抗－ＨｔｒＡ１抗體及其使用方法

专利摘要:
本發明提供抗-HtrA1抗體及其使用方法。
公开号:TW201321414A
申请号:TW101137846
申请日:2012-10-12
公开日:2013-06-01
发明作者:Yan Wu；Menno Van Lookeren-Campagne；Daniel Kirchhofer；Michael Terry Lipari；Kenneth J Katschke；Paul M Moran；Scott Stawicki；Wei-Ching Liang
申请人:Genentech Inc；
IPC主号:C07K16-00

专利说明:
抗-HtrA1抗體及其使用方法
本發明係關於抗-HtrA1抗體及其使用方法。
本申請案主張2011年10月14日申請之美國臨時申請案第61/547,649號之權利，該案之全文以引用的方式併入本文中。
序列表
本申請案含有由EFS-Web以ASCII格式提交且全部以引用的方式併入本文中之序列表。創建於2012年10月8日之該ASCII複本名稱為P4761R1-Sequence Listing.TXT且大小為47,263位元組。
絲胺酸蛋白酶HtrA1(PRSS11；Clan PA，S1家族)屬於HtrA蛋白之進化保守家族(Clausen,T.等人，Nat Rev Mol Cell Biol 12：152-62(2011)；Clausen,T.等人，Mol Cell 10：443-55(2002))。在人類中，HtrA1、3及4享有相同之結構域架構：N端IGFBP樣模組與Kazal樣模組、具有胰蛋白酶樣摺疊之蛋白酶結構域及C端PDZ結構域。HtrA1之生理學相關性已藉由識別導致家族性缺血性大腦小血管疾病之人類功能損失型突變而堅定地確定(Hara,K.等人，N Engl J Med 360：1729-39(2009))。分子機制涉及HtrA1之缺陷型TGF-β抑制作用，導致TGF-β信號傳導增加(Hara等人，2009)。異常HtrA1表現對TGF-β信號傳導之異常調節亦可導致關節炎疾病(Oka,C.等人，Development 131：1041-53(2004)；Tsuchiya,A.等人，Bone 37：323-36(2005))，可能結合HtrA1介導之對各種細胞外基質組分之降解作用(Chamberland等人，J Biol Chem 284：27352-9(2009)；Grau,S.等人，J Biol Chem 281：6124-9(2006)；Hadfield,K.D.等人，J Biol Chem 283：5928-38(2008)；Tocharus,J.等人，Dev Growth Differ 46：257-74(2004)；Tsuchiya等人，2005))，或間接經由基質金屬蛋白酶之上調作用(Grau等人，2006)。另外，人類遺傳學研究識別年齡相關黃斑變性之進程與HtrA1啟動子區域中之SNP之間的強相關性，其導致HtrA1轉錄物含量增加(Dewan,A.等人，Science 314：989-92(2006)；Yang,Z.等人，Science 314：992-3(2006))。因此，對HtrA1酶促功能之抑制係具有吸引力之治療方式，例如在年齡相關之黃斑變性及關節炎疾病中。
本發明提供抗-HtrA1抗體及其用於診斷及治療目的之使用方法。
在一個態樣中，本發明提供一種與包含SEQ ID NO：8之VH序列與SEQ ID NO：7之VL序列之抗體競爭結合至HtrA1之經分離抗體。例如，可使用ELISA分析來測定競爭性結合。
在一個態樣中，本發明提供一種結合至HtrA1的經分離抗體，其具有一或多種以下特性：(i)對於一或多種HtrA1受質具有小於50 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、5 nM、3 nM、2.5 nM、2 nM、1 nM或更小之IC₅₀；(ii)以1個可變結構域對HtrA1三聚體之一個次單元之比率結合至HtrA1(例如，Fab以3個Fab比1個HtrA1三聚體之比率結合至HtrA1三聚體，且IgG以3個IgG比2個HtrA1三聚體之比率結合至HtrA1三聚體)；(iii)對於包含兩個可變結構域之抗體而言，以導致形成與圖9中所示類似之「籠」之方式結合至HtrA1；(iv)不阻止HtrA1形成三聚體；(v)結合至HtrA1蛋白之環C中的一或多個殘基；(vi)結合至HtrA1之蛋白酶結構域；(vii)結合至包含SEQ ID NO：13之胺基酸N224或K248中之一或兩者或其在不同HtrA1序列中之胺基酸等效物(例如，SEQ ID NO：14之胺基酸N224及K248，參見圖10A及B)的抗原決定基；(viii)結合至包含一或多個以下殘基：SEQ ID NO：13之N224、K248、V201、T223、K243、K225、E247及H220或其在不同HtrA1序列中之胺基酸等效物的抗原決定基；(ix)與鼠類HtrA1交叉反應；(x)不與HtrA2、HtrA3及/或HtrA4交叉反應；(xi)與包含SEQ ID NO：8之VH序列與SEQ ID NO：7之VL序列之抗體競爭結合至HtrA1；(xii)以500 nM之解離常數結合至HtrA1；或(xiii)抑制HtrA1與α1-抗胰蛋白酶(A1AT)之間形成複合物。
在另一個態樣中，本發明提供一種結合至HtrA1之經分離抗體，其中該抗體(i)結合至包括HtrA1之N224、K248或其兩者之抗原決定基，且(ii)以30 nM之IC₅₀抑制HtrA1。在某些實施例中，抗原決定基另外包括HtrA1之一或多個以下殘基：V201、T223、K243、K225、E247及H220。在某些實施例中，抗體可另外包含一或多種以下特性：(i)以1個可變結構域對HtrA1三聚體之一個次單元之比率結合至HtrA1，或(ii)不阻止HtrA1形成三聚體。在某些實施例中，使用具有SEQ ID NO：12之受質之絲胺酸蛋白酶分析(例如本文所述之FRET分析)測定IC₅₀。
在某些實施例中，本文所述之抗體不與HtrA2、HtrA3及HtrA4中之一或多者交叉反應。
在某些實施例中，本文所述之抗體具有500 nM之解離常數。例如，可藉由使用Fab之BIAcore測定解離常數。
在某些實施例中，本文所述之抗體為單株抗體。
在某些實施例中，本文所述之抗體為人類、人類化或嵌合抗體。
在某些實施例中，本文所述之抗體為結合HtrA1之抗體片段。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHYFDY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：27)；(b)包含胺基酸序列QQX_gX_hX_iX_jPX_kT之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：24)；及(c)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_oYADSVKG之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：26)。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-H3；(b)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HVR-L3；及(c)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-H2。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-H3；(b)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3；及(c)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-H2。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-H3；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3及(c)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-H2。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含胺基酸序列GFX_lIX_mX_nYYIH之HVR-H1，其中X_l為N、S或T；X_m為S、D、Y或A；且X_n為G或D(SEQ ID NO：25)；(b)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_oYADSVKG之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：26)；及(c)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHYFDY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：27)。
在某些實施例中，本文所述之抗體另外包含(a)包含胺基酸序列RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA之HVR-L1，其中X_a為D、S或V；X_b為V或I；X_c為S、N或G；X_d為T或N；X_e為A或Y；且X_f為V或L(SEQ ID NO：23)；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列QQX_gX_hX_iX_jPX_kT之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：24)。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-H3。
在某些實施例中，本文所述之抗體另外包含(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-H3。
在某些實施例中，本文所述之抗體另外包含(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體另外包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體另外包含SEQ ID NO：17之重鏈可變結構域構架(FR2)序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)與SEQ ID NO：8之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：28之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：30之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：32之VH序列；(b)包含SEQ ID NO：31之VL序列；或(c)包含SEQ ID NO：32之VH序列及包含SEQ ID NO：31之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含SEQ ID NO：8之VH序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含SEQ ID NO：7之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含SEQ ID NO：30之VH序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含SEQ ID NO：28之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含SEQ ID NO：29之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含SEQ ID NO：8之VH序列與SEQ ID NO：7之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含SEQ ID NO：30之VH序列及SEQ ID NO：28之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含SEQ ID NO：30之VH序列及SEQ ID NO：29之VL序列。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含胺基酸序列GFX_lIX_mX_nYYIH之HVR-H1，其中X_l為N、S或T；X_m為S、D、Y或A；且X_n為G或D(SEQ ID NO：25)；(b)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_oYADSVKG之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：26)；(c)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHYFDY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：27)；(d)包含胺基酸序列RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA之HVR-L1，其中X_a為D、S或V；X_b為V或I；X_c為S、N或G；X_d為T或N；X_e為A或Y且X_f為V或L(SEQ ID NO：23)；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列QQX_gX_hX_iX_jPX_kT之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：24)。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含選自SEQ ID NO：4、20及47至51之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：5及52之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含選自SEQ ID NO：6及53之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含選自SEQ ID NO：1、18、21及33之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：3、19、22及34至46之胺基酸序列的HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：89)；(b)包含胺基酸序列X_gX_hX_iX_jPX_k之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：86)；及(c)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_o之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：88)。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含胺基酸序列GFX_lIX_mX_nYY之HVR-H1，其中X_l為N、S或T；X_m為S、D、Y或A；且X_n為G或D(SEQ ID NO：87)；(b)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_o之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：88)；及(c)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：89)。
在某些實施例中，本文所述之抗體另外包含(a)包含胺基酸序列X_aX_bX_cX_dX_eX_f之HVR-L1，其中X_a為D、S或V；X_b為V或I；X_c為S、N或G；X_d為T或N；X_e為A或Y；且X_f為V或L(SEQ ID NO：85)；(b)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列X_gX_hX_iX_jPX_k之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：86)。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含胺基酸序列GFX_lIX_mX_nYY之HVR-H1，其中X_l為N、S或T；X_m為S、D、Y或A；且X_n為G或D(SEQ ID NO：87)；(b)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_o之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：88)；(c)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：89)；(d)包含胺基酸序列X_aX_bX_cX_dX_eX_f之HVR-L1，其中X_a為D、S或V；X_b為V或I；X_c為S、N或G；X_d為T或N；X_e為A或Y；且X_f為V或L(SEQ ID NO：85)；(e)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列X_gX_hX_iX_jPX_k之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：86)。
在某些實施例中，本文所述之抗體包含(a)包含選自SEQ ID NO：4、20、47至51及75至80之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：5、52及81至82之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含選自SEQ ID NO：1、18、21、33及54至57之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含選自SEQ ID NO：2及58之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，本文所述之抗體為全長IgG1或IgG4抗體。
在另一個態樣中，提供一種經分離核酸，其編碼本文所述之抗-HtrA1抗體。
在另一個態樣中，提供一種宿主細胞，其包含編碼本文所述之抗-HtrA1抗體之經分離核酸。
在另一個態樣中，提供一種產生抗體之方法。該方法可包含在適合表現編碼抗-HtrA1抗體之核酸的條件下培養包含編碼抗-HtrA1抗體之經分離核酸的宿主細胞。該方法可另外包含自宿主細胞培養物回收抗-HtrA1抗體、純化抗-HtrA1抗體或調配抗-HtrA1抗體與醫藥學上可接受之賦形劑。
在另一個態樣中，提供一種包含抗-HtrA1抗體及細胞毒性劑之免疫結合物。
在另一個態樣中，提供一種包含抗-HtrA1抗體及醫藥學上可接受之載劑之醫藥調配物。
在另一個態樣中，本申請案提供一種用作藥物之抗-HtrA1抗體，例如用於治療年齡相關之黃斑變性(濕性或乾性)、地圖樣萎縮、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變、用於抑制視網膜細胞或感光細胞退化，或用於抑制眼睛中之HtrA1蛋白酶活性。
在另一個態樣中，本申請案提供抗-HtrA1抗體之用途，其用於製造藥物，例如用於治療年齡相關之黃斑變性(AMD，濕性或乾性)、地圖樣萎縮(GA)、糖尿病性視網膜病變(DR)、早產兒視網膜病變(ROP)或息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)，用於抑制視網膜細胞或感光細胞退化或用於抑制眼睛中之HtrA1蛋白酶活性的藥物。
在另一個態樣中，本申請案提供一種治療患有年齡相關之黃斑變性(濕性或乾性)、地圖樣萎縮、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變之個體的方法，其包含投與個體有效量之如本文所述之抗-HtrA1抗體。
在另一個態樣中，本申請案提供一種用於抑制個體中之視網膜細胞或感光細胞退化之方法，其包含投與個體有效量之如本文所述之抗-HtrA1抗體以抑制視網膜細胞或感光細胞退化。
在另一個態樣中，本申請案提供一種抑制個體眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性之方法，其包含投與個體有效量之如本文所述之抗-HtrA1抗體以抑制眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性。
專利或申請案檔案含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要的費用後，財產局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。 I.定義
用於本文目的之「受者人類構架」為包含來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架(如以下所定義)之輕鏈可變結構域(VL)構架或重鏈可變結構域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之受者人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在某些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下或2個或2個以下。在某些實施例中，VL受者人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用總和之強度。除非另作指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)來表示。親和力可由此項技術中已知之常用方法來量測，包括本文所述之彼等方法。下文描述用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例。
「親和力成熟」抗體係指與在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多種變化之親本抗體相比在一或多個高變區(HVR)中具有一或多種變化之抗體，該等變化使抗體對抗原之親和力得以改良。
術語「抗-HtrA1抗體」及「結合至HtrA1之抗體」係指能夠以足以使抗體用作標靶HtrA1之診斷劑及/或治療劑之親和力結合HtrA1的抗體。在一個實施例中，抗-HtrA1抗體與無關非HtrA1蛋白之結合程度小於如例如由放射免疫分析(RIA)量測之抗體與HtrA1結合之約10%。在某些實施例中，與HtrA1結合之抗體具有1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10^-8 M或10^-8 M以下，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)之解離常數(Kd)。在某些實施例中，抗-HtrA1抗體結合至在不同物種HtrA1之間保守之HtrA1抗原決定基。
術語「抗體」在本文中以最廣泛含義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指並非完整抗體之分子，其包含結合完整抗體所結合之抗原的完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
與參考抗體「結合至相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原的結合阻斷50%或50%以上之抗體，及反之，參考抗體在競爭分析中將抗體與其抗原的結合阻斷50%或50%以上。本文提供一種例示性競爭分析。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5種主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干種可進一步分為子類(同型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如，甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花屬生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素(mitomycin C)、瘤克寧錠(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段(諸如核分解酶)；抗生素；毒素(諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體)；及下文揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下有效達成所要治療或預防結果持續必需時間之量。
