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    • 专利摘要:
    本發明以提供適於NCL法之多胜肽片段之有效率的製造方法為目的。本發明的製造方法包含將包括經-Cys-W-(His)n-Z-Met-的介入序列而連接的N末端為半胱胺酸之第1多胜肽片段及第2多胜肽片段之多胜肽與CNBr反應，而得N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段與第3多胜肽片段的步驟，與將第3多胜肽片段與下述式(I)表示的化合物及下述式(II)表示的化合物依序反應，而得C末端被修飾的第2多胜肽片段的步驟。　□□
    公开号:TW201321400A
    申请号:TW101135056
    申请日:2012-09-25
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Yasuhiro Kajihara；ryo Okamoto；Motoharu Kimura；Kazuyuki Ishii
    申请人:Glytech Inc；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    適於NCL法之多胜肽片段之有效率的製造方法
    本發明是關於適合於NCL法(天然化學連接法(Native Chemical Ligation))的多胜肽片段之有效率的製造方法。
    對蛋白質的合成，已知有生物合成，化學合成，無細胞合成等種種方法。在生物合成方法中，利用大腸菌等的細胞內，將編碼作為合成目的之蛋白質的DNA導入於細胞內使其表現，而得蛋白質。化學合成是將胺基酸以有機化學的方法依序鍵結，而合成目的之蛋白質。又，無細胞合成是利用存在於大腸菌等的各種細胞內的酶等，以無細胞的方法合成蛋白質。這些方法，可視蛋白質的使用目的，大小，要加成的性質等而適宜，分別選用，或組合。
    在胺基酸序列的中間部分，要合成均勻地具有糖鏈或脂質等的特定修飾的蛋白質時，使用的方法是將含有糖鏈的胜肽片段，與不含糖鏈的胜肽片段各分別合成，以連接法(ligation)合成最後的蛋白質。含糖鏈的胜肽片段的合成，可使用預先經以糖鏈或脂質等修飾的胺基酸而化學合成。有不含糖鏈部分的胜肽片段的合成，可使用化學合成或生物合成而製造。
    化學合成胜肽鏈的方法而言，主要使用固相合成法。但固相合成法所得的胜肽鏈，一般是短鏈，最長也不過是50個殘基左右。因此要合成長鏈的胜肽鏈時，使用生物合成為理想。
    胜肽鏈連接手法而言有各種各樣的手法的報告，廣被使用的方法之一就是天然型化學的連接法(Native Chemical Ligation，NCL)。NCL法已知在無保護的胜肽鏈間也可進行，要在連接部位(ligation部位)生成天然醯胺鍵結(胜肽鍵結)的有用的方法(例如，專利文獻1)。NCL法是在C末端有α羧硫酯部分的第1胜肽與在N末端有半胱胺酸殘基的第2胜肽之間的化學選擇反應，半胱胺酸側鏈的硫醇基(SH基，也稱為巰基)與硫酯基的羰基碳選擇性地反應，經由硫醇基交換反應，生成硫酯鍵結初期中間物。此中間物進行自發性分子內轉位，在連接部位產生天然醯胺鍵，另一方面，使半胱胺酸側鏈硫醇再生。
    此方法是只使用無保護的胜肽在緩衝溶液中混合，而可經由胜肽鍵結將二個胜肽鏈連接的手法。NCL法是如胜肽的有多數官能基的化合物間的反應，也可選擇性地將一方的胜肽C末端與他方的胜肽N末端連接。由如此觀點，要將蛋白質化學合成時，如何利用NCL法成為很重要。
    但在利用NCL法時的問題點而言，可舉做為原料而必需的，在C末端有α羧硫酯部分的胜肽硫酯體的調製。胜肽硫酯的調製法，有各種各樣的方法的報告(例如，非專利文獻1及專利文獻2)，任何的手法都是，以固相合成法做為基礎，受固相合成的限制所束縛，因而能合成的胜肽硫酯體的大小受限制。再者，使用連接子的手法則需要將非天然型的胺基酸衍生物，或特別的衍生物另行化學合成，其步驟未必是簡便的。
    另一方面，有以細胞生物合成的多胜肽片段做為硫酯體而得的方法(內含蛋白(Intein)法)的報告(非專利文獻2)，但使用此方法時，不只是使多胜肽表現，要使蛋白質有發揮剪接(splicing)功能，則需要有成為標靶的胜肽序列，又所表現的內含蛋白複合蛋白質必需摺疊(folding)，採取固有的三維構造。因此，視所要表現的多胜肽序列，未必能得到胜肽硫酯，經常有需要做充分條件的最適化，附帶作業上的麻煩複雜性。
    又，與Intein法之外，也有可適用於生物合成的多胜肽的硫酯體的製造方法的報告(專利文獻3)。此方法是將所合成的多胜肽所含的半胱胺酸活性化，而將活性化的半胱胺酸的位置做為硫酯體而切取的方法。即，可將所活性化的半胱胺酸的N末端的胜肽片段做為硫酯體而得。但，用此方法時，所活性化的半胱胺酸在C末端被切取的多胜肽，在切取時其N末端形成化學性安定的環狀構造，不能使用於之後的蛋白合成。因此，N末端的胜肽片段需要另外製造成為可連接的胜肽片段。
    又，在生物合成中，全長的蛋白質雖能正常表現，但胜肽片段的情況時在細胞中會被認識有錯誤，被分解等有不能正常表現的情況。於是，在將全長蛋白質生物合成之後，以上述方法將需要的胜肽片段做為硫酯體切取時，所切取的胜肽片段不能利用C末側的長鏈的多胜肽。 [先前技術文獻] [專利文獻]
    [專利文獻1]國際公開第96/34878號小冊
    [專利文獻2]國際公開第2007/114454號小冊
    [專利文獻3]國際公開第2010/150730號小冊 [非專利文獻]
    [非專利文獻1]Ingenito et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11369-11374
    [非專利文獻2]Schwartz et al., CHEM. COMMUN., 2003, 2087-2090
    本發明的目的是提供一種適於NCL法、有效率地製造N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段與C末端被修飾的第2多胜肽片段的方法。
    本發明者等，為了要解決上述課題而累積研究的結果，發現：將第1多胜肽片段與第2多胜肽片段經由特定的序列，製成為1個多胜肽，則可以有效率地製造適於NCL法，N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段與C末側被修飾的第2多胜肽片段。
    即，本發明是關於適於NCL法之有效率地製造N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段與C末側被修飾的第2多胜肽片段的方法。該方法含有以下的步驟：(1)具有以下的構造的多胜肽與CNBr反應：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met-第1多胜肽片段(C末側)[在此n表示0至10的整數，Cys表示半胱胺酸，W表示任意的1，2或3個的胺基酸，Z表示任意的0，1，或2個的胺基酸，His表示組胺酸，Met表示甲硫胺酸。又，第1多胜肽片段的N末端是半胱胺酸。]得以下多胜肽片段的步驟；(A)N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段；(B)有以下的構造的第3多胜肽片段：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met'(C末側)[在此，Met’表示，Met的衍生物。](2)前述第3多胜肽片段，與下述式(I)表示的化合物反應： [式中，X是硫原子或氧原子，R1及R2是脫離基。]
    繼而，在有機溶媒中，與下述式(II)表示的化合物反應： [式中，Y是氧原子，硫原子，或=NH，R3是氫原子，醯基，或烷氧羰基。]藉以獲得具有以下構造的C末側被修飾的第2多胜肽片段的步驟：(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-NH-C(=Y)NHR3(C末側)
    在此，本發明的製造方法的一實施態樣中，再含有下述的步驟為特徵：在前述(2)的步驟中所得的C末側被修飾的第2多胜肽片段，與下述式表示的硫醇反應：R4-SH[式中，R4是由有取代或無取代的苄基，有取代或無取代的芳基，及有取代或無取代的烷基所成之群中所選擇的任一個基。]
    將C末側的-NH-C(=Y)NHR3基與硫醇基交換，藉以獲得具有以下的構造的C末側被修飾第2多胜肽片段：(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-SR4(C末側)。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，前述式(I)表示的化合物的X是硫原子為特徴。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，前述式(I)表示的化合物的R1是-O-C6芳基為特徴。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，前述式(I)表示的化合物的R2是鹵原子，或有取代或無取代的-S-C6-10芳基為特徴。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，前述式(II)表示的化合物的Y是=NH為特徴。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，前述式(II)表示的化合物的R3是乙醯基為特徴。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，前述，有以下的構造的多胜肽：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met-第1多胜肽片段(C末側)是由細胞表現的重組型多胜肽片段為特徴。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，前述細胞是大腸菌為特徴。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，W是1個胺基酸，且為由Val，Ile，Leu，Trp所成之群中所選擇的任一個胺基酸為特徴。
    又，在本發明的製造方法的一實施態樣中，n是6至10為特徴。
