元中之空泡形成與對照相比減少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。在一些實施例中，空泡形成與對照相比減少到至多1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，治療係指增強各種組織中之NaGlu酶活性。在一些實施例中，治療係指增強腦靶組織、脊髓神經元及/或週邊靶組織中之NaGlu酶活性。在一些實施例中，NaGlu酶活性與對照相比增強約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。在一些實施例中，NaGlu酶活性與對照相比增強至至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些實施例中，增強之NaGlu酶活性為至少約10 nmol/hr/mg、20 nmol/hr/mg、40 nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60 nmol/hr/mg、70 nmol/hr/mg、80 nmol/hr/mg、90 nmol/hr/mg、100 nmol/hr/mg、150 nmol/hr/mg、200 nmol/hr/mg、250 nmol/hr/mg、300 nmol/hr/mg、350 nmol/hr/mg、400 nmol/hr/mg、450 nmol/hr/mg、500 nmol/hr/mg、550 nmol/hr/mg、600 nmol/hr/mg或更多。在一些實施例中，腰區中之NaGlu酶活性增強。在一些實施例中，腰區中增強之NaGlu酶活性為至少約2000 nmol/hr/mg、3000 nmol/hr/mg、4000 nmol/hr/mg、5000 nmol/hr/mg、6000 nmol/hr/mg、7000 nmol/hr/mg、8000 nmol/hr/mg、9000 nmol/hr/mg、10,000 nmol/hr/mg或更多。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在某些實施例中，本發明之治療導致一或多種與NaGlu相關疾病有關之病理或生物標記之存在或者積累減少(例如，減少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、97.5%、99%或更多)或完全消除。該減少或消除在CNS細胞及組織(例如，神經元及寡樹突細胞)中尤其明顯。舉例而言，在一些實施例中，在投與個體後，本發明醫藥組合物顯示或達成個體之CNS細胞及組織中(例如，在大腦皮質、小腦、尾狀核及被殼、白質及/或丘腦中)生物標記溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)積累之減少。LAMP1係在溶酶體膜中大量表現之糖蛋白且其存在在許多患有溶酶體儲存病症之患者中有所增加(Meikle等人，Clin.Chem.(1997)43：1325-1335)。因此，LAMP1在患有溶酶體儲存症之患者中之存在或不存在(例如，如藉由LAMP染色所測定)可提供溶酶體活性之有用指示及用於診斷及監測溶酶體儲存症之標記。
    因此，本發明之一些實施例係關於減少或消除一或多種與NaGlu相關疾病有關之病理或生物標記之存在或積累之方法。類似地，本發明之一些實施例係關於提高一或多種與溶酶體儲存症有關之病理或生物標記(例如，LAMP1)之降解(或降解速率)之方法。
    在一些實施例中，治療係指降低認知能力損失之進展。在某些實施例中，認知能力損失之進展與對照相比降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。在一些實施例中，治療係指降低發育遲緩。在某些實施例中，發育遲緩與對照相比降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，治療係指延長存活(例如，存活時間)。舉例而言，治療可延長患者之預期壽命。在一些實施例中，本發明之治療可使患者之預期壽命與一或多個患有類似疾病且未經治療之對照個體之平均預期壽命相比延長超過約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約105%、約110%、約115%、約120%、約125%、約130%、約135%、約140%、約145%、約150%、約155%、約160%、約165%、約170%、約175%、約180%、約185%、約190%、約195%、約200%或更多。在一些實施例中，本發明之治療可使患者之預期壽命與一或多個患有類似疾病且未經治療之對照個體之平均預期壽命相比延長超過約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年或更長時間。在一些實施例中，本發明之治療使患者長期存活。本文所用術語「長期存活」係指存活時間或預期壽命長於約40年、45年、50年、55年、60年或更長時間。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    本文所用術語「改良」、「增加」或「減少」指示相對於對照之值。在一些實施例中，適宜對照係基線量測，例如在相同個體中在開始本文所述治療前之量測或在對照個體(或多個對照個體)中在不存在本文所述治療時之量測。「對照個體」係患有聖菲利柏氏症候群B之個體，其與所治療個體年齡大致相同及/或性別相同(以確保所治療個體與對照個體之疾病階段相當)。
    所治療個體(individual)(亦稱作「患者」或「個體(subject)」)係患有聖菲利柏氏症候群B或可能出現聖菲利柏氏症候群B之個體(胎兒、嬰兒、幼兒、青少年或成年人類)。該個體可具有殘留內源NaGlu表現及/或活性或無可量測活性。舉例而言，患有聖菲利柏氏症候群B之個體之NaGlu表現程度低於正常NaGlu表現程度之約30-50%、約25-30%、低於約20-25%、低於約15-20%、低於約10-15%、低於約5-10%、低於約0.1-5%。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，該個體係最近診斷患有該疾病之個體。通常，早期治療(診斷後儘可能快地開始的治療)對於使疾病之影響最小化及使治療之益處最大化而言至關重要。
    I.組合療法
    重組人類NaGlu蛋白質、例如含有足量寡糖(例如，甘露糖及磷酸化甘露糖(即，M6P))之重組人類NaGlu蛋白質可單獨或組合用於治療NaGlu相關疾病(例如，聖菲利柏氏症候群B)。應理解，本發明重組人類NaGlu蛋白質可單獨或與另一程式(例如手術程式)或藥劑(例如治療劑)組合使用，該另一程式或藥劑係由熟習此項技術者根據其既定目的來選擇。例如，另一程式或藥劑可為業內公認為可用於治療藉由本發明重組人類NaGlu蛋白質治療之疾病或病況之治療程式或藥劑。另一程式或藥劑亦可為賦予治療組合物以有益屬性之藥劑，例如影響組合物黏度之藥劑。
    亦應理解，本發明內包括之組合係彼等可用於其既定目的之組合。下文所述藥劑及程式係用於說明性目的且不欲限制本發明。作為本發明一部分之組合可係本發明重組人類NaGlu蛋白質及至少一種選自下文列表之另一藥劑或程式。若組合應使得所形成組合物可發揮其既定功能，則該組合亦可包括一種以上之另一藥劑或程式，例如兩種或三種其他藥劑。
    組合療法可包括手術程式、基因療法或酶補充療法。另外，可將重組人類NaGlu蛋白質與一或多種能預防或減少未降解受質之積累之其他治療劑(例如，其他重組蛋白質或抗體或藥物，例如，受質減少療法)共調配。