本文中之術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈中含有至少一部分恆定區之C端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異體Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，亦稱作EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「構架區」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外之可變結構域殘基。可變結構域之FR一般由4個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般按以下次序出現於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換地用以指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括原始轉型細胞及來源於其之子代，而與繼代數無關。子代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩檢或選擇具有相同功能或生物活性之突變子代。
「人類抗體」為所具有的胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義尤其排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為表示所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變結構域序列之子群。一般而言，序列子群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之子群。在一個實施例中，對於VL而言，子群為如Kabat等人(同上文)中之子群kappa I。在一個實施例中，對於VH而言，子群為如Kabat等人(同上文)中之子群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上所有之至少一個且一般為兩個可變結構域，其中所有或實質上所有之HVR(例如，CDR)對應於非人類抗體之HVR，且所有或實質上所有之FR對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。
B)L1之24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；C)30-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35(H1)、47-58(H2)、93-100a-j(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))。
除VH中之CDR1外，CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，該等殘基為接觸抗原之殘基。SDR係包含於稱為簡化CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之CDR區域內。例示性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31至34、L2之胺基酸殘基50至55、L3之胺基酸殘基89至96、H1之胺基酸殘基31至35B、H2之胺基酸殘基50至58及H3之胺基酸殘基95至102處。(參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另外指示，否則本文中根據Kabat等人(同上文)對可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。
「免疫結合物」為與一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)結合之抗體。
「個體(individual或subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體為人類。
「經分離」抗體為與其天然環境組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體經純化至大於95%或99%純度，如由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析法(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評估抗體純度之方法的評述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「經分離」核酸係指已與其天然環境組分分離之核酸分子。經分離核酸包括初始含有核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但核酸分子存在於染色體外不同於其天然染色體位置或僅含有編碼序列之染色體位置。
「編碼抗-HtrA1抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多種核酸分子，包括位於單一或獨立載體中之該(等)核酸分子及在宿主細胞中之一或多個位置處存在之該(等)核酸分子。
如本文所用之術語「單株抗體」係指獲自實質上均質之抗體群體的抗體，亦即除可能之變異抗體(例如含有天然存在之突變或在製備單株抗體製劑期間產生，該等變異體一般少量存在)以外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑不同，單株抗體製劑之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」表示獲自實質上均質之抗體群體的抗體特徵，且不應理解為要求由任何特定方法產生抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可由各種技術來製備，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體-呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，本文中描述該等方法及用於製造單株抗體之其他例示性方法。
「裸抗體」係指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「原生抗體」係指具有不同結構之天然存在免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG抗體為約150,000道爾頓之雜四聚醣蛋白，由經二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，每一重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，繼而為3個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，每一輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域，繼而為恆定輕鏈(CL)結構域。抗體輕鏈可基於其恆定結構域之胺基酸序列而指定為兩種類型中之一種，稱為κ及λ。
術語「藥品說明書(package insert)」用於係指治療產品之商業包裝中通常所包括之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、關於使用該等治療產品之禁忌及/或警示的資訊。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對候選序列與參考多肽序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比。可由此項技術中之多種方式，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，達成用以測定胺基酸序列一致性百分比目的之比對。熟習此項技術者可確定適於比對序列之參數，包括為在所比較序列之全長上達成最大比對所需之任何演算法。然而，為本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式之作者係Genentech,Inc.，且原始程式碼與使用者文獻一起在美國版權局(U.S.Copyright Office),Washington D.C.,20559申請，登記為美國版權登記第TXU510087號。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開獲得，或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯以供在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，如下計算既定胺基酸序列A對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可稱為既定胺基酸序列A具有或包含某一對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%)：100×分率X/Y其中X為在A與B之程式比對中，由序列比對程式ALIGN-2計為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不等時，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值均如緊鄰的前一段落中所述使用ALIGN-2電腦程式來獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈某種形式以允許其中所含活性成分之生物活性有效且不含對該調配物所投與之個體而言具有不可接受之毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指除活性成分以外，醫藥調配物中對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另外指示，否則如本文所用之術語「高溫需要相關A」或「HtrA1」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生HtrA1。該術語涵蓋「全長」未加工HtrA1以及由在細胞中加工所產生之任何形式的HtrA1。該術語亦涵蓋天然存在之HtrA1變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性HtrA1之胺基酸序列以SEQ ID NO：13展示。人類HtrA1之例示性片段包括包含胺基酸Q23-P480或P161-K379、基本上由其組成或由其組成之片段。
如本文所用之「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入，且可進行以用於預防或在臨床病理學病程期間進行。所要治療作用包括(但不限於)預防疾病出現或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理學後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病病狀及緩和或改善預後。在某些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病產生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中每一結構域包含4個保守構架區(FR)及3個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman及Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用VH或VL結構域自結合抗原之抗體分離以分別篩檢互補VL或VH結構域文庫。參見例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用之術語「載體」係指能夠使其所連接之另一核酸增殖之核酸分子。該術語包括呈自我複製型核酸結構(self-replicating nucleic acid structure)形式之載體以及併入其所引入之宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。 II.組合物及方法
在一個態樣中，本發明部分地基於以下發現，即HtrA1活性減小對眼睛中之感光細胞、外核層及視網膜電圖功能具有保護作用。在某些實施例中，提供與HtrA1結合之抗體。本發明之抗體例如適用於診斷或治療與HtrA1活性相關之各種疾病，包括眼科病症，諸如年齡相關之黃斑變性或地圖樣萎縮。
A.例示性抗-HtrA1抗體
在一個態樣中，本發明提供結合至HtrA1之經分離抗體。在某些實施例中，抗-HtrA1抗體具有一或多種以下特性：(i)對於一或多種HtrA1受質具有小於50 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、5 nM、3 nM、2.5 nM、2 nM、1 nM或更小之IC₅₀；(ii)以1個可變結構域對HtrA1三聚體之一個次單元之比率結合至HtrA1(例如，Fab以3個Fab比1個HtrA1三聚體之比率結合至HtrA1三聚體，且IgG以3個IgG比2個HtrA1三聚體之比率結合至HtrA1三聚體)；(iii)對於包含兩個可變結構域之抗體而言，以導致形成與圖9中所示類似之「籠」之方式結合至HtrA1；(iv)不阻止HtrA1形成三聚體；(v)結合至HtrA1蛋白之環C中的一或多個殘基；(vi)結合至HtrA1之蛋白酶結構域；(vii)結合至包含SEQ ID NO：13之胺基酸N224或K248中之一或兩者或其在不同HtrA1序列中之胺基酸等效物(例如，SEQ ID NO：14之胺基酸N224及K248，參見圖10A-B)的抗原決定基；(viii)結合至包含一或多個以下殘基：SEQ ID NO：13之N224、K248、V201、T223、K243、K225、E247及H220或其在不同HtrA1序列中之胺基酸等效物的抗原決定基；(ix)與鼠類HtrA1交叉反應；(x)不與HtrA2、HtrA3及/或HtrA4交叉反應；(xi)與包含SEQ ID NO：8之VH序列與SEQ ID NO：7之VL序列之抗體競爭結合至HtrA1；或(xii)以500 nM之解離常數結合至HtrA1；或(xiii)抑制HtrA1與α1-抗胰蛋白酶(A1AT)之間形成複合物。
在一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR的抗-HtrA1抗體：(a)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR的抗-HtrA1抗體：(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR的抗-HtrA1抗體：(a)包含選自SEQ ID NO：4、20、47至51及75至80之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：5、52及81至82之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含選自SEQ ID NO：1、18、21、33及54至57之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含選自SEQ ID NO：2及58之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR的抗-HtrA1抗體：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR的抗-HtrA1抗體：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR的抗-HtrA1抗體：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3。在又一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H2。在又一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3。
在一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L3。在又一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-H2。在又一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3。
在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含選自SEQ ID NO：4、20、47至51及75至80之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：5、52及81至82之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，抗體包括包含選自SEQ ID NO：6及53之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包括包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3及包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3。在又一個實施例中，抗體包括包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3、包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3及包含選自SEQ ID NO：5、52及81至82之胺基酸序列之HVR-H2。在又一個實施例中，抗體包括(a)包含選自SEQ ID NO：4、20、47至51及75至80之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：5、52及81至82之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3。
在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。在又一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2。在又一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。
在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。在又一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3；及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。在又一個實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3；及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2。在又一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含選自SEQ ID NO：1、18、21、33及54至57之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含選自SEQ ID NO：2及58之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，抗體包括(a)包含選自SEQ ID NO：1、18、21、33及54至57之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含選自SEQ ID NO：2及58之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，抗體包括(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包括(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，本發明之抗體包括(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明之抗體包括(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)包含選自SEQ ID NO：4、20、47至51及75至80之胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含選自SEQ ID NO：5、52及81至82之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)包含選自SEQ ID NO：1、18、21、33及54至57之胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含選自SEQ ID NO：2及58之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明之抗體包括(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明之抗體包括：(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包括(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種包括以下之抗體：(a)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，本發明提供一種包括以下之抗體：(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明提供一種包括以下之抗體：(a)包含選自SEQ ID NO：4、20、47至51及75至80之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：5、52及81至82之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含選自SEQ ID NO：1、18、21、33及54至57之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含選自SEQ ID NO：2及58之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明提供一種包括以下之抗體：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明提供一種包括以下之抗體：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個實施例中，本發明提供一種包括以下之抗體：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
在以上任何實施例中，抗-HtrA1抗體係人類化的。在一個實施例中，抗-HtrA1抗體包括如以上任何實施例中之HVR，且另外包含受者人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在另一個實施例中，抗-HtrA1抗體包括如以上任何實施例中之HVR，且另外包括包含SEQ ID NO：17之FR2序列之VH。