    又，本發明的別的態樣是關於製造適於NCL法，N末側是半胱胺酸的第1多胜肽片段的製造方法，係將有以下的構造的多胜肽與CNBr反應為特徴：(N末側)第2多胜肽片段-P-Met-第1多胜肽片段(C末側)[在此，P是任意的0至10個的胺基酸，Met表示甲硫胺酸，第1多胜肽片段的N末側是半胱胺酸。]
    又，本發明的別的態樣是關於含有下列步驟的糖鏈加成多胜肽的製造方法：(1)將要製造的所希望的糖鏈加成多胜肽的胜肽序列，至少分類而設計成如下所示的多胜肽片段的步驟：‧包括含有糖鏈加成的胺基酸的多胜肽之含有糖鏈多胜肽片段，‧包括含有比含有糖鏈多胜肽片段在較靠N末側的所希望的糖鏈加成胜肽的N末側的多胜肽之第2多胜肽片段，‧包括含有比含有糖鏈多胜肽片段在較靠C末側的所希望的糖鏈加成胜肽的C末側的多胜肽之第1多胜肽片段，‧可以存在時，在含有糖鏈多胜肽片段與第2多胜肽片段之間的多胜肽片段，‧可以存在時，在含有糖鏈多胜肽片段與第1多胜肽片段之間的多胜肽片段；在此，第1多胜肽片段的N末端是設計為半胱胺酸，(2)使用含有編碼具有以下構造的多胜肽的核苷酸序列的表現載體(expression vector)，並由大腸菌表現，而取得具有前述構造的多胜肽的步驟：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met-第1多胜肽片段(C末側)[在此，n表示0至10的整數，Cys表示半胱胺酸，W表示任意的1，2或3個胺基酸，Z表示任意的0，1，或2個的胺基酸，His表示組胺酸，Met表示甲硫胺酸。又，第1多胜肽片段的N末端是半胱胺酸。](3)將在步驟(2)所得的多胜肽與CNBr反應，而獲得以下的多胜肽片段的步驟；(A)N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段(B)具有以下的構造的第3多胜肽片段：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met'(C末側)(在此，Met’表示Met的衍生物。)(4)前述第3多胜肽片段與下述式(I)表示的化合物反應： [式中，X是硫原子或氧原子，R1及R2是脫離基。]繼而，在有機溶媒中，與下述式(II)表示的化合物反應： [式中，Y是氧原子，硫原子，或NH基，R3是氫原子，醯基，或烷氧羰基。]，藉以獲得具有以下構造的C末側被修飾的第2多胜肽片段的步驟：(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-NH-C(=Y)NHR3(C末側)；(5)任意地在前述(4)的步驟中所得的C末側被修飾的第2多胜肽片段，再與下述式表示的硫醇反應：R4-SH[式中，R4是由有取代或無取代的苄基，有取代或無取代的芳基，及有取代或無取代的烷基所成之群中所選擇的任一個基。]
    並將C末側的-NH-C(=Y)NHR3基與硫醇基交換，藉以獲得具有以下的構造的C末側被修飾的第2多胜肽片段的步驟；(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-SR4(C末側)(6)將以化學的方法合成而另外調製的‧前述含有糖鏈多胜肽片段，‧可以存在時，在含有糖鏈多胜肽片段與第2多胜肽片段之間的前述多胜肽片段，‧可以存在時，在含有糖鏈多胜肽片段與第1多胜肽片段之間的前述多胜肽片段，與，在步驟(3)中所得的N末端為半胱胺酸之第1多胜肽片段與在步驟(4)或(5)中所得的C末側被修飾的第2多胜肽片段，以能得到所希望的糖鏈加成多胜肽的順序，以連接(Ligation)法鍵結的步驟。
    又，在本發明的糖鏈加成多胜肽的製造方法的一實施態樣中，前述式(I)表示的化合物的X是硫原子為特徴。
    又，在本發明的糖鏈加成多胜肽的製造方法的一實施態樣中，前述式(I)表示的化合物中的R1是-O-C6芳基為特徴。
    又，在本發明的糖鏈加成多胜肽的製造方法的一實施態樣中，前述式(I)表示的化合物的R2是鹵原子，或有取代或無取代的-S-C6-10芳基為特徴。
    又，在本發明的糖鏈加成多胜肽的製造方法的一實施態樣中，前述式(II)表示的化合物Y是=NH為特徴。
    又，在本發明的糖鏈加成多胜肽的製造方法的一實施態樣中，前述式(II)表示的化合物R3是乙醯基為特徴。
    又，在本發明的糖鏈加成多胜肽的製造方法的一實施態樣中，W是1個胺基酸，且為由Val，Ile，Leu，Trp所成之群中所選擇的任一個胺基酸為特徴。
    又，在本發明的糖鏈加成多胜肽的製造方法的一實施態樣中，n是6至10為特徴。
    由本發明，提供一種適於NCL法之由多胜肽鏈有效率地製造N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段，及C末側被修飾的第2多胜肽片段的方法。
    又，本發明是即使做為胜肽片段不能正常地表現，也以胜肽片段與其他的胜肽片段連接的狀態，可使用連接使其表現，可有效率地製成被數個胜肽片段。
    又，將本發明的方法與以往的胜肽合成法併用，而即使是以往合成困難的在胜肽的一部分有修飾的長鏈胜肽，例如，使用本發明的方法，將沒有修飾的部分以容易產生比較長鏈的生物合成法製成片段，有修飾的部分則使用固相合成法製成片段，將這些連接而可簡便地製造。
    更具體而言，如果修飾是糖鏈時，只將含有天然鍵結型的糖鏈加成的胺基酸的片段以化學合成，其他的部分則以生物合成調製，以本申請案的方法將適合於連接的胜肽片段製成，連接，而可簡便製造長鏈的糖鏈胜肽。
    又，經由連接子在胜肽鏈後加成糖鏈等的方法是公知的，這在生物合成的長鏈胜肽也可以做糖鏈之後加成。但，經由連接子的糖鏈鍵結方法是利用特定的胺基酸及構造而將糖鏈等鍵結者。因此，例如，在胜肽中可以鍵結糖鏈的部位有複數個存在時，以生物合成得長鏈胜肽之後，將只含所希望的鍵結部位的胜肽片段，使用本案的方法由長鏈胜肽切出而加成糖鏈，與其餘的部分重新連接，也可以比以往較簡便地在選擇部位加成糖鏈。
    如以上所述，本發明的胜肽硫酯化方法在蛋白質合成的總體中有用。
    第1圖係表示在本發明的一實施的形態中，使用於多胜肽的表現的pET32a載體的序列資訊圖。
    第2圖係在本發明的一實施的形態中，表示使用大腸菌的具有本發明的介入序列的多胜肽片段的生物合成的模式圖。
    第3圖係表示將經表現的蛋白以Ni管柱精製時的照片圖。第3圖中，M=分子量標誌，E=經表現的混合物，P=通過管柱部分，1至8是以250mM咪唑的溶出分液編號，B=空白組。
    第4圖係在本發明的一實施的形態中，將以大腸菌表現的具有介入序列的多胜肽片段，使用CNBr分割成為2個多胜肽片段的步驟的流程圖。再者，在以大腸菌表現的多胜肽片段的N末端，經由甲硫胺酸而加成硫氧化還原蛋白，在CNBr的處理時，硫氧化還原蛋白也被切離。
    第5a圖表示將CNBr處理後的分解物以HPLC分析的結果。第5b圖表示有介白素-13衍生物的第1至第27個的胺酸的胜肽片段A的質量分析結果。第5c圖表示有介白素-13衍生物的第56個至第112個的胺基酸的胜肽片段D的質量分析結果。
    第6圖係利用本發明的適於NCL法的多胜肽片段製造方法的一實施的形態，將介白素-13衍生物分成4個多胜肽片段，生物合成為片段A與片段D之具有介入序列的融合蛋白質的流程的模式圖。
    以下，說明本發明的合適的實施形態。
    本發明是將含有以下構造的多胜肽(i)與CNBr反應：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met-第1多胜肽片段(C末側)‧‧‧‧(i)[在此，n表示0至10的整數，Cys表示半胱胺酸，W表示任意的1，2或3個胺基酸，Z表示任意的0，1，或2個胺基酸，His表示組胺酸，Met表示甲硫胺酸。又，第1多胜肽片段的N末端是半胱胺酸。]而得以下的多胜肽片段步驟。(A)N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段(B)有以下的構造的第3多胜肽片段(ii)：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met'(C末側)‧‧‧‧(ii)[在此，Met’表示Met的衍生物。]
    在本說明書中，「胜肽」就是有2個以上的胺基酸經由醯胺鍵而鍵結則無特別的限定，含公知胜肽及新穎胜肽以及胜肽改質體。一般稱為蛋白質的物質，在本發明中也將其包含在胜肽中。又，在本發明中，「多胜肽」也同樣包含在胜肽中。本發明的方法所用的胜肽鏈，可為天然的蛋白質，也可為以生物合成，化學合成或無細胞合成等方法而得的胜肽鏈。
    在本說明書中，「胜肽改質體」就是包含胜肽的自然變異體，轉譯後修飾體，或以人工方法改質的化合物。如此改質而言，例如，可舉胜肽的1或複數個的胺基酸殘基的烷化，醯化(例如乙醯化)，醯胺化(例如，胜肽的C末端的醯胺化)，羧化，酯形成，二硫化鍵形成，糖基化，脂質化，磷酸化，氫氧化，標識成分的鍵結等。
    本說明書中，「胺基酸」就是以其最廣的意義而使用，包含不只是天然的胺基酸，例如絲胺酸(Ser)，天冬醯胺酸(Asn)，纈胺酸(Val)，白胺酸(Leu)，異白胺酸(Ile)，丙胺酸(Ala)，酪胺酸(Tyr)，甘胺酸(Gly)，離胺酸(Lys)，精胺酸(Arg)，組胺酸(His)，天冬醯胺酸酸(Asp)，麩胺酸(Glu)，麩醯胺酸(Gln)，蘇胺酸(Thr)，半胱胺酸(Cys)，甲硫胺酸(Met)，苯丙胺酸(Phe)，色胺酸(Trp)，脯胺酸(Pro)，也包含胺基酸變異體及衍生物等非天然胺基酸。如是此項技術領域者，考慮此廣義的定義，則應可理解在本發明中的胺基酸，例如可舉L-胺基酸；D-胺基酸；胺基酸變異體及衍生物等的經化學修飾的胺基酸；正白胺酸，β-丙胺酸，鳥胺酸等在生體內不會成為蛋白質的構成材料的胺基酸；及此項技術領域者公知的具有胺基酸特性的以化學方法合成的化合物等。
    本說明書中，「多胜肽片段」就是合成目的蛋白質時被製造，含有目的蛋白質的胺基酸序列的一部分的多胜肽。
    在此，「第1多胜肽片段」及「第2多胜肽片段」就是各分別含有目的蛋白質的胺基酸序列的一部分的片段。本發明中，「第1多胜肽片段」及「第2多胜肽片段」是以經由介入序列而連接的狀態而被合成。又，本發明的方法中，「第1多胜肽片段」及「第2多胜肽片段」是最後分別可以適合於連接的形態的多胜肽片段獲得。
    又，第1多胜肽是設計為在其N末端含有半胱胺酸的多胜肽。如此在最後，成為第1多胜肽片段而切出時，在N末側與其他的胜肽片段可以連接。又，第2多胜肽片段是最後成為第2多胜肽而被切出時，C末側被修飾成為適合於連接的形態，在C末側可以連接其他的多胜肽片段。
    又，本發明的多胜肽(i)是在第1多胜肽片段與第2多胜肽片段之間，有「(N末側)-Cys-W-(His)n-Z-Met-(C末側)」的介入序列。
