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    本發明係關於一種僅使用四種由母溶液製得之緩衝溶液依小規模及大規模純化蛋白質(特定言之單株抗體)之兩步層析方法。
    公开号:TW201321402A
    申请号:TW101118395
    申请日:2012-05-23
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Didier Duthe；Laure Landric-Burtin；Benoit Mothes
    申请人:Sanofi Sa；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    抗體純化方法
    本發明係關於一種使用四種緩衝溶液小規模及大規模純化蛋白質，特定言之單株抗體之兩步層析方法。
    抗體純化可為最昂貴的生物生產態樣之一。單株抗體(Monoclonal antibody，mAb)一般使用三步之三樹脂層析方法來純化，在各步使用特定緩衝系統。此習知純化方法涵蓋捕捉步驟，隨後為離子交換步驟且以拋光步驟結束，且通常花費3至5個工作日(包括儲存及開啟階段)。隨著細胞培養物效價日益提高及用於生產之細胞培養物體積的增大，下游加工被視為工業瓶頸。當焦點已自批料體積轉移，且轉向下游加工能力時，此情況尤其與單株抗體生產有關。此外，早期臨床前及臨床階段研究需要更大量之可更快產生之抗體。因此，在產業中存在對減少用於抗體純化之步驟數量及縮短獲得批料所花費之時間的需要。
    本發明者已發現一種純化抗體之新穎方法，該方法包含有限數量之步驟，同時仍允許獲得高產率之具有極佳純度之純化抗體。純化蛋白質因此適用於醫學應用。因此，該方法可用以純化蛋白質，以用於臨床試驗及/或銷售包含該蛋白質之醫藥組合物。
    簡言之，此方法僅包含兩個層析步驟：一個親和層析步驟及一個多模式樹脂層析步驟。另外，已發現，此等兩個層析步驟期間所用之所有緩衝液均可由相同母溶液作為起始物來製備。換言之，所有緩衝液均可由相同化學製品組成，但其中一種緩衝液與另一種緩衝液之該等化學製品的濃度可能不同。此等緩衝液宜包含Bis Tris，例如與NaCl、乙酸及水組合。因為不需要更換任何緩衝液，所以該方法易於實施，且極適用於自動操作及/或以連續方式運作。另外，所有緩衝液均可由相同化學製品組成之事實可以大幅縮短製備層析管柱之時間，且亦減少對手動干預之需要。本發明方法進一步允許縮短或消除開啟階段(亦即開啟純化系統進行手動操作之步驟，諸如製備用於新緩衝液之層析管柱、稀釋樣品或調整其pH值)，由此降低污染風險。因此，本發明方法允許同時快速生產批料且縮短純化系統之佔用時間。因此，其適用於以工業規模按比例擴大及純化重組蛋白質。
    已建立並實施用於三種不同抗體之兩種特定方案。在第一種方案中，使用Bis Tris溶液調整第一層析步驟結束時所獲得之粗蛋白質溶離劑之pH值(參見實例3、實例4及實例5)。已顯示，鑒於此方案達成極佳且可重現之結果(不受所純化之特異性抗體影響)，其具有通用性(參見實例6)。在第二種方案中，使第一層析步驟結束時獲得之粗蛋白質溶離劑直接流過第二層析管柱，亦即不經過任何處理，如pH值調整、緩衝液更換或稀釋(參見實例7)。在此方案中，兩個層析步驟後可接著流過薄膜吸附器。此第二種方案之優點在於極快速(對於100 L起始物質為約7或8小時)。另外，其可完全自動，以連續方式運作，且不包含任何開啟階段。
    因此，本發明提供一種自溶液純化蛋白質之方法，該方法包含第一層析步驟，其包括使平衡緩衝液流過第一層析管柱，使該溶液流過該第一層析管柱，使平衡緩衝液流過該第一層析管柱，使洗滌及衛生處理緩衝液流過該第一層析管柱，使平衡緩衝液流過該第一層析管柱，使用第一溶離緩衝液自該第一層析管柱溶離粗蛋白質溶離劑，及視情況使用Bis Tris溶液調整該粗蛋白質溶離劑之pH值；及第二層析步驟，其包括使平衡緩衝液流過第二層析管柱，使粗蛋白質溶離劑流過該第二層析管柱，使平衡緩衝液流過該第二層析管柱，及使用第二溶離緩衝液自該第二層析管柱回收純化蛋白質。
    本發明亦提供一種自溶液純化蛋白質之方法，該方法包含第一層析步驟，其包含使平衡緩衝液流過第一層析管柱，使該溶液流過該第一層析管柱，使平衡緩衝液流過該第一層析管柱，使用第一溶離緩衝液自該第一層析管柱溶離粗蛋白質溶離劑，及視情況使用Bis Tris溶液調整該粗蛋白質溶離劑之pH值；及第二層析步驟，其包含使平衡緩衝液流過第二層析管柱，使粗蛋白質溶離劑流過該第二層析管柱，使平衡緩衝液流過該第二層析管柱，使洗滌及衛生處理緩衝液流過該第二層析管柱，使平衡緩衝液流過該第二層析管柱，及使用第二溶離緩衝液自該第二層析管柱回收純化蛋白質。
    在本發明之一個實施例中，Bis Tris溶液為1 M Bis Tris溶液。在其他實施例中，緩衝液各自包含Bis Tris及/或緩衝液各自包含不同濃度之相同化學製品。在另一實施例中，各緩衝液包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水。
    在本發明之一個實施例中，第一層析管柱為蛋白質A管柱且第二層析管柱為多模式樹脂層析管柱。在本發明之另一實施例中，第一層析管柱為多模式樹脂層析管柱且第二層析管柱為蛋白質A管柱。在本發明之其他實施例中，自溶液純化蛋白質之方法不包含有任何包含使該溶液流過陰離子交換層析(AEX)管柱之層析步驟。
    在本發明之一個實施例中，進行純化之蛋白質為抗體。在另一實施例中，抗體為單株抗體。
    在本發明之一個實施例中，該方法進一步包含在步驟(b)之後使粗蛋白質溶離劑流過薄膜吸附器。在其他實施例中，該方法進一步包含在步驟(b)後之奈米過濾步驟及/或在奈米過濾步驟後之超濾及透濾步驟。
    在本發明之某些實施例中，第一溶離緩衝液包含20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用乙酸調整至pH 3.5；第二溶離緩衝液包含20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用乙酸調整至pH 4.5；平衡緩衝液包含20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用乙酸調整至pH 7.4；且洗滌及衛生處理緩衝液包含20 mM Bis Tris及1 M NaCl，用乙酸調整至pH 7.4。在本發明之其他實施例中，第一溶離緩衝液包含20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用乙酸調整至pH 4.5；第二溶離緩衝液包含20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用乙酸調整至pH 3.5；平衡緩衝液包含20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用乙酸調整至pH 7.4；且洗滌及衛生處理緩衝液包含20 mM Bis Tris及1 M NaCl，用乙酸調整至pH 7.4。
