![]() 植物微體繁殖之組成物、方法及系統
专利摘要:
本發明係提供用於達成極高增殖率之植物體外微體繁殖(micropropagation)的組成物、方法及系統。 公开号:TW201321503A 申请号:TW101126435 申请日:2012-07-23 公开日:2013-06-01 发明作者:Jackie R Heinricher;Randall W Burr;Jerrin Victor 申请人:Booshoot Llc; IPC主号:A01C1-00
专利说明:
植物微體繁殖之組成物、方法及系統 本發明整體而言係關於植物繁殖之組成物、方法及系統。在一些具體例中,本發明係提供用於植物微體繁殖(micropropagation)之組成物、方法和系統。 (相關申請案之相互參照) 本案主張下列優先權及利益:2011年7月22日申請之美國臨時專利申請第61/510,955號;2011年8月2日申請之第61/514,331號;2011年8月5日申請第61/515,735號;2011年8月12日申請之第61/523,162號;2011年8月12日申請之第61/523,205號;2011年8月28日申請之第61/552,834號;2012年3月7日申請之第61/607,838號;及2012年3月30日申請之第61/618,344號,其各以參照方式全部併入本文用於所有目的。 隨著土地生產用於能量和原料的食物和生質的負擔增加,更多注意力被放在識別和利用生長更快和更多產的植物上。雖然有很多植物適用於這類目的,但對於開發快速、經濟的植物繁殖組成物、方法及系統仍存在極大的需求。 本發明提供用於植物組織培養的組成物、方法及系統,例如植物微體繁殖的組成物、方法及系統。在一些具體例中,所述組成物、方法及系統係用於植物體外微體繁殖。 提供用於植物體外微體繁殖的培養基,在一些具體例中,提供芽誘導培養基(bud induction media)及苗伸長/維持培養基(shoot elongation/maintenance media)。在一些具體例中,芽誘導培養基包含一種或多種強細胞分裂素,且苗伸長/維持培養基包含一種或多種相對弱的細胞分裂素。在一些具體例中,芽誘導培養基包含噻苯隆(thidiazuron,TDZ)或其類似物,且苗伸長及維持培養基包含除TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素。在一些具體例中,所述除TDZ之外的細胞分裂素係選自由N6-苄胺基嘌呤(BAP)、間拓樸林(meta-topolin,mT)、玉米素(zeatin)、玉米素核苷(zeatin riboside)、二氫玉米素(dihydrozeatin)、激動素、異戊烯腺嘌呤(ip,如2ip)、腺嘌呤半硫酸鹽(adenine hemisulfate)、二甲基烯丙基腺嘌呤(dimethylallyladenine)、N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(4-CPPU),及其類似物所組成之群。在一些具體例中,所述培養基可用於單子葉植物或雙子葉植物的植物體外微體繁殖。在一些具體例中,所述培養基可用於竹植物的體外微體繁殖。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基包含有效量的噻苯隆(TDZ)或其類似物,且其中所述苗伸長/維持培養基包含有效量的除TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中一種或多種除TDZ或其類似物之外的細胞分裂素選自由N6-苄胺基嘌呤(BAP)、間拓樸林(mT)、玉米素、玉米素核苷、二氫玉米素、激動素、2-異戊烯腺嘌呤(2ip)、腺嘌呤半硫酸鹽、二甲基烯丙基腺嘌呤、N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(4-CPPU),及其類似物所組成之群。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基中TDZ或其類似物的濃度能有效誘導苗芽。在一些具體例中,所述芽誘導培養基中TDZ或其類似物的濃度約0.25 mg/L至約100 mg/L,例如,約0.5 mg/L至約2 mg/L。因此,所述芽誘導培養基中TDZ或其類似物的濃度可為,例如,約0.25 mg/L、約0.3 mg/L、約0.4 mg/L、約0.5 mg/L、約0.6 mg/L、約0.7 mg/L、約0.8 mg/L、約0.9 mg/L、約1.0 mg/L、約1.5 mg/L、約2.0 mg/L、約2.5 mg/L、約3 mg/L、約4 mg/L、約5 mg/L、約6 mg/L、約7 mg/L、約8 mg/L、約9 mg/L、約10 mg/L、約15 mg/L、約20 mg/L、約25 mg/L、約30 mg/L、約40 mg/L、約50 mg/L、約60 mg/L、約70 mg/L、約80 mg/L、約90 mg/L或約100 mg/L。 在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中除TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素的濃度能有效使苗伸長。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中除TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素的濃度為自約0.01 mg/L至約100 mg/L,例如,自約0.25 mg/L至約5 mg/L。因此,所述苗伸長/維持培養基中除TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素的濃度可為,例如,約0.01 mg/L、約0.02 mg/L、約0.03 mg/L、約0.04 mg/L、約0.05 mg/L、約0.06 mg/L、約0.07 mg/L、約0.08 mg/L、約0.09 mg/L、約0.10 mg/L、約0.15 mg/L、約0.20 mg/L、約0.25 mg/L、約0.3 mg/L、約0.35 mg/L、約0.4 mg/L、約0.45 mg/L、約0.5 mg/L、約0.6 mg/L、約0.7 mg/L、約0.8 mg/L、約0.9 mg/L、約1.0 mg/L、約1.5 mg/L、約2.0 mg/L、約2.5 mg/L、約3 mg/L、約4 mg/L、約5 mg/L、約6 mg/L、約7 mg/L、約8 mg/L、約9 mg/L、約10 mg/L、約15 mg/L、約20 mg/L、約25 mg/L、約30 mg/L、約40 mg/L、約50 mg/L、約60 mg/L、約70 mg/L、約80 mg/L、約90 mg/L或約100 mg/L。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基及/或所述苗伸長/維持培養基進一步包含一種或多種生長素。在一些具體例中,所述生長素選自由β-萘氧乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、毒莠定(picloram),及其各別類似物所組成之群。例如,所述生長素是NAA或其類似物。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基是液體培養基。在一些具體例中,所述芽誘導培養基是固體培養基。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基是液體培養基。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基是固體培養基。 本發明又提供植物體外微體繁殖的方法。在一些具體例中,所述方法用於體外微體繁殖植物。在一些具體例中,所述方法包括(a)在第一培養基中培養植物組織培養物、培植體(explant)或種子,及(b)然後在第二培養基中培養從步驟(a)獲得的植物組織。在一些具體例中,第一培養基是芽誘導培養基,且第二培養基是苗伸長及維持培養基。 在一些具體例中,當使用芽誘導培養基以及苗伸長及維持培養基時,所述方法包括:(a)在芽誘導培養基中培養植物組織培養物、培植體或種子以誘導苗芽形成;及(b)在苗伸長/維持培養基中培養在步驟(a)獲得的苗芽。 在一些具體例中,當使用芽誘導培養基以及苗伸長及維持培養基時,所述方法進一步包括:(c)在芽誘導培養基中培養從步驟(b)獲得的苗以誘導苗芽形成;及(d)在苗伸長/維持培養基中培養在步驟(c)獲得的苗芽。 在一些具體例中,當使用芽誘導培養基以及苗伸長及維持培養基時,所述方法進一步包括:(e)將培養步驟(c)和步驟(d)重複至少一次、至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次,或更多次額外的迴圈。對於步驟(c)和步驟(d)可重複的迴圈次數沒有限制。在步驟(a)或步驟(c)中獲得的芽及/或苗可以在該芽及/或苗分別進入步驟(b)或步驟(d)之前分離,其中這樣的分離每次分離可產生單個芽或苗、2個芽及/或苗、3個芽及/或苗、或4個或更多芽及/或苗。最佳分離大量、快速生產單一物種、基因型或選殖株的複製竹通常係牽涉將步驟(a)或步驟(c)獲得的芽及/或苗在分別進入步驟(b)或步驟(d)之前分別分成1-3個芽及/或苗。當每次分離有2個或更多個芽及/或苗時,其在此領域係稱為聚叢(clumping)或芽及/或苗「團(clump)」。本發明的方法學中的一些變化可能是必需的,以針對竹的特定物種、基因型或選殖株精細調整方法,且這類方法的變化在本發明的公開之內。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基包含有效量的噻苯隆(TDZ)或其類似物,且其中所述苗伸長/維持培養基包含有效量的一種或多種除TDZ或其類似物之外的細胞分裂素。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中一種或多種除TDZ或其類似物的細胞分裂素選自由N6-苄胺基嘌呤(BAP)、間拓樸林(mT)、玉米素、玉米素核苷、二氫玉米素、激動素、2-異戊烯腺嘌呤(2ip)、腺嘌呤半硫酸鹽、二甲基烯丙基腺嘌呤、N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(4-CPPU),及其類似物所組成之群。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基中TDZ或其類似物的濃度能有效誘導苗芽。在一些具體例中,所述芽誘導培養基中TDZ或其類似物的濃度是約0.25 mg/L至約100 mg/L,例如約0.5 mg/L至約2 mg/L。因此,所述芽誘導培養基中TDZ或其類似物的濃度可以是,例如,約0.25 mg/L、約0.3 mg/L、約0.4 mg/L、約0.5 mg/L、約0.6 mg/L、約0.7 mg/L、約0.8 mg/L、約0.9 mg/L、約1.0 mg/L、約1.5 mg/L、約2.0 mg/L、約2.5 mg/L、約3 mg/L、約4 mg/L、約5 mg/L、約6 mg/L、約7 mg/L、約8 mg/L、約9 mg/L、約10 mg/L、約15 mg/L、約20 mg/L、約25 mg/L、約30 mg/L、約40 mg/L、約50 mg/L、約60 mg/L、約70 mg/L、約80 mg/L、約90 mg/L或約100 mg/L。 在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中除TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素的濃度能有效使苗伸長。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中除TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素的濃度是從約0.01 mg/L至約100 mg/L,例如,從約0.25 mg/L至約5 mg/L。因此,所述苗伸長/維持培養基中除TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素的濃度可以是,例如,約0.01 mg/L、約0.02 mg/L、約0.03 mg/L、約0.04 mg/L、約0.05 mg/L、約0.06 mg/L、約0.07 mg/L、約0.08 mg/L、約0.09 mg/L、約0.10 mg/L、約0.15 mg/L、約0.20 mg/L、約0.25 mg/L、約0.3 mg/L、約0.35 mg/L、約0.4 mg/L、約0.45 mg/L、約0.5 mg/L、約0.6 mg/L、約0.7 mg/L、約0.8 mg/L、約0.9 mg/L、約1.0 mg/L、約1.5 mg/L、約2.0 mg/L、約2.5 mg/L、約3 mg/L、約4 mg/L、約5 mg/L、約6 mg/L、約7 mg/L、約8 mg/L、約9 mg/L、約10 mg/L、約15 mg/L、約20 mg/L、約25 mg/L、約30 mg/L、約40 mg/L、約50 mg/L、約60 mg/L、約70 mg/L、約80 mg/L、約90 mg/L或約100 mg/L。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基及/或所述苗伸長/維持培養基進一步包含一種或多種生長素。在一些具體例中,所述生長素選自由β-萘氧乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、毒莠定及其各自的類似物。例如,所述生長素是NAA或其類似物。 在一些具體例中,步驟(a)及/或步驟(c)所述芽誘導培養基是液體培養基。在一些具體例中,步驟(a)及/或步驟(c)所述芽誘導培養基是固體培養基。在一些具體例中,步驟(b)及/或步驟(d)所述苗伸長/維持培養基是液體培養基。在一些具體例中,步驟(b)及/或步驟(d)所述苗伸長/維持培養基是固體培養基。 在一些具體例中,本發明的方法可牽涉特定迴圈中一個步驟使用液體培養基而下一個步驟使用固體培養基。例如,本發明涵蓋之方法,其中步驟(a)使用液體培養基完成而步驟(b)使用固體培養基完成。或者,如果步驟(a)及(b)及/或步驟(c)及(d)兩者都使用液體培養基完成,那麼本發明考慮的是可以改變該液體培養基而不將芽及/或苗移到另外的容器中(如試管、生物反應器、罐等)。例如,如果步驟(a)和(b)兩者都使用水耕(hydroponic)裝置的液體培養基完成,那麼在替換液體培養基時,該芽及/或苗可維持在其固定或非固定的位置上。 在一些具體例中,步驟(a)及/或步驟(c)的培養持續足以產生多於一個苗芽的期間。例如,該期間係經設置以使置於步驟(a)或(c)的芽誘導培養基之各竹組織培養物、培植體或種子產生至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少30個,或更多個苗芽。在一些具體例中,步驟(a)及/或步驟(c)的培養持續從約1小時至約3週或更長。例如,步驟(a)及/或步驟(c)的培養持續從約24小時至約60小時。因此,步驟(a)及/或步驟(c)的培養可持續約24小時、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約35小時、約40小時、約45小時、約50小時、約55小時、約56小時、約57小時、約58小時、約59小時或約60小時。在一些具體例中,步驟(a)或步驟(c)的培養階段可持續長於60小時,如約1週、約2週、約3週、約4週或更長。 在一些具體例中,步驟(b)及/或步驟(d)的培養持續任何期望的期間。在一些具體例中,步驟(b)及/或步驟(d)的培養持續從約24小時到約4週或更長。例如,步驟(b)及/或步驟(d)的培養持續從約3天到約5天或更長。因此,步驟(b)及/或步驟(d)的培養可持續約24小時、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約35小時、約40小時、約45小時、約48小時、約50小時、約55小時、約56小時、約57小時、約58小時、約59小時、約60小時、約72小時、約96小時或約120小時。在一些具體例中,步驟(b)及/或(d)的培養可持續長於120小時,如約1週、約2週、約3週、約4週或更長。 在一些具體例中,步驟(e)被重複至少一次、兩次、三次或更多次。 在一些具體例中,步驟(a)到(e)需要約1週、2週、3週、4週、5週、6週或更長。 在一些具體例中,所述植物是雙子葉植物的物種。在一些具體例中,所述植物是單子葉植物的物種。在一些具體例中,所述植物是竹物種。在一些具體例中,所述竹是毛竹(Phyllostachys edulisi‘Moso’)、蓉城竹(Phyllostachys bissetti)、缺苞箭竹(Fargesia denudata)、菲白竹(Pleioblastus fortunei)、維氏熊竹(Sasa Veitchii)、菲黃竹(Pleioblastus viridistriatus)、筱竹(Thamnocalamus crassinodus)、丘斯誇竹(Chusquea Culeo“Cana Prieta”)、白綠竹(Bambusa Old Hamii)、楠竹(Phyllostachys Moso)、烏芽竹(Phyllostachys Atrovaginata)、馬來甜龍竹(Dendrocalamus Asper)、瓜多竹(Guadua Angustifolia)、紫竹(Phylostachys Nigra)、青川箭竹(Fargesia rufa)、華西箭竹(Fargesia nitida)、伯齡達竹(Borinda Boliana)、神農箭竹(Fargesia murielae)、菲白竹(Pleioblastus fortune)、拐棍竹(Fargesia robusta)和白綠竹(Bambusa OldHamii)。 在一些具體例中,所述植物為非竹之物種。在一些具體例中,所述非竹植物之物種是老鸛草屬(Geranium spp.,如天竺葵(Geranium rozanne))、知風草(Hakonechloa macra,如金知風草(Hakonechloa macra Aureola)、金葉知風草(Hakonechloa macra All gold)、聖誕玫瑰屬(Helleborus,如聖誕玫瑰(Helleborus Ivory Prince))、紐西蘭麻(Phormium)、山葵(Wasabi,如Wasabi C2)、青籬竹屬(Arundinaria,如大青籬竹(Arundinaria gigantean))、或茄屬(Solanum,如馬鈴薯及Solanum tuberosum)。 在一些具體例中,從維持在生長培養基上作為原種(stock)的苗團獲得所述組織培養物。在一些具體例中,所述培植體是竹莖(cane)的節(segment)。在一些具體例中,所述竹莖的節包含節間(internode)。在一些具體例中,所述竹莖的節包含節段(nodal section)。在一些具體例中,所述節段包含單一個芽。在一些具體例中,所述芽是休眠或有活性的。在一些具體例中,所述培植體係取自約1週齡、約2週齡、約3週齡、約1月齡、約2月齡、約3月齡、約半年齡、約1年齡、約2年齡植物、約3年齡、約5年齡或更老的植物。在一些具體例中,使用竹的種子或其一部分。 在一些具體例中,在步驟(b)及/或步驟(d)培養該苗芽之前,將步驟(a)及/或步驟(c)獲得的苗芽分離。在一些具體例中,在步驟(b)及/或步驟(d)培養該苗芽之前,所述分離每次分離產生1到3個苗芽之群。 本發明還提供了用於植物繁殖之選擇性培養基及選擇性方法。在一些具體例中,所述選擇性培養基選自如本文描述的階段1培養基、階段2培養基、階段3培養基、階段4培養基、階段5培養基、階段6培養基、階段7培養基等。 在一些具體例中,使用至少一階段1培養基和至少一階段2培養基。 在一些具體例中,在植物繁殖中依序使用階段1及階段2培養基。在一些具體例中,所述培植體在階段1培養基上保留約1到約36小時(如使用強化培養基(spiked media)時)。在一些具體例中,所述培植體在階段1培養基上保留10-120天(如使用標準或減料培養基時)。在一些具體例中,所述培植體在被轉移到階段2培養基之前,在階段1培養基上保留至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多輪(如在每一輪中,將培植體從舊的階段1培養基轉移到新鮮的階段1培養基)。在一些具體例中,所述培植體在階段2培養基上保留約1到約36小時(如使用強化培養基時)。在一些具體例中,所述培植體在階段2培養基上保留約10-120天(如使用標準或減料培養基時)。在一些具體例中,所述培植體在階段2培養基上保留至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多輪(如在每一輪中,將培植體從舊的階段2培養基轉移到新鮮的階段2培養基)。 在一些具體例中,在植物繁殖時交替使用所述階段1和階段2培養基。在一些具體例中,所述交替連續進行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個迴圈。在一些具體例中,所述培植體在被轉移到階段2培養基之前,先在階段1培養基上保留至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多輪。在一些具體例中,所述培植體在被轉移回階段1培養基之前,先在階段2培養基上保留至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多輪。在一些具體例中,所述培植體在階段1培養基上約1-36小時(如使用強化培養基時)或更長(如使用標準或減料培養基時),隨後被轉移到階段2培養基。在一些具體例中,所述交替係持續至觀察到多個苗。在一些具體例中,所述交替係根據植物的物種和培養基持續約1週至約24個月。 可選擇地,根據先前的處理,然後將增殖的苗置於階段3培養基上以進一步增殖直到獲得期望數量的苗。所述階段3培養基上的培植體可進一步被轉移到階段4培養基。在一些具體例中,所述培植體在階段3培養基上約1-36小時(如使用強化培養基時),隨後被轉移到階段4培養基。在一些具體例中,所述培植體在階段3培養基上約10-120天或更長(如使用標準或減料培養基時),隨後被轉移到階段4培養基。在一些具體例中,所述培植體在階段4培養基上保留約10-120天。 或者,從階段2培養基所獲得的增殖苗可以在至少一種階段3培養基和至少一種階段4培養基之間交替。在一些具體例中,所述交替連續進行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個迴圈。在一些具體例中,所述交替係持續至期望數量的苗。在一些具體例中,藉由分離到新管且進一步擴張(expansion)以獲得期望數量的苗。在一些具體例中,每個增殖週期可獲得每管約1到10個苗。 在一些具體例中,所述培植體被置於交替的階段1培養基、階段2培養基和階段3培養基上,直到獲得期望數量的苗。在一些具體例中,增殖的苗隨後被置於階段4培養基上。 在一些具體例中,所述培植體被置於交替的階段1培養基和階段2培養基上,直到獲得期望數量的苗。在一些具體例中,增殖的苗隨後被置於交替的階段3培養基和階段4培養基上。 在一些具體例中,所述培植體被置於階段1培養基上約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10,或更多輪,且隨後被轉移到階段2培養基上約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10,或更多輪,直到獲得期望數量的苗。在一些具體例中,增殖的苗隨後被置於交替的階段3培養基和階段4培養基上。 在一些具體例中,所述培植體首先被置於階段1培養基上。在一些具體例中,所述培植體在階段1培養基上約1-36小時(如使用強化培養基時)。在一些具體例中,所述培植體在階段1培養基上約10-120天或更長(如使用標準或減料培養基時)。在一些具體例中,該步驟包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多輪新鮮的階段1培養基。然後將培植體保留在交替的階段2培養基和階段3培養基上,直到獲得期望數量的苗。在一些具體例中,增殖的苗被置於階段4培養基上。在一些具體例中,增殖的苗保留在階段4培養基上約10-120天。 仍然可選擇地,從階段4培養基獲得的增殖苗可以被轉移到如在本文中描述的階段5培養基上。在一些具體例中,所述苗被置於階段5培養基上約1-24小時或更長(如使用強化培養基時)。在一些具體例中,所述苗被置於階段5培養基上約10到120天(如使用標準或減料培養基時)。在一些具體例中,所述苗被轉移到小組織培養箱中,如Magenta培養箱。 仍然可選擇地,所述培植體首先被置於階段5培養基上直到獲得期望數量的苗,然後被轉移到如在本文中描述的階段6培養基上。在一些具體例中,所述苗被置於階段6培養基上約1-24小時或更長(如使用強化培養基時)。在一些具體例中,所述苗被置於階段6培養基上約10到120天(如使用標準或減料培養基時)。 在一些具體例中,從階段4培養基獲得的培植體被置於交替的階段5培養基和階段6培養基上,直到獲得期望數量的苗。 仍然可選擇地,保留在階段6培養基上的培植體被轉移到如本文描述的階段7培養基上。在一些具體例中,所述苗被置於階段7培養基上約1-24小時或更長(如使用強化培養基時)。在一些具體例中,所述苗被置於階段7培養基上約10到120天(如使用標準或減料培養基時)。 仍然可選擇地,從階段4培養基獲得的增殖苗可以被轉移到所述交替的階段4培養基、階段5培養基和階段6培養基上。 仍然可選擇地,如需要的話,從階段7培養基獲得的增殖苗可以被轉移到一個或多個其他額外的培養基上(如階段8、階段9等)以用於進一步的繁殖。 在一些具體例中,可選擇的培養基包含間拓樸林或其類似物。在一些具體例中,可選擇的培養基包含至少兩種其他細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基支持預定期間的增殖週期。在一些具體例中,所述培養基支持至少6個月的增殖週期。 在一些具體例中,可選擇的培養基包含至少3種細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基支持預定的期間的增殖週期。在一些具體例中,所述培養基支持至少6個月的增殖週期。 在一些具體例中,可選擇的培養基包含至少一種生長素和至少兩種細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基支持預定的期間的增殖週期。在一些具體例中,所述培養基支持至少6個月的增殖週期。 在一些具體例中,可選擇的培養基包含至少兩種生長素和至少兩種細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基支持預定的期間的增殖週期。在一些具體例中,所述培養基支持至少6個月的增殖週期。 在一些具體例中,可選擇的培養基包含至少兩種生長素和至少三種細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基支持預定的期間的增殖週期。在一些具體例中,所述培養基支持至少6個月的增殖週期。 本案還提供了用於植物微體繁殖的系統。在一些具體例中,所述系統包含生長器皿(growth vessel)、兩個或更多個培養基容器(container)以及用於驅動流體進及/或出生長器皿的能量來源。在一些具體例中,所述系統進一步包含控制器。在一些具體例中,系統進一步包含光源及/或提供CO2、O2、N2或其混合物至生長器皿的氣體源。 在一些具體例中,所述系統包含:用於在無菌或基本上無菌的環境中培養植物組織的生長器皿;具有第一流體口(fluid port)和第二流體口的第一培養基容器,所述第一流體口與生長器皿是流體可連接的;具有第一流體口和第二流體口的第二培養基容器,所述第一流體口與生長器皿是流體可連接的;和氣體源,其與第一培養基容器的第二流體口和第二培養基容器的第二流體口是流體可連接的。 在一些具體例中,所述系統進一步包含控制器,其係可以第一操作模式和第二操作模式操作,該第一操作模式係將加壓氣體從氣體源輸送到第一培養基容器以將其中含有的第一體積的液體置換到生長器皿,以及該第二操作模式係將加壓氣體從氣體源輸送到第二培養基容器以將其中所含第二體積的液體置換到生長器皿。 在一些具體例中,所述控制器在第三操作模式下是可操作的,該模式中允許生長器皿中所含液體從生長器皿流至第一培養基容器和第二培養基容器中的至少一個。 在一些具體例中,所述控制器在第一培養次序下是可操作的,其中在第一操作模式之後接著執行第三操作模式。 在一些具體例中,所述控制器在第二培養次序下是可操作的,其中在第二操作模式之後接著執行第三操作模式。 在一些具體例中,所述控制器在植物繁殖模式下是進一步可操作的,其中執行第一培養次序和第二培養次序。 在一些具體例中,將所述生長器皿升高到第一和第二培養基容器之上,以允許在第三操作模式中液體從生長器皿流入第一培養基容器和第二培養基容器中的至少一個。 在一些具體例中,所述系統進一步包含與生長器皿、第一培養基容器和第二培養基容器流體可連接的支管,在一些具體例中,所述支管是可操作的,以控制生長器皿和第一培養基容器之間以及生長器皿和第二培養基液體之間的液體流動。 在一些具體例中,所述生長器皿包括液體導管(conduit),該液體導管係經配置以將液體從生長器皿虹吸(siphon)到第一培養基容器和第二培養基容器的至少一個。 在一些具體例中,所述生長器皿是間歇浸沒式生物反應器(ebb and flow bioreactor)。 在一些具體例中,所述控制器是可操作的,以控制生長器皿和第一培養基容器之間、生長器皿和第二培養基容器、氣體源和第一培養基容器和氣體源和第二培養基容器之間的流體連通。 在一些具體例中,所述第一培養基容器包含如在本文中描述的芽誘導培養基,且所述第二培養基容器包含苗伸長/維持培養基。在一些具體例中,所述芽誘導培養基包含有效量的噻苯隆(TDZ)或其類似物,且所述苗伸長/維持培養基包含有效量的一種或多種除TDZ或其類似物之外的細胞分裂素。 本應用還提供了用於交換生物反應器/植物生長系統中的液體培養基的方法,以用於植物或植物組織的微體繁殖。 在一些具體例中,所述生物反應器包含用於培養植物組織的生長器皿、與生長器皿流體可連接的第一培養基容器、與生長器皿流體可連接的第二培養基容器、和與第一培養基容器和第二培養基容器流體可連接的氣體源。 在一些具體例中,所述方法包括:建立第一培養基容器和生長器皿之間的流體連通;生長器皿流體分離第二培養基容器;立氣體源和第一培養基容器之間的流體連通;壓縮氣體輸送到第一培養基容器以將第一體積的液體從第一培養基容器置換到生長器皿;許至少一部分第一體積的液體從生長器皿流回到第一培養基容器中;立第二培養基容器和生長器皿之間的流體連通;生長器皿流體分離第一培養基容器;立氣體源和第二培養基容器之間的流體連通;壓縮氣體輸送到第二培養基容器以將第二體積的液體從第一培養基容器置換到生長器皿;並許至少一部分第二體積的液體從生長器皿流回到第二培養基容器中。 在一些具體例中,將所述壓縮氣體以約1分鐘輸送到第一培養基容器。 在一些具體例中,將所述壓縮氣體以約1分鐘輸送到第二培養基容器。 在一些具體例中,允許液體以約8分鐘從生長器皿流回到第一培養基容器。 在一些具體例中,允許液體以約8分鐘從生長器皿流回到第二培養基容器。 在一些具體例中,將所述系統用於包含芽誘導培養基與苗伸長及維持培養基的植物繁殖。例如,將所述系統用於其中涉及芽誘導培養基與苗伸長及維持培養基交替的植物繁殖。 在一些具體例中,將所述系統用於包含如在本文中描述可選擇培養基的植物繁殖。例如,將所述系統用於植物繁殖,其中(1)涉及階段1培養基和階段2培養基的交替;(2)涉及階段2培養基和階段3培養基的交替;(3)涉及階段1培養基、階段2培養基和階段3培養基的交替;(4)涉及階段3培養基和階段4培養基的交替;(5)涉及階段4培養基和階段5培養基的交替;(6)涉及階段5培養基和階段6培養基的交替;(7)涉及階段4培養基、階段5培養基和階段6培養基的交替;及/或(7)涉及階段6培養基和階段7培養基的交替。 還提供用於將組織培養小植株(plantlet)的微環境間歇地暴露於如在本文中描述的液體營養溶液的裝置和方法。