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    • 专利摘要:
    本發明揭露一純化的單株抗體，或其抗原結合部分，其可專一性地結合至人類網格蛋白重鏈(clathrin heavy chain，CHC)。該抗體、或其抗原結合部分，表現至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、或全部八個以下之特性：(a)專一結合至胰腺癌細胞；(b)結合至癌細胞及腫瘤血管之細胞表面及細胞溶質；(c)會被CHC表現細胞所內化；(d)抑制腫瘤生長、侵入能力、轉移及血管新生；(e)誘發癌細胞及人類臍靜脈內皮細胞之細胞凋亡；(f)活體內抑制於胰臟癌之腫瘤生長及腫瘤血管；(g)抑制癌細胞之表皮生長因子、轉鐵蛋白及VEGF的內化作用；以及(h)抑制缺氧誘發因子-1α之表現及血管內皮生長因子之分泌。
    公开号:TW201321407A
    申请号:TW101136734
    申请日:2012-10-04
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Han-Chung Wu；Kuo-Hua Tung
    申请人:Academia Sinica；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    供抑制腫瘤血管生成及生長之新穎的抗網格蛋白重鏈之單株抗體及其應用
    本發明大致上係關於抗癌藥劑，更特定而言，係與供治療癌症之抗體有關。
    約95%之胰臟癌病例為腺癌。胰腺癌之五年整體存活率約為5%。於美國，其係造成癌症死亡之第四個主因。儘管使用了化療或放射療法，胰臟癌通常仍會於第一次治療後復發。迄今，仍無有效療法可供治療胰臟癌。最常用於治療胰臟癌之藥物為吉西他濱(gemcitabine，GEM)；該藥物是一種嘧啶核苷藥物，但也僅具有中等的療效。
    近來於臨床試驗中，兩種供標靶療法對抗胰臟癌之單株抗體(mAbs)藥物為西妥昔單抗(cetuximab)及癌思停(bevacizumab)，分別標靶表皮生長因子受體(epidermal growth factor recptor，EGFR)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。然而，臨床試驗數據顯示無論使用西妥昔單抗或癌思停，且與小分子藥物併用，皆對於胰臟癌病患之整體存活率無明顯地改善。
    因此，找出一適合的標靶對於發展抗胰臟癌之標靶療法十分重要。
    在一方面，本發明係關於一種純化的單株抗體，或其抗原結合部分，其可專一地結合至人類網格蛋白重鏈(CHC)上；該人類網格蛋白重鏈包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
    在另一方面，本發明係關於一種分離的單株抗體，或其結合片段。該分離的單株抗體，或其結合片段包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO：4之互補決定區1(CDR1)；(ii)包含SEQ ID NO：5之互補決定區2(CDR2)；及(iii)包含SEQ ID NO：6之互補決定區3(CDR3)；以及該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO：7之CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：8之CDR2；以及(iii)包含SEQ ID NO：9之CDR3。
    進一步於另一方面，本發明係關於一種於個體中偵測癌症之方法，其包含：(a)將該分離的單株抗體或如前述之結合片段施予一源自該個體之細胞或組織樣本；以及(b)分析該分離的單株抗體或其結合片段結合至該細胞或該組織樣本的情形；以及(c)與正常對照組比較抗體結合的情形，以決定該個體是否患有癌症，其中該癌症會表現人類網格蛋白重鏈。
    於又一方面，本發明係關於一供抑制腫瘤細胞生長及/或腫瘤血管新生之醫藥組合物，其包含前述之純化的單株抗體，或其抗原結合部分，以及醫藥上可接受之載劑。
    於再一方面，本發明係關於一供抑制腫瘤細胞生長及/或腫瘤血管新生之醫藥組合物，其包含(a)前述之分離的單株抗體，或其結合片段；及(b)醫藥上可接受之載劑。
    於又一方面，本發明係關於一分離的單鏈可變片段，包含：(a)前述之分離的抗體或結合的片段之重鏈可變區(SEQ ID NO：2)及輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)：以及(b)一連結胜肽，用以連結該重鏈可變區(SEQ ID NO：2)及該輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)。
    可藉由下述較佳具體實施例之說明，並搭配接續之圖式，以更佳明瞭本發明之前述及其它面相，雖然其中會有些變化及修改，但仍不背離本發明創新概念之精神及範疇。
    本發明伴隨之圖式將闡述一或多個具體實施例，並搭配所述之說明，以解釋本發明之原理。無論於何處所用，圖式中所用之元件編號係與具體實施例中所述者為相同或相似之元件。 定義
    本說明書中所使用的術語(於本發明之上下文中，及每個術語被使用到的特定上下文中)皆具有其於該領域之通常意義。部分用於說明本發明之術語係於下文中、或說明書之其他位置中來討論其所代表之意義，以提供實施者關於發明說明之額外導引。為了便於閱讀，部分術語會加強其表示方式，例如使用斜體字及/或引號。使用該類加強表示方式並不影響該術語之範圍及意義；該術語於本文中無論有無加強表示，其範圍及意義仍為相同。可被理解的是，相同的事物可以多於一種方式來描述。因此，可用其他語言及同義詞以代表本文所述之任何一或多個術語，且無論該術語是否有被闡述或討論於本文中，其意義上仍與本文所述者相同，而無其他特別不同處。本文亦提供部分術語之同義詞。所揭露之一個或多個同義詞並不代表不能使用其他的同義詞。本文中任一處所使用之實例，包含於本文中所述之任何術語之例子僅用於闡述，並非用於以任何形式來侷限本發明或任何示例性術語之範圍及意義。相同的，本發明並不侷限於說明書所述之各種具體實施例。
    除非另有定義，所有於本文中所用之技術及科學性之術語皆具有與本發明所屬領域之通常技藝者所瞭解之相同意義。若有抵觸，則以本文所包含之定義為主。
    本文所使用的「大致上(around)」、「約(about)」或「近乎(approximately)」乙詞一般是指一數值或範圍之20%之內，較佳者為10%之內，更佳者為5%之內。如無以該等術語表示時，本文所述之數量詞係指近似值，應可推斷為術語「大致上(around)」、「約(about)」或「近乎(approximately)」之意義。
    縮寫：mAb，單株抗體；CHC，網格蛋白重鏈；HIF-1α，缺氧誘發因子1α；VEGF，血管內皮生長因子；NNM，正常鼻黏膜；FACS，流式細胞分析；ELISA，酵素連結免疫吸附法；EMT，上皮-間質轉化；定量反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)；ChIP，染色質免疫沉澱法；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶；HUVEC，人類臍靜脈內皮細胞；IHC，免疫組織化學法；DFX，去鐵胺；HRE，缺氧反應元件；UEA-1，荊豆凝集素-1；CDR，互補決定區；LC-nanoESI-MS/MS，液相層析-奈米-電灑離子化法串聯式質譜儀。
    本文所使用的「製備」乙詞一般是指製備、製造之某物，或特別製造之一物質。
    本文所使用的「抗體」乙詞是指一免疫球蛋白(Ig)分子或免疫球蛋白分子之片段，其具有專一性結合至一特定抗原的能力。該Ig單體為一Y形分子，其係由四個胜肽鏈所組成；包含兩個相同的重鏈及兩個相同的輕鏈，其間由雙硫鍵所連結。該Y形分子之臂，例如，含有與抗原結合的位置，因而可用以辨識特定外源目標。抗體之該區域被稱作Fab(片段，抗原結合)區。
    抗體對於免疫學之具有通常技藝者而言是相當熟知的。如本文所使用的「抗體」乙詞不僅是指全長之抗體分子，亦包含帶有抗原結合能力之抗體分子片段。該等片段於該領域中亦十分常見，且常被應用於活體外及活體內。具體而言，本文所使用的「抗體」乙詞不僅為全長之免疫球蛋白分子，亦包含可與抗原結合之活性片段，像是常見的活性片段F(ab')2、Fab、Fv、及Fd。
    該抗原結合片段(Fab片段)係為一抗體上之區域，用於與抗原結合。該抗原結合片段係由每個重鏈及輕鏈之不變區及可變區所組成。該兩個可變區會與其專一抗原的抗原決定基結合。Fc及Fab片段可於實驗室製備。木瓜蛋白酶可用於切割免疫球蛋白單體成兩個Fab片段及一個Fc片段。胃蛋白酶會於鉸鏈區下進行酶切，如此即可形成一個F(ab')2片段及一個pFc'片段。酵素IdeS(從化膿性鏈球菌取得之免疫球蛋白降解酵素，商品名稱FabRICATORTM)可於中性酸鹼值時，以一特定序列方式酶切IgG。該F(ab')2片段可藉由溫和的還原反應被分成兩個Fab'片段。
    抗體之可變區係指FV區，且其為與抗原結合之最重要區域。
    該FV片段係由重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)所組成，二者由強的非共價鍵結連結在一起。因此，每個FV片段含有一個完整的抗原結合位置，且代表了一個可自抗體分子取得之最小活性片段。
    該重鏈及輕鏈之可變區可被融合在一起以形成一單鏈的可變片段(scFv)，其僅為Fab片段之一半大小，但仍保有與原始免疫球蛋白相同之專一性。
    據報告指出「完全」人類抗體可避免某些人源化及嵌合抗體之副作用。兩個成功的案例為，噬菌體顯現法所產生之抗體及藉由小鼠以基因工程方式所生產之更佳類人類抗體。噬菌體顯現法之使用可使之各種抗體區域表現於絲狀噬菌體之抗體上。