    本發明提供一種套組，其包含多模式樹脂層析管柱及/或蛋白質A管柱；及至少一種包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成之緩衝液。在一些實施例中，該套組用於使用本發明方法自溶液純化蛋白質。
    本發明亦提供一種套組，其包含多模式樹脂層析管柱及/或蛋白質A管柱；及製備至少一種包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成之緩衝液的說明書。在一些實施例中，該套組用於使用本發明方法自溶液純化蛋白質。
    本發明進一步提供包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成之緩衝液之用途，其係用於藉由至少一個層析步驟自溶液純化蛋白質。在一些實施例中，層析步驟為多模式樹脂層析步驟及/或蛋白質A層析步驟。亦提供包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成之緩衝液之用途，其係用於藉由本發明方法自溶液純化蛋白質。
    本發明進一步提供一種製備平衡緩衝液之方法，其包含製備100 L最終濃度為20 mM Bis Tris及20 mM NaCl之溶液；用乙酸將溶液之pH值調整至7.4；及收集50 L該溶液。本發明亦提供一種製備洗滌及衛生處理緩衝液之方法，其包含用乙酸將來自平衡緩衝液製備之剩餘50 L溶液之pH值調整至4.5；及收集25 L該溶液。本發明進一步提供一種製備溶離緩衝液之方法，其包含用乙酸將來自洗滌及衛生處理緩衝液製備之剩餘25 L溶液之pH值調整至3.5。本發明進一步提供一種製備溶離緩衝液之方法，其包含添加等量(eq.)1 M NaCl至來自溶離緩衝液製備之剩餘25 L溶液中。藉由本文所揭示之方法製備之緩衝液可用於使用本發明方法自溶液純化蛋白質。
    所揭示之純化方法的此等及其他特徵及優點將由以下實施方式連同隨附申請專利範圍更充分理解。應注意，申請專利範圍之範疇藉由其中之敍述來限定而並非藉由說明書中所闡述之特徵及優點的特定論述限定。
    以下關於所揭示純化方法之實施例的詳細描述在結合以下圖式閱讀時可得到最充分理解。
    基於混合模式樹脂(亦稱為多模式樹脂)之可用性，本發明者已開發一種僅使用兩個層析步驟之新穎純化方法。換言之，該方法僅包含兩個涉及流過層析管柱之步驟。
    本發明係關於一種自溶液純化蛋白質之方法，其包含以下或由以下組成：(a)第一層析步驟，其包含：- 使該溶液流過第一層析管柱；- 使用第一溶離緩衝液自該第一層析管柱溶離粗蛋白質溶離劑；及(b)第二層析步驟，其包含：- 使步驟(a)結束時獲得之該粗蛋白質溶離劑流過第二層析管柱；- 使用第二溶離緩衝液自該第二層析管柱回收純化蛋白質，其中緩衝液各自包含Bis Tris。
    更特定言之，兩個上述層析步驟各自可包含以下或由以下組成：- 使平衡緩衝液流過層析管柱；- 使該溶液或該粗蛋白質溶離劑流過層析管柱(如上文所提及)；- 使平衡緩衝液流過層析管柱；- 視情況使洗滌及衛生處理緩衝液流過層析管柱；- 視情況使平衡緩衝液流過層析管柱；- 使用溶離緩衝液自層析管柱溶離該粗蛋白質溶離劑或回收純化蛋白質(如上文所提及)，其中緩衝液各自包含Bis Tris。
    如上文所示，上述本發明之方法僅包含兩個層析步驟。更特定言之，該方法可缺少包含使溶液流過陰離子交換層析(AEX)管柱之層析步驟及/或用於拋光之層析步驟。儘管本發明方法僅包含兩個層析步驟，但其允許獲得適用於醫藥目的且詳言之適用於投與人類之純化蛋白質。
    除將純化方法中之步驟數量由三個減至兩個(且隨後縮短完成純化方法所需之總時間)之外，所揭示之方法亦會使用於純化之緩衝液之數量由七種減至四種。另外，緩衝液包含相同組分(亦即Bis Tris、NaCl、乙酸及水)，由此極大地促進緩衝液製備。所揭示之純化方法除可允許純化多種mAb之外，亦簡化mAb純化，改良總產率且減少原料、商品成本及加工時間。
    與如上文所述之習知蛋白質純化方法對比，本文所揭示之方法使用四種緩衝液：平衡緩衝液、洗滌緩衝液及兩種溶離緩衝液。所揭示之方法中使用之緩衝液由來自母溶液之相同化合物基質製得，該化合物基質極大地促進了緩衝液製備。
    如本文所用，「本發明之緩衝液」係指包含Bis Tris之緩衝液。Bis Tris為熟習此項技術者熟知之化合物，其IUPAC名稱為2-[雙(2-羥乙基)胺基]-2-(羥甲基)丙烷-1,3-二醇，且其CAS編號為6976-37-0。本發明之該等緩衝液可對應於平衡緩衝液、洗滌及衛生處理緩衝液及/或溶離緩衝液。
    更特定言之，本發明之該等緩衝液可包含不同濃度之相同化學製品(其中之一者為Bis Tris)或由其組成。在一個特定實施例中，緩衝液包含Bis Tris、乙酸及水或由其組成。在一個更特定實施例中，緩衝液包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成。換言之，該等緩衝液包含不同濃度之Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成。
    溶離緩衝液可例如包含15 mM至25 mM(例如20 mM)Bis Tris及15 mM至25 mM(例如20 mM)NaCl或由其組成，用乙酸調整至pH值介於3與4之間(例如3.5)。該種溶離緩衝液顯著適用於親和層析管柱(諸如蛋白質A管柱)。
    溶離緩衝液亦可包含15 mM至25 mM(例如20 mM)Bis Tris及15 mM至25 mM(例如20 mM)NaCl或由其組成，用乙酸調整至pH值介於4與5之間(例如4.5)。該種溶離緩衝液顯著適用於多模式樹脂層析管柱(諸如Capto Adhere)。
    溶離緩衝液亦可包含15 mM至25 mM(例如20 mM)Bis Tris及150 mM至250 mM(例如200 mM)NaCl或由其組成，用乙酸調整至pH值介於8與9之間(例如8.5)。該種溶離緩衝液顯著適用於多模式樹脂層析管柱(諸如Capto MMC)。
    平衡緩衝液可包含15 mM至25 mM(例如20 mM)Bis Tris及15 mM至25 mM(例如20 mM)NaCl或由其組成，用乙酸調整至pH值介於7與8之間(例如7.4)。