    在此，n是表示0至10的整數，Cys表示半胱胺酸，W表示任意的1，2或3個胺基酸，Z表示任意的0，1，或2個胺基酸，His表示組胺酸，Met表示甲硫胺酸。又，第1多胜肽片段的N末端是半胱胺酸。
    又，多胜肽(i)是其N末側及/或C末側中，經由上述介入序列，再跟別的多胜肽片段連接也可以。
    介入序列中，做為W表示的胺基酸而言，含由Val，Ile，Leu，Trp所成之群中所選擇的任一個胺基酸為理想，特別是，直接鄰接於N末側的Cys的胺基酸是由這些胺基酸所選擇為理想。如此，將高容積的胺基酸鄰接於Cys，則在後述的使用式(II)表示的化合物的反應(b)中，可抑制副反應的發生率，可提高目的之C末側被修飾的第2多胜肽的收率。
    又，介入序列中，(His)n表示組胺酸標籤(His tag)，係使經生物合成的多胜肽的精製容易者。組胺酸標籤加成的多胜肽的精製，可用該行業者周知的方法進行，例如，可使用商品的Ni-NTA瓊脂糖凝膠而容易精製。
    再者，上述介入序列中沒有組胺酸標籤時(n=0時)，也可將組胺酸標籤在多胜肽(i)的N末側或C末側加成而表現。介入序列具有組胺酸標籤時，n的理想是6至10的整數。
    又，介入序列中，Met是將在此Met更靠C末側存在的第1多胜肽切離時使用的胺基酸。
    將生物合成所得的多胜肽(i)在Met的位置切離時，例如，使用CNBr，70%HCOOH水溶液，而可在室溫處理。再者，要處理的胜肽序列中，在側鏈有OH基的Ser或Thr含多量時，側鏈的甲酸酯成為問題。這種情況時，為了避免酯化，應進行降低反應溶液的甲酸的含有量，使用無機酸，為了產生可以容易除去的三氟乙酸酯起見而使用TFA等應對為理想。
    上述反應中使用的理想的酸而言，例如，可舉甲酸，磷酸，三氟乙酸(TFA)，三溴乙酸，甲烷磺酸，但並不限定於這些。這些酸是以0.1%至50%的濃度加入為理想，較理想是1%至20%，更理想是1%至5%。
    又在上述反應中也可使用水混合性溶劑。水混合性溶劑只要是具有水混合性的溶劑則無特別限定，例如，可舉乙腈，三氟乙醇，二甲基甲醯胺，二甲基亞碸(DMSO)，氯化甲烷等，其中尤以乙腈，三氟乙醇，二甲基甲醯胺為理想。這種溶劑，以1%至70%的濃度加入為理想，較理想是20%至60%，更理想是35%至50%。
    如此，在酸與水混合性溶劑的存在下切斷，則可提高目的多胜肽的產生率。
    再者，由上述反應，在Met的位置將多胜肽(i)切離時，可得在N末側的有第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met’的胺基酸序列多胜肽片段，及在C末側的第1多胜肽片段。
    又，Met’表示Met的衍生物，表示在如上述的切斷反應生成的Met的衍生物。
    本發明的多胜肽(i)所含的「第1多胜肽片段」及「第2多胜肽片段」，基於胺基酸序列的長度或胺基酸的種類，可適宜設計理想片段。本發明中，在設計多胜肽片段時，特別是做為第1多胜肽片段而生物合成的多胜肽片段，設計在其N末端有半胱胺酸。
    本發明的多胜肽(i)，可為天然的蛋白質，也可為以生物合成，化學合成或無細胞合成等方法而得的胜肽鏈，理想是在菌體或細胞內表現的重組型蛋白質。重組型蛋白質只要是以人為在菌體內或細胞內表現即可，可為具有與天然蛋白質相同胜肽序列，也可為具有變異或精製用的標籤等的修飾的胜肽序列。
    本發明的多胜肽(i)，可以此項技術領域者公知的方法調製。例如，可在重組型載體導入目的之基因而使其表現。在本發明使用的重組型載體而言，只要能將宿主細胞形質轉換即可，視宿主細胞如何而可使用大腸菌用的質體，枯草菌用的質體，酵母用的質體，反轉錄病毒(retrovirus)，牛痘病毒(vaccinia virus)，桿狀病毒(baculovirus)等動物病毒載體等。這些中，在其宿主細胞中有適當地能將蛋白質表現的啟動子(promotor)等控制序列的載體為理想。又，宿主細胞而言，以重組型載體能將外來性基因表現即可，一般而言，可使用大腸菌，枯草菌，酵母，昆蟲細胞，動物細胞等。
    對宿主細胞將重組型載體移入的方法而言，使用一般常用的方法即可，例如，大腸菌的情況時，可利用熱刺激(heat shock)法，氯化鈣法或電穿孔法(electroporation)，酵母的情況時可利用氯化鋰法或電穿孔法。又，動物細胞的形質轉換，可使用電穿孔等物理的方法，或，脂質體法或磷酸鈣法等化學的方法，或反轉錄病毒等的病毒載體而進行。又，載體導入後是，以此項技術領域者周知的方法，確認目的之DNA序列有正確編入為理想。形質轉換體的宿主細胞的培養形態，考慮宿主的營養生理學性質而選擇培養條件即可。
    在本發明使用的胜肽是經過精製為理想。胜肽的精製方法可以用通常的一般性的精製法進行。例如，如是重組型蛋白質時，將表現在本發明使用的重組型蛋白質的菌體或細胞培養後，以公知的方法收集菌體或細胞，將此以適當的緩衝液懸浮，以超音波，溶菌酶及/或冷凍融解等而破壞菌體或細胞後，以離心分離或過濾而調製胜肽的粗抽出液。緩衝液中可以含有尿素或鹽酸胍等蛋白質變性劑，或TritonX-100TM等界面活性劑。如此所得的抽出液，或培養上澄液中所含的胜肽的精製，可用公知的精製方法進行。例如，將親和層析法，離子交換層析法，過濾器，超濾法，凝膠過濾，電泳法，鹽析，透析等適宜選擇，組合，而可進行胜肽的分離，精製。
    又，為了使重組型蛋白質的精製容易起見，在表現載體編入種種的標籤也可以。標籤之例而言，提高表現效率的標籤，提高精製效率的標籤等，可使用此項技術領域周知的標籤，例如可舉，硫氧化還原蛋白，GST標籤，Myc標籤，FLAG標籤，麥芽糖鍵結蛋白(MBP)等。
    又，這些標籤也可經由多胜肽(i)與Met(甲硫胺酸)連接。如此經由甲硫胺酸將標籤連接於多胜肽(i)而製成，則將第1多胜肽片段與第2多胜肽片段以甲硫胺酸做為標靶而切離時，同時可將標籤切離。
    又，不做為多胜肽(i)製成的，其他的蛋白質合成所必需的多胜肽片段的合成，則可使用在該技術領域已知的任意的化學合成法。特別是，糖鏈鍵結部分的多胜肽鏈的合成是為了要製造有均一的糖鏈構造的胜肽片段起見以化學合成為理想，這種手法而言，並無限定，例如可舉，液相合成法，固相合成法，Boc法，Fmoc法等。更具體而言，可使用做為糖鏈加成的胺基酸而使用糖鏈加成Asn，與通常的胜肽片段合成同樣，適用固相合成，液相合成等公知的胜肽合成方法而製造糖鏈加成胜肽片段的方法。這種方法，在國際公開第2004/005330號小冊(US2005222382(A1))中有說明，其所述內容整體在本說明書中參照而編入。
    又，做為目的之蛋白質的胺基酸序列中，製造在N末側及C末側有必需連接的胜肽片段時，為避免連接的副生成物，N末側的半胱胺酸，先要以噻唑啉型(thiazolidine type)的半胱胺酸或以Acm基等保護的半胱胺酸連接。即，連接製程是，由做為目的之蛋白質的C末側的胜肽片段進行連接，將連接完成的胜肽片段的N末端的半胱胺酸恢復成為可連接的狀態，依序在蛋白質的N末側將胜肽片段進行連接。例如，導入噻唑啉型的半胱胺酸時，在固相合成時導入也可以，以此項技術領域者周知的方法在多胜肽片段的合成後選擇性地將半胱胺酸噻唑啉化也可以。
    又，也可在所合成的多胜肽鏈經由鍵結基加成糖鏈。這種糖鏈的鍵結，可以使用該技術領域已知的任意的手法。這種手法而言，並無限定，例如可舉，將在還原末端具有由-NH-(CO)-CH2X，-NH-(CO)-(CH2)b-CH2X，異硫氰酸酯基，-NH-(CO)a-(CH2)b-CO2H及-NH-(CO)a-(CH2)b-CHO(式中，X表示鹵原子，a是0或1，b是1至4的整數)所成之群中所選擇的基的糖鏈衍生物與半胱胺酸的巰基縮合的方法(參照WO2005/010053)，或WO2005/095331所說明的使用鍵結劑的方法等。
    又，以上述方法，做為目的之胜肽的一部分的片段所製造的胜肽片段，為了要用於連接製程，而在連接製程之前必需有將位置N末側的多胜肽的C末端硫酯化的製程。這種硫酯化，可以使用此項技術領域者周知的方法實施，例如，將C末端的羧酸用PyBOP及DIPEA活性化，加過剰量的烷硫醇基而達成。使用此手法時，為了抑制在片段末端的胺基酸的α碳的立體配置，烷硫醇基的添加要在低溫進行為理想，較理想是10℃至-80℃，更理想是在0℃至-40℃的溫度進行。又，上述硫酯化是，使用Yamamoto et al.,J.Am.Chem.Soc.2008,130(2),501-510所說明的Fmoc法或Boc法等也可進行。
    本發明中，「胜肽硫酯體」(以下，有時只稱為硫酯體)就是指在C末端有羧硫酯部分(-C=O-SR)的胜肽而言。在本發明使用的胜肽硫酯體，只要能與其他的硫醇基可產生交換反應的硫酯體，則無特別的限定。R基而言，例如，可舉下述的R4所例示基。
    如此合成的本發明的多胜肽(i)，在介入序列中的Met的位置切離，而可得以下的多胜肽片段。(A)N末側是半胱胺酸的第1多胜肽片段(B)有以下構造的第3多胜肽片段(ii)(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met’(C末側)‧‧‧‧(ii)[在此，Met’表示Met的衍生物。]
    再者，在多胜肽(i)的N末側及/或C末側中，經由上述介入序列，再有別的多胜肽片段連接時，例如，再可得下述多胜肽片段。(B’)(N末側)多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met’(C末側)
    如上述而得的(A)N末側為半胱胺酸的第1多胜肽片段，可與C末端具有硫酯的胜肽連接。因此，本發明也提供一種多胜肽的製造方法，係含有以本發明的方法所得的N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段，與C末端有硫酯的胜肽以連接法鍵結的製程。
    在此，本發明的方法包含下述步驟：將多胜肽(i)切離而得的第3多胜肽片段(ii)，與以下述式(I)表示的化合物反應： [式中，X是硫原子或氧原子，R1及R2是脫離基。]繼而，在有機溶媒中，與下述式(II)表示的化合物反應： [式中，Y是氧原子，硫原子，或，=NH，R3是氫原子，醯基，或烷氧羰基。]
    而得有以下構造的C末側被修飾的第2多胜肽片段：(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-NH-C(=Y)NHR3(C末側)
    上述的步驟，首先，在有半胱胺酸殘基的第3多胜肽片段(ii)中，在前述半胱胺酸殘基的硫醇基與式(I)表示的化合物反應(反應a)，而製成第1中間物的製程。
