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    本發明確定一種與特定之生長抑制物質之解毒、代謝相關之細胞色素P450。本發明編碼一種包含編碼包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質的聚核苷酸，且分類為源自印度水稻之CYP72A31的細胞色素P450。
    公开号:TW201321510A
    申请号:TW101137878
    申请日:2012-10-12
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Hiroaki SAIKA；Fumio Taguchi；Kiyosumi Hori；Takashi Matsumoto；Tsuyoshi Tanaka；Junko HORITA；Koichiro Kaku；Tsutomu Shimizu
    申请人:Nat Inst Of Agrobio Sciences；Kumiai Chemical Industry Co；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    編碼細胞色素P450之基因及其利用
    本發明係關於一種編碼具有特徵活性之細胞色素P450之基因及其利用，更具體而言，係關於具有該基因之表現載體、具有該表現載體之轉形體以及基因轉殖植物、對於具有對植物生長有害之作用之物質具有抗性之植物的製造方法、防除對植物有害之雜草之方法。
    作為對植物發揮致死作用之物質及發揮延遲植物生長之作用之物質，存在多種多樣。以下，將對植物發揮致死作用之物質及發揮延遲植物生長之作用之物質統稱為具有對植物生長有害之作用之物質或生長抑制物質。
    例如對於農園藝用之農藥類或生長調節劑、肥料、材料等，有時亦對會經處理之植物產生危害作用，該等通常稱為藥害或肥料燒苗等。進而，已知微生物或節肢動物、線蟲等動物甚至其他植物有時亦產生生長抑制物質而帶來危害作用。
    針對該等生長抑制物質，為了避免其危害，作為於植物方面具有之方法，可列舉：藉由該物質之解毒、代謝的無毒化，吸收、轉移之抑制，排出之促進等。其中，尤其重要的是該物質之解毒、代謝功能之活化。作為此種與解毒、代謝相關之分子種類之例，已知有具有單氧化酶活性之細胞色素P450(非專利文獻1)。於水稻中鑑定出350種以上之P450，於阿拉伯芥中亦鑑定出240種以上之P450(非專利文獻2)。然而，藉由細胞色素P450之生長抑制物質之解毒、代謝之機制的全貌尚未闡明。
    因此，藉由明確細胞色素P450之生長抑制物質之解毒、代謝之機制的一部分，例如可對所需之植物賦予對生長抑制物質之抗性。又，若可確定與特定之生長抑制物質之解毒、代謝相關之細胞色素P450基因，則可提供一種以該細胞色素P450基因作為選擇標記物而利用之轉形方法。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
    [非專利文獻1] Daniele Werck-Reichhart等，植物科學發展趨勢，5，3，116-123 (2000)
    [非專利文獻2] David R. Nelson等，植物生理學，135，756-772 (2004)
    然而，如上述般，關於具有各種不同作用機理之大量生長抑制物質，藉由與細胞色素P450之關連而解毒、代謝之機制尚未闡明。因此，如上述般，難以利用細胞色素P450基因，對所需之植物賦予對生長抑制物質之抗性，或實現以該細胞色素P450基因作為選擇標記物而利用之轉形方法。
    因此，本發明之目的在於確定一種與特定之生長抑制物質之解毒、代謝相關之細胞色素P450，並利用編碼該細胞色素P450之基因。
    本發明者為了解決上述課題進行努力研究，結果藉由鑑定與對植物之生長抑制物質之抗性相關的細胞色素P450基因，並利用該細胞色素P450基因，成功製作出對該生長抑制物質具有抗性之植物，並構建以該細胞色素P450基因作為選擇標記物基因而利用之轉形方法等，從而完成本發明。
    即，本發明包括以下內容。
    (1)一種基因，其編碼包含以下(a)至(c)中之任一聚核苷酸且分類為源自印度水稻之CYP72A31的細胞色素P450，(a)編碼包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質的聚核苷酸，(b)編碼包含序列編號2之胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或複數個胺基酸之胺基酸序列之蛋白質，且作為賦予對生長抑制物質之抗性之基因而發揮功能的聚核苷酸，(c)在嚴格條件下和包含與序列編號1之鹼基序列互補之鹼基序列的聚核苷酸進行雜交，且作為賦予對生長抑制物質之抗性之基因而發揮功能的聚核苷酸。
    (2)一種表現載體，其含有如上述(1)之基因。
    (3)如(2)之表現載體，其中進而組入有與上述基因不同之任意基因。
    (4)一種轉形體，其含有如上述(2)或(3)之表現載體。
    (5)一種基因轉殖植物，其含有如上述(2)或(3)之表現載體。
    (6)如(5)之基因轉殖植物，其中植物為植物體、植物器官、植物組織或植物培養細胞。
    (7)一種具有對生長抑制物質之抗性的植物之製造方法，其特徵在於：培養或栽培如上述(5)或(6)之基因轉殖植物。
    (8)一種藉由於栽培有如上述(5)或(6)之基因轉殖植物之田地中利用生長抑制物質進行處理而防除對該植物有害之雜草的方法。
    (9)一種轉形方法，其包括：對顯示出對生長抑制物質之感受性之宿主導入如上述(3)之表現載體的步驟；及將於該生長抑制物質之存在下生長之細胞作為轉形體進行選拔的步驟。
    本說明書包括作為本申請案之優先權基礎之日本專利申請案2011-226174號之說明書及/或圖式所記載之內容。
    根據本發明，藉由利用編碼與植物之生長抑制物質之解毒、代謝相關之細胞色素P450的基因，可對植物賦予對該生長抑制物質之抗性。又，藉由以本發明之細胞色素P450基因作為選擇標記物基因而利用，可構建全新之轉形方法。進而，本發明之細胞色素P450基因可作為對植物之生長抑制物質之抗性之指標即抗性標記物基因而利用。
    以下，對本發明進行詳細說明。 1.細胞色素P450基因
    本發明之細胞色素P450基因(以下簡稱為P450基因)係與印度水稻所具有之雙草醚鈉鹽(BS，Bispyribac-sodium)抗性相關者。該P450係分類為CYP72A31，作為基因組序列已公開之日本晴(日本型水稻)中其5'末端缺失之偽基因而為人所知。即，本發明中確定之源自印度水稻之CYP72A31並未以於日本型水稻中發揮功能之形式保存。再者，該分類為CYP72A31之P450基因若與其他細胞色素P450基因即CYP72A32基因及CYP72A33基因進行比較，則所編碼之蛋白質具有80%左右之胺基酸同源性。但，該等CYP72A32基因及CYP72A33基因編碼之細胞色素P450並不顯示賦予對BS之抗性之作用機理。因此，本發明之P450基因可確定為日本型水稻中不存在之印度水稻所具有之BS抗性的原因基因。
    再者，決定源自印度水稻之CYP72A31之鹼基序列，於此基礎上檢索DDBJ(DNA Data Bank of Japan，日本DNA資料庫)之基因組概覽序列(GSS，genomic survey sequence)資料庫(其他區段中)及SciFinder之資料庫，結果檢索到完全一致之寄存編號CL959279。其中，該寄存編號CL959279係作為印度水稻之基因組解析結果之一部分寄存於GSS中者。又，寄存編號CL959279並未附註解，無法推斷其功能。又，若以由源自印度水稻之CYP72A31之鹼基序列所推斷之胺基酸序列作為查詢序列進行blastp檢索，則檢索到完全一致之寄存編號EAY74842。該寄存編號EAY74842係根據上述印度水稻之基因組解析預測ORF(Open Reading Frame，開放閱讀框架)而寄存者。又，寄存編號EAY74842附有註解稱推斷為細胞色素P450，但基於表現解析等之結果並未確定為細胞色素P450。
    將分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450基因之鹼基序列及該基因編碼之蛋白質之胺基酸序列分別表示於序列編號1及2。其中，作為分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450基因，並不限定於序列編號1及2中所確定者，亦可為鹼基序列或胺基酸序列不同但為旁系同源關係或狹義之同源關係之基因。
    又，分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450基因並不限定於該等序列編號1及2中所確定者，例如亦可為編碼如下蛋白質者，該蛋白質具有與序列編號2之胺基酸序列具有70%以上、較佳為80%以上、更佳為90%以上、最佳為95%以上之序列類似性的胺基酸序列，作為細胞色素P450發揮功能，且具有賦予對植物之生長抑制物質之抗性的功能。序列類似性之值可利用安裝有BLAST演算法之BLASTN或BLASTX程式算出(預設值之設定)。再者，序列類似性之值係算出將一對胺基酸序列進行雙序列比對(Pairwise Alignment)分析時完全一致之胺基酸殘基與物理化學上功能類似之胺基酸殘基的合計，以比較之總胺基酸殘基中之上述合計數之比率的形式算出。
    進而，分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450基因並不限定於該等序列編號1及2中所確定者，例如亦可為編碼如下蛋白質者，該蛋白質係具有針對序列編號2之胺基酸序列而置換、缺失、插入或附加1個或數個胺基酸之胺基酸序列，作為細胞色素P450而發揮功能，且具有賦予對植物之生長抑制物質之抗性的功能。此處，所謂數個，例如為2~30個，較佳為2~20個，更佳為2~10個，最佳為2~5個。
    進而又，分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450基因並不限定於該等序列編號1及2中所確定者，例如亦可為編碼如下蛋白質者，該蛋白質係針對包含序列編號1之鹼基序列之DNA的互補鏈之全部或一部分於嚴格條件下進行雜交，作為細胞色素P450而發揮功能，且具有賦予對植物之生長抑制物質之抗性的功能者。此處所謂之「嚴格條件」，意指形成所謂特異性雜交而不形成非特異性雜交之條件，例如可參照「分子選殖：實驗手冊」(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第三版)酌情而定。具體而言，可藉由南方雜交法(Southern hybridization)時之溫度或溶液中所含之鹽濃度、及南方雜交法之清洗步驟時之溫度或溶液中所含之鹽濃度而設定嚴格度。更詳細而言，作為嚴格條件，例如鈉濃度為25~500 mM，較佳為25~300 mM，溫度為42~68℃，較佳為42~65℃。更具體而言，為5×SSC(83 mM NaCl、83 mM檸檬酸鈉)、溫度42℃。
    如上述般，包含與序列編號1不同之鹼基序列之基因、或編碼與序列編號2不同之胺基酸序列之基因是否編碼作為細胞色素P450而發揮功能且具有賦予對植物之生長抑制物質之抗性之功能的蛋白質，可藉由如下方法確認：使用將該基因組入源自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之Nos啟動子與終止子等之間而成的表現載體，製作轉形植物，調查於使未轉形之植物枯死之生長抑制物質的存在下該轉形植物可否生長。再者，作為生長抑制物質，可使用雙草醚鈉鹽，但並不特別限定於此。
    再者，於實施例中說明詳細情況，分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450基因係具有對植物賦予對生長抑制物質之抗性之功能者，藉由所謂圖譜定址選殖(map-based cloning)而明確。所謂圖譜定址選殖，係作為於近緣之生物種間研究對生理活性物質等之感受性之差異的方法而為人所知之方法。圖譜定址選殖係以詳細之基因圖譜為基礎並利用DNA標記物縮限候補染色體區域而確定目標基因的方法。即，根據日本晴(日本型水稻)之基因組序列解碼之情況，製作日本型水稻與印度水稻之雜交系，藉由進行詳細之定址而製作出以日本型水稻之基因序列為基礎而部分置換為印度水稻之基因序列的染色體片段置換系群(Chromosome segment substitution lines，CSSL)。藉由使用該等調查對生理活性物質等之感受性之差異，可確定生理活性物質等之感受性之差異位於染色體之何區域。生理活性物質等之感受性試驗可藉由結冷膠培養基試驗、瓊脂培養基試驗、水耕試驗或盆栽試驗等進行發芽試驗或生長試驗。
    再者，作為染色體片段置換系群，有越光/Kasalath染色體片段置換系群(生物資源研究所基因組資源中心(獨立行政法人)，http：//www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/ineKKCSSL39.html)及越光/NonaBokra染色體部分置換系群(生物資源研究所基因組資源中心(獨立行政法人)，http：//www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/ineKNCSSL44.html)。 2.表現載體
    本發明之表現載體可藉由於適當之載體上連結(插入)本發明之細胞色素P450基因而獲得。用於插入本發明之細胞色素P450基因之載體只要為於宿主中可複製者則並無特別限定，例如可列舉質體、穿梭載體、輔助質體等。