在另一個態樣中，抗-HtrA1抗體包括與SEQ ID NO：8或29任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗-HtrA1抗體保留結合至HtrA1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：8或29中總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR外部之區域中(亦即，在FR中)出現取代、插入或缺失。抗-HtrA1抗體視情況包含SEQ ID NO：8、29或32中之VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含選自SEQ ID NO：4、20、25及47至51之胺基酸序列之HVR-H1、(b)包含選自SEQ ID NO：5、26及52之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含選自SEQ ID NO：6、27及53之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，提供一種抗-HtrA1抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：7、28或30中任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗-HtrA1抗體保留結合至HtrA1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：7、28或30中總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR外部之區域中(亦即，在FR中)出現取代、插入或缺失。抗-HtrA1抗體視情況包含SEQ ID NO：7、28、30或31中之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含選自SEQ ID NO：1、18、21、23及33之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含選自SEQ ID NO：3、19、22、24及34至36之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-HtrA1抗體，其中該抗體包含如上文所提供任何實施例中之VH及如上文所提供任何實施例中之VL。在一個實施例中，抗體包含分別於SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：31中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含分別於SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：7中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含分別於SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：28中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含分別於SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在又一個態樣中，本發明提供一種與本文所提供之抗-HtrA1抗體結合至相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供一種與包含SEQ ID NO：8之VH序列及SEQ ID NO：7之VL序列之抗-HtrA1抗體結合至相同抗原決定基之抗體。在某些實施例中，提供一種結合至含有SEQ ID NO：13之殘基N224、K248或其兩者或其在不同HtrA1序列中之殘基等效物的HtrA1之抗原決定基的抗體。在某些實施例中，HtrA1之抗原決定基另外包含一或多個以下殘基：SEQ ID NO：13之V201、T223、K243、K225、E247及H220，或其在不同HtrA1序列中之胺基酸等效物。在某些實施例中，提供一種結合至含有一或多個殘基N224、K248及V201或SEQ ID NO：13之所有前述殘基、或其在不同HtrA1序列中之殘基等效物的HtrA1之抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合至含有一或多個殘基N224、K248、V201、T223及K243或SEQ ID NO：13之所有前述殘基、或其在不同HtrA1序列中之殘基等效物的HtrA1之抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合至含有一或多個殘基N224、K248、V201、T223、K243、K225、E247及H22A或SEQ ID NO：13之所有前述殘基、或其在不同HtrA1序列中之殘基等效物的HtrA1之抗原決定基的抗體。在某些實施例中，抗原決定基為線性抗原決定基。在其他實施例中，抗原決定基為構形抗原決定基。
在本發明之又一個態樣中，根據任何以上實施例之抗-HtrA1抗體為單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一個實施例中，抗-HtrA1抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')₂片段。在另一個實施例中，抗體為全長抗體，例如如本文定義之完整IgG1抗體或其他抗體類別或同型。
在某些實施例中，根據任何以上實施例之抗-HtrA1抗體並非具有SEQ ID NO：8之VH序列與SEQ ID NO：7之VL序列之抗體。
在又一個態樣中，根據任何以上實施例之抗-HtrA1抗體可併有如下文部分1至7中所述之任何單一或組合特徵：
1.抗體親和力
在某些實施例中，本文提供之抗體具有1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM之解離常數(Kd)(例如10^-8 M或10^-8 M以下，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)。
在一個實施例中，藉由如以下分析所述以所關注抗體之Fab形式及其抗原進行之放射性標記抗原結合分析(RIA)量測Kd。藉由在存在一系列未經標記抗原滴定的情況下使Fab與最小濃度之經(¹²⁵I)標記抗原平衡，隨後用經抗-Fab抗體塗佈之培養盤捕獲結合抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立分析條件，用50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5 μg/ml捕獲抗-Fab抗體(Cappel Labs)將MICROTITER^®多孔培養盤(Thermo Scientific)塗佈隔夜，且接著在室溫(約23℃)下含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷2至5小時。在非吸附性培養盤(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM[¹²⁵I]-抗原與所關注Fab之連續稀釋液混合(例如符號Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中用抗-VEGF抗體Fab-12進行評估)。隨後將所關注Fab培育隔夜；然而，培育可持續較長時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至捕捉培養盤中以供培育(例如1小時)。隨後移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^®)之PBS將培養盤洗滌8次。當培養盤乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體(MICROSCINT-20^TM；Packard)，且在TOPCOUNT^TM γ計數器(Packard)上對培養盤計數十分鐘。選擇產生小於或等於20%最大結合之各Fab的濃度用於競爭性結合分析。
根據另一個實施例，使用表面電漿子共振分析，使用BIACORE^®-2000或BIACORE^®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下，用固定之抗原CM5晶片，在約10個反應單位(RU)下量測Kd。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)，之後以5微升/分鐘之流速注射以獲得約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。繼注射抗原之後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應基團。對於動力學量測而言，在25℃下，以約25 μl/min之流速注射含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)界面活性劑之PBS(PBST)中的Fab兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE^®評估軟體3.2版)，藉由同時擬合締合與解離感測器圖譜來計算締合速率(k_on)與解離速率(k_off)。平衡解離常數(Kd)以k_off/k_on比率計算。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上述表面電漿子共振分析測定之締合速率超過10⁶ M^-1s^-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該技術量測在25℃下、在遞增濃度之抗原存在下PBS(pH 7.2)中之20 nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度的增加或減少(激發=295 nm；發射=340 nm，16 nm帶通)，如在分光計(諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。
2.抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')₂片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單結構域抗體為包含抗體之所有或一部分重鏈可變結構域或所有或一部分輕鏈可變結構域之抗體片段。在某些實施例中，單結構域抗體為人類單結構域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術來製備，包括(但不限於)如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生。
3.嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體例如描述於美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在某些實施例中，人類化抗體中之某些FR殘基經來自非人類抗體(例如，HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代例如用以恢復或改良抗體之特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法例如在Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中綜述，且例如在Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「定向選擇」方法)中進一步描述。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；來源於特定子群輕鏈或重鏈可變區之人類抗體共同序列之構架區(參見例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.、151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及來源於篩檢FR文庫之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人類抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術來產生。人類抗體一般在van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中描述。
人類抗體可藉由向轉殖基因動物投與免疫原來製備，該轉殖基因動物已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。該等動物通常含有置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中之所有或一部分人類免疫球蛋白基因座。在該等轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常不經活化。關於由轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。例如亦參見描述XENOMOUSE^TM技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,041,870號及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請案公開案第US 2007/0061900號。來自由該等動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合來進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法來製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株。(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如於以下中描述之彼等方法：美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(Trioma技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類來源噬菌體呈現文庫之Fv純系可變結構域序列而產生。該等可變結構域序列隨後可與所要人類恆定結構域組合。下文描述自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
5.文庫來源抗體
本發明之抗體可藉由篩檢組合文庫中具有所要活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知用於產生噬菌體呈現文庫及篩檢該等文庫中具有所要結合特徵之抗體的各種方法。該等方法例如綜述於Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)中且進一步例如描述於McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury之Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因之譜系且在噬菌體文庫中隨機重組，其可隨後如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述篩檢抗原結合噬菌體。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述，可(例如自人類)選殖原生譜系以提供抗多種非自體抗原以及自體抗原之抗體的單一來源而無需任何免疫接種。最後，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高變CDR3區且完成活體外重排來合成製造原生文庫。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
6.多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性之一係針對HtrA1而另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至HtrA1之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現HtrA1之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「洞中突結(knob-in-hole)」工程(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由工程改造用於製造抗體Fc-雜二聚體分子之靜電牽引作用(WO 2009/089004A1)；使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用製造雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))及如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述製備三特異性抗體來製備。
本文中亦包括具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程改造抗體(包括「章魚抗體(Octopus antibody)」)(參見例如US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括包含結合至HtrA1以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
7.抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文所提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。該等修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內缺失殘基及/或插入殘基及/或取代殘基。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於進行取代突變誘發之所關注位點包括HVR及FR。表1中在「保守取代」之標題下展示保守取代。更實質性之變化在表1中於標題「例示性取代」下提供且如下文關於胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩檢具有所要活性，例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC的產物。
胺基酸可根據共同側鏈特性來分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將該等類別之一的成員換成另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得變異體的某些生物特性將相對於親本抗體有所改變(例如改良)(例如，增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。一種例示性取代變異體為親和力成熟抗體，其可便利地例如使用諸如本文所述彼等之基於噬菌體呈現之親和力成熟技術而產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異抗體並篩檢具有特定生物活性(例如結合親和力)之變異抗體。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。該等改變可在HVR「熱點(hotspot)」(亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率發生突變之密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行，其中測試所得變異體VH或VL之結合親和力。藉由構築二級文庫且自二級文庫再選擇來進行親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之某些實施例中，藉由多種方法之任一者(例如易出錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)將多樣性引入選用於成熟化之可變基因中。隨後產生二級文庫。隨後篩檢文庫以識別具有所要親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導之方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4至6個殘基)隨機化。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特定鑑別。尤其常以CDR-H3及CDR-L3為標靶。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要該等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。該等改變可在HVR「熱點」或SDR之外部。在上文提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種識別可標靶用於突變誘發之抗體殘基或區域之適用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在此方法中，識別標靶殘基之殘基或基團(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且由中性或帶負電胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代表現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間之接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基可經標靶或消除作為取代候選物。可篩檢變異體以確定其是否含有所要特性。
胺基酸序列插入包括長度為一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽的胺基及/或羧基未端融合體，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如，對於ADEPT而言)或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合體。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，對本文提供之抗體進行改變以增加或減小抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來方便地達成。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支雙觸角(biantennary)寡醣，其通常由N-鍵聯連接至Fc區之CH2結構域的Asn297。參見例如Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸角寡醣結構「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在某些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏與Fc區連接(直接或間接)之海藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，該抗體中海藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。海藻糖之量係如例如WO 2008/077546中所述，相對於如由MALDI-TOF質譜法量測之連接至Asn 297之所有糖結構(例如複合、混合及高甘露糖結構)總和計算Asn297處糖鏈內之海藻糖的平均量來確定。Asn297係指位於Fc區中大致位置297處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，由於抗體中存在小量序列變化，因此Asn297亦可位於位置297上游或下游之大致±3個胺基酸處，亦即位置294與300之間。該等海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。關於「去海藻糖基化」或「海藻糖缺失」抗體變異體之公開案實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株實例包括蛋白海藻糖基化不足之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng,94(4)：680-688(2006)；及WO 2003/085107)。