    將哺乳動物抗體之非CDR區以同種或異種抗體之相似區域取代，且仍保有如原始抗體之抗原決定基之專一性的技術，於現今已十分成熟。目前最為熟知之「人源化」抗體的發展及用途係將非人類CDRs與人類FR及/或Fc/pFc'區共價連結以製備一具功能之抗體。因此，例如，PCT國際公開號WO 92/04381教示人源化之鼠RSV抗體的生產及用途，其中至少一部份的鼠FR區已被人類的FR區所取代。該等抗體包括帶有抗原結合能力之全長抗體片段，通常被稱作為「嵌合」抗體。該等嵌合抗體之部分或全部的FR區或可被其他同源的人類FR區所取代而被生產。
    非人類(如：鼠類)之人源化形式抗體為嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗體之抗原結合次序列)，其含有源自非人類免疫球蛋白之最少序列。人源化抗體包括人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之一互補決定區(CDR)之殘基，係被來自非人類物種(提供者抗體)之CDR之殘基所取代，例如，小鼠、大鼠或兔子，其具有所需專一性、親和性及能力。於一些例子中，人類免疫球蛋白之Fv架構殘基係由對應之非人類殘基所取代。人源化抗體亦可包含非源自接受者之抗體或輸入者之CDR或架構序列之殘基。一般而言，該人源化抗體實質上將包含至少一個、典型為兩個的可變區之全部；其中全部或實質上全部之CDR區可對應非人類免疫球蛋白，以及全部或實質上全部的FR區為人類免疫球蛋白之共同序列。該人源抗體較佳地亦可包含至少一部份之免疫球蛋白的不變區(Fc)，典型地，其為人類之免疫球蛋白(Jones et al.,Nature,321：522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992))。
    人源化非人類抗體之方法係為該領域所習知者。一般而言，一人源化抗體具有一個或多個胺基酸殘基，其係源自非人類來源。該等非人類胺基酸殘基通常被稱作「輸入者」之殘基，其典型地是源自「輸入者」之可變區。人源化一般可藉由Winter及其同事所述之方法實行(Jones et al.,Nature,321：522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239：1534-1536(1988))；藉由將齧齒動物之CDRs或CDR序列取代人類抗體之對應序列。因此，該等人源化抗體為嵌合抗體(U.S.Pat.No.4,816,567)，其中實質上不到一個完整的人類可變區已被源自非人類物種之對應序列所取代。實際上，人源化抗體典型地為人類抗體，其中部分CDR殘基及可能部分FR殘基係由源自齧齒動物抗體之相似位置的殘基所取代。
    人類抗體亦可以該領域習知之不同技術生產，包括噬菌體顯現庫。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)及Boerner et al.,J.Immunol.,147(1)：86-95(1991))。相似地，人類抗體之製作亦可藉由將人類免疫球蛋白基因組引入轉殖基因動物內，如：小鼠，其中內源性免疫球蛋白基因已有部分或全部被不活化。經刺激，即可觀察到人類抗體之產生，其於各方面與在人類中所見者十分相似，包括基因重組、組裝、及抗體庫。此種方法誠如U.S.Pat.Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016所描述。該等完全人類或人源化單株抗體將因其不會引發對抗其本身之免疫反應而具有其特定的用途。請參閱U.S.Patent No.7,622,113，本文亦以引用方式將其全部內容引入。
    該抗體或可被標記且或可被固定於一固體支撐物上。此處所使用之「標記」乙詞是指一可偵測之化合物或組合物，其被直接或間接地共軛連結至該抗體上，以產生「標記」抗體。該標記可能為本身即可被偵測(如：放射同位素標記或螢光標記)，或為一酵素標記，其可催化一受質化合物或組合物之化學性轉變，遂使之得以被偵測到。
    吾人已產生幾種辨識胰臟癌細胞之mAbs。該等mAbs之一，Pa65-2，可辨識網格蛋白重鏈(CHC)。網格蛋白，係由於17q23.2之CLTC基因所編碼，為一重鏈三聚體(每一個約為190 kDa)，每組帶有一個輕鏈(25-27 kDa)。其組合之基本單元為一三臂結構，係為具有彈性、三臂的多面籠狀結構。網格蛋白於網格媒介之胞飲作用(clathrin-mediated endocytosis，CME)路徑中扮演重要之角色，該CME係為細胞膜流通之一主要的路徑。其牽涉到許多配體-受體複合物、細胞膜轉運子、及黏合分子之攝入。網格蛋白亦可穩定有絲分裂中之紡錘體的纖維。然而，CHC於腫瘤生成中之主要機制仍屬未知。
    吾人發現CHC可能可調控缺氧誘發因子-1(HIF-1α)的α子單元之穩定性。當細胞接觸到缺氧環境時，HIF-1α即被穩定，其接著正調控許多下游基因以促進細胞於低氧狀況下存活。HIF-1α的累積可媒介細胞的及系統性的適應性反應以維持氧氣的平衡。其亦可正調控缺氧誘發基因，該等基因於所有後生動物種族係參與血管新生、紅血球生成、能量代謝及細胞存活之決定。於癌症環境中，快速成長之實質固態瘤中的細胞會面臨到慢性的或間歇的缺氧狀況。因此，腫瘤細胞於其發展、侵入及轉移時，會面臨源自缺氧之極大壓力。於眾多實質固態瘤中，缺氧反應蛋白之表現提高係為一不佳的預後指標，且從許多研究結果指出直接或間接抗HIF-1α之表現的藥劑具有抗癌作用。
    本發明中，吾人發現於癌細胞中，CHC(與HIF-1α相關)會增加HIF-1α之蛋白穩定性並促進其轉位至細胞核，藉此調控VEGF基因表現。新合成之Pa65-2可抑制腫瘤生長及血管新生，意味著該mAb可於胰臟癌中用於抑制腫瘤血管新生及腫瘤生成。
    在一方面，本發明係關於一種純化的單株抗體，或其抗原結合部分，其可專一地結合至人類網格蛋白重鏈(CHC)上；該人類網格蛋白重鏈包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
    於本發明之一具體實施例中，該純化的單株抗體，或其抗原結合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區；以及(b)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的輕鏈可變區。
    於本發明之另一具體實施例中，該純化的單株抗體，或其抗原結合部分，可結合至選自由胰臟癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、口腔癌細胞、及腫瘤相關內皮細胞所組成群組之細胞。
    於另一方面中，本發明係關於一種分離的單株抗體，或其結合片段。該分離的單株抗體，或其結合片段包含：一重鏈可變區及一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO：4之互補決定區1(CDR1)；(ii)包含SEQ ID NO：5之互補決定區2(CDR2)；以及(iii)包含SEQ ID NO：6之互補決定區3(CDR3)；以及該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO：7之CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：8之CDR2；以及(iii)包含SEQ ID NO：9之CDR3。
    於又一方面中，本發明係關於一種於個體中偵測癌症之方法，其包含：(a)將如前述之分離的單株抗體或其結合片段，施予一源自該個體之細胞或組織樣本；以及(b)分析該分離的單株抗體或其結合片段結合至該細胞或該組織樣本的情形；以及(c)與正常對照組比較抗體結合的情形，以決定該個體是否患有癌症，其中該癌症會表現人類網格蛋白重鏈。
    於本發明之一具體實施例中，該分離的抗體或結合片段包含一重鏈可變區(VH)(SEQ ID NO：2)及/或一輕鏈可變區(VL)(SEQ ID NO：3)。
    於本發明之另一具體實施例中，該結合片段包含抗體的Fv片段。
    於本發明之又一具體實施例中，該結合片段包含抗體的Fab片段。
    於本發明之又一具體實施例中，該抗體為完全人類之單株抗體。
    於本發明之又一具體實施例中，該抗體為人源化之單株抗體。
    於本發明之又一具體實施例中，前述之抗體或其結合片段，可結合至會表現網格蛋白重鏈(CHC)之癌細胞。
    於本發明之又一具體實施例中，該分離的抗體或結合片段，可被一可偵測之化合物或酵素所標記。
    於本發明之又一具體實施例中，該分離的抗體或結合片段被一脂質體所包埋。
    另一方面，本發明係關於一種供抑制腫瘤細胞生長及/或腫瘤血管新生之方法，其包含投予一組合物至所需個體，該組合物包含前述純化的單株抗體、或其抗原結合部分，及醫藥上可接受之載劑。
    於再一方面，本發明係關於一種供抑制腫瘤細胞生長及/或腫瘤血管新生之方法，其包含投予一組合物至所需個體，該組合物包含前述之分離的單株抗體、或其結合片段，及醫藥上可接受之載劑。
    於又一方面，本發明係關於一種供抑制腫瘤細胞生長及/或腫瘤血管新生之醫藥組合物，包含前述純化的單株抗體，或其抗原結合部分，以及醫藥上可接受之載劑。
    於再一方面，本發明係關於一種供抑制腫瘤細胞生長及/或腫瘤血管新生之醫藥組合物，包含前述之分離的單株抗體，或其結合片段，以及醫藥上可接受之載劑。
    於本發明之一具體實施例中，該醫藥組合物進一步包含一抗癌藥劑。該抗癌藥劑可為小分子藥物，包括但不限於吉西他濱。
    於本發明之一具體實施例中，該腫瘤細胞會表現網格蛋白重鏈(CHC)。於本發明之另一具體實施例中，該腫瘤細胞係選自由胰臟癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、口腔癌細胞、及腫瘤相關內皮細胞所組成之群組。