    作為質體DNA，可列舉：源自大腸桿菌之質體(例如pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、源自枯草芽胞桿菌之質體(例如pUB110、pTP5等)、源自酵母之質體(例如YEp13、YCp50等)等；作為噬菌體DNA，可列舉λ噬菌體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。進而，亦可使用反轉錄病毒或牛痘病毒等動物病毒、桿狀病毒等昆蟲病毒載體。
    於載體中插入本發明之細胞色素P450基因係採用如下方法等：首先純化含有細胞色素P450基因之DNA片段，將經純化之該DNA片段以適當之限制酵素切斷，插入至適當之載體DNA之限制酵素部位或多選殖位點而連結於載體上。
    於本發明中，為了使任意基因表現，可於上述表現載體上進而插入該任意基因。插入任意基因之方法係與於載體中插入本發明之細胞色素P450基因之方法相同。
    關於本發明之細胞色素P450基因，可於使其連結於源自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之Nos啟動子與終止子等之間使用並導入至植物中後，調查除草劑抗性。再者，作為啟動子，除Nos啟動子以外，例如亦可列舉：椰菜嵌紋病毒35S啟動子(CaMV35S)、各種肌動蛋白基因啟動子、各種泛蛋白基因啟動子、胭脂鹼合成酵素基因之啟動子、菸草之PR1a基因啟動子、番茄之核酮糖1,5-二磷酸羧化酵素/氧化酵素小次單元基因啟動子、油菜籽蛋白基因(Napin Gene)啟動子、油體蛋白基因(Oleosin Gene)啟動子等。其中，可更佳地使用椰菜嵌紋病毒35S啟動子、肌動蛋白基因啟動子或泛蛋白基因啟動子。
    如此，於本發明中，可使用各種載體。進而，可製作於本發明之細胞色素P450基因上以同義或反義方向連接目標之任意基因而成者，並將其插入至稱為雙偶載體之pBI101(Clonetech公司)等載體中。 3.轉形體之製作
    本發明之轉形體可藉由將上述本發明之表現載體導入至宿主中而獲得。此處，作為宿主，只要為可表現本發明之細胞色素P450基因者，則並無特別限定，較佳為植物。若將本發明之表現載體導入至宿主中，則因本發明之細胞色素P450基因之表現而獲得對生長抑制物質之抗性。因此，可否成功地將上述本發明之表現載體導入至宿主中之確認可將對該生長抑制物質之抗性作為指標而評價。即，本發明之細胞色素P450基因亦可用作導入其他基因時之選拔標記物。
    於本發明中，作為轉形對象之植物，意指植物體整體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質部、維管束等)或植物培養細胞中之任一者。作為用於轉形之植物，可列舉屬於十字花科、禾本科、茄科、豆科等之植物(參照下述)，但並不限定於該等植物。
    十字花科：阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)
    茄科：菸草(Nicotiana tabacum)
    禾本科：玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)
    豆科：大豆(Glycine max)
    上述表現載體可利用通常之轉形方法導入至植物中，例如電穿孔法(Electroporation Method)、土壤桿菌法(Agrobacterium Method)、粒子槍法(Particle gun Method)、PEG法(Polyethyleneglycol Method，聚乙二醇法)等。
    例如於使用電穿孔法之情形時，利用具備脈衝控制器之電穿孔裝置於電壓500~1600 V、25~1000 μF、20~30 msec之條件下進行處理，將基因導入至宿主中。
    又，於使用粒子槍法之情形時，可直接使用植物體、植物器官、植物組織本身，可製備切片後使用，亦可製備原生質體使用。可使用基因導入裝置(例如Bio-Rad公司之PDS-1000/He等)對如此而製備之試樣進行處理。處理條件根據植物或試樣而有所不同，通常以1000~1800 psi左右之壓力、5~6 cm左右之距離進行。
    又，藉由利用植物病毒作為載體，可將本發明之細胞色素P450基因導入至植物體中。作為可利用之植物病毒，例如可列舉椰菜嵌紋病毒。即，首先將病毒基因組插入至源自大腸桿菌之載體等中而製備重組體後，於病毒之基因組中插入本發明之細胞色素P450基因。利用限制酵素將如此經修飾之病毒基因組自重組體切除，並接種至植物宿主中，藉此可將本發明之細胞色素P450基因導入至植物宿主中。
    於利用土壤桿菌之Ti質體之方法中，若使屬於土壤桿菌(Agrobacterium)屬之細菌感染植物，則利用其具有之使質體DNA之一部分轉移至植物基因組中之性質，將本發明之細胞色素P450基因導入至植物宿主中。屬於土壤桿菌屬之細菌中，根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染植物形成稱為冠癭(crown gall)之腫瘤，又，毛根土壤桿菌(Agrobacteriumu rhizogenes)感染植物而使之出現毛狀根。該等情況之原因在於：感染時，稱為Ti質體或Ri質體之存在於各個細菌中之質體上之稱為T-DNA區域(Transferred DNA，轉運DNA)的區域轉移至植物中，並組入至植物之基因組中。
    若於Ti或Ri質體上之T-DNA區域中已插入欲組入至植物基因組中之DNA，則土壤桿菌屬之細菌可於感染植物宿主時將目標DNA組入至植物基因組中。
    轉形之結果所獲得之腫瘤組織及地上部(shoot)、毛狀根等可直接用於細胞培養、組織培養或器官培養，又，可使用先前已知之植物組織培養法，藉由適當濃度之植物激素(生長素(auxin)、細胞分裂素(cytokinin)、激勃素(gibberellin)、離層酸(abscisic acid)、乙烯、油菜素甾醇(brassinosteroid)等)之投予等而使植物體再生。
    且說，利用導入有本發明之細胞色素P450基因之轉形體，可篩選新穎之對植物之生長抑制物質。即，使生長抑制物質之候補物質接觸導入有本發明之細胞色素P450基因之轉形體。又，亦使相同之生長抑制物質之候補物質接觸未導入有本發明之細胞色素P450基因之細胞(較佳為作為上述轉形體之來源的宿主細胞)。然後，上述轉形體生長，選擇使未導入有本發明之細胞色素P450基因之細胞致死的候補物質。可得出結論：所選擇之候補物質係利用本發明之細胞色素P450基因而解毒、代謝之生長抑制物質。
    篩選出之生長抑制物質對具有本發明之細胞色素P450基因之植物不具有毒性，但對不具有該細胞色素P450基因之植物具有毒性。因此，篩選出之生長抑制物質可用作選擇性地使具有本發明之細胞色素P450基因之植物生長時的除草劑。
    且說，本發明之表現載體不僅可導入至上述植物宿主中而獲得轉形體，亦可導入至大腸桿菌(Escherichia coli)等屬於大腸桿菌屬、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)等屬於芽胞桿菌屬、或螢光假單胞菌(Pseudomonas putida)等屬於假單胞菌屬之細菌、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等酵母、COS細胞(猴腎細胞)、CHO細胞(Chinese Hamster Ovary，中國倉鼠卵巢細胞)等動物細胞、或Sf9等昆蟲細胞等中而獲得轉形體。於以大腸桿菌、酵母等細菌為宿主之情形時，較佳為本發明之表現載體可於該細菌中自主複製，並且由本發明之細胞色素P450基因、核糖體鍵結序列、目標基因、轉錄終止序列所構成。又，亦可含有控制本發明之細胞色素P450基因的基因。
    向細菌導入重組載體之方法只要為對細菌導入DNA之方法則並無特別限定。例如可列舉使用鈣離子之方法、電穿孔法等。
    於以酵母為宿主之情形時，例如可使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。向酵母導入重組載體之方法只要為對酵母導入DNA之方法則並無特別限定，例如可列舉電穿孔法、原生質球法、乙酸鋰法等。
    於以動物細胞為宿主之情形時，可使用猴細胞COS-7、Vero、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、小鼠L細胞等。作為向動物細胞導入重組載體之方法，例如可列舉電穿孔法、磷酸鈣法、脂轉染法等。
    於以昆蟲細胞為宿主之情形時，可使用Sf9細胞等。作為向昆蟲細胞導入重組載體之方法，例如可列舉磷酸鈣法、脂轉染法、電穿孔法等。
    確認基因是否組入至宿主中可藉由PCR(polymerase chain reaction，聚合酵素鏈鎖反應)法、南方雜交法、北方雜交法(Northern hybridization)等進行。例如，由轉形體製備DNA，設計DNA特異性引子進行PCR。PCR係於與用於製備上述質體之條件相同的條件下進行。此後，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳或毛細管電泳等，利用溴化乙錠、SYBR Green液等進行染色，然後以1條帶(band)之形式檢測出擴增產物，藉此確認已轉形。又，亦可使用預先利用螢光色素等進行標記之引子進行PCR，檢測擴增產物。進而，亦可採用如下方法：使擴增產物結合於微量盤等之固相上，藉由螢光或酵素反應等確認擴增產物。 4.植物之製造
    於本發明中，可由上述轉形植物細胞等再生成轉形植物體。作為再生方法，係採用將愈傷組織狀之轉形細胞移入改變激素之種類、濃度之培養基中進行培養，形成不定胚，獲得完整之植物體。作為所使用之培養基，可例示LS培養基(Linsmaier-Skoog Medium)、MS培養基(Murashige-Skoog Medium)等。
    本發明之「製造植物體之方法」包括如下步驟：將插入有本發明之細胞色素P450基因之植物表現載體導入至宿主細胞中而獲得轉形植物細胞，由該轉形植物細胞再生轉形植物體，由所獲得之轉形植物體獲得植物種子，由該植物種子生產植物體。
    由轉形植物體獲得植物種子時，例如自生根培養基提取轉形植物體，移植入裝有含水土壤之盆中，於一定溫度下使之生長，形成花，並最終形成種子。又，由種子生產植物體時，例如於轉形植物體上形成之種子成熟時，進行分離，播種於含水土壤中，於一定溫度、照度下使之生長，藉此產生植物體。以此方式生產之植物表現本發明之細胞色素P450基因，因此對除草劑等生長抑制物質顯示出抗性。此處，所謂「對生長抑制物質顯示出抗性」，同義於與導入本發明之細胞色素P450基因前相比具有統計學之顯著差異而顯示對生長抑制物質之抗性。對生長抑制物質之抗性可基於在特定濃度下接觸該生長抑制物質時植物體之枯死率或莖葉部及根部等之生長抑制率等進行判斷。 5.有害雜草之防除方法
    藉由將本發明之細胞色素P450基因導入至植物中，以上述方法生產基因轉殖植物，可生產具有對生長抑制物質之抗性的植物。因此，例如針對有用植物製作出該基因轉殖植物，將該基因轉殖植物於田地中進行栽培，此時例如於整個該田地中利用如除草劑之使雜草枯死之物質進行處理，藉此可不對基因轉殖植物造成藥害而僅防除雜草。 6.生長抑制物質
    於本發明中，所謂生長抑制物質，只要為對植物之生長發揮抑制性作用之物質則並無特別限定。尤其是，於本發明中，所謂生長抑制物質，意指本發明之細胞色素P450基因編碼之細胞色素P450與其解毒、代謝關連者。例如，作為生長抑制物質，較佳為對原本並無本發明之細胞色素P450基因之植物(例如，日本型水稻)的抑制作用與對原本具有本發明之細胞色素P450基因之印度水稻的抑制作用進行比較而顯著較高的物質。
    具體而言，所謂生長抑制物質，例如包括：除草劑、植物成長調整劑、殺菌劑、殺蟲劑、殺壁蝨劑、殺線蟲劑、殺鼠劑等農藥類，肥料、植物活性劑等農園藝材料類，微生物生產之對植物有害之物質、節肢動物或線蟲等動物生產之對植物有害之物質、作為相剋作用(Allelopathy)之原因而為人所知之植物生產之對植物有害的物質、其他土壤中、水中、空氣中所含之對植物有害之物質。
    作為生長抑制物質中包括之除草劑的一例，可列舉雙草醚鈉鹽(BS)。BS係商品名Grass-short(註冊商標)及Nominee(Nominee，且Nominee為註冊商標)之主成分，具有除草活性。Grass-short係使用作為水田之田埂及非農耕地之抑草劑。另一方面，Nominee係用作栽培印度水稻(Indica rice)之水田之除草劑，對日本型水稻(Japonica rice)造成藥害，因此於日本僅用於水田之田埂。
    BS之標靶酵素為乙醯乳酸合成酵素(acetolactate synthase(ALS)，EC 2.2.1.6，別名acetohydroxy acid synthase(AHAS))，抑制該酵素致使植物枯死。日本型水稻與印度水稻中，標靶酵素之ALS蛋白質之胺基酸序列內4個胺基酸不同，該等不同於與ALS抑制劑之抵抗性相關之胺基酸置換。因此，該不同點並不構成印度水稻對BS之抗性較高之理由(Aldo Merotto等，J.Agric.Food Chem.,57,4,1389-1398(2009))。
    另一方面，關於BS之日本型水稻之解毒、代謝，已知BS之嘧啶環上之甲氧基受到氧化轉換成羥基而失去酵素抑制活性(松下等，日本農藥學會第19回大會講演要旨集，C-115，127(1994))。BS為嘧啶基水楊酸系之ALS抑制劑，作為代謝磺醯脲系ALS抑制型除草劑之細胞色素P450，已知有CYP81A6(日本專利特表2008-546419號公報)。然而，CYP81A6使磺醯脲系ALS抑制型除草劑之何部位氧化而使之不活化迄今尚未闡明。又，報告有CYP81A6基因亦分別存在於印度水稻及日本晴型水稻中(CIB-DDBJ，NCBI，ENA/EBI寄存編號DQ341412(印度型水稻)、AK104825(日本型水稻))。無法得出結論稱印度水稻之BS抗性係由分類為CYP81A6之細胞色素P450基因引起。