    在一或多個實施例中，組合療法可包括與免疫抑制劑共投與，如下文更詳細地論述。例如，若患者預期或經歷過敏性反應或不良免疫反應，則亦可在投與重組人類蛋白(例如重組人類NaGlu蛋白質)之前、期間或之後投與免疫抑制劑，例如(但不限於)抗組胺藥、皮質類固醇、西羅莫司(sirolimus)、伏環孢素(voclosporin)、環孢素(ciclosporin)、甲胺蝶呤(methotrexate)、針對IL-2受體之抗體、針對T細胞之抗體、針對TNF-α之抗體或融合蛋白(例如，英夫利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)或阿達木單抗(adalimumab))、CTLA-4-Ig(例如，阿巴他塞(abatacept))、抗OX-40抗體。
    J.免疫原性
    本發明醫藥組合物之特徵在於其耐受性。本文所用術語「可耐受的」及「耐受性」係指本發明醫藥組合物在投與該組合物之個體中不引發不良反應或者在投與該組合物之個體中不引發嚴重不良反應之能力。在一些實施例中，本發明醫藥組合物在投與該等組合物之個體中具有良好耐受性。
    一般而言，投與本發明rhNaGlu蛋白質不會在個體中造成嚴重不良效應。本文所用嚴重不良效應包括(但不限於)顯著免疫反應、毒性或死亡。本文所用術語「顯著免疫反應」係指嚴重或重大免疫反應，例如適應性T細胞免疫反應。
    因此，在多個實施例中，本發明之創新性方法不涉及合併免疫抑制劑療法(即，用作預治療/預調適或與該方法平行之任何免疫抑制劑療法)。在一些實施例中，本發明之創新性方法不涉及所治療個體中之免疫耐受性誘導。在一些實施例中，本發明之創新性方法不涉及使用T細胞免疫抑制劑對個體進行預治療或預調適。
    然而，在一些實施例中，個體在被投與本發明rhNaGlu之後出現免疫反應。因此，在一些實施例中，使接受本發明rhNaGlu之個體能耐受酶補充療法可能係有用的。可使用業內已知之各種方法來誘導免疫耐受性。舉例而言，可使用T細胞免疫抑制劑(例如環孢素A(CsA))及抗增殖劑(例如硫唑嘌呤(azathioprine，Aza)以及每週低劑量鞘內輸注所需補充酶之初始30-60天方案。
    熟習此項技術者已知之任一免疫抑制劑皆可與本發明之組合療法一起使用。該等免疫抑制劑包括(但不限於)環孢素、FK506、雷帕黴素(rapamycin)、CTLA4-Ig及抗TNF劑(例如依那西普)(例如，參見Moder,2000,Ann.Allergy Asthma Immunol.84,280-284；Nevins,2000,Curr.Opin.Pediatr.12,146-150；Kurlberg等人，2000,Scand.J.Immunol.51,224-230；Ideguchi等人，2000,Neuroscience 95,217-226；Potter等人，1999,Ann.N.Y.Acad.Sci.875,159-174；Slavik等人，1999,Immunol.Res.19,1-24；Gaziev等人，1999,Bone Marrow Transplant.25,689-696；Henry,1999,Clin.Transplant.13,209-220；Gummert等人，1999,J.Am.Soc.Nephrol.10,1366-1380；Qi等人，2000,Transplantation 69,1275-1283)。亦可使用已顯示在移植患者中有效之抗IL2受體(α-亞單位)抗體達利珠單抗(daclizumab，例如ZenapaxTM)作為免疫抑制劑(例如，參見Wiseman等人，1999,Drugs 58,1029-1042；Beniaminovitz等人，2000,N.Engl J.Med.342,613-619；Ponticelli等人，1999,Drugs R.D.1,55-60；Berard等人，1999,Pharmacotherapy 19,1 127-1 137；Eckhoff等人，2000,Transplantation 69,1867-1872；Ekberg等人，2000,Transpl.Int.13,151-159)。其他免疫抑制劑包括(但不限於)抗CD2(Branco等人，1999,Transplantation 68,1588-1596；Przepiorka等人，1998,Blood 92,4066-4071)、抗CD4(Marinova-Mutafchieva等人，2000,Arthritis Rheum.43,638-644；Fishwild等人，1999,Clin.Immunol.92,138-152)及抗CD40配體(Hong等人，2000,Semin.Nephrol.20,108-125；Chirmule等人，2000,J.Virol.74,3345-3352；Ito等人，2000,J.Immunol.164,1230-1235)。
    在其他實施例中，本發明包括包含共投與本發明NaGlu蛋白質及降低或抑制對NaGlu蛋白質之免疫反應之藥劑(例如免疫抑制劑)之方法。例如，若患者預期或經歷過敏性反應或不良免疫反應，則亦可在投與重組人類蛋白(例如重組人類NaGlu蛋白質)之前、期間或之後投與免疫抑制劑，例如(但不限於)抗組胺藥、皮質類固醇、西羅莫司、伏環孢素、環孢素、甲胺蝶呤、針對IL-2受體之抗體、針對T細胞之抗體、針對TNF-α之抗體或融合蛋白(例如，英夫利昔單抗、依那西普或阿達木單抗)、CTLA-4-Ig(例如，阿巴他塞)、抗OX-40抗體。
    在一實施例中，本發明提供預治療程式以最小化或預防可因投與本發明之重組蛋白質而引起的任何可能的過敏性反應。在一實施例中，為預防可能的過敏性反應，將H-1受體拮抗劑(亦稱作抗組胺藥，例如，苯海拉明(diphenhydramine))投與患者。在一實施例中，H-1受體拮抗劑係以約1 mg至約10 mg/公斤體重之劑量投與。舉例而言，抗組胺藥可以約5 mg/公斤之劑量投與。在一實施例中，抗組胺藥係以介於約0.1 mg/公斤體重與約10 mg/公斤體重之間之劑量投與。在一實施例中，抗組胺藥係以介於約1 mg/公斤體重與約5 mg/公斤體重之間之劑量投與。舉例而言，該劑量可為1 mg、2 mg、3 mg、4 mg或5 mg/公斤體重。抗組胺藥可藉由任何可用方法來投與。在一實施例中，抗組胺藥係靜脈內投與。在另一實施例中，抗組胺藥係以醫藥上可接受之膠囊來投與。
    可在投與本發明重組NaGlu之前投與抗組胺藥。在一實施例中，H-1受體拮抗劑係在投與重組NaGlu之前約10至約90分鐘(例如約30至約60分鐘)時投與。H-1受體拮抗劑可使用連接至血管輸液埠之移動式系統來投與。在一實施例中，抗組胺藥係在投與重組NaGlu之前約90分鐘時投與。在一實施例中，抗組胺藥係在投與重組NaGlu之前介於約10分鐘與約60分鐘之間時投與。在另一實施例中，抗組胺藥係在投與重組NaGlu之前介於約20分鐘與約40分鐘之間時投與。舉例而言，抗組胺藥可在投與重組NaGlu之前20、25、30、35或40分鐘時投與。
    在一實施例中，所投與抗組胺藥係苯海拉明。可使用任何可用抗組胺藥。該等抗組胺藥包括(但不限於)氯馬斯汀(clemastine)、多西拉敏(doxylamine)、氯雷他定(loratidine)、地氯雷他定(desloratidine)、非索非那定(fexofenadine)、非尼臘明(pheniramine)、西替利嗪(cetirizine)、依巴斯汀(ebastine)、普魯米近(promethazine)、氯苯比胺(chlorpheniramine)、左西替利嗪(levocetirizine)、奧洛他定(olopatadine)、喹硫平(quetiapine)、敏克靜(meclizine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、恩布拉敏(embramine)、二甲茚定(dimethidene)及右氯敏定(dexchloropheniramine)。
    在另一實施例中，對於靜脈內輸注，可藉由使用斜升(ramp-up)方案投與輸注劑來降低出現過敏性反應之可能。在此背景中，斜升方案係指隨輸注進程緩慢增加輸注速率，以使患者對藥劑之輸注不敏感。