    於又一方面，本發明關於一種分離的單鏈可變片段，包含：(a)如前述之分離的抗體或結合片段之重鏈可變區(SEQ ID NO：2)及輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)；以及(b)一連結胜肽，用以連結該重鏈可變區(SEQ ID NO：2)及該輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)。
    於本發明之又一具體實施例中，前述之分離的單株抗體或其抗原結合部分表現至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、或全部八個以下之特性：(a)專一結合至胰腺癌細胞；(b)結合至癌細胞及腫瘤血管之細胞表面及細胞溶質；(c)會被CHC表現細胞所內化；(d)抑制腫瘤生長、侵入能力、轉移及血管新生；(e)誘發癌細胞及人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)之細胞凋亡；(f)活體內抑制於胰臟癌之腫瘤生長及腫瘤血管；(g)抑制癌細胞之表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、轉鐵蛋白(transferrin，Tf)及VEGF的內化作用；或(h)抑制缺氧誘發因子-1α(HIF-1α)之表現及血管內皮生長因子(VEGF)之分泌。 實施例
    根據本發明之具體實施例中所述之示例性儀器、機構、方法及其相關結果，皆非意欲用於限制本發明之範圍。需注意的是，實例中可能使用之標題或次標題僅供方便閱讀，而不應以任何形式侷限本發明之範圍。再者，本文中所提出及揭露之部分理論，無論其對或錯，皆不應以任何形式用於侷限本發明之範圍，只要根據本發明可實施本發明，則不需考量任何特定理論或作用機制。 材料及方法
    細胞株及培養方法
    人類胰腺癌細胞株(MIA PaCa-2及AsPC-1)、人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)、人類卵巢癌細胞株(SKOV3)、人類直腸癌細胞株(COLO 205)、及人類皮膚纖維母細胞細胞株(CCD-1112Sk)皆購自美國菌種保藏中心(ATCC®)。該等細胞係根據細胞庫之方法進行培養且經復甦後繼代不超過6個月。正常鼻腔黏膜(normal nasal mucosal，NNM)上皮細胞係為一源自鼻腔瘜肉之初代培養物。人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)係購入(LONZATM)，並於EBM-2培養基(LONZATM)中生長。該等細胞株亦從美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC®)購入。人類口腔癌細胞株(SAS)係得自日本癌症研究資源庫。該等細胞根據細胞庫方法進行培養，並經復甦後繼代不超過6個月。
    單株抗體之產生
    抗MIA PaCa-2之單株抗體係根據以下之稍作修改的標準步驟產生。簡言之，將MIA PaCa-2以腹腔注射方式免疫母的BALB/cJ小鼠，共四次每次間隔3週。經最後一次免疫補強後的第四天，自該免疫後小鼠脾臟中收獲脾細胞，並將之以50%聚乙二醇(GIBCOTM)與NSI/1-Ag4-1骨髓瘤細胞進行融合。該等融合瘤中，對於MIA PaCa-2呈現陽性反應，且對NNM呈現陰性反應者，遂以有限之稀釋進行次選殖，並保存於液態氮中。注射過異十九烷(pristane)的BALB/cJ小鼠會產生腹水，並以蛋白質G瓊脂糖(Sepharose)4G凝膠(GE)純化mAbs。
    辨識出Pa65-2的標靶蛋白
    以蛋白質G瓊脂糖(GE)純化MIA PaCa-2細胞溶解物，佐以Pa65-2並以洗提緩衝液進行洗提。將洗提液以SDS-PAGE分離。將感興趣之條帶從膠上切下，並以被碘乙醯胺(iodoacetamide，IAA)烷化的二硫蘇糖醇(dithioerythreitol，DTE)還原，再以胰蛋白脢於37℃進行酶切16小時。將酶切後之胜肽送於中央研究院(台北)之蛋白質體及結構生物研究中心之核心實驗室的LC-MS/MS定序儀分析。
    免疫沈澱及免疫墨點分析
    將細胞以RIPA緩衝液萃取，並使用抗CHC抗體、Pa65-2、mAb X-22(Affinity)或抗HIF-1α抗體(BD)將上清液進行免疫沈澱，接著以免疫墨點法分析。使用加強的化學發光劑(enhanced chemiluminescence reagent，ECL)(Thermo)以使訊號呈現出來。
    酵素連結免疫吸附分析法及流式細胞分析
    將細胞培養於96孔之聚苯乙烯盤中3天，接著以2%多聚甲醛進行固定。經阻斷及以PBS/0.1% Tween 20(PBST0.1)洗滌兩次後，將融合瘤之上清液加入盤中，並於室溫培養2小時。經洗滌後再以辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)-共軛之山羊抗鼠IgG進行培養1小時。根據製造商之使用說明(Sigma)以受質鄰苯二胺(ortho-phenylene-diamine，OPD)進行呈色反應，並以3 N HCl終止呈色反應。再以微量盤式光譜儀於吸光值490 nm進行測量。每個對照組及測試組皆經三重複測試。每個實驗皆重複至少三次。為了分析結合情形，將細胞(每管1×105個細胞)製備、洗滌、離心及重新懸浮於100 μl的含有Pa65-2或NM-IgG的PBS/1% FCS中。將細胞置於4℃培養1小時，並以PBS/1% FCS洗滌兩次，再以螢光素異硫氰酸鹽(fluorescent isothiocyanate，FITC)標記之山羊抗鼠IgG於4℃進行染色20分鐘。將染色之細胞進行洗滌兩次，並以FACscan(BD)進行測量螢光訊號。至少以5×103個細胞進行表單模式(listmode)分析，以單一細胞之方式進行測量，並以頻率分佈圖譜或點陣圖譜呈現。
    MTT法
    將細胞培養於96孔盤中。為了降低癌細胞之生長，將細胞培養於含有50 μg/ml Pa65-2或NM-IgG之Dulbecco’s modified Eagle’s培養基(DMEM)中。經培養0、1、2、3天後，將細胞進行MTT分析。以微量盤式光譜儀於吸光值540 nm進行測量。每次分析皆重複三次。
    Pa65-2抑制HUVEC之內化作用
    將HUVEC以無血清培養基洗滌，並在37℃培養於1% BSA之無血清培養基中，並以Pa65-2或NM-IgG(50 μg/ml)於37℃進行前處理。接著將之與或不與VEGF-A(40 ng/ml)於37℃或4℃一起培養。細胞經洗滌後，進行固定並使之可穿透化。將該可穿透之細胞以抗VEGF-A抗體(A-20，Santa Cruz)進行培養。最後，將細胞以玫紅-共軛的二級抗體進行染色。
    細胞增生分析及侵入分析
    RT-CES(ACEA)，一種微電子細胞感應系統，係用於計算活細胞之數目。將細胞(5×103)種於微量滴定盤之每個含有感應器之孔洞中。該電子感應器可提供檢測每個孔洞中之細胞參數的連續式的(每6小時)、定量的測量結果。細胞生長係測量72小時，且每個孔洞之細胞參數係於所有時間點被紀錄。根據製造商之指示，細胞侵入係以24孔Biocoat Matrigel侵入管(8 μm；Millipore)分析。於顯微鏡下的五個預定視野中計算細胞數目。試驗係以三重複進行。
    shRNA轉染及螢光酵素報導基因分析
    產生含有CHC shRNA ID TRCN0000007984(中央研究院，台北)及pLKO.1空載體之對照組的慢病毒(pLKO.1)，並用以感染MIA PaCa-2細胞。以嘌呤黴素篩選出穩定的轉染物。將VEGF報導子質體中所含有之VEGF基因之核苷酸-2274至+379插入螢光酵素報導子pGL2-Basic(PROMEGATM)中，如前述之方式(Forsythe et al(1996)Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1.Mol Cell Biol,16,4604-13)。VEGF啟動子引子序列係列於表3中。螢光酵素報導子基因分析係根據製造商之指示，以水母螢光酵素(Renilla Luciferase)分析系統(PROMEGATM)進行。使用該水母螢光酵素將轉染效率進行正規化。相對光度單位係以螢火蟲螢光酵素(Firefly Luciferase)活性比水母螢光酵素活性(正規化之螢光酵素活性)的比例來計算。
    定量反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
    根據製造商之指示，以RNeasy Mini套組(QIAGEN)萃取RNA萃取物。第一股之cDNA係自1.0 μg之總RNA藉由SuperScript III反轉錄酶(INVITROGENTM)進行合成。CLTC、VEGF、HIF-1α、紅血球生成素(EPO)、血小板衍生生長因子-β(PDGF-β)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)之引子序列皆列於表4中。使用LightCycler 480系統(Roche)以進行即時PCR。循環溫度為：變性94℃、黏合60℃、及延長70℃。每個樣本之數據係以GAPDH之表現量進行正規化。
    缺氧分析
    為了進行缺氧實驗，使MIA PaCa-2細胞生長於Ruskinn缺氧腔(APM-50D，18 Astec，日本)中，並以1% O2、5% CO2處理18小時、或給予除鐵胺(DFX)(100 μM，Sigma)處理達5或16小時。為了進行蛋白酶體抑制試驗，將MG132(10 μM，Sigma)加入培養基中，接著培養5到17小時。
    染色質免疫沉澱法(ChIP)