在一些具體例中,設備包括框架(frame)、架組件(shelf assembly)和驅動組件(drive assembly)。在此具體例中,驅動組件可經配置以接合架組件,以促進架組件相對於框架的擺動運動,從而使組織培養小植株間歇地暴露於所述液體營養溶液。在一些具體例中,本文描述一般係涉及架(rack),且更具體地係涉及用於植物繁殖器皿的擺動架。 已可獲得栽培和工業用途的更快生長的植物,包括竹亞科植物。所述竹亞科(屬於禾本科)包含木本和草本竹兩者,目前大致辨識出120種溫帶和熱帶的木本竹屬。竹是具有許多不同應用的多用途植物,據估計世界範圍內約22億人在一定程度上使用竹,且於1985年全球可歸因於竹的收入估計約為45億美元,竹的市場也在擴大。竹筍是亞洲烹飪的原料,且竹存在於許多產品中,包括牙籤、掃帚、用於葡萄栽培(viticulture)和樹木栽培(arboriculture)的杆(pole)、景觀材料、鑲花地板、層壓材料、傢俱、手工藝品和其他家庭用品。此外,竹正成為紡織材料的重要來源和紙張生產的成分和結構木料(structural timber)的來源。 植物物種,諸如竹,係被認為是環境友好的「綠色」產品,其具有非常快的生長速度。儘管生長速度快,這些植物的其他特性使它們很難在工業規模上快速繁殖。例如,許多商業上重要的竹僅以間隔長達60-130年的時間開花。使該長開花週期的困難性增加的是許多竹顯示大規模(或集體性)開花,即種群中的所有植物同時開花。例如,桂竹(Phyllostachys bambusoides)以間隔130年的時間開花,且在該物種中,同系(same stock)的所有植物在同一時間開花,而與地理位置或天氣條件的差異無關,在開花之後竹死亡。竹的漫長開花間隔和大規模開花的傾向使要獲得用於繁殖的種子非常困難。使該問題更複雜的是,即使能夠獲得竹的種子,卻無法保持存活超過3-6個月。 由於這些使用傳統有性生殖繁殖竹及其他快速生長植物物種的困難,經常使用無性技術,如分株(clump division)和扦插(cutting)繁殖這些植物。然而,這些無性繁殖技術,因為它們產生大規模生產的能力和它們的實踐效率都很低,不足以達到預計的世界性需求。此外,許多無性繁殖方法的缺點是不能消除親本植物中存在的病原體。因此,實現植物大規模生產的組成物、方法和系統是高度期望的。微體繁殖(也稱為組織培養,此等術語在本文中可交互使用)是一種可被用於實現該目的優秀的潛在方法。 微體繁殖與從扦插生長植物並非沒有相似之處。然而,與從扦插生長的植物不同的是,微體繁殖植物在體外無菌培養基中生長。典型地,該生長培養基包含固體或半固體材料如瓊脂,還添加了各種化合物如營養物、無機鹽、生長調節物、糖、維生素和其他化合物。 組織培養植物的優勢在於植物可以在無菌環境中生長以使他們更可能保持無疾病。其他優勢包括在小空間內生長非常大量植物的能力、微體繁殖植物的水和營養需求降低、和可繼而用於產生更多組織培養材料的組織快速增殖。此外,微體繁殖非常靈活且快速擴大規模是可能的(1年中可從單一基因型生產接近1百萬個植物)。如此短時間範圍和如此大量係非任何習知方法所能匹敵的。組織培養還提供了易於運輸和輸送的高品質植物的生產。 已經發表了一些關於植物的組織培養的論文。然而,在實施上(即,竹的大規模繁殖),這些論文中描述的組成物、方法和系統並不能轉化為商業可行的繁殖系統。 植物物種的組織培養中遇到的困難包括內源或表面污染和褐變(browning)的高發生率、與休眠或生長惰性(topophysis)和玻璃質化(hyperhydricity)相關的因素。本案揭示內容係提供了克服這些困難、允許植物以商業規模無性生產的組成物、方法和系統。 液體培養基的微體繁殖提高了營養的攝取且促進生長。然而,液體培養基中體外培養的優勢經常被技術問題抵消,諸如窒息(asphyxia)、玻璃質化、剪切力(shear forces)和複雜裝備的需求。 國際專利申請公開號WO/2011/100762以引用方式全部併入本文,其描述對竹體外繁殖有用的組成物和方法。 本案係揭示用於植物快速體外繁殖的新穎組成物、方法和系統。本發明提供可在更短時間內顯著提高植物組織培養增殖率的組成物和方法。在一些具體例中,在固體或液體誘導培養基中以很短時間段利用強細胞分裂素如噻苯隆,以在植物物種的培植體中誘導多個苗芽的形成。利用含有強細胞分裂素如噻苯隆的培養基的芽誘導處理後,接著苗伸長和維持處理係藉由使用相對弱的細胞分裂素如BAP、間拓樸林、2ip、玉米素和或玉米素核苷,以完成該培養物的苗伸長和維持。當依序地交替這個過程,在3週的培養週期內達成2X和28X間的培養增殖率。 (定義) 本發明提供了用於植物繁殖的組成物、方法和系統。在一些具體例中,所述組成物包含至少一種植物激素。如本文說明及申請專利範圍中所使用的動詞「包含」,連同其詞形變化,是以其非限制性含義使用,意指包括在該詞之後的物件,但未排除沒有特別提出的物件。 在一些具體例中,所述組成物、方法和系統對植物體外繁殖是有用的。如本文使用的術語「植物」指任何屬於植物界的活生物(即,任何植物界中的屬/種)。這包括熟悉的生物,例如但不限於樹木、草本植物、灌木、草、藤、蕨類、苔蘚和綠藻。該等術語係指單子葉植物(也稱為monocots)和雙子葉植物(也稱為dicots)。特定的植物實例包括但不限於竹、玉米、馬鈴薯、薔薇、蘋果樹、向日葵、小麥、稻、香蕉、番茄、匏瓜(opo)、南瓜、櫛瓜(squash)、萵苣、高麗菜(cabbage)、橡樹、觀賞鳳梨(guzmania)、天竺葵、木槿(hibiscus)、鐵線蓮(clematis)、聖誕紅(poinsettias)、甘蔗、芋頭、浮萍(duck weed)、松樹、草地早熟禾(Kentucky blue grass)、結縷草(zoysia)、椰樹、十字花科葉菜(brassica leafy vegetables,如青花菜(broccoli)、蕪菁(broccoli raab)、球芽甘藍(Brussels sprouts)、高麗菜、大白菜(Chinese cabbage,Bok Choy和Napa)、花椰菜(cauliflower)、義大利甘藍(cavalo)、散葉甘藍(collards)、羽衣甘藍(kale)、球莖甘藍(kohlrabi)、芥菜(mustard greens)、油菜(rape greens)、和其他十字花科葉菜作物)、球莖蔬菜(如大蒜、韭、洋蔥(乾球洋蔥(dry bulb)、綠洋蔥(green)和青蔥(Welch))、珠蔥和其他球莖蔬菜作物)、柑橘類水果(如葡萄柚、檸檬、萊姆、橙、柑橘、雜交柑橘、柚和其他柑橘類水果作物)、葫蘆科蔬菜(如黃瓜、醃菜西瓜(citron melon)、可食葫蘆、醃漬用小黃瓜(gherkin)、甜瓜(muskmelons,包括甜瓜屬的雜交種及/或栽培種)、西瓜、洋香瓜(cantaloupe)和其他葫蘆科蔬菜作物)、果實蔬菜(包括茄子、酸漿(ground cherry)、茄瓜(pepino)、胡椒、番茄、黏果酸漿(tomatillo)和其他果實蔬菜作物)、葡萄、葉菜(如長葉萵苣(romaine))、根/塊莖和球莖蔬菜(如馬鈴薯)和樹生堅果(杏仁、山胡桃、開心果和胡桃)、漿果(如番茄、小檗、醋栗、接骨木果、鵝莓、忍冬、盾葉鬼臼(mayapples)、莢迷果(nannyberries)、俄勒岡葡萄、沙棘、樸樹果、熊果、越橘、草莓、海葡萄、黑莓、雲莓、羅甘莓、懸鉤子、美莓(salmonberries)、果實樹莓(thimbleberries)和裹白樹莓(wineberries))、穀類作物(如玉米、稻、小麥、大麥、高粱、黍(millets)、燕麥(oats)、黑麥(ryes)、黑小麥(triticales)、蕎麥(buckwheats)、福尼奧米(fonio)和藜麥(quinoa))、梨果(pome fruit)(如蘋果、梨)、核果(stone fruits)(如咖啡、棗、芒果、橄欖、椰子、油椰子、開心果、杏仁、杏、櫻桃、西洋李、油桃、桃和李)、藤(如鮮食葡萄、釀酒葡萄)、纖維作物(如大麻、棉花)、觀賞植物(ornamentals)等。例如,所述植物為Camelineae族的一個物種,例如C.alyssum、C.anomala、C.grandiflora、C.hispida、C.laxa、C.microcarpa、C.microphylla、C.persistens、C.rumelica、C.sativa、C.Stiefelhagenii或其任何雜交種。 在一些具體例中,所述組成物、方法和系統對於作物植物的體外繁殖是有用的。本文使用的術語「作物植物」指任何生長用於任何商業目的的植物,其包括但不限於下列目的:種子生產、乾草生產、裝飾用途、果實生產、漿果生產、蔬菜生產、油生產、蛋白質生產、草料生產、動物牧草、高爾夫球場、草坪、花卉生產、景觀、侵蝕防治(erosion control)、綠色肥料、提高土壤耕作性(tilth)/健康、生產醫藥產品/藥品、生產食品或食品添加劑、吸煙產品、紙漿生產和木材生產。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統生產的植物所衍生的植物部分。本文使用的術語「植物部分」指植物的任何部分,其包括但不限於苗、根、莖、種子、托葉(stipules)、葉、花瓣、花、胚珠、苞片(bracts)、枝、葉柄、節間、樹皮、被短柔毛(pubescence)、分蘖(tillers)、根莖(rhizomes)、葉狀體(fronds)、葉片、花粉、雄蕊等等。在某種培養基如土壤中生長的植物的兩個主要部分,經常被稱為「地上」部分,也經常被稱為「苗」,以及「地下」部分,也經常被稱為「根」。本文使用的用語「衍生於」係指起源或來源,且可包括天然產生的、重組的、未純化的或純化的分子。衍生於某一起源或來源的核酸或胺基酸可具有如本文其他處定義的所有種類的核苷酸改變或蛋白質修飾。本文使用的用語「一種」或「一個」係指該實體的一或多者,例如「一種基因」係指一或多種基因,或至少一種基因。同樣地,用語「一種」(或「一個」)、「一或多種」和「至少一種」在本文中可互換使用。此外,由不定冠詞「一種」或「一個」所提及之「元件」未排除存在有多於一種該元件的可能性,除非上下文清楚地要求有且僅有一種該元件。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物所衍生的植物組織。本文使用的術語「植物組織」指植物的任何部分。植物器官的實例包括但不限於葉、莖、根、塊莖、種子、枝、被短柔毛、根瘤(nodule)、葉腋、花、花粉、雄蕊、雌蕊、花瓣、花序梗(peduncle)、柄(stalk)、柱頭、花柱、苞片、果實、幹(trunk)、心皮(carpel)、萼片、花藥、胚珠、花梗(pedicel)、針葉(needle)、毬果(cone)、根莖、匍匐枝(stolon)、苗、果皮(pericarp)、胚乳(endosperm)、胎座(placenta)、漿果(berry)、雄蕊和葉鞘。 在一些具體例中,所述組成物、方法和系統對於單子葉植物的繁殖是有用的。本文使用的術語「單子葉植物的」或「單子葉植物」係指有花植物的任何亞綱(單子葉植物綱(Monocotyledoneae)),其具有僅含有單種葉的胚且通常具有平行脈葉,花的部分為3的倍數,且在莖和根處沒有次生生長。實例包括百合;蘭;稻;玉米,草,諸如高羊茅(tall fescue)、山羊麥(goat grass)和草地早熟禾(Kentucky bluegrass);穀物,諸如小麥、燕麥和大麥;鳶尾;洋蔥和棕櫚。 在一些具體例中,所述組成物、方法和系統對於竹植物的體外繁殖是有用的。本文使用的術語「竹」係指竹亞科的植物。在國際專利申請公開號WO2011100762(以引用方式全部併入本文)中描述了代表性竹之屬。 在一些具體例中,本發明提供了包含本文所描述的組成物、方法和系統生產的植物種源(germplasm)的植物。本文使用的術語「種源」指具有其特定的分子和化學構成的遺傳物質,該遺傳物質包含了生物的遺傳素質的物質基礎。 在一些具體例中,本發明提供了從本文所描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的後代。本文使用的術語「後代」指從一種或多種親本植物或其後代的無性或有性生殖作為後代產生的任何植物。例如,可藉由親本植物的選殖或自交(selfing)或兩種親本植物的雜交產生後代植物,且包括自交後代(selfings)以及F1或F2或之後的世代。F1是從親本產生的第一代後代,親本中至少一個是第一次作為某一性狀的供體使用,而第二代(F2)或後續世代(F3、F4等)的後代是從F1、F2等的自交產生的樣品。因此F1可以是(且通常是)從兩個繁殖純種(true breeding)的親本之間雜交產生的雜種(繁殖純種對於某一性狀為同型接合的),而F2可以是(且通常是)從所述F1雜交體的自花授粉產生的後代。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的雜交,和製造和使用這類雜交的方法。本文使用的術語「雜交(cross)」、「雜交(crossing)」、「異花授粉」或「雜交育種」指一種藉由植物上一朵花的花粉被施加(人工地或自然地)至另一植物上的花的胚珠(柱頭)上之過程。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的栽培種(cultivars)。本文使用的術語「栽培種」係指已由園藝學(horticultural)或農藝學(agronomic)技術產生的植物的變種(variety)、品系(strain)或品種(race),並且正常情況下不存在於野生種群中。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的變種。本文使用的術語「變種」係指物種的細分,由一組該物種中的個體組成,這組個體在形態或功能上與其他類似的一群個體是截然不同的。 本文使用的術語「變種」或「栽培種」係指一組類似的植物,其藉由結構特徵和性能可以將該組植物與同一物種中的其他變種識別出來。本文使用的術語「變種」與於1961年12月2日生效、於1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日內瓦修訂的保護植物新品種國際公約(International Convention for the Protection of New Varieties of Plants)(UPOV條約)中相應的定義具有等同的含義。因此,「變種」指最低的已知層級的單個植物學分類(botanical taxon)中的植物族群(plant grouping),該族群,不考慮育種者權利的授予條件是否完全達到,可以i)由特定的基因型或基因型組合產生特徵的表現來定義,ii)由至少一種所述特徵的表現與任何其他植物族群區別,和iii)就其進行不變繁殖的適應性而被認為是一個單元。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的基因型。本文使用的術語「基因型」指個體細胞、細胞培養物、組織、生物(如植物)或生物群體的遺傳構成。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的選殖株。本文使用的術語「選殖株」指從單個前體遺傳或衍生的,且遺傳上與該前體等同或基本上等同的細胞、細胞群體、部分、組織、生物(如植物)或生物群體。在一些具體例中,所述選殖株產生於包括至少一個無性步驟的過程。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的雜種。本文使用的術語「雜種」指在一個或多個基因上不同的親體之間的雜交產生的任何個體細胞、組織或植物。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的近交系(inbreds)。本文使用的術語「近交系」或「近交品系」指相對的純種品系。 在一些具體例中,本發明提供了從本文描述的組成物、方法和系統產生的植物衍生的種群。本文使用的術語「種群」係指具有共同的遺傳衍生過程(genetic derivation)的遺傳上同質或異質的植物集合。 在一些具體例中,本發明提供了用於植物物種生物培養(bioculture)的生物反應器。本文使用的術語「生物反應器」指任何能保存、支持和/或生長可存活組織的器皿、裝置或系統。換言之,本文使用的術語「生物反應器」可指保存可存活的植物組織的生長器皿,保存、支持和/或生長可存活組織需要的或說明保存、支持和/或生長可存活組織的生長器皿內部或外部的各種其他元件,和其任何子系統。 在一些具體例中,本發明提供了用於植物物種生物培養的間歇浸沒式生物反應器。本文使用的術語「間歇浸沒式生物反應器」指設計為分別由營養培養基迴圈的流入和流出到生物反應器滋養可存活組織的任何生物反應器。經常在水培中使用間歇浸沒式生物反應器。本文使用的「植物繁殖系統」是用於生長可存活的植物組織的生物反應器。 (組成物) 微體繁殖是使用現代的植物組織培養方法,以實施快速增殖原種植物材料而產生大量後代植物。微體繁殖係用於增殖新的植物,如那些藉由習知植物育種方法已經被遺傳修飾的或育種的。其還被用於為從不產生種子或對無性生殖反應不佳的原種植物進行的種植提供足量的小植株。 微體繁殖可首先從要繁殖的植物材料的選擇開始。清潔的沒有病毒和真菌的原種材料在最健康的植物的生產中是重要的。一旦選擇了用於培養的植物材料,即開始培植體的收集且根據將要使用的組織類型,所述組織類型包括莖尖(stem tips)、花藥、花瓣、花粉和其他植物組織。然後將該培植體材料表面滅菌,通常以多個過程的漂白和酒精洗滌且最後在無菌水中漂洗。將這小部分植物組織,有時僅為單個細胞,置於通常含有蔗糖作為能量來源和一種或多種植物生長調節劑(植物激素)的生長培養基上。通常將該培養基用瓊脂稠化(thicken)以製造在生長中支撐該培植體的凝膠。一些植物在簡單的培養基上容易地生長,而其他植物需要更複雜的培養基以成功生長;植物組織依賴培養基生長並分化為新的組織。例如,含有細胞分裂素的培養基被用於從植物芽製造分枝的苗。 增殖係為取出第一階段中產生的組織樣本並增加它們的數量。在成功的引入和生長植物組織之後,於建立階段(establishment stage)後接著增殖。藉由該過程的重複迴圈,可以將單個培植體樣本從一個增加到數百或上千的植物。根據生長的組織的類型,增殖可牽涉不同的方法和培養基。如果生長的植物材料是癒合組織(callus tissue),可將其置於攪拌器中且切成更小的塊並在同一類型的培養基上重培養以生長更多的癒合組織。如果所述組織作為稱作小植株的小植物生長,則經常添加激素以使小植株產生許多可以被移除和重培養的分株(offshoots)。 下一階段(「移植前(pretransplant)階段」)係牽涉處理產生的小植株/苗以促進根生長和「硬化(hardening)」,其係在體外或在無菌或基本無菌的環境中施行。「硬化」指用於自然生長環境的植物的準備。在本階段之前,小植株係設計為促進快速生長的「理想」條件下生長。由於缺乏必要性,植物很可能對疾病是高度易感的且經常不具有完全功能的表皮覆蓋,而且在它們對水和能源的使用中效率會比較低。體外條件下的濕度高且在這些條件下生長的植物並不形成阻止植物脫水的有效角質層(cuticle)和氣孔(stomata),在從培養中取出時,小植株需要時間來調節適應更自然的環境條件。硬化通常牽涉將小植株從高濕度、低光照、溫暖的環境緩慢脫離到可以看做是所述物種的自然生長環境的環境。 在植物微體繁殖的最終階段,將小植株從植物培養基中移出並轉移到土壤或(更普遍地)盆栽肥料中以用習知方法繼續生長。該階段經常和「移植前」階段組合。 現代植物組織培養在過濾空氣的無菌條件下施行。來自該環境的活的植物材料在其表面(且有時在內部)被微生物自然污染,因此起始材料(培植體)在化學溶液(通常是酒精或漂白劑)中的表面滅菌是必需的。然後通常將培植體置於固體培養基的表面,但有時直接置於液體培養基中,特別是期望細胞懸浮培養的時候。固體和液體培養基一般由無機鹽和一些有機營養物、維生素和植物激素組成。固體培養基由液體培養基添加通常為純化瓊脂的膠凝劑(gelling agent)製備而來。 培養基的組成,特別是植物激素和氮源(硝酸鹽對比銨鹽或胺基酸)對於從起始培植體生長的組織的形態具有深遠的影響。例如,植物生長素過量經常將導致根的增生(proliferation),而細胞分裂素的過量可產生苗。植物生長素和細胞分裂素的平衡經常將產生細胞或癒合組織的無序生長,但是長出物(outgrowth)的形態將依賴於植物物種和培養基組成。隨著培養物的生長,通常將塊切下並轉移到新的培養基(繼代培養(subculture))以允許生長或改變培養物的形態。組織培養者的技能和經驗在判斷應培養哪塊和丟棄哪些塊時是重要的。當培養物中顯現出苗時,可以將其切下並用生長素生根以產生小植株,可以在小植株成熟時將其轉移到盆栽土以進一步在溫室中作為正常的植物生長。 從植物獲得的要培養的組織被稱為培植體。基於某些模式系統特別是煙草的工作,經常聲稱可以從植物的任何部分生長出全能的培植體。然而,在實施時已證明該觀念是無效的。在許多物種中,不同器官的培植體在它們的生長和再生的速度上不同,而一些完全不生長。培植體材料的選擇還決定了由組織培養產生的小植株是單倍體或雙倍體的。用不適當的培植體還會增加微生物污染的風險。因此在組織培養之前做出培植體的適當選擇是非常重要的。 不同的器官和培植體在再生潛力上的特定差異具有不同的解釋。顯著的因素包括細胞迴圈中的細胞階段、內源生長調節劑的可獲性或運輸能力和細胞的代謝能力的差異。最普遍使用的組織培植體是植物的分生組織末端,如莖尖、腋芽尖(auxiliary bud tip)和根尖。這些組織具有高的細胞分裂速率且或集中或產生需要的生長調節物質,包括植物生長素和細胞分裂素。一些培植體,如根尖,係難以分離且被土壤微生物相(microflora)污染而在組織培養過程中成問題。某些土壤微生物相可與根系統形成緊密的結合,或甚至在根內生長。與根結合的土壤顆粒難以在對根沒有損傷的情況下移除,而損傷隨後會允許微生物的侵襲。這些結合的微生物相一般會在植物組織顯著生長之前在組織培養基上過度生長。氣生(土壤之上)的培植體也富含不想要的微生物相。然而,它們更容易藉由溫和的漂洗從培植體上移除,且通常可藉由表面滅菌將剩餘物殺死。大多數表面微生物相不與植物組織形成緊密的結合。這樣的結合通常可藉由培植體表面上的花斑(mosaic)、脫色或局部壞死之外觀檢查而發現。 獲得未污染的培植體的一個選擇性方式是從幼苗(seedlings)取得培植體,所述幼苗是從表面滅菌的種子無菌生長的。對於強表面滅菌劑如次氯酸鹽的滲透,種子的硬表面較不可滲透,因此用於種子可接受的滅菌條件較用於無性組織者嚴格得多。 組織培養的植物為選殖株時,如果用以產生第一培植體的原始母系植物對於病原體或環境條件是易感的,整個作物對於同一問題也會是易感的,且相反地任何陽性性狀也會保留在該系內。在植物科學中廣泛使用植物組織培養,其還具有許多商業應用。所述應用包括: 1.在林業和花卉栽培中廣泛使用微體繁殖。微體繁殖還可用於保存稀有的或瀕危的植物物種。 2.植物育種者可使用組織培養來篩選細胞而非植物的有利特徵,如病原體抗性/耐受性。 3.將生物反應器內液體培養中的植物細胞的大規模生長作為次產物的來源,如作為生物藥使用的重組蛋白。 4.藉由原生質體(protoplast)融合和新的雜交體的再生將遠源物種雜交。 5.對遠源物種雜交授粉並隨後將產生的胚組織培養,否則所述胚在正常情況下會死亡(胚胎拯救(Embryo Rescue))。 6.用於從單倍體培養產生加倍的單倍體(雙倍體)植物以在育種程序中更快地獲得同型接合系,其通常係藉由秋水仙素(colchicine)處理導致染色體數目的加倍。 7.作為用於轉化的組織,隨後是遺傳構建體的短期測試或轉基因植物的再生。 8.可使用某些技術如分生組織尖培養以從如馬鈴薯和許多軟果實物種的被感染的原種產生乾淨的植物材料。 9.使用分生組織和苗培養以產生大量等同個體的微體繁殖。 用於植物微體繁殖的培養基和方法至少已描述於M.R.Ahuja,Micropropagation of woody plants,Springer,1993,ISBN 0792318072,9780792318071;Narayanaswamy,Plant cell and tissue culture,Tata McGraw-Hill Education,1994,ISBN 0074602772,9780074602775;Singh和Kumar,Plant Tissue Culture,APH Publishing,2009,ISBN 8131304396,9788131304396;Y.P.S.Bajaj High-tech and micropropagation V,Springer,1997,ISBN 3540616063,9783540616061;Trigiano和Gray,Plant Tissue Culture,Development and Biotechnology,CRC Press,2010,ISBN 1420083260,9781420083262;Gupta和Ibaraki,Plant tissue culture engineering Volume 6 of Focus on biotechnology,Springer,2006,ISBN 1402035942,9781402035944;Jain和Ishii,Micropropagation of woody trees and fruits Volume 75 of Forestry sciences,Springer,2003,ISBN 1402011350,9781402011351;和Aitken-Christie等,Automation and environmental control in plant tissue culture,Springer,1995,ISBN 0792328418,9780792328414,其各以引用方式全部併入本文中。 國際專利申請公告之WO2011100762(其以引用方式全部併入本文)中已描述了用於竹微體繁殖的培養基和方法。 本發明提供了可用於植物如竹植物的體外微體繁殖的培養基。所述培養基可以是液體的、半固體的或固體的,且所述培養基的物理狀態可以藉由摻入一種或多種膠凝劑而變化。可以使用本領域已知的任何適用於植物組織培養基的膠凝劑。瓊脂是最普遍用於該目的,這類瓊脂的實例包括Agar Type A、E或M和BactoTMAgar。其他示例性的膠凝劑包括角叉膠(carrageenan)、吉蘭糖膠(gellan gum)(由市售PhytaGelTM、Gelrite®和GelzanTM獲得)、褐藻酸(alginic acid)和其鹽,和瓊脂糖。也可使用這些試劑的混合物,如兩種或更多種瓊脂、角叉膠、吉蘭糖膠、瓊脂糖和褐藻酸或其鹽。典型地,所述培養基包含瓊脂,且添加了各種化合物如營養物、無機鹽、生長調節劑、碳源、維生素和其他化合物。 在一些具體例中,所述培養基包含一種或多種植物生長需要的最低限度的營養物,如胺基酸、大量元素(macroelements)、微量元素、鋁、硼、氯(氯化物)、鉻、鈷、銅、碘、鐵、鉛、鎂、錳、鉬、氮(硝酸鹽)、鉀、磷(磷酸鹽)、矽、鈉、硫(硫酸鹽)、鈦、釩、鋅、纖維醇(inositol)和未限定的培養基組分如酪蛋白水解物(casein hydrolysates)或酵母萃取物。例如,所述培養基可包括以下的任意組合:NH4NO3、KNO3、Ca(NO3)2、K2SO4、MgSO4、MnSO4、ZnSO4、K2SO5、CuSO4、CaCl2、KI、CoCl2、H3BO3、Na2MoO4、KH2PO4、FeSO4、Na2EDTA、Na2H2PO4、纖維醇(如肌醇)、硫胺(thiamine)、吡哆醇(pyridoxine)、煙酸(nicotinic acid)、甘胺酸、核黃素(riboflavin)、抗壞血酸(ascorbic acid)及矽標準溶液。所述培養基可進一步包含其他的已在例如國際專利申請公告之WO2011100762中描述的組分。本領域的技術人員已知可省去一種或多種上述組分而不影響培養基的功能。 所述培養基可包含一種或多種碳源如糖。非限制的示例性的糖包括蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖和山梨糖醇(sorbitol)或其之組合。 表1顯示了上述組分的示例性濃度。可基於植物的物種、組織的類型和目的等調整這些組分的濃度,而基本上不影響培養基的功能。 所述培養基進一步包含一種或多種有效量的植物生長調節劑。植物生長調節劑的實例包括植物激素,如生長素和具有類生長素活性的化合物、細胞分裂素和具有類細胞分裂素活性的化合物。術語「細胞分裂素」指一類植物生長調節劑,其特徵在於它們刺激組織培養中細胞分裂和苗器官發生(organogenesis)的能力。細胞分裂素的非限制性實例包括:N6-苄胺基嘌呤(BAP)(亦稱N6-苄基腺嘌呤(BA))、間拓樸林、玉米素、激動素、噻苯隆(TDZ)、間拓樸林、2-異戊烯腺嘌呤(亦稱6-γ-γ-(二甲基烯丙基胺基)-嘌呤或2ip)、腺嘌呤半硫酸鹽、二甲基烯丙基腺嘌呤、4-CPPU(N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲),及其類似物。術語「生長素」指一類植物生長調節劑,其主要特徵為其在切離的植物組織中刺激細胞分裂的能力。除了在細胞分裂和細胞伸長上的作用之外,生長素還影響其他發育過程,包括根發生(root initiation)。非限制性的實例是β-萘氧乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、毒莠定及其類似物。更多細胞分裂素和植物生長素係描述於WO2011100762、US5211738、US20100240537、US20060084577、US20030158043、及Aremu等人之(Plant Cell Tiss.Organ.Cult.,DOI 10.1007/s11240-011-0007-7,2011),其藉由引用方式全部併入本文。 在一些具體例中,在所述培養基中可包括其他植物激素,如脫落酸(abscisic acid)、激勃素(gibberellic acid)、其類似物或其之組合。在一些具體例中,可在培養基中添加活性炭以改善細胞生長和發育。 如存在於培養基中,每種細胞分裂素可以以從約0.001 mg/L-約100 mg/L和所有兩者之間的量存在。例如,細胞分裂素的濃度是約0.001、0.01、0.1、1、2、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 mg/L或更多。 在一些具體例中,所述培養基包含間拓樸林及/或其類似物。在一些具體例中,間拓樸林以如下量存在:等於或大於1.5 mg/L、等於或大於2.0 mg/L、等於或大於2.5 mg/L、等於或大於3.0 mg/L、等於或大於3.5 mg/L、等於或大於4.5 mg/L或等於或大於5.0 mg/L。在其他具體例中,間拓樸林以3.2 mg/L或5.36 mg/L的量存在。在另外的具體例中,間拓樸林的量不能低於1.5 mg/L、不能低於2.0 mg/L、不能低於2.5 mg/L、不能低於3.0 mg/L、不能低於3.5 mg/L、不能低於4.5 mg/L或不能低於5.0 mg/L。在一些具體例中,可含括高至200 mg/L的任何量之間拓樸林及/或其類似物。在一些具體例中,將所述培養基用於竹的微體繁殖。在一些具體例中,所述竹植物選自下列組成之物種:青籬竹屬(Arundinaria)、莿竹屬(Bambusa)、北風竹屬(Borinda)、秋竹屬(chusquea)、麻竹屬(Dendrocalamus)、箭竹屬(fargesia)、瓜多竹屬(Guadua)、孟宗竹屬(Phyllostachys)、苦竹屬(Pleioblastus)和筱竹屬(Thamnocalamus)。 在一些具體例中,所述培養基包含噻苯隆及/或其類似物。在一些具體例中,噻苯隆及/或其類似物可如下存在:0.001 mg/L、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.25、1.50、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.5、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 mg/L。在一些具體例中,還可含括高至200 mg/L的任何量之噻苯隆及/或其類似物。 如存在於培養基中的話,每種生長素可從約0.001 mg/L-約100 mg/L及所有兩者之間的量存在。例如,生長素的濃度是約0.001、0.01、0.1、1、2、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或約100 mg/L。 