    在反應(a)中使用的化合物是以下的式(I)表示。
    式中，X是硫原子或氧原子，但理想是硫原子。
    R1及R2是做為脫離基，在反應(a)的條件下，如比被取代的原子或原子團的求核性低，而有脫離功能者則無特別的限定，但R1及R2是各分別是不同的脫離基為理想。做為R1及R2具體而言，可舉鹵原子，有取代或無取代的-O-烷基，有取代或無取代的-O-烯基，有取代或無取代的-O-炔基，有取代或無取代的-O-芳基，有取代或無取代的-O-雜芳基，有取代或無取代的-S-烷基，有取代或無取代的-S-烯基，有取代或無取代的-S-炔基，有取代或無取代的-S-芳基，或有取代或無取代的-S-雜芳基。做為R1及R2較理想的組合可舉R1是由有取代或無取代的-O-C6-10芳基及有取代或無取代的-S-C1-8烷基所成之群中所選的脫離基，及，R2是由鹵原子，有取代或無取代的-S-C1-8烷基，有取代或無取代的-S-C6-10芳基所成之群中所選的脫離基。
    本發明中，「烷基」是由脂肪族烴除去任意的1個氫原子而衍生的一價基，是含有氫及碳原子的烴基或具有烴的部分集合。烷基是含直鏈狀或支鏈狀的構造。做為本發明的烷基而理想的可舉碳原子數是1至8的烷基。再者，「C1-8烷基」就是表示碳原子數是1至8的烷基，具體例而言，可舉甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，庚基，辛基等。
    本發明中，「烯基」就是至少有1個雙鍵的1價基。依雙鍵及取代基的配置，雙鍵的幾何學的形態，可採取異側(E)或同側(Z)，順或反配置。烯基是含直鏈狀或支鏈狀。做為本發明的烯基而理想可舉碳原子數是2至8的烯基。「C2-8烯基」就是表示碳原子數是2至8的烯基，具體例而言，可舉乙烯基，烯丙基(allyl)，丙烯基(propenyl)，丁烯基，戊烯基，己烯基，庚烯基，辛烯基等。
    本發明中，「炔基」就是至少有1個參鍵的1價基。炔基是含直鏈狀或支鏈狀的炔基。做為本發明的炔基而理想可舉碳原子數是2至8的炔基。「C2-8炔基」就是表示碳原子數是2至8的炔基，具體例而言，可舉乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔基，庚炔基，辛炔基等。
    本發明中，「芳基」就是表示芳香族性的烴環式基。本發明的芳基而理想可舉碳原子數是6至10的芳基。「C6-10芳基」就是表示碳原子數是6至10的芳基，具體而言，例如可舉，苯基，1-萘基，2-萘基等。
    本發明中，「雜芳基」就是表示由雜芳環除去任意位置的1或2個氫原子所衍生的1價或2價基。本發明中，「雜芳環」就是表示構成環的原子中含有1或複數個雜原子的芳香族性環，理想是5至9員環。環可為單環，也可為苯環或與單環雜芳環縮合的2環式雜芳基。具體例而言，可舉呋喃基，噻吩基，吡咯基，苯並呋喃基，苯並噻吩基，吲哚基，吡啶基，喹啉基等。
    上述的脫離基所有的取代基的種類，個數，取代位置並無特別的限定，做為取代基而言，例如可舉，烷基，烯基，烷氧基，芳基，甲醯基，羰基，羧基，烷羧基，烷氧羰基，鹵原子，磺醯基，或硝基等。
    做為本發明的式(I)表示的化合物而言，更具體而言，可舉：
    再者，也可使用上述的， 與MPAA((4-羧甲基)硫酚)反應的下述硫甲醯酯化試劑，
    將式(I)表示的化合物與第3多胜肽片段(ii)的半胱胺酸殘基反應，可得如下圖之半胱胺酸殘基中的SH基鍵結-C(=X)-R1基的第1中間物。
    在本發明中，反應(a)是在酸性條件下為理想，特別是在pH3至5進行為理想。反應是在緩衝液與乙腈的混合溶媒中，在0至50℃，理想是在15至25℃，進行約0.1至3小時，理想是進行10分鐘至1小時為理想，但不受其限定。
    其次，在本發明的方法中，在有機溶媒中，進行在前述第1中間物與式(II)表示的化合物反應，在形成鄰接於前述半胱胺酸殘基的N末側的胺基酸之間的胜肽鍵結的羧基上加成-NH-C(=Y)NHR3基，將前述胜肽鍵結切斷，可將比所切斷的前述胜肽鍵結較在N末側的胜肽片段做為第2中間物而得的製程(反應(b))。
    上述反應(b)中使用的化合物是以下的式(II)表示。
    式中，Y是氧原子，NH基，或硫原子，R3是，氫原子，醯基，或烷氧羰基。
    本發明中，「醯基」就是表示由羧酸的羧基除去OH基的原子團。做為本發明的醯基而言，理想是可舉碳原子數是1至5的醯基。具體而言，例如可舉，乙醯基，三甲基乙醯基，丙醯基，丁醯基等。
    本發明中，「烷氧基」就是表示有「烷基」鍵結的氧基。本發明的烷氧基可為直鏈狀也可為支鏈狀。本發明的烷氧基理想是可舉碳原子數是1至14的直鏈狀烷氧基或碳原子數是3至14個的支鏈狀烷氧基。具體而言，例如可舉，甲氧基，乙氧基，正丙氧基，異丙氧基，正丁氧基，2-甲基-2-丙氧基，正戊氧基，正己氧基等。
    又，「C2-n烷氧羰基」就是表示有C1-(n-1)的烷氧基的羰基。本發明的烷氧羰基理想是可舉碳原子數是2至15的烷氧羰基。具體而言，例如可舉甲氧羰基，乙氧羰基，正丙氧羰基，異丙氧羰基，正丁氧羰基，2-甲基-2-丙氧羰基，正戊氧羰基，正己氧羰基等。
    做為醯基理想是可舉乙醯基。又，做為烷氧羰基理想是可舉三級丁氧羰基(Boc基)。
    做為本發明的式(II)表示的化合物，更具體而言，可舉下列化合物等：
    本發明中，反應(b)是在有機溶媒的存在下中進行為理想。有機溶媒是溶解性高，且求核性低的溶媒為理想。這種有機溶媒而言，例如可舉，DMSO，DMF，二噁烷等。反應是在0至50℃，理想是15至25℃，進行約1至24小時，理想是5至10小時為理想，但不限定於這些。
    在鄰接於半胱胺酸殘基的N末側的胺基酸之間形成胜肽鍵結的羧基加成-NH-C(=Y)NHR3基，如下圖，胜肽鏈在半胱胺酸殘基的N末側被切斷。
    再者，胜肽的側鏈上有胺基時，在進行本發明的反應(b)之前，在側鏈的胺基導入脂溶性的保護基也可以。脂溶性保護基而言，例如可舉，9-芴基甲氧羰(Fmoc)基，三級丁氧羰(Boc)基，烯丙氧羰(Alloc)基等含羰基，乙醯(Ac)基等醯基，烯丙基，苄基等保護基，但並不特別限定於這些。
    要將脂溶性保護基導入時，例如要導入Fmoc基時，加入9-芴基甲基-N-羥基丁二醯亞胺碳酸酯(9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate)及碳酸氫鈉進行反應而可導入。反應是在0至50℃，理想是在室溫，進行約1至5小時左右為佳，但不受限定。
    反應(b)中，可將比被切斷的胜肽鏈的切斷部更靠N末側的胜肽片段作為如下述式(III)的第2中間物。
    本發明的胜肽硫酯體的製造方法是再含有將前述第2中間物與硫醇基反應，將C末端的-NH-C(=Y)NHR3基與硫醇基交換，而將第2中間物的C末端硫酯化的製程(反應(c))。
    在反應(c)所用的第2中間物可在反應(b)的後單離，也可不單離。
    在理想態樣中，在前述反應(c)中，使用以下的式(IV)表示的硫醇基。
    R4-SH (式IV)
    R4是只要不阻礙硫醇基交換反應，在羰基碳上的取代反應中可成為脫離基的基則無特別的限定。理想是，R4是由有取代或無取代的苄基，有取代或無取代的芳基及有取代或無取代的烷基所選擇的任一個基，較理想是由有取代或無取代的苄基，有取代或無取代的C6-10芳基，及，有取代或無取代的C1-8烷基所選擇的任一個基。更具體而言，可由苄硫醇等苄型的脫離基，硫酚，4-(羧甲基)-硫酚等芳型的脫離基，2-巰基乙磺酸基，3-巰基丙酸醯胺等烷型的脫離基等選擇。這些脫離基所有的取代基的種類，個數，取代位置是沒有特別的限定。
    由反應(c)的進行，第2中間物是如下述圖所示會完全變換為硫酯體。
    如上述所得的胜肽硫酯體是在胜肽或被修飾胜肽中，將有-SH基的胺基酸殘基在N末端含有的胜肽(或被修飾胜肽)，可使用連接法連接。因此，本發明也提供一種多胜肽的製造方法，該方法係含有將本發明的方法所得的胜肽硫酯體，與在N末端有半胱胺酸的胜肽鏈用連接法鍵結的製程。
    又，代替上述胜肽硫酯體，而將在前述步驟(b)所得的第2中間物，原封不動使用於連接法也是可能的。這時，可省略成為硫酯體的變換製程之點而為理想。
    在本發明中，「連接法(ligation)」不只是在專利文獻1所說明的天然型化學的連接法(Native Chemical Ligation,NLC法)，也包含對含有非天然胺基酸，胺基酸衍生物(例如，蘇胺酸衍生物A，保護甲硫胺酸，糖鏈加成胺基酸等)的胜肽，應用上述天然型化學的連接法的情況。由連接法，可製造在連接部位有天然醯胺鍵(胜肽鍵結)的胜肽。
    使用連接法的連接可在胜肽-胜肽間，胜肽-被修飾胜肽間，被修飾胜肽-被修飾胜肽間的任一者。
    再者，本說明書中所用的用語是用於說明特定的實施態樣而使用，並無限定發明的意圖。
    又，本說明書中所用的「含」的用語，除開由文脈上可明白地應做不同的理解的情況，是所說明的事項(部材，步驟，要素，數字等)之存在的意圖，不排除此以外的事項(部材，步驟，要素，數字等)的存在。
    除非有不同的定義，這裏所用的全部的用語(含技術用語及科學用語。)，與由本發明所屬技術領域者所廣受理解的意義相同。這裏所用的用語，除非明白的表示有不同的定義，應解釋為與本說明書及在關連技術領域中的意義有整合性的意義，不應被理想化，或，被過度解釋成形式性的意義。
    本發明的實施態樣有時在參照模式圖下說明的情況，但模式圖的情況，為了能明確說明起見，有表現誇張的情況。
    第一，第二等用語被用於表現種種的要素而使用，但可理解這些要素不為這些用語所限定。這些用語是只用於將一個要素與其他的要素區別而使用的，例如，第一的要素當做第二的要素而說明，同樣地，第二的要素當做第一的要素說明就是，在不逸脫本發明的範圍是可能的。
    以下，將本發明參照實施例更詳細說明。但是，本發明是可用各種各樣的態樣具現化，應解釋為不受在這裏說明的實施例所限定。 [實施例]
    下述實施例中，陳述使用本發明的方法的介白素-13(Interleukin 13,IL13)的衍生物(序列編號1)(糖鏈與天然的IL13不同之故稱為「衍生物」。)的合成方法。
    具體而言，將想要製造的所希望的糖鏈加成多胜肽的介白素13衍生物分類如下而設計。
    ‧多胜肽片段A，係有在IL13的第1至第27個胺基酸序列(這是相當於「在比含有糖鏈多胜肽片段在較靠N末側，而含有所希望的糖鏈加成胜肽的N末側的多胜肽所成之第2多胜肽片段」。)
    ‧多胜肽片段B，係有在IL13的第28至第43個胺基酸序列的(這是相當於「在含有糖鏈多胜肽片段與第2多胜肽片段之間的多胜肽片段」。)