    染色質免疫沉澱法(ChIP)之步驟已於先前技術描述過。簡言之，將對照組及表現shCHC之MIA PaCa-2細胞以1%甲醛進行固定，溶解於溶解緩衝液中，超音波震碎、並以離心分離出來。將上清液以抗CHC、抗HIF-1α(Abcam)、或NM-IgG(Sigma)抗體進行免疫沈澱。接著將沈澱物以LightCycler 480系統進行增幅。於免疫沈澱DNA中之特定序列的相對含量係使用△△C t 之方法，並以源自總萃取DNA(輸入DNA)所得之C t 作為參考數值來判定。免疫沈澱標靶之量係以即時PCR定量，而免疫沈澱標靶之值係以IP DNA相對供免疫沈澱之input DNA總量(IP/input)計算，以獲得相對倍數增強值。ChIP引子序列係如表5所示。
    免疫-電子顯微鏡
    將細胞以細胞刮取器(Costar)輕緩地從角瓶中刮下，並於多聚甲醛及戊二醛中固定。經固定後，將細胞沈澱物以緩衝液及30%甘油進行沖洗，並輕緩地置於室溫進行整夜攪拌。將細胞於AFS(Leica)下進行凍結置換，其係藉由甲醇將該等細胞於-91℃進行脫水4到5天。之後將細胞回溫至-50℃，並以Lowicryl HM20包埋，並以UV於-50℃進行聚合。使用Ultracut UC7(Leica)以取得90 nm厚度之超薄切片。接著將該等切片以Pa65-2鼠的IgG或抗HIF-1α兔的IgG進行培養。將與18 nm金顆粒共軛之二級抗體(Jackson)山羊抗鼠的IgG(F(ab')2片段)、或與12 nm金顆粒共軛之山羊抗兔IgG(F(ab')2片段)分別用於其相對之切片中。最後，將切片以醋酸鈾醯及檸檬酸鉛進行染色，並以TEM(Hitachi)檢驗。
    Pa65-2抑制細胞的內化作用
    如先前研究所述方法，EGF及Tf攝入試驗係以螢光方式進行。將細胞以無血清培養基進行沖洗，並置於37℃、含1% BSA之無血清培養基中進行培養，並於37℃以Pa65-2或NM-IgG(50μg/ml)進行前處理。接著將之以或不以Alex 555-EGF(1μg/ml，INVITROGENTM)或Alex 555-轉鐵蛋白(50μg/ml)，於37℃或4℃進行培養。再以Leica TCS SP共軛焦顯微鏡(Leica)將細胞成像。
    免疫螢光染色
    將細胞以抗Pa65-2及抗HIF-1α抗體進行培養，接著以帶有FITC或玫紅共軛之二級抗體(Jackson)處理。再以共軛焦顯微鏡(Leica)進行影像拍攝。
    細胞凋亡分析
    使用sulforhodamine FLICA細胞凋亡檢測套組(Immunochemistry Technologies)以偵測凋亡蛋白酶活性，藉此評估培養細胞之細胞凋亡。將於96孔盤中之細胞以Pa65-2或NM-IgG進行處理24小時。經與FLICA培養後，將細胞以螢光盤讀值機(Molecular Devices)於激發光/散射光波長為550/595 nm時進行判讀。
    動物模式
    所有動物實驗係遵守國家動物實驗中心之規範進行。試驗方案皆經中央研究院(台北)之動物實驗倫理委員會所批准。一異種移植模式係藉由將MIA PaCa-2細胞注入NOD/SCID小鼠中來產生，其中該細胞帶有CHC shRNA或對照組載體。兩種轉殖細胞被同時注入八隻動物之後腿的不同側。為了分析Pa65-2之抗腫瘤效率，將帶有MIA PaCa-2所衍生之胰臟癌異種移植物(~50 mm3)之NOD/SCID小鼠，以靜脈注射方式於尾靜脈注入Pa65-2、或吉西他濱、或NM-IgG、或等量之PBS。每三天以卡尺進行腫瘤之測量，且例行地觀察小鼠是否有體重喪失，以作為判斷藥物毒性之症狀。腫瘤體積係以長度×(寬度)2×0.52計算。動物之照護係根據中央研究院(台北)所建立之規範進行。
    CD31染色及末端去氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP末端標記法(TUNEL)
    CD31之染色及TUNEL法皆如先前所述方式進行。再以螢光顯微鏡觀察該等切片，並以MetaMorph軟體分析。
    組織樣本之分析
    以ABI9600熱迴圈儀(Applied Biosystems)分析人類胰臟癌基因表現陣列(Origene)。組織陣列係購自Pantomics Inc。組織切片係以對CHC(Pa65-2)、VEGF(GeneTex)、HIF-1α(Millipore)、NM-IgG及UEA-1-FITC(載體)具專一性之抗體進行染色。DAB強度之定量係以HistoQuest軟體(TissueGnostics)分析。試驗方案已由中央研究院(台北)之人體研究倫理委員會之人體試驗委員會所批准。
    cDNA合成及增幅不同之可變區
    以FastTrack mRNA分離套組(INVITROGENTM)從產生Pa65-2之融合瘤細胞中萃取出總mRNA。cDNA合成方式係基於Orlandi等人(1989)所述之方式(Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction，Proc Natl Acad Sci U S A,86 ,3833-7)進行。首先製備一反應混合物，其中含有10 μg的mRNA、20 pmol的VH1FOR引子或VK1FOR引子，引子序列皆列於表6中。250 μM的每種dNTP、50 mM Tris-HCl pH 8.3、140 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM二硫蘇糖醇及20單位(unit)的RNAsin(PHARMACIATM/LKB Biotechnology)於70℃加熱10分鐘並冷卻。將反轉錄酶(Anglian Biotec)加入並讓反應於42℃進行1小時。藉由Taq DNA聚合酶(PROMEGATM)進行增幅時，製備一反應混合物，其中含有5 μl的cDNA-RNA雜交體、25 pmol的引子VH1FOR或VK1FOR，及VH1BACK或VK1BACK引子序列皆列於表6中。250 μM的每種dNTP、67 mM三(羥甲基)胺基甲烷(tris(hydroxymethyl)amino methane)(pH 8.8)、17 mM(NH4)2SO4、10 mM MgCl2、每毫升200 μg的吉利丁、及2單位的Taq DNA聚合酶進行PCR 45個迴圈(1',95℃；1',55℃；2',72℃)接著進行膠體純化。根據製造商之使用說明，將PCR產物選殖入TA選殖載體pCR2.1(INVITROGENTM)，並將該載體轉染入大腸桿菌之DH5α株(GIBCO BRLTM)中並進行定序。
    統計分析
    若適用時，統計分析係使用非成對學生T檢定進行分析。*,p<0.05,**,p<0.01被認為具有顯著差異。
    酵素連結免疫吸附分析法及流式細胞分析
    將3×103個細胞培養於96孔之聚苯乙烯盤中3天，接著以2%多聚甲醛進行固定。經阻斷及以PBS/0.1% Tween 20(PBST0.1)洗滌兩次後，將融合瘤之上清液加入盤中，並於室溫培養2小時。經洗滌後再以辣根過氧化酶(HRP)-共軛之山羊抗鼠IgG進行培養1小時。根據製造商之使用說明(Sigma,St.Louis,MO)以受質鄰苯二胺(ortho-phenylene-diamine，OPD)進行呈色反應，並以3 N HCl終止呈色反應。再以微量盤式光譜儀於吸光值490 nm進行測量。每個對照組及測試組皆經三重複測試。每個實驗皆重複至少三次。為了分析結合情形，將細胞(每管1×105個細胞)製備、洗滌、離心及重新懸浮於100 μl的含有Pa65-2或NM-IgG的PBS/1% FCS中。將細胞置於4℃培養1小時，並以PBS/1% FCS洗滌兩次，再以螢光素異硫氰酸鹽(fluorescent isothiocyanate，FITC)標記之山羊抗鼠IgG於4℃進行染色20分鐘。將染色之細胞進行洗滌兩次，並以FACScan(BD Biosciences,San Jose,CA)進行測量螢光訊號。至少以5×103個細胞進行表單模式(list mode)分析，以單一細胞之方式進行測量，並以頻率分佈圖譜或點陣圖譜呈現。
    定量反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)
    根據製造商之操作步驟，以RNeasy Mini套組(QIAGEN,Valencia,CA)萃取RNA萃取物。第一股之cDNA係自1.0 μg之總RNA藉由SuperScript III反轉錄酶(INVITROGENTM,Carlsbad,CA)進行合成。用於PCR增幅之引子為：GAPDH-F,5'-CTTCACCACCATGGAGGAGGC-3'(SEQ ID NO：30)；GAPDH-R,5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'(SEQ ID NO：31)；及CLTC-F,5'-GACAAAGGTGGATAAATTAGATGC-3'(SEQ ID NO：20)；CLTC-R,5'-TAAACAATGGGTTGTGTCTCTGTA-3'(SEQ ID NO：21)。使用LightCycler 480系統(Roche,Indianapolis,IN)以進行即時PCR。循環溫度為：變性94℃、黏合60℃、及延長70℃。每個樣本之數據係以GAPDH之表現量進行正規化。
    可變區之cDNA合成及增幅