在一些具體例中,所述培養基包含NAA及/或其類似物。在一些具體例中,NAA及/或其類似物可如下存在:0.001 mg/L、0.01、0.0125、0.015、0.0175、0.02、0.0225、0.025、0.0275、0.03、0.0325、0.035、0.0375、0.04、0.0425、0.045、0.0475、0.05、0.0525、0.055、0.0575、0.06、0.0625、0.065、0.0675、0.07、0.0725、0.075、0.0775、0.08、0.0825、0.085、0.0875、0.09、0.0925、0.095、0.0957、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.25、1.50、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.5、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 mg/L。在一些具體例中,可含括高至200 mg/L的任何量之NAA及/或其類似物。 在一些具體例中,所述培養基包含IBA及/或其類似物。在一些具體例中,IBA及/或其類似物可如下存在:0.001 mg/L、0.01、0.025、0.05、0.075、0.08、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475、0.5、0.525、0.55、0.575、0.6、0.625、0.65、0.675、0.7、0.725、0.75、0.775、0.8、0.825、0.85、0.875、0.9、0.925、0.95、0.975、1.0、1.25、1.50、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 mg/L。在一些具體例中,可含括高至200 mg/L的任何量之IBA及/或其類似物。 在一些具體例中,所述培養基包含BAP及/或其類似物。在一些具體例中,BAP及/或其類似物可如下存在:0.001 mg/L、0.01、0.025、0.05、0.06、0.07、0.0725、0.075、0.0775、0.08、0.0825、0.085、0.0875、0.09、0.0925、0.095、0.0975、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475、0.5、0.525、0.55、0.575、0.6、0.625、0.65、0.675、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.25、1.50、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.5、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 mg/L。在一些具體例中,可含括高至200 mg/L的任何量之BAP及/或其類似物。 在一些具體例中,所述培養基包含2ip及/或其類似物。在一些具體例中,2ip及/或其類似物可如下存在:0.001 mg/L、0.01、0.025、0.05、0.075、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.25、1.50、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 mg/L。在一些具體例中,可含括高至200 mg/L的任何量之2ip及/或其類似物。 在一些具體例中,所述培養基包含DPU及/或其類似物。在一些具體例中,DPU及/或其類似物可如下存在:0.001 mg/L、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.25、1.50、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.5、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 mg/L。在一些具體例中,可含括高至200 mg/L的任何量之DPU及/或其類似物。 在一些具體例中,所述培養基包含CPPU及/或其類似物。在一些具體例中,CPPU及/或其類似物可如下存在:0.001 mg/L、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.25、1.50、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.5、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 mg/L。在一些具體例中,可含括高至200 mg/L的任何量之CPPU及/或其類似物。 在一些具體例中,還可以按比率利用一種或多種細胞分裂素和一種或多種其他細胞分裂素或生長素的組合,和生長素和其他生長素或細胞分裂素的組合。例如,在一些具體例中,可含括下列示例性比率之本文公開的任何兩種成對的細胞分裂素及/或生長素:100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1;9:1、8:1、7:1、6.9:1、6.8:1、6.7:1、6.6:1、6.5:1、6.4:1、6.3:1、6.2:1、6.1:1、6:1、5.9:1、5.8:1、5.7:1、5.6:1、5.5:1、5.4:1、5.3:1、5.2:1、5.1:1、5:1;4:1、3:1、2:1、1:1、0.75:1、0.5:1、0.25:1、0.1:1、0.075:1、0.05:1、0.025:1或0.001:1。這些比率可以用於間拓樸林(及類似物)和噻苯隆(及類似物)之間、和NAA(及類似物)之間、和BAP(及類似物)之間、和IBA(及類似物)之間、和2ip(及類似物)之間、和DPU(及類似物)之間及/或和CPPU(及類似物)之間。類似地,該比率可用於噻苯隆(及類似物)和NAA(及類似物)之間、和BAP(及類似物)之間、和IBA(及類似物)之間、和2ip(及類似物)之間、和DPU(及類似物)之間及/或和CPPU(及類似物)之間。該比率還可用於NAA(及類似物)和BAP(及類似物)之間、和IBA(及類似物)之間、和2ip(及類似物)之間、和DPU(及類似物)之間及/或和CPPU(及類似物)之間。該比率還可用於BAP(及類似物)和IBA(及類似物)之間、和2ip(及類似物)之間、和DPU(及類似物)之間及/或和CPPU(及類似物)之間。簡而言之,依據任何所述公開的比率,可含括每種細胞分裂素和/或生長素或其類似物與本文公開的另一種細胞分裂素和/或生長素。 在一些具體例中,本發明提供了至少兩種類型的在體外微體繁殖中使用的培養基。第一培養基,在本文中稱為「芽誘導培養基」,包含至少一種強細胞分裂素,如噻苯隆或其類似物。第二培養基,在本文中稱為「苗伸長/維持培養基」,包含一種或多種除芽誘導培養基中細胞分裂素以外的細胞分裂素。例如,所述細胞分裂素選自:間拓樸林、激動素、異戊烯腺嘌呤(iP)、玉米素、反玉米素、玉米素核苷、二氫玉米素、苄胺基嘌呤(BAP)、苄基腺苷([9R]BAP),其類似物,或其之組合。還可用其他可獲的用於組織培養基的細胞分裂素取代上述細胞分裂素以實現類似的效果。 芽誘導培養基和苗伸長/維持培養基兩者皆包含用於植物組織培養的基本培養基的組分,如碳源和鹽。在一些具體例中,兩種培養基都可包含一種或多種選自下列的組分:NH4NO3、KNO3、Ca(NO3)2、K2SO4、MgSO4、MnSO4、ZnSO4、CuSO4、K2SO5、CaCl2、Kl、CoCl2、H3BO3、Na2MoO4、KH2PO4、FeSO4、Na2EDTA、Na2H2PO4、甘胺酸、肌醇、硫胺、吡哆醇、煙酸和核黃素。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基僅包含一種強細胞分裂素,例如噻苯隆(TDZ)或其類似物。在一些具體例中,所述芽誘導培養基包含一種另外的細胞分裂素。在一些具體例中,芽誘導培養基進一步包含一種或多種生長素,如NAA、2,4-D、IBA、IAA、毒莠定或其類似物。 在一些具體例中,芽誘導培養基中所述強細胞分裂素(如TDZ)的濃度是約0.25 mg/L(±10%)至約100 mg/L(±10%),例如,約0.2 mg/L(±10%)、約0.5 mg/L(±10%)、約1.0 mg/L(±10%)、約5 mg/L(±10%)、約10 mg/L(±10%)、約20 mg/L(±10%)、約30 mg/L(±10%)、約40 mg/L(±10%)、約50 mg/L(±10%)、約60 mg/L(±10%)、約70 mg/L(±10%)、約80 mg/L(±10%)、約90 mg/L(±10%)或約100 mg/L(±10%)。例如,TDZ的濃度是約0.2(±10%)至約20(±10%)mg/L、約0.4(±10%)至約10(±10%)mg/L,或約0.5(±10%)至約2(±10%)mg/L。 在一些具體例中,芽誘導培養基中生長素的濃度是約0.01 mg/L(±10%)至約10 mg/L(±10%),例如,約0.01 mg/L(±10%)、約0.05 mg/L(±10%)、約0.1 mg/L(±10%)、約0.5 mg/L(±10%)、約1 mg/L(±10%)、約5 mg/L(±10%)或約10 mg/L(±10%)。 在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基包含一種或多種除TDZ以外的細胞分裂素,如間拓樸林、激動素、異戊烯腺嘌呤(iP如2ip)、玉米素、反玉米素、玉米素核苷、二氫玉米素、苄胺基嘌呤(BAP)、苄基腺苷([9R]BAP),其類似物。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基進一步包含一種或多種生長素,如NAA、2,4-D、IBA、IAA、毒莠定或其類似物。 在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中細胞分裂素的濃度是約0.01 mg/L(±10%)至約100 mg/L(±10%),例如,約0.01 mg/L(±10%)、約0.05 mg/L(±10%)、約0.1 mg/L(±10%)、約0.5 mg/L(±10%)、約1 mg/L(±10%)、約5 mg/L(±10%)、約10 mg/L(±10%)、約20 mg/L(±10%)、約30 mg/L(±10%)、約40 mg/L(±10%)、約50 mg/L(±10%)、約60 mg/L(±10%)、約70 mg/L(±10%)、約80 mg/L(±10%)、約90 mg/L(±10%),或約100 mg/L(±10%)。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中細胞分裂素的濃度是約0.01(±10%)至約20(±10%)mg/L、約0.1(±10%)至約10(±10%)mg/L,或約0.25(±10%)至約5(±10%)mg/L。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基中生長素的濃度是約0.01 mg/L(±10%)至約50 mg/L(±10%),例如,約0.01 mg/L(±10%)、約0.05 mg/L(±10%)、約0.1 mg/L(±10%)、約0.5 mg/L(±10%)、約1 mg/L(±10%)、約5 mg/L(±10%)、約10 mg/L(±10%)、約20 mg/L(±10%)、約30 mg/L(±10%)、約40 mg/L(±10%),或約50 mg/L(±10%)。在一些具體例中,所述苗伸長/維持培養基中生長素的濃度是約0.01(±10%)至約20(±10%)mg/L、約0.02(±10%)至約10(±10%)mg/L,或約0.05(±10%)至約5(±10%)mg/L。 表2顯示了所述芽誘導培養基和苗伸長/維持培養基中組分的非限制性的濃度。可以省去或替換表2中的一種或多種組分而不影響培養基的功能。可以調整每種組分的濃度而不影響培養基的功能。 在一些具體例中,所述培養基可選自圖7顯示的表中所列者,或其任何同等的培養基。 除了上述「芽誘導培養基」和「苗伸長/維持培養基」的組合之外,本發明還提供其他用於植物繁殖的選擇性培養基組合。例如,提供了包含至少一種階段1培養基和至少一種階段2培養基的培養基組合。在一些具體例中,當使用某一培養基多於一次時,保留特定過程中指定培養基的編號。例如,本文揭露的某些具體例包括於交替的培養基中進行培植體或苗之迴圈。例如,可將培植體置於階段1培養基接著於階段2培養基中,然後返回到其階段1培養基。在此上下文中,當重複暴露於一種培養基時,該培養基保留其在該特定過程中的最低的階段編號。 在一些具體例中,所述過程開始時,可獲得或製備階段1培養基。階段1培養基包括植物一般易於接受的pH(通常從4.0-7.0或4.5-6.5)。本文所揭示的階段1培養基可包括(i)間拓樸林;(2)至少三種細胞分裂素;(3)細胞分裂素間拓樸林或其類似物與至少兩種其他的細胞分裂素的組合;(4)至少一種生長素和至少兩種細胞分裂素;(5)至少兩種生長素和至少兩種細胞分裂素或(6)至少兩種生長素和至少三種細胞分裂素。在某些具體例中,階段1培養基必須包括多於1種的生長素。在其他的具體例中,階段1培養基必須包括多於1種的細胞分裂素。在進一步的具體例中,階段1培養基必須包括多於1種的生長素和多於1種的細胞分裂素。 在一些具體例中,所述細胞分裂素和生長素選自間拓樸林、噻苯隆、NAA、IBA、BAP、2ip、CCPU和DPU的一種或多種。在另外的具體例中,所述細胞分裂素和生長素選自間拓樸林或其類似物、噻苯隆或其類似物、NAA或其類似物、IBA或其類似物、BAP或其類似物、2ip或其類似物、CCPU或其類似物和DPU或其類似物的一種或多種。 在一些具體例中,所述培養基具有至少兩種其他的細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基維持至少6個月的繁殖週期。 在一些具體例中,所述培養基至少包含三種細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基能維持至少6個月的繁殖週期。在一些具體例中,提供了包含細胞分裂素間拓樸林或其類似物與至少兩種其他的細胞分裂素的組合的培養基。 在一些具體例中,所述培養基包含至少一種生長素和至少兩種細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基能維持至少6個月的繁殖週期。在一些具體例中,至少一種細胞分裂素是間拓樸林或其類似物。 在一些具體例中,所述培養基包含至少兩種生長素和至少兩種細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基能維持至少6個月的繁殖週期。 在一些具體例中,所述培養基包含至少兩種生長素和至少三種細胞分裂素。在一些具體例中,所述培養基能維持至少6個月的繁殖週期。 在一些具體例中,所述微體繁殖的植物在無菌的培養基中體外生長。 在一些具體例中,所述培養基可以是液體的、半固體的或固體的,且可以藉由摻入或移除一種或多種膠凝劑改變所述培養基的物理狀態。可以使用本領域已知的任何適用於植物組織培養基的膠凝劑。瓊脂是最通常用於該目的的。這類瓊脂的實例包括Agar Type A、E或M和Bacto® Agar(Becton Dickinson & Co.)。其他示例性的膠凝劑包括角叉膠、吉蘭糖膠(由市售PhytaGelTM(Sigma-Aldrich)、Gelrite®(Sigma-Aldrich)和GelzanTM(Caisson Labs)獲得)、褐藻酸和其鹽、和瓊脂糖。還可使用這些試劑的混合物,如兩種或更多種的瓊脂、角叉膠、吉蘭糖膠、瓊脂糖和褐藻酸或其鹽。 植物生長調節劑的實例包括脫落酸(ABA)、三十烷醇(triacontanol)、間苯三酚(phloroglucinol)、生長素和具有類生長素活性的化合物、細胞分裂素和具有類細胞分裂素活性的化合物。示例性的生長素包括4-氟苯氧基乙酸(FA)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸(2,4,5-T)、3-溴氧化吲哚-3-乙酸、4-溴苯氧基乙酸、麥草畏(dicamba)、p-氯苯氧基乙酸(CPA)、吲哚-3-丙酸(IPA)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、毒莠定和其組合。示例性的細胞分裂素包括間拓樸林、噻苯隆、N-(2-氯-4-吡啶)-N-苯脲(CCPU)、1,3-二苯脲(DPU)、腺嘌呤半硫酸鹽、苄基腺嘌呤、二甲基烯丙基腺嘌呤、激動素、玉米素、核苷、腺苷、間拓樸林核苷、間拓樸林-9-葡糖苷、正拓樸林(ortho-topolin)、正拓樸林核苷、正拓樸林-9-葡糖苷、對拓樸林(para-topolin)、對拓樸林核苷、對拓樸林-9-糖苷、正甲氧拓樸林、正甲氧拓樸林核苷、間甲氧拓樸林、間甲氧拓樸林核苷、間甲氧拓樸林-9-葡糖苷和其組合,和具有類細胞分裂素活性的植物萃取物,如椰汁、香蕉粉、麥芽萃取物、鳳梨粉或番茄粉。 所述培養基中還可包括激勃素。所述培養基中可包括一種糖或糖的組合且其可充當碳源。這類糖是本領域的通常技術人員已知的。示例性的糖包括果糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖醇和山梨糖醇或其組合。其他示例性的添加劑(建議但非限制性的功能)包括聚胺(再生增強劑);檸檬酸、聚乙烯基吡啶(PVP)和硫代硫酸鈉(抗褐化劑);CaNO3或葡萄糖酸鈣(玻璃質化還原劑);多效唑(paclobutrazol)或嘧啶醇(ancymidol)(增殖增強劑);乙醯基水楊酸(乙烯抑制劑)和p-氯苯氧基異丁酸(PCIB)和三碘苯甲酸(TIBA)(抗-生長素)。 在一些具體例中,基底培養基可以是Murashige及Skoog(MS)。合適的營養鹽還包括但不限於,Anderson’s Rhododendron、Chu’s N-6、DKW、Gamborg’s B-5、Hoaglands No.2、Kao & Michayluk、Nitsch & Nitsch、Schenk及Hildebrant、Vacin及Went、Whites及WPM,由市售來源如Caisson Laboratories,Inc或Phytotechnology Laboratories可獲得者。 階段1培養基的一個實例包括間拓樸林。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、NAA和BAP。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、NAA和BAP。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、NAA、BAP和IBA。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP和IBA。另一種非限制性的實例包括噻苯隆、NAA、BAP和2ip。另一種非限制性的實例包括噻苯隆、NAA和2ip。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP、IBA和2ip。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、IBA、2ip和BAP。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、CPPU、NAA和BAP。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、DPU、NAA和BAP。另一種非限制性的實例包括噻苯隆、CPPU、BAP、IBA和2ip。另一種非限制性的實例包括CPPU、DPU、NAA和BAP。另一種非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、CPPU、DPU、NAA、BAP、IBA和2ip。這些非限制性實例中的每一個都可包括間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP、DPU、CPPU、IBA和/或2ip的類似物。 然後將階段1培養基置於試管或其他適當的容器中(包括罐、箱、壺、杯、無菌袋技術、生物反應器、暫時的浸漬器皿等,其中未指明的統稱為「管」)。可以將這些管加蓋或覆蓋並以高壓滅菌(autoclave)為滅菌管和培養基。在另一個具體例中,經由5-25磅壓力psi,在200℉的溫度高壓滅菌10-25分鐘完成滅菌。在另一個具體例中,經由15磅壓力psi,在250℉的溫度高壓滅菌15-18分鐘完成滅菌。液體培養基可接受過濾滅菌。 在所述培植體可以在階段1培養基上自己安置之後,從這些培植體生長出的細胞培養物被轉移到階段2培養基中。本文揭示的階段2培養基可包括(i)間拓樸林;(2)至少三種細胞分裂素;(3)細胞分裂素間拓樸林或其類似物與至少兩種其他的細胞分裂素的組合;(4)至少一種生長素和至少兩種細胞分裂素;(5)至少兩種生長素和至少兩種細胞分裂素或(6)至少兩種生長素和至少三種細胞分裂素。在某些具體例中,階段2培養基必須包括多於1種生長素。在其他的具體例中,階段2培養基必須包括多於1種細胞分裂素。在進一步的具體例中,階段2培養基必須包括多於1種生長素和多於1種細胞分裂素。 在一些具體例中,所述細胞分裂素和生長素選自間拓樸林、噻苯隆、NAA、IBA、BAP、2ip、CCPU和DPU的一種或多種。在另外的具體例中,所述細胞分裂素和生長素選自間拓樸林或其類似物、噻苯隆或其類似物、NAA或其類似物、IBA或其類似物、BAP或其類似物、2ip或其類似物、CCPU或其類似物和DPU或其類似物的一種或多種。 在一些具體例中,所述階段2培養基的一個實例包括間拓樸林。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、NAA和BAP。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、NAA和BAP。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、NAA、BAP和IBA。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP和IBA。另一個非限制性的實例包括噻苯隆、NAA、BAP和2ip。另一個非限制性的實例包括噻苯隆、NAA和2ip。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP、IBA和2ip。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、IBA、2ip和BAP。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、CPPU、NAA和BAP。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、DPU、NAA和BAP。另一個非限制性的實例包括噻苯隆、CPPU、BAP、IBA和2ip。另一個非限制性的實例包括CPPU、DPU、NAA和BAP。另一個非限制性的實例包括間拓樸林、噻苯隆、CPPU、DPU、NAA、BAP、IBA和2ip。這些非限制性實例中的每一個都可包括下列的類似物:間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP、DPU、CPPU、IBA和/或2ip。 在本文揭示的特定具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林、噻苯隆、NAA和BAP。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林、NAA和BAP。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林、NAA、BAP和IBA。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP和IBA。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括噻苯隆、NAA、BAP和2ip。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括噻苯隆、NAA和2ip。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP、IBA和2ip。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林、IBA、2ip和BAP。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林、噻苯隆、CPPU、NAA和BAP。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括間拓樸林、噻苯隆、DPU、NAA和BAP。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基兩者都包括噻苯隆、CPPU、BAP、IBA和2ip。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養基都包括CPPU、DPU、NAA和BAP。在另一個非限制性的具體例中,階段1和階段2培養兩者基都包括間拓樸林、噻苯隆、CPPU、DPU、NAA、BAP、IBA和2ip。這些非限制性實例中的每一個還可包括下列的類似物:間拓樸林、噻苯隆、NAA、BAP、DPU、CPPU、IBA和/或2ip。 在一些具體例中,階段1和階段2培養基的實例係描述於WO/2011/100762,其以引用方式全部併入本文。例如,階段1和階段2培養基可選自由下列族群所組成的培養基:培養基b-12c(i-v);培養基CW2(i-v);培養基CW3(i-v);培養基b-9(i-v);培養基CW4(i-v);培養基CW1(i-v);培養基CW5(i-v);培養基CW6(i-v);培養基b-10(i-v);培養基b-11(i-v);培養基b-1(i-v);培養基b-4(i-v);培養基b-6(i-v)。 在一些具體例中,階段1和階段2培養基的實例選自下列:培養基b-12c(i-v): 培養基CW2(i-v): 培養基CW3(i-v): 培養基b-9(i-v): 培養基CW4(i-v): 培養基CW1(i-v): 培養基CW5(i-v): 培養基CW6(i-v): 培養基b-10(i-v): 培養基b-11(i-v): 培養基b-1(i-v): 培養基b-4(i-v): 培養基b-6(i-v): 培養基B-9N2 培養基B-12C CPPU 培養基B-12C DPU 在一些具體例中,所述非細胞分裂素的組分是由市售來源可獲得之Anderson’s Rhododendron、Chu’s N-6、DKW、Gamborg’sB-5、Hoaglands No.2、Kao & Michayluk、Nitsch & Nitsch、Schenk及Hildebrant、Vacin及Went、Whites及WPM中所發現者。特定的培養基可具有比前述表中提供者更高或更低程度的大量營養物(macronutrients),且其他的將缺少硝酸鹽。在一些具體例中,所述培養基具有更高或更低程度的大量營養物且缺少硝酸鹽。在一些具體例中,所述培養基具有更高程度的大量營養物且缺少硝酸鹽。 本文所揭示的培養基還包括強化培養基。所述強化培養基為將上述培養基中的至少一種細胞分裂素和/或生長素的濃度增加,例如且不限於,1%、3%、5%、7%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%或200%。在其他的具體例中,上述培養基中的至少一種細胞分裂素和/或生長素的濃度增加,例如且不限於,1-10%、5-15%、10-20%、15-25%、20-30%、25-35%、30-40%、35-45%、40-50%、45-55%、50-60%、55-65%、60-70%、65-75%、70-80%、75-85%、80-90%、85-95%、90-100%、95-105%、100-110%、105-115%、110-120%、115-125%、120-130%、125-135%、130-140%、135-145%、140-150%、145-155%、150-160%、155-165%、160-170%、165-175%、170-180%、175-185%、180-190%、185-195%、190-200%、195-205%、3-6%、7-17%、12-22%、17-27%、22-32%、27-37%、32-42%、37-47%、42-52%、47-57%、52-62%、57-67%、62-72%、67-77%、72-82%、77-87%、82-92%、87-97%、92-102%、97-107%、102-112%、107-117%、112-122%、117-127%、122-132%、127-137%、132-142%、137-147%、142-152%、147-157%、152-162%、157-167%、162-172%、167-177%、172-182%、177-187%、162-172%、167-177%、182-192%、187-197%、192-202%、197-207%,或200-210%。當多於一種細胞分裂素和/或生長素經強化,每種增加的細胞分裂素和/或生長素的濃度可以與培養基中其他細胞分裂素和/或生長素相同或不同的量增加。 下表提供了本文所揭示的強化培養基的非限制性的實例。每種培養基包括了在上述各自的表或如下述段落中所描述以調整為具有下列細胞分裂素程度的經調整組分:培養基b-12c(i-v): 培養基CW2(i-v): 培養基CW3(i-v): 培養基b-9(i-v): 培養基CW4(i-v): 培養基CW1(i-v): 培養基CW5(i-v): 培養基CW6(i-v): 培養基b-10(i-v): 培養基b-11(i-v): 培養基b-1(i-v): 培養基b-4(i-v): 培養基b-6(i-v): 培養基B-9N2: 培養基B-12C CPPU 培養基B-12C DPU 另外的強化培養基可包括添加或調整成下列細胞分裂素和/或生長素濃度的任何上述標準的培養基:培養基AA 培養基AB 培養基AC 如在下述更完整解釋,當利用強化培養基時,培植體或苗一般(但並非必然)在強化培養基比置於非強化培養基者的時間更短,且在培養於強化培養基之後,將該培植體或苗轉移到含有標準程度的、降低程度的或沒有細胞分裂素和/或生長素的培養基上(含有降低或沒有細胞分裂素和/或生長素者在本文中都稱為「減料」培養基)。 本文所揭示培養基的一種或多種成分可基於植物種類進行調整。 在一些具體例中,本文所揭示培養基可用於竹的組織培養。WO/2011/100762係描述代表性竹之屬,其以引用方式全部併入本文中。 在一些具體例中,階段1培養基係選自由下列族群之組成:b-12c-v培養基、B-12C-CPPU-v培養基、B-12C DPU-v、B-9N2-v培養基或b-10-v培養基或其強化版本。 在一些具體例中,階段2培養基係選自由下列族群之組成:CW1-v培養基;CW2-v培養基;CW3-v培養基;CW4-v培養基;CW5-v培養基;CW6-v培養基、B-12C-CPPU-v培養基、B-12C DPU-v、B-9N2-v培養基或其強化和減料/標準版本,進行10-120天的週期(如下述更完整描述的修飾強化培養基)。 在一些具體例中,可以包括一種或多種階段3培養基。在一些具體例中,階段3培養基係選自由下列族群之組成:Br-2-v培養基;Ech-v培養基或Amel-v培養基,或其強化和減料/標準版本(如下述更完整描述的修飾強化培養基)。 