    並且，如下述實施例所示，得出結論：印度水稻之BS抗性係由分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450基因引起。又，該分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450基因不僅與BS之分解、代謝相關，亦與各種除草劑之分解、代謝相關。
    作為除草劑之具體例，例如可列舉：2,3,6-TBA(2,3,6-trichlorobenzoic acid，2,3,6-三氯苯甲酸)、2,4-D((2,4-Dichlorophenyloxy)acetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)(包括與胺、二乙基胺、三乙醇胺、異丙基胺、鈉或鋰等之鹽)、2,4-DB((2,4-dichlorophenoxy)butyric acid，2,4-二氯苯氧丁酸)、2,4-PA(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)、ACN(quinoclamine，莫克草)、AE-F-150944(編號)、CAT(Simazine，西瑪津)、DBN(dichlobenil，二氯苯睛)、DCBN(Chlorthiamid，草克樂)、DCMU(3,4-二氯苯-1,1-二甲基)、DCPA(3,4-二氯丙醯替苯胺)、DNOC(dinitro-O-cresol，二硝基鄰甲酚)(包括胺或鈉等之鹽)、DPA(得拉本)、EPTC(Ethyl dipropylthiocarbamate，丙草丹)、IPC(二硝基鄰甲酚鈉)、MCPA(2-甲基-4-氯苯氧乙酸)、MCPA異丙基胺鹽、MCPA乙酯、MCPA鈉、MCPA硫乙酯、MCPB(2-甲基-4-氯苯氧丁酸)、MCPP(2-甲-4-氯苯氧丙酸)、MDBA(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)、MDBA異丙基胺鹽、MDBA鈉鹽、PAC(啡那宗)、SAP(地散磷)、S-莫多草(S-metolachlor)、SYP-298(編號)、SYP-300(編號)、TCA(trichloroacetic acid，三氯乙酸)(包括與鈉、鈣或銨等之鹽)、TCTP(敵草索)、碘苯腈(ioxynil、ioxynil-octanoate)、苯草醚(aclonifen)、丙烯醛(acrolein)、草芬定(azafenidin)、亞喜芬(acifluorfen-sodium)、四唑嘧磺隆(azimsulfuron)、亞速爛(asulam)、乙草胺(acetochlor)、草脫淨(atrazine)、莎稗磷(anilofos)、胺唑草酮(amicarbazone)、醯嘧磺隆(amidosulfuron)、胺基三唑(amitrole)、氯胺基吡啶酸(aminopyralid)、甲基胺草磷(amiprofs-methyl)、草殺淨(ametryn)、拉草(alachlor)、亞汰草(alloxydim)、環丙嘧啶醇(ancymidol)、愛速隆(isouron)、異氯草酮(isoxachlortole)、異唑草酮(isoxaflutole)、異草胺(isoxaben)、異丙隆(isoproturon)、艾分卡巴腙(ipfencarbazone)、咪唑酸(imazaquin)、甲咪唑菸酸(imazapic)(包括與胺等之鹽)、咪唑菸酸(imazapyr)(包括與異丙基胺等之鹽)、咪草酯(imazamethabenz-methyl)、甲氧咪草菸(imazamox)(包括與胺鹽等之鹽)、咪唑乙菸酸(imazethapyr)(包括與胺鹽等之鹽)、依速隆(imazosulfuron)、Indaziflam、茚草酮(indanofan)、禾草畏(esprocarb)、胺苯磺隆(ethametsulfuron-methyl)、乙丁烯氟靈(ethalfluralin)、磺噻隆(ethidimuron)、亞速隆(ethoxysulfuron)、氯氟草醚(ethoxyfen-ethyl)、益覆滅(ethofumesate)、乙氧苯草胺(etobenzanid)、茵多酸二鈉鹽(endothal-disodium)、樂滅草(oxadiazon)、丙炔草酮(oxadiargyl)、草酮(oxaziclomefone)、環氧嘧磺隆(oxasulfuron)、復祿芬(oxyfluorfen)、歐拉靈(oryzalin)、嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)、坪草丹(orbencarb)、唑草胺(cafenstrole)、乙基克繁草(carfentrazone-ethyl)、卡靈草(karbutilate)、草長滅(carbetamide)、快伏草(quizalofop-P-ethyl)、禾康酯(quizalofop-P-tefuryl)、快伏草(quizalofop-ethyl)、莫克草(quinoclamine)、快克草(quinclorac)、氯甲喹啉酸(quinmerac)、苄草隆(cumyluron)、嘉磷塞(glyphosate)(包括與鈉、鉀、胺、丙基胺、異丙基胺、二甲基胺或三甲基硫等之鹽)、固殺草(glufosinate)(包括與胺或鈉等之鹽)、剋草同(clethodim)、炔草酯(clodinafop-propargyl)、畢克草(clopyralid)、可滅蹤(clomazone)、甲氧基護穀(chlomethoxyfen)、克普草(clomeprop)、氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)、克爛本(chloramben)、氯草敏(chloridazon)、氯嘧磺隆(chlorimuron-ethyl)、氯磺隆(chlorsulfuron)、大克草(chlorthal-dimethyl)、草克樂(chlorthiamid)、氯酞亞胺(chlorphthalim)、整形醇(chlorflurenol)(包括低級烷基酯)、克普芬(chlorpropham)、滅落寧(chlorbromuron)、克美素(chlormequat)、枯草龍(chloroxuron)、綠麥隆(chlorotoluron)、嘧啶肟草醚(saflufenacil)、氰乃淨(cyanazine)、達有龍(diuron)、麥草畏(dicamba)(包括與胺、二乙基胺、異丙基胺、二甘醇胺、鈉或鋰等之鹽)、草滅特(cycloate)、環殺草(cycloxydim)、雙氯磺草胺(diclosulam)、環磺隆(cyclosulfamuron)、二氯苯(dichlobenil)、禾草靈(diclofop-methyl)、2,4-滴丙酸(dichlorprop)、高2,4-滴丙酸(dichlorprop-P)、大刈特(diquat(-dibromide))、汰硫草(dithiopyr)、環草隆(siduron)、撻乃安(dinitramine)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、西速隆(cinosulfuron)、特樂酚(dinoterb)、丁基賽伏草(cyhalofop-butyl)、大芬滅(diphenamid)、雙苯唑快(difenzoquat)、吡氟醯草胺(diflufenican)、氟吡草腙(diflufenzopyr)、二氟林(diflumetorim)、草滅淨(simazine)、二甲草胺(dimethachlor)、異戊乙淨(dimethametryn)、汰草滅(dimethenamid)、西草淨(simetryn)、哌草丹(dimepiperate)、噁唑隆(dimefuron)、環庚草醚(cinmethylin)、磺草酮(sulcotrione)、甲磺草胺(sulfentrazone)、磺醯磺隆(sulfosulfuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron-methyl)、西殺草(sethoxydim)、特草定(terbacil)、汰草龍(daimuron)、得拉本(dalapon)、噻唑菸酸(thiazopyr)、噻克松(thiencarbazone)、仲草丹(tiocarbazil)、殺丹(thiobencarb)、噻二唑草胺(thidiazimin)、噻苯隆(thidiazuron)、噻吩磺隆甲酯(thifensulfuron-methyl)、抑芽醇(n-decanol)、甜菜安(desmedipham)、敵草淨(desmetryne)、氟丙酸(tetrapion)、欣克草(thenylchlor)、牧草胺(tebutam)、得匍隆(tebuthiuron)、得殺草(tepraloxydim)、雙環磺草酮(tefuryltrione)、草淨津(terbuthylazine)、特丁淨(terbutryn)、特丁通(terbumeton)、Tembotrione、苯吡唑草酮(topramezone)、肟草酮(tralkoxydim)、三氟草胺(triaziflam)、醚苯磺隆(triasulfuron)、野麥畏(tri-allate)、草達津(trietazine)、三氯比(triclopyr(-butotyl))、三氟甲磺隆(tritosulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron-methyl)、三福林(trifluralin)、三氟啶磺隆鈉鹽(trifloxysulfuron-sodium)、苯磺隆(tribenuron-methyl)、鈉得爛(naptalam)(包括與鈉等之鹽)、萘丙胺(naproanilide)、滅落脫(napropamide)、菸嘧磺隆(nicosulfuron)、草不隆(neburon)、氟草敏(norflurazon)、萬隆(vernolate)、巴拉刈(paraquat dichloride)、甲基合氯氟(haloxyfop-methyl)、高甲基合氯氟(haloxyfop-P-methyl)、合速隆(halosulfuron-methyl)、畢拉草(bilanafos-sodium)、胺氯吡啶酸(picloram)、氟吡醯草胺(picolinafen)、雙環吡喃酮(bicyclopyrone)、雙草醚鈉鹽(bispyribac-sodium)、唑啉草酯(pinoxaden)、必芬諾(bifenox)、派草磷(piperophos)、雙唑草腈(pyraclonil)、磺醯草吡唑(pyrasulfotole)、普芬草(pyrazoxyfen)、百速隆(pyrazosulfuron-ethyl)、苄草唑(pyrazolynate)、派芬草(pyraflufen-ethyl)、Pyridafol、嘧硫草醚鈉鹽(pyrithiobac-sodium)、必汰草(pyridate)、環酯草醚(pyriftalid)、稗草畏(pyributicarb)、嘧啶肟草醚(pyribenzoxim)、嘧啶硫蕃(pyrimisulfan)、嘧硫草醚(pyriminobac-methyl)、派羅克殺草碸(pyroxasulfone)、甲氧磺草胺(pyroxsulam)、非草隆(fenuron)、Fenoxasulfone、芬殺草(fenoxaprop-P-ethyl)、芬殺草(fenoxaprop-ethyl)、解草啶(fenclorim)、噻唑禾草靈(fenthiaprop-ethyl)、四唑醯草胺(fentrazamide)、苯敵草(phenmedipham)、甲醯胺磺隆(foramsulfuron)、丁基拉草(butachlor)、布芬草(butafenacil)、丁胺磷(butamifos)、拔敵草(butylate)、比達寧(butralin)、丁苯草酮(butroxydim)、伏速隆(flazasulfuron)、麥草氟甲酯(flamprop-methyl)、高麥草氟甲酯(flamprop-M-methyl)、麥草氟乙酯(flamprop-ethyl)、麥草氟異丙酯(flamprop-isopropyl)、高效麥草氟異丙酯(flamprop-M-isopropyl)、氟嘧磺隆(primisulfuron-methyl)、伏寄普(fluazifop-butyl)、伏寄普(fluazifop-P-butyl)、異丙草酯(fluazolate)、可奪草(fluometuron)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、氟酮磺隆鈉鹽(flucarbazone-sodium)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、氟噻甲草酯(fluthiacet-methyl)、氟啶嘧磺隆(flupyrsulfuron-methyl-sodium)、氟草胺(flufenacet)、氟噠草酯(flufenpyr-ethyl)、氟丙酸鈉鹽(flupropanate-sodium)、氟胺草唑(flupoxam)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟烯草酸(flumiclorac-pentyl)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、氟啶草酮(fluridone)、呋草酮(flurtamone)、呋嘧醇(flurprimidol)、氟氯比(fluroxypyr)、氟草吡酮(flurochloridone)、普拉草(pretilachlor)、胺氟樂靈(prodiamine)、氟丙磺隆(prosulfuron)、苄草丹(prosulfocarb)、普拔草(propaquizafop)、雷蒙得(propachlor)、普拔根系(propazine)、除草寧(propanil)、戊炔草胺(propyzamide)、異丙草胺(propisochlor)、咪唑嘧磺隆(propyrisulfuron)、苯胺靈(propham)、氟唑草胺(profluazol)、丙苯磺隆鈉鹽(propoxycarbazone-sodium)、環苯草酮(profoxydim)、克草(bromacil)、佈滅淨(prometryn)、撲滅通(prometon)、溴草腈(bromoxyni)(包括與丁酸、辛酸或庚酸等之酯體)、溴芬諾(bromobutide)、雙氟磺草胺(florasulam)、菲殺淨(hexazinone)、倍尼芬(benefin)、烯草胺(pethoxamid)、草除靈(benazolin)、平速爛(penoxsulam)、氟丁醯草胺(beflubutamid)、克草猛(pebulate)、醯苯草酮(bencarbazone)、雙苯嘧草酮(benzfendizone)、地散磷(bensulide)、苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)、苯并雙環酮(benzobicyclon)、吡草酮(benzofenap)、本達隆(bentazone)(包括與鈉等之鹽)、甲氯醯草胺(pentanochlor)、殺丹(benthiocarb)、施得圃(pendimethalin)、環戊惡草酮(pentoxazone)、倍尼芬(benflnralin)、呋草磺(benfuresate)、調節膦(fosamine-ammonium)、氟磺胺草醚(fomesafen)、福芬素(forchlorfenuron)、馬來醯肼(maleic