    以FastTrack mRNA分離套組(INVITROGENTM,Carlsbad,CA)從產生Pa65-2之融合瘤細胞中萃取出總mRNA。cDNA合成方式係基於Orlandi等人(1989)所述之方式(Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction，Proc Natl Acad Sci U S A,86,3833-7)進行。首先製備一反應混合物，其中含有10 μg的mRNA、20 pmol的VH1FOR引子5'-d(TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3'(SEQ ID NO：36)或VK1FOR引子5'-d(GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO：37)、250 μM的每種dNTP、50 mM Tris-HCl pH 8.3、140 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM二硫蘇糖醇、及20單位的RNAsin(PHARMACIATM/LKB Biotechnology，Inc.，Piscataway，NJ)於70℃加熱10分鐘並冷卻。將反轉錄酶(Anglian Biotec,Colchester,U.K.)加入並讓反應於42℃進行1小時。藉由Taq DNA聚合酶(PROMEGATM，Madison，Wisconsin，USA)進行增幅時，製備一反應混合物，其中含有5μl的cDNA-RNA雜交體、25 pmol的適當引子VH1FOR或VK1FOR，及VH1BACK 5'-d(AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'(其中S=C或G、M=A或C、R=A或G、及W=A或T)(SEQ ID NO：38)或VK1BACK 5'-d(GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3'(SEQ ID NO：39)、250 μM的每種dNTP、67 mM三(羥甲基)胺基甲烷(pH 8.8)、17 mM(NH4)2SO4、10 mM MgCl2、每毫升200 μg的吉利丁、及2單位的Taq DNA聚合酶。PCR係執行45個迴圈(1',95℃；1',55℃；2',72℃)接著進行膠體純化。根據製造商之使用說明，將PCR產物選殖入TA選殖載體pCR2.1(INVITROGENTM,Carlsbad,CA)，並將該載體轉染入大腸桿菌之DH5α株(GIBCO BRLTM ,Gaithersburg,Md,USA)中並進行定序。
    刮傷試驗
    將1×105個細胞種於組織培養盤上。經24小時培養後，利用一塑膠裝置將細胞以標準方式刮除，以於每個孔洞中製造出一無細胞區域，2 mm之寬度。將該等細胞於37℃接著進行培養。於第7小時及14小時觀察細胞移入刮傷區之移動情形。 結果
    抗胰臟癌之mAbs的產生及特徵
    為了獲得供胰腺癌療法之可能標靶，係以MIA PaCa-2細胞免疫BALB/cJ小鼠。得到超過6000個融合瘤細胞。以ELISA試驗檢測每一融合孔洞之上清液對於抗MIA PaCa-2抗原之專一性抗體之產生。挑選16個對MIA PaCa-2細胞具有較高的反應性之融合瘤細胞(數據未呈現)。藉由ELISA、流式細胞儀及免疫螢光分析確認，該等單株抗體之一，Pa65-2，被發現可專一辨識MIA PaCa-2細胞，但不會辨識正常的鼻黏膜(NNM)細胞(圖7A-C)。免疫電子顯微鏡顯示Pa65-2於細胞內的位置在MIA PaCa-2細胞之細胞膜上(圖7D)。將胰腺癌細胞株MIA PaCa-2及AsPC-1，以及正常細胞株HUVEC、NNM、及CCD-1112Sk，以ELISA及西方墨點分析進行篩選以瞭解Pa65-2之結合性質。大抵而言，Pa65-2具有很強的結合能力可與胰臟癌細胞株結合(圖1A-B)。
    全部46個胰臟癌組織樣本皆可被Pa65-2正染色，而兩個正常的胰臟組織則不會被染色，如胰臟癌組織分析所示(圖1C及表2)。值得注意的是，Pa65-2的標靶抗原不僅於腫瘤組織存在，亦存在於類血管結構中(圖1C，箭號)。藉由免疫螢光分析進一步確認，Pa65-2的抗原與內皮細胞標記荊豆凝集素-1(Ulex europeus agglutinin-1，UEA-1)之螢光訊號共位於人類胰臟癌組織的血管中(圖8)。Pa65-2亦可與其他類型的癌細胞株結合，包括MDAMB-231(乳癌)、CL1-5(肺癌)、SKOV3(卵巢癌)及SAS(口腔癌)，如ELISA及西方墨點分析所示(圖9)。
    為了要辨識出Pa65-2之標靶，製備MIA PaCa-2總細胞溶解物，並以Pa65-2共軛結合的免疫親和層析法純化。藉由銀染及西方墨點法證實Pa65-2可辨識出一個帶有190 kDa分子量的標靶蛋白(圖1D)。根據LC-MS/MS分析及Swiss-Prot資料庫檢索，發現該Pa65-2的標靶蛋白為人類網格蛋白重鏈(CHC)(圖10)。藉由同步進行免疫沈澱法及西方墨點分析確認Pa65-2對於CHC的專一性，其係使用市售的CHC抗體，mAb X-22，其之CDR未知(圖1E)。使用Pa65-2進行西方墨點分析顯示，若將CHC剔弱，則訊號會顯著地減少(圖2A)。該等資料進一步確認Pa65-2可專一性地辨識CHC。Pa65-2之重鏈及輕鏈之三個互補決定區(CDRs)係呈現於表1中。
    抑制CHC表現可抑制胰臟癌之生長
    為了要評估CHC於腫瘤生成中之功能角色，於MIA PaCa-2細胞中，藉由shRNA將CHC表現剔弱。當於MIA PaCa-2細胞中之CHC被剔弱後(圖2A)，癌細胞之生長率(圖2B)、癌細胞之群落形成(圖2C)、及癌細胞之侵犯能力(圖2D)皆顯著地被降低了。然而，於人類皮膚纖維母細胞中抑制CHC表現則不會對細胞的增生率有影響(圖11)。為了分析於活體內負調控CHC表現對於腫瘤生長的功效，一異種移植模式遂被產生，其係藉由將帶有CHC基因剔弱之MIA PaCa-2細胞注入NOD/SCID小鼠之一側，以及將對照組注入另一側而建構。吾人發現將CHC剔弱可顯著降低異種移植腫瘤生長(圖2E-圖2G)。平均而言，相較於對照組，於第45天時，抑制CHC可導致腫瘤生長減少92.6%(圖2E)。於第50天時，將小鼠犧牲，並摘除腫瘤(圖2F)以測量腫瘤重量(圖2G)。結果顯示一隻小鼠於CHC剔弱側無腫瘤發生，而其他七隻小鼠於其CHC剔弱側顯示帶有微乎其微大小的腫瘤(圖2F)。相同的結果可於CHC剔弱之CL1-5肺癌細胞中觀察到(圖12A-圖12E)。再者，TUNEL染色顯示剔弱CHC可增加腫瘤細胞的細胞凋亡(圖2H)。該等結果指出CHC對於調控腫瘤生成扮演一重要之角色。
    CHC於胰臟癌中調控VEGF表現
    剔弱CHC可顯著地降低腫瘤生長(圖2E-G)。為了要探討是否喪失CHC表現即可抑制腫瘤之血管新生，係以CD31進行免疫螢光染色。於異種移植的老鼠中發現，將CHC剔弱可導致腫瘤血管減少78%(圖3A)。由於習知HIF-1α-媒介之VEGF路徑於腫瘤血管新生中扮演重要角色，吾人進一步探討將CHC剔弱，對於HIF-1α及VEGF之表現是否有影響。結果顯示於異種移植腫瘤之CHC、VEGF、及HIF-1α蛋白表現量，於CHC剔弱組中皆顯著地降低(圖3B及圖13)。此外，相較於對照組之腫瘤組織，CHC及VEGF的mRNA量於CHC剔弱之腫瘤組織中皆被減低(圖3C)。然而，於CHC剔弱之異種移植腫瘤中僅觀察到HIF-1α蛋白量的減少(圖3B及圖13)，而其mRNA量則沒有減少(圖3C)。進一步評估19個人類胰臟癌樣本中CHC及VEGF之mRNA量，吾人發現一CHC及VEGF表現量間之關連性(係數=0.299；最小關連性，P=0.02)(圖3D)。
    吾人進一步探討CHC於調控VEGF基因表現之分子機制。經缺氧處理下，於空白對照組細胞中VEGF mRNA量增加，然而於缺氧及正常含氧情況下，當CHC被剔弱時，VEGF mRNA量係顯著地減少(圖3E)。螢光酵素分析亦顯示CHC可參與調控VEGF-A啟動子之活性(圖3F)。為了更直接地評估CHC是否可結合至VEGF-A啟動子上之缺氧反應元件(hypoxia-response element，HRE)，吾人於CHC-表現及剔弱之細胞中，進行染色質免疫沉澱分析(chromatin immunoprecipitation，ChIP)。結果發現CHC會結合至VEGF-A啟動子區域(圖3G)，而且於CHC剔弱細胞中，可觀察到CHC及HIF-1α結合至VEGF-A啟動子區域的能力顯著地降低(圖3G-H)。從該等觀察結果中可推測CHC可能與HIF-1α進行交互作用，且共位於VEGF-A啟動子區域之HRE上，其可誘發VEGF-A之表現。
    於MIA PaCa-2細胞中CHC可與HIF-1α交互作用並穩定之
    為了探討是否CHC可與HIF-1α進行交互作用，吾人藉由共軛焦顯微鏡分析CHC與HIF-1α是否共位。有趣的是，於缺氧狀況下，CHC位於80%的MIA PaCa-2細胞核中，而HIF-1α位於83%的MIA PaCa-2細胞核中。同時分析時，於缺氧狀況下，MIA PaCa-2細胞之70%的細胞核中同時含有CHC及HIF-1α(圖4A及圖14A-C)。然而，當將CHC剔弱後，可於細胞質或細胞核偵測到低量的HIF-1α(圖4A及圖14A-C)。相同的結果亦可於CL1-5肺癌細胞中觀察到(圖12F)。接著，以免疫沈澱法及免疫電子顯微鏡分析CHC及HIF-1α之間的蛋白交互作用。如圖4B所示，HIF-1α與CHC會同時免疫沈澱在一起。該雙重標記之免疫電子顯微鏡資料進一步顯示CHC及HIF-1α會出現於MIA PaCa-2細胞之細胞核及細胞質中。CHC及HIF-1α之共位尤其可於空白對照組及對照組之細胞的細胞核內觀察到(圖4C)，其意味著該兩個蛋白間會發生交互作用。
    可觀察到的是，於缺氧狀況下誘發的HIF-1α蛋白量在CHC剔弱細胞中被降低(圖4C及圖14D)，而HIF-1α的mRNA量卻不受CHC剔弱的影響(圖14E)，其暗示CHC可能影響HIF-1α蛋白穩定性。為了測試將CHC剔弱是否會降低HIF-1α蛋白之穩定性，以亞胺環己酮(cycloheximide，CHX)處理細胞以阻斷蛋白之重新合成(de novo protein synthesis)。結果顯示抑制CHC會降低HIF-1α蛋白之穩定性(圖14F)。然而，於CHC剔弱細胞中降低的HIF-1α蛋白量，會被MG132(一種蛋白酶體抑制劑)所恢復(圖4D)。吾人進一步分析於CHC剔弱細胞中，HIF-1α-依賴型基因之表現情形。結果顯示剔弱CHC會抑制EPO(圖4E)及PDGF-β基因表現(圖4F)。相似的資料亦可於腫瘤異種移殖物中觀察到(圖4G)。綜上所述，該等數據指出CHC及HIF-1α間的交互作用可能可保護HIF-1α的蛋白穩定性。