在一些具體例中,階段2、階段3、階段4、階段5、階段6、階段7培養基的非限制性實例包括:培養基Ech(i-v): 培養基BR-2(i-v): 培養基Amel(i-v) 在一些具體例中,這些培養基的強化版本的非限制性實例包括:培養基Ech(i-v): 培養基BR-2(i-v): 培養基Amel(i-v): (細胞分裂素和類似物) 依據所揭示的有用化合物係包括間拓樸林類似物,其具有通式: 其中W是芳基或雜芳基;R1是經取代的或未經取代的烷基,其中烷基中的任何C可以用O、N或S取代;各R2獨立地是H、OH、C1-C6烷基、C1-C6伸烷基、C1-C6炔基、鹵素、氰基、C1-C6烷氧基、芳基或雜芳基,各自可選擇性地經C1-C6烷基、SH、NHR3、CO2R3或鹵素取代;R3是H、OH、C1-C6烷基、C1-C6伸烷基、C1-C6炔基、鹵素、羧基基團、酯基基團、醛或氰基;R是0至8。 在一些具體例中,W是 其中虛線代表存在或不存在之鍵;X1-X7各自獨立地選自C、N、O、S,條件是將環與N連接的X是C。 在一些具體例中,所述化合物具有結構, 其中虛線代表存在或不存在之鍵。 在一些具體例中,所述化合物具有結構, 其中虛線代表存在或不存在之鍵;X8-X12各自獨立地選自C、N、O、S;各R4獨立地是H、OH、C1-C6烷基、C1-C6伸烷基、C1-C6炔基、鹵素、氰基、C1-C6烷氧基、芳基或雜芳基,其各自可選擇性地經C1-C6烷基、SH、NHR3、CO2R3或鹵素取代;R3是H、OH、C1-C6烷基、C1-C6伸烷基、C1-C6炔基、鹵素、羧基基團羧基基團、酯基基團、醛或氰基;p是0到5;且q是0到6。 在一些具體例中,所述化合物具有結構, 在一些具體例中,所述化合物具有結構, 又更進一步地,所述化合物可具有選自如下的結構: 在一些具體例中,R4是OH。 在一些具體例中,所述化合物具有選自如下的結構: 在一些具體例中,所述化合物具有結構, 其中虛線代表存在或不存在之鍵。 在另一個具體例中,所述化合物具有結構 其中虛線代表存在或不存在之鍵;X8-X12是各自獨立地選自C、N、O、S;各R4獨立地是H、OH、C1-C6烷基、C1-C6伸烷基、C1-C6炔基、鹵素、氰基、C1-C6烷氧基、芳基或雜芳基,其各自可選擇性地經C1-C6烷基、SH、NHR3、CO2R3或鹵素取代;R3是H、OH、C1-C6烷基、C1-C6伸烷基、C1-C6炔基、鹵素、羧基基團、酯基基團、醛或氰基;P是0到5;且q是0到6。 在一些具體例中,所述化合物具有結構 更有一些具體例中,所述化合物具有結構 在一些具體例中,所述化合物是間拓樸林,也稱為6-(3-羥基苄基胺基)-嘌呤,且縮寫為mT,具有經驗分子式C12H10N5OH、分子量241.25和下列結構式: 其中所述間拓樸林是柳樹或楊樹的衍生物。 間拓樸林類似物特定地包括但不限於:間拓樸林核苷、間拓樸林-9-葡糖苷、正拓樸林、正拓樸林核苷、正拓樸林-9-葡糖苷、對拓樸林、對拓樸林核苷、對拓樸林-9-葡糖苷、正甲氧拓樸林、正甲氧拓樸林核苷、間甲氧拓樸林、間甲氧拓樸林核苷和間甲氧拓樸林-9-葡糖苷。在特定的具體例即本文中稱為「mT限制性具體例」中,可以將6-(3-氟代苄基胺基)嘌呤(FmT)、6-(3-氟代苄基胺基)嘌呤-9-核苷(FmTR)和/或6-(3-甲氧苄基胺基)嘌呤-9-核苷(memTR)從間拓樸林類似物的類中排除。 依據所揭示有用的化合物包括噻苯隆類似物,其具有通式 其中V是芳基或雜芳基;各R5和R6是各自獨立的H、OH、C1-C6烷基、C1-C6伸烷基、C1-C6炔基、鹵素、氰基、C1-C6烷氧基、芳基或雜芳基,其各自選擇性地經C1-C6烷基或鹵素取代;n是0到4;o是0到5 X13-X16各自獨立地選自C、N、O、S;Z1和Z2是各自獨立的NH、O、SH或CH,或可組合Z1和Z2以形成經取代或未經取代的芳基或雜芳基;且Y1是O或S。 在另一個具體例中,化合物具有結構 其中X17-X21各自獨立地選自C、N、O、S。 在其他的具體例中,化合物包括 在一個具體例中,所述化合物是噻苯隆,亦稱為1-苯基-3-(1,2,3-噻二唑-5-基)脲和5-苯羰基胺基-1,2,3-噻二唑,具有經驗分子式C9H8N4OS、分子量220.25和下列結構式 依據所揭示有用的化合物包括B-萘氧乙酸類似物,其具有通式: 或其鹽;其中Ra是COR3、CO2R3、CONR3R4、或CN;各Rb獨立地是R3;OR3;F;Cl;Br;I;CN;NO2;OCF3;CF3;NR2R3;SR3、SOR3、SO2R3、CO2R3、COR3、CONR3R4、CSNR4R5;或選擇性地經取代的芳基或選擇性地經取代的雜芳基,其中芳基或雜芳基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br、或I;A是1、2、3、4、5、6、或7;Xa是NH、S或O;各R3獨立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、或C2-C6炔基;及各R4獨立地是R3或選擇性地經取代的苯基,其中苯基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br、或I。 在另一個具體例中,所述化合物具有結構: 在一個具體例中,所述化合物是B-萘氧乙酸(NAA),亦稱為(2-萘氧)-(9CI)乙酸且具有CAS號120-23-0,具有經驗分子式C12H10O3、分子量202.21和下列結構式: NAA類似物的其他實例可包括但不限於: 依據所揭示有用的化合物包括吲哚丁酸(IBA)的類似物,其具有通式: 或其鹽;其中R1是COR3、CO2R3、CONR3R4或CN;各R2獨立地是R3;OR3;F;Cl;Br;I;CN;NO2;OCF3;CF3;NR2R3;SR3、SOR3、SO2R3、CO2R3、COR3、CONR3R4、CSNR4R5;或選擇性地經取代的芳基或選擇性地經取代的雜芳基,其中芳基或雜芳基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I;n是1、2、3或4;X是NH、S或O;各R3獨立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基;及各R4獨立地是R3或選擇性地經取代的苯基,其中苯基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I。 在另一個具體例中,所述化合物具有結構: 在一個具體例中,所述化合物是吲哚丁酸(IBA),也稱為1-吲哚-3-丁酸,且具有CAS號133-32-4,具有經驗分子式C12H13NO2、分子量203.24和下列結構式: IBA類似物的其他實例可包括但不限於: 依據所揭示有用的化合物包括苄胺基嘌呤(BAP)類似物,其具有通式: 或其鹽;其中虛線代表存在或不存在之鍵;各R5和各R6獨立地是R3;OR3;F;Cl;Br;I;CN;NO2;OCF3;CF3;NR2R3;SR3、SOR3、SO2R3、CO2R3、COR3、CONR3R4、CSNR4R5;或選擇性地經取代的芳基或選擇性地經取代的雜芳基,其中芳基或雜芳基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I;o是0、1、2、3、4或5;p是0、1或2;X1是NH、S或O;X4是-N=且X5是-NH-、-S-或-O-;或X5是-N=且X4是-NH-、-S-或-O-;X2和X3獨立地是N或CR6;各R3獨立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基;及各R4獨立地是R3或選擇性地經取代的苯基,其中苯基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I。 在一些具體例中,X4是-N=且X5是-NH-、-S-或-O-,且虛線代表存在或不存在之鍵。因此,考慮依據以下化學式的化合物。 在其他的具體例中,X5是-N=且X4是-NH-、-S-或-O-。因此,考慮依據以下化學式的化合物。 在另一個具體例中,所述化合物具有結構: 在另一個具體例中,所述化合物具有結構: 在一個具體例中,所述化合物是苄基胺基嘌呤(BAP),亦稱為9H-嘌呤-6-胺,N-(苯甲基)-,其具有CAS編號1214-39-7、經驗分子式C12H11N5、分子量225.25和下列結構式: BAP類似物的其他實例可包括但不限於: 依據所揭示有用的化合物包括6-y-y-(二甲基烯丙基胺基)-嘌呤(2ip)類似物,其具有通式: 或其鹽;其中虛線代表存在或不存在之鍵;其中R7、R8和各R9獨立地是R3;OR3;F;Cl;Br;I;CN;NO2;OCF3;CF3;NR2R3;SR3、SOR3、SO2R3、CO2R3、COR3、CONR3R4、CSNR4R5;或選擇性地經取代的芳基或選擇性地經取代的雜芳基,其中芳基或雜芳基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I;q是0、1或2;X6是NH、S或O;X9是-N=且X10是-NH-、-S-或-O-;或X10是-N=且X9是-NH-、-S-或-O-;X7和X8獨立地是N或CR9;及各R3獨立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基;及各R4獨立地是R3或選擇性地經取代的苯基,其中苯基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I。 在一些具體例中,虛線代表存在或不存在之鍵。因此,考慮依據以下結構式的化合物。 在一些具體例中,X9是-N=且X10是-NH-、-S-或-O-。因此,考慮依據以下結構式的化合物。 在其他的具體例中,X10是-N=且X9是-NH-、-S-或-O-。因此,考慮具有以下結構的化合物。 在另一個具體例中,所述化合物具有結構: 在一個具體例中,所述化合物是6-y,y,-(二甲基烯丙基胺基)-嘌呤(2ip)或DAP,亦稱為N-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-9H-嘌呤-6-胺,具有CAS編號2365-40-4、經驗分子式C10H13N5、分子量203.24和下列結構式: 2ip類似物的其他實例包括但不限於: 依據所揭示有用化合物包括N,N-二苯脲(DPU)類似物,其具有通式: 或其鹽;其中各R10和各R11獨立地是R3;OR3;F;Cl;Br;I;CN;NO2;OCF3;CF3;NR2R3;SR3、SOR3、SO2R3、CO2R3、COR3、CONR3R4、CSNR4R5;或選擇性地經取代的芳基或選擇性地經取代的雜芳基,其中芳基或雜芳基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I;r和s獨立地是0、1、2、3、4或5;X11和X12獨立地是NR10、S或O;各R3獨立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基;及各R4獨立地是R3或選擇性地經取代的苯基,其中苯基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I。 在另一個具體例中,所述化合物具有結構: 在一個具體例中,所述化合物是N,N-二苯脲(DPU),其由如下化學式代表: DPU類似物的其他實例包括但不限於: 依據所揭示有用的化合物包括N-吡啶基-N’-苯脲(在本文中可交互使用PPU和CPPU)類似物,其具有通式: 或其鹽;其中各R12和各R13獨立地是R3;OR3;F;Cl;Br;I;CN;NO2;OCF3;CF3;NR2R3;SR3、SOR3、SO2R3、CO2R3、COR3、CONR3R4、CSNR4R5;或選擇性地經取代的芳基或選擇性地經取代的雜芳基,其中芳基或雜芳基的各取代基獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I;t和u獨立地是0、1、2、3、4或5;X13和X14獨立地是NR12、S或O;各R3獨立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基;及各R4獨立地是R3或選擇性地經取代的苯基,其中苯基的各取代物獨立地是C1-C6烷基、F、Cl、Br或I。 在一個具體例中,化合物具有結構: 在另一個具體例中,化合物具有結構: 在一個具體例中,所述化合物是N-(2-氯吡啶-4-基)-N’-苯脲,其由如下化學式代表: PPU類似物的其他實例可包括但不限於: (植物繁殖系統) 生物反應器提供一種有前途的大規模微體繁殖方法,使得在對培養參數(如pH、通氣、氧氣、二氧化碳、激素、營養物等)具有高度控制的大容器中工作成為可能。利用人工智慧,生物反應器和微體繁殖步驟的自動化也可相容,藉此降低生產成本。 以前主要將生物反應器應用於微生物技術、細胞培養和體細胞胚胎發生(somatic embryogenesis),而且在本發明之前,用於植物微體繁殖的生物反應器是罕見、複雜和昂貴的。 為了解決這些問題,本發明提供了使用生物反應器於植物微體繁殖的新穎組成物、方法和系統。不希望受任何理論束縛,本發明藉由控制/降低苗/小植株對生長組成物/環境中累積的(例如某些植物激素,如TDZ)和/或作為植物生長的副產物產生的(如酚類化合物(phenolics))有毒組分的暴露,實現了極大改進的植物微體繁殖。 圖1係示意地說明依據一個具體例的植物繁殖系統100,所述系統100是為植物的大規模增殖而配置。在一些具體例中,將所述系統100用於單子葉植物的大規模增殖。在一些具體例中,將所述系統100用於竹的大規模增殖。所述系統100包括生長器皿110、第一培養基容器130、第二培養基容器150、氣體源170和控制器190。 生長器皿110是為了將植物組織在無菌或基本上無菌的環境中培養而配置。生長器皿110可以是任何能為植物組織和營養培養基提供無菌或基本上無菌的環境的適合容器。生長器皿110可進一步具有任何適合的材料和任何期望的形狀。例如,生長器皿110可以是透明的,以允許對植物組織的視覺觀察和光刺激,而且可構建為減少培養組織上的剪切力。 在一些具體例中,所述生長器皿110包含一種或多種適用於植物生長的光源。或者,所述生長器皿是透明的,以允許在生長器皿110外提供的光刺激。 在一些具體例中,所述生長器皿110與氣體源連接。在一些具體例中,所述氣體源提供二氧化碳、氧氣、氮氣或其組合。在一些具體例中,提供的氣體或氣體混合物是無菌的或基本上無菌的。根據包括例如在植物繁殖系統100中生長的植物類型的多種因素中的任何一個,可以預先容易地控制向生長器皿110提供的氣體混合物的比率。 配置第一培養基容器130和第二培養基容器150以含有液體和氣體,且每個都可與生長器皿110和氣體源170流體連接。可以根據包括如在植物繁殖系統100中生長的植物類型在內的多種因素中的任何一個納入另外的培養基容器。培養基容器130、150可含有完全相同的液體培養基,或者含量及/或組成不同的培養基。培養基容器130、150可以任何合適的方式液體地連接到生長器皿110。例如,在一些具體例中,生長器皿110可具有多個流體交換口(未顯示),且可將各培養基容器130、150連接到分別的培養基交換口。各個連接可以是直接且連續的,或包括可控閥(如手動的或在控制器190的電子控制下)。在一些具體例中,生長器皿110可具有單個流體交換口(未顯示)以連接所有的培養基容器130、150,和支管(未顯示)以控制培養基容器130、150和生長器皿110之間的液體培養基的交換。所述支管可包括任意數量的流體連通器(communicators)和閥(手動、電子致動、液壓致動等)以控制培養基容器130、150和生長器皿110之間的流體連通。在一些具體例中,生長器皿110可具有多個流體交換口(未顯示)以連接每個培養基容器。 氣體源170可以是任何適用於將加壓氣體輸送到培養基容器130、150的裝置或系統。氣體源170可包括一種或多種,但不限於氣體壓縮罐和氣體泵。可以使用任意數量的氣體源170。例如,在一些具體例中,可將每個培養基容器130、150連接到不同的氣體源170。在一些具體例中,可以使用支管將氣體源170連接到培養基容器130、150。所述支管可包括任意數量的流體連通器和閥(手動、電子致動、液壓致動等)以控制加壓氣體到培養基容器130、150的供應。可以將支管和閥連接到控制器190以允許自動及/或電子控制對培養基容器130、150的氣體供應。氣體源170使用的氣體可以是任何不損害培養基容器130、150中液體培養基的氣體。這類氣體的實例包括任何惰性氣體、氧氣、氮氣、二氧化碳、具有大氣組成的氣體及其組合。 氣體源170可藉由向培養基容器130、150中的一個或兩個輸送大量的加壓氣體來改變培養基容器130、150中的氣壓而操作。在一些具體例中,配置氣體源170以向第一培養基容器130或第二培養基容器150輸送加壓氣體,將第一培養基容器130或第二培養基容器150中的氣壓提高到約1磅每平方英寸(psi),如約0.7 psi、約0.8 psi、約0.9 psi、約1 psi、約1.1 psi或約1.2 psi。第一培養基容器130或第二培養基容器150中增加的氣壓使第一培養基容器130中含有的液體培養基的至少一部分從第一培養基容器130置換到生長器皿110,或第二培養基容器150中含有的液體培養基的至少一部分從第二培養基容器150置換到生長器皿110。經由解除(deactivate)或隔離氣體源170以允許第一培養基容器130或第二培養基容器150中的氣壓回到其最初的(如大氣壓)值。如此,生長器皿110中的液體培養基的置換部分返回到第一或第二培養基容器中。加壓和解除氣體源170的組合係導致第一培養基及/或第二培養基與生長器皿110中植物組織接觸的「脈動」。 在一些具體例中,在解除階段過程中,培養基容器使壓力均衡,且開始自動的虹吸排水,使培養基排空回到原始的培養基容器中。在一些具體例中,虹吸排水速率是約500到1000 mls/分,如600-720 mls/分。 在一些具體例中,在排水時,植物部分地浸沒於培養基約2到約4分鐘,如約2.5到約3分鐘。 在一些具體例中,在排空培養基之後且在下一種培養基進入容器之前,將容器中的植物以預定的時間乾燥。在一些具體例中,將所述植物乾燥約3-6分鐘,如約5分鐘。 對於第一培養基容器130或第二培養基容器150,可以根據如植物繁殖系統100中生長的植物類型將脈動過程重複任意迴圈數。例如,重複迴圈總共花費約半小時至約3週,如約24小時至約60小時,或約24小時至約4週,如約3天至約5天。在一些具體例中,第一培養基容器容納包括植物激素TDZ的芽誘導培養基,而第二培養基容器容納不包括TDZ的苗伸長/維持培養基。 在一些具體例中,可以在第一培養基容器130和第二培養基容器150之間交替所述脈動過程。在一些具體例中,可對第一培養基容器130的脈動過程重複預定的迴圈數,然後轉換到第二培養基容器進行預定的迴圈數。在一些具體例中,可依據多種預定模式中的任意一種以重複和交替第一培養基容器130和第二培養基容器150之間的脈動過程,例如,依據植物繁殖系統100中生長的植物類型。例如,可以約半小時至約3週的時間重複對第一培養基的脈動過程,如約24小時至約60小時,且隨後對第二培養基以約24小時至約4週重複,如約3天至約5天。 植物繁殖系統100的操作係為手動控制,或是由控制器190控制,所述控制器190可以是處理器、計算裝置或任何如本領域已知的可程式設計的/可配置的裝置或系統。配置所述控制器190以電子控制氣體源170,且至少控制氣體源170的啟動和解除。在一些具體例中,配置所述控制器190以電子控制將氣體源170與各個培養基容器130、150連接的支管,以使得選擇其中一個培養基容器成為可能。在一些具體例中,配置所述控制器190以電子控制將培養基容器130、150和生長器皿110連接的支管,以能夠控制培養基容器130、150和生長器皿110之間的液體流動。此外,且與各種具體例及其組合並非不一致的是,可以將控制器190連接到多個氣體源、多個支管及/或多個閥,並配置成用於其之控制。本文未舉例說明的系統100於其他方面的控制(如氣體交換系統、溫度控制系統等的控制)係在本發明範圍內。 控制器190在第一操作模式下是可操作的,其中控制器引起氣體源170將加壓氣體輸送到第一培養基容器130以將其中含有的第一體積的液體置換到生長器皿110。此外,控制器190在第二操作模式下是可操作的,其中控制器引起氣體源170將加壓氣體輸送到第二培養基容器150以將其中含有的第二體積的液體置換到生長器皿110。在一些具體例中,以預定的時間運行第一和第二操作模式。在一些具體例中,將第一和第二操作模式運行約1分鐘±半分鐘,如約30秒、約40秒、約50秒、約60秒、約70秒、約80秒或約90秒。如上描述的,可以依據預定的模式重複及/或交替第一和第二操作模式。 此外,在已執行第一操作模式或第二操作模式之後(即,生長器皿110含有來自培養基容器130、150其中之一的液體),控制器190可在第三操作模式下運行而操作。在第三操作模式中,允許生長器皿110中的液體返回到其各自的培養基容器,例如,通過解除氣體源170。在一些具體例中,以預定的時間運行第三操作模式。在一些具體例中,第三操作模式係運行約8分鐘,如約7分鐘、7.5分鐘、8分鐘、8.5分鐘等。 在一些具體例中,控制器190可藉由運行包含第一操作模式-第三操作模式次序的一個或多個迴圈的第一培養次序而操作。在一些具體例中,第一培養次序係運行從約1小時至約3週,如從約24小時至約60小時。控制器190也可藉由運行包含第二操作模式-第三操作模式次序的一個或多個迴圈的第二培養次序而操作。在一些具體例中,第二培養次序係運行從約24小時至約4週,且例如,3天到約5天。 在一些具體例中,控制器190可藉由運行包含每個第一培養次序後是第二培養次序的一個或多個迴圈的植物繁殖次序而操作。植物繁殖次序的迴圈數範圍可從1至8或更多。 在一些具體例中,可藉由任何已知的方法,如高壓滅菌,對生長系統的一個或多個或所有部分滅菌。 在一些具體例中,藉由氣壓將培養基驅入或驅出生長器皿。在一些具體例中,藉由其他力,如重力、電力等,將培養基驅入或驅出生長器皿。 現參見圖2-5C,其顯示了植物繁殖系統200的示例性具體例。系統200的操作與上述系統100類似,因此除非另外說明的,系統200的各種元件可以與其他具體例中的具有類似的設計和功能。例如,生長器皿210可與生長器皿110類似。 圖2舉例說明的具體例包括生長器皿210、支管240、第一培養基容器230、第二培養基容器250、作為氣體源的氣體泵270、和作為控制器的計時器控制電路290。將單個氣體源270附於第一培養基容器230,且其可移除及重附著於第二培養基容器250。有利地,各個培養基容器230、250所使用的濾器252(另參見圖3)係防止培養基容器中任何可能的氣體泵270(甚至在轉換的時候)對液體培養基的污染。或者,可以使用兩個氣體源,各個源係在計時器控制電路290的控制下附著於培養基容器230或250,因此不需要重附著。如圖3之說明,各個培養基容器230、250具有第一流體口232,其與生長器皿210的口222為流體連通或者以其他方式可連接,以使培養基容器和生長器皿之間的流體可以交換。各個培養基容器230、250還具有第二流體口236,其與氣體源270為流體連通或者以其他方式可連接的以改變培養基容器中的氣壓。口232和236係形成於密封培養基容器的接合器238上以防止污染,例如一種艙壁接合器(bulkhead adapter)。如圖所示,第二液體口236另外與濾器252接合(如具有階形倒刺軟管(stepped hose barbs)的通氣口濾器)以防止在與氣體泵270交換氣體時培養基容器中流體的污染。 圖2和4說明了與分別來自培養基容器230、250的管242和244連接的支管240的非限制性設計。圖4說明了形成於支管240上以分別控制來自每個管242、244流動的閥246和248。可以使用任何合適的兩通閥(2-way valve),例如球閥、門閥、蝶形閥等。閥246、248可以受計時器290的電子控制,並且/或者是手動控制。在圖2描述的裝置中,閥246開啟,以將生長器皿210和第一培養基容器230流體連接。閥248關閉,以將第二培養基容器250從生長器皿210和第一培養基容器230流體隔離。以此種方式,阻止了第一培養基容器230和第二培養基容器250之間的液體混合。 藉由計時器控制電路290開/關氣體泵的電源供應,實現對氣體泵270的控制。在一個具體例中,所述氣體泵是1 psi泵,當其由電路290供能時(例如在第一或第二操作模式下),將氣體泵入連接的第一培養基容器230以將壓力提高到1 psi。當電路290切斷對氣體泵270的供能時,可以解除或者以其他方式關閉氣體泵270(例如在第三操作模式下),由此通過使泵入的氣體流回到氣體泵中而使第一培養基容器中的壓力均衡。 如圖5A-C之說明,生長器皿210包括用於進入生長器皿內部的閉合物212、便於運輸的柄216。儘管圖示為形成於正面部分,閉合物212和柄216可以形成於生長器皿210的任何其他部分。在一個具體例中,生長器皿210是間歇浸沒式生物反應器。 生長器皿210也可具有形成於生長器皿上的氣體交換口220和流體交換口222,儘管任何數量的氣體交換口和流體交換口都在本發明的範圍之內。口220和222與接合器接合以使生長器皿210內部的流體能夠連通,同時維持無菌。在一個具體例中,所述口220和222與艙壁接合器接合。生長器皿210還包括附著於口222以與生長器皿內部流體連通的流體導管(conduit)226。所述導管226具有充足的長度且具有有適當的橫截面的內腔以使流體能從生長器皿210的底部虹吸到選擇的培養基的容器230中,如在下面以更多細節描述的圖1的系統100。 在一個具體例中,生長器皿210用於植物的大規模增殖。在一些具體例中,生長器皿210係用於竹的大規模增殖。在一些具體例中,生長管進一步用於培養物的預生根和生根。再次參見圖1的系統100,在使用中,將待培養的植物組織(如竹組織)置於生長器皿110中,隨後將其置於相對於培養基容器130、150能達到虹吸作用的高度。將第一和第二液體培養基分別置於培養基容器130、150中。在一個具體例中,第一和第二液體培養基是不同的。如所討論,氣體源170與培養基容器130、150連接,且控制器190與氣體源和任何需要電子控制的其他元件連接。 如圖6說明所描述控制器190的示例性植物繁殖次序300的操作。儘管以逐步的方式說明,但需要注意的是這些步驟的執行順序並不必要按此進行。在302,控制器190開始植物繁殖次序。在304,控制器190開始第一培養次序。在306,控制器190建立第一培養基容器130和生長器皿110之間的流體連通。控制器190還建立了氣體源170和第一培養基容器130之間的流體連通。控制器190還將第二培養基容器150與生長器皿110流體隔離。在308,控制器進入第一操作模式並驅動氣體源170將加壓氣體輸送到第一培養基容器130,以將其中含有的第一體積的液體置換到生長器皿110中。在310,該控制器隨後進入第三連通模式且藉由解除氣體源170允許生長器皿110中至少一部分第一體積的液體返回到第一培養基容器130。 在312,如果第一培養次序未完成,所述控制器190返回到308,並再次進入第一操作模式。如果第一培養次序是完成的,所述控制器在314開始第二培養次序。在316,所述控制器建立第二培養基容器150和生長器皿110之間的流體連通。所述控制器還建立氣體源170和第二培養基容器150之間的流體連通。所述控制器還將第一培養基容器130與生長器皿110流體隔離。在318,所述控制器進入第二操作模式,並驅動氣體源170將加壓氣體輸送到第二培養基容器150,以將其中含有的第二體積的液體置換到生長器皿110中。在320,所述控制器隨後進入第三連通模式,並且藉由解除氣體源170允許生長器皿110中至少一部分第二體積的液體返回到第二培養基容器150。 在322,如果第二培養次序未完成,所述控制器190返回到318,並再次進入第二操作模式。如果第二培養次序是完成的但(由324確定)植物繁殖次序未完成,所述控制器190返回到步驟304並再次開始第一培養次序。如果植物繁殖次序是完成的,控制器190在326退出植物繁殖過程。在一個具體例中,所述控制器190包括用於信號通知植物繁殖次序結束的視覺及/或音訊指示器。 因此本發明之態樣在提供對於獨立控制、多個培養基、脈動時間(即啟動/解除時間)和培養時間、以及整組可用液體培養基的總培養迴圈數的控制完全可程式設計的半自動或全自動的、封閉的植物繁殖系統方面是有利的。期望地,該系統的所有元件是可高溫滅菌的,因此是可再度使用的。藉由降低勞動力、疏忽和污染的損失而達成顯著的成本節約。 植物微體繁殖系統的非限制性實例包括在美國專利號3,578,431;4,320,594;4,669,217;4,908,315;4,934,096;5,049,505;5,088,231;5,104,527;5,119,588;5,139,956;5,171,683;5,184,420;5,186,895;5,212,906;5,225,342;5,558,984;5,597,731;和US 6,753,178中所描述者。在Etienne等人(Bioreactors in coffee micropropagation,Braz.J.Plant Physiol.,18(1):45-54,2006);Ziv(Bioreactor Technology for Plant Micropropagation Horticultural Reviews,Volume 24,Jules Janick編輯ISBN 0-471-33374-3);和Paek等人(Application of bioreactors for large-scale micropropagation systems of plants,In vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37:149-157,March-April 2001)中可發現植物微體繁殖系統的更多實例。 可理解的是,本發明的植物繁殖系統還包括藉由添加本領域技術人員已知的系統的一個或多個部分/特徵而從本文中描述的示例性系統衍生的系統。 (用於植物微體繁殖的架) 許多植物之物種具有熟知的微體繁殖過程。在一些情況下,例如,期望間歇地將生長培養基中培養的植物組織曝露於液體營養溶液。一些已知設計為實施該功能的系統並不適當且有破損及/或機械故障的傾向。此外,已知系統對於大規模的應用不夠健全。因此,需要改進的裝置以間歇地將組織培養小植株的微環境曝露於液體營養溶液。 在一些具體例中,裝置包括框架、由框架支持的架組件,和與架組件連接的驅動組件。在這類具體例中,可配置該驅動組件以給予架組件相對於框架的擺動運動(oscillating motion),而使繁殖器皿中和由架組件支援的組織培養小植株間歇地曝露於液體營養溶液。 圖8和9是依據一個具體例的擺動架100的立體圖。擺動架100包括框架110、架組件140和驅動組件170。框架100包括支柱111、上跨構件120和底125。可以從任何合適的材料形成框架100的元件。例如,在一些具體例中,框架100可以從鋁形成。在其他的具體例中,框架100可從鋁合金、鋼和/或鋼合金形成,並且可以具有任何合適的規格(gauge)或厚度。 支柱111可以是任何合適的配置且從底125向上延伸,如本文中以進一步的細節描述。上跨構件120可以具有任何合適的大小、形狀或配置。例如,在一些具體例中,上跨構件120可以是塑造(formed)(如機械彎曲)或壓出(extruded)C-溝槽。在另外的具體例中,上跨構件120可以是基本上閉合或實心結構,例如,如箱型管(box tubing)或棒材(bar stock)。配置上跨構件120以將其連接到支柱111的上面部分。以該方式,上跨構件120能增加擺動架100的上面部分的剛度及/或強度。 底125可以是任何合適的平臺或結構。例如,儘管圖8-10所示的是基本I-型(如包括橫跨構件,其連接於與橫跨構件垂直排列的兩個支撐構件),在其他的具體例中,底125可具有任何形狀或配置。在一些具體例中,例如,底125可具有基本為矩形的結構。在其他的具體例中,底125可包括硬化(stiffening)構件及/或類似物。例如,在一些具體例中,底125可包括與底125的上表面連接(如用螺絲旋緊、焊接、用鉚釘釘牢或以其他方式扣緊)之片狀金屬部分,其配置以增加底125的剛度和/或強度。此外,在圖8-10顯示的具體例中,底125包括一組腳輪(caster wheel)而可移動或重置擺動架100。 如圖10所示,底125包括從底125的上表面延伸的支撐構件126。更具體地,該支撐構件126被固定地連接(如焊接)到底125的上表面並至少承受一個支柱111的一部分。此外,支撐構件126之一包括配置以分別承受驅動組件170的驅動軸(drive shaft)172和搖軸(rocker shaft)182的驅動軸開口127和搖軸開口128。 支柱111包括限定基本為C-型的橫截面(圖11)和蓋112(圖10)的一組壁(walls)。