hydrazide)、滅可普鉀鹽(mecoprop-potassium)、精滅可普鉀鹽(mecoprop-P)、甲磺胺磺隆(mesosulfuron-methyl)、硝草酮(mesotrione)、滅草胺(metazachlor)、噻唑隆(methabenzthiazuron)、雙醚氯吡嘧磺隆(metazosulfuron)、苯草酮(metamitron)、唑唑醯草胺(metamifop)、甲基殺草隆(methyldymron)、甲氧隆(metoxuron)、磺草唑胺(metosulam)、甲磺隆(metsulfuron-methyl)、秀穀隆(metobromuron)、吡喃隆(metobenzuron)、莫多草(metolachlor)、滅必淨(metribuzin)、縮節胺(mepiquat-chloride)、滅芬草(mefenacet)、綠穀隆(monolinuron)、稻得壯(molinate)、碘甲磺隆鈉鹽(iodosulfulon-methyl-sodium)、乳氟禾草靈(lactofen)、理有龍(linuron)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)、環草定(lenacil)等，但並不限定於該等。
    作為植物成長調整劑之具體例，例如可列舉：1-萘乙醯胺(α-naphthalene acetamide)、1-甲基環丙烯(1-methylcyclopropene)、2,6-二異丙基萘(2,6-diisopropylnaphthalene)、4-CPA(番茄生長素)、四烯雌酮(aviglycine)、離層酸(abscisic acid)、環丙嘧啶醇(ancymidol)、依納素(inabenfide)、吲哚乙酸(indole acetic acid)、吲哚丁酸(indole butyric acid)、單克素(uniconazole-P)、吲熟酯(ethychlozate)、乙烯磷(ethephon)、8-羥基喹啉硫酸鹽(oxine-sulfate)、藏茴香酮(carvone)、甲酸鈣(calcium formate)、番茄美素鈉鹽(cloxyfonac-sodium)、番茄美素鉀鹽(cloxyfonac-potassium)、調果酸(cloprop)、矮壯素(chlormequat)、膽鹼(choline)、細胞分裂素(cytokinins)、胺腈(cyanamide)、環丙醯草胺(cyclanilide)、2,4-滴丙酸(dichlorprop)、調呋酸(dikegulac)、激勃素(gibberellin)、脫葉噻(dimethipin)、殺雄啉(sintofen)、Daminodide、癸醇(n-decyl alcohol)、三十烷醇(1-triacontanol)、抗倒酯(trinexapac-ethyl)、多效唑(paclobutrazol)、石蠟(paraffin)、吡草醚(pyraflufen-ethyl)、仲丁靈(butralin)、氟節胺(flumetralin)、呋嘧醇(flurprimidol)、抑草丁(flurenol)、茉莉酮(prohydrojasmon)、調環酸鈣鹽(prohexadione-calcium)、苄基胺基嘌呤((6-)benzylaminopurine)、施得圃(pendimethalin)、福芬素(forchlorfenuron)、馬來醯肼(maleic hydrazide)、縮節胺(mepiquat)、美福泰(mefluidide)、蠟、MCPA硫乙酯、MCPB、4-CPA(番茄生長素)、氯化鈣、硫酸鈣、過氧化鈣、綠藻提取物、混合天然藥提取物等，但並不限定於該等。
    作為殺菌劑之具體例，例如可列舉：BAG-010(編號)、BAF-045(編號)、二辛酸銅(copper dioctanoate)、DBEDC(胺磺酮)、SYP-Z-048(編號)、TPTA(硫代磷酸三苯基三胺)、TPTC(三苯基氯化錫)、TPTH(三苯基氫氧化錫)、阿拉酸式苯(acibenzolar-S-methyl)、亞托敏(azoxystrobin)、安美速(amisulbrom)、Aldimorph(4-十二烷基-2,6-二甲基嗎啉)、亞汰尼(isotianil)、吡唑萘菌胺(isopyrazam)、亞賜圃(isoprothiolane)、種菌唑(ipconazole)、依普同(iprodione)、纈黴威(iprovalicarb)、丙基喜樂松(iprobenfos)、依滅列(imazalil)、克熱淨烷苯磺酸鹽(iminoctadine-albesilate)、克熱淨醋酸鹽(iminoctadine-triacetate)、易胺座(imibenconazole)、氯唑靈(echlomezole)、護粒松(edifenphos)、噻唑菌胺(ethaboxam)、護粒松(edifenphos)、乙氧喹(ethoxyquin)、依得利(etridiazole)、烯肟菌酯(enestroburin)、依普座(epoxiconazole)、歐殺斯(oxadixyl)、Oxazinylazole、嘉保信(oxycarboxin)、氧四環素(oxytetracycline)、唑咪唑延胡索酸鹽(oxpoconazole-fumarate)、歐索林酸(oxolinic acid)、辛噻酮(octhilinone)、呋醯胺(ofurace)、肟醚菌胺(orysastrobin)、鄰苯基苯酚(o-phenylphenol)、嘉賜黴素(kasugamycin)、四氯丹(captafol)、加普胺(carpropamid)、貝芬替(carbendazim)、萎鏽靈(carboxin)、快諾芬(quinoxyfen)、蟎離丹(chinomethionat)、蓋普丹(captan)、五氯硝基苯(quintozene)、雙胍辛胺(guazatine)、克收欣(kresoxim-methyl)、地茂散(chloroneb)、百菌清(chlorothalonil)、賽座滅(cyazofamid)、乙黴威(diethofencarb)、雙氯氰菌胺(diclocymet)、益發靈(dichlofluanid)、達滅淨(diclomezine)、大克爛(dicloran)、腈硫醌(dithianon)、達克利(diniconazole)、代森鋅(zineb)、白粉克(dinocap)、聯苯(diphenyl)、二苯胺(diphenylamine)、苯醚甲環唑(difenoconazole)、野燕枯甲硫酸鹽(difenzoquat metilsulfate)、賽芬胺(cyflufenamid)、二氟林(diflumetorim)、環克座(cyproconazole)、賽普洛(cyprodinil)、矽氟唑(simeconazole)、達滅芬(dimethomorph)、克絕(cymoxanil)、醚菌胺(dimoxystrobin)、福美鋅(ziram)、硫矽菌胺(silthiofam)、鏈黴素(streptomycin)、螺環菌胺(spiroxamine)、噻達新(sedaxane)、座賽胺(zoxamide)、邁隆(dazomet)、代森環(thiadiazin)、噻醯菌胺(tiadinil)、腐絕(thiabendazole)、得恩地(thiram)、甲基多保淨(thiophanate-methyl)、賽氟滅(thifluzamide)、四氧硝基苯(tecnazene)、克枯爛(tecloftalam)、四克利(tetraconazole)、咪菌威(debacarb)、得克利(tebuconazole)、異丁乙氧喹啉(tebufloquin)、多寧(dodine)、嗎菌靈(dodemorph)、三泰隆(triadimenol)、三泰芬(triadimefon)、咪唑(triazoxide)、三賽唑(tricyclazole)、滅菌唑(triticonazole)、三得芬(tridemorph)、賽福座(triflumizole)、三氟敏(trifloxystrobin)、賽福寧(triforine)、甲基益發靈(tolylfluanid)、脫克松(tolclofos-methyl)、甲磺菌胺(tolnifanide)、代森鈉(nabam)、酞菌酯(nitrothal-isopropyl)、尼瑞莫(nuarimol)、維利黴素(validamycin)、Valifenalate、Bixafen、啶氧菌酯(picoxystrobin)、比多農(bitertanol)、土菌消(hydroxyisoxazole)、哌丙靈(piperalin)、殺紋寧(hymexazol)、百克敏(pyraclostrobin)、白粉松(pyrazophos)、甲氧苯啶菌(pyriofenone)、比芬諾(pyrifenox)、稗草畏(pyributicarb)、吡菌苯威(pyribencarb)、派美尼(pyrimethanil)、百快隆(pyroquilon)、免克寧(vinclozolin)、富爾邦(ferbam)、凡殺同(famoxadone)、葉枯淨(phenazine oxide)、咪唑菌酮(fenamidone)、芬瑞莫(fenarimol)、芬諾尼(fenoxanil)、富米綜(ferimzone)、芬克座(fenbuconazole)、甲呋醯胺(fenfuram)、粉銹啶(fenpropidin)、芬普福(fenpropimorph)、環醯菌胺(fenhexamid)、滅菌丹(folpet)、熱必斯(phthalide)、布瑞莫(bupirimate)、麥穗寧(fuberidazole)、保米黴素(blasticidin-S)、福拉比(furametpyr)、呋霜靈(furalaxyl)、扶吉胺(fluazinam)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟比來(fluopicolide)、氟吡菌醯胺(fluopyram)、唑呋草(fluoroimide)、氟喹唑(fluquinconazole)、護汰寧(fludioxonil)、護矽得(flusilazole)、氟硫滅(flusulfamide)、氟噻菌淨(flutianil)、福多寧(flutolanil)、護汰芬(flutriafol)、福嗎啉(flumorph)、丙氧喹啉(proquinazid)、撲克拉(prochloraz)、撲滅寧(procymidone)、丙硫菌唑(prothioconazole)、布羅波爾(bronopol)、普拔克(propamocarb-hydrochloride)、普克利(propiconazole)、甲基鋅乃浦(propineb)、撲殺熱(probenazole)、溴克座(bromuconazole)、菲克利(hexaconazole)、本達樂(benalaxyl)、右本達樂(benalaxyl-M)、免賴得(benomyl)、披扶座(pefurazoate)、平克座(penconazole)、賓克隆(pencycuron)、苯噻菌胺(benthiavalicarb-isopropyl)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、戊苯吡菌胺(penflufen)、白克列(boscalid)、福賽得(fosetyl-alminium)、保粒黴素(polyoxin)、代森福美鋅(polycarbamate)、代森錳銅(mancopper)、曼普胺(mandipropamid)、代森錳鋅(mancozeb)、代森錳(maneb)、邁克尼(myclobutanil)、米多黴素(mildiomycin)、滅速克(methasulfocarb)、威百畝(metam)、滅達樂(metalaxyl)、右滅達樂(metalaxyl-M)、滅特座(metconazole)、苯氧菌胺(metominostrobin)、滅芬農(metrafenone)、滅派林(mepanipyrim)、滅普寧(mepronil)、硫酸羥喹啉(oxyquinoline sufate)、銀(silver)、波爾多液(Bordeaux mixture)、鹼式氯化銅(copper oxychloride)、氧化亞銅(cuprous oxide)、氫氧化銅(copper hydroxide)、硫酸銅(copper sulfate)、喹啉銅(oxine-copper)、壬基酚磺酸銅(copper(nonylphenyl)sulphonate)等銅化合物、硫(sulfur)化合物、碳酸氫鉀(potassium bicarbonate)、碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、脂肪酸甘油酯、香菇菌絲體提取物等，但並不限定於該等。