    藉由Pa65-2抑制配體內化及細胞生長
    網格蛋白所媒介之胞飲作用(Clathrin-mediated endocytosis，CME)為細胞膜受體之內化作用主要的機制。吾人評估Pa65-2對於表皮生長因子(EGF)及轉鐵蛋白(Tf)之內化作用的影響；該等蛋白皆為CME之已知配體。如圖5A所示，以Pa65-2處理MIA PaCa-2細胞會阻斷EGF及轉鐵蛋白之攝入。此外，以Pa65-2處理不僅抑制癌細胞增生(圖5B)及轉移(圖5C)，亦會誘發MIA PaCa-2細胞之細胞凋亡(圖5D)。西方墨點分析顯示以Pa65-2處理可抑制由缺氧狀況所誘發的HIF-1α表現及VEGF分泌(圖5E)。然而，以正常的老鼠IgG(NM-IgG)處理，則不會有任何抑制活性(圖5A-E)。再者，吾人亦發現Pa65-2可抑制VEGF的內化及誘發HUVECs的細胞凋亡(圖15)。
    Pa65-2抑制胰臟異種移植物之生長
    由於CHC shRNA剔弱可於活體內嚴重地影響異種移植腫瘤之生長，吾人探討於胰臟癌中Pa65-2是否可直接抑制腫瘤血管新生及生長。將MIA PaCa-2細胞種於NOD/SCID小鼠。當腫瘤長到50 mm3時，每三天投予小鼠Pa65-2(10 mg/kg)、NM-IgG或PBS。結果顯示於第36天時，Pa65-2處理組之平均腫瘤體積較對照組約小兩倍(n=6，P<0.05；圖6A及圖16A)。當分析腫瘤切片時，發現於Pa65-2處理之腫瘤，凋亡細胞增加了(n=6，P<0.01；圖6B)且血管減少了(P<0.05；圖6C)。吾人進一步比較Pa65-2及吉西他濱(一種廣泛使用之第一線胰臟癌治療劑)於腫瘤生長上之抑制效果。結果顯示以Pa65-2治療時可與以吉西他濱治療時得到相同的療效(圖6A及16B)。該等發現顯示Pa65-2具有抑制胰臟腫瘤生長及血管新生之能力。
    表1顯示抗CHC單株抗體之VH及VL區之胺基酸序列，其與圖10中所示之SEQ ID NO：1相關。
    表2顯示於人類胰臟癌組織樣本之CHC表現情形。吾人藉由降低原始數據規模修改「Quick Score」方法(Siegel et al.(2012)"Cancer statistics 2012" CA Cancer J Clin,62,10-29)。兩個指標被用於評估腫瘤之染色結果。標記指標(LI)係指於總細胞數目中被免疫染色之腫瘤細胞數目(或稱陽性細胞)的比例。分數係以0至2來計分；0-10%=0、11-49%=1、50-100%=2。第二個指標為強度指標(II)，其用以測量免疫染色之平均強度。分數係以0至2來計分；無染色=0、弱染色=1、及強染色=2。將該兩個指標加起來計分以得到腫瘤標記分數(Labeling Score，LS)，其範圍從0至4。
    表3顯示用於選殖之引子表。表4顯示用於定量RT-PCR之引子表。表5顯示用於ChIP之引子表。表6顯示用於cDNA合成及增幅可變區之引子表。


    表6顯示供IgG之可變區之cDNA合成及增幅的引子表。如表6所示，引子VH1BACK包括25種不同序列。序列AGGTCAAACTGCAGSAGTCAGG(SEQ ID NO：38)係為其中之一代表性序列。 討論
    Pa65-2係藉由篩選抗MIA PaCa-2之融合瘤細胞以產生，其被發現可透過與其標靶，CHC，進行交互作用，以專一結合至不同癌症及腫瘤血管之細胞表面及細胞溶質中。本發明證實於癌症細胞中以及腫瘤相關之內皮細胞中之CHC表現為正調控的。吾人發現藉由Pa65-2或shRNA抑制CHC可抑制腫瘤生長及血管新生。ChIP分析指出CHC與HIF-1 α可進行交互作用，且參與VEGF轉錄作用之調控。將CHC表現剔弱亦可減少HIF-1α之蛋白穩定性。就吾人所知，本發明為第一個研究證實CHC藉由穩定HIF-1α，並接著正調控VEGF的表現，以促進血管新生及腫瘤生長。
    吾人近來的研究發現於胰臟癌組織及其他癌症中CHC的表現量較高。此外，吾人發現Pa65-2可結合至腫瘤細胞及腫瘤相關的內皮細胞。該等發現指出於腫瘤及腫瘤相關的內皮細胞中CHC的表現，可能與於病理情況下，藉由胞飲作用所增加攝入之生長因子有關連。藉由shRNA降低CHC的量可導致HIF-1α之蛋白穩定性降低，且減少HIF-1α下游基因的表現。
    基於本發明可知，CHC促進腫瘤生長及血管新生過程可能透過兩個路徑。其中之一為藉由網格蛋白所媒介之胞飲作用增加生長因子或受體之攝入；另一者為增加VEGF的表現，可能是於缺氧情況下，藉由與HIF-1α進行交互作用進而穩定HIF-1α(圖6D)。綜上所述，吾人製備了一單株抗體，Pa65-2，其可透過辨識CHC而專一地結合至胰臟癌細胞及腫瘤相關的內皮細胞。吾人結果明顯地指出CHC可於活體外及活體內促進腫瘤生長、侵入及血管新生。Pa65-2抑制EGF、Tf及VEGF的內化作用，且具有與吉西他濱相似的抗腫瘤活性。吾人結果指出Pa65-2 mAb或CHC shRNA可用於降低癌細胞侵入、轉移及VEGF表現，以及抑制腫瘤生長及血管新生。
    歸納來說，胰腺癌係為一侵略性的疾病，且帶有高死亡率。近來，能用於治療的方式十分侷限。為了要改善胰腺癌之治療效果，吾人製備一單株抗體(mAb)，Pa65-2，其可專一地結合至胰臟癌細胞及腫瘤血管，但不會與正常細胞結合。Pa65-2的標靶蛋白為人類網格蛋白重鏈(CHC；SEQ ID NO：1)。吾人發現將CHC剔弱或以Pa65-2治療不僅降低癌細胞增生、細胞群落之形成及侵入，亦可誘發癌細胞之細胞凋亡。活體內研究顯示無論藉由shRNA或Pa65-2抑制CHC皆可抑制腫瘤生長及血管新生。CHC之其中一重要功能在於與缺氧誘發因子(HIF)-1 α蛋白結合，增加該蛋白之穩定性，以及促進其細胞核轉位，以及與缺氧反應元件(HRE)啟動子之結合，藉此調控血管內皮生長因子(VEGF)的表現。剔弱CHC導致HIF-1α及其下游標靶基因表現之負調控，如VEGF、紅血球生成素(erythropoietin，EPO)及血小板衍生生長因子-β(platelet-derived growth factor-β，PDGF-β)。Pa65-2之治療會阻斷癌細胞攝入表皮生長因子(EGF)及轉鐵蛋白(Tf)、抑制癌細胞增生、侵入及誘發癌細胞之細胞凋亡。總結，吾人之發現指出CHC於腫瘤生成及血管新生之過程中扮演重要之角色。Pa65-2抗體或CHC shRNA具潛力可供胰臟癌療法所用。
    前述本發明之示例性具體實施例之說明，僅用於闡述及說明之目的，並非用以侷限或限制本發明至所揭露之精確的態樣。各種可能之修飾或變化皆可由前述教示所推知。
    本發明所選擇及說明之具體實施例及實例，係為了說明本發明之原理及其可實施性，藉此讓該領域具有通常技藝者得以實行本發明，以及思及各種具體實施例，以及各種適用特定用途之不同修改。對於屬於本發明領域之具有通常技藝者，可顯而易見地推知其他不同的具體實施例，且不會背離本發明之精神及範圍。因此，本發明之範圍係藉由所附之申請專利範圍所定義，而非由前述說明或本文所述之示例性具體實施例所定義。
    本發明之說明引用及討論了某些參考文獻，包含專利、專利申請案及不同的公開文獻。於本文所引用及/或討論之參考文獻僅用以釐清本發明之說明，並非意旨該等參考文獻為本發明之「先前技術」。所有於本說明書中引用及討論之參考文獻，皆引用其全部內容於本文中，且每個參考文獻亦個別地以相同範疇被引入參考。
    圖1顯示抗胰臟癌之mAbs的產生及特性。Pa65-2於胰腺癌細胞株及各種不同正常細胞株之結合能力之(A)ELISA分析及(B)西方墨點分析。NM-IgG被用作對照組。(C)於人類胰臟癌組織陣列之Pa65-2的免疫組織化學分析。箭號所指為類血管結構。標準尺，50 μm。(D)藉由免疫親和層析法純化Pa65-2所標靶之蛋白。第1道，分子量指標；第2道，自Pa65-2共軛的親和性管柱中純化的蛋白；及第3道，自Pa65-2共軛的親和性管柱中純化的蛋白之西方墨點分析。(E)以Pa65-2將MIA PaCa-2之全細胞溶解物進行免疫沈澱，並以抗CHC抗體及對照組抗體進行西方墨點分析。
    圖2顯示抑制CHC表現可抑制胰臟癌之生長。(A)CHC剔弱之結果係以定量RT-PCR判定(上圖)以及西方墨點分析(下圖)。CHC之條帶訊號係以GAPDH進行正規化。誤差條係以±標準差(standard deviation，SD)表示。** P<0.01。(B)於空白對照組、對照組載體及轉染shCHC之MIA PaCa-2細胞中，利用微電子細胞感應系統分析細胞增生情形。誤差條係以±標準差(SD)表示。** P<0.01。(C)MIA PaCa-2細胞群落形成之能力。上圖為代表圖。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(D)剔弱CHC表現降低侵入。標準尺，40 μm；誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(E)八隻NOD/SCID小鼠係以s.c.(1×107個細胞)方式於後腿側邊注入；右側注入帶有對照組載體-轉殖的MIA PaCa-2；以及左側注入帶有CHC shRNA轉殖的MIA PaCa-2。每5天以卡尺測量腫瘤，腫瘤體積係以長度×(寬度)2×0.52方式計算。誤差條係以±SD表示。* P<0.05；** P<0.01。(F)顯示帶有腫瘤之小鼠的代表圖(上圖)及腫瘤負擔(下圖)。(G)測量腫瘤之重量。誤差條係以±SD表示。* P<0.05。(H)藉由TUNEL染色偵測MIA PaCa-2細胞中由CHC shRNA所誘發之細胞凋亡。標準尺，200 μm；誤差條係以±SD表示。** P<0.01。