    K.投與
    本發明方法涵蓋單次以及多次投與治療有效量之本文所述之本發明rhNaGlu。本發明rhNaGlu可端視個體病況之性質、嚴重度及程度以規律性間隔來投與。在一些實施例中，治療有效量之本發明rhNaGlu蛋白質可以規律性間隔(例如，每年一次、每6個月一次、每5個月一次、每3個月一次、每兩月(每兩個月一次)、每月(每個月一次)、每兩週(每兩週一次)或每週)週期性地靜脈內或鞘內投與。
    在一些實施例中，鞘內投與可結合其他投與途徑(例如，靜脈內、皮下、肌內、非經腸、經皮或經黏膜(例如，經口或經鼻))來使用。在一些實施例中，彼等其他投與途徑(例如，靜脈內投與)之實施頻率可不超過每兩週、每月、每兩個月一次、每3個月一次、每4個月一次、每5個月一次、每6個月一次、每年投與。
    本文所用術語「治療有效量」主要係基於本發明醫藥組合物中所含治療劑之總量來確定。一般而言，治療有效量足以為個體達成有意義之益處(例如，治療、調節、治癒、預防及/或改善潛在疾病或病況)。舉例而言，治療有效量可係足以達成期望治療及/或預防效應之量，例如足以調節溶酶體酶受體或其活性且由此治療該溶酶體儲存症或其症狀(例如，在將本發明組合物投與個體後減少或消除「斑馬體(zebra body)」或細胞空泡形成之存在或發生)之量。一般而言，投與有需要之個體之治療劑(例如，本發明rhNaGlu)之量將取決於該個體之特徵。該等特徵包括個體之病況、疾病嚴重度、一般健康情況、年齡、性別及體重。熟習此項技術者將能根據該等及其他相關因素容易地確定適當劑量。另外，可視情況採用客觀及主觀分析來確定最適劑量範圍。
    治療有效量一般以可包含多個單位劑量之投藥方案投與。對於任一特定治療性蛋白質而言，治療有效量(及/或在有效投藥方案內之適當單位劑量)可端視(例如)投與途徑、與其他醫藥劑之組合而變化。同樣，任一特定患者之具體治療有效量(及/或單位劑量)可取決於多種因素，包括所治療病症及該病症之嚴重度；所用具體醫藥劑之活性；所用具體組合物；患者之年齡、體重、一般健康情況、性別及飲食；所用具體融合蛋白之投與時間、投與途徑及/或排泄或代謝速率；治療持續時間；及醫學領域中熟知之類似因素。
    在一些實施例中，治療有效劑量介於約0.005 mg/kg體重至500 mg/kg體重範圍內，例如約0.005 mg/kg體重至400 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至300 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至200 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至100 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至90 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至80 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至70 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至60 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至50 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至40 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至30 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至25 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至20 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至15 mg/kg體重、約0.005 mg/kg體重至10 mg/kg體重。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值(例如，10-50 mg/kg、1-5 mg/kg、2-8 mg/kg、5-10 mg/kg、0.1-10 mg/kg、0.3-30 mg/kg、0.3-50 mg/kg、0.5-10 mg/kg、5-30 mg/kg或6-27 mg/kg)作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，治療有效劑量大於或至少為約0.1 mg/kg體重、大於或至少為約0.2 mg/kg體重、大於或至少為約0.3 mg/kg體重、大於或至少為約0.4 mg/kg體重、大於或至少為約0.5 mg/kg體重、大於或至少為約1.0 mg/kg體重、大於或至少為約3 mg/kg體重、大於或至少為約5 mg/kg體重、大於或至少為約6 mg/kg體重、大於或至少為約7 mg/kg體重、大於或至少為約10 mg/kg體重、大於或至少為約15 mg/kg體重、大於或至少為約20 mg/kg體重、大於或至少為約30 mg/kg體重、大於或至少為約40 mg/kg體重、大於或至少為約50 mg/kg體重、大於或至少為約60 mg/kg體重、大於或至少為約70 mg/kg體重、大於或至少為約80 mg/kg體重、大於或至少為約90 mg/kg體重、大於或至少為約100 mg/kg體重。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。
    在一些實施例中，治療有效劑量亦可藉由mg/kg腦重量來界定。如熟習此項技術者可瞭解，腦重量與體重可能相關(例如，參見Dekaban AS.「Changes in brain weights during the span of human life：relation of brain weights to body heights and body weights」，Ann Neurol 1978；4：345-56)。
    在一些實施例中，治療有效劑量亦可藉由mg/15 cc CSF來界定。如熟習此項技術者可瞭解，基於腦重量及體重之治療有效劑量可轉化為mg/15 cc CSF。舉例而言，成年人類中CSF之體積為約150 mL(Johanson CE等人，「Multiplicity of cerebrospinal fluid functions：New challenges in health and disease」Cerebrospinal Fluid Res.2008年5月14日；5：10)。因此，給予成人0.1 mg至50 mg蛋白質之單劑量注射可為成人中之約0.01 mg/15 cc CSF(0.1 mg)至5.0 mg/15 cc CSF(50 mg)劑量。
    另外應理解，對於任何特定個體，具體劑量方案應根據個體需要及投與酶補充療法之管理者或監督者之專業判斷隨時間加以調整，且本文所述劑量範圍僅係實例性，且不欲限制所主張本發明之範圍或實踐。 VIII.套組
    本發明另外提供含有本發明重組人類NaGlu之套組或其他製品且提供其重構(若凍乾)及/或使用之說明書。套組或其他製品可包括容器、導管及任何其他可用於鞘內投與及相關手術中之物件、裝置或設備。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器(例如，預填充注射器)、安瓿、藥筒、儲器或二室注射器給藥系統(lyo-ject)。容器可自諸如玻璃或塑膠等各種材料形成。在一些實施例中，容器係預填充注射器。適宜預填充注射器包括(但不限於)具有經烘烤聚矽氧塗層之硼矽酸鹽玻璃注射器、具有經噴塗聚矽氧之硼矽酸鹽玻璃注射器或不含聚矽氧之塑膠樹脂注射器。