另外提供具有平分型寡醣之抗體變異體，例如，其中連接至抗體Fc區之雙觸角寡醣係由GlcNAc平分。該等抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供寡醣中至少一個半乳糖殘基連接至Fc區之抗體變異體。該等抗體變異體可具有改良之CDC功能。該等抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有某些但並非所有效應功能之抗體變異體，此使其成為用於其中抗體之活體內半衰期重要而某些效應功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用的所要候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確定CDC及/或ADCC活性之降低及/或衰竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC、NK細胞之初級細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁上之表3中。用以評估所關注分子之ADCC活性的活體外分析之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號中(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如，流動式細胞測量術之ACTI^TM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；及CytoTox 96^®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。用於該等分析之適用效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型(諸如在Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭示之彼動物模型)中，活體內評估所關注分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體無法與C1q結合且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代之彼等抗體(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在兩個或兩個以上胺基酸位置265、269、270、297及327處經取代之Fc突變體，包括殘基265及297經取代為丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合得以改良或減弱之某些抗體變異體已有所描述。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有改良ADCC之一或多個胺基酸取代之Fc區，例如Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處的取代。
在某些實施例中，在Fc區中產生改變，致使C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或減弱)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
半衰期增加且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合得以改良之抗體描述於US 2005/0014934A1(Hinton等人)中，新生兒Fc受體負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。彼等抗體包括其中具有使Fc區與FcRn之結合得以改良之一或多處取代的Fc區。該等Fc變異體包括在以下Fc區殘基之一或多處具有取代之Fc變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例如「硫基MAb(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸工程改造抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之其他非蛋白部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中之穩定性而可在製造時具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可分支或未分支。連接至抗體之聚合物數目可變化，且若連接一種以上聚合物，則該等聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生之聚合物的數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定條件下之療法等考慮來確定。
在另一個實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性加熱之非蛋白部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。此輻射可具有任意波長，且包括(但不限於)不損害一般細胞但可將非蛋白部分加熱至可殺死抗體-非蛋白部分近側之細胞之溫度的波長。
B.重組方法及組合物
舉例而言，可使用如美國專利第4,816,567號中所述之重組法及組合物來產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗-HtrA1抗體之經分離核酸。該核酸可編碼包含抗體VL之胺基酸序列及/或包含抗體VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在又一個實施例中，提供一或多種包含該核酸之載體(例如表現載體)。在又一個實施例中，提供一種包含該核酸之宿主細胞。在一種該實施例中，宿主細胞包含(例如，經以下轉型)：(1)包含某一核酸之載體，該核酸編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體；及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗-HtrA1抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
為重組產生抗-HtrA1抗體，分離例如如上所述之編碼抗體之核酸且插入一或多個載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離及定序。
適於選殖或表現抗體編碼之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，尤其在不需要糖基化及Fc效應功能時。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其描述大腸桿菌中之抗體片段的表現。)在表現之後，抗體可自細菌細胞漿(bacterial cell paste)分離於可溶性部分中且可經進一步純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適於抗體編碼之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)獲得。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別出多種可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。例如參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES^TM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1細胞株；人類胚胎腎細胞株(如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽托利細胞(sertoli cell)(如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell,BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述之TRI細胞；MRC 5細胞及FS4細胞。其他有用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR^- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
C.分析
本文提供之抗HtrA1抗體可藉由此項技術中已知之各種分析針對其物理/化學特性及/或生物活性來識別、篩檢或表徵。
1.結合分析及其他分析
在一個態樣中，例如藉由已知方法(諸如ELISA、西方墨點法等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一個態樣中，可使用競爭分析來識別與Fab94或IgG94競爭結合至HtrA1之抗體。在某些實施例中，該種競爭抗體結合至Fab94或IgG94所結合之相同抗原決定基(例如，線性或構形抗原決定基)。對抗體所結合之抗原決定基進行定位之詳細例示方法係提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols,」，Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在例示性競爭分析中，在包含結合至HtrA1之第一標記抗體(例如，Fab94或IgG94)及經測試其與第一抗體競爭結合至HtrA1之能力之第二未標記抗體的溶液中培育固定HtrA1。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育固定HtrA1。在允許第一抗體與HtrA1結合之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與固定HtrA1相關之標記量。若測試樣品中與固定HtrA1相關之標記量相對於對照樣品實質上減少，則表示第二抗體與第一抗體競爭結合至HtrA1。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性分析
在一個態樣中，提供用以識別其具有生物活性之抗-HtrA1抗體的分析。舉例而言，生物活性可包括阻斷、拮抗、抑制、干擾、調節及/或降低HtrA1之一或多種生物活性。亦提供具有該種活體內及/或活體外生物活性之抗體。
在某些實施例中，測試本發明抗體之該種生物活性。在某些實施例中，抗-HtrA1抗體結合至HtrA1且降低或抑制其對一或多種HtrA1受質之絲胺酸蛋白酶活性，該等HtrA1受質例如包括如下文實例中所述之H2-Opt肽、β-酪蛋白或BODIPY FL酪蛋白受質或任何其他適合之HtrA1受質。在某些實施例中，抗-HtrA1抗體以對於一或多種HtrA1受質而言小於50 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、5 nM、3 nM、2.5 nM、2 nM、1 nM或1 nM以下之IC₅₀抑制HtrA1絲胺酸蛋白酶活性。在某些實施例中，抗-HtrA1抗體保護感光細胞以防退化、保護外核層之厚度或保護眼部疾病模型(諸如下文實例中所述之恆定曝光小鼠模型)中之視網膜電圖功能活性。
D.免疫結合物
本發明亦提供包含本文中與一或多種細胞毒性劑結合之抗-HtrA1抗體的免疫結合物，該等細胞毒性劑諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白毒素，細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，免疫結合物為一種其中抗體與一或多種藥物結合之抗體-藥物結合物(ADC)，該等藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧利他汀(auristatin)，諸如單甲基奧利他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素(daunomycin)或小紅莓(doxorubicin)(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)及美國專利第6,630,579號)；甲胺喋呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，諸如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、特賽他賽(tesetaxel)及奧塔他賽(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)及CC1065。
在另一個實施例中，免疫結合物包含與酶促活性毒素或其片段結合之如本文所述之抗體，該等毒素包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素(ricin)A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。
在另一個實施例中，免疫結合物包含與放射性原子結合以形成放射性結合物的如本文所述之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍法研究之放射性原子(例如Tc^99m或I¹²³)或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱作磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如再次為碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑來製備，該等偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苄醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苄醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰氧基苄基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。連接子可為有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用以下可購得(例如自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A購得)之交聯試劑製備之該等結合物，該等交聯試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。
E.用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文提供之任何抗-HtrA1抗體均適用於偵測生物樣品中HtrA1之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如包含感光細胞、視網膜色素上皮細胞、外核層細胞、內核層細胞、Muller細胞、睫狀上皮或視網膜組織之樣品。
在一個實施例中，提供用於診斷或偵測方法之抗-HtrA1抗體。在又一個態樣中，提供一種偵測生物樣品中HtrA1之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗-HtrA1抗體在允許抗-HtrA1抗體結合至HtrA1之條件下接觸，及偵測在抗-HtrA1抗體與HtrA1之間是否形成複合物。該方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用抗-HtrA1抗體來選擇適合抗-HtrA1抗體療法之個體，例如其中HtrA1為用於選擇患者之生物標記。
在某些實施例中，可藉由偵測HtrA1基因或HtrA1對照序列中之一或多種多形現象(諸如HtrA1啟動子多形現象rs11200638(G/A))來識別適於抗-HtrA1抗體治療之患者(參見例如A.DeWan等人，Science 314：989-992(2006))。
可使用本發明抗體診斷之例示性病症包括眼部病症，諸如濕性年齡相關之黃斑變性(AMD)、乾性年齡相關之黃斑變性、地圖樣萎縮(GA)、糖尿病性視網膜病變(DA)、早產兒視網膜病變(ROP)或息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)。
在某些實施例中，提供經標記之抗-HtrA1抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H及¹³¹I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素(fluorescein)及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基(dansyl)；傘酮(umbelliferone)；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素(luciferin)；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，以及使用過氧化氫來氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似物。
F.醫藥調配物
如本文所述之抗-HtrA1抗體之醫藥調配物係藉由混合具有所要純度的該抗體與一或多種視情況可選之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))而製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文之例示性醫藥學上可接受之載劑另外包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX^®,Baxter International,Inc.)。某些例示性
sHASEGPs及使用方法(包括rHuPH20)於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中描述。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種其他葡糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)合併。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。含水抗體調配物包括美國專利第6,171,586及WO 2006/044908中描述者，後一調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
為治療特定適應症所需，本文之調配物亦可含有一種以上活性成分，較佳為具有不會彼此不利影響之互補活性的活性成分。舉例而言，為治療與不欲之新血管生成相關之眼病(諸如濕性AMD)，可能需要進一步提供抗血管生成療法，諸如LUCENTIS^TM(蘭尼單抗(ranibizumab))之抗VEGF療法。該等活性成分適合以有效達成預定目的之量組合存在。在其他實施例中，治療與不欲之眼新血管生成相關之疾病或病症可能涉及抗-HtrA1抗體與光動力療法(例如與MACUGEN^TM或VISUDYNE^TM)之組合。
活性成分可截留於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微囊中，例如分別為在膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或聚乳液中之羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質呈成形物品(例如薄膜或微囊)之形式。
欲用於活體內投藥之調配物通常無菌。易於例如藉由經無菌過濾膜過濾來實現滅菌。
G.治療方法及組合物
本文提供之任何抗-HtrA1抗體均可用於治療方法中。
在某些實施例中，抗-HtrA1抗體適用於抑制患有眼部病症或有發展眼部病症風險之患者(例如，眼睛中具有HtrA1多形現象、HtrA1表現增加或至少一個眼睛中具有隱結(drusen)之患者)眼睛中之視網膜細胞(諸如視網膜色素上皮(RPE)細胞)或感光細胞退化。在某些實施例中，抗-HtrA1抗體可用於在待治療眼睛中具有隱結之患者眼睛中減緩發展為晚期地圖樣萎縮或乾性年齡相關之黃斑變性。在某些實施例中，可藉由在患者之至少一個眼睛中偵測疾病發作來識別適合以抗-HtrA1抗體治療之患者。舉例而言，可藉由在一個眼睛中偵測隱結、地圖樣萎縮或膠狀新血管生成而另一眼睛無症狀來選擇某些患者。該等患者可為用於在無症狀眼睛中之預防性治療的良好候選者，例如以延遲該等症狀(例如，隱結、地圖樣萎縮及/或膠狀新血管生成)在無症狀眼睛中發作或降低其嚴重度。或者，可根據本文所述之方法治療有症狀眼睛、或治療有症狀眼睛與無症狀眼睛。因此，抗-HtrA1抗體可用於預防或抑制患者眼睛之眼部病症發展，其中該患者之另一眼睛已患有隱結、濕性AMD或地圖樣萎縮，而經治療之眼睛尚無症狀。或者，治療有症狀眼睛，或治療有症狀眼睛與無症狀眼睛。
在另一個實施例中，抗-HtrA1抗體適用於治療關節炎。
在一個態樣中，提供一種用作藥物之抗-HtrA1抗體。在其他態樣中，提供一種用於治療眼部疾病或病症(諸如AMD(濕性或乾性)、GA、DR、PCV或ROP)之抗-HtrA1抗體。在某些實施例中，提供一種用於治療方法中之抗-HtrA1抗體。在某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有眼部疾病或病症之個體之方法中的抗-HtrA1抗體，該方法包含投與個體有效量之抗-HtrA1抗體。在一種該實施例中，該方法另外包含投與個體有效量之至少一種如下文所述之其他治療劑。在其他實施例中，本發明提供一種用於抑制患者眼睛中之視網膜細胞(諸如RPE細胞)或感光細胞退化的抗-HtrA1抗體。在某些實施例中，本發明提供一種用於抑制個體中之視網膜細胞或感光細胞退化之方法中的抗-HtrA1抗體，該方法包含投與個體有效量之抗-HtrA1抗體以抑制視網膜細胞或感光細胞之退化。在其他實施例中，本發明提供一種用於抑制患者眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性的抗-HtrA1抗體。在某些實施例中，本發明提供一種用於抑制患者眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性之方法中的抗-HtrA1抗體，該方法包含投與個體有效量之抗-HtrA1抗體以抑制眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性。根據以上任何實施例之「個體」較佳為人類。在其他實施例中，本發明提供一種用於在有此需要之患者(例如具有伴息肉樣動脈瘤擴張之脈絡膜血管網路的患者)中抑制PCV之抗-HtrA1抗體。
在又一個態樣中，本發明提供抗-HtrA1抗體之用途，其用於製造或製備藥物。在一個實施例中，該藥物用於治療眼部病症，諸如AMD(濕性或乾性)、GA、DR、PCV或ROP。在又一個實施例中，該藥物用於治療眼部病症之方法中，該方法包含投與患有眼部病症之個體有效量之藥物。在一個該實施例中，該方法另外包含投與個體有效量之至少一種例如如下文所述之其他治療劑。在又一個實施例中，該藥物係用於抑制個體眼睛中之視網膜細胞或感光細胞退化。在又一個實施例中，該藥物用於抑制個體之視網膜細胞或感光細胞退化之方法中，該方法包含投與個體有效量之藥物以抑制個體中之視網膜細胞或感光細胞退化。在又一個實施例中，該藥物用於抑制個體眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性。在又一個實施例中，該藥物用於抑制個體眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性的方法中，該方法包含投與個體有效量之藥物以抑制眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性。根據任何以上實施例之「個體」可為人類。
在又一個態樣中，本發明提供一種治療眼部病症(諸如AMD(濕性或乾性)、GA、DR、PCV或ROP)之方法。在一個實施例中，該方法包含投與患有該種眼部病症之個體有效量之抗-HtrA1抗體。在一個該實施例中，該方法另外包含投與個體有效量之至少一種例如如下文所述之其他治療劑。根據任何以上實施例之「個體」可為人類。