    洗滌及衛生處理緩衝液可包含15 mM至25 mM(例如20 mM)Bis Tris及0.9 mM至1.1 mM(例如1 M)NaCl或由其組成，用乙酸調整至pH值介於7與8之間(例如7.4)。
    更特定言之，一種用於所揭示之方法之平衡緩衝液含有20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用2 mM乙酸調整至pH 7.4。一種用於所揭示之方法之洗滌緩衝液含有20 mM Bis Tris及1 M NaCl，用2 mM乙酸調整至pH 7.4。用於所揭示之方法之第一溶離緩衝液含有20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用275 mM乙酸調整至pH 3.5。用於所揭示之方法之第二溶離緩衝液含有20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，用35 mM乙酸調整至pH 4.5。
    以上緩衝液調配物之優點包括相對於傳統純化方法能夠使mAb產物以較大相容性流經用於所揭示之方法中的兩個層析管柱，同時使不當交互作用降至最低、限制pH值及導電性下降且促進產率增加。除使用較少數量之緩衝液之外，所揭示之方法之另一態樣為使用Bis-Tris緩衝液。
    如本文所用，術語「多肽」或「蛋白質」係指具有天然蛋白質(亦即由天然存在且特定言之非重組細胞或經遺傳工程改造或重組之細胞產生之蛋白質)之序列的分子，且包含具有天然蛋白質之胺基酸序列的分子，或缺失、添加及/或取代天然序列之一或多個胺基酸的分子。在某些態樣中，待純化之蛋白質為抗體。
    如本文所用，術語「抗體」係指完整抗體或其與用於特異性結合之完整抗體相競爭之結合片段。結合片段包括(但不限於)F(ab)、F(ab')、F(ab')2、Fv及單鏈抗體。術語「重鏈」包括具有足以賦予抗原以特異性之可變區序列的任何免疫球蛋白多肽。
    如本文所用，術語「重鏈」涵蓋全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。VH結構域處於多肽之胺基端，且CH3結構域處於羧基端。
    如本文所用，術語「輕鏈」涵蓋全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區結構域VL及恆定區結構域CL。像重鏈一樣，輕鏈之可變區結構域處於多肽之胺基端。如本文所用，術語「輕鏈」包括具有足以賦予抗原以特異性之可變區序列的任何免疫球蛋白多肽。
    天然存在之抗體結構單元通常包含四聚體。該四聚體每一者通常由兩個相同多肽鏈對構成，每一對具有一個全長輕鏈(分子量通常為約25 kDa)及一個全長重鏈(分子量通常為約50 kDa至70 kDa)。各輕鏈及重鏈之胺基端部分通常包括通常負責抗原識別之約100至110個或110個以上胺基酸之可變區。每條鏈之羧基端部分通常界定負責效應功能之恆定區。通常將人類輕鏈劃分為(kappa)及λ(lambda)輕鏈。通常將重鏈劃分為μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干子類，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有包括(但不限於)IgM1及IgM2之子類。IgA類似地細分為包括(但不限於)IgA1及IgA2之子類。在全長輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區通常由約12個或12個以上胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約10個以上胺基酸之「D」區。
    各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。可變區通常展現由三個高變區(亦稱為互補決定區或CDR)接合之相對保守構架區(FR)之相同通用結構。每一對之兩個鏈之CDR通常由構架區對準，由此可使得結合於特異性抗原決定基。由N端至C端，輕鏈與重鏈可變區通常包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。通常可根據Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公開案第91-3242號之定義將胺基酸分配至各結構域。雙特異性或雙功能性抗體通常為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。
    F(ab)片段包含一個輕鏈及一個重鏈之CH1及可變區。F(ab)分子之重鏈不可與另一重鏈分子形成雙硫鍵。F(ab')片段含有一個輕鏈及一個含有介於CH1與CH2結構域域之間的大部分恆定區之重鏈，以便可在兩個重鏈之間形成鏈間雙硫鍵，從而形成F(ab')2分子。Fv區包含來自重鏈與輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。單鏈抗體為重鏈及輕鏈可變區已由可撓性連接子連接以形成構成抗原結合區之單一多肽鏈的Fv分子。在某些實施例中，應瞭解，除「多特異性」或「多功能性」抗體以外之二價抗體包含具有相同抗原特異性之結合位點。
    可藉由所揭示之方法純化之單株抗體(mAb)可藉由多種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如此項技術中熟知之標準體細胞雜交技術。儘管原則上體細胞雜交程序較佳，但亦可採用產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴細胞之病毒性或致癌性轉型。單株抗體可例如對應於鼠類、嵌合、人類化或全人類抗體。
    在一個特定實施例中，藉由本發明方法純化之抗體為選自由以下組成之群的單株抗體：特異性結合於原纖維體形式之人類β-類澱粉蛋白的抗體(例如人類化抗體)、特異性結合於細菌表面多醣聚-N-乙醯基葡糖胺(PNAG)的抗體(例如全人類抗體)、及特異性結合於CD38跨膜醣蛋白的抗體(例如人類化抗體)。
    如本文所用，片語「回收蛋白質」係指在使用所揭示之純化方法之後收集蛋白質。所揭示之純化方法可使用多種標準蛋白質層析技術來實現，諸如(但不限於)親和層析、離子交換層析、疏水性交互作用層析、凝膠過濾層析及多模式樹脂層析。
    在所揭示之方法之某些實施例中，第一或第二層析管柱為蛋白質A管柱。蛋白質A管柱經由樹脂配位體與蛋白質之間的親和力起作用，實現雜質之高效率移除。在所揭示之方法中使用蛋白質A管柱之另一優點為mAb對蛋白質A具有通用親和力。在所揭示之方法之一個實施例中，蛋白質A管柱為MabSelect Sure樹脂(GE Healthcare)。