    ‧多胜肽片段C，係有在IL13的第44至第55個胺基酸序列(此片段含有加成糖鏈的胺酸。因此，此片段是相當於「含有糖鏈加成的胺基酸的多胜肽所成之含有糖鏈多胜肽片段」。)
    ‧多胜肽片段D，係在IL13的第56至第112個胺基酸序列(這是相當於「在比含有糖鏈多胜肽片段在較靠C末側而含有所希望的糖鏈加成胜肽的C末側的多胜肽所成之第1多胜肽片段」。)
    第6圖是這種表示設計的模式圖。
    如後述，上述多胜肽片段A與上述多胜肽片段D是以大腸菌表現法而使其表現，經由規定的步驟而調製。
    又，上述多胜肽片段B與上述多胜肽片段C是以化學合成調製。
    然後將這些被調製的4個多胜肽片段以連接法使其連接而製造IL-13衍生物。
    再者，例如，寫成多胜肽片段C‧D時，是表示由多胜肽片段C與多胜肽片段D連接而成。 1.多胜肽片段A(第1至第27個胺基酸)及多胜肽片段D(第56至第112個胺基酸序列)的調製
    2個糖鏈非鍵結部分(多胜肽片段A(化合物1)(序列編號2)及多胜肽片段D(化合物4)(序列編號3)是使用大腸菌表現系製成為融合蛋白質(化合物6)(序列編號4)。 1-1.將編碼糖鏈非鍵結部分的核酸分子在大腸菌的導入
    (1)在內有5ml LB培養基A(組成：H2O 1l中，含有胰蛋白腖(Bacto-tryptone)10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，洋菜15g)的試管中，加大腸菌(BL21)懸液100μl，以漩渦混合器(Voltex mixer)處理後在37℃孵育一夜。
    (2)製成2支試管，內有5ml LB培養基A並加(1)的培養液200μl，在37℃孵育。測定濁度(OD600)，在50分鐘後達OD600=0.4時將試管放入於冰中。
    (3)將(2)的試管中內容物移入於錐形管，在0℃，以2,000rpm離心20分鐘。
    (4)以傾倒法將上澄液捨棄，將沈澱物打碎，加0.1M CaCl2 3ml，在冰中放置20分鐘。
    (5)將(4)的管在0℃，以2,000rpm離心20分鐘。
    (6)以傾倒法將上澄液捨細棄，將沈澱物打碎，加0.1M CaCl2 0.5ml，以漩渦混合器處理後，移到另外準備的管中。
    (7)在(6)的管中，加入含有編碼有IL13的第1至第27個的胺基酸序列，介入序列(Cys-Val-His-His-His-His-His-His-Met)，及第56至第112個的胺基酸序列連接的序列的核酸分子(序列編號5)的pET32a載體2ml，輕輕地混合後，在冰中靜置1小時。再者，該載體是由其發明者等自由分送給第三者。前述核酸分子是插入在pET32a載體(Novagen公司)的硫氧化還原蛋白(redoxin)的下游的NcoI/BamHI部位(參照第1圖)。
    (8)將(7)的試樣在42℃的水浴浮置3分鐘(熱震法)，繼而在冰中冷却1分鐘。
    (9)在(8)中，加LB培養基A5ml，在37℃孵育45分鐘後，在室溫，以3,000rpm離心10分鐘。
    (10)捨棄上澄液(濾液)，打碎沈澱物後，對沈澱物加LB培養基A1ml，漩渦混合器處理後全量分成100μl，900μl的2部分，分別加LB培養基B(組成：H2O 1l中，加有胰蛋白腖10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g及葡萄糖5g而混合，對此加1.5%的洋菜(15g/l)，20分鐘高壓釜處理，放冷至50至60℃加100mg的氨苄青黴素(Ampicillin))30ml的培養皿中，使用康拉地細菌接種棒(Conradi bacteria spreader)撒佈。
    (11)將(10)的培養皿在37℃靜置10小時。
    (12)將在(11)所形成的菌落，以滅菌過的牙籤勾取於試管中(內有在LB培養基A中以1000：1的比含有10%氨苄青黴素的LBamp培養基3ml)，漩渦混合器處理後在37℃孵育一夜。 2.基因的確認 2-1.質體DNA的取出
    (1)將上述1-1‧(12)的試樣的1.5ml移入於Eppendorf管。
    (2)在室溫以7,000rpm離心3分鐘後，除去上澄液並打碎沈澱物。
    (3)對沈澱物，加100ml的GTE(50mM葡萄糖，25mM Tris‧HCl，10mMEDTA)，漩渦混合器處理後，使用振盪器懸浮5分鐘，再加鹼SDS溶液(0.2N NaOH，1%SDS)200ml翻轉混和後，在冰中冷却5分鐘。
    (4)加5M乙酸鉀溶液150ml翻轉混和後，在冰中冷却5分鐘。
    (5)加三氯甲烷15ml而漩渦混合器處理，在4℃，以13.000rpm離心15分鐘後，將上澄液移入於另一個Eppendorf管，對此上澄液加10mg/ml Rnase 3ml，在37℃放置1小時。
    (6)對(5)的試樣，加(酚：三氯甲烷：異戊醇=25：24：1)500ml，在室溫，以13,000rpm離心10分鐘。
    (7)將上澄液移到另一支Eppendorf管，加3M NaOAc 40ml，EtOH 1ml而翻轉混和，漩渦混合器處理後在-80℃靜置30分鐘。
    (8)將(7)的Eppendorf管在4℃，以13,000rpm離心30分鐘。
    (9)除去上澄液，對沈澱物加70% EtOH 1ml漩渦混合器處理後，在室溫，以13,000rpm離心5分鐘。
    (10)除去上澄液，以乾燥器乾燥。
    (11)加經過高壓釜處理的純水(aH2O)15ml，以振盪器攪拌10分鐘。 2-2.質體DNA的限制酶處理及電泳法
    (1)取上述2-1‧(11)的試樣的5ml，添加含BamHI及NcoI的限制酶處理液A(10×K緩衝液(Tris‧HCl pH8.5 200mM，MgCl2 100mM，DTT 10mM，KCl 1M)2.25ml，0.1% BSA 2.25ml，NcoI 0.85ml，BamHI 0.85ml，aH2O 10.76ml)15ml而混合，在37℃放置2小時。
    (2)恢復到室溫，加反應停止液(H2O中，50%甘油，0.5% SDS，2mM EDTA，0.25%二甲苯腈(xylene cyanol)，0.25%溴酚藍)5ml。
    (3)在4%聚丙烯醯胺凝膠(30%丙烯酸溶液1.995ml，10×TBE(H2O 1l中，Trisma base 108g，硼酸55g，0.25M EDTA 80ml)1.5ml，10%APS(H2O 1l中，過硫酸銨0.1g)75ml，TEMED 10ml，aH2O 15ml)(2)上裝設試樣，以50V(定電壓)電泳。(電泳緩衝液是1×TBE(將10×TBE稀釋10倍)，分子量標誌(marker)是使用Φ×174。)
    (4)以溴化乙啶(Ethidium bromide)染色15分鐘，在300nm評估試料時，可看到759bp左右的帶域。使其表現的蛋白質是有253個胺基酸長，因此可確認有相當於該長度的DNA被割出。 3.蛋白質的表現
    (1)在試管2支中分別加入2×YTamp(aH2O 1l中，胰蛋白腖16g，bacto酵母抽提物10g，NaCl 5g，氨苄青黴素100mg)5ml，再各分別加入上述1-1‧(12)的液(4℃保存2週的試樣)30ml後，在37℃孵育一夜。
    (2)在2×YTamp1l加(1)的製成溶液10ml，在37℃開始孵育。
    (3)測定濁度(OD600)，在2小時後達OD=0.6時加1M異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)1ml，進行誘導3小時。
    (4)將(3)的試樣放在冰中，在4℃，以3,500rpm離心10分鐘。
    (5)捨棄上澄液，收集菌體。
    (6)在-20℃保存。 4.表現蛋白的精製
    (1)將在上述3.(6)所得的試樣在室溫解凍後，溶解於100ml的緩衝液A(100Mm NaH2PO4，10mM Tris‧HCl，6M鹽酸胍，5mM咪唑，pH8.0)，在冰中超音波處理，破碎細胞壁。
    (2)取Ni-NTA瓊脂膠(50%EtOH)10ml，在固相合成管(管柱)充填後以緩衝液A取代，將(1)的試樣裝入並與Ni-NTA瓊脂膠充分混和後溶出。
    (3)將溶出液回收，再度裝入於管柱。將此操作重複1O次，將最後的溶出液回收。(透過液(1))
    (4)將(3)的Ni-NTA瓊脂膠，以緩衝液B(100mM NaH2PO4，10mM Tris‧HCl，6M鹽酸胍，250mM咪唑，pH8.0)100ml清洗，回收清洗液。(透過液(2))
    (5)使用緩衝液C(100mM NaH2PO4，10mM Tris‧HCl，6M鹽酸胍，400mM咪唑，pH8‧0)10ml溶出(溶出液)。使用考馬斯亮藍液(Coomassie Brilliant Blue G250,CBBG)，確認蛋白的溶出。
    (6)在透析管中放入(5)的溶出液，裝有純水的51燒杯中使透析管浮起，在4℃攪拌一夜，進行透析。
    (7)將透析管的內容物回收於離心沉澱管中，在4℃，以3,500rpm離心10分鐘後，捨棄上澄液，而得硫氧化還原蛋白蛋白質為鍵結的多胜肽片段A-Cys-Val-His標籤-Met-多胜肽片段D融合多胜肽(化合物6)約25mg(參照第2圖及第3圖)。
    (再者，C是表示Cys，V是表示Val，H是表示His，M是表示Met。以下均同。) 5. CNBr處理
    (1)對將在4.(7)所得的融合多胜肽(化合物6)以HPLC精製後冷凍乾燥試樣100mg，在氬氣下加20ml的含有2%TFA及40%乙腈水溶液，再加76mg的CNBr在遮光下攪拌一夜。由此處理，融合蛋白質的硫氧化還原蛋白部及His標籤與糖鏈非鍵結部多胜肽片段D之間的甲硫胺酸的C末側的醯胺鍵被加水分解，可在多胜肽片段A加成介入序列，與多胜肽片段D分離。
    (2)用HPLC分析，以質量分析確認保持時間12分鐘處得到所希望的多胜肽片段A-C-Val-His-His-His-His-His-His-Met衍生物(化合物10)(序列編號6)2.3mg，及多胜肽片段D(化合物4)4.2mg(參照第4圖及第5圖)。
    6.硫酯化