如圖8-10中所示,配置支柱111以從底125的上表面延伸。更具體地,將支柱111置於支撐構件126周圍,由此使支柱111從底125的上表面延伸出去。類似而言,支撐構件126被置於由限定C型橫截面的一組壁限定的容積115內。以此種方式,支柱111可以與底125及/或支撐構件126連接(如焊接及/或扣緊)。支柱111可進一步限定配置任意數量的接受擺動架100的部分的孔。例如,至少一個支柱111可包括驅動軸開口113和搖軸開口114,其被配置為分別接受驅動軸172和搖軸182,分別納入驅動組件170,且在支撐構件126中被分別安置為與驅動軸開口127和搖軸開口128對齊。 在一些具體例中,支柱111可配置為限定任何數量的孔和/或突起以參與照明系統(未顯示)及/或控制系統(未顯示)的一部分。在一些具體例中,每個蓋112可與各自的支柱111連接以使蓋112和支柱111將一組電子元件(未顯示)儲存於容積115內。例如,在一些具體例中,所述容積115可含有電線、開關、繼電器、電子裝置(如可程式設計邏輯控制器(PLC)包括,例如,至少一個處理器、一個記憶體和一個網路介面)及/或類似物。在一些具體例中,至少一個支柱111可包括感測器支架121。在這類具體例中,可將感測器置於感測器支架121上,並且指示及/或監控架組件140相對於框架110的位置,如本文中進一步所描述。 架組件140與支柱111(參見如圖8)可旋轉地連接,且包括一組架141、一組外部軸襯(outer bushings)150、一組內部軸襯(inner bushings)155和一組連桿145。例如,如圖12所示,架組件140可包括任何適合數量的配置為垂直堆疊的架141。此外,架141藉由連桿145可操作地連接在一起(例如,連桿145傳遞至少一部分力以引起架組件140的每個架141同時轉動,如本文中進一步所描述)。儘管在圖12中顯示為包括兩個連桿145,在一些具體例中,架組件可包括任何適合數量的連桿141。例如,在一些具體例中,架組件可包括一組的四個連桿141以將第一組的兩個連桿145置於架141的一個側面而第二組的兩個連桿145置於架141的第二側面。 如圖13顯示的,每個架141包括一組由支撐管144連接在一起的平臺142(例如,將一個支撐管144置於架141的一個側面且第二支撐管144置於架141的第二側面)。如圖14所顯示,平臺142限定了限定為雙回路(double return)的橫截面形狀,由此增加平臺142的強度和剛度。此外,架141的支撐管144中的至少一個是配置為與連桿145連接。 配置外部軸襯150和內部軸襯155(圖15)以將架組件140可旋轉地連接到支柱111。更具體的,將內部軸襯155與架141的支撐管144剛性連接且將外部軸襯150與支柱111剛性連接。以該種方式,可將內部軸襯155可旋轉地置於由外部軸襯150限定的開口151之內。因此,架141可繞著置於外部軸襯150的開口151之內的內部軸襯155轉動,以回應由驅動組件170施加的至少一部分力。 現參見圖16,驅動組件包括發動機171、傳動齒輪(drive gear)173和搖動組件180。發動機171可以是限定任何適合的扭矩及/或輸出速率的任何適合發動機。例如,在一些具體例中,所述發動機171是Bison 650AC。如圖10顯示,將發動機171配置為與至少一個支柱111連接,以使驅動軸172從發動機171延伸,經過支柱111的驅動軸開口113和支撐構件126的驅動軸開口127。將傳動齒輪173配置為置於驅動軸172周圍,且容納於由支柱111限定的容積115中。 搖動組件180包括搖動齒輪181、搖軸182、軸承183、安裝托架184和搖動軸襯186。搖動齒輪181可以是任何適合的尺寸及/或限定任何適合數量的齒。此外,將搖動齒輪181置於容積115之內,且可操作地連接於傳動齒輪173,例如藉由鏈(未顯示)。可以如此安排傳動齒輪173和搖動齒輪181以限定傳動齒輪173和搖動齒輪181之間的期望的齒輪比率。 配置搖軸182以插入搖動齒輪181和軸承183中,並且經由支撐構件126的搖軸開口128和支柱111的搖軸開口114延伸。軸承183可用於促進搖軸182的轉動及/或降低搖動組件180上的磨損。進一步將搖軸182配置為經由搖動軸襯186插入且固定連接(如焊接)於安裝托架184。隨著搖軸182與安裝托架184的連接,可將安裝托架184與第一架141的支撐管144連接。因此,在安裝托架184與第一架141和搖軸182連接的情況下,架組件140可操作地連接於發動機171。 例如,圖17-19分別說明了第一種配置、第二種配置、第三種配置中擺動架100的一部分。如圖17中可見的,擺動架100可為第一種配置,而使架141的平臺142與水準軸基本平行(例如,架141與地面平行)。在一些具體例中,架141可以與連桿145基本垂直,而擺動架100處於第一種配置。 如圖18顯示的,可將搖動齒輪181以箭頭AA的方向旋轉將擺動架100移向第二種配置。更具體地,發動機171(圖18中未顯示)可以是電子連接(例如,如控制台處於「開」位置),而使發動機171旋轉驅動軸172和傳動齒輪173。可以將發動機171配置為以任何給定的輸出速率旋轉驅動軸172。例如,在一些具體例中,可以將發動機171配置為以0.5 RPM和1 RPM之間的速率旋轉驅動軸172。 如上描述的,搖動齒輪181藉由一種鏈可操作地連接於傳動齒輪173。因此,該鏈將由發動機171產生的旋轉力的一部分傳遞到搖動齒輪181,而使搖動齒輪181以箭頭AA的方向旋轉。隨著安裝托架184與第一架141連接(如上所述),由發動機171產生的轉動力的一部分被施加到第一架141上。以該種方式,推動第一架141的一端以箭頭BB的方向移動而推動第一架141的另一端以箭頭CC的方向移動。此外,由於連桿145與架141的每一個連接,連桿145將由發動機171產生的轉動力的一部分傳遞到每一個架141上。因此,每個架141被配置為與第一架141同時移動,以回應由發動機171產生的轉動力的至少一部分。此外,當與如培養的植物組織一起使用時,架141的繞軸旋轉動作可以使置於平臺142的表面上的一組植物組織的部分,例如根,間歇地傾斜,而使所述部分(如根)交替地浸沒和脫離器皿中含有的液體營養物。進一步擴展的,架141的繞軸轉動動作可以將架141以相對於水準軸的某角度放置,由此,液體營養物以箭頭DD的方向流動。 如圖19顯示,可將搖動齒輪181以箭頭EE的方向(基本和方向AA相反)旋轉將擺動架100從第二種配置移至第三種配置。隨著搖動齒輪181以箭頭EE的方向移動,推動第一架141的一端以箭頭FF的方向移動(基本與方向BB相反)且推動第一架141的另一端的部分以箭頭GG的方向移動(基本與方向CC相反)。此外,連桿145推動架組件140的每一個架141與第一架141同時移動。由此,當與如培養的植物組織一起使用時,架141以方向EE繞軸轉動的動作可以推動液體營養物以箭頭HH的方向流動,而使培養的植物組織(如根)交替的浸沒和脫離器皿中含有的液體營養物。 在使用時,可以將擺動架100配置為在第二種配置和第三種配置之間擺動。在一些具體例中,擺動架100可以給定的迴圈時間在第二種配置和第三種配置之間擺動。例如,在一些具體例中,所述迴圈時間可以是25秒(例如,擺動時間為15秒且在進入相反方向之前在第二種配置或第三種配置中的保留時間為10秒)。在其他的具體例中,所述迴圈時間可以是任何其他的適合的時間長度。在一些具體例中,所述擺動架100可包括感測器(上述)。在這類具體例中,可將該感測器,例如一種磁性感測器配置為感知架組件140相對於框架100的位置。可將該感測器配置為與例如可程式設計邏輯控制器處於電子通信的。所述可程式設計邏輯控制器和感測器可檢測系統故障。例如,在一些具體例中,可將所述可程式設計邏輯控制器配置為如果所述感測器未以預定的時段(例如35秒)感知架組件140的位置的話,向輸出裝置發送電子信號以產生適合的輸出。所述輸出可以是可聽見的警報、閃光、電話、電子郵件及/或任何其他適合的通知。 可使用任何適合的製造技術產生本文中描述的元件。例如,在一些具體例中,一些元件可以是模壓的。在一些具體例中,所述元件可以是塑造的(如彎曲的)。在這類具體例中,所述元件可包括任何適合的特徵以使該元件限定特定的材料屬性。例如,平臺142在上面描述為包括雙回路的,該雙回路被配置為增加平臺142的強度及/或剛度。在一些具體例中,其他元件可包括類似的特徵。例如,在一些具體例中,支柱111可包括雙回路。在其他的具體例中,所述連桿145可包括雙回路。 可以任何適合的方式組合本文中描述的元件。例如,在一些具體例中,元件可以是焊接的。在其他的具體例中,所述元件的至少一部分可以是機械扣緊的。例如,在一些具體例中,可以藉由螺栓和螺帽、螺絲釘、插腳及/或類似物將本文中描述的元件的部分組合(如連接)。在一些具體例中,可以使用自扣螺帽(如PEM螺帽)和螺栓或螺絲釘一起組合所述元件的部分。 儘管已在上面描述了各種具體例,需要理解的是其僅被作為實例呈現,且無限制性。在上述圖表及/或具體例指示以某些定位或位置安排的某些元件的情況下,可以修改元件的安排。類似地,在上述方法及/或事件指示以某種順序發生的某些事件及/或步驟的情況下,可以修改該事件及/或步驟的排序。雖然已經特別顯示和描述了具體例,需要理解的是可以進行各種形式和細節上的改變。 儘管已經將各種具體例描述為具有特定的特徵及/或元件的組合,具有來自上述任何具體例的任何特徵及/或元件的組合的其他具體例是可能的。 (植物微體繁殖的方法) 微體繁殖的植物可起始於選擇的植物組織塊,稱為「培植體」或「母體植物」。該培植體是將在組織培養過程中發育的細胞的來源。例如,所述培植體可以是來自如下的任何部分或細胞的集合:頂端分裂組織、頂芽、腋芽、不定芽、副芽、假頂芽、形成層(cambium)、側生分生組織、側芽、營養芽(vegetative buds)、繁殖芽(reproductive buds)、混合芽(mixed buds)、苗段(shoot segments)、苗尖(shoot apices)、莖段(stem segments)、莖的未成熟節段、側苗、幼苗、種子、開始從地面出現的苗、未成熟的花芽、花序、花冠段、葉段,或它們的任何部分。在一個具體例中,從約1週齡、約2週齡、約3週齡、約1月齡、約2月齡、約3月齡、約半年齡、約1年齡、約2年齡、約3年齡、約5年齡或更老的植物中選取培植體。獲得所述培植體的植物可在任何適合的條件下生長,包括但不限於,在生長室(chamber)中生長、在溫室中生長、在田間生長或在組織培養容器中(培養皿、margenta箱等)。在一些具體例中,所述培植體是從作為生長培養基上的原種維持的叢生苗獲得的組織培養物。在一些具體例中,所述培植體是具有一個或多個腋芽的節段,其可以是休眠的或有活性的。在一些其他的具體例中,所述培植體是種子或其部分。 本發明提供了用於植物的體外微體繁殖的方法,所述植物如裸子植物、被子植物、單子葉植物、雙子葉植物、作物、農業/經濟/環境上重要的植物等。 在一些具體例中,本文揭示的方法可用於裸子植物的體外微細繁殖。例如,所述方法可用於下列科/目的植物的體外微體繁殖:蘇鐵科(Cycadaceae)、澤米鐵科(Zamiaceae)、銀杏科(Ginkgoaceae)、千歲蘭科(Welwitschiaceae)、買麻藤科(Gnetaceae)、麻黃科(Ephedraceae)、松科(Pinaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、羅漢松科(Podocarpaceae)、金松科(Sciadopityaceae)、柏科(Cupressaceae)或紫杉科(Taxaceae)。 在一些具體例中,本文揭示的方法可用於被子植物的體外微體繁殖。例如,所述方法可用於金魚藻科(Ceratophyllum)、金粟蘭科(Chloranthaceae)、真雙子葉(eudicots)、木蘭類(magnoliids)或單子葉植物的科/目的植物的體外微體繁殖。 在一些具體例中,本文揭示的方法可用於雙子葉植物的體外微體繁殖。例如,所述方法可用於下列科/目中的植物的體外微體繁殖:黃楊科(Buxaceae)、雙頰果科(Didymelaceae)、清風藤科(Sabiaceae)、昆欄樹科(Trochodendraceae)、水青樹科(Tetracentraceae)、毛茛目(Ranunculales)、山龍眼目(Proteales)、鱗枝樹科(Aextoxicaceae)、智利藤科(Berberidopsidaceae)、五椏果科(Dilleniaceae)、洋二仙草目(Gunnerales)、石竹目(Caryophyllales)、虎耳草目(Saxifragales)、檀香目(Santalales)、薔薇類(rosids)、單果樹科(Aphloiaceae)、四棱果科(Geissolomataceae)、西蘭木科(Ixerbaceae)、美洲苦木科(Picramniaceae)、栓皮果科(Strassburgeriaceae)、葡萄科(Vitaceae)、燧體木目(Crossosomatales)、牻牛兒枝目(Geraniales)、桃金娘目(Myrtales)、蒺藜科(Zygophyllaceae)、刺毬果科(Krameriaceae)、蒜樹科(Huaceae)、衛矛目(Celastrales)、金虎尾目(Malpighiales)、酢漿草目(Oxalidales)、豆目(Fabales)、薔薇目(Rosales)、葫蘆目(Cucurbitales)、殼鬥目(Fagales)、癭椒樹科(Tapisciaceae)、白花菜目(Brassicales)、錦葵目(Malvales)、無患子目(Sapindales)、菊類(asterids)、山茱萸目(Cornales)、杜鵑花目(Ericales)、紫草科(Boraginaceae)、茶茱萸科(Icacinaceae)、五蕊茶科(Oncothecaceae)、二歧草科(Vahliaceae)、絞木目(Garryales)、茄目(Solanales)、龍膽目(Gentianales)、唇形目(Lamiales)、鱗葉樹科(Bruniaceae)、彎藥樹科(Columelliaceae)、離水花科(Desfontainiaceae)、寄奴花科(Eremosynaceae)、鼠刺科(Escalloniaceae)、盔瓣花科(Paracryphiaceae)、多香木科(Polyosmaceae)、楔蕊花科(Sphenostemonacae)、智利木科(Tribelaceae)、冬青目(Aquifoliales)、傘形目(Apiales)、川續斷目(Dipsacales)或菊目(Asterales)。 在一些具體例中,本文中所述方法可用於單子葉植物的體外微體繁殖。例如,所述方法可用於下列科/目中的植物的體外微體繁殖:菖蒲目(Acorales)、澤瀉目(Alismatales)、天門冬目(Asparagales)、薯蕷目(Dioscoreales)、百合目(Liliales)、露兜樹目(Pandanales)、無葉蓮目(Petrosaviales)、多須草科(Dasypogonaceae)、檳榔目(Arecales)、鴨蹠草目(Commelinales)、禾本目(Poales)或薑目(Zingiberales)。 在一些具體例中,本文中所述方法可用於竹物種的體外微體繁殖,例如毛竹(如Phyllostachys edulisi‘Moso’)、蓉城竹、缺苞箭竹、菲白竹、維氏熊竹、菲黃竹、筱竹、丘斯誇竹(Chusquea Culeo“Cana Prieta”)、白綠竹、楠竹、烏芽竹、馬來甜龍竹或瓜多竹。在一些具體例中,所述竹物種是毛竹,Moso。 在一些具體例中,所述方法用於快速的竹體外微體繁殖。在本文中公開的方法可以實現高的苗增殖率。如本文使用的術語「增殖率」指微體繁殖過程中起始於單個培植體獲得的植物苗的增殖倍數。例如,在培植體是包含單個芽的節段且一個微體繁殖迴圈後獲得3個苗的情況下,增殖率是3X。在一些具體例中,使用芽誘導培養基和苗伸長/維持培養基,可以在微體繁殖後實現至少約2X到約30X的增殖率。例如,可以在約5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、或約28天或更多天之內實現約2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、11X、12X、13X、14X、15X、16X、17X、18X、19X、20X、21X、22X、23X、24X、25X、26X、27X、28X、29X、約30X、或更高。 在一些具體例中,本發明是基於意想不到的發現,即培植體在含有強細胞分裂素如TDZ的第一培養基上的脈動處理,隨後該培植體在含有一種或多種除TDZ之外的細胞分裂素的第二培養基上的處理,可提供具有意想不到的高增殖率的快速體外微體繁殖,所述除TDZ之外的細胞分裂素如相對弱於TDZ的細胞分裂素,例如間拓樸林、激動素、異戊烯腺嘌呤(iP,例如2ip)、玉米素、反玉米素、玉米素核苷、二氫玉米素、苄胺基嘌呤(BAP)或苄基腺苷([9R]BAP)。 在一些具體例中,方法包括使用芽誘導培養基和苗伸長/維持培養基,其中所述芽誘導培養基包含強細胞分裂素,例如TDZ,而且苗伸長/維持培養基包含相對弱的細胞分裂素,例如間拓樸林、激動素、異戊烯腺嘌呤(iP,例如2ip)、玉米素、反玉米素、玉米素核苷、二氫玉米素、苄胺基嘌呤(BAP)或苄基腺苷([9R]BAP)。 本文中描述了芽誘導培養基的實例。在一些具體例中,芽誘導培養基包含一種或多種強細胞分裂素或其類似物。在一些具體例中,芽誘導培養基僅包含一種強細胞分裂素,其中所述細胞分裂素是TDZ或其類似物。在一些具體例中,芽誘導培養基中強細胞分裂素(例如TDZ)的濃度是約0.25 mg/L到約100 mg/L,例如,約0.5 mg/L到約2 mg/L。 本文中描述了苗伸長/維持培養基的實例。在一些具體例中,苗伸長/維持培養基包含一種或多種相對弱的細胞分裂素,例如除TDZ以外的細胞分裂素。在一些具體例中,苗伸長/維持培養基僅包含一種相對弱的細胞分裂素,例如BAP、間拓樸林、ip(例如2ip)、玉米素、玉米素核苷或其組合。在一些具體例中,苗伸長/維持培養基包含多於一種細胞分裂素。在一些具體例中,苗伸長/維持培養基中細胞分裂素的濃度是約0.01 mg/L到約100 mg/L,例如0.25 mg/L到約5 mg/L。 在一些具體例中,芽誘導培養基及/或苗伸長/維持培養基包含一種或多種生長素,例如β-萘氧乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、毒莠定或其類似物。在一些具體例中,芽誘導培養基及/或苗伸長/維持培養基包含NAA。在一些具體例中,所述培養基中生長素的濃度是0.01 mg/L到約50 mg/L,例如約0.25 mg/L到約0.5 mg/L。 在一些具體例中,所述方法包括(a)在芽誘導培養基中培養組織培養物、培植體或種子/種子的部分以誘導苗芽形成;(b)在苗伸長/維持培養基中培養從步驟(a)獲得的苗芽。 所述方法可進一步包括(c)在芽誘導培養基中培養從步驟(b)獲得的苗以誘導苗芽形成;並(d)在苗伸長/維持培養基中培養從步驟(c)獲得的苗芽。 在一些具體例中,所述方法進一步包括(e)將培養步驟(c)和步驟(d)重複至少一次。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基和苗伸長/維持培養基都是液體培養基。液體培養基的優點在於可以迅速和容易地將老的培養基用新鮮的培養基替換,或將一種類型的培養基用另一種類型的培養基替換,而不用將植物的幼苗從一個容器轉移到另一個容器中。因此,在一些具體例中,整個微體繁殖過程是在單個容器中完成,例如,在一個生物反應器中。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基及/或苗伸長/維持培養基是半固體或固體培養基。在一些具體例中,可以任何期望的順序連續使用液體培養基和半固體培養基或固體培養基。例如,步驟(a)及/或(c)中的芽誘導培養基是液體、半固體或固體;步驟(b)及/或步驟(d)中的苗伸長/維持培養基是液體、半固體或固體。 在一些具體例中,步驟(a)或步驟(c)的培養時間持續約1小時到約3週。例如,步驟(a)或步驟(c)的培養時間持續約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約22小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約54小時、約60小時、約1週、約1.5週、約2週、約2.5週、約3週、約3.5週、約4週或更長。 在一些具體例中,步驟(b)或步驟(d)的培養時間持續約0.5週、約1週、約1.5週、約2週、約2.5週、約3週、約3.5週、約4週、約4.5週、約5週、約5.5週、約6週、約7週、約8週或更長。 步驟中的培養時間可以根據植物的物種、培植體的類型、期望的增殖率調整。不希望受理論束縛的,在一些具體例中,對於竹物種,步驟(a)或步驟(c)的培養時間可以是約1小時到約3週,例如,約24小時到約60小時,且步驟(b)或步驟(d)的培養時間可以是約24小時到約4週,例如,約3天到約5天。 重複步驟(c)和步驟(d)可進一步改進苗的增殖率。例如,步驟(a)的處理和步驟(b)的處理之後產生的多個苗可經步驟(c)和步驟(d)的一輪或多輪處理。在一些具體例中,將步驟(c)的處理和步驟(d)的處理進行至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次或更多次。由於所有步驟中的處理是短時間的,需要達到非常高的苗增殖率的總時間非常短。 在一些具體例中,在進行下一個步驟之前可將老的培養基用新鮮的培養基替換1次、2次、3次或更多次,重複(a)到(e)的每個步驟。 在一些具體例中,起始於單個培植體,本方法可在約3週內提供約10X到約30X的苗的增殖率。此外,可以在約6週、約10週、約2個月、約2.5個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月內獲得至少約500、至少約1,000、至少約2,000、至少約3,000、至少約4,000、至少約5,000、至少約6,000、至少約7,000、至少約8,000、至少約9,000、至少約10,000、至少約20,000、至少約30,000、至少約40,000、至少約50,000、至少約60,000、至少約70,000、至少約80,000、至少約90,000、至少約100,000、或更多個植物的苗。 為了進一步改進苗的增殖率,可以在從步驟(a)、(b)、(c)和(d)中選擇一個或多個步驟期間或緊接其後加入分離步驟。例如,步驟(a)及/或步驟(c)中產生的多個苗芽,或步驟(c)及/或步驟(c)中產生的多個苗可以被分為單個的部分,且可將每個分開的部分置於包含新鮮培養基的單個容器中。例如,芽誘導培養基中產生的多個苗芽可以被分成單個的部分,並且或者置於新鮮的芽誘導培養基上,或者置於新鮮的苗伸長/維持培養基上;苗伸長/維持培養基中產生的多個苗可以被分成單個的部分,並且或者置於新鮮的苗伸長/維持培養基上,或者置於新鮮的芽誘導培養基上。每個分開的部分可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個苗芽或苗。 本發明還提供了使用本文中描述的植物生長系統的用於植物微體繁殖的方法。 在一些具體例中,本發明的植物生長系統用於植物的微體繁殖。在一些具體例中,其用於竹的微體繁殖。在一些具體例中,其用於下列的微體繁殖:毛竹、蓉城竹、缺苞箭竹、菲白竹、維氏熊竹、菲黃竹、筱竹、丘斯誇竹、白綠竹、楠竹、烏芽竹、馬來甜龍竹、或瓜多竹、毛金竹(Nigra Henon)、青川箭竹(Rufa)或紫竹(Nigra)。 再次參見圖1中的系統100,在用於植物的微體繁殖中,植物繁殖次序起始於將培植體置入生長器皿110。在一些具體例中,第一培養基容器130包含如本文中描述的芽誘導培養基,而第二培養基容器150包含苗伸長/維持培養基。 在一些具體例中,所述芽誘導培養基包含有效量的噻苯隆(TDZ)或其類似物,並且其中所述苗伸長/維持培養基包含有效量的一種或多種除TDZ或其類似物以外的細胞分裂素。在一些具體例中,所述芽誘導培養基中TDZ或其類似物的濃度是約0.25 mg/L到約100 mg/L,例如,從0.5 mg/L到約2 mg/L。在一些具體例中,苗伸長/維持培養中一種或多種除TDZ或其類似物以外的細胞分裂素選自:N6-苄胺基嘌呤(BAP)、間拓樸林(mT)、玉米素、激動素、2-異戊烯腺嘌呤(2ip)、腺嘌呤半硫酸鹽、二甲基烯丙基腺嘌呤、N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(4-CPPU)、及其各自的類似物所組成之群。在一些具體例中,一種或多種除TDZ或其類似物以外的細胞分裂素的濃度為從約0.01 mg/L到約100 mg/L,例如,從約0.25 mg/L到約5 mg/L。在一些具體例中,所述芽誘導培養基及/或苗伸長/維持培養基進一步包含一種或多種生長素,例如β-萘氧乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、毒莠定、及其各自的類似物。 在一些具體例中,第一培養次序304持續約半小時到約3週,例如,約24小時到約60小時,而第二培養次序314持續約24小時到約4週,例如,約3天到約5天。 在一些具體例中,植物繁殖次序的長度由達到的增殖率決定。在一些具體例中,增殖率為在約3週到約6個月內從至少約1,000到至少約100,000。 就發明者所知,此為首次將這類系統用於植物的微體繁殖,特別是竹的微體繁殖。使用生物反應器的方法是獨特的,至少由於下列原因: 1.該方法既適用於小規模(例如實驗室)也適用於大規模(例如工業)的植物微體繁殖。 2.該方法允許以更有效的方式使用本文中描述的脈動微體繁殖技術(例如,迴圈的培養基;更少的勞動;更精確的控制;更少的污染等)。 3.該方法為較以前的方法能有極大改進的苗/植物的繁殖(例如,使用固體培養基的微體繁殖,和不在生物反應器使用液體培養基的微體繁殖)。 4.該方法為較之前的方法能有更高的植物存活率,特別是對於某些植物物種,如毛竹。 5.竹釋放酚類化合物,當其在培養基/環境中積累時,對苗/植物是有害的,這一直都是使用固體培養基的一個問題。從固體生長環境(例如,組織培養管/箱中的植物微體繁殖)轉向液體環境並將脈動方法和生物反應器組合,本發明在獲得的苗/植物的數量上實現了較大的改進,並實現了改進作為結果產生的植物的健康和產生完整尺寸植物的能力。不希望受任何理論束縛的,發明人相信這些成果是利用本發明的生物反應器系統,控制/降低苗/小植株對曝露於生長組合物中毒性成分(例如,某些植物激素,如TDZ)及/或植物產生的副產物(例如酚類化合物)的結果。 除了上述基於使用「芽誘導培養基」和「苗伸長/維持培養基」組合的方法以外,本發明還提供了基於使用「階段1培養基」、「階段2培養基」、「階段3培養基」及/或更多培養基的選擇性植物微體繁殖方法。 在具體例中,所述方法包括使用至少一種「階段1培養基」和至少一種「階段2培養基」,和培植體。可以依照本公開使用多種適當的培植體。在依據本公開的某些具體例中,可將莖的不成熟節段作為培植體材料使用。在一個具體例中,所述培植體可以是新的生長有節莖(growth cane),其側苗剛剛破開節段上的鞘。新的生長有節莖包括那些從當前的季節或年度內的植物獲得的,其中這類新的生長有節莖可以從植物上的任何節獲得。在一個具體的具體例中,培植體材料包括或限於從有節莖的底部起第三個節。 在一些具體例中,所述植物是竹。在WO/2011/100762中,其藉由引用方式全部併入本文,其係描述收集和初始地消毒竹的培植體的詳細方法。在一些具體例中,可以使用消毒劑例如二氯異三聚氰酸、二氯異氰尿酸、三氯三三酮(trichlorotriazinetriona)、氯化汞、過氧化氫、FungiGoneTM(bioWorld,Inc.,Dublin,OH)、植物防腐劑。在一些具體例中,在起始的消毒之後,可以將竹的外鞘(outer sheaths)剝去並丟棄,並將剩餘部分放置到商業漂白劑或類似的消毒溶液的約1%至約50%的溶液中。在一些具體例中,可將漂白劑加熱到約20-60℃,例如23-50℃。在一些具體例中,還可將組織的超音波處理(sonication)和真空滲透(vacuum infiltration)與描述的消毒步驟一起使用。 在一些具體例中,增殖過程可藉由連續分離和增殖苗基本上無限地持續。在一些具體例中,可不引起新的培植體而重複增殖迴圈至少1個月、至少3個月、至少6個月、至少12個月、至少24個月、至少36個月、或更長。在一些具體例中,增殖迴圈包括每迴圈1-10天、每迴圈2-9天、每迴圈3-6天、每迴圈0.5-3天、每迴圈4-5天、每迴圈0.5-1天、每迴圈10-120天等。 本發明具有許多優點。不希望受任何理論束縛的,本文揭示的方法不需要使用種子或花序以起始植物,或選擇患病的起始植物,或使用抗生素、體細胞胚胎發生、假小穗(pseudospiklets),或誘導及/或逆轉開花。為了組織培養之後的成功生長,產生的植物不需要直接在盆上灑水而用頂部(overhead)灑水就可保持健康,而且不需要在轉移到溫室或其他生長條件之前對光強度或濕度條件的多種調整。此外,培養基可以不含聚天冬胺酸、海藻濃縮物及/或表面活性劑。這些對於以前方法的改進提供了有關於產生植物的健康以及生長和處理效率之更額外的優點。 在一些具體例中,本發明可用於草的繁殖。在一些具體例中,所述微體繁殖的植物未被遺傳修飾過。其他特定具體例排除了微體繁殖步驟中特美汀(timentin)及/或卡那黴素的使用。 在一些具體例中,當本方法用於竹的繁殖時,使用年齡在3個月和3年之間的竹植物的培植體。在一些具體例中,可將具有剛破鞘的側苗的有節莖的節作為培植體使用。在一些具體例中,可將每個節段切成苗完整的3-5毫米的段。在一些具體例中,可將外鞘剝去並丟棄,而且將剩餘的節段部分置於具有終濃度為0.6%的氫氧化鈉的10%的漂白溶液中。在一些具體例中,可將漂白溶液中的培植體在可調速的Lab Rotators,Barnstead/Lab line orbital Shaker(模型號KS 260)搖動臺上以每分鐘6-9轉放置1小時。然後可將該培植體置於具有終濃度為0.06%的氫氧化鈉的1%的漂白溶液中,並放回到搖動臺上30分鐘。可以重複該1%的漂白溶液的步驟。 在一些具體例中,可隨後將單個的培植體置於管中階段1培養基上(15-25 mL),並且將該管置於處在從65℉-70℉的溫度和36-54 μmole/m2/s2的全光譜光度的受調控的清潔的生長室。起始的階段1培養基可以是pH 5.7的b-12c-iv。隨後可以每10-120天(通常每21天)將培植體轉移到新鮮的b-12c-iv培養基,而丟棄污染的管。 在一些具體例中,如果利用b-12c-iv培養基的強化版本,在轉移到本文中公開的「標準」培養基或含有實質降低或沒有細胞分裂素的培養基(本文中使用的「減料」培養基)以進行10-120天的週期的剩餘部分之前,可以將培植體在強化培養基中放置0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小時。放置於強化培養基中的另外的時段包括任意的0.1和240小時之間,且可包括但不限於,0.1-0.5小時、0.3-2.5小時、2.5-6小時、1-10小時、5-15小時、10-20小時、15-25小時、20-30小時、25-35小時、30-40小時、35-45小時、40-50小時、45-55小時、50-60小時、55-65小時、60-70小時、65-75小時、70-80小時、75-85小時、80-90小時、85-95小時、90-100小時、95-105小時、100-110小時、105-115小時、110-120小時、115-125小時、120-130小時、125-135小時、130-140小時、135-145小時、140-150小時、145-155小時、150-160小時、155-165小時、160-170小時、165-175小時、170-180小時、175-185小時、180-190小時、185-195小時、190-200小時、195-205小時、200-210小時、205-215小時、210-220小時、215-225小時、220-230小時、225-235小時、230-240小時、235-245小時、240-250小時、3-6小時、7-17小時、12-22小時、17-27小時、22-32小時、27-37小時、32-42小時、37-47小時、42-52小時、47-57小時、52-62小時、57-67小時、62-72小時、67-77小時、72-82小時、77-87小時、82-92小時、87-97小時、92-102小時、97-107小時、102-112小時、107-117小時、112-122小時、117-127小時、122-132小時、127-137小時、132-142小時、137-147小時、142-152小時、147-157小時、152-162小時、157-167小時、162-172小時、167-177小時、172-182小時、177-187小時、162-172小時、167-177小時、182-192小時、187-197小時、192-202小時、197-207小時、202-212小時、207-217小時、212-222小時、217-227小時、222-232小時、227-237小時、232-242小時、237-247小時或242-252小時。