    在所揭示之方法之其他實施例中，第一或第二層析管柱為多模式(混合模式)樹脂層析管柱。多模式樹脂經由關於mAb：離子、疏水性及氫鍵交互作用之若干機制與所關注之蛋白交互作用。更特定言之，在多模式樹脂層析管柱中，mAb：離子交互作用為與經典陰離子交換層析(AEX)管柱中發生之mAb：陰離子交互作用相反之mAb：陽離子交互作用。
    在所揭示之方法之一個特定實施例中，多模式樹脂為Capto Adhere樹脂(GE Healthcare)。Capto adhere為具有高度交聯之瓊脂糖基基質之多模式陰離子交換劑。下文概述Capto adhere之特徵(參見GE Healthcare Life Sciences，資料文檔28-9078-88 AC)。
    在所揭示之方法之另一特定實施例中，多模式樹脂為Capto MMC樹脂(GE Healthcare)。Capto MMC為具有高度交聯之瓊脂糖基基質之多模式陽離子交換劑。下文概述Capto MMC之特徵(參見GE Healthcare Life Sciences，資料文檔11-0035-45 AA)。
    本發明方法可包含或不包含在第一層析步驟結束時使用Bis Tris溶液調整粗蛋白質溶離劑之pH值。
    在第一實施例中，在第一層析步驟結束時使用Bis Tris溶液使粗蛋白質溶離劑之pH值例如介於6與7之間(例如6.5)。該Bis Tris溶液可為1 M Bis Tris溶液。在該方法中，多模式樹脂層析管柱可例如對應於Capto Adhere管柱。此方法之特定實例揭示於實例3至實例6中。
    在第二實施例中，使在第一層析步驟結束時獲得之粗蛋白質溶離劑直接流過第二層析管柱。更特定言之，在兩個步驟之間不進行處理(諸如pH值調整、緩衝液更換或稀釋)。在該方法中，多模式樹脂層析管柱可例如對應於Capto MMC管柱。另外，如下文進一步描述，可在第二層析步驟之後使粗蛋白質溶離劑流過薄膜吸附器。此方法之特定實例揭示於實例7中。在該方法中，完全不存在需要人工干預及開啟純化系統之步驟間處理(例如在不活化容器中稀釋、不活化後過濾(post inactivity filtration)及在蛋白質A池容器中進行pH值調整)。
    本文所揭示之方法可用以回收純化蛋白質。如本文所用，「純化」係指可使得蛋白質活體外、離體或活體內有效使用之純度。對於適用於活體外、離體或活體內應用之蛋白質，實質上應不含會干擾蛋白質在該等應用中之使用或至少對於納入所關注蛋白質不合乎需要的污染物、其他蛋白質及/或化學製品。該等應用包括製備治療性組合物、投與呈治療性組合物形式之蛋白質及本文所揭示之其他方法。較佳地，如本文所提及，「純化」蛋白質為具有以下特徵之蛋白質：其可藉由任何方法(亦即藉由自天然來源直接純化、以重組方式或以合成方式)產生，且已自其他蛋白質組分純化以便該蛋白質佔所給出之組合物中的總蛋白質至少約80重量%，且更佳至少約85重量%，且更佳至少約90重量%，且更佳至少約91重量%，且更佳至少約92重量%，且更佳至少約93重量%，且更佳至少約94重量%，且更佳至少約95重量%，且更佳至少約96重量%，且更佳至少約97重量%，且更佳至少約98重量%，且更佳佔所給出之組合物中的總蛋白質至少約99重量%。
    如本文所用，「粗蛋白質」係指具有以下特徵之蛋白質：其可藉由任何方法(亦即藉由自天然來源直接純化、以重組方式或以合成方式)產生且已自其他蛋白質組分純化以便該蛋白質佔所給出之組合物中的總蛋白質約80重量%以下。
    在一個實施例中，所揭示之方法另外包含稱為「步驟(c)」之第三步驟，其中在步驟(b)之後使粗蛋白質溶離劑流過薄膜吸附器。詳言之，步驟(c)可在使第一層析步驟結束時所獲得之粗蛋白質溶離劑直接流過第二層析管柱時進行。薄膜吸附器為一種使用具有大孔隙而非微孔粒子之薄膜的層析基質或過濾器形式。此等孔隙覆蓋整個過濾器區域且促成樣品之極快流率，以及與薄膜之內部結構內的目標分子之最佳結合。可將薄膜併入離心管柱中，以便容易且選擇性地自複雜溶液分離目標蛋白質。使用薄膜吸附器之益處在於其對污染物之結合性與習知層析方法一樣有效；其允許高加工流率，其不需要包裝、驗證或清潔，且可拋棄但亦可再使用。耐鹽性薄膜甚至可以進行更多類型之純化法。在某些實施例中，薄膜吸附器為耐鹽性交互作用層析薄膜吸附器(例如Satorius STIC薄膜吸附器)或Q薄膜吸附器。
    當為達成醫藥目的而純化重組蛋白質時，層析步驟之後通常為過濾步驟。因此，本發明方法在步驟(b)或步驟(c)之後可進一步包含奈米過濾步驟。在奈米過濾步驟之後可進一步進行超濾及透濾步驟。如本文所用，「超濾」或「UF」係指使用半透薄膜基於粒度及UF薄膜中孔隙之尺寸以物理方式且選擇性地自溶液移除粒子及/或離子的過濾技術。如本文所用，「奈米過濾」係指經由用以移除例如病毒粒子之奈米過濾器過濾溶液。如本文所用，「透濾」係指使用超濾薄膜自溶液完全移除、替換鹽或溶劑或降低鹽或溶劑之濃度的技術。
    最終，可將純化蛋白質調配成適於儲存之組合物及/或調配成適於投與動物及/或人類之醫藥組合物。
    所揭示方法之許多優點中之一者為其允許獲得良好產率之高純度蛋白質。由本發明方法回收之純化蛋白質可例如展現至少95%、96%、97%、98%或99%之純度。另外，本發明方法可允許以至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之產率回收純化蛋白質。
    本發明之另一態樣係關於製備適用於本發明方法之緩衝液的方法。實際上，所有此等緩衝液可由單一母溶液作為起始物極輕易且快速地製備。
    該製備緩衝液之方法可包含以下步驟或由以下步驟組成：i)製備最終濃度為15 mM至25 mM(例如20 mM)Bis Tris及15 mM至25 mM(例如20 mM)NaCl之溶液(例如100 L溶液)；ii)用乙酸將溶液之pH值調整至介於7與8之間(例如7.4)的值；iii)收集一半溶液，由此獲得平衡緩衝液；iv)用乙酸將來自步驟(iii)之剩餘一半溶液之pH值調整至介於4與5之間(例如4.5)的值；v)收集一半步驟(iv)所獲得之溶液，由此獲得溶離緩衝液；vi)用乙酸將來自步驟(v)之剩餘一半溶液之pH值調整至介於3與4之間(例如3.5)的值，由此獲得另一溶離緩衝液；vii)收集一半步驟(iii)所獲得之平衡緩衝液且添加NaCl以獲得介於0.9 mM與1.1 mM之間(例如1 M)的最終NaCl濃度，由此獲得洗滌及衛生處理緩衝液；該方法以示意圖形式描繪於圖1中。