    將在上述5.所得的多胜肽片段A-C-Val-His-His-His-His-His-His-Met衍生物(化合物10)6mg溶解於二甲基甲醯胺(DMF)680μl後，在溶液加N,N-二異丙基乙胺(DIEtN)2.6μl(10eq)，及Boc-OSu3.2mg(10eq)反應約1小時，得多胜肽片段A-C-Val-His-His-His-His-His-His-Met衍生物(化合物10)的N末端的胺基及序列中的Lys殘基的側鏈的胺基的計2個地方被Boc化的37殘基的部分保護的多胜肽片段(化合物100)(序列編號7)。將此37殘基胜肽，溶解於磷酸緩衝溶液(pH=5.0，100nM)，加氯硫代甲酸酯(chlorothionoformate)(5當量)，將半胱胺酸的硫醇基修飾為硫碳酸型，原封不動直接用HPLC精製。將所得的多胜肽片段(化合物101)(序列編號8)冷凍乾燥而獲得1.7mg。將此全量溶解於DMSO，加乙醯胍(0.5M在DMSO中)，在常溫反應8小時。將生成物用HPLC精製，得有IL-13的第1至第27的胺基酸序列多胜肽片段A的C末端的羧基為胍基修飾的多胜肽片段(化合物102)(序列編號9)0.3mg。
    此胜肽-胍衍生物是，巰基乙基硫酸等烷硫醇基處理而變換為硫酯衍生物，但以胍基原封不動，也可做為天然化學連接之用。
    (又，M’表示Met的衍生物。以下均同。)
    7.多胜肽片段B(第28至第43個的胺基酸)的合成
    多胜肽片段B(化合物2)的伸長是使用一般性的Fmoc法或Boc法的固相合成法而合成。
    在固相合成管裝入使用蒸餾DMF及蒸餾DCM充分清洗後乾燥的Boc-Leu-PAM樹脂94.34mg(50μmol)。使用於縮合的胺基酸的胺基是使用Boc基加以保護。又，反應如無特別註明是在固相合成管內進行。
    以DMF，DCM充分清洗，之後，將10%硫酸/二噁烷溶液(1.0ml)加於樹脂而攪拌30分鐘，將Boc基做脫保護，以DCM，DMF將樹脂清洗。
    之後，做為連接子而將S-三苯甲基(trityl)-3-巰丙酸5當量(87.1mg，250μmol)，DIPEA 10當量(87.3μl，500μmol)，及HBTU 5當量(94.8mg，250μmol)溶解於DMF(1.0ml)，裝入於前述的充填有調製樹脂的固相合成用管內，在室溫攪拌0.5小時。攪拌後，將樹脂以DCM及DMF清洗數次，繼而以DCM，DMF充分清洗。之後，將TFA加於樹脂攪拌30分鐘而將三苯甲基(trityl)脫保護，以DCM，DMF將樹脂清洗。
    其次，將樹脂以DMF清洗後，將第1個殘基的Boc-Tyr(Br-Z)-COOH 5當量(123.6mg，250μmol)，HBTU 5當量(94.8mg，50μmol)，DIPEA 10當量(87.3μl，500μmol)在DMF溶媒(1.0ml)中混合，將其加於樹脂並在室溫攪拌0.5小時而得中間物(化合物14)。
    縮合後將樹脂以DMF清洗後，以凱澤測試(Kaiser test)確認在樹脂上有胺基酸的縮合，依序與Boc-Leu-PAM-Resin同樣將Boc基脫保護。第2殘基以下也是同樣進行縮合。第16殘基為止，都各以單次縮合(single coupling)而結束。
    又，相當於在IL-13的胺基酸序列中的第28個的胺基酸Cys是以噻唑啶型保護而縮合。
    縮合完成的樹脂以DMF及DCM充分清洗，將TFA：DMS：間-甲酚：EDT：TfOH=5：3：0.8：0.2：1的混合物1ml加於樹脂並在冰上攪拌1小時，以樹脂進行側鏈的脫保護。將此以二乙醚充分清洗後乾燥。 8.由樹脂的切出
    在上述7.所調製胜肽要從樹脂切出時，將TFA：苯甲硫醚(Thioanisol)：EDT：TfOH=8：0.8：0.2：0.8的混合物1ml在冰上加入，攪拌1小時。以二乙醚沈澱後，在室溫乾燥後將試樣用HPLC(管柱：Synmetory 300(TM)C4，3.5μm，4.6×150mm，流速：1.0ml/分，含18%至54%CH3CN的0.09%TFA的18分鐘的線型梯度)分析，保持時間13分鐘處，得連接子加成而成硫酯體的狀態切出，有在IL13的胺基酸序列中第28至第43個胺基酸序列的胜肽硫酯體(化合物103)。將此胜肽硫酯(化合物103)(序列編號10)用HPLC精製，將分取溶液冷凍乾燥而得5mg。IL13(28至43)硫酯體(化合物103)；ESI-MS：m/z以C85H130N20O25S4的計算值：[M+H]+ 1959.8，[M+2H]2+ 980.4，實測值：1960.8，981.0 9.糖鏈鍵結部分的多胜肽片段C(第44至第55個胺基酸)的合成
    多胜肽片段C(化合物3)的伸長是使用一般性的Fmoc法的固相合成法。
    在固相合成管中裝入4-(4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁酸(HMPB)-聚(乙二醇)-聚(二甲基丙烯醯胺)共聚物(PEGA)樹脂1.67mg(50μmol)，以蒸餾DMF及蒸餾DCM充分清洗、乾燥後使用。用於縮合的胺酸的胺基是以Fmoc基保護。又，反應是如無特別說明時都是在固相合成管內進行。
    將Fmoc-Gly-OH 5當量(74.3mg，250μmol)及N-甲基咪唑3.75當量(14.9μl，187.5μmol)溶解於DCM(1.0ml)，裝入於有充填前述調製樹脂的固相合成用管內，在室溫攪拌2小時。攪拌後，將樹脂用DCM：MeOH：DIPEA=17：2：1清洗數次，繼而以DCM、DMF充分清洗。之後，將20%哌啶/DMF溶液(1.0ml)加於樹脂攪拌30分鐘而將Fmoc基脫保護，以DMF清洗樹脂。
    其次，將樹脂以DMF清洗後，將第2個殘基的Fmoc-Ser(tButyl)-COOH5當量(95.9mg，50μmol)，HOBt‧H2O 5當量(33.8mg，50μmol)，DIPCDI 5當量(38.5μl，50μmol)在DMF溶媒(1.0ml)中混合，將其加於樹脂在室溫攪拌1小時。縮合後將樹脂以DMF清洗後，以凱澤測試確認在樹脂上有胺基酸縮合，與第1個殘基同樣將Fmoc基脫保護。第3個殘基也同樣進行縮合。其次，做為第4個殘基，而將下述式(20)表示的Fmoc-Asn-去唾液酸糖(asialoglycose)鏈鍵結。
    即，將第3個殘基的纈胺酸的Fmoc基脫保護後，以DMF清洗樹脂後，將Fmoc-As n-去唾液酸糖鏈(大塚化學股份有限公司製，198mg，100μmol)，DEPBT 3當量(45mg，150μmol)，DIPEA 2當量(18.5μl，100μmol)加DMSO：DMF溶媒4：1(2.5ml)，在第4個殘基導入糖鏈天冬醯胺酸。之後，胺基酸的縮合是與第1至第3個殘基的胺基酸同樣進行，但所用的Fmoc-保護胺基酸的反應溶液中的濃度，都是以DMF調製成為50mM左右而進行。糖鏈天冬醯胺酸加成後，Fmoc保護胺酸是各單次的縮合(single coupling)而完成。
    再者，位置在N末端的Cys(相當於在IL-13的胺基酸序列中的第45個的胺基酸的Cys)是以噻唑啶型保護。
    將縮合完成的樹脂以DMF及DCM充分清洗，將AcOH：DCM：MeOH=5：4：1的混合物2ml加於樹脂攪拌3小時後，由樹脂將胺基酸側鏈受保護的含有糖鏈的多胜肽片段(化合物104)(序列編號11)切出。將此，在室溫減壓濃縮並乾固，以苯將乙酸共沸。在其一部分，加95%TFA，2.5%三異丙基矽烷(TIS)，2.5% H2O，將相當於IL-13的胺基酸序列中的第44個的Cys以外的胺基酸側鏈的保護基除去，在室溫減壓濃縮後，使用高速液體層析法(HPLC)確認純度，結果在保持11分鐘處由質量分析的結果確認做為目的之含有糖鏈的多胜肽片段C(化合物105)(序列編號12)。化合物105：ESI-MS：m/z以C112H187N17O63S的計算值：[M+2H]2+ 1406.1，[M+3H]3+ 937.7，實測值：1406.8，938.3 10.含有糖鏈多胜肽片段C的硫酯化
    將在上述9‧所得的胺基酸側鏈受保護的含有糖鏈的多胜肽片段(化合物104)用苯共沸後，以乾燥器乾燥。此多胜肽片段(化合物104)之中，將10.1mg(3.3μmol)溶解於DMF 0.4ml，加乾燥分子篩4Å(6mg)及苄硫醇基30當量(11.6μl，99μmol)，在-20℃攪拌1小時，加PyBOP 5當量(8.58mg，16.5μmol)，DIPEA 5當量(2.9μl，16.5μmol)反應2小時而進行C末端的硫酯化。反應完成後，在二乙醚6ml中將反應溶液滴下，將白色沈澱物以離心分離法回收。以二乙醚將沈澱物清洗數次，乾燥成白色固形物而得含有糖鏈多胜肽硫酯(化合物106)(序列編號13)。對此固形物加TFA：H2O：TIS：EDT=90：5：2.5：2.5的混合物1ml攪拌3小時，除去胜肽側鏈的保護基。在室溫減壓濃縮後將試樣用HPLC(管柱：Synmetory300(TM)C4，3.5μm，4.6×150mm，流速：1.0ml/分，含18%至54%CH3CN的0.09%TFA的15分鐘的線型梯度)分析，在保持時間9.5分鐘處得有在IL13的胺基酸序列中的第44至第55個的胺基酸的糖鏈多胜肽硫酯(化合物107)(序列編號14)。將此含有糖鏈多胜肽硫酯(化合物107)使用HPLC精製，將分取溶液冷凍乾燥而得7.2mg。IL13(44至55)硫酯體(化合物107)；ESI-MS：m/z以C119H193N17O62S2的計算值：[M+2H]2+ 1459.1，[M+3H]3+ 973.1，實測值：1459.7，973.5 11.含有糖鏈多胜肽片段C與多胜肽片段D的連接
    將在上述10.所得的硫酯化含有糖鏈多胜肽片段(化合物107)(1.2mg，425nmol)，與在上述5.所得的糖鏈非鍵結部分的多胜肽片段D(化合物4)(2.3mg，355nmol)，加於緩衝溶液(6M鹽酸胍，0.2MPBS，20mMTCEP(三(2-羧乙基)膦)，0.04M MPAA(4-巰苯乙酸)，pH6.8)180μl，在室溫反應3小時，而得含有糖鏈多胜肽片段C與多胜肽片段D連接的含有糖鏈多胜肽片段(化合物108)(序列編號15)。天然化學連接法完成後，將其原封不動，將甲氧胺鹽酸鹽(30mg，359μmol)加入於反應溶液，將pH調整為4.0而分解N末端的噻唑啶，變換為半胱胺酸。12小時後，將反應混合物使用HPLC分析的結果，觀察到與其相當的尖峰。又，將此尖峰的化合物精製，以質量分析，確認得到含有糖鏈多胜肽片段(化合物109)(序列編號16)2.3mg。化合物109：ESI-MS：m/z以C402H654N102O141S3的計算值：[M+4H]4+ 2316.7，[M+5H]5+ 1853.5，[M+6H]6+ 1544.8，[M+7H]7+ 1324.2，[M+8H]8+ 1158.8，[M+9H]9+ 1030.2，實測值：2317.7，1854.5，1545.7，1325.2，1030.9 12.多胜肽片段B與含有糖鏈多胜肽片段C‧D的連接