在又一個態樣中，本發明提供一種抑制個體中之視網膜細胞或感光細胞退化的方法。在一個實施例中，該方法包含投與個體有效量之抗-HtrA1抗體以抑制個體中之視網膜細胞或感光細胞退化。在一個實施例中，「個體」為人類。
在又一個態樣中，本發明提供一種抑制個體眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性的方法。在一個實施例中，該方法包含投與個體有效量之抗-HtrA1抗體以抑制個體眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性。在一個實施例中，「個體」為人類。
可藉由評估眼內疾病中常用之各種端點來量測使用抗-HtrA1抗體治療眼部病症之功效，諸如進行眼睛檢查、量測眼內壓、評估視力、量測裂隙燈壓力、評估眼內炎症、量測CNV尺寸、量測CNV洩露(例如藉由螢光素血管攝影術)、量測隱結之量、量測隱結之位置等。在某些實施例中，例如可藉由量測基線至所需時間點之最佳校正視力(best correction visual acuity,BCVA)的平均變化(例如，其中BCVA係基於早期治療糖尿病性視網膜病變研究(ETDRS)視力圖及4公尺之測試距離評估)、量測與基線相比在所需時間點處視力損失少於15個字母之個體的比例、量測與基線相比在所需時間點視力增益大於或等於15個字母之個體的比例、量測在所需時間點視力史尼林當量(visual-acuity Snellen equivalent)為20/2000或更差之個體的比例或量測NEI視力功能調查表(NEI Visual Functioning Questionnaire)來評估視力損失。
在又一個態樣中，本發明提供包含本文提供之任何抗-HtrA1抗體的醫藥調配物，其例如用於任何以上治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗-HtrA1抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗-HtrA1抗體及至少一種例如如下文所述之其他治療劑。
本發明之抗體可單獨或與其他藥劑組合用於治療中。舉例而言，本發明之抗體可與至少一種其他治療劑共投與。在某些實施例中，一種其他治療劑為適合治療與眼睛中不利新血管生成相關之眼部病症(諸如濕性AMD)的治療劑。適合之治療劑例如包括抗血管生成治療劑，諸如抗-VEGF療法，如LUCENTIS^TM(蘭尼單抗)。
上述該等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或各別調配物中)及分開投藥，在此狀況下本發明抗體之投與可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。本發明之抗體亦可與光動力學療法組合使用(例如，與MACUGHN^TM或VISUDYNE^TM)。
本發明之抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適合方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內投藥，且必要時對於局部治療，則包括病灶內投藥。非經腸輸液包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。在一例示性實施例中，可藉由玻璃體內注射投與本發明之抗體(及任何其他治療劑)。部分地視投藥之短暫性或長期性而定，可藉由任何適合途徑給藥，例如藉由注射(諸如靜脈內、玻璃體內或皮下注射)。本文涵蓋多種給藥時程，包括(但不限於)在多個時間點單次或多次投與、團式投與及脈衝輸注。
本發明之抗體將以符合良好醫學實踐之方式來調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及開業醫生已知之其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視調配物中存在之抗體量、病症或治療之類型及其他上述因素而定。該等藥劑通常以與本文所述之相同劑量且利用如本文所述之投藥途徑來使用，或以本文所述劑量之約1%至99%使用，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任意劑量及任何途徑來使用。
為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視所治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重度及病程、投與抗體以達成預防抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體適於一次性或經一系列治療投與患者。無論藉由一或多次分開投藥或藉由連續輸注，視疾病類型及嚴重度而定，投與患者之初始候選劑量例如為約1 μg/kg至15 mg/kg(例如，0.1 mg/kg-10 mg/kg)抗體。一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高劑量之範圍內，此視上文提及之因素而定。對於歷經數天或更長時間重複投藥而言，視病況而定，通常持續治療直至發生對疾病症狀之所需抑止。抗體之一種例示性劑量在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可投與患者約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg中之一或多種劑量(或其任何組合)。該等劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如，以使得患者接受約二至約二十或例如約六劑量之抗體)。可投與最初較高之起始劑量，繼而投與一或多次較低劑量。
應理解，任何上述調配物或治療方法均可使用本發明之免疫結合物替代抗-HtrA1抗體或除抗-HtrA1抗體外亦使用本發明之免疫結合物來進行。
H.製造物品
在本發明之另一個態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之材料的製造物品。製造物品包含容器及位於容器上或與容器相關之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納組合物自身或與有效治療、預防及/或診斷病況之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌存取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或藥品說明書指示該組合物用於治療所選病況。此外，製造物品可包含(a)內含組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)內含組合物之第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或治療劑。本發明該實施例中之製造物品可另外包含藥品說明書，該藥品說明書指示組合物可用於治療特定病況。或者或另外，該製造物品可另外包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液。其可另外包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應瞭解，任何以上製造物品均可包括本發明之免疫結合物替代抗-HtrA1抗體或除抗-HtrA1抗體外亦包括本發明之免疫結合物。
序列密鑰
抗-HtrA1抗體YW505.94之輕鏈HVR
HVR L1：RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：1)
HVR L2：SASFLYS(SEQ ID NO：2)
HVR L3：QQSYTTPPT(SEQ ID NO：3)
抗-HtrA1抗體YW505.94之重鏈HVR
HVR H1：GFNISGYYIH(SEQ ID NO：4)
HVR H2：WIDPYGGDTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)
HVR H3：GTFLTSWGHYFDY(SEQ ID NO：6)
抗-HtrA1抗體YW505.94之輕鏈VR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：7)
抗-HtrA1抗體YW505.94之重鏈VR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISGYYIHWVRQAPGKGLEWVGWIDPYGGDTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTFLTSWGHYFDYWGQGT(SEQ ID NO：8)
人類HtrA1(caps中之全長序列，蛋白酶結構域加下劃線，殘基N224及K248加陰影)
mqipraallpllllllaapasaQLSRAGRSAPLAAGCPDRCEPARCPPQPEHCEGGRARDACGCCEVCGAPEGAACGLQEGPCGEGLQCVVPFGVPASATVRRRAQAGLCVCASSEPVCGSDANTYANLCQLRAASRRSERLHRPPVIVLQRGACGQGQEDPNSLRHKYNFIADVVEKIAPAVVHIELFRKLPFSKREVPVASGSGFIVSEDGLIVTNAHVVTNKHRVKVELKNGATYEAKIKDVDEKADIALIKIDHQGKLPVLLLGRSSELRPGEFVVAIGSPFSLQNTVTTGIVSTTQRGGKELGLRNSDMDYIQTDAIINYGNSGGPLVNLDGEVIGINTLKVTAGISFAIPSDKIKKFLTESHDRQAKGKAITKKKYIGIRMMSLTSSKAKELKDRHRDFPDVISGAYIIEVIPDTPAEAGGLKENDVIISINGQSVVSANDVSDVIKRESTLNMVVRRGNEDIMITVIPEEIDP(SEQ ID NO：13)
鼠類HtrA1(caps中之全長序列，蛋白酶結構域加下劃線)
mqslrttllsllllllaapslalPSGTGRSAPAATVCPEHCDPTRCAPPPTDCEGGRVRDACGCCEVCGALEGAACGLQEGPCGEGLQCVVPFGVPASATVRRRAQAGLCVCASSEPVCGSDAKTYTNLCQLRAASRRSEKLRQPPVIVLQRGACGQGQEDPNSLRHKYNFIADVVEKIAPAVVHIELYRKLPFSKREVPVASGSGFIVSEDGLIVTNAHVVTNKNRVKVELKNGATYEAKIKDVDEKADIALIKIDHQGKLPVLLLGRSSELRPGEFVVAIGSPFSLQNIVTTGIVSTTQRGGKELGLRNSDMDYIQTDAIINYGNSGGPLVNLDGEVIGINTLKVTAGISFAIPSDKIKKFLTESHDRQAKGKAVTKKKYIGIRMMSLTSSKAKELKDRHRDFPDVLSGAYIIEVIPDTPAEAGGLKENDVIISINGQSVVTANDVSDVIKKENTLNMVVRRGNEDIVITVIPEEIDP(SEQ ID NO：14)
鼠類HtrA3(蛋白酶結構域加下劃線)
MQARALLPATLAILATLAVLALAREPPAAPCPARCDVSRCPSPRCPGGYVPDLCNCCLVCAASEGEPCGRPLDSPCGDSLECVRGVCRCRWTHTVCGTDGHTYADVCALQAASRRALQVSGTPVRQLQKGACPSGLHQLTSPRYKFNFIADVVEKIAPAVVHIELFLRHPLFGRNVPLSSGSGFIMSEAGLIVTNAHVVSSSSTASGRQQLKVQLQNGDAYEATIQDIDKKSDIATIVIHPKKKLPVLLLGHSADLRPGEFVVAIGSPFALQNTVTTGIVSTAQRDGKELGLRDSDMDYIQTDAIINYGNSGGPLVNLDGEVIGINTLKVAAGISFAIPSDRITRFLSEFQNKHVKDWKKRFIGIRMRTITPSLVEELKAANPDFPAVSSGIYVQEVVPNSPSQRGGIQDGDIIVKVNGRPLADSSELQEAVLNESSLLLEVRRGNDDLLFSIIPEVVM(SEQ ID NO：15)
鼠類HtrA4(蛋白酶結構域加下劃線)
MSFQRLWAVRTQFLLLWLLLPAVPVPWAEARRSRVSLPCPDACDPTRCPTLPTCSAGLAPVPDRCGCCRVCAAAEGQECGGARGRPCAPRLRCGAPFSRDPSGGAWLGTCGCAEGAEDAVVCGSDGRTYPSLCALRKENRAARQRGALPAVPVQKGACEEAGTTRAGRLRRKYNFIAAVVEKVAPSVVHLQLFRRSPLTNQEIPSSSGSGFIVSEDGLIVTNAHVLTNQQKIQVELQSGARYEATVKDIDHKLDLALIKIEPDTELPVLLLGRSSDLRAGEFVVALGSPFSLQNTVTAGIVSTTQRGGRELGLKNSDIDYIQTDAIINHGNSGGPLVNLDGDVIGINTLKVTAGISFAIPSDRIRQFLEDYHERQLKGKAPLQKKYLGLRMLPLTLNLLQEMKRQDPEFPDVSSGVFVYEVIQGSAAASSGLRDHDVIVSINGQPVTTTTDVIEAVKDNDFLSIIVLRGSQTLFLTVTPEIIN(SEQ ID NO：16)
YW505.95 HC FR2
WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：17)
抗-HtrA1抗體YW505.94a.28之輕鏈HVR
HVR L1：RASQSINTYLA(SEQ ID NO：18)
HVR L2：SASFLYS(SEQ ID NO：2)
HVR L3：QQSDDTPPT(SEQ ID NO：19)
抗-HtrA1抗體YW505.94a.28之重鏈HVR
HVR H1：GFSISGYYIH(SEQ ID NO：20)
HVR H2：WIDPYGGDTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)
HVR H3：GTFLTSWGHYFDY(SEQ ID NO：6)
抗-HtrA1抗體YW505.94a.28之輕鏈VR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINTYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDDTPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：28)
抗-HtrA1抗體YW505.94a.28之重鏈VR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISGYYIHWVRQAPGKGLEWVGWIDPYGGDTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTFLTSWGHYFDYWGQGT(SEQ ID NO：29)
抗-HtrA1抗體YW505.94a.54之輕鏈HVR
HVR L1：RASQVVGNYLA(SEQ ID NO：21)
HVR L2：SASFLYS(SEQ ID NO：2)
HVR L3：QQSDDHPPT(SEQ ID NO：22)
抗-HtrA1抗體YW505.94a.54之重鏈HVR
HVR H1：GFSISGYYIH(SEQ ID NO：20)
HVR H2：WIDPYGGDTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)
HVR H3：GTFLTSWGHYFDY(SEQ ID NO：6)
抗-HtrA1抗體YW505.94a.54之輕鏈VR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVVGNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDDHPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：30)
抗-HtrA1抗體YW505.94a.54之重鏈VR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISGYYIHWVRQAPGKGLEWVGWIDPYGGDTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTFLTSWGHYFDYWGQGT(SEQ ID NO：29)
輕鏈HVR共同序列
HVR L1：RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA，其中X_a為D、S或V；X_b為V或I；X_c為S、N或G；X_d為T或N；X_e為A或Y；且X_f為V或L(SEQ ID NO：23)；HVR L2：SASFLYS(SEQ ID NO：2)
HVR L3：QQX_gX_hX_iX_jPX_kT，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：24)；重鏈HVR共同序列
HVR H1：GFX_lIX_mX_nYYIH，其中X_l為N、S或T；X_m為S、D、Y或A；且X_n為G或D(SEQ ID NO：25)；HVR H2：WIDPYGGDTX_oYADSVKG，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：26)；HVR H3：GTFLTX_pWGHYFDY，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：27)。
共同輕鏈VR
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQX _a X _b X _c X _d X _e X _f AWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQX _g X _h X _i X _j PX _k TFGQGTKVEIKR，其中X_a為D、S或V；X_b為V或I；X_c為S、N或G；X_d為T或N；X_e為A或Y；X_f為V或L；X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S；(SEQ ID NO：31)
共同重鏈VR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFX _l IX _m X _n YYIHWVRQAPGKGLEWVGWIDPYGGDTX _o YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTFLTX _p WGHYFDYWGQGT，其中X_l為N、S或T；X_m為S、D、Y或A；X_n為G或D；X_o為N或D；且X_p為S或T(SEQ ID NO：32)
YW505.94a51 HVR L1：RASQDVGTYLA(SEQ ID NO：33)
YW505.94a.1 HVR L3：QQVYSHPPT(SEQ ID NO：34)
YW505.94a.7 HVR L3：QQSYTNPPT(SEQ ID NO：35)
YW505.94a.22 HVR L3：QQSYATPTT(SEQ ID NO：36)
YW505.94a.37 HVR L3：QQSYSSPAT(SEQ ID NO：37)
YW505.94a.39 HVR L3：QQVYTTPPT(SEQ ID NO：38)
YW505.94a.40 HVR L3：QQVYATPST(SEQ ID NO：39)
YW505.94a.42 HVR L3：QQSYNSPAT(SEQ ID NO：40)
YW505.94a.46 HVR L3：QQSYSTPAT(SEQ ID NO：41)
YW505.94a.50 HVR L3：QQSYTAPTT(SEQ ID NO：42)
YW505.94a.51 HVR L3：QQDSTLPPT(SEQ ID NO：43)
YW505.94a.52 HVR L3：QQSDAAPPT(SEQ ID NO：44)
YW505.94a.78 HVR L3：QQSYSTPPT(SEQ ID NO：45)
YW505.94a.89 HVR L3：QQSYTRPPT(SEQ ID NO：46)
YW505.94a.7 HVR H1：GFSISDYYIH(SEQ ID NO：47)
YW505.94a.26 HVR H1：GFSIDGYYIH(SEQ ID NO：48)
YW505.94a.38 HVR H1：GFTIYDYYIH(SEQ ID NO：49)
YW505.94a.78 HVR H1：GFSIAGYYIH(SEQ ID NO：50)
YW505.94a.82 HVR H1：GFTISDYYIH(SEQ ID NO：51)
YW505.94A.42 HVR H2：WIDPYGGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：52)
YW505.94A.46 HVR H3：GTFLTTWGHYFDY(SEQ ID NO：53)
III.實例
以下為本發明之方法及組合物實例。應瞭解，倘若具有上文提供之一般描述，可實踐各種其他實施例。 實例1：產生抗-HtrA1抗體
噬菌體呈現。合成抗體文庫在M13噬菌體上呈現二價Fab片段且藉由在重鏈之三個互補決定區(CDR)中使用寡核苷酸(oligo)定點突變誘發產生多樣性。Fab文庫之詳情先前有描述(Lee,C.V.等人，J Mol Biol.340：1073-93(2004)；Lee,C.V.等人，J Immunol Methods.284：119-32(2004))。在4℃下以MuHtrA1_PD(10 μg/ml)將Nunc 96孔Maxisorp免疫培養盤塗佈隔夜，且隨後在室溫下以噬菌體阻斷緩衝液(PBS、1%(w/v)BSA、0.05%(v/v)吐溫(Tween)20)阻斷1 h。將抗體噬菌體文庫添加至經MuHtrA1_PD塗佈之培養盤中且在室溫下培育隔夜。以PBS、0.05%(v/v)吐溫20緩衝液洗滌培養盤且將結合之噬菌體以50 mM HCl-500 mM NaCl溶離30 min且以相同體積之1 M Tris-HCl(pH 7.5)中和。使回收之噬菌體在大腸桿菌XL-1藍細胞中擴增。在後續選擇循環中，將以經抗原塗佈之培養盤培育抗體噬菌體減少至2-3小時且逐漸增加培養盤洗滌之嚴格度。將13種識別出之純系重定格式為IgG(如下文關於Fab94所述)、表現於293細胞中且藉由蛋白A親和力層析法純化。在結合ELISA中，該13種純化IgG與MuHtrA1_PD結合。
抗-HtrA1 Fab94及IgG94表現與純化。將Fab94(YW505.94)之重鏈與輕鏈兩者之可變區次選殖至大腸桿菌Fab表現載體(AEP1)中。將所得質體轉型至大腸桿菌菌株34B8中。使單一群落在37℃下在30 ml補充有50 μg/ml羧苄青黴素(Carbenicilin)之LB培養基中生長隔夜。將5 ml培養液接種至500 ml補充有羧苄青黴素(50 μg/ml)之完整C.R.A.P.培養基(Simmons,L.C.等人，J Immunol Methods.263：133-47(2002))中且在30℃下生長24 h。使用蛋白A瓊脂糖樹脂純化Fab94蛋白。
將Fab94之輕鏈與重鏈兩者之可變結構域選殖至具有人類輕鏈或重鏈(人類IgG1)恆定結構域之以pRK5為主之質體中以供在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中短暫表現。藉由使用蛋白A瓊脂糖層析法純化IgG94蛋白。
分別在圖1A及1B中展示Fab94(YW505.94)之輕鏈可變區與重鏈可變區之胺基酸序列。 實例2：產生HtrA1蛋白
蛋白構築體。藉由使用Taq聚合酶自全長純系進行PCR擴增來選殖全長人類HtrA1(HuHtrA1)(Q23-P480)及全長鼠類HtrA1(MuHtrA1)(P24-P480)。引子含有向所得PCR產物中添加限制位點BamHI及EcoRI之部分所需之核苷酸。將PCR片段接合至在BamHI限制位點上游含有His₆序列(SEQ ID NO：90)之經改質pAcGP67桿狀病毒轉移載體(BD Pharmingen)中，在HtrA1蛋白上產生N端His₆標記(SEQ ID NO：90)。