    或者，製備緩衝液之方法可包含以下或由以下組成：i)製備最終濃度為15 mM至25 mM(例如20 mM)Bis Tris及15 mM至25 mM(例如20 mM)NaCl之溶液(例如100 L溶液)；ii)用乙酸將溶液之pH值調整至介於8與9之間(例如8.2)的值；iii)收集四分之一(例如25 L)溶液，由此獲得溶離緩衝液；iv)用乙酸將來自步驟(iii)之剩餘溶液之pH值調整至介於7與8之間(例如7.4)的值；v)收集三分之二步驟(iv)所獲得之溶液，由此獲得平衡緩衝液；vi)用乙酸將來自步驟(v)之剩餘溶液之pH值調整至介於3與4之間(例如3.5)的值，由此獲得另一溶離緩衝液；vii)收集一半步驟(v)所獲得之平衡緩衝液且添加NaCl以獲得介於0.9 mM與1.1 mM之間(例如1 M)的最終NaCl濃度，由此獲得洗滌及衛生處理緩衝液；該方法以示意圖形式描繪於圖6中。
    上文製備緩衝液之方法中之一者亦可對應於本發明方法之第一步驟，之後執行兩個層析步驟。
    本發明進一步係關於一種包含以下或由以下組成之套組：(a)多模式樹脂層析管柱及/或親和層析管柱，諸如蛋白質A管柱；及(b)至少一種本發明之緩衝液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成)及/或製備至少一種本發明之緩衝液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成)的說明書。
    本發明進一步涵蓋本發明之緩衝液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成)之用途，其係用於藉由至少一個層析步驟自溶液純化蛋白質。更特定言之，該至少一個層析步驟可為多模式樹脂層析步驟及/或親和層析步驟，諸如蛋白質A管柱。 實例
    以下實例說明所揭示方法之特定實施例及其各種用途。其僅為說明性目的而闡述，且不應將其視為以任何方式限制本發明之範疇。 實例1：最佳化純化緩衝液
    1.1.在蛋白質A管柱之情況下可將Bis Tris緩衝液用作溶離緩衝液
    當用蛋白質A管柱進行層析步驟時，溶離緩衝液通常由檸檬酸鹽或甘胺酸緩衝液組成。使用以下經典條件進行該用蛋白質A管柱實施之層析步驟
    - 管柱：80 mL MabSelect Sure
    - 平衡緩衝液：PBS緩衝液，pH 7.2
    - 溶離緩衝液：100 mM檸檬酸鈉，pH 3.0
    - 加載：1 L包含1.48 g/L抗CD38 mAb之溶液。
    在層析步驟之後獲得175 mL包含7.92 g/L mAb之粗蛋白質溶離劑(1.386 g mAb)。
    本發明者研究檸檬酸鹽緩衝液是否可用Bis Tris緩衝液替換。使用以下條件：
    - 管柱：80 mL MabSelect Sure
    - 平衡緩衝液：PBS緩衝液，pH 7.2
    - 溶離緩衝液：100 mM Bis Tris，pH 3.5(用乙酸調整pH值)
    - 加載：1 L包含1.48 g/L抗CD38 mAb之溶液。
    本發明者獲得200 mL包含6.8 g/L mAb(1.369 g mAb)之粗蛋白質溶離劑。
    此情況顯示在用蛋白質A管柱執行層析步驟時，使用Bis Tris緩衝液作為溶離緩衝液允許獲得與經典的檸檬酸鈉緩衝液一樣之良好結果。
    1.2.在多模式樹脂層析管柱之情況下宜將Bis Tris緩衝液用作緩衝液
    接著使流經蛋白質A層析管柱後獲得之粗蛋白質溶離劑流經Capto adhere多模式樹脂層析管柱。為此，本發明者首先測試以下條件：
    - 管柱：1 mL Capto adhere
    - 平衡緩衝液：100 mM檸檬酸鈉，pH 8.6(80%)，及100 mM檸檬酸，pH 2.2(20%)，最終pH值接近於5.3
    - 溶離緩衝液：不同濃度之兩個上述緩衝液，以鑑別進行最佳溶離之位置
    - 洗滌緩衝液：與平衡緩衝液一致
    - 加載：20 mL包含35 mg抗CD38 mAb之粗蛋白質溶離劑，pH值為5.3。
    發現抗體在洗滌步驟期間發生溶離，此顯然係由於pH值之下降。實際上，pH值由5.3瞬間降至4.0，之後又增至pH 5.3。pH值降至4.0之事實足以在洗滌步驟期間使抗體溶離。
    接著本發明者研究使用Bis Tris緩衝液是否可避免在洗滌步驟期間發生不合需要之溶離。其測試以下條件：
    - 管柱：1 mL Capto adhere
    - 平衡緩衝液：20 mM Bis Tris，pH 7.0(用乙酸調整pH值)
    - 溶離緩衝液：20 mM Bis Tris，pH 6.0(用乙酸調整pH值)
    - 洗滌/再生緩衝液：20 mM Bis Tris，pH 4.0(用乙酸調整pH值)
    - 衛生處理緩衝液：0.5 N NaOH
    - 加載：18 mL包含約30 mg抗CD38 mAb之粗蛋白質溶離劑。此溶離劑來自以上段落1.1所述之第二層析。用1 M Bis Tris溶液將溶離劑之pH值調整至pH 7.2，之後加載於Capto adhere管柱上。
    本發明者發現此等條件允許獲得抗體之恰當溶離。實際上，用pH值為6.0之Bis Tris溶離緩衝液溶離抗體。在pH 4.0下再生期間及在用NaOH衛生處理期間觀察到兩個較小且可忽略之峰。
    進一步測試用HCl替代乙酸調整Bis Tris緩衝液之pH值是否會有益。使用以下條件：
    - 管柱：1 mL Capto adhere
    - 平衡緩衝液：20 mM Bis Tris，pH 7.0(用1 N HCl調整pH值)
    - 溶離緩衝液：具有Bis Tris緩衝液之梯度(20 mM，pH 4，用1 N HCl調整pH值)。
    - 加載：10 mL包含約15 mg抗CD38 mAb之粗蛋白質溶離劑。此溶離劑來自以上段落1.1所述之第二層析。用1 M Bis Tris溶液將溶離劑之pH值調整至pH 7.2，之後加載於Capto adhere管柱上。
    使用此等條件，在洗滌步驟期間抗體不會發生溶離。因此，此分析法證實使用Bis Tris緩衝液可防止在洗滌步驟期間抗體發生不合需要之溶離。然而，在用HCl而非用乙酸調整pH值時，溶離步驟期間pH值不會同樣快速地下降。因此，在用HCl而非用乙酸調整pH值時，抗體之溶離效率較差。
    總之，本發明者驚人地發現在多模式樹脂層析步驟期間，使用包含Bis Tris之平衡緩衝液及溶離緩衝液可使得在洗滌及衛生處理步驟期間避免抗體發生不合需要之溶離。其進一步發現用乙酸調整Bis Tris緩衝液之pH值有利。因為亦發現Bis Tris緩衝液適用於執行蛋白質A層析步驟，所以本發明者已發現一種緩衝液全部可由相同化合物基質製得之純化方法，其大大有助於緩衝液製備。