    作為殺蟲劑、殺壁蝨劑、殺線蟲劑之具體例，例如可列舉：1,3-二氯丙烯(1,3-dichloropropene)、BPMC(丁苯威)、BPPS(毆蟎多)、BRP(二溴磷)、CL900167(編號)、冰晶石(cryolite)、CVMP(殺蟲畏)、CYAP(氰乃松)、DCIP(二氯異丙醚)、D-D(二氯丙烷-二氯丙烯混合物)、DCIP(二氯異丙醚)、DDVP(敵敵畏)、DEP(鄰苯二甲酸二乙酯)、DMTP(甲噻硫磷)、DNOC(二硝甲酚)、ECP(嗜酸陽離子蛋白)、EPN(苯硫磷)、MEP(2-甲基-5-乙基吡啶)、MIPC(葉蟬散)、MPP(倍硫磷)、NAC、N-甲基二硫代胺基甲酸銨(NCS)、NI-30(編號)、NNI-0101、PAP(賽達松)、PHC(安丹)、RU15525(編號)、Thiazosulfen、XMC(滅克蝨)、ZXI-8901(編號)、阿納寧(acrinathrin)、亞滅松(azamethiphos)、乙基穀速松(azinphos-ethyl)、甲基穀速松(azinphos-methyl)、亞醌蟎(acequinocyl)、亞滅培(acetamiprid)、亞滅培(acetamiprid)、乙醯蟲腈(acetoprol)、毆殺松(acephate)、亞環錫(azocyelotin)、阿巴汀(abamectin)、三亞蟎(amitraz)、棉鈴威(alanycarb)、得滅克(aldicarb)、賽滅寧(alpha-eypermethrin)、亞烈寧(allethrin)、水胺硫磷(isocarbophos)、加福松(isoxathion)、甲基亞芬松(isofenphos-methyl)、滅必蝨(isoprocarb)、Imicyafos、益達胺(imidacloprid)、依普寧(imiprothrin)、因得克(indoxacarb)、益化利(esfenvalerate)、愛芬克(ethiofencarb)、愛殺松(ethion)、益斯普(ethiprole)、二硫松(disulfoton)、依殺蟎(etoxazole)、依芬寧(etofenprox)、普伏松(ethoprophos)、因滅汀(emamectin)、安殺番(endosulfan)、益避寧(empenthrin)、歐殺滅(oxamyl)、滅多松(oxydemeton-methyl)、毆滅松(omethoate)、油酸鈉(sodium oleate)、斯美地(metam-sodium)、硫線磷(cadusafos)、剋特寧(kadethrin)、水黃皮素(karanjin)、培丹(cartap)、加保利(carbaryl)、丁基加保扶(carbosulfan)、加保扶(carbofuran)、伽瑪賽洛寧(gamma-cyhalothrin)、滅爾蝨(xylylcarb)、拜裕松(quinalphos)、烯蟲炔酯(kinoprene)、蟎離丹(chinomethionat)、蠅毒磷(coumaphos)、可尼丁(clothianidin)、克芬蟎(clofentezine)、可芬諾(chromafenozide)、氯氧磷(chlorethoxyfos)、剋安勃(chlorantraniliprole)、氯丹(chlordane)、氯化苦(chloropicrin)、陶斯松(chlorpyrifos)、甲基陶斯松(chlorpyrifos-methyl)、克凡派(chlorfenapyr)、克芬蟎(clofentezine)、克芬松(chlorfenvinphos)、克福隆(chlorfluazuron)、可芬諾(chromafenozide)、氯甲磷(chlormephos)、唑蟎氰(cyenopyrafen)、氰蟲醯胺(cyazypyr)、氰乃松(cyanophos)、汰芬隆(diafenthiuron)、氰蟲醯胺(cyantraniliprole)、得氯蟎(dienochlor)、唑蟎氰(cyenopyrafen)、雙特松(dicrotophos)、除線磷(dichlofenthion)、乙氰菊酯(cycloprothrin)、大克蟎(dicofol)、環蟲腈(dicyclanil)、二硫松(disulfoton)、達特南(dinotefuran)、消蟎通(dinobuton)、賽洛寧(cyhalothrin)、賽酚寧(cyphenothrin)、賽扶寧(cyfluthrin)、二福隆(diflubenzuron)、賽芬蟎(cyflumetofen)、氟蟎(diflovidazin)、殺蟎錫(cyhexatin)、賽滅寧(cypermethrin)、甲基毒蟲畏(dimethylvinphos)、樂果(dimethoate)、矽護芬(silafluofen)、賽滅淨(cyromazine)、賜諾殺(spinosad)、賜諾特(spinetoram)、賜派芬(spirodiclofen)、賜派滅(spirotetramat)、螺甲蟎酯(spiromesifen)、Sulcofuron(sulcofuron-sodium)、氟蟲胺(sulfluramid)、硫丙磷(sulprofos)、氟啶蟲胺腈(sulfoxaflor)、治螟磷(sulfotep)、傑他賽滅寧(zeta-cypermethrin)、大利松(diazinon)、福化利(tau-fluvalinate)、賽果培(thiacloprid)、賽速安(thiamethoxam)、硫敵克(thiodicarb)、硫賜安(thiocyclam)、殺蟲雙(thiosultap)、硫伐隆(thiofanox)、硫滅松(thiometon)、殺蟲畏(tetrachlorvinphos)、得脫蟎(tetradifon)、治滅寧(tetramethrin)、治滅寧(tetramethrin)、丁基嘧啶磷(tebupirimfos)、得芬諾(tebufenozide)、得芬瑞(tebufenpyrad)、七氟菊酯(tefluthrin)、得福隆(teflubenzuron)、滅賜松(demeton-S-methyl)、亞培松(temephos)、魚藤酮(rotenone)、第滅寧(deltamethrin)、託福松(terbufos)、泰滅寧(tralomethrin)、拜富寧(transfluthrin)、唑蚜威(triazamate)、三唑磷(triazophos)、三氯松(trichlorfon)、殺蟲脲(triflumuron)、混殺威(trimethacarb)、唑蟲醯胺(tolfenpyrad)、二溴磷(naled)、尼古丁(nicotine)、烯啶蟲胺(nitenpyram)、奈馬菌素(nemadectin)、氟醯脲(novaluron)、多氟脲(noviflumuron)、烯蟲乙酯(hydroprene)、蚜滅多(vamidothion)、巴拉松(parathion)、甲基巴拉松(parathion-methyl)、苄蟎醚(halfenprox)、氯蟲醯肼(halofenozide)、百亞列寧(bioallethrin)、百列滅寧(bioresmethrin)、雙三氟蟲脲(bistrifluron)、愛美松(hydramethylnon)、必芬蟎(bifenazate)、畢芬寧(bifenthrin)、吡蚜酮(pymetrozine)、吡唑硫磷(pyraclofos)、噠硫磷(pyridaphenthion)、畢達本(pyridaben)、啶蟲丙醚(pyridalyl)、Pyrifluquinazon、吡丙醚(pyriproxyfen)、比加普(pirimicarb)、畢汰芬(pyrimidifen)、亞特松(pirimiphos-methyl)、除蟲菊酯(pyrethrins)、胺磺磷(famphur)、氟蟲腈(fipronil)、芬殺蟎(fenazaquin)、芬滅松(fenamiphos)、溴蟎酯(phenisobromolate)、撲滅松(fenitrothion)、芬諾克(fenoxycarb)、芬硫克(fenothiocarb)、酚丁滅寧(phenothrin)、丁基滅必蝨(fenobucarb)、芬殺松(fenthion)、賽達松(phenthoate)、芬化利(fenvalerate)、芬普蟎(fenpyroximate)、芬佈賜(fenbutatin oxide)、芬普寧(fenpropathrin)、佈嘉信(butocarboxim)、丁酮酚威(butoxycarboxim)、布芬淨(buprofezin)、呋線威(furathiocarb)、普亞列寧(prallethrin)、嘧蟎酯(fluacrypyrim)、氟蟎脲(flucycloxuron)、護賽寧(flucythrinate)、氟硫滅(flusulfamide)、福化利(fluvalinate)、吡氟硫磷(flupyrazofos)、嘧蟲胺(flufenerim)、氟芬隆(flufenoxuron)、氟大滅(flubendiamide)、氟氯苯菊酯(flumethrin)、Flurimfen、普硫松(prothiofos)、氟尼胺(flonicamid)、加護松(propaphos)、毆蟎多(propargite)、佈飛松(profenofos)、安丹(propoxur)、胺丙畏(propetamphos)、安丹(propoxur)、新殺璊(bromopropylate)、貝他賽滅寧(beta-cypermethrin)、貝他賽扶寧(beta-cyfluthrin)、六伏隆(hexaflumuron)、合賽多(hexythiazox)、飛達松(heptenophos)、百滅寧(permethrin)、免速達(bensultap)、安殺番(endosulfan)、苯蟎特(benzoximate)、免敵克(bendiocarb)、免扶克(benfuracarb)、巴賽松(phoxim)、裕必松(phosalone)、福賽絕(fosthiazate)、福賜米松(phosphamidon)、益滅松(phosmet)、覆滅蟎(formetanate)、福瑞松(phorate)、機油(petroleum oils)、馬拉松(malathion)、密滅汀(milbemectin)、滅加松(mecarbam)、滅加松(mecarbam)、倍硫磷亞碸(mesulfenfos)、納乃得(methomyl)、四聚乙醛(metaldehyde)、美氟綜(metaflumizon)、達馬松(methamidophos)、威百畝鉀鹽(metham-potassium)、威百畝銨鹽(metham-ammonium)、滅賜克(methiocarb)、滅大松(methidathion)、異硫氰酸甲酯(methyl isothiocyanate)、甲氧氯(methoxychlor)、滅芬諾(methoxyfenozide)、甲醚菊酯(methothrin)、美特寧(metofluthrin)、美賜平(methoprene)、治滅蝨(metholcarb)、美文松(mevinphos)、亞素靈(monocrotophos)、賽洛寧(lambda-cyhalothrin)、剋安勃(chlorantraniliprole)、祿芬隆(lufenuron)、列滅寧(resmethrin)、雷皮菌素(lepmectin)、魚藤酮(rotenone)、丙二醇單脂肪酸酯(propylene glycol monolaurate)、硫酸菸鹼(nicotine sulfate)、左旋咪唑(levamisol)、環氧乙烷(ethylene oxide)、芬佈賜(fenbutatin oxide)、脂肪酸甘油酯、酒石酸甲噻嘧啶、菜籽油、澱粉、大豆卵磷脂、蘇力菌(Bacillus thuringiensis)產生之結晶蛋白質等，但並不限定於該等。
    作為肥料之具體例，例如可列舉：氮質肥料、磷酸質肥料、鉀質肥料、有機質肥料、石灰質肥料、苦土肥料、錳質肥料、硼質肥料、化肥、複合肥料等，但並不限定於該等。
    作為微生物生產之對植物有害之物質的具體例，例如可列舉：病原細菌生產之酚酮等，但並不限定於該等。
    作為植物生產之對植物有害之物質的具體例，例如可列舉：由背高泡立草(Solidago altissima)之根釋放之順脫氫母菊酯(cis-dehydromatricaria ester)等，但並不限定於該等。
    該等物質均為公知者，有市售，取得方法記載於公知文獻中。 [實施例]
    以下，使用實施例更詳細地說明本發明，但本發明之技術範圍並不限定於以下之實施例。 [實施例1]對雙草醚鈉鹽顯示抗性之越光/Kasalath之回交系SL202的選拔
    使用由越光/Kasalath之回交製成之39系越光/Kasalath染色體片段置換系群(Chromosome segment substitution lines，CSSL，農業生物資源研究所水稻基因組資源中心(獨立行政法人)分售，Ebitani等，Breed.Sci.,55,65-73(2005))，進行雙草醚鈉鹽(BS)感受性試驗。BS感受性係藉由於含有BS 1 μM之結冷膠培養基中之生長試驗進行研究。
    使Hoglund mix 1.6 g(Sigma-Aldrich公司)及Gelrite 3 g(和光化學)懸浮於1 L之蒸餾水中後，以電子爐加溫溶解，將溫度降低至50~60℃後以最終濃度1 μM添加BS。將其向30 mL容積之管瓶中分注15 mL製作結冷膠培養基。將CSSL之稻穀於0.5%次氯酸鈉中浸泡20分鐘左右後，仔細清洗。將其浸泡於蒸餾水中，於27℃下靜置3~5天左右進行催芽。將催芽種子以芽在上之方式輕輕埋入結冷膠培養基中。將其與裝有蒸餾水之燒杯一起裝入透明盒子中，以保鮮膜封蓋。於27℃、螢光燈照明下(明期14小時、暗期10小時)使之生長7~9天。所使用之39系種子中，越光1號染色體之一部分置換成Kasalath 1號染色體之該部分之系SL201及SL202對BS顯示與Kasalath相同的抵抗性(圖1)。 [實施例2]自由SL202與越光之回交獲得之F2個體之BS抗性個體之選拔及雙草醚鈉鹽抗性細胞色素P450基因之資料發掘
    系SL201及SL202為雙草醚鈉鹽抗性，但於以下之實驗中使用系SL202進行。以SL202與越光進行回交，將所獲得之190系F2個體之BS感受性試驗藉由實施例1中記載之使用結冷膠之BS感受性檢測的方法進行。