強化培養基中的放置還可比標準或減料培養基中的週期少0.5小時,比標準或減料培養基中的週期少1小時,和比標準或減料培養基中的週期少1和240小時之間的全部時段。或者,代替在標準或減料培養基中進行週期的剩餘部分,可將培植體在強化培養基上放置一段時間然後在標準或減料培養基上培養完整的週期時間(即10-120天,未因花在強化培養基的時間而減少)。 不含有細胞分裂素或含有實質性降低的細胞分裂素的培養基可以是減料b-9培養基、減料CW2培養基、減料b-10培養基、減料b-11培養基、減料b-12c培養基、減料b-1培養基、減料b-4培養基、減料b-6培養基、減料CW1培養基、減料CW3培養基、減料CW4培養基、減料CW5培養基、減料CW6培養基、減料B-9N2培養基、減料B-12C CPPU培養基、減料B-12C DPU培養基,其或者除去所有的細胞分裂素及/或生長素,或者至少一種細胞分裂素及/或生長素的量可降低1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%、1-10%、5-15%、10-20%、15-25%、20-30%、25-35%、30-40%、35-45%、40-50%、45-55%、50-60%、55-65%、60-70%、65-75%、70-80%、75-85%、80-90%、85-95%、90-100%、3-6%、7-17%、12-22%、17-27%、22-32%、27-37%、32-42%、37-47%、42-52%、47-57%、52-62%、57-67%、62-72%、67-77%、72-82%、77-87%、82-92%或87-97%。減料培養基的非限制性實例包括(表格未顯示無細胞分裂素或生長素的具體例):培養基B-9N2 培養基B-12C CPPU 培養基B-12C DPU 或者,可以將上面提到的細胞分裂素用類似或更高程度的較弱細胞分裂素替換。例示性的較弱細胞分裂素包括玉米素和激動素。 可以藉由瓊脂的細菌性變色或可見的表面污染鑑別污染的管。這些培植體可在選擇的b-12c-iv培養基上保留3-4個10-120天的週期(通常21天的週期)或者如在強化步驟中修改的(強化培養基的時段為0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小時,在轉移到標準的或減料的培養基以進行10-120天的週期的剩餘部分或進行完整的10-120天的週期之前)。置於強化培養基中的另外的時段包括在0.1和240小時之間的任意時間,且可包括但不限於:0.1-0.5小時、0.3-2.5小時、2.5-6小時、1-10小時、5-15小時、10-20小時、15-25小時、20-30小時、25-35小時、30-40小時、35-45小時、40-50小時、45-55小時、50-60小時、55-65小時、60-70小時、65-75小時、70-80小時、75-85小時、80-90小時、85-95小時、90-100小時、95-105小時、100-110小時、105-115小時、110-120小時、115-125小時、120-130小時、125-135小時、130-140小時、135-145小時、140-150小時、145-155小時、150-160小時、155-165小時、160-170小時、165-175小時、170-180小時、175-185小時、180-190小時、185-195小時、190-200小時、195-205小時、200-210小時、205-215小時、210-220小時、215-225小時、220-230小時、225-235小時、230-240小時、235-245小時、240-250小時、3-6小時、7-17小時、12-22小時、17-27小時、22-32小時、27-37小時、32-42小時、37-47小時、42-52小時、47-57小時、52-62小時、57-67小時、62-72小時、67-77小時、72-82小時、77-87小時、82-92小時、87-97小時、92-102小時、97-107小時、102-112小時、107-117小時、112-122小時、117-127小時、122-132小時、127-137小時、132-142小時、137-147小時、142-152小時、147-157小時、152-162小時、157-167小時、162-172小時、167-177小時、172-182小時、177-187小時、162-172小時、167-177小時、182-192小時、187-197小時、192-202小時、197-207小時、202-212小時、207-217小時、212-222小時、217-227小時、222-232小時、227-237小時、232-242小時、237-247小時或242-252小時。強化培養基中的放置還可比標準或減料培養基中的週期少0.5小時,比標準或減料培養基中的週期少1小時,以及比標準或減料培養基中的週期少1和240小時之間的任意的時段。如果培植體在特定的強化培養基類型(例如,b-12c)上培養,當轉移到標準或減料培養基時,所述標準或減料培養基可具有相同的類型(例如,標準或減料b-12c)或不同的類型(例如,標準或減料CW1、CW2、CW6、b6、b9等)。 在本文揭示的特定具體例中,培養時段為小於12週、小於9週或小於6週。 如果增殖產生,可將培植體在第三個週期之後從培養基上取出。如果增殖未產生或者未以顯著程度產生,可將培植體保留在培養基進行第四個週期。 接下來可將活的苗轉移到階段2培養基(如果在前面的步驟中使用標準b-12c,或者如果使用基本的強化步驟,則轉移到階段3培養基),例如pH為5.7的b-9、CW1、CW2、CW3、CW4、CW5、CW6、b-6、B-9N2、B-12C CPPU或B-12C DPU。可將該培養物保留在該階段2培養基上,直到分離到新管和進一步擴展獲得期望數量的苗。一般地,時間的範圍包括10-120天的週期(通常14-21天的週期),在該時間內,將培養物安排為經過另一輪增殖或轉移到階段3或階段4培養基,例如,pH為5.7的b-10-iv或b-11-iv以進一步增殖。 在本文中公開的具體的具體例中,培養時間段為小於12週、小於9週或小於6週。 或者,在轉移到相同或不同類型的標準或減料培養基以進行10-120天的週期的剩餘部分或完整的10-120天的週期之前,還可將活的苗在強化b-9、CW1、CW2、CW3、CW4、CW5、CW6、b-6、B-9N2、B-12C CPPU、B-12C DPU培養基上放置0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小時的時段。置於強化培養基中的另外的時段包括0.1和240小時之間的任意時段,且可包括但不限於,0.1-0.5小時、0.3-2.5小時、2.5-6小時、1-10小時、5-15小時、10-20小時、15-25小時、20-30小時、25-35小時、30-40小時、35-45小時、40-50小時、45-55小時、50-60小時、55-65小時、60-70小時、65-75小時、70-80小時、75-85小時、80-90小時、85-95小時、90-100小時、95-105小時、100-110小時、105-115小時、110-120小時、115-125小時、120-130小時、125-135小時、130-140小時、135-145小時、140-150小時、145-155小時、150-160小時、155-165小時、160-170小時、165-175小時、170-180小時、175-185小時、180-190小時、185-195小時、190-200小時、195-205小時、200-210小時、205-215小時、210-220小時、215-225小時、220-230小時、225-235小時、230-240小時、235-245小時、240-250小時、3-6小時、7-17小時、12-22小時、17-27小時、22-32小時、27-37小時、32-42小時、37-47小時、42-52小時、47-57小時、52-62小時、57-67小時、62-72小時、67-77小時、72-82小時、77-87小時、82-92小時、87-97小時、92-102小時、97-107小時、102-112小時、107-117小時、112-122小時、117-127小時、122-132小時、127-137小時、132-142小時、137-147小時、142-152小時、147-157小時、152-162小時、157-167小時、162-172小時、167-177小時、172-182小時、177-187小時、162-172小時、167-177小時、182-192小時、187-197小時、192-202小時、197-207小時、202-212小時、207-217小時、212-222小時、217-227小時、222-232小時、227-237小時、232-242小時、237-247小時或242-252小時。強化培養基中的放置還可比標準或減料培養基中的週期少0.5小時,比標準或減料培養基中的週期少1小時,以及比標準或減料培養基中的週期少1和240小時之間的任意時段。 一般地,每個增殖週期可獲得每管1-10個苗。 在從增殖過程移出後,可將苗轉移到含有階段3、階段4或階段5培養基的小組織培養箱(稱為「magenta箱」)中10-120天(通常14-21天),在該實例中,在pH為5.7的BR-2進行10-120天(通常14-21天)或在pH為5.7的Amel進行10-120天(通常14-21天)。如上,可將苗在強化培養基中放置較短的時間隨後在標準或減料培養基放置10-120天的週期的剩餘部分或完整的10-120天的週期。 在本文中揭示的特定具體例中,培養時間為小於12週、小於9週或小於6週。 如可以被本領域的通常技術人員理解的,當使用強化培養基時,由於之後標準或減料培養基的使用,強化培養基的使用提高了特定過程中的培養基階段的數量。如果僅在一個階段使用強化培養基,該過程一般擴大1個培養基階段。如果在兩個階段使用強化培養基,該過程一般擴大2個培養基階段。如果在三個階段使用強化培養基,該過程一般擴大3個培養基階段等。 或者,也可以使用下列步驟(階段1、階段2、階段3等,培養基係如文中別處所定義):隨後可將各個培植體置於管中的階段1培養基(15-25 mL)上,並將管置於處在溫度從65℉-70℉和全光譜光度36-90 μmole/m2/s2的受調控清潔生長室。階段1培養基可以是pH為5.7的標準b-12c-iv或強化b-12c-iv培養基。如果置於標準b-12c-iv,每10-120天(一般每21天)可將培植體轉移到新鮮的b-12c-iv培養基,而將污染的管丟棄。如果置於強化b-12c-iv培養基,可將培植體在強化培養基上保留0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小時,並且隨後轉移到沒有強化組分的培養基(標準或減料)以進行10-120天的週期的剩餘部分或完整的10-120天的週期。置於強化培養基中的另外時段包括0.1和240小時之間的任意時段,且可包括但不限於,0.1-0.5小時、0.3-2.5小時、2.5-6小時、1-10小時、5-15小時、10-20小時、15-25小時、20-30小時、25-35小時、30-40小時、35-45小時、40-50小時、45-55小時、50-60小時、55-65小時、60-70小時、65-75小時、70-80小時、75-85小時、80-90小時、85-95小時、90-100小時、95-105小時、100-110小時、105-115小時、110-120小時、115-125小時、120-130小時、125-135小時、130-140小時、135-145小時、140-150小時、145-155小時、150-160小時、155-165小時、160-170小時、165-175小時、170-180小時、175-185小時、180-190小時、185-195小時、190-200小時、195-205小時、200-210小時、205-215小時、210-220小時、215-225小時、220-230小時、225-235小時、230-240小時、235-245小時、240-250小時、3-6小時、7-17小時、12-22小時、17-27小時、22-32小時、27-37小時、32-42小時、37-47小時、42-52小時、47-57小時、52-62小時、57-67小時、62-72小時、67-77小時、72-82小時、77-87小時、82-92小時、87-97小時、92-102小時、97-107小時、102-112小時、107-117小時、112-122小時、117-127小時、122-132小時、127-137小時、132-142小時、137-147小時、142-152小時、147-157小時、152-162小時、157-167小時、162-172小時、167-177小時、172-182小時、177-187小時、162-172小時、167-177小時、182-192小時、187-197小時、192-202小時、197-207小時、202-212小時、207-217小時、212-222小時、217-227小時、222-232小時、227-237小時、232-242小時、237-247小時或242-252小時。強化培養基中的放置還可比標準或減料培養基中的週期少0.5小時,比標準或減料培養基中的週期少1小時,以及比標準或減料培養基中的週期少1和240小時之間的任意時段。這些培植體可在b-12c-iv培養基或強化b-12c-iv培養基上保留2個10-120天的週期(通常21天的週期)。在週期之間,可以移除多餘的鞘。在轉移到第三個週期時,可將培植體轉移到階段2培養基或階段3培養基(根據是否使用強化步驟),在本實例中,用7 g/L而非上面提供的5.5 g/L的角叉膠補充的標準b-12c-iv或者用7 g/L而非上面提供的5.5 g/L的角叉膠補充的強化b-12c-iv進行0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小時,隨後轉移到標準或減料b-12c-iv。置於強化培養基中的另外的時段包括在0.1和240小時之間的任意時段,且可包括但不限於,0.1-0.5小時、0.3-2.5小時、2.5-6小時、1-10小時、5-15小時、10-20小時、15-25小時、20-30小時、25-35小時、30-40小時、35-45小時、40-50小時、45-55小時、50-60小時、55-65小時、60-70小時、65-75小時、70-80小時、75-85小時、80-90小時、85-95小時、90-100小時、95-105小時、100-110小時、105-115小時、110-120小時、115-125小時、120-130小時、125-135小時、130-140小時、135-145小時、140-150小時、145-155小時、150-160小時、155-165小時、160-170小時、165-175小時、170-180小時、175-185小時、180-190小時、185-195小時、190-200小時、195-205小時、200-210小時、205-215小時、210-220小時、215-225小時、220-230小時、225-235小時、230-240小時、235-245小時、240-250小時、3-6小時、7-17小時、12-22小時、17-27小時、22-32小時、27-37小時、32-42小時、37-47小時、42-52小時、47-57小時、52-62小時、57-67小時、62-72小時、67-77小時、72-82小時、77-87小時、82-92小時、87-97小時、92-102小時、97-107小時、102-112小時、107-117小時、112-122小時、117-127小時、122-132小時、127-137小時、132-142小時、137-147小時、142-152小時、147-157小時、152-162小時、157-167小時、162-172小時、167-177小時、172-182小時、177-187小時、162-172小時、167-177小時、182-192小時、187-197小時、192-202小時、197-207小時、202-212小時、207-217小時、212-222小時、217-227小時、222-232小時、227-237小時、232-242小時、237-247小時或242-252小時。強化培養基中的放置還可比標準或減料培養基中的週期少0.5小時,比標準或減料培養基中的週期少1小時,以及比標準或減料培養基中的週期少1和240小時之間的任意時段。第三個週期之後,可以清理培植體。可將培植體在用7 g/L而非上面提供的5.5 g/L的角叉膠補充的b-12c-iv上保留10-120天的週期(通常21天的週期),直到觀察到多個苗。可以在3-15個月內觀察到多個苗。當使用多個週期時,可將外置體在標準的培養基上培養所有週期,在強化培養基隨後在標準培養基上培養所有週期或者在強化培養基隨後在減料培養基上培養所有週期。或者,可使培植體在整個週期中接受任意組合和順序的一種或多種處理。 在本文揭示的特定具體例中,培養時間為小於12週、小於9週或小於6週。 一旦培植體顯示出多個苗,可以將其或者維持在產生苗時的當前的培養基上(每10-120天轉移到新鮮的培養基)或者轉移到後續的培養基。非限制性的後續培養基包括但不限於,pH為5.7的b-9培養基、CW1培養基、CW2培養基、CW3培養基、CW4培養基、CW5培養基、CW6培養基或b-6培養基,或它們的強化版本,隨後轉移到標準或減料培養基。可以將培養物保留在當前的或後續的培養基上,直到分離到新管和進一步擴展獲得期望數量的苗。一般地,時間範圍包括10-120天的週期(通常21天的週期),在該週期之間可以安排培養物進行另一輪的增殖或轉移到下一個階段的培養基,例如「magenta箱」中pH為5.7的BR-2培養基10-120天(通常21天)或pH為5.7的Amel培養基10-120天(通常14-21天)。 本文揭示的特定具體例中,培養時間為小於12週、小於9週或小於6週。 在甚至更具體的非限制性具體例中,可以依據連續的段落[000198]-[0002-1]中描述的步驟在下列培養基(pH為5.5-5.7)中微體繁殖下列物種:大青籬竹(Arundinaria gigantea):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;巴苦竹(Bambusa balcoa):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;龍頭竹(Bambusa vulgaris):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;黃金間碧竹(Bambusa vulgaris‘Vitatta’):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;白綠竹:b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;馬甲竹(Bambusa tulda):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;勃氏甜龍竹(Dendrocalamus brandesii):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;馬來甜龍竹:b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;版納甜龍竹(Dendrocalamus hamiltoni):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;龍竹(Dendrocalamus giganteus):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;黃竹(Dendrocalamus membranaceus):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;印度實竹(Dendrocalamus strictus):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;菲律賓巨草竹(Gigantochloa aspera):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;小黑竹(Gigantochloa scortechini):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;瓜多竹(Guadua culeata):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;尼加拉瓜瓜多竹(Guadua aculeata‘Nicaragua’):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;抱葉瓜多竹(Guadua amplexifolia):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;狹葉瓜多竹(Guadua angustifolia):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;雙色狹葉瓜多竹(Guadua angustofolia bi-color):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;圓錐瓜多竹(Guadua paniculata):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;梨竹(Melocanna bambusoides):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;李海竹(Neohouzeaua dullooa(Teinostachyum)):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;蘆葦竹(Ochlandra travancorica):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;毛竹:b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;紫竹:b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;毛金竹(Phyllostachys nigra‘Henon’):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本;思勞竹(Schizostachyum lumampao):b-9-v、CW1-v、CW3-v、CW4-v、CW5-v、CW6-v、B-9N2-v、B-12C CPPU-v、B-12C DPU-v或其強化或減料版本。 在一些具體例中,所述方法包括使用本發明的生物反應器。在一些具體例中,所述方法包括使用本發明的架。在一些具體例中,所述方法包括使用本發明的生物反應器和架。在一些具體例中,當在微體繁殖中交替使用兩種或更多種上述培養基時,可以使用本文中描述的生物反應器,例如,當交替使用階段1和階段2培養基時,當交替使用階段3和階段4培養基時,和/或當交替使用階段1、階段2和階段3培養基時等。 (套組) 本發明還提供用於植物繁殖的套組。在一些具體例中,所述套組包括一種或多種本發明的培養基。在一些具體例中,所述套組包括植物物種的一種或多種培植體。 例如,套組可包括一種或多種芽誘導培養基、苗伸長/維持培養基、b-9-i培養基、b-9-ii培養基、b-9-iii培養基、b-9-iv培養基、b-9-v培養基、強化b-9-i培養基、強化b-9-ii培養基、強化b-9-iii培養基、強化b-9-iv培養基、強化b-9-v培養基、減料b-9-i培養基(下述減料培養基)、減料b-9-ii培養基、減料b-9-iii培養基、減料b-9-iv培養基、減料b-9-v培養基、CW2-i培養基、CW2-ii培養基、CW2-iii培養基、CW2-iv培養基、CW2-v培養基、強化CW2-i培養基、強化CW2-ii培養基、強化CW2-iii培養基、強化CW2-iv培養基、強化CW2-v培養基、減料CW2-i培養基、減料CW2-ii培養基、減料CW2-iii培養基、減料CW2-iv培養基、減料CW2-v培養基、b-10-i培養基、b-10-ii培養基、b-10-iii培養基、b-10-iv培養基、b-10-v培養基、強化b-10-i培養基、強化b-10-ii培養基、強化b-10-iii培養基、強化b-10-iv培養基、強化b-10-v培養基、減料b-10-i培養基、減料b-10-ii培養基、減料b-10-iii培養基、減料b-10-iv培養基、減料b-10-v培養基、b-11-i培養基、b-11-ii培養基、b-11-iii培養基、b-11-iv培養基、b-11-v培養基、強化b-11-i培養基、強化b-11-ii培養基、強化b-11-iii培養基、強化b-11-iv培養基、強化b-11-v培養基、減料b-11-i培養基、減料b-11-ii培養基、減料b-11-iii培養基、減料b-11-iv培養基、減料b-11-v培養基、b-12c-i培養基、b-12c-ii培養基、b-12c-iii培養基、b-12c-iv培養基、b-12c-v培養基、強化b-12c-i培養基、強化b-12c-ii培養基、強化b-12c-iii培養基、強化b-12c-iv培養基、強化b-12c-v培養基、減料b-12c-i培養基、減料b-12c-ii培養基、減料b-12c-iii培養基、減料b-12c-iv培養基、減料b-12c-v培養基、b-1-i培養基、b-1-ii培養基、b-1-iii培養基、b-1-iv培養基、b-1-v培養基、強化b-1-i培養基、強化b-1-ii培養基、強化b-1-iii培養基、強化b-1-iv培養基、強化b-1-v培養基、減料b-1-i培養基、減料b-1-ii培養基、減料b-1-iii培養基、減料b-1-iv培養基、減料b-1-v培養基、b-4-i培養基、b-4-ii培養基、b-4-iii培養基、b-4-iv培養基、b-4-v培養基、強化b-4-i培養基、強化b-4-ii培養基、強化b-4-iii培養基、強化b-4-iv培養基、強化b-4-v培養基、減料b-4-i培養基、減料b-4-ii培養基、減料b-4-iii培養基、減料b-4-iv培養基、減料b-4-v培養基、b-6-i培養基、b-6-ii培養基、b-6-iii培養基、b-6-iv培養基、b-6-v培養基、強化b-6-i培養基、強化b-6-ii培養基、強化b-6-iii培養基、強化b-6-iv培養基、強化b-6-v培養基、減料b-6-i培養基、減料b-6-ii培養基、減料b-6-iii培養基、減料b-6-iv培養基、減料b-6-v培養基、CW1-i培養基、CW1-ii培養基、CW1-iii培養基、CW1-iv培養基、CW1-v培養基、強化CW1-i培養基、強化CW1-ii培養基、強化CW1-iii培養基、強化CW1-iv培養基、強化CW1-v培養基、減料CW1-i培養基、減料CW1-ii培養基、減料CW1-iii培養基、減料CW1-iv培養基、減料CW1-v培養基、CW3-i培養基、CW3-ii培養基、CW3-iii培養基、CW3-iv培養基、CW3-v培養基、強化CW3-i培養基、強化CW3-ii培養基、強化CW3-iii培養基、強化CW3-iv培養基、強化CW3-v培養基、減料CW3-i培養基、減料CW3-ii培養基、減料CW3-iii培養基、減料CW3-iv培養基、減料CW3-v培養基、CW4-i培養基、CW4-ii培養基、CW4-iii培養基、CW4-iv培養基、CW4-v培養基、強化CW4-i培養基、強化CW4-ii培養基、強化CW4-iii培養基、強化CW4-iv培養基、強化CW4-v培養基、減料CW4-i培養基、減料CW4-ii培養基、減料CW4-iii培養基、減料CW4-iv培養基、減料CW4-v培養基、CW5-i培養基、CW5-ii培養基、CW5-iii培養基、CW5-iv培養基、CW5-v培養基、強化CW5-i培養基、強化CW5-ii培養基、強化CW5-iii培養基、強化CW5-iv培養基、強化CW5-v培養基、減料CW5-i培養基、減料CW5-ii培養基、減料CW5-iii培養基、減料CW5-iv培養基、減料CW5-v培養基、CW6-i培養基、CW6-ii培養基、CW6-iii培養基、CW6-iv培養基、CW6-v培養基、強化CW6-i培養基、強化CW6-ii培養基、強化CW6-iii培養基、強化CW6-iv培養基、強化CW6-v培養基、減料CW6-i培養基、減料CW6-ii培養基、減料CW6-iii培養基、減料CW6-iv培養基、減料CW6-v培養基、B-9N2-i培養基、B-9N2-ii培養基、B-9N2-iii培養基、B-9N2-iv培養基、B-9N2-v培養基、強化B-9N2-i培養基、強化B-9N2-ii培養基、強化B-9N2-iii培養基、強化B-9N2-iv培養基、強化B-9N2-v培養基、減料B-9N2-i培養基、減料B-9N2-ii培養基、減料的B-9N2-iii培養基、減料B-9N2-iv培養基、減料B-9N2-v培養基、B-12C CPPU-i培養基、B-12C CPPU-ii培養基、B-12C CPPU-iii培養基、B-12C CPPU-iv培養基、B-12C CPPU-v培養基、強化B-12C CPPU-i培養基、強化B-12C CPPU-ii培養基、強化B-12C CPPU-iii培養基、強化B-12C CPPU-iv培養基、強化B-12C CPPU-v培養基、減料B-12C CPPU-i培養基、減料B-12C CPPU-ii培養基、減料B-12C CPPU-iii培養基、減料B-12C CPPU-iv培養基、減料B-12C CPPU-v培養基、B-12C DPU-i培養基、B-12C DPU-ii培養基、B-12C DPU-iii培養基、B-12C DPU-iv培養基、B-12C DPU-v培養基、強化B-12C DPU-i培養基、強化B-12C DPU-ii培養基、強化B-12C DPU-iii培養基、強化B-12C DPU-iv培養基、強化B-12C DPU-v培養基、減料B-12C DPU-i培養基、減料B-12C DPU-ii培養基、減料B-12C DPU-iii培養基、減料B-12C DPU-iv培養基、減料B-12C DPU-v培養基、Br-2-i培養基、Br-2-ii培養基、Br-2-iii培養基、Br-2-iv培養基、Br-2-v培養基、強化Br-2-i培養基、強化Br-2-ii培養基、強化Br-2-iii培養基、強化Br-2-iv培養基、強化Br-2-v培養基、減料Br-2-i培養基、減料Br-2-ii培養基、減料Br-2-iii培養基、減料Br-2-iv培養基、減料Br-2-v培養基、Ech-i培養基、Ech-ii培養基、Ech-iii培養基、Ech-iv培養基、Ech-v培養基、強化Ech-i培養基、強化Ech-ii培養基、強化Ech-iii培養基、強化Ech-iv培養基、強化Ech-v培養基、減料Ech-i培養基、減料Ech-ii培養基、減料Ech-iii培養基、減料Ech-iv培養基、減料Ech-v培養基、Amel-i培養基、Amel-ii培養基、Amel-iii培養基、Amel-iv培養基、Amel-v培養基、強化Amel-i培養基、強化Amel-ii培養基、強化Amel-iii培養基、強化Amel-iv培養基、強化Amel-v培養基、減料Amel-i培養基、減料Amel-ii培養基、減料Amel-iii培養基、減料Amel-iv培養基、及/或減料Amel-v培養基。