    進行其他實驗以確定平衡緩衝液、洗滌緩衝液及兩種溶離緩衝液之最佳pH值，其均包含Bis Tris以及乙酸以達到調整pH值之目的。本發明者進一步出乎意料地發現宜將NaCl添加至緩衝液中。此等其他實驗引向描述於實例2至實例7中的純化緩衝液及方案。 實例2：調配純化緩衝液
    本文所述之兩步純化方法利用四種緩衝液：平衡緩衝液、洗滌及衛生處理緩衝液及兩種溶離緩衝液，所有均由相同母溶液製備。方案之示意圖展示於圖1中且如下：將等量20 mM Bis Tris及等量20 mM NaCl引入100 L注射用水(WFI)中作為母溶液，且接著使用乙酸將該溶液之pH值調整至7.4。接著收集50 L所得溶液且儲存為平衡緩衝液。接著移除25 L平衡緩衝液且添加等量1 M NaCl，由此使pH值降至3.5。此所得25 L溶液為洗滌及衛生處理緩衝液。接著用乙酸將剩餘50 L母溶液之pH值調整至4.5。接著收集25 L此溶液作為一種溶離緩衝液。接著使用乙酸將剩餘25 L母溶液之pH值調整至3.5，產生另一溶離緩衝液。 實例3：兩步單株抗體純化方法
    兩步單株抗體(mAb)純化方法使用MabSelect Sure樹脂由第一層析步驟起始。使2管柱體積(CV)之平衡緩衝液流過管柱。接著將mAb溶液加載於管柱上。接下來使2 CV洗滌緩衝液流過管柱，繼之以2 CV平衡緩衝液。隨後使用1 CV第一溶離緩衝液溶離粗mAb溶液。兩個層析步驟之間為低pH值處理。此舉可為使用1 M乙酸進行之低pH值調整以達到pH 3.5±0.1，或使用1 M Bis Tris進行之pH值調整以達到pH 5±0.1。第二層析使用Capto Adhere層析管柱進行。使2 CV平衡緩衝液流過管柱。接著使粗mAb溶液加載於管柱上，繼之使4 CV平衡緩衝液流過。接著使用1 CV第二溶離緩衝液溶離部分純化之mAb溶液。層析之後，可用奈米過濾及超濾/透濾過濾mAb。奈米過濾使用X0HC及VPD預過濾器(Millipore)以預過濾步驟開始，且使用Viresolve Pro過濾器(Millipore)以奈米過濾結束。接著進行超濾，目標濃度為50 g/L，繼之使用7體積組胺酸緩衝液進行透濾(該方法之示意圖參見圖2)。 實例4：小批純化人類化13C3 mAb
    利用實例2中所述之方案小批純化53 g人類化13C3 mAb。如國際公開案第WO 2009/065054號中所述，13C3 mAb結合於原纖維體形式之人類β-類澱粉蛋白。
    經由深度過濾系統澄清mAb批量收集物且使用0.22 μm過濾器進行過濾，之後在2℃至8℃下儲存於50 L拋棄式袋中96小時，之後進行純化。將43 L批量收集物以240 cm/h之流率加載於3.1 L MabSelect Sure管柱上。如上所述執行第一層析步驟，且收集6 L mAb溶液。接著用4 L Milli-Q水稀釋溶離液以產生濃度約5 g/L之溶液。接著用1 L 1 M Bis Tris將pH值再調整至6.5。接著經由C0HC級深度過濾器及0.22 μm Millipak過濾器過濾11.03 L總體積。接著收集11.58 L且儲存於2℃至8℃下。對於第二層析步驟，將MabSelect sure溶離液以240 cm/h流率加載於4 L Capto adhere管柱上。加載步驟之後，如上所述進行層析且收集於10 L袋中，最終體積為5.58 L。經由0.22 μm Millipak過濾器過濾最終產物且儲存於2℃至8℃下。
    與經典mAb純化相比，本文所揭示之兩步方法產生類似結果，總產率>90%且純度>98%，在此情況下，特定言之純度為99.4%且最終濃度為9.49 g/L。 實例5：大量純化單株抗體
    兩步純化方法亦可用於大規模純化單株抗體。對於第一層析步驟，將人類化13C3 mAb之批量收集物(216 L)分成4個等分試樣且以240 cm/h流率分4次運作加載於3.1 L MabSelect Sure管柱上，每次約54 L。如上所述進行層析，且將mAb溶離液收集於Mobuis 100 L袋中。另外，在每次加載步驟之後，用平衡緩衝液平衡管柱。量測19.7 L溶液之pH值為3.9。接著用60 L MilliQ水將溶離液稀釋至濃度為5 g/L。接著用4.0 L 1 M乙酸將pH值調整至3.5，持續約1小時時間。pH值穩固之後，對於Capto Adhere步驟用7 L 1 M Bis Tris溶液將溶離液之pH值調整至pH 6.5。此步驟之最終體積為91 L且使產物儲存於4℃下。對於第二層析步驟，將MabSelect sure溶離液分開且以240 cm/h流率分4次運作加載於3.5 L Capto Adhere管柱上。在每次加載步驟之後，用平衡緩衝液平衡管柱。所有溶離物經由0.22 μm過濾器彙集於同一50 L Flexboy袋中，且在各步驟之後，使用洗滌緩衝液執行衛生處理。最終體積為22.1 L且儲存於2℃至8℃下。接著用X0HC過濾器(Millipore)執行深度過濾步驟。由於用於以下步驟之X0HC過濾器與VPF預過濾器之間存在相容性問題，故將VPF預過濾器添加至X0HC過濾器上以在相同固持器中執行過濾。為使產率損失降至最低，在兩個深度過濾器之後串聯安裝Modus 1.3奈米過濾器。溶液經由0.22 m2 X0HC級過濾器(2×0.11 m2)、0.22 m2 VPF過濾器(2×0.11 m2)及Modus 1.3(0.21 m2)過濾。過濾沖洗之後，所回收之總體積為25.9 L。不會出現壓力問題，其中壓力以1.8巴起始且在460 ml/min下以約1.3巴結束。最終步驟為溶液之超濾及透濾。兩個製程在具有使容量增至1.71 m2之固持器之Millipore Cogent M中進行。將批料以9.3 L之恆定體積加載於Cogent M上，濃縮溶液至50 g/L。在12 L/M/H泵交叉流下50 min之後達到第一濃度。接著在14 L/M/H泵交叉流下在165分鐘內由7體積10 mM組胺酸(pH 6.5)進行透濾。接著在8 L/M/H泵交叉流下使產物緩慢濃縮30分鐘。調整流量至保持於△P<0.6巴，以1670 ml/min起始且以520 ml/min結束。所收集溶液之最終體積為2.6 L，含有457 g mAb，最終濃度為175.7 g/L(UV)。最終，使用0.22 μm Sartopore 2-150過濾器過濾產物且儲存於4℃下。 實例6：純化不同單株抗體
    除人類化13C3抗體之外，使用上文所述兩步純化方法純化其他抗體，亦即特異性結合於細菌表面多醣聚-N-乙醯基葡糖胺(PNAG)的全人類抗體及特異性結合於CD38跨膜醣蛋白的人類化單株抗體。
    下表顯示純化此三種抗體時獲得之總產率及純度。
    1總產率對應於奈米過濾、超濾及透濾步驟之前的產率。