    圖3顯示於胰臟癌中之CHC調控VEGF的表現。(A)於CHC剔弱之腫瘤切片中，藉由免疫螢光染色(上圖)分析內皮細胞標記CD31之表現。使用MetaMorph軟體(下圖)進行螢光強度之定量。標準尺，200 μm；誤差條係以±SD表示。* P<0.05。(B)於腫瘤切片中，CHC、VEGF及HIF1-α之免疫組織化學共位。標準尺，40 μm。(C)於異種移殖腫瘤中，CHC、VEGF及HIF-1α之基因表現的定量RT-PCR分析。基因表現程度皆以GAPDH訊號進行正規化。誤差條係以±SD表示。* P<0.05；** P<0.01。(D)自19個人類胰臟癌病患取得之樣本的CHC及VEGF mRNA量，其係藉由定量RT-PCR分析測得。CHC及VEGF表現之間的關連性係以Spearman’s分析評估。(r=0.299；P=0.02)。(E)於CHC剔弱之MIA PaCa-2細胞中，VEGF mRNA的定量RT-PCR分析。VEGF的表現係以GAPDH進行正規化。誤差條係以±SD表示。* P<0.05；** P<0.01。(F)缺氧後，CHC在MIA PaCa-2細胞中對於VEGF啟動子活化之影響。該細胞係以報導子質體轉染並進行螢光酵素分析。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(G)及(H)經缺氧16小時後，藉由染色質免疫沈澱(chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析CHC及HIF-1α於VEGF啟動子之結合能力。使用含有兩個HIF-1α結合位置(-534至-158)之VEGF啟動子區域之專一引子組。使用抗(G)CHC(Pa65-2)及(H)HIF-1α抗體進行ChIP分析。正常的小鼠IgG被作為陰性對照組。誤差條係以±SD表示。* P<0.05；** P<0.01。
    圖4顯示於MIA PaCa-2細胞中，CHC與HIF-1α進行交互作用並穩定之。(A)經以抗CHC(綠色：FITC染色)或HIF-1α(紅色：玫紅染色)抗體進行雙重免疫螢光染色後，再以共軛焦顯微鏡分析CHC及HIF-1α之共位情形。標準尺，10 μm。(B)以抗CHC及HIF-1α抗體將細胞溶解物進行共免疫沈澱，並以Pa65-2及抗HIF-1α抗體進行免疫墨點法。(C)以雙重標記之免疫電子顯微鏡分析CHC及HIF-1α於MIA PaCa-2細胞之細胞核中之共位。空白對照組(左圖)及對照組(中圖)細胞，皆顯示CHC及HIF-1α於細胞核區域共位；CHC係以18 nm之膠體金共軛抗體(箭號，插入圖)所標記；HIF-1α係以12 nm之膠體金共軛抗體(白箭號，插入圖)所標記；N.shCHC-轉殖之細胞(右圖)於細胞核中表現明顯減少的CHC訊號以及幾乎可忽略之HIF-1α標記(C：細胞質；N：細胞核)。標準尺，200 nm。(D)將MIA PaCa-2細胞與DFX(100 μM)，於不含有(左及中圖)或含有蛋白酶體抑制劑MG-132(10 μM)(右圖)中，培養0到16小時。從不同時間間隔取得之全細胞溶解物進行西方墨點分析。於CHC剔弱之MIA PaCa-2細胞中(E)EPO及(F)PDGF-β mRNA之定量RT-PCR分析。誤差條係以±SD表示。* P<0.05；** P<0.01。(G)於異種移殖腫瘤中，進行EPO及PDGF-β基因表現之定量RT-PCR分析。基因表現量係以GAPDH訊號進行正規化。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。
    圖5顯示Pa65-2抑制配體內化作用及胰臟癌細胞之生長。(A)經以Pa65-2抑制CHC後，於MIA PaCa-2細胞中之EGF及轉鐵蛋白之內化作用的免疫螢光分析。MIA PaCa-2細胞係先以Pa65-2或NM-IgG於37℃進行前處理，接著以Alex 555-EGF(1 μg/ml)或Alex 555-轉鐵蛋白(50 μg/ml)於37℃(紅色：玫紅染色)進行培養，再以WGA-Alex 647(綠色)進行細胞膜染色及使用DAPI(藍色)進行細胞核之染色。標準尺，20 μm(左圖)。EGF-Alex 555(中圖)或轉鐵蛋白-Alex 555(右圖)染色之百分比係以總數為100個MIA PaCa-2細胞作為基礎而計算。藉由共軛焦顯微鏡分析染色。誤差條係以±SD表示。* P<0.05。(B)以Pa65-2或NM-IgG(50 μg/ml)處理MIA PaCa-2細胞3天。藉由MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)分析細胞增生。誤差條係以±SD表示。* P<0.05。(C)Pa65-2抑制MIA PaCa-2細胞侵入。誤差條係以±SD表示。* P<0.05；** P<0.01。(D)Pa65-2誘導MIA PaCa-2細胞凋亡。誤差條表示±SD。** P<0.01。(E)於Pa65-2(50 μg/ml)或NM-IgG(50 μg/ml)存在下，將MIA PaCa-2細胞與DFX(100 μM)培養48小時。藉由西方墨點法分析培養基及全細胞溶解物。
    圖6顯示Pa65-2抑制胰臟之異種移殖的腫瘤生長。(A)帶有腫瘤之小鼠(平均腫瘤大小界於40至60 mm3)，係以10 mg/kg的Pa65-2或15 mg/kg的吉西他濱(GEM)、或NM-IgG、或PBS進行i.v.注射。每三天測量腫瘤大小(每組n=6)。誤差條係以±SD表示。* P<0.05。(B)藉由TUNEL染色(左圖)偵測於腫瘤組織中Pa65-2所誘發之細胞凋亡。螢光強度之定量係以MetaMorph軟體(右圖)進行。標準尺，200 μm。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(C)藉由免疫螢光染色分析腫瘤切片中之內皮標記(CD31)的表現(上圖)。螢光強度之定量係以MetaMorph軟體(下圖)進行。標準尺，200 μm；誤差條係以±SD表示。* P<0.05。(D)CHC媒介之腫瘤新生的可能機制之代表性圖解。於缺氧情況下，CHC具有一額外媒介缺氧誘發之血管新生之角色。CHC會與HIF-1α進行交互作用，進而穩定之。CHC於HIF-1α細胞核的定位及HRE啟動子之結合扮演一協助的角色，其可造成VEGF之產量增加。抑制CHC表現可抑制腫瘤新生及血管新生。
    圖7顯示Pa65-2對於MIA PaCa-2細胞之結合活性判讀結果。(A)由ELISA可知Pa65-2顯示出抗MIA PaCa-2細胞之高親和性。正常小鼠IgG(NM-IgG)則作為陰性對照組。(B)流式細胞分析Pa65-2對於MIA PaCa-2及NNM細胞之結合活性(左圖)，螢光強度指出Pa65-2對於該等細胞之結合活性(右圖)。(C)免疫螢光分析Pa65-2於MIA PaCa-2及NNM細胞中之定位。標準尺，50 μm。(D)藉由標記之免疫電子顯微鏡得知，Pa65-2對於MIA PaCa-2細胞膜及細胞質展現高親和性。正常小鼠之IgG(NM-IgG)作為陰性對照組。標準尺，500 nm。
    圖8顯示Pa65-2及荊豆凝集素-1(UEA-1)之免疫螢光染色之結果，其指出兩者共位。該等結果指出Pa65-2亦會表現於人類胰臟癌之血管中(紅：Pa65-2；綠：UEA-1)。標準尺，20 μm。
    圖9顯示Pa65-2對於不同癌細胞株之結合活性。(A)Pa65-2於不同癌細胞株之結合活性的ELISA分析。NM-IgG作為對照組。(B)Pa65-2於不同癌細胞株之西方墨點分析。
    圖10顯示Pa65-2標靶蛋白及人類CHC蛋白之序列的多肽序列比對結果，其係得自LC-nanoESI-MS/MS分析。粗體字及底線代表Pa65-2標靶蛋白之序列，其與人類CHC蛋白序列吻合(SEQ ID NO：1)。
    圖11顯示抑制CHC表現對於人類皮膚纖維母細胞之生長無影響。(A)藉由西方墨點法分析將CHC剔弱之結果。MIA PaCa細胞作為對照組。藉由MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)分析(B)MIA PaCa-2細胞及(C)CCD-1112Sk細胞增生。誤差條係以±SD表示。* P<0.05。
    圖12顯示抑制CHC表現會抑制肺癌細胞之生長及侵入。(A)藉由西方墨點法分析將CHC剔弱之結果。(B)將CHC表現剔弱會降低CL1-5細胞之細胞聚落形成之能力。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(C)剔弱CHC表現會降低細胞侵入。標準尺，40 μm。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(D)八隻NOD/SCID小鼠係以s.c.(1×107個細胞)方式於後腿側邊注入；左側注入帶有對照組載體-轉殖的CL1-5細胞；及右側注入帶有CHC shRNA轉殖的CL1-5細胞。每5天以卡尺測量腫瘤，腫瘤體積係以長度×(寬度)2×0.52方式計算。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(E)測量腫瘤之重量。誤差條係以±SD表示。* P<0.05。(F)將CL1-5細胞與DFX(100 μM)培養5小時(右圖)，或與20% O2培養5小時(左圖)，CHC及HIF-1α之共位係以免疫螢光法分析。標準尺，10 μm。
    圖13顯示於連續染色切片上CHC、VEGF及HIF-1α之定量，其係使用HistoQuest分析軟體進行。