    通常，位於容器上或與容器相連之標籤指示使用及/或重構說明。舉例而言，標籤可指示將調配物重構至上述蛋白質濃度。標籤可進一步指示調配物可用於或意欲用於(例如)靜脈內或鞘內投與。在一些實施例中，容器可含有單劑量之含有補充酶(例如，重組NaGlu蛋白質)之穩定調配物。在各個實施例中，單劑量之穩定調配物係以小於約15 mL、10 mL、5.0 mL、4.0 mL、3.5 mL、3.0 mL、2.5 mL、2.0 mL、1.5 mL、1.0 mL或0.5 mL之體積存在。或者，容納調配物之容器可為容許反覆投與(例如，投與2-6次)調配物之可重複使用之小瓶。套組或其他製品可進一步包括不含適宜稀釋劑(例如，BWFI、鹽水、緩衝鹽水)之第二容器。在混合稀釋劑與調配物後，重構調配物中之最終蛋白質濃度通常將為至少1 mg/mL(例如，至少5 mg/mL、至少10 mg/mL、至少25 mg/mL、至少50 mg/mL、至少75 mg/mL、至少100 mg/mL)。
    套組或其他製品可進一步包括自商業及使用者角度考慮合意之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、導管、注射器及具有使用說明之包裝插頁。亦涵蓋處於上述範圍及值中間之範圍及值作為本發明之一部分。 實例
    以下具體實例意欲闡釋本發明且不應視為限制申請專利範圍之範圍。整個本申請案以及圖式中引用之所有圖式及所有參考文獻、專利及已公開專利申請案之內容皆係全文以引用方式明確併入本文中。 實例1
    rhNaGlu之純化
    rhNaGlu蛋白質係藉由使用業內已知之方法來純化。將含有rhNaGlu之卵白(EW)在pH 6下溶解過夜且經由離心及/或深層過濾使其澄清。用1 M NaOAc緩衝液(pH 4)將EW調節至pH 6。對於深層過濾過程，使用T2600過濾器(PallTM,40 μm)作為第一過濾且隨後使用PDF1(PallTM,K200P,15 μm+EKS,0.22 μm)作為第二過濾步驟。該等過濾器為一次性使用之膜且每一過濾器之最佳化容量(capacity)為60 L EW/m2。膜之容積(hold volume)為2 L/m2(T2600)及4-5 L/m2(PDF1)。在該過程中，在收集經過濾EW之前清除容積。使用等於膜容積之緩衝液(20 mM磷酸鹽/137 mM NaCl,pH 6)來驅逐留在過濾器上之EW。
    應用苯基-HIC(疏水作用層析)管柱作為捕獲步驟。由於大部分卵白蛋白親水，99%卵白蛋白穿過HIC管柱進入流出物(flow through)。rhNaGlu與苯基-HIC具有較高疏水性結合。
    將含有rhNaGlu之卵白以30：1之比率加載至管柱上。在完成加載後，用平衡緩衝液、5 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6)及5 mM Tris緩衝液(pH 7.2)洗滌管柱。用30%丙二醇(pH 7.2)來沖提rhNaGlu。在完成加載後，用平衡緩衝液及5 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6)洗滌管柱。用30%丙二醇及5 mM Tris緩衝液(pH 7.2)來沖提rhNaGlu。管柱結合力為約4.5 mg/mL。穿過苯基-HIC管柱之rhNaGlu之純度可達到>95%(增加至950倍)。回收率為約80%，佔丙二醇沖提物之30%。
    用1 M乙酸將所沖提rhNaGlu流份調節至pH 5，且隨後將其加載至GigaCap S管柱上(EW：管柱大小=10：1)。用50 mM NaOAc緩衝液(pH 5)平衡管柱。在完成加載後，用平衡緩衝液洗滌管柱。用50 mM NaOAc/60 mM NaCl(pH 5)來沖提rhNaGlu。
    使用經純化rhNaGlu來實施蛋白質表徵。在SDS-PAGE上分析自卵白純化之rhNaGlu之分子量(約90 kDa)(圖6)。卵白中之rhNaGlu之平均表現程度展示於圖7中。自轉基因禽類產生之rhNaGlu之特徵概述於表2中。
    實例2
    rhNaGlu在卵白中之穩定性
    在產卵後7天打破單一卵並分析其活性。將內含物分為兩半且對每一半實施標準卵白澄清。將未經處理及經澄清之卵白等分且儲存於4℃及-20℃下以保持酶活性穩定性。卵白中之rhNaGlu顯示至少長達50天之穩定酶活性。
    評價冷凍/解凍循環穩定性。將經純化rhNaGlu在液氮中冷凍10秒且在37℃下解凍2 min。酶活性經10個循環顯示無變化。
    將經純化rhNaGlu透析至不同pH緩衝液中以量測純酶之穩定性。結果顯示，純rhNaGlu在pH 5-8之間穩定12天。 實例3
    寡糖剖析
    甘露糖-6-磷酸(M6P)係作為糖蛋白三級結構之重要部分之N-連接寡糖之末端單糖，且在納入糖蛋白之最終寡糖中時由存於細胞表面上之M6P受體識別且與其結合，隨後容許其內化至溶酶體中。因此，M6P係將糖蛋白靶向溶酶體之有效表位。
    對蛋白質糖基化之分析係糖蛋白表徵之重要部分。寡糖可作為O-連接聚糖經由絲胺酸或蘇胺酸連接至蛋白質，或作為N-連接聚糖經由天冬醯胺連接至蛋白質。
    為分析寡糖之結構，實施各種層析及光譜技術。採用高效陰離子交換層析與脈衝式安培檢測聯用(HPAEC-PAD)。使用此技術，將寡糖基於電荷快速分為一般類別(即，中性、帶有單電荷或帶有多電荷)且藉由與純標準品比較來測定其結構。
    所有方法皆係基於Hardy及Townsend所述之方案(Hardy,M.R.及Townsend,R.R.,「High-pH anion-exchange chromatography of glycoprotein-derived carbohydrates」,1994,Methods Enzymol.230：208-225)。在4℃下使用Tube-O-透析儀將轉基因禽類源rhNaGlu之經純化樣品對奈米純水透析約24小時以移除鹽及其他污染物。在整個透析過程期間四次補充奈米純水。在透析後，將每一樣品分為三等份。將欲用於中性及胺基糖分析之等份樣品用2 N三氟乙酸(TFA)在100℃下水解4小時，且將用於甘露糖-6-磷酸分析之等份樣品用6.75 N TFA在100℃下水解1.5小時。然後將水解產物在N2下乾燥，用50 μL H2O再次溶解，在冰中超音波處理7 min且將其轉移至注射小瓶中。
    將已知莫耳數之中性及胺基糖及甘露糖-6-磷酸之標準品混合物與樣品以相同方式同時水解。製備四種濃度之中性及胺基糖標準品混合物及甘露糖-6-磷酸以建立校正方程。藉由自校正方程之線性插值來量化樣品中每種糖之莫耳數。
    藉由HPAEC-PAD單獨分析寡糖譜及甘露糖-6-磷酸譜。儀器控制及數據採集係使用Dionex chromeleon軟體來完成。對經水解rhNaGlu之HPAEC-PAD分析檢測到M6P。M6P之平均量測量為3.8 μg(CV 3.7%)/210 μg經水解蛋白質。轉化為莫耳後為13.4 nmol M6P/2.8 nmol蛋白質，此等效於3.2莫耳M6P/莫耳蛋白質之比率。
    亦使用HPAEC-PAD獲得rhNaGlu(雞)之寡糖譜(參見圖8)。該等譜顯示單一樣品中PNGase F反應之良好可重複性。在對應於中性寡糖之區域(約10 min至約20 min)中觀察到峰叢。亦觀察到一組在約25 min與約35 min之間沖提之顯著較小之峰，其可能係由帶單電荷之物質產生。
    自轉基因禽類(雞)產生之rhNaGlu樣品獲得之單糖組成分析結果概述於表3中，其列示所分析rhNaGlu中每一單糖之平均莫耳比。
    實例4
    至纖維母細胞中之細胞攝取