藉由PCR擴增來選殖缺少N-結構域及PDZ結構域(例如，含有殘基D161-K379)之人類HtrA1(HtrA1_PD)的蛋白酶結構域。將經擴增之DNA插入經修飾之pET載體中，產生N端His₆標記(SEQ ID NO：90)及在HtrA1之D161密碼子上游融合之凝血酶裂解位點。根據製造商實驗方案(Agilent Technologies,Santa Clara CA)，使用QuikChange XL定點突變誘發套組產生HtrA1_PD Ala突變體。藉由DNA定序證實構築體。使用Pfu(Agilent)聚合酶自全長純系選殖鼠類HtrA1(MuHtrA1_PD)(G156-S367)、鼠類HtrA3(MuHtrA3_PD)(P133-F350)及鼠類HtrA4(MuHtrA4_PD)(E159-Y371)之蛋白酶結構域。引子含有向所得PCR產物中添加限制位點Not I及Stu I所需之核苷酸。將PCR片段接合至具有phoA啟動子之表現載體的pST23中。該表現載體在Not I限制位點上游含有胺基酸序列MK(HQ)₆MHQSTAA(SEQ ID NO：11)，導致unizyme標記與蛋白酶結構域之N端融合。
如本文所述，分別參考SEQ ID NO：13-16來製造huHtrA1、muHtrA1、muHtrA3及muHtrA4之胺基酸殘基。由一個字母胺基酸編碼後接其在SEQ ID NO：13-16之一中之位置來規定胺基酸位置。舉例而言，全長huHtrA1包含由SEQ ID NO：13之位置23之麩醯胺酸開始且以SEQ ID NO：13之位置480之脯胺酸結束的序列，例如Q23-P480。類似地，HtrA蛋白中特定位置之突變由起始胺基酸後接SEQ ID NO：13-16之一中之位置、後接經取代之胺基酸來表示。舉例而言，HuHtrA1(SEQ ID NO：13)之位置248處之離胺酸突變為丙胺酸稱作K248A。
蛋白表現及純化。在粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)昆蟲細胞(表現系統LLC,Woodland,CA)中表現HuHtrA1及MuHtrA1。所收穫之昆蟲細胞培養基(在pH調節至6.8之後)分別添加NiCl₂、CaCl₂及NaCl至1.0、2.5及150 mM之最終濃度。
在大腸桿菌BL21(Stratagene)中表現HuHtrA1_PD構築體(野生型及S328A突變體)。使大腸桿菌培養物在37℃下於含有50 μg/ml羧苄青黴素之LB培養基中生長直至A₆₀₀達到0.8至1.0且隨後以0.4 mM IPTG誘發且在16℃下生長24 h。使細菌細胞集結粒再懸浮於1/10培養體積之50 mM Tris pH 8.0、500 mM NaCl中且使用微流化床裝置(Microfluidizer)破壞。將溶胞物以30,000×g離心30 min。
使用鎳-氮基-三乙酸樹脂(Qiagen)純化HuHtrA1、MuHtrA1、HuHtrA1_PD及HuHtrA1_PD(S328A)。在負載昆蟲細胞培養基或大腸桿菌溶胞物之後，以10管柱體積(CV)之50 mM Tris pH 8.0、500 mM NaCl洗滌管柱，繼而以10 CV之50 mM Tris pH 8.0、1 M NaCl、20 mM咪唑洗滌管柱。以50 mM Tris pH 8.0、200 mM NaCl、10%甘油、0.25% CHAPS、300 mM咪唑溶離蛋白。將彙集之溶離份藉由在S-200管柱(GE Healthcare)上之尺寸排外層析法進一步純化且收集對應於三聚體蛋白形式之峰溶離份。如由SDS-PAGE所評估，蛋白純度大於90%，且使用BCA^TM蛋白分析(Pierce,Rockford,IL)測定蛋白濃度。
如關於野生型HuHtrA1_PD所述(參見上文)表現HuHtrA1_PD Ala突變體(除S328A以外之15種突變體之組)。以50 ml溶解緩衝液/500 ml集結粒向細菌細胞集結粒中添加溶解緩衝液(PopCulture,EMD Chemical,San Diego CA)。以均質器(polytron)使集結粒完全懸浮於溶解緩衝液中且在室溫下攪拌30 min。在4℃下以33,700×g將細胞溶胞物離心(Beckman,LA-16.250轉子)30 min，且經0.22 μm過濾器裝置(Nalgene)過濾所得上清液。將經過濾之上清液負載至以50 mM Tris、300 mM NaCl、10 mM咪唑、10%甘油pH 8.0(緩衝液A)預平衡之Ni-NTA管柱(3 ml,Qiagen)上。一經負載，即以12 CV緩衝液A洗滌管柱，繼而以20 CV緩衝液A+0.1% Triton X-114洗滌。以15 CV緩衝液A再次洗滌管柱以移除清潔劑。以緩衝液A+200 mM咪唑、0.25% CHAPS溶離蛋白。將彙集之溶離份以經50 mM Tris pH 8.0、200 mM NaCl、10%甘油、0.25% CHAPS平衡之Superdex 200(Hi負載16/60，120 ml，GE Healthcare)進一步純化。收集對應於HtrA1_PD三聚體峰之溶離份。如由SDS-PAGE所評估，蛋白純度大於90%，且使用BCA^TM蛋白分析(Pierce,Rockford,IL)測定蛋白濃度。
在大腸桿菌58F3中表現MuHtrA1_PD、MuHtrA3_PD及MuHtrA4_PD(Szeto,W.等人，Cancer Res.61：4197-205(2001))。將在30℃下在含有50 μg/ml羧苄青黴素之LB培養基中生長隔夜之大腸桿菌培養物稀釋(1/100 vol)為含有補充有50 μg/ml羧苄青黴素之C.R.A.P.培養基的較大培養物(Simmons,L.C.等人，J Immunol Methods.263：133-47(2002))。接種之後，使大腸桿菌在30℃下生長約20 h。如關於HuHtrA1_PD所述純化MuHtrA1_PD(參見上文)。為純化MuHtrA3_PD及MuHtrA4_PD，向細菌細胞集結粒中添加溶解緩衝液(50 mM Tris pH 8.5、500 mM NaCl、10 mM咪唑、10%甘油)。以均質器使集結粒在溶解緩衝液中均質化且以微流化床破壞細胞。離心細胞溶胞物且經0.22 μm過濾器裝置(Nalgene)過濾所得上清液。將經過濾之上清液負載至以25 mM Tris pH 8.5、500 mM NaCl、20 mM咪唑、10%甘油(緩衝液B)預平衡之3 ml Ni-NTA管柱(Qiagen)上。負載之後，以12 CV緩衝液B洗滌管柱，繼而以20 CV緩衝液B+0.1% Triton X-114洗滌。以15 CV緩衝液B再次洗滌管柱以移除清潔劑。以25 mM Tris pH 8.5、500 mM NaCl、250 mM咪唑、10%甘油、0.25% CHAPS溶離蛋白。將彙集之溶離份在以25 mM Tris pH 8.5、10%甘油、0.5 mM TCEP、0.25% CHAPS平衡之120 ml Superdex 75(GE Healthcare)上進一步純化。收集對應於蛋白酶三聚體峰之溶離份。如由SDS-PAGE所評估，蛋白純度大於90%。 實例3：使用FRET分析測定抗-HtrA1抗體之抑制活性
合成肽受質。使用標準偶合程序，以HBTU在Fmoc-Lys(Boc)-wang樹脂上合成初始描述為HtrA2之受質的肽H2-Opt(Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK)(SEQ ID NO：12)(Martins,L.M.等人，J Biol Chem.278：49417-27(2003))。將Fmoc-Lys(DNP)-OH(Anaspec)併入P5'位置。將肽合成直至P5(Mca,7-甲氧基-香豆素，Aldrich)且隨後在室溫下使用三氟乙酸、三異丙基矽烷及水歷時2小時自固體支撐物裂解。使肽自乙醚沈澱，用乙酸、乙腈、水萃取且凍乾。使粗標記肽溶解且在使用乙腈/水之製備型逆相C18管柱上純化。彙集經純化之溶離份、凍乾且由液相層析法/質譜法(PE/Sciex)分析，且發現與其計算質量一致。
肽受質之酶促分析。在37℃下，將HtrA1在具有經在50 mM Tris-HCl pH 8.0、200 mM NaCl、0.25% CHAPS(分析緩衝液)中連續稀釋之IgG94或Fab94的96孔黑色底透培養盤(Nalge Nunc Int.,Rochester,NY)中培育20 min。對於初始測試13種噬菌體來源之抗-HtrA1抗體之組而言，以HuHtrA1或HuHtrA1_PD培育單一濃度之IgG(最終濃度為0.16 mg/ml-0.28 mg/ml)。將肽受質Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK(SEQ ID NO：12)(H2-Opt)於DMSO中之10 mM儲備溶液於水中稀釋至12.5 μM，在37℃下預升溫且隨後添加至反應混合物中。反應物之最終濃度為：5 nM HuHtrA1或MuHtrA1、0.005-300 nM IgG94、0.02-900 nM Fab94、2.5 μM H2-Opt。在SPECTRAmax M5微量滴定盤讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上量測螢光信號(激發328 nm，發射393 nm)之增加且測定H2-Opt裂解之線性速率(mRFU/min)。除最終酶濃度為1 nM、IgG94濃度為300 nM且培育時間為15 min以外，同樣進行胰蛋白酶(Roche)及彈性蛋白酶(MP Biomedicals)之IgG94抑制作用實驗。
如圖2中所示，以HuHtrA1或HuHtrA1_PD培育13種噬菌體來源之抗體(IgG)組且量測酶活性。在13種測試抗體中，抗體YW503.57、YW504.57、YW504.61及YW505.94(亦稱作Fab94、抗體94、Ab94或IgG94)強烈抑制HuHtrA1與HuHtrA1_PD兩者之活性。
如圖3中所示，IgG94以濃度依賴性方式以1.8 nM之IC₅₀值抑制HuHtrA1對於H2-Opt受質之酶促活性。在30 nM IgG94以上達成完全抑制。相反，胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶家族之兩種其他成員(胰蛋白酶及彈性蛋白酶)在300 nM下不受IgG94抑制，表明IgG94對於HuHtrA1具有特異性。Fab94亦以濃度依賴性方式抑制HuHtrA1，但如29.1 nM之IC₅₀值所指示，不及IgG94有效。該等結果與由表面電漿子共振實驗測定之31.1 nM之K _D值完全一致(參見下文表1)。該等結果表明IgG94及Fab94能夠完全中和HuHtrA1對於小合成肽受質之酶促活性且該活性具有特異性。此外，IgG94相對於Fab94之效能增加約16倍與基於質量分析由「籠樣」IgG94：HtrA1複合物所預測之結合力作用一致(參見例如表2及圖9)。
亦使用上述分析，以螢光淬滅之肽受質H2-Opt及1.0 nM HuHtrA1或1.5 nM HuHtrA1_PD測定親和力改良之變異抗體YW505.94a.28之抑制效能。結果展示如下。
實例4：使用巨分子受質測定抗-HtrA1抗體之抑制活性
於MonoQ離子交換管柱上再純化牛β-酪蛋白(Sigma-Aldrich)以產生高度純化物質。在37℃下，將HuHtrA1在Eppendorf管中連同增加濃度之IgG94一起在分析緩衝液中培育15 min，之後添加巨分子受質。對於β-酪蛋白消化而言，反應物之最終濃度為：10 nM HuHtrA1、50 μg/ml β-酪蛋白、2.3-150 nM IgG94。對於核心蛋白聚糖而言，最終濃度為：125 nM HuHtrA1、50 μg/ml核心蛋白聚糖(R & D Systems)、2-125 nM IgG94。對於雙糖鏈蛋白聚糖而言，最終濃度為：75 nM HuHtrA1、50 μg/ml雙糖鏈蛋白聚糖(R & D Systems)、2.3-150 nM IgG94。在37℃下培育之後(對於β-酪蛋白而言為2 h、對於核心蛋白聚糖而言為14 h、對於雙糖鏈蛋白聚糖而言為6 h)，添加SDS樣品緩衝液且使樣品沸騰且藉由SDS-PAGE(非還原性)分析。
在96孔黑色底透培養盤(Nalge Nunc Int.,Rochester,NY)中進行螢光染料標記之酪蛋白BODIPY FL酪蛋白(Invitrogen)的水解。在37℃下，將HuHtrA1或MuHtrA1以在分析緩衝液中連續稀釋之IgG94培育15 min。在分析緩衝液中添加BODIPY FL之後，反應物濃度如下：30 nM HuHtrA1、30 nM MuHtrA1、5 μg/ml BODIPY FL、0.24-250 nM IgG94。在SPECTRAmax M5微量滴定盤讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上量測螢光信號(激發484 nm，發射535 nm)之增加且測定BODIPY FL裂解之線性速率(mRFU/min)且表示為不受抑制速率百分比(對照)。
如圖6中所示，HuHtrA1使巨分子受質β-酪蛋白、核心蛋白聚糖及雙糖鏈蛋白聚糖(泳道2)降解。在不存在HuHtrA1的狀況下，受質在實驗期間保持完整(圖6，泳道1)。以增加濃度之IgG94預培育HuHtrA1(圖6，泳道9-泳道3)導致對受質降解之濃度依賴性抑制作用。在所測試之最高IgG94濃度下，完全防止β-酪蛋白、核心蛋白聚糖及雙糖鏈蛋白聚糖之降解(圖6，泳道3)。該等結果表明IgG94強烈且有效地抑制HuHtrA1針對三種巨分子受質之活性。
如圖4中所示，IgG94分別以8.3 nM及5.4 nM之IC₅₀值濃度依賴性地抑制HuHtrA1及MuHtrA1對BODIPY FL之水解。該等結果表明IgG94識別且完全中和HuHtrA1及MuHtrA1針對巨分子受質BODIPY FL之酶促活性。 實例5：測定抗-HtrA1抗體對HtrA1之特異性
藉由與其抑制結構相關蛋白酶MuHtrA3_PD及MuHtrA4_PD之能力相比，量測其抑制muHtrA1_PD之活性來評估IgG94之特異性(參見圖5)。除MuHtrA1_PD、MuHtrA3_PD及MuHtrA4_PD之濃度分別為6 nM、20 nM及20 nM且IgG94之濃度範圍為0.2-400 nM以外，使用如上文實例3中所述之FRET分析測定特異性。除MuHtrA1_PD、MuHtrA3_PD及MuHtrA4_PD之濃度為50 nM且IgG94之濃度範圍為1.4-1000 nM以外，亦使用如上文實例4中所述之BODIPY FL酪蛋白受質分析特異性。IgG94抑制MuHtrA1_PD對H2-Opt(圖5，左圖)及BODIPY FL(圖5，右圖)之裂解，但對於H2-Opt及BODIPY FL受質而言，不抑制濃度分別高達400 nM及1000 nM之MuHtrA3_PD及MuHtrA4_PD對相同受質之裂解。該等結果表明IgG94具有優良特異性且不損害相關蛋白酶之活性。 實例6：藉由BIAcore測定抗體親和力
為藉由單循環動力學測定Fab94之結合親和力，使用利用BIAcore^TM T100儀器進行之表面電漿子共振(SRP)量測。簡言之，根據供應商說明書以EDC及NHS試劑活化S系列感測器晶片CM5，且使抗生蛋白鏈菌素(Pierce)偶合以達成約2000反應單位(RU)，繼而以1M乙醇胺阻斷未反應之基團。
對於動力學量測而言，首先以10 μl/min之流動速率注射生物素標記HuHtrA1_PD或MuHtrA1_PD以在3種不同流動細胞(FC)(除FC1(參考細胞)以外)處捕獲約100 RU，且隨後注射Fab94(0.48 nM-300 nM)於0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、0.005%界面活性劑P20中之5倍連續稀釋液(流動速率：30 μl/min)，注射之間無再生。記錄感測器圖譜且在減去參考細胞信號之後由BIAcore^TM T100評估軟體(2.0版)來評估。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)計算締合速率(k _締合)與解離速率(k _解離)。平衡解離常數(K _D)計算為比率k _解離/k _締合(參見下文表1)。Fab94對HuHtrA1_PD與對MuHtrA1_PD之結合動力學極為類似。K _D值分別為31.1 nM及28.9 nM。
表1. 藉由表面電漿子共振，Fab94對HuHtrA1_PD及MuHtrA1_PD之結合親和力 實例7：HuHtrA1_PD上之IgG94抗原決定基定位
為識別IgG94之功能結合抗原決定基，產生具有個別丙胺酸突變之HuHtrA1_PD突變體組用於結合實驗。使大部分突變殘基位於活性位點周圍之表面環上，且亦包括催化性絲胺酸(S328)及天冬胺酸(D250)。如實例2中所述在大腸桿菌中表現突變體且藉由尺寸排外層析法純化三聚體。使用ELISA分析測定結合，該分析係使用在PBS中以2 μg/ml之HuHtrA1_PD突變體塗佈1 h、繼而在室溫下以PBST緩衝液(0.5% BSA及0.05%吐溫20於PBS中)阻斷1 h之MAXISORP^TM微量滴定盤來進行。添加在PBST緩衝液中連續稀釋5倍之Ig94(50 nM至0.0006 nM)且培育30 min。以PBT緩衝液(0.05%吐溫20於PBS中)洗滌培養盤，且添加HRP結合之山羊抗-人類IgG(H+L)(Invitrogen)(1：5000於PBST緩衝液中)且培育1 h。以PBT緩衝液洗滌培養盤且藉由添加四甲基聯苯胺受質(Kirkegaard及Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)顯影。對450 nm下之吸光度隨溶液中抗體濃度之變化作圖，以測定EC₅₀值。隨後在HtrA1結構上定位影響結合之突變體的位置。
在結合ELISA中，IgG94展示與突變體HuHtrA1_PD(N224A)及HuHtrA1_PD(K248A)之結合減少最大(參見圖7A)。在使用較低濃度HtrA1塗佈培養盤(1 μg/ml)及縮短培育時間(自1小時減少至20分鐘培育)重複實驗之後，IgG94亦展示與HuHtrA1突變體V201A、H220A、T223A、K225A、K243A及E247A之結合減少至少5倍(參見圖7A)。該等結果表明IgG94結合至包括位於環B與環C上之殘基N224及K248的抗原決定基(參見圖7B及7C)。在胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶中，已知該等環為與受質相互作用之特異性決定區之一部分。K248(環C)極為接近催化性D250且N224極為接近催化性H220。因此，IgG94與該等殘基之結合可藉由直接位阻或藉由如關於中和亦識別環C中之殘基的抗-HGFA抗體所發現之間接立體異位機制來損害受質與催化性間隙之通道(Ganesan,R.等人，Structure 17：1614-1624(2009)；Wu,Y.等人，Proc Natl Acad Sci USA 104：19784-9(2007))。或者，抗體結合可藉由直接影響催化三聯體殘基D250及/或H220來抑制催化作用。 實例8：藉由尺寸排外層析法-多角度光散射(SEC-MALLS)測定HtrA1_PD與Fab94及IgG94之複合物的化學計量
催化失活形式HuHtrA1_PD(S328A)用於形成複合物。在Tris緩衝液(50 mM Tris-HCl,pH 8.0、200 mM NaCl、10%甘油、0.25% CHAPS)中形成Fab94：HuHtrA1_PD(S328A)與IgG94：HuHtrA1_PD(S328A)複合物。將該等複合物與個別組分在4℃下單獨培育隔夜，且隨後注射且於S200 Superdex 10/300 GL管柱(GE Healthcare)上以0.5 mL/min之流動速率在Tris緩衝液中解析。以來自Wyatt Technologies之18-度光散射偵測器(具有QELS之Dawn Helios II)及折射率偵測器(Optilab reX)收集資料。由Astra 5軟體進行分析以產生與溶離時間無關之莫耳質量。以對照IgG進行校正。
SEC-MALLS實驗表明Fab94及IgG94與HuHtrA1_PD(S328A)形成具有不同質量之複合物。所測定出之複合物質量及推斷之化學計量展示於表2中。
所測定出之210,100 Da之Fab94：HtrA1_PD(S328A)複合物質量與結合一個HuHtrA1_PD(S328A)三聚體之3個Fab的複合物(3：1複合物)一致。該種3：1複合物之實驗質量與理論質量之間的差異僅為4.2%。因此，一個Fab能夠結合至一個HtrA1同質三聚體中之每一HuHtrA1_PD(S328A)單體。
所測定出之618,600 Da之IgG94：HtrA1_PD(S328A)複合物質量與3：2之化學計量充分擬合，其中3個IgG分子結合至兩個HuHtrA1_PD(S328A)三聚體。該種3：2複合物之實驗質量與理論質量之間的差異僅為1.9%。
所闡明之化學計量與Fab94及IgG94能夠完全抑制HtrA1活性之發現一致，由於HtrA1三聚體中之每一單體結合至一個Fab或結合至IgG之一個Fab臂。因此，在該等複合物中，無可用之「自由」HtrA1單體，此與Fab94及IgG94對HtrA1酶活性之完全抑制相一致。吾人建議「籠」模型用於IgG94：HtrA1_PD(S328A)複合物，其中3個IgG之Fab臂橋接兩個三聚體，每個Fab臂結合至一個單體(參見圖9)。該模型亦可解釋IgG94在酶促分析中之效能增加超過Fab94約16倍(參見例如圖3)，由於IgG94強烈受益於其與HtrA1_PD三聚體結合中之結合力作用。 實例9：YW505.94之親和力成熟
抗-HtrA1親和力成熟之構築體文庫。藉由將CDR H1中之Kabat殘基N28變為絲胺酸以移除潛在之N-連接糖基化位點，由YW505.94[Ab94]產生純系YW505.94a。來源於噬質體pV0350-2b之噬質體pW0703(Lee等人，J.Mol.Biol 340,1073-1093(2004))(其在所有CDR-L3位置含有終止密碼子(TAA)且在M13噬菌體表面上呈現單價Fab)充當用於接枝純系YW505.94a之重鏈可變結構域(V_H)以供親和力成熟之文庫模板。使用硬與軟兩種無規化策略進行親和力成熟。對於硬無規化而言，使用設計用於模擬天然人類抗體之胺基酸使位於三個輕鏈CDR選定位置之一個輕鏈文庫(L1/L2/L3硬)無規化，且該經設計之DNA簡併如所述(Lee等人，2004)。對於軟無規化而言，標靶位於CDR-L3之Kabat位置91、92、93、94及96、CDR-H1之28-35、CDR-H2之50-58及CDR-H3之95-100的具有CDR環之兩種不同組合(L3/H1軟、L3/H2軟及L3/H3軟)的選定殘基用於無規化。為達成軟無規化條件(其在選定位置處引入約50%之突變率)，以有利於野生型核苷酸之70-10-10-10鹼基混合物合成誘發突變之DNA(Gallop等人，J.of Med.Chem. 37,1233-1251(1994))。
用於分離親和力改良變異體之噬菌體揀選策略。對於親和力改良選擇而言，使噬菌體文庫在第一輪經受培養盤揀選，繼而為四輪溶液揀選。對於第一輪培養盤揀選而言，在室溫(RT)下於1% BSA及0.05%吐溫20中以約3 O.D./ml之噬菌體投入分別地針對經人類HtrA1(HuHtrA1)塗佈之培養盤(NUNC Maxisorp培養盤)揀選四個文庫(L1/L2/L3硬、L3/H1軟、L3/H2軟及L3/H3軟)歷時1小時。在第一輪培養盤揀選之後，進行四輪溶液揀選以增加選擇嚴格度。對於溶液揀選而言，在室溫(RT)下將1 O.D./ml自第一輪培養盤揀選繁殖之噬菌體在100 μl含有1% Superblock(Pierce biotechnology)及0.05%吐溫20之緩衝液中以500 nM生物素標記HuHtrA1培育至少1小時。將混合物以1% Superblock進一步稀釋10倍，且在室溫(RT)下伴隨輕微震盪以每孔100 μl塗覆至經卵白素(neutravidin)塗佈之孔(10 μg/ml)中歷時15 min，以使得生物素標記之HuHtrA1可結合噬菌體。以PBS-0.05%吐溫20將該等孔洗滌10次。為測定背景結合，在經卵白素塗佈之培養盤上捕獲含有未經生物素標記之HuHtrA1選擇之噬菌體的對照孔。以0.1 N HCl溶離經結合之噬菌體歷時20 min，以1/10體積之1 M Tris pH 11中和、滴定且繁殖以供下一輪。接著，同時使用兩種增加選擇嚴格度之方法再進行三輪溶液揀選。第一種方法(用於締合速率選擇)將生物素標記之標靶蛋白濃度自10 nM減少至0.1 nM。第二種方法(用於解離速率選擇)添加過量非生物素標記之HuHtrA1蛋白(100至1000倍以上)以競爭掉較弱結合物。同樣，噬菌體投入減少(0.1至0.5 O.D/ml)以降低背景噬菌體結合。
高產量親和力篩檢ELISA(單點競爭)。自第5輪篩檢挑選純系且在37℃下，在96孔阻斷(QIAgene)中於350 μl/孔的具有50 μg/ml羧苄青黴素及1e 10/ml KO7之2YT培養基中生長隔夜。由相同培養盤挑選經XL-1感染之親本噬菌體群落作為對照。在室溫(RT)下以PBS中100 μl/孔之HuHtrA1蛋白(2 μg/ml)塗佈96孔Nunc Maxisorp培養盤歷時2小時。以PBS中之100 μl 0.5% BSA及0.05%吐溫(PBST緩衝液)阻斷培養盤歷時1小時。