在另外的具體例中,所述套組可包含一種或多種用於組織培養過程的容器,其包括但不限於,管、罐、箱、壺、杯、無菌袋技術、生物反應器、暫時的浸漬器皿等。在另一個具體例中,所述套組可包含用於竹的組織培養的說明書。在另一個具體例中,所述套組包含前述的組合。在相同或不同的容器中,可以發現各種套組的元件。此外,當供應套組時,可將培養基的不同組分包裝在分別的容器中並在使用前立即混合。如此分別包裝組分可允許長期的儲存,而不損失活性組分的功能。或者,可以預先混合地提供培養基。 藉由下列不應理解為限制的實例進一步說明本發明。所有本應用中引用的所有參考文獻、專利和公開專利申請的內容以及附圖,以引用方式全部併入本文以用於所有目的。 [實施例] (實施例1) 毛竹以階段1至階段5培養基的微體繁殖-I 以約3月齡和約3年齡之間的竹植物開始,將來自側苗剛破鞘的有節莖的節用作培植體。將每個節段切成3-5毫米的段及完整的苗。將一些培植體,包括取自1年或更長時間的有節莖的培植體,在70%的異丙醇的罐中搖動3秒以預先沖洗,隨後在流動的自來水中沖洗1分鐘。其他的培植體不預先沖洗。 將外鞘剝去並丟棄,而且將剩餘的節段部分置於10%的漂白溶液中。將漂白溶液中的培植體在可調速Lab Rotators,Barnstead/Lab line orbital Shaker(模型號KS 260)搖動臺上以每分鐘6-9轉放置1小時。對於一些培植體,包括取自從1年齡或更長的有節莖者,修改步驟而於10%的漂白溶液加入數滴Tween 20並將該培植體浸漬45分鐘而非1小時。隨後將所述培植體放置於1%的漂白溶液中,並放回到搖動臺上30分鐘。隨後重複該1%的漂白溶液步驟並可隨後用無菌的蒸餾水沖洗。 隨後將單個的培植體置於管中階段1培養基上(15-25 mL),並且將該管置於溫度從65℉-70℉和全光譜光度36-90 μmole/m2/s2的受調控清潔生長室。在本實施例中,階段1培養基是強化b-12c-iv或如實施例10中描述。這些外植體在強化b-12c-iv培養基上保留2個8-118天的週期(通常12天的週期)。在週期之間將多餘的鞘移除。當轉移到第三個週期時,培植體被轉移到階段2培養基,在本實施例中,是用0.5-3 g/L(最佳是2 g/L)的酪蛋白羥基化物補充的強化b-12c-iv。在第三個週期之後,清理該培植體。將培植體保留在用0.5-3 g/L的酪蛋白羥基化物補充的強化b-12c-iv上進行8-118天的週期(通常12天的週期),直到觀察到多個苗。一般在3-15個月內觀察到多個苗。 一旦所述培植體顯示多個苗,將其轉移到在本實施例中是pH為5.7的減料B-9N2-iv的階段3培養基進行10-120天的週期(通常21天的週期)。將苗在該階段3培養基和在本實施例中為減料B-9N2-iv液體(除去瓊脂)的階段4培養基之間交替以用於連續交替的10-120天的週期(通常21天的週期),直到通過分離到新管和進一步的擴展獲得期望數量的苗。一般每個繁殖週期每管獲得1-10個苗。隨後將該苗置於階段5培養基,在本實施例中是pH 5.7標準Amel-iv進行10-120天(通常14-21天)。 (實施例2) 毛竹以階段1至階段5培養基微體繁殖-II 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將單個培植體置於管中階段1培養基上(15-25 mL),並且將該管置於溫度從65℉-70℉和全光譜光度36-90 μmole/m2/s2的受調控清潔生長室。在本實施例中,階段1培養基是強化b-12c-iii或如實施例10中描述。這些培植體在強化b-12c-iii培養基上保留2個10-120天的週期(通常14天的週期)(注意:在本實施例中,儘管培養基強化,時間並未縮短,因為b-12c-iii被視為弱強化培養基)。在週期之間移除多餘的鞘。當轉移到第三個週期時,將培植體轉移到階段2培養基,在本實施例中是減料B-9N2-iii。在1或2個10-120天的週期(一般14天的週期)之後,清理該培植體並將其放回到階段1培養基以進行額外的1或2個10-120天的週期(通常14天的週期)。將該培植體保留在交替的階段1和階段2培養基上,直到觀察到多個苗。一般在3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦培植體顯示多個苗,其被轉移到階段3培養基,在本實施例中是pH為5.7的減料B-9N2-iii進行10-120天的週期(通常21天的週期)。在該階段3培養基和在本實施例中為減料B-9N2-iii液體(除去瓊脂)的階段4培養基之間,以連續交替的10-120天週期(通常21天的週期)交替苗,直到分離到新管並進一步擴展觀察到期望數量的苗。一般每個增殖週期每管獲得1-10個苗。隨後將苗置於階段5培養基,在本實施例中是pH為5.7的標準Amel-iv進行10-120天(通常14-21天)。 (實施例3) 白綠竹以階段1、階段2和階段3培養基微體繁殖 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將單個培植體置於管中階段1培養基上(15-25 mL),並且將該管置於溫度從65℉-70℉和全光譜光度36-90 μmole/m2/s2的受調控清潔生長室。在本實施例中,階段1培養基是強化b-12c-ii或如實施例10中描述。這些培植體在強化b-12c-ii培養基上保留2個8-118天的週期(通常12天的週期)。在週期之間除去多餘的鞘。將培植體保留在迴圈的強化b-12c-ii培養基上,直到觀察到多個苗。一般3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦培植體顯示多個苗,其被轉移到階段2培養基,在本實施例中為pH為5.7的減料b-10-iv,10-120天的週期(通常21天的週期)。在減料b-10-iv培養基上以連續交替的10-120天的週期(通常21天的週期)保留苗,直到分離到新管並進一步擴展觀察到期望數量的苗。一般每個增殖週期每管獲得1-10個苗。隨後將苗置於階段3培養基,在本實施例中,是pH為5.7的標準Amel-iv進行10-120天(通常14-21天)。 (實施例4) 毛竹以階段1至階段4培養基微體繁殖 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將單個培植體置於管中階段1培養基上(15-25 mL),並且將該管置於溫度從65℉-70℉和全光譜光度200-500 μmole/m2/s2的受調控清潔生長室。在本實施例中,階段1培養基是強化b-12c-iv或如實施例10中描述。這些培植體在強化b-12c-iv培養基上保留2個8-118天的週期(通常12天的週期)。在週期之間除去多餘的鞘。將培植體保留在迴圈的強化b-12c-ii培養基上,直到觀察到多個苗。一般3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦培植體顯示多個苗,其被轉移到階段2培養基,在本實施例中為pH為5.7的減料B-9N2-iv,10-120天的週期(通常21天的週期)。在該階段2培養基和在本實施例中為強化b-11-iv的階段3培養基之間,以連續交替的10-120天的週期(通常21天的週期)交替苗,直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。一般每個增殖週期每管獲得1-10個苗。隨後將苗置於階段4培養基,在本實施例中,是pH為5.7的標準Amel-iv進行10-120天(通常14-21天)。 (實施例5) 竹植物以階段1、階段2、階段3、階段4、階段5及/或階段6培養基微體繁殖 以3月齡和3年齡之間的竹植物開始,使用來自側苗剛破鞘的有節莖的節作為培植體。將每個節段切成3-5毫米的段及完整的苗。將外鞘剝去並丟棄,剩餘節段部分的塊置入終濃度為0.6%氫氧化鈉的10%漂白溶液中。將該漂白溶液中的培植體在可調速Lab Rotators,Barnstead/Lab line orbital Shaker(模型號KS 260)搖動臺上以每分鐘6-9轉放置1小時。隨後將培植體置於終濃度為0.06%氫氧化鈉的1%漂白溶液中,並放回到搖動臺上30分鐘。隨後重複該1%的漂白溶液步驟。 隨後將單個培植體置於管中階段1培養基上(15-25 mL),並且將該管置於溫度從65℉-70℉和全光譜光度36-90 μmole/m2/s2的受調控清潔生長室。本實施例中,起始的階段1培養基是pH為5.7的強化b-12c-iv。將培植體在強化b-12c-iv培養基上保留1-36小時,之後轉移到在本實施例中為減料b-12c-iv培養基的階段2培養基,進行10-120天(通常21天)週期的剩餘部分。 將污染的管丟棄。可以瓊脂的細菌性變色或可見的表面污染鑑別污染的管。這些培植體經歷3-4次階段1/2培養基的交替,每次包括10-120天的週期(通常21天的週期)。對每個週期(階段1和階段2培養基之間的交替),培植體的亞組在階段1強化b-12c-iv培養基上1-36小時,隨後轉移到階段2減料b-12c-iv培養基進行剩餘的週期。其他的培植體在強化/減料方案的培養和標準b-12c-iv培養基的培養之間交替(階段1、階段2和階段3培養基之間的交替)。或者,培植體的第一10-120天的週期可以在標準b-12c-iv培養基中開始該過程,並隨後轉移到強化/減料方案進行下面的一個或多個週期。 如果增殖發生,將培植體在第三個週期之後從培養基取出。如果未發生增殖或未以顯著程度發生增殖,將培植體保留在培養基上進行第四個週期。基於特定培植體之前處理和處理參數(在強化/減料上或在強化/減料和標準之間交替的進行所有週期),選擇強化/減料或標準培養基。 接下來將活的苗轉移到階段3或階段4培養基(根據之前的處理),在本實施例中是pH為5.7的標準b-9-iv。將培養物保留在b-9-iv培養基上,直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。一般地,時間的範圍包括10-120天的週期(通常14-21天的週期),在週期之間將培養物安排為經過另一輪的階段3或階段4培養基中的增殖,或轉移到階段4或階段5培養基,在本實施例中是pH為5.7的標準b-10-iv,以進一步增殖。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。 在從增殖過程移出之後,將苗轉移到含有階段5或階段6培養基,在本實施例中是pH為5.7的標準BR-2-iv的小組織培養箱(稱為「magenta箱」)進行10-120天(通常14-21天)。 (實施例6) 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將培植體轉移到含有階段1培養基的罐,在本實施例中,階段1培養基是pH為5.7的標準b-12c-iv(液體;30-40 mL),在溫度從65℉-70℉和全光譜光度36-90 μmole/m2/s2的受調控清潔生長室中。每10-120天(通常每21天)將該培植體轉移到新鮮的標準的b-12c-iv培養基,而丟棄污染的管。藉由瓊脂的細菌性變色或可見的表面污染鑑別污染的管。這些培植體在標準b-12c-iv培養基上保留3-4個10-120天的週期(通常21天的週期)。 隨後將培養物轉移到階段2培養基上,在本實施例中,是提供每分鐘6-9轉旋轉架上罐中的強化b-11-iv(液體)。將該培養物在pH為5.7的強化b-11-iv培養基上保留0.5-12小時,並隨後轉移到階段3的減料b-12c-iv培養基上進行10-120天的週期(通常14天的週期)的剩餘部分,直到分離到新罐並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每罐可獲得1-15個苗。隨後將苗置於在本實施例中是pH為6的標準Ech-iv的階段4培養基上10-120天(通常14-21天)。 (實施例7) 如實施例1中選擇培植體並對其消毒。隨後將該培植體轉移到含有階段1培養基的管中,在本實施例中,所述階段1培養基是強化b-12c-iv,放置24-48小時,隨後將培養物轉移到階段2的減料b-12c-iv培養基10-21天(一般為14)。 隨後將苗轉移到階段3培養基,在本實施例中,是magenta箱中的強化b-9-iv(40-50 mL)。在強化b-9-iv培養基上保留12-36小時,隨後轉移到階段4減料b-9-iv培養基或減料CW-2-iv培養基進行10-120天的週期(通常14天的週期)的剩餘部分,直到分離到新的箱並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每箱可獲得1-20個苗。隨後將苗置於在本實施例中是強化BR-2-iv的階段5培養基上5-10小時,接著轉移到階段6減料BR-2-iv進行10-120天(通常14-21天)週期的剩餘部分。 (實施例8) 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將該培植體轉移到含有在本實施例中是pH為5.7的強化b-12c-ii的階段1培養基的管。將培植體在強化b-12c-ii培養基上保留3-18小時,隨後轉移到標準b-12c-iv培養基上10-21天(通常14天)。在強化b-12c-ii中3-18小時,隨後在標準b-12c-iv中10-21天,重複該迴圈直到培植體開始增殖。隨後將苗轉移到在本實施例中是pH為5.5的標準b-1-iv的階段3培養基進行10-120天的週期(通常21天的週期),直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將苗置於在本實施例中pH為5.7的強化Br-2-iv的階段4培養基中1-10小時,隨後在標準Br-2-iv中14-21天。 (實施例9) 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將培植體置於含有在本實施例中是強化b-12c-iv的階段1培養基的管中1-24小時。隨後將苗轉移到在本實施例中是標準b-10-iv培養基的階段2培養基中10-120天(一般為14)。持續階段1到階段2培養基的交替直到培植體開始增殖。一旦開始增殖,將苗轉移到pH為5.5的標準b-4-iv培養基中進行10-120天的週期(通常21天的週期),直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將苗置於在本實施例中是pH為5.7的強化Br-2-iv的階段4培養基中1-10小時,隨後在階段5培養基,標準Amel-iv中進行10-120天(通常14-21天)。 (實施例10) 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將培植體轉移至含有階段1培養基的管中,在本實施例中是如實施例1中描述的標準b-12c-iv培養基。隨後將苗轉移到在本實施例中是pH為5.5的強化b-9-iv的階段2培養基中4-24小時。在強化b-9-iv培養基中培養4-24小時之後,將苗置於階段3標準b-9-iv培養基中10-120天(通常21天)。重複強化和標準b-9-iv培養基之間的交替,直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將苗置於在本實施例中是pH為5.7的Amel-iv的階段4培養基中10-120天(通常14-21天)。 (實施例11) 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將培植體轉移至含有階段1培養基的箱中,在本實施例中是標準b-10-iv(40-50 mL)。將苗保留在交替的標準b-10-iv培養基(10-120天的週期(通常21天的週期))、階段2強化b-10-iv培養基(1-10小時)和階段3減料b-10-iv培養基(10-120天的週期(通常10天的週期)),直到分離到新的箱並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每箱可獲得1-20個苗。隨後將苗置於在本實施例中是pH為5.7的Amel-iv的階段4培養基中10-120天(通常14-21天)。 (實施例12) 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將培植體轉移至含有在本實施例中是強化b-12c-i的階段1培養基的管中1-24小時,之後在階段2減料b-10-i中以10-21天(一般為14)進行3-4個週期。然後將苗轉移到在本實施例中是pH為5.5的強化b-9-iv的階段3培養基中1-5小時,之後轉移到階段4的標準b-9-iv培養基進行10-120天的週期(通常21天的週期),直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。還可使用pH為5.5的交替的強化和標準或減料B-6培養基。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將苗置於在本實施例中是pH為5.7的Amel-iv的階段5培養基中10-120天(通常14-21天)。 (實施例13) 如實施例1選擇培植體並對其消毒。隨後將培植體轉移至含有階段1培養基的管中,在本實施例中,階段1培養基是如實施例1中描述的標準的b-12c-iv。隨後將培植體轉移至在本實施例中是pH為5.5的強化b-10-iv的階段2培養基0.5-3小時,之後在作為階段3培養基的標準b-10-iv培養基中進行10-120天的週期(通常21天的週期)。重複該強化到標準b-10-iv週期,直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將苗置於在本實施例中是pH為5.7的標準的Amel-iv的階段3培養基中10-120天(通常14-21天)。 (實施例14) 以3月齡和3年齡之間的竹植物作為開始,使用來自側苗剛破鞘的有節莖的節作為培植體。將每個節段切成3-5毫米的段及完整的苗。將一些培植體,包括取自1年或更長時間的有節莖的培植體,在70%的異丙醇的罐中搖動3秒以預先沖洗,隨後將它們在流動的自來水中沖洗1分鐘。不預先沖洗其他的培植體。 將外鞘剝去並丟棄,且將剩餘節段部分置入10%的漂白溶液中。將該漂白溶液中的培植體在可調速Lab Rotators,Barnstead/Lab line orbital Shaker(模型號KS 260)搖動臺上以每分鐘6-9轉放置1小時。對於包括取自1年齡或更大齡有節莖的培植體,於10%的漂白溶液加入數滴Tween 20,並修改所述步驟將該培植體浸漬45分鐘而非1小時。隨後將所述培植體放置於1%的漂白溶液中,並放回到搖動臺上30分鐘。隨後重複該1%的漂白溶液步驟。 隨後將單個培植體置於管中階段1培養基上(15-25 mL),並且將該管置於溫度從65℉-70℉和全光譜光度36-90 μmole/m2/s2的受調控清潔生長室。在本實施例中,階段1培養基是pH為5.7的標準b-12c-iv。每10-120天(通常每21天)將該外植體轉移到新鮮的b-12c-iv培養基,而丟棄污染的管。這些培植體在b-12c-iv培養基上保留2個10-120天的週期(通常21天的週期)。在週期之間除去多餘的鞘。在轉移到第三個週期時,將該培植體轉移到在本實施例中為用7 g/L的角叉膠(而非上面提供的5.5 g/L)補充的強化b-12c-i的階段2培養基中0.5-10小時,之後在標準b-12c-iv中放置10-120天(通常為21)。在第三個週期之後,清理該培植體。將該培植體保留在這些交替的階段2和階段3培養基上一定的時間,直到觀察到多個苗。可以在3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦培植體顯示多個苗,或者將其維持在其交替的階段2培養基/階段3培養基上,或者將其轉移到在本實施例中pH為5.7時使用的標準b-9-iv的階段4培養基。除了使用b-9培養基之一之外,還可以使用pH為5.7的CW1培養基。在階段2/3培養基或階段4培養基上保持該培養物,直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。一般地,時間的範圍包括10-120天的週期(通常21天的週期),在週期之間將培養物安排為經過另一輪的增殖,或者轉移到階段4或在本實施例中是pH為5.7的標準BR-2-iv的階段5培養基中以在「magenta箱」中進行10-120天(通常21天)。 (實施例15) 如實施例10選擇培植體並對其消毒。隨後將培植體轉移到含有在本實施例中為強化b-12c-iv(液體;30-40 mL)的階段1培養基的罐中。這些培植體在強化b-12c-iv培養基上保留0.5-24小時,隨後在階段2減料b-12c-i中放置10-120天(通常為21)。將該過程重複2次。在週期之間除去多餘的鞘。 在轉移到第三個週期時,將培植體轉移到在本實施例中為用7 g/L的角叉膠(而非5.5 g/L)補充的標準b-12c-iv的階段3培養基中10-120天的週期(通常21天的週期)。在第三個週期之後,清理該培植體。將該培植體在用7 g/L的角叉膠補充的階段3標準的b-12c-iv中保持10-120天的週期(通常21天的週期),直到觀察的多個苗。可以在3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦培植體顯示多個苗,或者將其維持在其階段3培養基上,或者轉移到階段4培養基,在本實施例中,是提供每分鐘6-9轉的旋轉架上的罐中的pH為5.7的強化b-11-iv(液體)。苗在強化b-11-iv上保留0.5-24小時,之後轉移到階段5標準b-11-iv。該培養物在階段3或階段4/5培養基上保留10-120天的週期(通常14天的週期),直到分離到新罐並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每罐獲得1-15個苗。隨後將該苗置於階段4或階段6培養基中,在本實施例中是pH為6的強化Ech-iv,1-24小時。然後將苗轉移到階段5或階段7培養基(即,標準Ech-iv)中10-120天(通常21天)。 (實施例16) 如實施例10選擇培植體並對其消毒。隨後將該培植體轉移到含有在本實施例中為強化b-12c-iv的階段1培養基的管中。這些培植體在強化b-12c-iv培養基上保留0.5-24小時,之後轉移到階段2標準b-12c-iv培養基進行10-120天的週期(通常21天的週期)。將此交替重複3次。在週期之間除去多餘的鞘。當轉移到第四個週期時,將培植體轉移到在本實施例中是用7 g/L的角叉膠(而非5.5 g/L)補充的強化b-12c-iv的階段3培養基中1-24小時,之後轉移到階段4減料b-12c-ii培養基。在第四個週期之後,清理培植體。將該培植體保留在交替的階段3/4培養基上進行10-120天的週期(通常21天的週期),直到觀察到多個苗。可以在3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦培植體顯示多個苗,或者將其維持在其階段3/4培養基,或者轉移到階段5培養基,在本實施例中,為magenta箱中的標準b-9-iv(40-50 mL)(也可使用CW1培養基或其強化和減料和/或標準版本)。在b-9-iv培養基上保留10-120天的週期(通常14天的週期),直到分離到新的箱並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每箱可獲得1-20個苗。隨後將該苗置於階段5或階段6培養基,在本實施例中為BR-2-iv,10-120天(通常14-21天)。 (實施例17) 如實施例10選擇培植體並對其消毒。隨後將該培植體轉移到含有階段1培養基的管中,在本實施例中階段1培養基為標準b-12c-iv,如實施例28所描述。這些培植體在標準b-12c-iv培養基上保留2個10-120天的週期(通常21天的週期)。在週期之間,除去多餘的鞘。當轉移到第三個週期時,將培植體轉移到階段2培養基,在本實施例是用7 g/L(而非5.5 g/L)的角叉膠補充的標準的b-12c-iv。在第三個週期之後,清理培植體。將所述培植體在用7 g/L的角叉膠補充的標準b-12c-iv上保留10-120天的週期(通常21天的週期),直到觀察到多個苗。可以在3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦外植體顯示多個苗,或者將其維持在其階段2培養基,或者轉移到在本實施例中是pH為5.5的強化b-1-iv的階段3培養基5-10小時,隨後轉移到階段4的無細胞分裂素的b-1培養基進行10-120天的週期(通常21天的週期)。重複階段3/4培養基的交替,直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將苗置於階段3或階段5培養基,在本實施例中是pH為5.7的強化Br-2-iv中1-10小時,接著在減料Br-2-i中10-120天(通常14-21天)。 (實施例18) 如實施例10選擇培植體並對其消毒。隨後將培植體轉移到含有階段1培養基的管中,在本實施例中,階段1培養基為強化b-12c-iv。這些培植體在強化b-12c-iv培養基上保留0.5-10小時,隨後轉移到階段2的無細胞分裂素的b-12c培養基中進行2個10-120天的週期(通常21天的週期)。在週期之間,除去多餘的鞘。當轉移到第三個週期時,將培植體轉移到在本實施例中是用7 g/L的角叉膠(而非5.5 g/L)補充的強化b-12c-iii的階段3培養基中0.5-10小時,之後轉移回階段2無細胞分裂素的b-12c培養基。第三個週期之後,清理培植體。將該培植體在交替的階段3/2培養基上保留10-120天的週期(通常21天的週期),直到觀察到多個苗。可以在3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦培植體顯示多個苗,或者將其維持在其交替的階段3/2培養基,或者轉移到在本實施例中是pH為5.5的強化b-4-iv的階段4培養基12-36小時,隨後是階段5的無細胞分裂素的b-4-iv 10-120天(通常21天的週期),直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將苗置於階段4或階段6培養基,在本實施例中是pH為5.7的Br-2-iv中10-120天(通常14-21天)。 (實施例19) 如實施例10選擇培植體並對其消毒。隨後將該培植體轉移到含有階段1培養基的管,在本實施例中,階段1培養基為標準b-12c-iv,亦如實施例28所描述。這些培植體在b-12c-iv培養基上保留2個10-120天的週期(通常21天的週期)。在週期之間,除去多餘的鞘。當轉移到第三個週期時,將培植體轉移到階段2培養基,在本實施例中,為用7 g/L的角叉膠而非上面提供的5.5 g/L補充的標準b-12c-iv。在第三個週期之後,清理該培植體。將該培植體在用7 g/L的角叉膠補充的標準b-12c-iv上保留10-120天的週期(通常21天的週期),直到觀察到多個苗。可以在3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦該培植體顯示多個苗,或者將其維持在其階段2培養基上,或者轉移到在本實施例中是pH為5.5的標準b-9-iv的階段3培養基進行10-120天的週期(通常21天),直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。還可以使用pH為5.5的b-6培養基。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將苗置於階段3或階段4培養基,在本實施例中是pH為5.7的強化Amel-iv培養基中0.5-24小時,接著轉移到階段4或5無細胞分裂素的Amel培養基中進行10-120天(通常14-21天)。 (實施例20) 如實施例10選擇培植體並對其消毒。隨後將該培植體轉移到含有階段1培養基的箱,在本實施例中,階段1培養基為強化b-10-iv(40-50 mL)。培植體在強化b-10-iv培養基上保留1-5小時,並隨後轉移到階段2無細胞分裂素的b-10培養基1-5天,然後轉移到階段3減料b-10-ii培養基5-115天(通常18天)。在週期之間除去多餘的鞘,並將該交替重複兩次。當轉移到第三次交替時,培植體被轉移到在本實施例中為用7 g/L的角叉膠(而非5.5 g/L)補充的強化b-10c-i的階段4培養基中1-5小時,隨後轉移到階段5無細胞分裂素的b-10c 1-5天和階段6的減料b-12c中5-115天(通常18天)。在第三個週期之後清理培植體。將該培植體保留在交替的階段4/5/6培養基上直到觀察到多個苗。可以在3-15個月之內觀察到多個苗。將培養物保留在交替的階段4/5/6培養基直到獲得期望數量的苗。每個增殖週期每箱可獲得1-20個苗。隨後將該苗在本實施例中是pH為5.7的標準的Amel-iv的階段7培養基上放置10-120天(通常14-21天)。 (實施例21) 如實施例10選擇培植體並對其消毒。隨後將該培植體轉移到含有階段1培養基的管,在本實施例中,階段1培養基為標準b-12c-iv,如實施例28所描述。這些培植體在標準b-12c-iv培養基上保留2個10-120天的週期(通常21天的週期)。在週期之間,除去多餘的鞘。當轉移到第三個週期時,將該培植體轉移到階段2培養基,在本實施例中,為用7 g/L的角叉膠而非上面提供的5.5 g/L補充的標準b-12c-iv。在第三個週期之後,清理培植體。將該培植體保留在用7 g/L的角叉膠補充的標準b-12c-iv上10-120天的週期(通常21天的週期),直到觀察到多個苗。可以在3-15個月之內觀察到多個苗。 一旦培植體顯示多個苗,或者將其維持在其階段2培養基上,或者轉移到在本實施例中是pH為5.5的強化b-9-iv的階段3培養基0.5-24小時,隨後轉移到階段4無細胞分裂素的b-4培養基10-120天。持續該階段2或階段3/4培養基的交替週期(通常21天的週期),直到分離到新管並進一步擴展獲得期望數量的苗。還可以使用pH為5.5的強化或標準b-6培養基。每個增殖週期每管可獲得1-10個苗。隨後將該苗在階段3或階段5培養基,在本實施例中是pH為5.7的強化Amel-iv中24小時,接著轉移到標準Amel-iv進行10-120天(通常14-21天)。 如可被通常技術人員從提供的實施例理解的,單個物種的組織培養方法包括培養基、時間和生長條件的輕微的變化。這些對於單個物種的變化需要基於包括位置、期望的產量、起始材料等因素而最佳化。 