    將野生型人類纖維母細胞及黏多糖貯積症III B(NaGlu缺陷)人類纖維母細胞置於24孔板中(2.5×104細胞/孔)且在37℃及5% CO2下培育過夜。使用含有纖維母細胞基本培養基之條件化培養基及具有低血清之纖維母細胞生長套組。將各種量之rhNaGlu(30、10、3.0、1.0、0.3及0 μg/mL)在37℃及5% CO2下共培育24小時以測定人類纖維母細胞之細胞攝取程度(參見，圖9)。用PBS將孔洗滌三次。以100 μL/孔添加裂解緩衝液且將板在37℃下培育10 min。將細胞裂解物轉移至1.5 mL離心管中。實施一個冷凍及解凍循環。將細胞裂解物以10,000 rpm離心10 min。使用25 μL上清液進行分析。分析時間為2小時。使用業內已知之方法且根據以下文獻中闡述之方法量測酶活性：Marsh等人，Clinical Genetics(1985)27：258-262；Chow等人，Carbohydrate Research(1981)96：87-93；Weber等人，Protein Expression and Purification,(2001)21：251-259)。
    如圖9中所示，陰性對照(即，MPS IIIB)不展現任何NaGlu活性，而陽性對照(即，野生型人類纖維母細胞)顯示NaGlu活性。經0.3 μg/mL rhNaGlu處理之MPS IIIB細胞展現在野生型纖維母細胞中觀察到之正常活性程度之約50%。經1 μg/mL rhNaGlu處理之MPS IIIB細胞顯示為在野生型細胞中所觀察到者約4倍之NaGlu活性。令人驚訝地，經30 μg/mL rhNaGlu處理之MPS IIIB細胞顯示為在野生型細胞中所觀察到者至少40倍之NaGlu活性。此結果表明，自轉基因禽類(雞)產生之rhNaGlu以較高程度有效內化至人類纖維母細胞中。
    為確定rhNaGlu是否係經由M6P受體介導之胞吞作用內化，實施M6P抑制分析。對於M6P抑制分析，將各種濃度之遊離M6P添加至經30 μg/mL rhNaGlu處理之人類MPS IIIB纖維母細胞中且如上所述量測酶活性。如圖10中所示，人類MPS IIIB纖維母細胞不展現任何NaGlu活性，表明遊離M6P有效抑制NaGlu攝取。與之相反，經30 μg/mL rhNaGlu處理之MPSIII纖維母細胞在不存在遊離M6P時展現較高程度之酶活性，表明蛋白質有效內化至NaGlu缺陷纖維母細胞中且保留活性。此酶活性受培養基中以0.03 mM及更高濃度存在之M6P單糖之抑制。條件化培養基中存在之1 mM M6P單糖抑制蛋白質細胞攝取之超過90%。
    該等結果表明，自轉基因禽類產生之rhNaGlu經由M6P受體介導之胞吞作用有效內化至MPS IIIB纖維母細胞中，且rhNaGlu與M6P單糖競爭受體識別。該等結果與聚糖分析一致，該聚糖分析揭示，自轉基因禽類產生之rhNaGlu上存在M6P結構。 實例5
    活性NaGlu融合蛋白之生成
    設計兩種不同rhNaGlu融合構築體以驗證在禽類表現系統中表現rhNaGlu融合蛋白之可行性。
    在一種構築體中，使用習用PCR及DNA重組技術將編碼8個連續天冬胺酸殘基(DDDDDDDD)之核酸序列與編碼NaGlu蛋白質之核酸序列在全長NaGlu cDNA序列(SEQ ID NO：2)之5'末端處融合。在另一種構築體中，編碼TfRL(即，THRPPMWSPVWP；SEQ ID NO：5)之核酸序列與編碼NaGlu之核酸序列在全長NaGlu cDNA序列之3'末端處融合。使用EcoRI及HindIII限制位點將每一構築體插入pTT22表現載體中。將所得載體各自轉染至人類胚腎(HEK)293細胞中且獲得表現大量融合NaGlu蛋白質之穩定純系。自條件化培養基分離與8個連續天冬胺酸殘基之鏈段在N-末端處融合之rhNaGlu蛋白質(AAA-NaGlu)及與運鐵蛋白受體配體(TfRL)在C-末端處融合之rhNaGlu蛋白質(NaGlu-TfRL)。
    使用業內已知方法量測AAA-NaGlu及NaGlu-TfRL之酶活性(例如，參見Marsh等人，Clinical Genetics(1985)27：258-262；Chow等人，Carbohydrate Research,(1981)96：87-93；Weber等人，Protein Expression and Purification(2001)21：251-259；Neufeld等人，Protein Expression and Purification(2000)19：202-211；及Weber等人，Human Molecular Genetics(1996)5：771-777)。
    如圖13及14中所示，自HEK293細胞產生之AAA-NaGlu及NaGlu-TfRL融合蛋白顯示較高程度之酶活性。該等結果確認了該等構築體可用於自轉基因禽類表現系統產生具有增加量之磷酸化甘露糖同時保留酶活性之NaGlu融合蛋白之可能性。 實例6
    至巨噬細胞中之細胞攝取
    亦量測自雞產生之rhNaGlu至人類巨噬細胞中之內化。將NR8383巨噬細胞與10 μg/mL rhNaGlu一起在F12生長培養基中在37℃及5% CO2下培育0、4、8、24、32及48小時。回收樣品且用PBS洗滌，之後將其裂解。將2.5×105細胞在1 mL裂解緩衝液(10 mM磷酸Na(pH 6.0)，0.05%NP40)中裂解，且將裂解物轉移至1.5 mL離心管中並以10,000 rpm離心10 min。藉由Bradford分析測定蛋白質濃度且冷凍各等份樣品以供NaGlu酶分析。
    使用標準方法量測酶活性。將25 mM受質(4-甲基傘形酮基2-乙醯胺基-2-去氧-a-D-吡喃葡萄糖苷)在奈米純水中稀釋至2 mM以形成工作受質原液。在分析緩衝液(1%牛血清白蛋白)中製備樣品之稀釋液。將25 μL 200 mM乙酸鈉分配至多孔板之孔中。將25 μL標準品及25 μL樣品添加至指定孔中。將50 μL工作受質原液添加至每一孔中且輕敲板以混合。將板用黏著膜密封且在37℃下培育30分鐘。然後藉由添加50 μL終止溶液(1 M甘胺酸，pH 12.5)來終止反應。將板置於使用底部螢光之微量板讀取器上且在360 nm激發及460 nm發射下量測強度。藉由與0.25 mM、0.125 mM、0.0625 mM、0.0312 mM、0.0156 mM及0.0078 mM之4-甲基傘形酮(4-MU)標準品比較來量測所釋放4-MU之濃度。
    如圖15中所繪示，與10 μg/mL rhNaGlu一起培育之巨噬細胞中之NaGlu活性程度在48小時時間中幾乎線性增加：巨噬細胞攝取rhNaGlu相當慢，但在所量測之整個時間段中穩定攝取。NaGlu活性之相對緩慢但延長之攝取(與在其糖基化結構中含有M6P及/或甘露糖之其他溶酶體酶相比)出人意料且令人驚訝。同樣令人驚訝且出人意料地，大量rhNaGlu蛋白質經延長時間被吸收至巨噬細胞中，從而使細胞內酶活性程度為在未暴露於rhNaGlu之野生型巨噬細胞中觀察到之基底程度之至少10、50、100、200、300、500或甚至1,000倍。該等結果顯示，rhNaGlu在細胞外以及細胞內環境中非常穩定。此外，該等結果表明，rhNaGlu可具有在活體內容許較長血清半衰期(例如，較長循環)及高血清濃度之物理化學特徵，該等性質對增強至中樞神經系統(CNS)中之攝取係理想的。
    實例7
    rhNaGlu至NaGlu缺陷小鼠中之投與
    自品系B6.129S6-NaGlu tm1Efn /J之配種對生成純合無效小鼠。以相同方式生成對照野生型小鼠。根據標準PCR方案實施基因定型。文獻中闡述，在出生時，純合NaGlu(-/-)無效小鼠富有活力，大小正常，且不顯示任何明顯身體或行為異常，但其在所有組織中皆展現無NaGlu(參見，Li等人，(1999)Proc.,Natl.Acad.Sci.USA 96：14505-14510)。在1個月年齡時，在大多數組織中發現形成空泡之巨噬細胞。腎臟上皮細胞及腦中一些部分中之神經元亦受影響。空泡形成隨著年齡而愈發顯著。在4-5個月時，小鼠在開放空間測試中顯示異常行為。較老動物可患有尿滯留及行走困難。純合無效NaGlu-/-小鼠之典型壽命係8-12個月(參見，Li等人，(1999)Proc.,Natl.Acad.Sci.USA 96：14505-14510)。