在總體積為100 μl之具有或不具有5 nM HuHtrA1之PBST緩衝液中以1：5稀釋噬菌體上清液且在室溫(RT)下培育至少1小時。隨後將75 μl混合物轉移至經HuHtrA1塗佈之培養盤。將培養盤輕微震盪15 min以使得可將未結合之噬菌體捕獲至經HuHtrA1塗佈之培養盤上。以PBS中之0.05%吐溫20(PBT緩衝液)將培養盤洗滌5次。藉由在ELISA緩衝液中添加辣根過氧化酶(HRP)-結合之抗-M13抗體(1：5000)且在室溫(RT)下培育30 min定量結合。以PBT緩衝液將培養盤洗滌5次。接著，向孔中添加100 μl/孔之1：1比率之3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)過氧化酶受質及過氧化酶溶液B(H₂O₂)(Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg,MD))且在室溫(RT)下培育5分鐘。藉由向每孔中添加100 μl 1 M磷酸(H₃PO₄)且使其在室溫(RT)下培育5分鐘終止反應。使用標準ELISA培養盤讀取器在450 nm下測定每孔之OD。由以下等式計算OD減少(%)：OD_{450 nm}減少(%)=[(具有競爭者之孔的OD_{450 nm})/(無競爭者之孔的OD_{450 nm})]*100。
與親本噬菌體孔(100%)之OD_{450 nm}減少(%)相比，挑選OD_{450 nm}減少(%)小於50%之純系用於序列分析(參見圖15及16)。選擇獨特純系用於噬菌體製備以藉由噬菌體競爭ELISA來測定結合親和力(噬菌體IC₅₀)(參見圖17及18)。隨後，將大部分親和力改良純系(YW505.94a.28及YW505.94a.54)重定格式為人類IgG1用於抗體產生且進一步用於BIAcore結合動力學分析。
噬菌體競爭ELISA以測定IC ₅₀ 。在室溫(RT)下以PBS中2 μg/ml之HuHtrA1塗佈MAXISORP^TM微量滴定培養盤歷時2 hr且隨後在室溫(RT)下再以PBST緩衝液阻斷1小時。在組織培養物微量滴定培養盤中以PBST緩衝液中連續稀釋之HuHtrA1或MuHtrA1將來自培養物上清液之純化噬菌體培育1小時，之後歷時15分鐘將80 μl混合物轉移至經HuHtrA1塗佈之孔中以捕獲未結合之噬菌體。以PBT緩衝液洗滌培養盤且歷時1小時添加HRP-結合之抗-M13(Amersham Pharmacia Biotech)(1：5000於PBST緩衝液中)。以PBT緩衝液洗滌培養盤且藉由添加四甲基聯苯胺受質(Kirkegaard及Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)進行顯影。對450 nm下之吸光度隨溶液中HuHtrA1或MuHtrA1濃度之變化作圖，以測定噬菌體IC₅₀。此用作對在噬菌體表面上呈現之Fab純系的親和力估計。圖17展示來自噬菌體競爭分析之結果，表明YW505.94a親和力改良之變異體針對HuHtrA1之結合。圖18展示來自噬菌體競爭分析之結果，表明YW505.94a親和力改良之變異體針對MuHtrA1之結合。
藉由BIAcore測定抗體親和力。為藉由單循環動力學測定HtrA1抗體之結合親和力，使用利用BIAcore^TM T100儀器進行之表面電漿子共振(SRP)量測。簡言之，根據供應商說明書以EDC及NHS試劑活化一系列S感測器晶片CM5，且使抗生蛋白鏈菌素(Pierce)偶合以達成約2000反應單位(RU)，繼而以1 M乙醇胺阻斷未反應之基團。
對於動力學量測而言，首先以10 μl/min之流動速率注射生物素標記之人類或鼠類HtrA1以在3種不同流動細胞(FC)(除FC1(參考細胞)以外)處捕獲約100 RU，且隨後在同一循環中相繼注射抗-HtrA1 Fab於HBS-P緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中由低(0.48 nM)至高(300 nM)[5個點](之5倍連續稀釋液流動速率：30 μl/min)，注射之間無再生。記錄感測器圖譜且經受參考及緩衝液扣除，之後由BIAcore^TM T100評估軟體(2.0版)來評估。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型計算締合速率(k _締合)與解離速率(k _解離)。平衡解離常數(K _D)計算為比率k _解離/k _締合。結果展示於下文表3中。
實例10：在恆定曝光後，在不存在HtrA1的狀況下感光體、外核層(ONL)及功能反應之防護
構築HtrA1基因剔除小鼠。為產生HtrA1(+/-)胚胎幹細胞，將線性化標靶載體DNA電穿孔至Balb/c背景之ES細胞中以在外顯子1之5'區及外顯子1之3'區引入Flox位點及引入之新黴素(neomycin)-抗性基因(Neo)。選擇對新黴素具有抗性之ES純系，且藉由以表現cre重組酶之表現質體電穿孔ES細胞來切除外顯子1加新黴素卡匣。藉由對標靶ES細胞中之整個HtrA1基因座及上游啟動子區定序來證實同源重組。將標靶純系注射至C57BL/6囊胚中以產生生殖系傳遞之雄性嵌合小鼠。進行+/-雌性與+/-雄性小鼠之混種繁殖以在Balb/c背景上產生-/-雌性或-/-雄性HtrA1小鼠。藉由對HtrA1 wt及ko小鼠卵巢進行RT-PCR證實HtrA1之成功缺失。
恆定曝光模型。將8-13週齡之雄性Balb/c Htral wt/wt或ko/ko小鼠正常圈養(籠中<100 lux)直至開始恆定曝光(CLE)。為開始CLE，將小鼠單獨圈養在僅以金屬線架(wire rack)覆蓋而無濾紙上蓋之標準籠中。將食物顆粒及水凝膠置於籠底部，而非金屬線頂上，用於營養而不阻擋進入籠之光線。將十個籠置於配備有螢光燈且密封於白色面板中之Metro架上以向小鼠傳遞約1200 lux歷時長達14天。在CLE期間每天圍繞Metro架反時針旋轉籠子以確保等同曝光。若使用多個架子，亦在架子之間旋轉籠子以確保等同曝光。
光學相干斷層攝影法。在曝光之前4至7天進行光學相干斷層攝影法(OCT)以提供視網膜厚度基線量測。使用Heidelberg Spectralis HRA+OCT相機進行OCT。以150-300 μl無菌鹽水中之70-80 mg/kg氯胺酮/15 mg/kg甲苯噻嗪使動物麻醉，以1%托品醯胺(tropicamide)滴劑擴張眼睛且由OCT量測視網膜厚度。使用人造淚液保持眼睛濕潤以防白內障。在OCT之後，使動物自麻醉狀態恢復且回到其籠及光架中。
視網膜電圖。在曝光前7天且在CLE後15天時進行視網膜電圖(ERG)。使用Diagnosys LLC Espion 2視力電生理學系統且以Colordome桌上Ganzfeld作為光源進行且記錄ERG。使小鼠在暗室中適應黑暗隔夜以平衡感光體。一旦適應黑暗，即在黑暗中進行所有後續程序，僅以紅燈用於照明。以200-300 μl PBS中之氯胺酮(75至80 mg/kg)及甲苯噻嗪(7.5-15 mg/kg)(IP)使動物麻醉。使用連接至其控制裝置之恆溫板將小鼠體溫維持在37℃。以1%托品醯胺擴張瞳孔。以Burian-Allen銀或鉑線圈電極同時記錄兩隻眼睛之ERG。將小鼠置於平台上，經前額皮下插入參考電極且在尾底部皮下插入接地電極。將Gonak hypermellose溶液置於角膜上以在角膜與電極之間建立電接觸，且在實驗期間保護眼睛以防乾燥。將電極置於左眼及右眼上且將小鼠插入ColorDome光刺激器中。以白光刺激眼睛(7次閃爍強度為4e-5、2e-5、0.5、2、5、10、20 cd.s/m²)且在0.15-1000 Hz下帶通過濾信號且在2 kHz下取樣。
測定小鼠視網膜及卵巢中之HtrA mRNA含量。摘除完整眼睛，移除視網膜且置於RLT緩衝液(Qiagen)中且-80℃下冷凍直至均質化。將視網膜均質化且由輕微MACS M管(Miltinyi Biotec)粉碎。類似於視網膜，自雌性HtrA1 wt、het及ko小鼠分離卵巢且如關於視網膜所述均質化。使用Qiagen Plus Rneasy套組分離RNA；以高容量cDNA套組(Applied Biosystem)產生cDNA；對於外顯子1-2(視網膜及卵巢)、外顯子3-4(卵巢)及外顯子5-6(卵巢)使用20 μg cDNA、Taqman Gene Expression Master Mix(Applied Biosystem)及Taqman Gene Expression Assay引子(Applied Biosystem)進行Taqman qPCR且在ABI 7500即時PCR系統(Applied Biosystem)上運行。將HtrA表現校正為18s表現(來自Applied Biosystem之引子)。
如圖11中所示，在恆定曝光之小鼠模型中，HtrA1 mRNA表現增加。然而，在同一模型中，視網膜中之HtrA2含量未增加。此外，在未曝光小鼠之視網膜中，HtrA1含量顯著高於HtrA2、HtrA3及HtrA4含量。
此外，吾人發現缺乏HtrA1表現之小鼠在光誘發退化之小鼠模型中展示對於感光體(圖13)、外核層(ONL)(圖14)及功能反應(ERG)(圖12)之防護作用。 實例11：抗-HtrA1抗體在恆定曝光大鼠模型中之作用
如上文關於小鼠所述使大鼠經受恆定曝光。將評估抗-HtrA1抗體對於保護大鼠眼睛以防由曝光導致之退化的功效。以適合在實驗過程期間維持眼睛內抗-HtrA1抗體有效濃度之劑量及頻率使大鼠眼睛經受玻璃體內抗-HtrA1抗體的注射。如上文關於小鼠模型所述，在曝光之後監控大鼠眼睛以由OCT且功能性地由ERG測定視網膜厚度。 實例12：HtrA1表現在大鼠玻璃體內充足且在光脅迫下在小鼠眼液及眼睛組織中累積
ELISA分析。為分析大鼠組織，將抗-muHtrA1兔多株抗體(Genentech)稀釋至125 ng/mL，而為分析小鼠眼液及視網膜組織，將抗-huHtrA1小鼠單株抗體(Genentech)稀釋至250 ng/mL，兩者均在PBS中，且在4℃隔夜培育期間塗佈至384孔ELISA培養盤(Nunc；Neptune,NJ)上。以PBS加0.05%吐溫20洗滌培養盤且在2小時培育期間以PBS加0.5%牛血清白蛋白(BSA)阻斷。在室溫下伴隨輕微攪拌進行此培育及所有後續培育。在樣品/標準稀釋緩衝液(PBS、0.5% BSA、15 ppm Proclin、0.05%吐溫20、0.25% CHAPS、0.2% BgG、5 mM EDTA、0.35 M NaCl(pH 7.4))中稀釋重組鼠類HtrA1標準物(Genentech)及來自大鼠或鼠類組織之樣品，添加至經洗滌培養盤中且培育1.5-2小時。在以對於大鼠組織而言稀釋至100 ng/mL之生物素標記抗-muHtrA1兔多株抗體(Genentech)培育1小時期間偵測培養盤結合之HtrA1，且對於小鼠眼液及視網膜組織而言，生物素標記抗-huHtrA1小鼠單株抗體(Genentech)經稀釋至200 ng/mL，兩者均在分析緩衝液(PBS、0.5% BSA、15 ppm Proclin、0.05%吐溫20)中，繼而為洗滌步驟及以亦在分析緩衝液中稀釋(1：20,000)之抗生蛋白鏈菌素-HRP(GE Healthcare；Piscataway,NJ)培育30分鐘。最終洗滌之後，添加四甲基聯苯胺(KPL,Gaithersburg,MD)，顯色10-15分鐘，且以1 M磷酸終止反應。在450 nm下，使用微量滴定盤讀取器以620 nm作為參考讀取培養盤數據。由muHtrA1標準曲線之四參數擬合計算大鼠或鼠類HtrA1之濃度。
如圖19A中所示，與大鼠玻璃體中之HtrA1表現含量相比，HtrA1在大鼠卵巢、大腦、脾及整個眼睛組織中之表現較低。如圖19B中所示，與對照相比，小鼠眼液中之HtrA1含量在恆定曝光模型中增加。如圖19C中所示，與對照相比，小鼠視網膜組織中之HtrA1含量在恆定曝光模型中增加。
雖然上文已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例略為詳細地描述本發明，但不應將該等描述及實例解釋為限制本發明之範疇。本文引用之所有專利及科學文獻的揭示內容均以全文引用的方式明確併入本文中。
圖1A-B. 圖1A展示抗-HtrA1抗體94(YW505.94)之輕鏈可變結構域序列(SEQ ID NO：7)。圖1B展示抗-HtrA1抗體94(YW505.94)之重鏈可變結構域序列(SEQ ID NO：8)。根據Kabat編號系統(Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of proteins of immunological interest，第5版，National Institutes of Health,Bethesda,MD)對殘基進行編號。YW505.94輕鏈可變結構域序列與人類KappaI輕鏈共同序列(SEQ ID NO：9)比對且YW505.94重鏈可變結構域序列與人類子群III重鏈序列(SEQ ID NO：10)比對。帶框序列為根據Kabat定義之CDR。抗-HtrA1(YW505.94)與共同序列之間的序列差異加陰影。
圖2. 篩檢13種噬菌體衍生抗體(IgG)組。以HuHtrA1或HuHtrA1_PD培育單一濃度(0.08-0.28 mg/ml最終)之IgG且在FRET分析中量測酶活性。在13種測試抗體中，抗體YW503.57、YW504.57、YW504.61及YW505.94(亦稱作Ab94或IgG94)強烈抑制HuHtrA1與HuHtrA1_PD兩者活性。
圖3. IgG94與Fab94對HuHtrA1之抑制作用。在37℃下以IgG94與Fab94培育HuHtrA1歷時20 min。量測針對肽受質H2-Opt之酶活性且由所測定之線性速度計算分率活性(v_i/v_o)。300 nM之IgG94不由胰蛋白酶(1 nM)或彈性蛋白酶(1 nM)抑制H2-Opt水解。
圖4. IgG94由HuHtrA1及MuHtrA1抑制螢光染料標記之酪蛋白(BODIPY FL)的水解。在37℃下以IgG94培育HuHtrA1及MuHtrA1歷時15 min。在37℃下於微量滴定盤讀取器上量測酪蛋白BODIPY FL試劑之水解，且測定螢光增加之線性速率且表示為未抑制速率百分比(對照相對於對照之%)。
圖5. IgG94之特異性。以增加濃度之IgG94培育MuHtrA1_PD、MuHtrA3_PD及MuHtrA4_PD，且測定針對肽受質H2-Opt(上圖)或酪蛋白BODIPY FL試劑(下圖)之酶活性且表示為未抑制酶活性百分比(對照相對於對照之%)。
圖6. IgG94對HuHtrA1介導之巨分子受質裂解的抑制作用。在37℃下，以HuHtrA1(對於β-酪蛋白而言為10 nM、對於核心蛋白聚糖而言為125 nM、對於雙糖鏈蛋白聚糖而言為75 nM)培育增加濃度之IgG94(對於β-酪蛋白而言為2.3-150 nM；對於核心蛋白聚糖而言為2-125 nM；對於雙糖鏈蛋白聚糖而言為2.3-150 nM)歷時15 min。添加受質β-酪蛋白、核心蛋白聚糖及雙糖鏈蛋白聚糖(50 μg/ml)且培育2-14 h。添加SDS樣品緩衝液之後，由SDS-PAGE(非還原性條件)分析消化物且由SimplyBlue Safestain染色。
圖7A-C. 在HuHtrA1_PD上對IgG94之功能抗原決定基定位。圖7A展示以丙胺酸取代活性位點周圍之殘基量測IgG94與HuHtrA1_PD突變體之結合的ELISA之結果。陰影箭頭表示導致大於5倍之結合減少的丙胺酸取代。圖7B展示HuHtrA1_PD(PDB 3NWU)之結構(Clausen,T.等人，Nat Rev Mol Cell Biol.12：152-62(2011))，其中指示突變殘基。中灰色陰影表示在初始實驗中無IgG94結合損失之突變；深灰色陰影表示具有>5倍結合親和力損失之殘基子集。對表面圖示中展示之形成蛋白酶結構域三聚體之三種單體以淺灰色加陰影。對催化三聯體殘基D250及S328加下劃線。圖7C展示帶有HuHtrA1_PD(PDB 3NWU)單體(淺灰色，如草圖)上之抗原決定基殘基N224及K248之環的放大視圖。亦包括催化殘基H220。
圖8A-B. Fab94：HuHtrA1_PD(S328A)複合物(圖8A)及IgG94：HuHtrA1_PD(S328A)複合物(圖8B)之SEC-MALLS(尺寸排外層析法-多角度雷射光散射)。展示SEC之溶離峰(x軸)及個別蛋白與複合物之質量(y軸；越過溶離峰之點線)。
圖9. IgG：HuHtrA1-PD複合物之假定「籠模型」。
圖10A-B. 人類HtrA1(SEQ ID NO：13)、鼠類HtrA1(SEQ ID NO：14)、鼠類HtrA3(SEQ ID NO：15)及鼠類HtrA4(SEQ ID NO：16)之比對。
圖11. 在恆定曝光之小鼠模型中，視網膜中之HtrA1 mRNA表現增加(左上圖)。HtrA2含量在同一模型中不顯著變化(右上圖)。在小鼠視網膜中，基線處之HtrA1表現顯著高於HtrA2、HtrA3及HtrA4表現含量(下圖)。
圖12. 在恆定曝光之小鼠模型中，在不存在HtrA1表現的狀況下，雙極細胞/Muller細胞反應增加。
圖13. 在恆定曝光之小鼠模型中，在不存在HtrA1表現的狀況下之視網膜防護。
圖14. 在恆定曝光之小鼠模型中，在不存在HtrA1表現的狀況下之外核層(ONL)感光細胞防護。
圖15. 抗-HtrA1抗體YW505.94a之親和力改良變異體之輕鏈HVR序列。
圖16. 抗-HtrA1抗體YW505.94a之親和力改良變異體之重鏈HVR序列。
圖17. 表明YW505.94a親和力改良變異體針對HuHtrA1之結合的噬菌體競爭分析結果。
圖18. 表明YW505.94a親和力改良變異體針對MuHtrA1之結合的噬菌體競爭分析結果。
圖19A-C. 展示大鼠組織(圖19A)、小鼠眼液(圖19B)及小鼠視網膜組織(圖19C)中之HtrA1蛋白含量的ELISA分析結果。
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<223> 人工序列之描述：合成共同肽
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<223> Val或Ile
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<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Ser、Asn或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Thr或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ala或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Val或Leu
<400> 23
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ser、Val或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Tyr、Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Thr、Ser、Ala、Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Thr、His、Asn、Ser、Ala、Leu或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Pro、Thr、Ala或Ser
<400> 24
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asn、Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser、Asp、Tyr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Gly或Asp
<400> 25
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Asn或Asp
<400> 26
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ser或Thr
<400> 27
<210> 28
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 28
<210> 29
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 29

<210> 30
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 30
<210> 31
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> Asp、Ser或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> Val或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> Ser、Asn或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Thr或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> Ala或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Val或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (91)..(91)
<223> Ser、Val或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (92)..(92)
<223> Tyr、Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (93)..(93)
<223> Thr、Ser、Ala、Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (94)..(94)
<223> Thr、His、Asn、Ser、Ala、Leu或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (96)..(96)
<223> Pro、Thr、Ala或Ser
<400> 31
<210> 32
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成共同多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> Asn、Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> Ser、Asp、Tyr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Gly或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (104)..(104)
<223> Ser或Thr
<400> 32
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 33
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 34
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 35
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 36
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 37
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 38
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 39

<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 40
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 41
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 42
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 43
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 44
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 45
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 46
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 47