對於上列實施例中提供的各個物種,特別是具體例,其各可起始及/或增殖於:b-9-i培養基、b-9-ii培養基、b-9-iii培養基、b-9-iv培養基、b-9-v培養基、強化b-9-i培養基、強化b-9-ii培養基、強化b-9-iii培養基、強化b-9-iv培養基、強化b-9-v培養基、減料b-9-i培養基(以下描述減料培養基)、減料b-9-ii培養基、減料b-9-iii培養基、減料b-9-iv培養基、減料b-9-v培養基、CW2-i培養基、CW2-ii培養基、CW2-iii培養基、CW2-iv培養基、CW2-v培養基、強化CW2-i培養基、強化CW2-ii培養基、強化CW2-iii培養基、強化CW2-iv培養基、強化CW2-v培養基、減料CW2-i培養基、減料CW2-ii培養基、減料CW2-iii培養基、減料CW2-iv培養基、減料CW2-v培養基、b-10-i培養基、b-10-ii培養基、b-10-iii培養基、b-10-iv培養基、b-10-v培養基、強化b-10-i培養基、強化b-10-ii培養基、強化b-10-iii培養基、強化b-10-iv培養基、強化b-10-v培養基、減料b-10-i培養基、減料b-10-ii培養基、減料b-10-iii培養基、減料b-10-iv培養基、減料b-10-v培養基、b-11-i培養基、b-11-ii培養基、b-11-iii培養基、b-11-iv培養基、b-11-v培養基、強化b-11-i培養基、強化b-11-ii培養基、強化b-11-iii培養基、強化b-11-iv培養基、強化b-11-v培養基、減料b-11-i培養基、減料b-11-ii培養基、減料b-11-iii培養基、減料b-11-iv培養基、減料b-11-v培養基、b-12c-i培養基、b-12c-ii培養基、b-12c-iii培養基、b-12c-iv培養基、b-12c-v培養基、強化b-12c-i培養基、強化b-12c-ii培養基、強化b-12c-iii培養基、強化b-12c-iv培養基、強化b-12c-v培養基、減料b-12c-i培養基、減料b-12c-ii培養基、減料b-12c-iii培養基、減料b-12c-iv培養基、減料b-12c-v培養基、b-1-i培養基、b-1-ii培養基、b-1-iii培養基、b-1-iv培養基、b-1-v培養基、強化b-1-i培養基、強化b-1-ii培養基、強化b-1-iii培養基、強化b-1-iv培養基、強化b-1-v培養基、減料b-1-i培養基、減料b-1-ii培養基、減料b-1-iii培養基、減料b-1-iv培養基、減料b-1-v培養基、b-4-i培養基、b-4-ii培養基、b-4-iii培養基、b-4-iv培養基、b-4-v培養基、強化b-4-i培養基、強化b-4-ii培養基、強化b-4-iii培養基、強化b-4-iv培養基、強化b-4-v培養基、減料b-4-i培養基、減料b-4-ii培養基、減料b-4-iii培養基、減料b-4-iv培養基、減料b-4-v培養基、b-6-i培養基、b-6-ii培養基、b-6-iii培養基、b-6-iv培養基、b-6-v培養基、強化b-6-i培養基、強化b-6-ii培養基、強化b-6-iii培養基、強化b-6-iv培養基、強化b-6-v培養基、減料b-6-i培養基、減料b-6-ii培養基、減料b-6-iii培養基、減料b-6-iv培養基、減料b-6-v培養基、CW1-i培養基、CW1-ii培養基、CW1-iii培養基、CW1-iv培養基、CW1-v培養基、強化CW1-i培養基、強化CW1-ii培養基、強化CW1-iii培養基、強化CW1-iv培養基、強化CW1-v培養基、減料CW1-i培養基、減料CW1-ii培養基、減料CW1-iii培養基、減料CW1-iv培養基、減料CW1-v培養基、CW3-i培養基、CW3-ii培養基、CW3-iii培養基、CW3-iv培養基、CW3-v培養基、強化CW3-i培養基、強化CW3-ii培養基、強化CW3-iii培養基、強化CW3-iv培養基、強化CW3-v培養基、減料CW3-i培養基、減料CW3-ii培養基、減料CW3-iii培養基、減料CW3-iv培養基、減料CW3-v培養基、CW4-i培養基、CW4-ii培養基、CW4-iii培養基、CW4-iv培養基、CW4-v培養基、強化CW4-i培養基、強化CW4-ii培養基、強化CW4-iii培養基、強化CW4-iv培養基、強化CW4-v培養基、減料CW4-i培養基、減料CW4-ii培養基、減料CW4-iii培養基、減料CW4-iv培養基、減料CW4-v培養基、CW5-i培養基、CW5-ii培養基、CW5-iii培養基、CW5-iv培養基、CW5-v培養基、強化CW5-i培養基、強化CW5-ii培養基、強化CW5-iii培養基、強化CW5-iv培養基、強化CW5-v培養基、減料CW5-i培養基、減料CW5-ii培養基、減料CW5-iii培養基、減料CW5-iv培養基、減料CW5-v培養基、CW6-i培養基、CW6-ii培養基、CW6-iii培養基、CW6-iv培養基、CW6-v培養基、強化CW6-i培養基、強化CW6-ii培養基、強化CW6-iii培養基、強化CW6-iv培養基、強化CW6-v培養基、減料CW6-i培養基、減料CW6-ii培養基、減料CW6-iii培養基、減料CW6-iv培養基、減料CW6-v培養基、B-9N2-i培養基、B-9N2-ii培養基、B-9N2-iii培養基、B-9N2-iv培養基、B-9N2-v培養基、強化B-9N2-i培養基、強化B-9N2-ii培養基、強化B-9N2-iii培養基、強化B-9N2-iv培養基、強化B-9N2-v培養基、減料B-9N2-i培養基、減料B-9N2-ii培養基、減料B-9N2-iii培養基、減料B-9N2-iv培養基、減料B-9N2-v培養基、B-12C CPPU-i培養基、B-12C CPPU-ii培養基、B-12C CPPU-iii培養基、B-12C CPPU-iv培養基、B-12C CPPU-v培養基、強化B-12C CPPU-i培養基、強化B-12C CPPU-ii培養基、強化B-12C CPPU-iii培養基、強化B-12C CPPU-iv培養基、強化B-12C CPPU-v培養基、減料B-12C CPPU-i培養基、減料B-12C CPPU-ii培養基、減料B-12C CPPU-iii培養基、減料B-12C CPPU-iv培養基、減料B-12C CPPU-v培養基、B-12C DPU-i培養基、B-12C DPU-ii培養基、B-12C DPU-iii培養基、B-12C DPU-iv培養基、B-12C DPU-v培養基、強化B-12C DPU-i培養基、強化B-12C DPU-ii培養基、強化B-12C DPU-iii培養基、強化B-12C DPU-iv培養基、強化B-12C DPU-v培養基、減料B-12C DPU-i培養基、減料B-12C DPU-ii培養基、減料B-12C DPU-iii培養基、減料B-12C DPU-iv培養基、減料B-12C DPU-v培養基、或其依據本文中描述各種過程之組合。 (實施例22) 用於脈動方法的方法及材料 國際專利申請公告號WO2011100762係以引用方式全部併入本文中,其係描述用於竹組織培養的一般過程。 下表描述實施例1-3中使用的芽誘導培養基和苗伸長培養基。 (實施例23) 藉由脈動方法的竹微體繁殖-I 在本實施例中,將毛竹的組織培養物接種到生物反應器中。將芽誘導培養基接種到生物反應器中並將該培養物在生長室中培養48小時。48小時之後,將芽誘導培養基用苗伸長和維持培養基替換,並將竹植物額外培養5天的時間。將上面的週期再重複兩次而總共有三次芽誘導處理和三次苗伸長和維持處理。 在處理時間結束時,收集資料以確定培養物的增殖率。與膠狀培養基中增殖率為2X的對照處理相比,達成28X的增殖率。 (實施例24) 藉由脈動方法的竹微體繁殖-II 在本實施例中,從溫室中收集毛竹的有節莖片段並在將節片段放置到芽誘導培養基之前表面滅菌。該莖片段具有單一個芽,其可以是休眠的或有活性的。在生長室中將培養物培養1小時到3週的時間,而以2週為最佳培養物培養時間。 該休眠的或有活性的腋芽在芽誘導階段中產生苗。在芽誘導階段結束時分離該苗芽並在芽伸長及維持培養基上培養1到3週的時間。 在此過程中,該單一個的腋芽發展成為多個苗。重複芽誘導過程和苗伸長/維持過程數次以得到足以從單一個腋芽產生100,000個植物的苗增殖率。 (實施例25) 藉由脈動方法的竹微體繁殖-III 在本實施例中,將毛竹的種子表面滅菌並置於芽誘導培養基。將該培養物在生長室中培養1小時到3週的時間。 種子在芽誘導培養基中發芽並產生多個苗。隨後將由種子衍生的多個苗在苗伸長/維持培養基中放置1到3週的時間。 將芽誘導和芽伸長/維持過程重複數次以達成足以從單一個種子培植體產生100,000個植物的苗增殖率。 (實施例26) 藉由脈動方法的竹微體繁殖-VI 在本實施例中,將蓉城竹、缺苞箭竹、菲白竹、維氏熊竹、菲黃竹、筱竹、丘斯誇竹、白綠竹、楠竹、烏芽竹、馬來甜龍竹或狹葉瓜多竹的組織培養物接種到生物反應器中。將芽誘導培養基接種到生物反應器並將培養物在生長室中培養48小時。48小時之後,將芽誘導培養基用苗伸長和維持培養基替換,並將竹植物額外培養5天的時間。將上面的週期再重複2次,而總共有三次芽誘導處理和三次苗伸長和維持處理。 在處理時間結束時,收集資料以確定培養物的增殖率。與膠狀培養基中增殖率為2X的對照處理相比,每個竹物種達成約10X到約28X的增殖率。 (實施例27) 藉由脈動方法的竹微體繁殖-V 從溫室中收集蓉城竹、缺苞箭竹、菲白竹、維氏熊竹、菲黃竹、筱竹、丘斯誇竹、白綠竹、楠竹、烏芽竹、馬來甜龍竹或狹葉瓜多竹的有節莖的片段,並在將節部分放置到芽誘導培養基之前表面滅菌。該節的片段具有一個單一的芽,其可以是休眠的或有活性的。將該培養物在生長室中培養1小時到3週的時間,而以2週為最佳培養時間。 該休眠的或活性的腋芽在芽誘導階段中產生苗。在芽誘導階段結束時分離該苗芽並在芽伸長和維持培養基上培養1到3週的時間。 在此時段內,該單一個的腋芽發展成為多個苗。重複芽誘導和苗伸長/維持過程數次以得到足以從單一個腋芽產生100,000個植物的苗增殖率。 (實施例28) 藉由脈動方法的竹微體繁殖-VI 將蓉城竹、缺苞箭竹、菲白竹、維氏熊竹、菲黃竹、筱竹、丘斯誇竹、白綠竹、楠竹、烏芽竹、馬來甜龍竹或狹葉瓜多竹的種子表面消毒並置於芽誘導培養基上。將該培養物在生長室中培養1小時到3週的時間。 該種子在芽誘導培養基中發芽並產生多個苗。隨後將由種子衍生的多個苗在苗伸長/維持培養基中放置1到3週的時間。 將芽誘導和芽伸長/維持過程重複數次以實現足以從單一個種子培植體產生100,000個植物的苗增殖率。 (實施例29) 使用生物反應器的竹微體繁殖 ˙材料和方法 將毛竹、毛金竹(Nigra Henon)、青川箭竹(Rufa)和紫竹(Nigra)植物的苗培養物在間歇浸沒式生物反應器中生長,如圖中描述的。使用液體的增殖培養基B11和Dic 25/30 ST。 步驟 將約100到300個不同竹物種的微體苗(micro shoot)使用無菌技術接種到間歇浸沒式生物反應器中。將該生物反應器密封並在生長室中培養(25℃且照相週期(photo period)為16/8)。將該培養物在Dic 25/30 ST液體培養基中總共曝露5天且在B11培養基中總共2天。將培養基迴圈(脈動)重複3到6週的時間。每3週一次將培養基完全轉變為新鮮的培養基。 ˙結果 該微體苗對培養基的脈動處理有反應並快速增殖。在3到6週的培養時間內,從每個生物反應器產生了估計的數量為1000到10000的植物。 (實施例30) 使用生物反應器的竹微體繁殖-II ˙材料和方法 將毛竹、毛金竹、青川箭竹、華西箭竹、秋竹(Chusquea culeou)、伯齡達竹、神農箭竹、「九寨溝」華西箭竹、菲白竹、丘斯誇竹、缺苞箭竹(Fargesia denudate)、「平武」拐棍竹、「臥龍」拐棍竹、紫竹、麻竹屬和斑葉白綠竹(Variagated Old Hamii)之植物苗培養物在間歇浸沒式生物反應器中生長,如圖式中描述。下表列出了各個竹物種的液體增殖培養基。 圖7顯示了B11、DIC 25/30 ST和DIC 25/30 DT的配方。 ˙步驟 將不同竹物種的微體苗使用無菌技術接種到間歇浸沒式生物反應器中。將該生物反應器密封並在生長室中培養(25℃且照相週期是16/8)。依據表4指定的條件,將該培養物曝露於Dic 25/30 ST液體培養基和B11培養基。將培養基迴圈(脈動)重複3-6週的時間。每3週一次將該培養基完全轉變為新鮮的培養基。 ˙結果 該微體苗對培養基的脈動處理有反應並快速增殖。在3到6週的培養時間內,從每個生物反應器產生了估計的數量為1000到10000的植物。 (實施例31) 其他植物的微體繁殖 ˙材料和方法 將天竺葵(Geranium rozanne)、金色知風草(Hakonechloa macra‘Aureola’)、金葉知風草(Hakonechloa macra‘All gold’)、聖誕玫瑰(Helleborus Ivory Prince)、紐西蘭麻(Phormium)、山葵(Wasabi C2)、大青籬竹(Arundinaria gigantea)、馬鈴薯和馬鈴薯植物的苗培養物在間歇浸沒式生物反應器中培養,如附圖式所描述。在下表中列出了每個竹物種的液體增殖培養基。 B11、DKW、DIC 25/30 ST、Wasabi、DIC 25/30、Lilly light和Lilly dark的配方係如圖7所示。 ˙步驟 將表5中列出的不同植物物種的微體苗使用無菌技術接種到間歇浸沒式生物反應器中。將該生物反應器密封並在生長室中培養(25℃且照相周期是16/8)。在依據表5的條件下,將該培養物曝露於適合的培養基。將培養基迴圈(脈動)重複3-6週的時間。每3週一次將該培養基完全轉變為新鮮的培養基。 ˙結果 該微體苗對培養基的脈動處理有反應並快速增殖。在3到6週的培養時間內,從每個生物反應器產生了估計的數量為1000到10000的植物。 本案所揭示發明的原理可應用到許多可能的具體例中,舉例說明的具體例應被認為僅是實例,且不應作為限制本發明的範圍。 除另外定義,本文中所有的技術和科學術語具有和本發明所屬的技術領域的通常技術人員一般所理解的相同的含義。儘管可在實施或本發明的測試中使用任何與本文所述類似或等同的方法和材料,本文係敘述較佳的方法和材料。 所有引用的公開刊物、專利和專利公開案係以引用方式全部併入本文以用於所有目的。又,說明書所引用之存在GenBank中的核酸序列和多肽序列係以引用方式併入本文。 本文中討論的公開刊物僅以其所提供揭示內容在本案申請日之前者。本文中的所有內容都不應理解為以先前的發明認定本發明並非早於該公開刊物。 儘管本發明係連結其特定具體例所描述,應理解的是其能進一步修改,而且本案意圖涵蓋大致上依據本發明的原理和包括從本案揭示內容以本發明所屬領域的已知或慣例而衍伸的任何變化、用途或修改,且可應用於上文提出的基本特徵和如下附加的申請專利範圍中。 100‧‧‧植物繁殖系統,擺動架 110‧‧‧生長器皿,框架 111‧‧‧支柱 112‧‧‧蓋 113‧‧‧驅動軸開口 114‧‧‧搖軸開口 115‧‧‧容積 120‧‧‧上跨構件 121‧‧‧感測器支架 125‧‧‧底 126‧‧‧支撐構件 127‧‧‧驅動軸開口 128‧‧‧搖軸開口 130‧‧‧第一培養基容器 140‧‧‧架組件 141‧‧‧架 142‧‧‧平臺 144‧‧‧支撐管 145‧‧‧連桿 150‧‧‧第二培養基容器,外部軸襯 151‧‧‧開口 155‧‧‧內部軸襯 170‧‧‧氣體源,驅動組件 171‧‧‧發動機 172‧‧‧驅動軸 173‧‧‧傳動齒輪和 180‧‧‧搖動組件 181‧‧‧搖動齒輪 182‧‧‧搖軸 183‧‧‧軸承 184‧‧‧安裝托架 186‧‧‧搖動軸襯 190‧‧‧控制器 200‧‧‧植物繁殖系統 210‧‧‧生長器皿 212‧‧‧閉合物 216‧‧‧柄 220‧‧‧氣體交換口 222‧‧‧流體交換口 226‧‧‧流體導管 230‧‧‧第一培養基容器 232‧‧‧第一流體口 236‧‧‧第二流體口 238‧‧‧接合器 240‧‧‧支管 242‧‧‧管 244‧‧‧管 246‧‧‧閥 248‧‧‧閥 250‧‧‧第二培養基容器 252‧‧‧濾器 270‧‧‧氣體泵(氣體源) 290‧‧‧計時器控制電路 300‧‧‧植物繁殖次序 302‧‧‧開始植物繁殖次序 304‧‧‧開始第一培養次序 306‧‧‧建立第一培養基容器和生長器皿之間的流體連通 308‧‧‧執行第一操作模式 310‧‧‧執行第三操作模式 312‧‧‧第一培養次序是否完成? 314‧‧‧開始第二培養次序 316‧‧‧建立第二培養基容器和生長器皿之間的流體連通 318‧‧‧執行第二操作模式 320‧‧‧執行第三操作模式 322‧‧‧第二培養次序是否完成? 324‧‧‧植物繁殖次序是否完成? 326‧‧‧結束植物繁殖次序 圖1為本發明系統之方塊圖。 圖2為圖1系統的非限制性具體例之示意圖。 圖3為圖2系統的培養基容器之示意圖。 圖4為圖2系統的支管之示意圖。 圖5A為圖2系統的生長器皿之前視圖。 圖5B為圖5A的生長器皿之側視圖。 圖5C為圖5A的生長器皿之俯視圖。 圖6為本發明的植物繁殖次序之流程圖。 圖7為顯示B-11、DIC 25/30 ST、DIC 25/30 DT、DKW、Wasabi、DIC 25/30、Lilly light和Lilly dark培養基配方之表,除了以克/L代表糖以外,所有的成分都以毫克/L代表。 圖8為依據一個具體例的擺動架之正面立體圖。 圖9為圖8的擺動架之側面立體圖。 圖10為圖9擺動架標示為區域Z部分的放大分解圖。 圖11為圖8擺動架中所包括支柱(upright)沿圖8中線4-4之橫截面圖。 圖12為圖8擺動架中所包括架組件之立體圖。 圖13為圖12架組件的部分的立體圖。 圖14為圖6的架組件的部分中包括的平臺(platform)沿圖13中線7-7之橫截面圖。 圖15為圖11架組件中所包括軸襯(bushings)的立體圖。 圖16為圖8擺動架中所包括驅動組件的分解圖。 圖17為圖8擺動架的部分在第一種配置下之側視圖。 圖18為圖8擺動架的部分在第二種配置下之側視圖。 圖19為圖8擺動架的部分在第三種配置下之側視圖。 100‧‧‧植物繁殖系統 110‧‧‧生長器皿 130‧‧‧第一培養基容器 150‧‧‧第二培養基容器 170‧‧‧氣體源 190‧‧‧控制器
权利要求:
Claims (20) [1] 一種體外微體繁殖竹的方法,其包含:(a)在芽誘導培養基中培養竹的組織培養物、培植體或種子以誘導苗芽的形成;(b)在苗伸長/維持培養基中培養從步驟(a)中獲得的苗芽;(c)在芽誘導培養基中培養來自步驟(b)的苗以誘導苗芽的形成;(d)在苗伸長/維持培養基中培養從步驟(c)中獲得的苗芽;及(e)重複培養步驟(c)及步驟(d)至少一個額外的迴圈;其中,所述芽誘導培養基包含有效量的噻苯隆(TDZ)或其類似物,且其中所述苗伸長/維持培養基,除了TDZ或其類似物之外,包含有效量的一種或多種細胞分裂素;其中,可選擇性地,步驟(a)及/或步驟(c)中之芽誘導培養基是液體培養基及/或固體培養基,且步驟(b)及/或步驟(d)中之苗伸長/維持培養基是液體培養基及/或固體培養基。 [2] 如申請專利範圍第1項之方法,其中,步驟(e)係重複至少一次。 [3] 如申請專利範圍第1項之方法,其中,所述之竹係為毛竹(Phyllostachys edulisi‘Moso’)、蓉城竹(Phyllostachys bissetti)、缺苞箭竹(Fargesia denudata)、菲白竹(Pleioblastus fortunei)、維氏熊竹(Sasa Veitchii)、菲黃竹(Pleioblastus viridistriatus)、筱竹(Thamnocalamus crassinodus)、丘斯誇竹(Chusquea Culeo“Cana Prieta”)、白綠竹(Bambusa Old Hamii)、楠竹(Phyllostachys Moso)、烏芽竹(Phyllostachys Atrovaginata)、馬來甜龍竹(Dendrocalamus Asper)或狹葉瓜多竹(Guadua Angustifolia)、紫竹(Phylostachys Nigra)、青川箭竹(Fargesia rufa)、華西箭竹(Fargesia nitida)、伯齡達竹(Borinda Boliana)、神農箭竹(Fargesia murielae)、菲白竹(Pleioblastus fortune)、拐棍竹(Fargesia robusta)及白綠竹(Bambusa Oldhamii)。 [4] 如申請專利範圍第1項之方法,其中,所述之竹培植體是竹莖的節,其中該竹莖的節係可選擇性地包含節間。 [5] 如申請專利範圍第1項之方法,其中,該芽誘導培養基中TDZ或其類似物的濃度是約0.5 mg/L至約2 mg/L。 [6] 如申請專利範圍第1項之方法,其中,該苗伸長/維持培養基中除了TDZ或其類似物之外,所述之一種或多種細胞分裂素係選自由N6-苄胺基嘌呤(BAP)、間拓樸林(mT)、玉米素、激動素、2-異戊烯腺嘌呤(2ip)、腺嘌呤半硫酸鹽、二甲基烯丙基腺嘌呤、N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(4-CPPU)以及其各自的類似物所組成之群,其中,可選擇性地,該苗伸長/維持培養基中除了TDZ或其類似物之外的一種或多種細胞分裂素的濃度是從約0.25 mg/L至約5 mg/L。 [7] 如申請專利範圍第1項之方法,其中,該芽誘導培養基及/或苗伸長/維持培養基進一步包含一種或多種生長素,其中,可選擇性地,該一種或多種生長素係選自由β-萘氧乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、毒莠定(picloram)及其各自的類似物所組成之群。 [8] 一種系統,其包含:用於在無菌或基本上無菌的環境中培養植物組織的生長器皿;具有第一流體口及第二流體口的第一培養基容器,該第一流體口與該生長器皿是流體可連接的;具有第一流體口和第二流體口的第二培養基容器,該第一流體口與該生長器皿是流體可連接的;氣體源,其與該第一培養基容器的第二流體口及該第二培養基容器的第二流體口是流體可連接的;以及控制器,其係可以第一操作模式和第二操作模式操作,該第一操作模式係將加壓氣體從氣體源輸送到第一培養基容器以將其中含有的第一體積的液體置換到生長器皿,以及該第二操作模式係將加壓氣體從氣體源輸送到第二培養基容器,以將其中含有的第二體積的液體置換到生長器皿。 [9] 如申請專利範圍第8項之系統,其中,該控制器係可以第三操作模式操作,該第三操作模式係允許生長器皿中含有的液體從生長器皿流至第一培養基容器及第二培養基容器中至少一者。 [10] 如申請專利範圍第9項之系統,其中,該控制器係可以第一培養次序操作,該第一培養次序係在第一操作模式之後執行該第三操作模式。 [11] 如申請專利範圍第10項之系統,其中,該控制器係可以第二培養次序操作,該第二培養次序係在第二操作模式之後執行該第三操作模式。 [12] 如申請專利範圍第11項之系統,其中,該控制器係進一步可以植物繁殖模式操作,該植物繁殖模式係執行該第一培養次序及該第二培養次序。 [13] 如申請專利範圍第8項之系統,其進一步包含一支管,其係與該生長器皿、該第一培養基容器及該第二培養基容器流體可連接,其中,該支管可操作以控制該生長器皿及該第一培養基容器之間,以及該生長器皿及該第二培養基容器之間的液體流動。 [14] 一種用於植物組織微體繁殖於生物反應器中交換液體培養基之方法,該生物反應器包含用於培養植物組織的生長器皿、與生長器皿流體可連接的第一培養基容器、與生長器皿流體可連接的第二培養基容器、以及與第一培養基容器及第二培養基容器流體可連接的氣體源,所述方法包括:建立第一培養基容器及生長器皿之間的流體連通;將第二培養基容器與生長器皿流體分離;建立氣體源及第一培養基容器之間的流體連通;將壓縮氣體輸送到第一培養基容器以將第一體積液體從第一培養基容器置換到生長器皿;允許至少一部分的第一體積液體從生長器皿流回到第一培養基容器中;建立第二培養基容器及生長器皿之間的流體連通;將第一培養基容器與生長器皿流體分離;建立氣體源及第二培養基容器之間的流體連通;將壓縮氣體輸送到第二培養基容器以將第二體積液體從第一培養基容器置換到生長器皿;及允許至少一部分的第二體積液體從生長器皿流回到第二培養基容器中。 [15] 一種用於微體繁殖竹之培養基,其中,該培養基係包含間拓樸林或其類似物及至少一種或至少兩種其他細胞分裂素,其中該培養基係維持至少6個月的增殖週期。 [16] 如申請專利範圍第15項之培養基,其中,該培養基包含至少一種生長素或至少兩種生長素,其中,可選擇性地,該培養基係選自下列所組成之群:(1)包含NAA和BAP或其類似物的培養基;(2)包含NAA和噻苯隆或其類似物的培養基;(3)包含NAA和IBA或其類似物的培養基;(4)包含NAA和2ip或其類似物的培養基;(5)包含BAP和噻苯隆或其類似物的培養基;(6)包含BAP和IBA或其類似物的培養基;(7)包含BAP和2ip或其類似物的培養基;(8)包含IBA和噻苯隆或其類似物的培養基;(9)包含IBA和2ip或其類似物的培養基;(10)包含噻苯隆和2ip或其類似物的培養基;(11)包含NAA、BAP和間拓樸林或其類似物的培養基,如標準或強化CW2培養基、標準或強化CW1培養基、或標準或強化b-10培養基;(12)包含NAA、BAP、間拓樸林和噻苯隆或其類似物的培養基,如標準或強化b-12c培養基、標準或強化b-9培養基、標準或強化b-11培養基、或標準或強化B-9N2培養基;(13)包含NAA、BAP、間拓樸林和噻苯隆和CCPU及/或DPU或其類似物的培養基,如標準或強化B-12C CPPU培養基或標準或強化B-12C CPU培養基;(14)包含NAA、BAP、間拓樸林和IBA或其類似物的培養基,如標準或強化CW3或標準或強化CW5培養基;(15)包含NAA、BAP、間拓樸林、噻苯隆和IBA或其類似物的培養基,如標準或強化CW4或標準或強化CW6培養基;(16)包含NAA、BAP、噻苯隆和2ip或其類似物的培養基,如標準或強化b-1或標準或強化b-4培養基;(17)包含NAA、噻苯隆和2ip或其類似物的培養基,如標準或強化b-6培養基;或(18)包含以下、基本上由以下組成或由以下所組成的培養基:強化b-9-i培養基、強化b-9-ii培養基、強化b-9-iii培養基、強化b-9-iv培養基、強化b-9-v培養基、減料b-9-i培養基、減料b-9-ii培養基、減料b-9-iii培養基、減料b-9-iv培養基、減料b-9-v培養基、強化CW2-ii培養基、強化CW2-iii培養基、強化CW2-iv培養基、強化CW2-v培養基、減料CW2-i培養基、減料CW2-ii培養基、減料CW2-iii培養基、減料CW2-iv培養基、減料CW2-v培養基、強化b-10-i培養基、強化b-10-ii培養基、強化b-10-iii培養基、強化b-10-iv培養基、強化b-10-v培養基、減料b-10-i培養基、減料b-10-ii培養基、減料b-10-iii培養基、減料b-10-iv培養基、減料b-10-v培養基、強化b-11-i培養基、強化b-11-ii培養基、強化b-11-iii培養基、強化b-11-iv培養基、強化b-11-v培養基、減料b-11-i培養基、減料b-11-ii培養基、減料b-11-iii培養基、減料b-11-iv培養基、減料b-11-v培養基、強化b-12c-i培養基、強化b-12c-ii培養基、強化b-12c-iii培養基、強化b-12c-iv培養基、強化b-12c-v培養基、減料b-12c-i培養基、減料b-12c-ii培養基、減料b-12c-iii培養基、減料b-12c-iv培養基、減料b-12c-v培養基、強化b-1-i培養基、強化b-1-ii培養基、強化b-1-iii培養基、強化b-1-iv培養基、強化b-1-v培養基、減料b-1-i培養基、減料b-1-ii培養基、減料b-1-iii培養基、減料b-1-iv培養基、減料b-1-v培養基、強化b-4-i培養基、強化b-4-ii培養基、強化b-4-iii培養基、強化b-4-iv培養基、強化b-4-v培養基、減料b-4-i培養基、減料b-4-ii培養基、減料b-4-iii培養基、減料b-4-iv培養基、減料b-4-v培養基、強化b-6-i培養基、強化b-6-ii培養基、強化b-6-iii培養基、強化b-6-iv培養基、強化b-6-v培養基、減料b-6-i培養基、減料b-6-ii培養基、減料b-6-iii培養基、減料b-6-iv培養基、減料b-6-v培養基、強化CW1-i培養基、強化CW1-ii培養基、強化CW1-iii培養基、強化CW1-iv培養基、強化CW1-v培養基、減料CW1-i培養基、減料CW1-ii培養基、減料CW1-iii培養基、減料CW1-iv培養基、減料CW1-v培養基、強化CW3-i培養基、強化CW3-ii培養基、強化CW3-iii培養基、強化CW3-iv培養基、強化CW3-v培養基、減料CW3-i培養基、減料CW3-ii培養基、減料CW3-iii培養基、減料CW3-iv培養基、減料CW3-v培養基、強化CW4-i培養基、強化CW4-ii培養基、強化CW4-iii培養基、強化CW4-iv培養基、強化CW4-v培養基、減料CW4-i培養基、減料CW4-ii培養基、減料CW4-iii培養基、減料CW4-iv培養基、減料CW4-v培養基、強化CW5-i培養基、強化CW5-ii培養基、強化CW5-iii培養基、強化CW5-iv培養基、強化CW5-v培養基、減料CW5-i培養基、減料CW5-ii培養基、減料CW5-iii培養基、減料CW5-iv培養基、減料CW5-v培養基、強化CW6-i培養基、強化CW6-ii培養基、強化CW6-iii培養基、強化CW6-iv培養基、強化CW6-v培養基、減料CW6-i培養基、減料CW6-ii培養基、減料CW6-iii培養基、減料CW6-iv培養基、減料CW6-v培養基、B-9N2-i培養基、B-9N2-ii培養基、B-9N2-iii培養基、B-9N2-iv培養基、B-9N2-v培養基、強化B-9N2-i培養基、強化B-9N2-ii培養基、強化B-9N2-iii培養基、強化B-9N2-iv培養基、強化B-9N2-v培養基、減料B-9N2-i培養基、減料B-9N2-ii培養基、減料B-9N2-iii培養基、減料B-9N2-iv培養基、減料B-9N2-v培養基、B-12C CPPU-i培養基、B-12C CPPU-ii培養基、B-12C CPPU-iii培養基、B-12C CPPU-iv培養基、B-12C CPPU-v培養基、強化B-12C CPPU-i培養基、強化B-12C CPPU-ii培養基、強化B-12C CPPU-iii培養基、強化B-12C CPPU-iv培養基、強化B-12C CPPU-v培養基、減料B-12C CPPU-i培養基、減料B-12C CPPU-ii培養基、減料B-12C CPPU-iii培養基、減料B-12C CPPU-iv培養基、減料B-12C CPPU-v培養基、B-12C DPU-i培養基、B-12C DPU-ii培養基、B-12C DPU-iii培養基、B-12C DPU-iv培養基、B-12C DPU-v培養基、強化B-12C DPU-i培養基、強化B-12C DPU-ii培養基、強化B-12C DPU-iii培養基、強化B-12C DPU-iv培養基、強化B-12C DPU-v培養基、減料B-12C DPU-i培養基、減料B-12C DPU-ii培養基、減料B-12C DPU-iii培養基、減料B-12C DPU-iv培養基或減料B-12C DPU-v培養基。 [17] 一種微體繁殖竹之方法,其包含在申請專利範圍第15及16項中任一項的培養基中培養竹培植體及/或苗。 [18] 如申請專利範圍第17項之方法,其中,所述之竹是蓉城竹(Phyllostachys bissetti);缺苞箭竹(Fargesia denudata);菲白竹(Pleioblastus fortunei);維氏熊竹(Sasa Veitchii);菲黃竹(Pleioblastus viridistriatus);筱竹(Thamnocalamus crassinodus);丘斯誇竹(Chusquea Culeo“Cana Prieta”);白綠竹(Bambusa Old Hamii);楠竹(Phyllostachys Moso);烏芽竹(Phyllostachys Atrovaginata);馬來甜龍竹(Dendrocalamus Asper);狹葉瓜多竹(Guadua Angustifolia),大青籬竹(Arundinaria gigantea);巴苦竹(Bambusa balcoa);龍頭竹(Bambusa vulgaris);黃金間碧竹(Bambusa vulgaris ‘Vitatta’);白綠竹(Bambusa Oldhamii);馬甲竹(Bambusa tulda);勃氏甜龍竹(Dendrocalamus brandesii);馬來甜龍竹(Dendrocalamus asper);版納甜龍竹(Dendrocalamus hamiltoni);龍竹(Dendrocalamus giganteus);黃竹(Dendrocalamus membranaceus);印度實竹(Dendrocalamus strictus);菲律賓巨草竹(Gigantochloa aspera);小黑竹(Gigantochloa scortechini);瓜多竹(Guadua culeata);尼加拉瓜瓜多竹(Guadua aculeata ‘Nicaragua’);抱葉瓜多竹(Guadua amplexifolia);狹葉瓜多竹(Guadua angustifolia);雙色狹葉瓜多竹(Guadua angustofolia bi-color);圓錐瓜多竹(Guadua paniculata);梨竹(Melocanna bambusoides);李海竹(Neohouzeaua dullooa(Teinostachyum));蘆葦竹(Ochlandra travancorica);毛竹(Phyllostachys edulis ‘Moso’);紫竹(Phyllostachys nigra);毛金竹(Phyllostachys nigra‘Henon’);或思勞竹(Schizostachyum lumampao)。 [19] 如申請專利範圍第17項之方法,其中,該方法包括將竹培植體及/或苗依序地在強化培養基及減料培養基中培養,或依序地在減料培養基及強化培養基中培養。 [20] 一種用於植物繁殖之架,其如說明書實質地描述及顯示者。
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