    靜脈內(IV)投與
    藉由尾靜脈注射靜脈內投與供試品及媒劑係根據下文來完成。在注射前，藉由用白熾燈溫和加熱動物或藉由將尾巴浸泡在約43℃之溫水中來達成血管擴張。然後將動物置於約束裝置中。在注射前，用70%異丙醇將尾巴表面消毒。尾側靜脈之位置緊貼皮下，且藉由施加拉力在尾遠端部分中辨別。將27G針斜面向上向靜脈中插入3-4 mm。然後以緩慢濃注形式經10秒時間投與供試品或媒劑，如藉由因所投與液體立刻佔據血管空間而觀察到靜脈變透明來證實。在移除針後，輕壓刺破部位來止血。立即遵照程式監測動物以確保正常活動。
    鞘內(IT)投與
    藉由腰椎穿刺注射鞘內投與供試品及媒劑係根據下文來完成。在注射前，使用在整個程式中經由鼻椎體維持之異氟烷麻醉動物。在每次注射前，根據需要藉由除毛來準備注射部位。將動物以俯臥體位置於平臺上，從而確保後肢跨在平臺上且動物背部形成凸曲線。在注射前用70%異丙醇擦洗背部表面且使其乾燥。觸摸檢查脊柱及髖骨以定位L4-L5或L5-L6邊緣。將30G針斜面朝向顱骨插入椎間隙中。藉由觀察閃尾(tail flick)來確認置放。然後以濃注形式投與供試品或媒劑。使動物自麻醉中恢復且立即遵照程式監測以確保四肢之正常活動及使用。
    結果
    每隔一天一次以6.75或27 mg/kg之劑量經由尾靜脈注射(IV投與)向12週齡NaGlu-/-小鼠(B6.129S6-NaGlu tm1Efn /J)投與rhNaGlu(雞)，總計5次劑量(rhNaGlu濃度分別為1.125或4.5 mg/mL)。類似地，每隔一天一次以0.31 mg/kg之劑量經由腰椎穿刺注射(IT投與)向12週齡NaGlu-/-小鼠投與rhNaGlu(雞)，總計5次劑量(NaGlu濃度為1.54 mg/mL)。每隔一天以相同劑量濃度將媒劑(10 mM磷酸鹽緩衝液、150 mM NaCl及0.02% Tween80，pH 5.5-5.8)投與NaGlu-/-剔除小鼠，共5次劑量。在研究持續期間亦維持未經治療之野生型及NaGlu-/-剔除小鼠。
    在第五次最終注射後4小時殺死動物。剖檢所有動物屍體且切除肝、腦、脾、心臟、肺及腎。徑向分開每一器官，提供用於冷凍(-80℃)及福馬林固定儲存之樣品。
    針對以下分析組織樣品：(1)硫酸乙醯肝素濃度，使用基於硫酸乙醯肝素二糖之SAX-HPLC分析之分析方法；及(2)α-N-乙醯基葡萄糖胺酶之酶活性，使用基於細胞之酶活性分析。
    使用包埋於石蠟中、以4 μm切片、安裝在載玻片上且經蘇木色素(hematoxylin)及曙紅(eosin)(H&E)染色之福馬林固定之組織樣品實施對腦、肝、腎、脾、心臟及肺組織之組織病理學評估。
    在以6.25及27 mg/kg體重之劑量將rhNaGlu(雞)反覆靜脈內投與(5次劑量經10天時間)NaGlu-/-小鼠後，NaGlu-/-小鼠的腦、肝及腎中之硫酸乙醯肝素濃度出現明顯劑量依賴性降低(表5；圖16-18)。在靜脈內投與後，腦及肝中之相對α-N-乙醯基葡萄糖胺酶活性有所提高(表6)。該等結果由於在經IV投與治療之NaGlu-/-小鼠中觀察到之NaGlu酶活性及所得受質清除率而出人意料且令人驚訝，從而表明，全身性投與之rhNaGlu(雞)分佈至NaGlu-/-小鼠腦中且即使在血腦障壁(BBB)存在下亦有效產生效力。
    在以0.31 mg/kg之劑量將rhNaGlu(雞)鞘內投與(5次劑量，經10天時間)NaGlu-/-小鼠後，NaGlu-/-小鼠腦中之硫酸乙醯肝素濃度降低(表5；圖19)，從而表明，rhNaGlu(雞)靶向腦且有效減少NaGlu-/-小鼠腦中之積累受質。

    * * *
    上文說明書中之每一實例皆係以解釋本發明而非限制本發明之方式來提供。事實上，熟習此項技術者可理解，可在本發明中進行各種修改、組合、添加、刪除及改變而不背離本發明之範圍或精神。例如，作為一實施例之一部分闡釋或闡述之特徵可用於另一實施例中以產生又一實施例。本發明意欲涵蓋該等修改、組合、添加、刪除及改變。
    出於所有目的，本文所引用之所有出版物、專利、專利申請案、互聯網網站及登錄號/數據庫序列(包括多核苷酸及多肽序列二者)皆係全文以引用方式併入本文中，併入程度如同每一個別出版物、專利、專利申請案、互聯網網站或登錄號/數據庫序列皆明確且個別地指明如此以引用方式併入一般。
    圖1繪示人類重組NaGlu之胺基酸序列(胺基酸殘基1-23，信號肽)。
    圖2繪示人類重組NaGlu之核酸序列(cDNA)，包括編碼信號肽之核酸序列。
    圖3繪示1.1 kb卵白蛋白啟動子之核酸序列。
    圖4A-D繪示用於禽類基因轉殖之pSIN-OV-1.1-I-rhNaGlu載體之核酸序列。
    圖5係pSIN-OV-1.1-I-rhNaGlu載體之示意圖。
    圖6繪示對自轉基因雞(Gallus)之卵白分離並純化之rhNaGlu進行之西方分析(Western analysis)。
    圖7繪示貯存於轉基因雞卵白中之rhNaGlu之平均濃度。
    圖8繪示使用HPAEC-PAD獲得之自轉基因雞產生之rhNaGlu之寡糖譜。
    圖9繪示在人類皮膚纖維母細胞中對rhNaGlu之攝取分析(MPS IIIB，NaGlu缺陷；正常，野生型人類皮膚纖維母細胞；1U酶活性=nmol蛋白質/hr)。
    圖10繪示使用各種濃度之M6P單糖對rhNaGlu(雞)之攝取抑制分析(1U酶活性=1 μmol蛋白質/min)。
    圖11繪示含有重組人類NaGlu融合構築體之pTT22載體之示意圖(AAA-NaGlu：融合至全長NaGlu之N-末端之酸性胺基酸殘基)。
    圖12繪示含有重組人類NaGlu融合構築體之pTT22載體之示意圖(NaGlu-TfRL：融合至全長NaGlu之C-末端之運鐵蛋白受體配體)。
    圖13繪示與自雞產生之rhNaGlu相比，自HEK293產生之AAA-NaGlu之酶活性。
    圖14繪示與自HEK293產生之AAA-NaGlu相比，自HEK293產生之NaGlu-TfRL之酶活性。
    圖15繪示隨時間(48小時)將rhNaGlu(雞)攝取至巨噬細胞細胞系(NR8383)中之程度。細胞NaGlu活性係以單位/mg蛋白質來量測。
    圖16繪示在靜脈內投與媒劑後在NaGlu(-/-)小鼠腎中(KO)；在劑量濃度為6.25 mg/kg之rhNaGlu雞中；或在劑量濃度為27 mg/kg之rhNaGlu雞中之硫酸乙醯肝素受質含量(μg/mg組織)。野生型(WT)小鼠未經處理。
    圖17繪示在靜脈內投與媒劑後在NaGlu(-/-)小鼠腦中(KO)；在劑量濃度為6.25 mg/kg之rhNaGlu雞中；或在劑量濃度為27 mg/kg之rhNaGlu雞中之硫酸乙醯肝素受質含量(μg/mg組織)。野生型(WT)小鼠未經處理。
    圖18繪示在靜脈內投與媒劑後在NaGlu(-/-)小鼠肝中(KO)；在劑量濃度為6.25 mg/kg之rhNaGlu雞中；或在劑量濃度為27 mg/kg之rhNaGlu雞中之硫酸乙醯肝素受質含量(μg/mg組織)。野生型(WT)小鼠未經處理。
    圖19繪示在鞘內投與媒劑後在NaGlu(-/-)小鼠腦中(KO)或在劑量濃度為0.31 mg/kg之rhNaGlu雞中之硫酸乙醯肝素受質含量(μg/mg組織)。野生型(WT)小鼠未經處理。
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    <212> PRT
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    <212> DNA