    圖14顯示於MIA PaCa細胞中CHC剔弱會促進HIF-1α蛋白之降解。(A)CHC、(B)HIF-1α、(C)HIF-1α及CHC陽性細胞核之百分比係如圖4A所示。以三個不同之1 mm2視野用計算。定量之方法即如先前所述。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(D)將DFX(100 μM)處理16小時之MIA PaCa-2細胞進行細胞質C及細胞核N區域之免疫墨點法分析(抗PRAP-1及抗-α-微管蛋白作為內部對照組)。(E)於CHC剔弱之MIA PaCa-2細胞中，經於正常含氧或缺氧情況下，CHC(左圖)及HIF1-α mRNA(右圖)之定量RT-PCR分析。基因表現量係以GAPDH訊號進行正規化。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。(F)先將MIA PaCa細胞置於含有DFX(100 μM)時培養16小時，接著於對照組及shCHC細胞中以CHX(5 μg/ml)處理所示之時間。收獲細胞並藉由免疫墨點法(左圖)分析全細胞溶解物中之HIF-1α蛋白量。條帶之強度，係由密度計量儀判定，並以GADPH訊號進行正規化，並以初始HIF-1α含量之百分比表示(右圖)。
    圖15顯示Pa65-2於活體外抑制內皮細胞之生長。(A)藉由免疫螢光分析經以Pa65-2抑制CHC後，HUVECs中VEGF的內化作用。將HUVECs以Pa65-2或NM-IgG於37℃進行前處理，接著在有或無VEGF(40 ng/ml)下於37℃或4℃進行培養。將細胞進行染色以偵測抗VEGF-A之抗體(紅色：玫紅染色)並使用DAPI(藍色)染細胞核。標準尺，50 μm。(B)藉由TUNEL染色，於HUVEC中偵測Pa65-2所誘發之細胞凋亡。標準尺，100 μm。誤差條係以±SD表示。** P<0.01。
    圖16顯示Pa65-2及GEM於帶有人類胰臟癌異種移殖物之NOD/SCID小鼠之抗腫瘤功效之比較結果。(A)測量腫瘤重量。誤差條係以±SD表示。* P<0.05。(B)不同處理對於體重改變無影響(每組n=6)。
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    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> ChIP VEGF r
    <400> 33
    <210> 34
    <211> 20
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> ChIP GAPDH f
    <400> 34
    <210> 35
    <211> 20
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> ChIP GAPDH r
    <400> 35
    <210> 36
    <211> 34
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> VH1FOR
    <400> 36
    <210> 37
    <211> 22
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> VK1FOR
    <400> 37
    <210> 38
    <211> 22
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> VH1FOR或VK1FOR及VH1BACK
    <400> 38
    <210> 39
    <211> 24
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> VK1BACK
    <400> 39
    权利要求:
    Claims (19)
    [1] 一種純化的單株抗體，或其抗原結合部分，其可專一地結合至人類網格蛋白重鏈(CHC)上；該人類網格蛋白重鏈包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
    [2] 如申請專利範圍第1項之純化的單株抗體，或其抗原結合部分，包含：(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；以及(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
    [3] 如申請專利範圍第1項之純化的單株抗體，或其抗原結合部分，其結合至選自由胰臟癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、口腔癌細胞、及腫瘤相關內皮細胞所組成群組之細胞。
    [4] 一種分離的單株抗體，或其結合片段，包含：(a)重鏈可變區，其包含：(i)互補決定區1(CDR1)，其包含SEQ ID NO：4；(ii)互補決定區2(CDR2)，其包含SEQ ID NO：5；以及(iii)互補決定區3(CDR3)，其包含SEQ ID NO：6；以及(b)一輕鏈可變區，包含：(i)CDR1，其包含SEQ ID NO：7；(ii)CDR2，其包含SEQ ID NO：8；以及(iii)CDR3，其包含SEQ ID NO：9。
    [5] 如申請專利範圍第4項之分離的抗體或結合片段，其中該結合片段包含抗體的Fv片段。
    [6] 如申請專利範圍第4項之分離的抗體或結合片段，其中該結合片段包含抗體的Fab片段。
    [7] 如申請專利範圍第4項之分離的抗體或結合片段，其中該抗體為完全人類之單株抗體。
    [8] 如申請專利範圍第4項之分離的抗體或結合片段，其中該抗體為人源化之單株抗體。
    [9] 如申請專利範圍第4項之抗體或結合片段，其可結合至表現網格蛋白重鏈(CHC)之癌細胞。
    [10] 如申請專利範圍第4項之分離的抗體或結合片段，其可被一可偵測之化合物或酵素所標記。
    [11] 如申請專利範圍第4項之分離的抗體或結合片段，其被一脂質體所包埋。
    [12] 一種供抑制腫瘤細胞生長及/或腫瘤血管新生之醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之純化的單株抗體，或其抗原結合部分，以及醫藥上可接受之載劑。
    [13] 一種供抑制腫瘤細胞生長及/或腫瘤血管新生之醫藥組合物，包含如申請專利範圍第4項所述之分離的單株抗體，或其結合片段，以及醫藥上可接受之載劑。
    [14] 如申請專利範圍第12項之醫藥組合物，其中該腫瘤細胞表現網格蛋白重鏈(CHC)。
    [15] 如申請專利範圍第12項之醫藥組合物，其中該腫瘤細胞係選自由胰臟癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、口腔癌細胞、及腫瘤相關內皮細胞所組成之群組。
    [16] 如申請專利範圍第13項之醫藥組合物，進一步包含一抗癌藥劑。
    [17] 一種分離的單鏈可變片段，包含：(a)如申請專利範圍第2項所述之分離的抗體或結合的片段之重鏈可變區(SEQ ID NO：2)及輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)；以及(b)一連結胜肽，用以連結該重鏈可變區(SEQ ID NO：2)及該輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)。
    [18] 一種於個體中偵測癌症之方法，包含：(a)將如申請專利範圍第4項所述之分離的單株抗體或其結合片段，施予一源自該個體之細胞或組織樣本；以及(b)分析該分離的單株抗體或其結合片段結合至該細胞或該組織樣本的情形；以及(c)與正常對照組比較抗體結合的情形，以決定該個體是否患有癌症，其中該癌症會表現人類網格蛋白重鏈。
    [19] 如申請專利範圍第1項之分離的單株抗體，或其抗原結合部分，其表現至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、或全部八個以下之特性：(a)專一結合至胰腺癌細胞；(b)結合至癌細胞及腫瘤血管之細胞表面及細胞溶質；(c)會被CHC表現細胞所內化；(d)抑制腫瘤生長、侵入能力、轉移及血管新生；(e)誘發癌細胞及人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)之細胞凋亡；(f)活體內抑制於胰臟癌之腫瘤生長及腫瘤血管；(g)抑制癌細胞之表皮生長因子(EGF)、轉鐵蛋白(Tf)及VEGF的內化作用；以及(h)抑制缺氧誘發因子-1α(HIF-1α)之表現及血管內皮生長因子(VEGF)之分泌。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US8969530B2|2015-03-03|
    US20130084298A1|2013-04-04|
    TWI485158B|2015-05-21|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US7473531B1|2003-08-08|2009-01-06|Colora Corporation|Pancreatic cancer targets and uses thereof|
    JP5133842B2|2008-10-14|2013-01-30|国立大学法人千葉大学|癌が疑われる患者または癌患者由来の組織の癌部と非癌部との判別方法およびそれに用いる判別試薬|WO2016118090A1|2015-01-23|2016-07-28|Agency For Science, Technology And Research|Cancer specific antigen-binding proteins|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161543118P| true| 2011-10-04|2011-10-04||
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