    其結果得知，供於試驗之190個個體中，138個個體顯示BS抗性，因此與BS抵抗性相關之基因位於1個基因座上，進行顯性遺傳。繼而，使用顯示BS抗性之80個個體，調查1號染色體上之標記物部分(R2635、C122、R2417、C86)之基因型為越光型抑是Kasalath型，結果，R2635中為Kasalath型同型或Kasalath型與越光型之異型，相對於此，標記物C122、R2417、C86中為越光型同型、Kasalath型同型及Kasalath型與越光型之異型。系SL202之標記物中，C161至C178之區域為越光型且其他區域為Kasalath型或Kasalath型與越光型混合存在之區域，因此可認為BS抗性基因存在於系SL202之1號染色體上之標記物C178與C122間之基因區域中。進而，使用可認為C178與C122間之基因區域為Kasalath型與越光型之異型基因型之個體自殖獲得之次世代(F3世代)的個體，藉由實施例1中記載之使用結冷膠之BS感受性檢測的方法進行BS感受性試驗。供於試驗之925個個體中，418個個體顯示BS抵抗性。其中，使用顯示BS抗性之258個個體，調查1號染色體上之標記物部分(RM7075、C178、RM5638、RM9、41834-50、R2635、RM2574、RM7266、RM1180、RM5919、RM3642、RM1349-1、RM3143、C122)之基因型為越光型抑是Kasalath型。其結果為，標記物RM9與41834-50中僅存在Kasalath型同型或Kasalath型與越光型之異型，不存在越光型同型之個體，因此可認為原因基因於1號染色體上之標記物RM9~41834-50間存在約372 kb(圖2)。由日本晴之公開基因組資訊(水稻基因組註解資料庫(RAP-BD，The Rice Annotaion Project Database)，http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/)得知，3個P450基因(0s01g0602200、0s01g0602400、0s01g0602500)位於該區域(圖3)。
    根據P450之註解資訊(細胞色素P450主頁，http：//drnelson.uthsc.edu/rice.html)，該等3個基因為CYP72A31(偽基因)、CYP72A32、CYP72A33。針對日本晴、Kasalath，進行該等之基因之比較解析，結果得知Kasalath中之CYP72A31基因自起始密碼子至終止密碼子存在全ORF，推斷其為功能性，相對於此，日本晴中CYP72A31基因之包括第1、第2外顯子之約3.2 kb缺失，為偽基因(圖4)。再者，CYP72A32及CYP72A33於日本晴、Kasalath中均編碼功能性基因。根據以上內容結果，強烈提示CYP72A31基因與BS抗性相關之可能性。 [實施例3]CYP72A31、72A32、72A33基因表現解析
    將日本晴(NB)及Kasalath(Kas)之脫穎種子滅菌後，置於MSHF培養基(Toki et al.,Plant J.,47,969(2006))中，於30℃、常明條件下進行栽培。第7天對莖葉部(seedling)及根(root)進行取樣，以液氮速凍後於-80℃下保存。又，將日本晴(NB)及Kasalath(Kas)之脫穎種子滅菌後，置於N6D培養基(Toki et al.,Plant J.,47,969(2006))中，以33℃明條件下10小時/30℃暗條件下14小時進行培養。於培養第7天或第21天對愈傷組織[第7天(初級愈傷組織(primary callus))、播種後第21天(次級愈傷組織(secondary callus))]進行取樣，以液氮速凍後於-80℃下保存。使用該等進行CYP72A31、CYP72A32、CYP72A33基因之表現解析。
    使用RNeasy Plant迷你試劑盒(QIAGEN公司，Piscataway，NJ，USA)自各樣品提取總RNA。cDNA係使用逆轉錄酵素ReverTra Ace(東洋紡社，日本大阪)進行擴增。製作含有總RNA 1 μg、10 pmol/μL Oligo(dT)20引子(試劑盒隨附)2 μL、5×RT緩衝液(ReverTra Ace隨附)4 μL、dNTP混合物(各10 mM，試劑盒隨附)1 μL、10 U/μL RNase抑制劑(試劑盒隨附)1 μL、ReverTra Ace(試劑盒隨附)1 μL之20 μL的反應液，於42℃下進行20分鐘逆轉錄反應後，於99℃下加熱5分鐘使反應停止。該等於4℃下保存。
    將反應後之cDNA溶液稀釋10倍，將所獲得者用於即時PCR。關於即時PCR，使用Power SYBR Green PCR Master Mix(LIFE TECHNOLOGY公司，Foster City，CA，USA)製備反應液，使用ABI7300即時PCR(Applied Biosystems公司)進行轉錄產物之定量。製作含有cDNA溶液5 μL、1 μM引子各1 μL、Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μL之20 μL之反應液，以95℃加熱10分鐘後，將95℃、15秒及60℃、1分鐘之反應重複40個循環。各基因之轉錄產物量以OsActin1基因之表現量修正。擴增CYP72A31基因時，使用5'-GAAGAACAAACCTGACTACGAAGGCT-3'(序列編號3)作為正向引子，使用5'-CTCCATCTCTTTGTATGTTTTCCGACCAAT-3'(序列編號4)作為反向引子。擴增CYP72A32基因時，使用5'-AGGACTATTTGGGAAGAACAAACCTGAG-3'(序列編號5)作為正向引子，使用5'-TTCATCTCCTTGTATGTTCTCCGCTTAAG-3'(序列編號6)作為反向引子。擴增CYP72A33基因時，使用5'-GGAAGAATAAACCAGACTATGATGGCC-3'(序列編號7)作為正向引子，使用5'-CTCCATCTCCTTGTATGTTTTTCGAGTAAG-3'(序列編號8)作為反向引子。又，擴增OsActin1基因時，使用5'-AGGCCAATCGTGAGAAGATGACCCA-3'(序列編號9)作為正向引子，使用5'-GTGTGGCTGACACCATCACCAGAG-3'(序列編號10)作為反向引子。
    將結果示於圖5A~圖5C中。如圖5A~圖5C中所示，日本晴中由於CYP72A31基因為偽基因故而未確認到基因表現。又，如圖5A~圖5C中所示，於Kasalath之愈傷組織中，CYP72A31基因之表現量較低。該情況與Kasalath之愈傷組織未顯示BS抗性之情況一致(參照下述之圖8)。又，已知，CYP72A31基因於根部之表現多於莖葉部。
    另一方面，CYP72A32基因於日本晴之莖葉部中顯示尤其較高之表現模式。CYP72A33基因於日本晴及Kasalath中可見表現模式上之較大之差異。
    [實施例4]HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A31：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A31)、HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A32：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A32)、HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A33：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A33)、HptII：：35Spro：：日本晴CYP72A32：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-nbCYP72A32)、HptII：：35Spro：：日本晴CYP72A33：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-nbCYP72A33)、HptII：：35Spro：：sGFP：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-sGFP及pCAMBIA1302-sGFP)、OsALS(W548L/S627I)：：OsAct-1pro：：sGFP：：Tnos載體質體(pSTARA-sGFP)向根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105株中之導入
    將上述8種載體質體(50 ng、圖6)加入至於冰上溶解之40 μl之電穿孔用土壤桿菌勝任細胞(EHA105株)中，平穩地混合。將勝任細胞混合液移入經冰浴冷卻之比色管中，使用Gene Pulser Xcell(Bio Rad公司)於25 μF、2.4 kV、200 Ω之條件下進行電穿孔。其後，迅速地將1 ml之YM液體培養基(於1 L培養基中含有0.4 g酵母萃取物(DIFCO公司製造)、10 g甘露糖醇、0.1 g NaCl、0.1 g MgSO4、0.5 g K2HPO4-3H2O。pH值調整為7.0)加入至比色管中進行混合後，將全量移入1.5 ml微量管，以27℃、250 rpm進行3小時振盪培養。培養結束後，於YM瓊脂培養基(含有12.5 ppm立復黴素、25 ppm氯黴素、50 ppm康黴素(pSTARA-sGFP以外之載體質體)，或含有12.5 ppm立復黴素、25 ppm氯黴素、50 ppm觀黴素(pSTARA-sGFP載體質體))上塗佈50 μl左右，於27℃下培養2-3天。將菌落接種於YM液體培養基(含有12.5 ppm立復黴素、25 ppm氯黴素、50 ppm康黴素(pSTARA-sGFP以外之載體質體)，或含有12.5 ppm立復黴素、25 ppm氯黴素、50 ppm觀黴素(pSTARA-sGFP載體質體))，於27℃下振盪培養2-3天。製作甘油儲存液後於-85℃下進行保存。 [實施例5]轉形水稻之製作
    使用經次氯酸鈉滅菌之水稻(Oryza sativa,cv.Nipponbare或Oryza sativa,cv.Kasarath)之種子進行利用土壤桿菌之轉形(Toki et al.,Plant J.,47,969(2006))。 <土壤桿菌之預培養>
    於進行轉形3天前，將實施例4中製備之土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens EHA105株)塗佈於AB固形培養基(含有12.5 ppm立復黴素、25 ppm氯黴素、50 ppm康黴素(pSTARA-sGFP以外之載體質體)，或含有12.5 ppm立復黴素、25 ppm氯黴素、50 ppm觀黴素(pSTARA-sGFP載體質體))上，於24℃、黑暗條件下培養3天。 <土壤桿菌之感染及共存培養>
    於50 ml之Falcon管中裝入AAM培養基40 ml，以成為40 mg/l之方式添加乙醯丁香酮。以200 μl吸嘴之前端少量刮取預培養之土壤桿菌，溶解於上述之AAM培養基中，於黑暗條件下振盪30分鐘。從源自在N6D培養基中培養5天之子葉盤的愈傷組織去除地上部及胚乳部分，加入至添加有土壤桿菌之AAM培養基中，振盪1.5分鐘。將AAM培養基之上清液倒出至燒杯中，將殘留於水稻種子上之多餘AAM培養基以滅菌之Kimtowel(商品名，Crecia股份有限公司製)去除。將愈傷組織置於2N6-AS培養基(添加40 mg/l乙醯丁香酮)中於24℃、黑暗條件下共存培養3天。 <土壤桿菌之除去及選拔>
    將共存培養之愈傷組織移入50 ml之Falcon管中，以含有500 mg/l卡本西林之滅菌水清洗7-8次，將多餘之洗液以球型刻度滴管(Komagome pipette)等儘可能去除。清洗後，於水變清澈時於滅菌水中靜置10分鐘。以滅菌水500 ml清洗10次左右，將愈傷組織置於經滅菌之Kimwipe(拭鏡紙)上去除多餘水分。將愈傷組織移植於N6D(50 ppm潮黴素(pSTARA-sGFP載體以外)或0.25 μM雙草醚鈉鹽(pSTARA-sGFP載體)、400 mg/l卡本西林)培養基中，以34℃、明處培養兩週後，進行繼代，進而培養兩週。 <轉形體之再分化>
    選拔培養後，將愈傷組織移植於水稻再分化培養基RE-III(含有50 ppm潮黴素或0.25 μM雙草醚鈉鹽)，以27℃、16L/8D進行培養，誘導其再分化。2週後進行継代，進而在約2~3週獲得再分化之轉形水稻(T0)。若地上部、根發生分化，則移植至無激素(HF)培養基(含有50 ppm潮黴素或0.25 μM雙草醚鈉鹽)中。將各培養基組成示於表1。
    <轉形體之栽培及T1種子之採種>
    將於無激素(HF)培養基中充分生根之個體移植入直徑8 cm之聚氯乙烯盆中於封閉系統溫室(25-30℃、16L/8D)下進行培育，採集T1種子。 [實施例6]利用HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A31：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A31)及HptII：：35Spro：：sGFP：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-sGFP)進行轉形之水稻愈傷組織(日本晴、Kasalath)於含BS之培養基中之愈傷組織的增殖試驗
    依據實施例5，將HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A31：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A31、kasCYP72A31過度表現構建物)及作為對照之HptII：：35Spro：：sGFP：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-sGFP、sGFP過度表現構建物)藉由土壤桿菌法導入至水稻(品種：日本晴及Kasalath)中。分離以50 ppm潮黴素選拔出之轉形愈傷組織，移植入含有雙草醚鈉鹽(BS)之培養基中研究愈傷組織之增殖。