    接著在臨床試驗框架中將純化人類化13C3 mAb及純化抗PNAG mAb投與人類。
    總之，由三種不同抗體已證實兩步純化方法允許獲得良好產率且純度極佳之純化抗體，純化抗體之品質適用於投與人類。 實例7：「一天一批」純化方法
    大規模純化亦可採用使用與多模式管柱連接之蛋白質A管柱，使第一層析步驟結束時獲得之粗蛋白質溶離劑直接流過第二層析管柱(參見圖3)。使用大規模純化方法之一些益處為無需進一步稀釋、pH值調整或儲存。另外，此方法允許快速加載粗抗體製劑。使用大規模抗體純化方法經7小時30分鐘純化340 g mAb批料(參見圖4)。純化方法得到98%之產率(332/340 g)及96.9%之純度(參見圖5)。另外，使用該方法移除污染物達到與習知純化方法所見類似之程度。
    上述大規模純化方法可用以滿足用於例如臨床前及臨床試驗中之更大且更有效抗體製備之目標。
    更特定言之，稱為「一天一批」之此方法適用於人類化13C3 mAb之大規模純化。目標為在無儲存、開啟階段、稀釋/調整步驟之情況下經由2個層析步驟僅一天內純化全部200 L批料。
    緩衝液如圖6中所示製備。
    對於第一層析步驟，將批量收集物(179 L)分成4個等分試樣且分4次運作加載於3.1 L MabSelect Sure管柱上。所有運作均由緩衝液B(20 mM NaCl、20 mM Bis Tris，pH 7.4)平衡，用緩衝液D(1 M NaCl、20 mM Bis Tris，pH 7.4)洗滌且用緩衝液C(20 mM NaCl、20 mM Bis Tris，pH 3.5)溶離。將各溶離物直接加載於3.1 L Capto MMC管柱中。在各加載運作之前，用緩衝液C(20 mM NaCl、20 mM Bis Tris，pH 3.5)平衡管柱，接著在加載之後，用緩衝液B(20 mM NaCl、20 mM Bis Tris，pH 7.4)平衡管柱，且用緩衝液A(200 mM NaCl、20 mM Bis Tris，pH 8.2)溶離產物。將全部批料在一個工作日內純化，自上午7點至下午3點。
    此兩個層析步驟之後，使所有溶離之溶離份流經STIC薄膜，之後收集於50 L袋中。
    加載於第一管柱上之總體積為179 L，其中mAb濃度為1.61 g/L。所純化之總體積為35.7 L，其中mAb效價為7.26 g/L。總產率為90%。
    已詳細地且參考其特定實施例描述本發明，顯然在不背離隨附申請專利範圍中所定義的本發明之範疇的情況下，可能存在修改及變化。更特定言之，儘管本文認為本發明之一些態樣尤其有利，但預期本發明未必限於此等特定態樣。
    本文所述及/或引用之參考文獻各自以全文引用的方式併入本文中。
    圖1顯示用以調配實例3至實例6中所揭示之純化方法之緩衝液的方案之示意圖。
    圖2顯示兩步純化方法之示意圖。
    圖3顯示兩步純化方法用於大規模純化管柱之示意圖。
    圖4顯示「一天一批」大規模純化之示意圖。
    圖5顯示「一天一批」大規模純化之結果。
    圖6顯示用以調配實例7中所揭示之純化方法之緩衝液的方案之示意圖。
    权利要求:
    Claims (43)
    [1] 一種自溶液純化蛋白質之方法，其包括：(a)第一層析步驟，其包括：使該溶液流過第一層析管柱；使用第一溶離緩衝液自該第一層析管柱溶離粗蛋白質溶離劑；及(b)第二層析步驟，其包含：使步驟(a)結束時獲得之該粗蛋白質溶離劑流過第二層析管柱；使用第二溶離緩衝液自該第二層析管柱回收純化蛋白質，其中該等緩衝液各自包含Bis Tris。
    [2] 如請求項1之方法，其中該兩個層析步驟每一者包括：使平衡緩衝液流過該層析管柱；使該溶液或該粗蛋白質溶離劑流過該層析管柱；使平衡緩衝液流過該層析管柱；視情況使洗滌及衛生處理緩衝液流過該層析管柱；視情況使平衡緩衝液流過該層析管柱；使用溶離緩衝液自該層析管柱溶離該粗蛋白質溶離劑或回收純化蛋白質，其中該等緩衝液各自包含Bis Tris。
    [3] 如請求項1或2之方法，其中該等緩衝液各自由不同濃度之相同化學製品組成。
    [4] 如請求項1至3中任一項之方法，其中該等緩衝液各自由Bis Tris、乙酸、NaCl及水組成。
    [5] 如請求項1至4中任一項之方法，其中該自溶液純化蛋白質之方法僅包括兩個層析步驟。
    [6] 如請求項1至5中任一項之方法，其中該等層析管柱中之一者為親和層析管柱。
    [7] 如請求項6之方法，其中該親和層析管柱為蛋白質A管柱。
    [8] 如請求項1至7中任一項之方法，其中該等層析管柱中之一者為多模式樹脂層析管柱。
    [9] 如請求項1至8中任一項之方法，其中步驟(a)進一步包括使用Bis Tris溶液調整該粗蛋白質溶離劑之pH值。
    [10] 如請求項9之方法，其中將該pH值調整至介於6與7之間的值。
    [11] 如請求項1至8中任一項之方法，其中使步驟(a)結束時獲得之該粗蛋白質溶離劑直接流過第二層析管柱，而不經過任何處理，諸如pH值調整、緩衝液更換或稀釋。
    [12] 如請求項1至11中任一項之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)第一層析步驟，其包括：(i)使平衡緩衝液流過第一層析管柱；(ii)使該溶液流過該第一層析管柱；(iii)使平衡緩衝液流過該第一層析管柱；(iv)使洗滌及衛生處理緩衝液流過該第一層析管柱；(v)使平衡緩衝液流過該第一層析管柱；(vi)使用第一溶離緩衝液自該第一層析管柱溶離粗蛋白質溶離劑；及(vii)視情況使用Bis Tris溶液調整該粗蛋白質溶離劑之pH值；及(b)第二層析步驟，其包括：(i)使平衡緩衝液流過第二層析管柱；(ii)使來自步驟(a)之該粗蛋白質溶離劑流過該第二層析管柱；(iii)使平衡緩衝液流過該第二層析管柱；及(iv)使用第二溶離緩衝液自該第二層析管柱回收純化蛋白質。
    [13] 如請求項1至12中任一項之方法，其中該第一層析管柱為親和層析管柱。
    [14] 如請求項13之方法，其中該親和層析管柱為蛋白質A管柱。
    [15] 如請求項1至14中任一項之方法，其中該第二層析管柱為多模式樹脂層析管柱。
    [16] 如請求項1至11中任一項之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)第一層析步驟，其包含：(i)使平衡緩衝液流過第一層析管柱；(ii)使該溶液流過該第一層析管柱；(iii)使平衡緩衝液流過該第一層析管柱；(iv)使用第一溶離緩衝液自該第一層析管柱溶離粗蛋白質溶離劑；及(v)視情況使用Bis Tris溶液調整該粗蛋白質溶離劑之pH值；及(b)第二層析步驟，其包括：(i)使平衡緩衝液流過第二層析管柱；(ii)使來自步驟(a)之該粗蛋白質溶離劑流過該第二層析管柱；(iii)使平衡緩衝液流過該第二層析管柱；(iv)使洗滌及衛生處理緩衝液流過該第二層析管柱；(v)使平衡緩衝液流過該第二層析管柱；及(vi)使用第二溶離緩衝液自該第二層析管柱回收純化蛋白質。