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 48
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 49
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 50
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 51
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 52
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 53
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 54
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 55
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 56
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 57
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 58
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 59
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 60
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 61
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 62
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 63
<210> 64
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 64
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 65
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 66
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 67
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 68
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 69
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 70
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 71
<210> 72
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 72
<210> 73
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 73
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 74
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 75
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 76
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 77
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 78
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 79
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 80
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 81
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 82
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 83
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 84
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp、Ser或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Val或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ser、Asn或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Thr或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ala或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Val或Leu
<400> 85
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ser、Val或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Tyr、Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Thr、Ser、Ala、Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Thr、His、Asn、Ser、Ala、Leu或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Pro、Thr、Ala或Ser
<400> 86
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asn、Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser、Asp、Tyr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Gly或Asp
<400> 87
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Asn或Asp
<400> 88
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ser或Thr
<400> 89
<210> 90
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成6×His標記
<400> 90

权利要求:
Claims (92)
[1] 一種經分離之抗體，其與包含SEQ ID NO：8之VH序列及SEQ ID NO：7之VL序列之抗體競爭結合至HtrA1。
[2] 如請求項1之抗體，其中使用ELISA分析測定競爭結合。
[3] 一種結合至HtrA1之經分離之抗體，其中該抗體(i)結合至包括HtrA1之N224、K248或兩者之抗原決定基，且(ii)以30 nM之IC₅₀抑制HtrA1。
[4] 如請求項3之抗體，其中該抗體另外包含一或多種以下特性：(i)以1個可變結構域對HtrA1三聚體之一個次單元之比率結合至HtrA1，或(ii)不阻止HtrA1三聚體形成。
[5] 如請求項3之抗體，其中該IC₅₀係使用絲胺酸蛋白酶分析以具有SEQ ID NO：12之受質測定。
[6] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體不與HtrA2、HtrA3及HtrA4中之一或多者交叉反應。
[7] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體具有500 nM之解離常數。
[8] 如請求項6之抗體，其中該解離常數係使用Fab在25℃由BIAcore測定。
[9] 如請求項1至5中任一項之抗體，其為單株抗體。
[10] 如請求項1至5中任一項之抗體，其為人類、人類化或嵌合抗體。
[11] 如請求項1至5中任一項之抗體，其為結合HtrA1之抗體片段。
[12] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHYFDY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：27)；(b)包含胺基酸序列QQX_gX_hX_iX_jPX_kT之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：24)；及(c)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_oYADSVKG之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：26)。
[13] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(b)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3；及(c)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2。
[14] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(b)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3；及(c)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2。
[15] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3；及(c)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2。
[16] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)包含胺基酸序列GFX_lIX_mX_nYYIH之HVR-H1，其中X_l為N、S或T；X_m為S、D、Y或A；且X_n為G或D(SEQ ID NO：25)；(b)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_oYADSV KG之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：26)；及(c)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHYFDY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：27)。
[17] 如請求項1至5中任一項之抗體，其另外包含(a)包含胺基酸序列RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA之HVR-L1，其中X_a為D、S或V；X_b為V或I；X_c為S、N或G；X_d為T或N；X_e為A或Y；且X_f為V或L(SEQ ID NO：23)；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列QQX_gX_hX_iX_jPX_kT之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：24)。
[18] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。
[19] 如請求項18之抗體，其另外包含(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。
[20] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。
[21] 如請求項20之抗體，其另外包含(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。
[22] 如請求項20之抗體，其另外包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
[23] 如請求項1至5中任一項之抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。
[24] 如請求項1至5中任一項之抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。
[25] 如請求項1至5中任一項之抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
[26] 如請求項1至5中任一項之抗體，其另外包含SEQ ID NO：17之重鏈可變結構域構架(FR2)序列。
[27] 如請求項1至5中任一項之抗體，其包含(a)與SEQ ID NO：8之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
[28] 如請求項1至5中任一項之抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：32之VH序列；(b)包含SEQ ID NO：31之VL序列；或(c)包含SEQ ID NO：32之VH序列及包含SEQ ID NO：31之VL序列。
[29] 如請求項27之抗體，其包含SEQ ID NO：8之VH序列。
[30] 如請求項27之抗體，其包含SEQ ID NO：7之VL序列。
[31] 如請求項27之抗體，其包含SEQ ID NO：30之VH序列。
[32] 如請求項27之抗體，其包含SEQ ID NO：28之VL序列。
[33] 如請求項27之抗體，其包含SEQ ID NO：29之VL序列。
[34] 一種抗體，其包含SEQ ID NO：8之VH序列與SEQ ID NO：7之VL序列。
[35] 一種抗體，其包含SEQ ID NO：30之VH序列與SEQ ID NO：28之VL序列。
[36] 一種抗體，其包含SEQ ID NO：30之VH序列與SEQ ID NO：29之VL序列。
[37] 一種結合至HtrA1之抗體，其包含(a)與SEQ ID NO：8之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
[38] 一種結合至HtrA1之抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：32之VH序列；(b)包含SEQ ID NO：31之VL序列；或(c)包含SEQ ID NO：32之VH序列與包含SEQ ID NO：31之VL序列。
[39] 一種抗體，其包含(a)包含胺基酸序列GFX_lIX_mX_nYYIH之HVR-H1，其中X_l為N、S或T；X_m為S、D、Y或A；且X_n為G或D(SEQ ID NO：25)；(b)包含胺基酸序列WIDPYGGDTX_oYADSVKG之HVR-H2，其中X_o為N或D(SEQ ID NO：26)；(c)包含胺基酸序列GTFLTX_pWGHYFDY之HVR-H3，其中X_p為S或T(SEQ ID NO：27)；(d)包含胺基酸序列RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA之HVR-L1，其中X_a為D、S或V；X_b為V或I；X_c為S、N或G；X_d為T或N；X_e為A或Y；且X_f為V或L(SEQ ID NO：23)；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列QQX_gX_hX_iX_jPX_kT之HVR-L3，其中X_g為S、V或D；X_h為Y、D或S；X_i為T、S、A、D或N；X_j為T、H、N、S、A、L或R；且X_k為P、T、A或S(SEQ ID NO：24)。
[40] 如請求項39之抗體，其中該抗體包含(a)包含選自SEQ ID NO：4、20及47至51之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：5及52之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含選自SEQ ID NO：6及53之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含選自SEQ ID NO：1、18、21及33之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：3、19、22及34至46之胺基酸序列之HVR-L3。
[41] 如請求項40之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。
[42] 如請求項40之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。
[43] 如請求項40之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-L3。
[44] 如請求項1至5及34至43中任一項之抗體，其為全長IgG1或IgG4抗體。
[45] 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至44中任一項之抗體。
[46] 一種宿主細胞，其包含如請求項45之核酸。
[47] 一種產生抗-HtrA1抗體之方法，其包含如請求項46之宿主細胞在適合表現編碼抗-HtrA1抗體之核酸的條件下培養。
[48] 如請求項47之方法，其另外包含自該宿主細胞培養物回收該抗-HtrA1抗體。
[49] 一種免疫結合物，其包含如請求項1至44中任一項之抗體及細胞毒性劑。
[50] 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至44中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
[51] 如請求項1至5及34至43中任一項之抗體，其係用作藥物。
[52] 如請求項1至5及34至43中任一項之抗體，其係用於治療年齡相關之黃斑變性、地圖樣萎縮、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。
[53] 如請求項52之抗體，其係用於治療乾性年齡相關之黃斑變性。
[54] 如請求項1至5及34至43中任一項之抗體，其係用於抑制視網膜細胞或感光細胞退化。
[55] 如請求項1至5及34至43中任一項之抗體，其係用於抑制眼睛中之HtrA1蛋白酶活性。
[56] 一種如請求項1至44中任一項之抗體的用途，其用於製造藥物。
[57] 如請求項56之用途，其中該藥物係用於治療年齡相關之黃斑變性、地圖樣萎縮、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。
[58] 如請求項57之用途，其中該年齡相關之黃斑變性為乾性年齡相關之黃斑變性。
[59] 如請求項56之用途，其中該藥物係用於抑制視網膜細胞或感光細胞退化。
[60] 如請求項56之用途，其中該藥物係用於抑制眼睛中之HtrA1蛋白酶活性。
[61] 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3。
[62] 如請求項1至5中任一項之抗體，其另外包含(a)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3。
[63] 一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HVR-L3。
[64] 如請求項67之抗體，其中該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L3。
[65] 如請求項63或64之抗體，其中該抗體包含(a)包含選自SEQ ID NO：4、20、47至51及75至80之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：5、52及81至82之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含選自SEQ ID NO：6、53及83至84之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含選自SEQ ID NO：1、18、21、33及54至57之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含選自SEQ ID NO：2及58之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：3、19、22、34至46及59至74之胺基酸序列之HVR-L3。
[66] 如請求項61之抗體，其為全長IgG1或IgG4抗體。
[67] 如請求項62之抗體，其為全長IgG1或IgG4抗體。
[68] 如請求項63或64中任一項之抗體，其為全長IgG1或IgG4抗體。
[69] 一種經分離之核酸，其編碼如請求項61至68中任一項之抗體。
[70] 一種宿主細胞，其包含如請求項69之核酸。
[71] 一種產生抗-HtrA1抗體之方法，其包含如請求項70之宿主細胞在適合表現編碼抗-HtrA1抗體之核酸的條件下培養。
[72] 如請求項71之方法，其另外包含自該宿主細胞培養物回收該抗-HtrA1抗體。
[73] 一種免疫結合物，其包含如請求項61至68中任一項之抗體及細胞毒性劑。
[74] 一種醫藥調配物，其包含如請求項61至68中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
[75] 如請求項61之抗體，其係用作藥物。
[76] 如請求項62之抗體，其係用作藥物。
[77] 如請求項63或64之抗體，其係用作藥物。
[78] 如請求項61之抗體，其係用於治療年齡相關之黃斑變性、地圖樣萎縮、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。
[79] 如請求項62之抗體，其係用於治療年齡相關之黃斑變性、地圖樣萎縮、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。
[80] 如請求項63或64之抗體，其係用於治療年齡相關之黃斑變性、地圖樣萎縮、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。
[81] 如請求項78之抗體，其係用於治療乾性年齡相關之黃斑變性。
[82] 如請求項61之抗體，其係用於抑制視網膜細胞或感光細胞退化。
[83] 如請求項62之抗體，其係用於抑制視網膜細胞或感光細胞退化。
[84] 如請求項63或64之抗體，其係用於抑制視網膜細胞或感光細胞退化。
[85] 如請求項61之抗體，其係用於抑制眼睛中之HtrA1蛋白酶活性。
[86] 如請求項62之抗體，其係用於抑制眼睛中之HtrA1蛋白酶活性。
[87] 如請求項63或64之抗體，其係用於抑制眼睛中之HtrA1蛋白酶活性。
[88] 一種如請求項61至68中任一項之抗體的用途，其用於製造藥物。
[89] 如請求項88之用途，其中該藥物係用於治療年齡相關之黃斑變性、地圖樣萎縮、糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。
[90] 如請求項89之用途，其中該年齡相關之黃斑變性為乾性年齡相關之黃斑變性。
[91] 如請求項88之用途，其中該藥物係用於抑制視網膜細胞或感光細胞退化。
[92] 如請求項88之用途，其中該藥物係用於抑制眼睛中之HtrA1蛋白酶活性。

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法律状态:

优先权:

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申请号 | 申请日 | 专利标题

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