    於在日本晴及Kasalath之愈傷組織中導入有GFP過度表現構建物之情形時，任一系均藉由置於含有0.25、0.5、0.75 μM BS之培養基中，而抑制其生長(圖7)。另一方面，於向日本晴及Kasalath之愈傷組織中導入CYP72A31過度表現構建物並同樣地置於含有0.25、0.5、0.75 μM BS之培養基中之情形時，日本晴及Kasalath均可確認與置於不含BS之培養基中之愈傷組織同樣地增殖的愈傷組織(圖8：日本晴、圖9：Kasalath)。又，圖7中非重組Kasalath之愈傷組織不顯示BS抗性，其原因在於Kasalath愈傷組織中之CYP72A31基因之表現量較少(參照圖5A~圖5C)。 [實施例7]利用HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A32：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A32)、HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A33：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A33)、HptII：：35Spro：：日本晴CYP72A32：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-nbCYP72A32)、HptII：：35Spro：：日本晴CYP72A33：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-nbCYP72A33)進行轉形之水稻愈傷組織(日本晴、Kasalath)於含BS之培養基中之愈傷組織的增殖試驗
    依據實施例5，將HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A32：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A32、kasCYP72A32過度表現構建物)、HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A33：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A33、kasCYP72A33過度表現構建物)、HptII：：35Spro：：日本晴CYP72A32：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-nbCYP72A32、nbCYP72A32過度表現構建物)、HptII：：35Spro：：日本晴CYP72A33：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-nbCYP72A33 nbCYP72A33過度表現構建物)藉由土壤桿菌法導入至水稻(品種：日本晴)中。分離以50 ppm潮黴素選拔出之轉形愈傷組織，移植入含有雙草醚鈉鹽(BS)之培養基中研究愈傷組織之增殖。
    將使源自日本晴之CYP72A32過度表現的結果、使源自Kasalath之CYP72A32過度表現的結果分別示於圖10(a)及(b)。又，將使源自日本晴之CYP72A33過度表現的結果、使源自Kasalath之CYP72A33過度表現的結果分別示於圖11(a)及(b)。如圖10及11所示，即便使源自Kasalath及源自日本晴之CYP72A32及CYP72A33之任一者過度表現，日本晴愈傷組織於含BS之培養基中亦不增殖。 [實施例8]源自Kasalath之CYP72A31基因轉形水稻愈傷組織於含BS之再分化培養基上之再分化試驗
    依據實施例5，將HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A31：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A31、kasCYP72A31過度表現構建物)及作為對照之HptII：：35Spro：：sGFP：：Tnos載體質體(pCAMBIA1302-sGFP、sGFP過度表現構建物)及OsALS(W548L/S627I)：：OsAct-1pro：：sGFP：：Tnos載體質體(pSTARA-sGFP、BS抗性構建物)藉由土壤桿菌法導入至水稻(品種：日本晴)中。依據圖12之A)所示之排程，選拔利用50 ppm之潮黴素進行轉形之愈傷組織。利用pCAMBIA1390-KasCYP72A31構建物之轉形效率為85%(83/98愈傷組織)。其中將43愈傷組織移植入含有0.25 μM之BS之再分化培養基中，結果以91%(39/43愈傷組織)之再分化效率自愈傷組織分化出地上部及根(圖13)。繼而，移植入含有0.25 μM之BS之無激素培養基，結果根部伸長之個體為再分化個體之73%(16/22再分化個體)(圖14)。另一方面，以不具有BS抗性標記物之pCAMBIA1302-sGFP轉形之愈傷組織於含有0.25 μM之BS之再分化培養基上無法確認再分化個體，KLB-279(pSTARA載體)自愈傷組織分化地上部及根，可確認再分化個體(圖13)。 [實施例9]源自Kasalath之CYP72A31基因轉形水稻再分化個體於含BS之無激素培養基上之生根試驗
    實驗例8中藉由50 ppm潮黴素選拔獲得利用pCAMBIA1390-KasCYP72A31構建物進行轉形之水稻(日本晴)愈傷組織。於將該等移植入含有50 ppm之潮黴素之再分化培養基中之情形時，以95%(38/40愈傷組織)之再分化效率自愈傷組織分化出地上部及根。繼而，將pCAMBIA1390-KasCYP72A31構建物之再分化個體25個移植入含有1 μM之BS之無激素培養基中，結果7個個體根部伸長(28%之根部伸長率，圖15)。另一方面，作為對照之利用pCAMBIA1302-sGFP構建物進行轉形之再分化個體於含有1 μM之BS之無激素培養基中完全未見生根，植物體枯死。
    由實施例8與實施例9明確，使用Kasalath CYP72A31基因，可與水稻2點變異型ALS(W548L/S627I)基因同樣地以含有0.25 μM之BS之再分化培養基選拔再分化個體，於含有0.25、1 μM之BS之無激素培養基中根部伸長。進而明確，藉由使用含有1 μM之BS之無激素培養基，可防止導入基因之逃逸。 [實施例10]轉形阿拉伯芥之製作
    本實施例中，利用實施例4中製作出之土壤桿菌，將HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A31：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A31)、HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A32：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A32)、HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A33：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A33)藉由浸漬法(浸漬)導入至阿拉伯芥(環境型：Col-0)中。浸漬法係依據慣例。將所獲得之T2種子於含有20 ppm潮黴素之培養基上進行栽培，調查對潮黴素顯示感受性之個體之比率。於播種之所有個體中將顯示潮黴素抗性之系視為認為T-DNA同型且固定之系，選拔K31-4-2、K31-6-5作為pCAMBIA1390-KasCYP72A31之固定系，選拔K32-1-1、K32-3-1、K32-5-1作為pCAMBIA1390-KasCYP72A32之固定系，選拔K33-1-3、K33-2-4作為pCAMBIA1390-KasCYP72A33之固定系。將該等之種子播種於含有各濃度之BS之培養基中，栽培10天。將結果示於圖16A及圖16B。
    根據圖16A及圖16B判斷，過度表現源自Kasalath之CYP72A31之轉形阿拉伯芥系中，即便於對非轉形阿拉伯芥(NT)之生長可見阻礙之高濃度之BS條件下，亦顯示與未處理BS之條件同樣地生長。另一方面，過度表現源自Kasalath之CYP72A32及CYP72A33之任一者之轉形阿拉伯芥系中，未見此種BS感受性之降低。
    繼而，關於非轉形阿拉伯芥(NT(圖17中A~C中「Col-0」))及轉形個體(K31-4-2(圖17中A~C中「K31oe-4-2」)、K31-6-5(圖17中A~C中「K31oe-6-5」))，將各系15粒種子於含有各濃度之BS之培養基上進行栽培。自栽培開始第10天調查(a)發芽之個體(可見自種子之生根之個體)之比率、(b)真葉展開之個體之比率、(c)地上部之鮮重(15個體之總和)。將該等(a)~(c)之測定結果分別示於圖17A~C。再者，圖17A~C中所示之圖表表示3次重複之平均±SE(n=3)。如圖17A~C所示，於(a)~(c)任一指標中，K31-4-2、K31-6-5與NT相比，BS感受性均明顯降低。
    繼而，關於非轉形阿拉伯芥(NT(圖18中A~C中「Col-0」))及轉形個體(K32-1-1(圖18中A~C中「K32oe-1-1」)、K32-3-1(圖18中A~C中「K32oe-3-1」)、K32-5-1(圖18中A~C中「K32oe-5-1」))，將各系15粒種子於含有各濃度之BS之培養基上進行栽培。自栽培開始第10天調查(a)發芽之個體(可見自種子之生根之個體)之比率、(b)真葉展開之個體之比率、(c)地上部之鮮重(15個體之總和)。將該等(a)~(c)之測定結果分別示於圖18A~C。再者，圖18A~C所示之圖表中，圖表表示3次重複之平均±SE(n=3)。如圖18A~C所示，明確於任一指標中，K32-1-1、K32-3-1、K32-5-1均顯示與NT同程度之BS感受性。
    繼而，關於非轉形阿拉伯芥(NT(圖19中A~C中「Col-0」))及轉形個體(K33-1-3(圖18中A~C中「K33oe-1-3」)、K33-2-4(圖18中A~C中「K33oe-2-4」))，將各系15粒種子於含有各濃度之BS之培養基上進行栽培。自栽培開始第10天調查(a)發芽之個體(可見自種子之生根之個體)之比率、(b)真葉展開之個體之比率、(c)地上部之鮮重(15個體之總和)。將該等(a)~(c)之測定結果分別示於圖19A~C。再者，圖19A~C所示之圖表中，圖表表示3次重複之平均±SE(n=3)。如圖19A~C所示，明確於任一指標中，K33-1-3、K33-2-4均顯示與NT同程度之BS感受性。 [實施例11]使用導入有源自Kasalath之CYP72A31過度表現構建物之阿拉伯芥或水稻的藥劑感受性試驗
    為了調查源自Kasalath之CYP72A31基因對BS以外之藥劑是否顯示抗性，使用依據實施例10製作出之利用HptII：：35Spro：：Kasalath CYP72A31：：Tnos載體質體(pCAMBIA1390-KasCYP72A31)進行轉形之阿拉伯芥之同型系(K31-4-2)或實施例5中製作出之水稻之後代的同型系(T3)(K31-4-6-2)，調查藥劑感受性。 <使用轉形阿拉伯芥之藥劑感受性試驗>
    使Murashige-Skoog(MS)培養基用混合鹽類(和光純藥工業股份有限公司製造)1袋、蔗糖20 g、鹽酸硫胺明3 mg、菸鹼酸5 mg、鹽酸吡哆醇0.5 mg溶解於蒸餾水中，以蒸餾水進行定容製成1 L。以1 M之KOH將pH值製備成5.8~6.3後，添加3 g之結冷膠，以電子爐使結冷膠溶解。此後進行高壓蒸氣滅菌處理，製備無菌MS培養基。將供試藥劑以最終濃度成為1.3、4.1、12、37、110或330 nM之方式添加於該無菌MS培養基中。將種子滅菌之阿拉伯芥播種於含有藥劑之MS培養基中，以22℃、連續明期栽培12~14天。
    再者，本實施例中，作為藥劑，使用雙草醚鈉鹽(bispyribac-sodium)、嘧硫草醚鈉鹽(pyrithiobac-sodium)、嘧硫草醚(pyriminobac)、苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)、平速爛(penoxsulam)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron-ethyl)、醯嘧磺隆(amidosulfuron)、唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)、菸嘧磺隆(nicosulfuron)及咪唑嘧磺隆(propyrisulfuron)。
    將使用雙草醚鈉鹽(bispyribac-sodium)及嘧硫草醚鈉鹽(pyrithiobac-sodium)作為藥劑栽培12天之結果示於表2及圖20。
    再者，表2所示之「感受性比」係根據[K31-4-2中顯示真葉展開率40%以上之最高藥劑濃度]/[NT中顯示真葉展開率40%以上之最高藥劑濃度]算出之值。
    又，將使用雙草醚鈉鹽(bispyribac-sodium)、嘧硫草醚(pyriminobac)、苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)、平速爛(penoxsulam)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron-ethyl)、醯嘧磺隆(amidosulfuron)、唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)、菸嘧磺隆(nicosulfuron)及咪唑嘧磺隆(propyrisulfuron)作為藥劑栽培14天之結果示於表3及圖21~24。