    將在上述11.所得的含有糖鏈多胜肽片段(化合物109)(1.3mg，140nmol)，與在上述8.所得的硫酯化多胜肽片段B(化合物103)(0.40mg，209nmol)，加入於緩衝溶液(6M鹽酸胍，0.2M PBS，40mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)，0.02M MPAA(4-巰苯乙酸)，pH7.1)70μl，在室溫反應8小時，得多胜肽片段B與含有糖鏈多胜肽片段C‧D連接的含有糖鏈多胜肽片段(化合物110)(序列編號17)。天然化學連接法完成後，將其原封不動，將甲氧胺鹽酸鹽(1.2mg，14μmol)加入於反應溶液，將pH調整為4.0分解N末端的噻唑啉，變換成半胱胺酸。12小時後，將反應混合物用HPLC分析的結果，觀察到與其相當的尖峰。又，將此尖峰的化合物精製，以質量分析，確認得到含有糖鏈多胜肽片段(化合物111)(序列編號18)0.6mg。化合物111：ESI-MS：m/z以C477H767N121O163S6的計算值：[M+5H]5+ 2199.1，[M+6H]6+ 1832.7，[M+7H]7+ 1571.1，[M+8H]8+ 1374.8，[M+9H]9+ 1222.2，[M+10H]10+ 1100.0，[M+11H]11+ 1000.1，實測值：2200.4，1834.1，1572.3，1375.9，1223.3，1100.9，1000.9 13.多胜肽片段A與含有糖鏈多胜肽片段B‧C‧D的連接
    在上述12.所得的含有糖鏈多胜肽片段(化合物111)(0.6mg，54nmol)，與在上述6.所得的胍衍生物化多胜肽片段(化合物102)(0.2mg，62nmol)，加入於緩衝溶液(6M鹽酸胍，0.2M PBS，20mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)，0.1M MPAA(4-巰苯乙酸)，pH7.2)50μl，在室溫反應24小時。24小時後，將反應混合物用HPLC分析的結果，觀察到與其相當的尖峰。將此尖峰的化合物精製，以質量分析，確認得到含有糖鏈多胜肽(化合物112)(序列編號19)0.1mg。化合物112：ESI-MS：m/z以C617H1000N156O207S6的計算值：[M+8H]8+ 1763.4，[M+9H]9+ 1567.6，[M+10H]10+ 1410.9，[M+11H]11+ 1282.7，[M+12H]12+ 1175.9，[M+13H]13+ 1085.5，[M+14H]14+ 1008.1，實測值：1764.3，1568.5，1411.8，1283.6，1176.8，1086.3，1009.0 14. Boc基的除去
    將在上述13.所得的112殘基的含有糖鏈多胜肽(化合物112)0.1mg，溶解於5%含水三氟乙酸200μl，在室溫反應1小時。將反應後的溶液吹氬氣濃縮後，以緩衝溶液(6M鹽酸胍，0.2M PBS)200μl稀釋，將所得的溶液用HPLC精製。回收主尖峰而得有做為目的之均勻的糖鏈的介白素-13衍生物(化合物113)(序列編號1)0.1mg。 15.介入序列的最適化
    為了要將在介入序列(-Cys-W-(His)n-Z-Met-)的W最適化，比較在C末端有組胺酸標籤的胜肽硫代甲酸酯的胍化中生成的胍體(下示反應式)的單離收率。
    X=G，V，I，P，F，W，L(此處，D表示Asp，V表示Val，A表示Ala，F表示Phe，C表示Cys，X表示Gly，Val，Ile，Pro，Phe，Trp，Leu的任一個胺基酸。)
    在胍化反應中，在Boc-Asp-Val-Ala-Asp-Phe-Cys(C(S)OPh)-Xaa-His-His-His-His-His-His-OH(Xaa=Gly，Val，Ile，Phe，Pro，Trp)(序列編號20)的Xaa，使用胺基酸不同的6個胜肽硫代甲酸酯。在含各胜肽硫代甲酸酯的胜肽硫代甲酸酯/DMSO溶液(2mM)中加同體積量的1-乙醯胍/DMSO溶液(1M)，以漩渦混合器攪拌。在37℃的水浴中靜置1日後，以二乙醚沈澱，清洗。以半分取HPLC精製，得目的化合物(序列編號21)。將各胜肽的單離收率在第1表中分別表示。ESIMS計算值[M+H]+ 748.3實測值，748.3。
    如第1表所示的結果，將Val，Trp，Ile插入在組胺酸標籤的N末側時，能得到非常多量的胍體。特別是，Val及Ile，能抑制副生成物的生成。
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    <221> CARBOHYD
    <222> (52)..(52)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 1
    <210> 2
    <211> 27
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <400> 2
    <210> 3
    <211> 57
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <400> 3
    <210> 4
    <211> 253
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <400> 4
    <210> 5
    <211> 282
    <212> DNA
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <400> 5
    <210> 6
    <211> 36
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (36)..(36)
    <223> X為高絲胺酸內酯
    <400> 6
    <210> 7
    <211> 37
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (1)..(1)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (24)..(24)
    <223> Boc
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    <221> MISC_FEATURE
    <222> (36)..(36)
    <223> X為高絲胺酸內酯
    <400> 7
    <210> 8
    <211> 36
    <212> PRT
    <213> 人工
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    <223> 化學合成
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (1)..(1)
    <223> Boc
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    <221> BINDING
    <222> (24)..(24)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (28)..(28)
    <223> C(=S)OPh
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (36)..(36)
    <223> X為高絲胺酸內酯
    <400> 8
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    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (1)..(1)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (24)..(24)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (27)..(27)
    <223> -NH-C=NH(NHAc)
    <400> 9
    <210> 10
    <211> 16
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (1)..(1)
    <223> 1C具有噻唑啶基
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (16)..(16)
    <223> -S-CH2CH2CONHCH(CH2CH(CH3)2)COOH
    <400> 10
    <210> 11
    <211> 12
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (1)..(1)
    <223> 1C具有噻唑啶基
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (1)..(1)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (5)..(5)
    <223> OtBu
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (6)..(6)
    <223> tBu
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (11)..(11)
    <223> tBu
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (9)..(9)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 11
    <210> 12
    <211> 12
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (1)..(1)
    <223> 1C具有噻唑啶
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (9)..(9)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 12
    <210> 13