    <213> 人類
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    <212> DNA
    <213> 雞
    <400> 3
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    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> pSIN-OV-1.1-I-rhNaGlu
    <400> 4
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    <211> 12
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 運鐵蛋白受體配體(TfRL)
    <400> 5
    权利要求:
    Claims (88)
    [1] 一種組合物，其包含重組人類N-乙醯基-α-D-葡萄糖胺酶(rhNaGlu)之分離混合物，該rhNaGlu包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列24至743，其中該混合物中至少10%之該rhNaGlu包含至少一種具有甘露糖-6-磷酸(M6P)之聚糖結構。
    [2] 如請求項1之組合物，其中該具有M6P之rhNaGlu能被吸收至NaGlu缺陷之哺乳動物細胞中，從而使得內化rhNaGlu恢復在相同類型之野生型哺乳動物細胞中觀察到之正常NaGlu活性之至少50%。
    [3] 如請求項2之組合物，其中該聚糖結構係N-連接聚糖。
    [4] 如請求項3之組合物，其中該rhNaGlu含有至少1莫耳M6P/莫耳蛋白質。
    [5] 如請求項3之組合物，其中該rhNaGlu含有介於約1與約6莫耳之間之M6P/莫耳蛋白質。
    [6] 如請求項5之組合物，其中該rhNaGlu含有約2莫耳M6P/莫耳蛋白質。
    [7] 如請求項5之組合物，其中該rhNaGlu含有約3莫耳M6P/莫耳蛋白質。
    [8] 如請求項5之組合物，其中該rhNaGlu含有約4莫耳M6P/莫耳蛋白質。
    [9] 如請求項5之組合物，其中該rhNaGlu含有約5莫耳M6P/莫耳蛋白質。
    [10] 如請求項5之組合物，其中該rhNaGlu含有約6莫耳M6P/莫耳蛋白質。
    [11] 如請求項2之組合物，其中該NaGlu缺陷之哺乳動物細胞係人類細胞。
    [12] 如請求項11之組合物，其中該NaGlu缺陷之人類細胞係皮膚纖維母細胞、肝細胞或巨噬細胞。
    [13] 如請求項11之組合物，其中該NaGlu缺陷之人類細胞係神經元細胞。
    [14] 如請求項13之組合物，其中該rhNaGlu在全身投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    [15] 如請求項14之組合物，其中該rhNaGlu在靜脈內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    [16] 如請求項13之組合物，其中該rhNaGlu在鞘內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    [17] 如請求項2之組合物，其中該具有M6P之rhNaGlu由NaGlu缺陷細胞內化且恢復活體內正常NaGlu活性之至少100%。
    [18] 如請求項2之組合物，其中該具有M6P之rhNaGlu含有至少25莫耳甘露糖/莫耳蛋白質。
    [19] 如請求項1之組合物，其中該混合物中至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%之該rhNaGlu含有M6P。
    [20] 如請求項19之組合物，其中該混合物中至少20%之該rhNaGlu含有至少一個M6P。
    [21] 如請求項20之組合物，其中該混合物中至少30%之該rhNaGlu含有至少一個M6P。
    [22] 如請求項21之組合物，其中該混合物中至少40%之該rhNaGlu含有至少一個M6P。
    [23] 如請求項22之組合物，其中該混合物中至少50%之該rhNaGlu含有至少一個M6P。
    [24] 如請求項23之組合物，其中該混合物中至少60%之該rhNaGlu含有至少一個M6P。
    [25] 一種組合物，其包含重組人類N-乙醯基-α-D-葡萄糖胺酶(rhNaGlu)之分離混合物，該rhNaGlu包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列24至743，其中該混合物包含足量含有一或多種包含甘露糖-6-磷酸(M6P)之聚糖結構之rhNaGlu，從而使得該含有M6P之rhNaGlu經由M6P受體介導之胞吞作用內化至具有NaGlu缺陷之哺乳動物細胞中且恢復在表現內源NaGlu之相同類型之野生型細胞中觀察到之NaGlu活性的至少50%。
    [26] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu經N-連接糖基化。
    [27] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu經O-連接糖基化。
    [28] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu包含至少1莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。
    [29] 如請求項26之組合物，其中該rhNaGlu包含約1、2、3、4、5或6莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。
    [30] 如請求項29之組合物，其中該rhNaGlu包含約3莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。
    [31] 如請求項29之組合物，其中該rhNaGlu包含約4莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。
    [32] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu包含甘露糖。
    [33] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu包含N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)。
    [34] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu包含半乳糖。
    [35] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu包含N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。
    [36] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu不含岩藻糖。
    [37] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu不含葡萄糖。
    [38] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu恢復正常NaGlu酶活性之至少60%、70%、80%、90%、95%或100%。