    再者，表3所示之「感受性比」係根據[K31-4-2中顯示真葉展開率80%以上之最高藥劑濃度]/[NT中顯示真葉展開率80%以上之最高藥劑濃度]算出之值。
    根據表2及3以及圖20~24判斷，以過度表現之方式導入有源自Kasalath之CYP72A31基因的阿拉伯芥之同型系(K31-4-2)對雙草醚鈉鹽(bispyribac-sodium)、嘧硫草醚鈉鹽(pyrithiobac-sodium)、嘧硫草醚(pyriminobac)、苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)、平速爛(penoxsulam)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron-ethyl)、醯嘧磺隆(amidosulfuron)、唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)、菸嘧磺隆(nicosulfuron)、咪唑嘧磺隆(propyrisulfuron)顯示抗性。 <使用轉形水稻之藥劑感受性試驗>
    又，依據實施例1之方法，製作含有供試藥劑濃度0.01、0.1、1或10 μM之結冷膠培養基，將水稻種子滅菌、催芽、播種、栽培。將其結果示於表4及圖25。
    再者，表4所示之「感受性比」係根據[K31-4-6-2中顯示CK比40%以上之最高藥劑濃度]/[野生型水稻中顯示CK比40%以上之最高藥劑濃度]算出之值。
    根據表4及圖25判斷，過度表現源自Kasalath之CYP72A31基因之轉形水稻對雙草醚鈉鹽(bispyribac-sodium)及唑啉草酯(pinoxaden)顯示抗性。
    根據以上結果，明確CYP72A31基因對BS以外之生長抑制物質亦顯示抗性。 [實施例12]導入有pCAMBIA1390-KasCYP72A31之水稻愈傷組織利用BS之轉形體的選拔
    使用利用pCAMBIA1390-KasCYP72A31進行轉形之水稻，調查是否可將BS用作選拔試劑，將源自Kasalath之CYP72A31基因用作轉形之選拔標記物。依據實施例5，使用pCAMBIA1390-KasCYP72A31或pSTARA-sGFP以土壤桿菌法分別進行水稻(日本晴)之轉形。 <N6D培養基中之藥劑抗性愈傷組織之選拔>
    將利用pCAMBIA1390-KasCYP72A31進行轉形之水稻(日本晴)愈傷組織於含有0.1或0.25 μM之BS之N6D培養基或者含有50 ppm潮黴素之N6D培養基中培養4週，進行藥劑抗性愈傷組織之選拔。又，將利用pSTARA-sGFP進行轉形之水稻愈傷組織於含有0.25 μM之BS之N6D培養基中同樣地進行選拔。
    將結果示於圖26。該結果為，將利用pCAMBIA1390-KasCYP72A31進行轉形之水稻愈傷組織於含有BS濃度0.1或0.25 μM之N6D培養基中進行培養之情形時，選拔效率(所獲得之轉形愈傷組織/總愈傷組織之比率)分別為71%、61%。將相同之轉形愈傷組織於含有50 ppm潮黴素之N6D培養基中進行培養之情形時，選拔效率為79%，與以BS為選拔試劑之情形大致相同。再者，利用pSTARA-sGFP進行轉形之水稻愈傷組織之BS選拔的選拔效率為82%。 <轉形體之再分化>
    繼而，利用pCAMBIA1390-KasCYP72A31進行轉形，將利用含有0.1 μM之BS之N6D培養基所選拔之愈傷組織於含有0.25 μM之BS之水稻再分化培養基RE-III中培養13天，此後於未添加藥劑之再分化培養基RE-III中培養14天。
    其結果如圖27所示，獲得再分化個體。
    由以上之結果明確，可將BS用作選拔試劑，將CYP72A31基因用作轉形標記物。
    本說明書中引用之所有刊物、專利及專利申請案係直接作為參考而併入本說明書中。
    圖1係表示越光、Kasalath及越光/Kasalath染色體片段置換系於含BS之培養基中生長之結果的照片。
    圖2係表示利用基因座區域定位而研究BS抗性之原因基因之結果的特性圖。
    圖3係表示位於1號染色體上之標記物RM9~41834-50間之3個P450的特性圖。
    圖4係表示將Kasalath中之CYP72A31基因與日本晴中之CYP72A31基因進行比較之結果的特性圖。
    圖5A係表示解析日本晴愈傷組織及Kasalath愈傷組織中之CYP72A31基因之表現之結果的特性圖。
    圖5B係表示解析日本晴愈傷組織及Kasalath愈傷組織中之CYP72A32基因之表現之結果的特性圖。
    圖5C係表示解析日本晴愈傷組織及Kasalath愈傷組織中之CYP72A33基因之表現之結果的特性圖。
    圖6係模式性地表示用於製作出轉形水稻之8種載體質體之概略構成圖。
    圖7係表示於將GFP過度表現構建物導入至日本晴及Kasalath中之情形時由BS引起之生長抑制的照片。
    圖8係表示於將源自Kasalath之CYP72A31過度表現構建物導入至日本晴中之情形時由BS引起之生長抑制的照片。
    圖9係表示於將源自Kasalath之CYP72A31過度表現構建物導入至Kasalath中之情形時由BS引起之生長抑制的照片。
    圖10係表示使源自日本晴之CYP72A32過度表現之結果(a)、使源自Kasalath之CYP72A32過度表現之結果(b)的照片。
    圖11係表示使源自日本晴之CYP72A33過度表現之結果(a)、使源自Kasalath之CYP72A33過度表現之結果(b)的照片。
    圖12A)、B)係說明於實施例8及9中實施之轉形方法之圖。
    圖13係使轉形水稻於含BS之再分化培養基中生長時之照片。
    圖14係使圖13中所示之再分化個體於含BS之無激素培養基中生長時的照片。
    圖15係表示使實施例9中製作之再分化個體於含BS之無激素培養基中生長並觀察根之成長之結果的照片。
    圖16A係表示利用源自Kasalath之CYP72A31基因、源自Kasalath之CYP72A32基因或源自Kasalath之CYP72A33進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果的照片。
    圖16B係表示利用源自Kasalath之CYP72A31基因、源自Kasalath之CYP72A32基因或源自Kasalath之CYP72A33進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果的照片。
    圖17A係表示利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(發芽個體之比率)的特性圖。
    圖17B係表示利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(真葉展開之個體之比率)的特性圖。
    圖17C係表示利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(地上部之鮮重)的特性圖。
    圖18A係表示利用源自Kasalath之CYP72A32基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(發芽個體之比率)的特性圖。
    圖18B係表示利用源自Kasalath之CYP72A32基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(真葉展開之個體之比率)的特性圖。
    圖18C係表示利用源自Kasalath之CYP72A32基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(地上部之鮮重)的特性圖。
    圖19A係表示利用源自Kasalath之CYP72A33基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(發芽個體之比率)的特性圖。
    圖19B係表示利用源自Kasalath之CYP72A33基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(真葉展開之個體之比率)的特性圖。
    圖19C係表示利用源自Kasalath之CYP72A33基因進行轉形之阿拉伯芥(Col-0)於含BS之培養基中之生長試驗之結果(地上部之鮮重)的特性圖。
    圖20係表示針對利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之阿拉伯芥(K31-4-2)與非轉形阿拉伯芥(NT)，使用未添加藥劑之培養基、添加BS之培養基、添加嘧硫草醚鈉鹽之培養基之生長試驗之結果的照片。
    圖21係表示針對利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之阿拉伯芥(K31-4-2)與非轉形阿拉伯芥(NT)，使用未添加藥劑之培養基、添加BS之培養基、添加嘧硫草醚之培養基之生長試驗之結果的照片。
    圖22係表示針對利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之阿拉伯芥(K31-4-2)與非轉形阿拉伯芥(NT)，使用添加苄嘧磺隆之培養基、添加平速爛之培養基之生長試驗之結果的照片。
    圖23係表示針對利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之阿拉伯芥(K31-4-2)與非轉形阿拉伯芥(NT)，使用添加吡嘧磺隆之培養基、添加醯嘧磺隆之培養基、添加唑吡嘧磺隆之培養基之生長試驗之結果的照片。
    圖24係表示針對利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之阿拉伯芥(K31-4-2)與非轉形阿拉伯芥(NT)，使用添加菸嘧磺隆之培養基、添加咪唑嘧磺隆之培養基之生長試驗之結果的照片。
    圖25係表示針對利用源自Kasalath之CYP72A31基因進行轉形之水稻(K31-4-6-2)與非轉形水稻(NT)，使用添加BS之培養基、添加唑啉草酯之培養基之生長試驗之結果的照片。
    圖26係表示針對導入有pCAMBIA1390-KasCYP72A31或pSTARA-sGFP之水稻愈傷組織，使用含BS之N6D培養基之生長試驗之結果的照片。
    圖27係表示利用BS選拔導入有pCAMBIA1390-KasCYP72A31之水稻愈傷組織後使其再分化之試驗之結果的照片。
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    <220>
    <223> 合成DNA
    <400> 8
    <210> 9
    <211> 25
    <212> DNA
    <213> 人工
    <220>
    <223> 合成DNA
    <400> 9
    <210> 10
    <211> 24
    <212> DNA
    <213> 人工
    <220>
    <223> 合成DNA
    <400> 10
    权利要求:
    Claims (9)
    [1] 一種基因，其編碼包含以下(a)~(c)中之任一者所記載之聚核苷酸且分類為源自印度水稻之CYP72A31之細胞色素P450，(a)編碼包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質的聚核苷酸，(b)編碼包含序列編號2之胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或複數個胺基酸之胺基酸序列之蛋白質，且作為賦予對生長抑制物質之抗性之基因而發揮功能的聚核苷酸，(c)在嚴格條件下和包含與序列編號1之鹼基序列互補之鹼基序列的聚核苷酸進行雜交，且作為賦予對生長抑制物質之抗性之基因而發揮功能的聚核苷酸。
    [2] 一種表現載體，其含有如請求項1之基因。
    [3] 如請求項2之表現載體，其進而組入有與上述基因不同之任意基因。
    [4] 一種轉形體，其含有如請求項2或3之表現載體。
    [5] 一種基因轉殖植物，其含有如請求項2或3之表現載體。
    [6] 如請求項5之基因轉殖植物，其中植物為植物體、植物器官、植物組織或植物培養細胞。
    [7] 一種對生長抑制物質具有抗性的植物之製造方法，其特徵在於：培養或栽培如請求項5或6之基因轉殖植物。
    [8] 一種防除對該植物有害之雜草之方法，係藉由於栽培有如請求項5或6之基因轉殖植物之田地中利用生長抑制物質進行處理。
    [9] 一種轉形方法，其包括：對顯示出對生長抑制物質之感受性之宿主導入如請求項3之表現載體的步驟；及將於該生長抑制物質之存在下生長之細胞作為轉形體進行選拔的步驟。
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    TWI621710B|2018-04-21|
    AR088321A1|2014-05-28|
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    JP6045500B2|2016-12-14|
    KR102060513B1|2019-12-30|
    引用文献:
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2011-226174||2011-10-13||
    JP2011226174||2011-10-13||
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