    [17] 如請求項1至11及16中任一項之方法，其中該第一層析管柱為多模式樹脂層析管柱。
    [18] 如請求項1至11、16及17中任一項之方法，其中該第二層析管柱為親和層析管柱。
    [19] 如請求項18之方法，其中該親和層析管柱為蛋白質A管柱。
    [20] 如請求項1至19中任一項之方法，其中該蛋白質為抗體。
    [21] 如請求項20之方法，其中該抗體為單株抗體。
    [22] 如請求項20或21之方法，其中該單株抗體係選自由以下組成之群：特異性結合於原纖維體形式之人類β-類澱粉蛋白的抗體、特異性結合於細菌表面多醣聚-N-乙醯基葡糖胺(PNAG)的抗體及特異性結合於CD38跨膜醣蛋白的抗體。
    [23] 如請求項1至22中任一項之方法，其在步驟(b)之後進一步包括使該粗蛋白質溶離劑流過薄膜吸附器之步驟(c)。
    [24] 如請求項23之方法，其中該薄膜吸附器為耐鹽性交互作用層析薄膜吸附器。
    [25] 如請求項1至24中任一項之方法，其在步驟(b)或(c)之後進一步包括奈米過濾步驟。
    [26] 如請求項25之方法，其在奈米過濾步驟之後進一步包括超濾及透濾步驟。
    [27] 如請求項1至15及20至26中任一項之方法，其中該第一溶離緩衝液包含15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl，用乙酸將pH值調整至介於3與4之間。
    [28] 如請求項1至15及20至27中任一項之方法，其中該第二溶離緩衝液包含15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl，用乙酸將pH值調整至介於4與5之間。
    [29] 如請求項1至15及20至27中任一項之方法，其中該第二溶離緩衝液包含15 mM至25 mM Bis Tris及150 mM至250 mM NaCl，用乙酸將pH值調整至介於8與9之間。
    [30] 如請求項1至11及16至26中任一項之方法，其中該第一溶離緩衝液包含15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl，用乙酸將pH值調整至介於4與5之間。
    [31] 如請求項1至11及16至26中任一項之方法，其中該第一溶離緩衝液包含15 mM至25 mM Bis Tris及150 mM至250 mM NaCl，用乙酸將pH值調整至介於8與9之間。
    [32] 如請求項1至11、16至26、30及31中任一項之方法，其中該第二溶離緩衝液包含15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl，用乙酸將pH值調整至介於3與4之間。
    [33] 如請求項2至32中任一項之方法，其中平衡緩衝液包含15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl，用乙酸將pH值調整至介於7與8之間。
    [34] 如請求項2至33中任一項之方法，其中該洗滌及衛生處理緩衝液包含15 mM至25 mM Bis Tris及0.9 mM至1.1 mM NaCl，用乙酸將pH值調整至介於7與8之間。
    [35] 如請求項1至34中任一項之方法，其中該純化蛋白質之回收產率為至少85%。
    [36] 如請求項1至35中任一項之方法，其中該回收之純化蛋白質展現至少95%之純度。
    [37] 如請求項1至36中任一項之方法，其進一步包含將該回收之純化蛋白質調配成醫藥組合物之步驟。
    [38] 一種製備適用於如請求項1至37中任一項之方法的緩衝液之方法，其包括以下步驟：i)製備最終濃度為15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl之溶液；ii)用乙酸將該溶液之pH值調整至介於7與8之間的值；iii)收集一半該溶液，由此獲得平衡緩衝液；iv)用乙酸將來自步驟(iii)之剩餘一半溶液之pH值調整至介於4與5之間的值；v)收集一半步驟(iv)獲得之該溶液，由此獲得一溶離緩衝液；vi)用乙酸將來自步驟(v)之剩餘一半溶液之pH值調整至介於3與4之間的值，由此獲得另一溶離緩衝液；vii)收集一半步驟(iii)獲得之該平衡緩衝液且添加NaCl以獲得介於0.9 mM與1.1 mM之間的最終NaCl濃度，由此獲得洗滌及衛生處理緩衝液。
    [39] 一種製備適用於如請求項1至37中任一項之方法的緩衝液之方法，其包括以下步驟：i)製備最終濃度為15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl之溶液；ii)用乙酸將該溶液之pH值調整至介於8與9之間的值；iii)收集四分之一該溶液，由此獲得一溶離緩衝液；iv)用乙酸將來自步驟(iii)之剩餘溶液之pH值調整至介於7與8之間的值；v)收集三分之二步驟(iv)獲得之該溶液，由此獲得平衡緩衝液；vi)用乙酸將來自步驟(v)之剩餘溶液之pH值調整至介於3與4之間的值，由此獲得另一溶離緩衝液；vii)收集一半步驟(v)獲得之該平衡緩衝液且添加NaCl以獲得介於0.9 mM與1.1 mM之間(例如1 M)的最終NaCl濃度，由此獲得洗滌及衛生處理緩衝液。
    [40] 一種套組，其包含：(a)多模式樹脂層析管柱及/或親和層析管柱，諸如蛋白質A管柱；及(b)至少一種包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成之緩衝液。
    [41] 一種套組，其包含：(a)多模式樹脂層析管柱及/或親和層析管柱，諸如蛋白質A管柱；及(b)用於製備至少一種包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成之緩衝液的說明書。
    [42] 一種包含Bis Tris、乙酸、NaCl及水或由其組成之緩衝液的用途，其係用於藉由至少一個層析步驟，自溶液純化蛋白質。
    [43] 如請求項42之用途，其中該層析步驟為多模式樹脂層析步驟及/或親和層析管柱，諸如蛋白質A管柱。
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