    [39] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu在全身投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    [40] 如請求項39之組合物，其中該rhNaGlu在靜脈內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    [41] 如請求項25之組合物，其中該NaGlu缺陷之哺乳動物細胞係人類細胞。
    [42] 如請求項41之組合物，其中該人類細胞係皮膚纖維母細胞、肝細胞或巨噬細胞。
    [43] 如請求項41之組合物，其中該NaGlu缺陷之人類細胞係神經元細胞。
    [44] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu係包含第二部分之融合蛋白。
    [45] 如請求項44之組合物，其中該第二部分係多肽。
    [46] 如請求項45之組合物，其中該多肽選自由以下組成之群：運鐵蛋白受體配體(TfRL)、胰島素樣生長因數受體(IGF2R)配體、低密度脂蛋白(LDL)受體配體及酸性胺基酸(AAA)殘基。
    [47] 如請求項25之組合物，其中該rhNaGlu係自轉基因禽類產生。
    [48] 如請求項47之組合物，其中該轉基因禽類係雞、火雞、鴨或鵪鶉。
    [49] 如請求項48之組合物，其中該轉基因禽類係雞。
    [50] 如請求項49之組合物，其中該rhNaGlu係自輸卵管細胞產生。
    [51] 一種組合物，其包含分離之重組人類N-乙醯基-α-D-葡萄糖胺酶(rhNaGlu)，該rhNaGlu包含一或多種具有足量甘露糖-6-磷酸(M6P)之聚糖結構，此容許該rhNaGlu經由M6P受體介導之胞吞作用內化至具有NaGlu缺陷之哺乳動物細胞中，從而使得當在活體內內化時，該rhNaGlu恢復在正常個體中之相同類型的細胞中觀察到之NaGlu活性之至少50%。
    [52] 如請求項51之組合物，其中該rhNaGlu蛋白質經N-連接糖基化。
    [53] 如請求項51之組合物，其中該rhNaGlu蛋白質經O-連接糖基化。
    [54] 如請求項51之組合物，其中該rhNaGlu包含約2、3、4、5或6莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。
    [55] 如請求項51之組合物，其中該rhNaGlu在全身投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    [56] 如請求項55之組合物，其中該rhNaGlu在靜脈內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    [57] 如請求項51之組合物，其中該rhNaGlu在鞘內投與時被有效遞送至具有NaGlu缺陷之哺乳動物之腦中。
    [58] 一種包含轉基因之轉基因禽類，該轉基因含有可操作連接至編碼重組人類NaGlu(rhNaGlu)之核酸序列之啟動子，其中該轉基因含於該轉基因禽類之基因組中且在輸卵管細胞中表現，從而使得該rhNaGlu在該轉基因禽類之該輸卵管細胞中糖基化，分泌至輸卵管管腔中且貯存於該轉基因禽類之卵之卵白中。
    [59] 如請求項58之轉基因禽類，其中該rhNaGlu包含約2、3、4或6莫耳M6P/莫耳rhNaGlu。
    [60] 如請求項58之轉基因禽類，其中該啟動子組件係輸卵管特異性啟動子。
    [61] 如請求項60之轉基因禽類，其中該輸卵管特異性啟動子係卵白蛋白啟動子。
    [62] 如請求項58之轉基因禽類，其中該轉基因禽類選自由以下組成之群：雞、火雞、鴨及鵪鶉。
    [63] 一種卵，其係由如請求項58之轉基因禽類產生。
    [64] 一種產生重組人類NaGlu(rhNaGlu)之方法，其包含：a)產生包含轉基因之轉基因禽類，該轉基因具有可操作連接至編碼闡述於SEQ ID NO：1之24至743中之該rhNaGlu之核酸序列之啟動子組件，其中該轉基因含於該轉基因禽類之基因組中且在輸卵管細胞中表現，從而使得該rhNaGlu在該轉基因禽類之該輸卵管細胞中糖基化，分泌至輸卵管管腔中且貯存於該轉基因禽類所產卵之卵白中；及b)自該卵白分離該rhNaGlu。
    [65] 如請求項64之方法，其中該啟動子組件係輸卵管特異性啟動子。
    [66] 如請求項65之方法，其中該輸卵管特異性啟動子係卵白蛋白啟動子。
    [67] 如請求項64之方法，其中該禽類選自由以下組成之群：雞、火雞、鴨及鵪鶉。
    [68] 如請求項67之方法，其中該禽類係雞。
    [69] 一種載體，其包含編碼人類NaGlu且與卵白蛋白啟動子可操作連接之核苷酸序列。
    [70] 一種宿主細胞，其包含如請求項69之載體。
    [71] 一種分離核酸，其包含SEQ ID NO：4中5232至10248之核酸序列。
    [72] 一種醫藥調配物，其包含如請求項1之組合物與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。
    [73] 一種組合物，其包含在靜脈內投與時跨越具有NaGlu缺陷之哺乳動物之血腦障壁之重組人類NaGlu蛋白質。
    [74] 一種治療具有NaGlu缺陷之個體之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1、25或51中任一項之組合物。
    [75] 一種將重組人類NaGlu蛋白質遞送至具有NaGlu缺陷之個體之腦中之方法，該方法包含將重組人類NaGlu蛋白質靜脈內投與該個體。
    [76] 一種將重組人類NaGlu蛋白質以治療有效量自循環運輸跨越血腦障壁之方法，該方法包含將重組人類NaGlu蛋白質靜脈內投與具有NaGlu缺陷之個體。
    [77] 如請求項74至76中任一項之方法，其中該NaGlu缺陷係聖菲利柏氏症候群B(Sanfilippo syndrome B)。
    [78] 如請求項74至76中任一項之方法，其中該個體係人類。
    [79] 如請求項74至76中任一項之方法，其中以約1至約30 mg/kg體重之劑量將該重組人類NaGlu蛋白質靜脈內投與該個體。
    [80] 如請求項79之方法，其中以約6至約27 mg/kg體重之劑量將該重組人類NaGlu蛋白質靜脈內投與該個體。
    [81] 如請求項74之方法，其中將該重組人類NaGlu蛋白質鞘內投與該個體。
    [82] 如請求項81之方法，其中該重組人類NaGlu蛋白質係以至少約0.3 mg/kg體重之劑量鞘內投與。
    [83] 如請求項82之方法，其中該重組人類NaGlu蛋白質係以約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg體重之劑量鞘內投與。
    [84] 如請求項82之方法，其中該重組人類NaGlu蛋白質係以約10至約30 mg/kg體重之劑量鞘內投與。
    [85] 如請求項74之方法，其中該治療有效量係有效降低該個體之腦、腎或肝中之硫酸乙醯肝素含量之量。
    [86] 如請求項74之方法，其中該治療有效量係有效增強該個體之腦或肝中之NaGlu活性之量。
    [87] 如請求項74之方法，其進一步包含投與第二治療劑。
    [88] 如請求項87之方法，其中該第二治療劑係免疫抑制劑。
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161546248P| true| 2011-10-12|2011-10-12||
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