    <211> 12
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (1)..(1)
    <223> 1C具有噻唑啶基
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (1)..(1)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (5)..(5)
    <223> OtBu
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (6)..(6)
    <223> tBu
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (11)..(11)
    <223> tBu
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (12)..(12)
    <223> -SBn
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (9)..(9)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 13
    <210> 14
    <211> 12
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (1)..(1)
    <223> 1C具有噻唑啶基
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (12)..(12)
    <223> -SBn
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (9)..(9)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 14
    <210> 15
    <211> 69
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (1)..(1)
    <223> 1C具有噻唑啶基
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (9)..(9)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 15
    <210> 16
    <211> 69
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (9)..(9)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 16
    <210> 17
    <211> 85
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (1)..(1)
    <223> 1C具有噻唑啶基
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (25)..(25)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 17
    <210> 18
    <211> 85
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (25)..(25)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 18
    <210> 19
    <211> 112
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (1)..(1)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (24)..(24)
    <223> Boc
    <220>
    <221> CARBOHYD
    <222> (52)..(52)
    <223> 去唾液酸寡糖
    <400> 19
    <210> 20
    <211> 13
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (1)..(1)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (6)..(6)
    <223> C(=S)OPh
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (7)..(7)
    <223> X is G,V,I,P,F,W,or L
    <400> 20
    <210> 21
    <211> 5
    <212> PRT
    <213> 人工
    <220>
    <223> 化學合成
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (1)..(1)
    <223> Boc
    <220>
    <221> BINDING
    <222> (5)..(5)
    <223> -NH-C=NH(NHAc)
    <400> 21
    由於本案的圖式為實施形態之模式圖，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。
    权利要求:
    Claims (20)
    [1] 一種製造方法，其係適於NCL法之有高效率的製造N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段，與C末側被修飾的第2多胜肽片段的方法，該方法含有以下的步驟：(1)將具有以下構造的多胜肽與CNBr反應：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-z-Met-第1多胜肽片段(C末側)[在此，n表示0至10的整數，Cys表示半胱胺酸，W表示任意的1，2或3個胺基酸，Z表示任意的0，1或2個胺基酸，His表示組胺酸，Met表示甲硫胺酸；又，第1多胜肽片段的N末端為半胱胺酸]而得以下多胜肽片段的步驟；(A)N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段(B)有以下構造的第3多胜肽片段：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met'(C末側)[在此，Met’是表示Met的衍生物](2)前述第3多胜肽片段，與下述式(I)表示的化合物反應： [式中，X是硫原子或氧原子，R1及R2是脫離基]繼而在有機溶媒中，與下述式(II)表示的化合物反應： [式中，Y是氧原子，硫原子或=NH，R3是氫原子，醯基或烷氧羰基。]藉以獲得具有以下構造的C末側被修飾的第2多胜肽片段的步驟：(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-NH-C(=Y)NHR3(C末側)。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，復包含下述的步驟：在前述(2)的步驟中所得的C末側被修飾的第2多胜肽片段，再與下述式表示的硫醇基反應：R4-SH[式中，R4是由有取代或無取代的苄基，有取代或無取代的芳基，及有取代或無取代的烷基所成之群中所選擇的任一個基]而將C末側的-NH-C(=Y)NHR3基與硫醇基交換，藉以獲得具有以下構造的C末側被修飾的第2多胜肽片段的步驟；(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-SR4(C末側)。
    [3] 如申請專利範圍第1項或第2項所述之製造方法，其中，前述式(I)表示的化合物中的X為硫原子。
    [4] 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，前述式(I)表示的化合物中的R1為-O-C6芳基。
    [5] 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之製造方法，其中，前述式(I)表示的化合物中的R2是鹵原子或有取代或無取代的-S-C6-10芳基。
    [6] 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之製造方法，其中，前述式(II)表示的化合物中的Y是=NH。
    [7] 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之製造方法，其中，前述式(II)表示的化合物中的R3是乙醯基。
    [8] 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之製造方法，其中，前述具有以下構造的多胜肽：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met-第1多胜肽片段(C末側)是由細胞表現的重組型多胜肽片段。
    [9] 如申請專利範圍第8項所述之製造方法，其中，前述細胞是大腸菌。
    [10] 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之製造方法，其中，W是1個胺基酸，且為由Val，Ile，Leu，Trp所成之群中所選擇的任一個胺基酸。
    [11] 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之製造方法，其中，n是6至10的整數。
    [12] 一種製造方法，其係適於NCL法的製造N末側為半胱胺酸的第1多胜肽片段的方法，係將具有以下構造的多胜肽與CNBr反應：(N末側)第2多胜肽片段-P-Met-第1多胜肽片段(C末側)[在此，P是任意的0至10個的胺基酸，Met是表示甲硫胺酸，第1多胜肽片段的N末端是半胱胺酸]。
    [13] 一種糖鏈加成多胜肽的製造方法，係含有以下的步驟：(1)將要製造的所希望的糖鏈加成多胜肽的胜肽序列，至少分類而設計成如下所示的多胜肽片段的步驟，‧包括含有糖鏈加成的胺基酸的多胜肽之含有糖鏈多胜肽片段，‧包括含有比含有糖鏈多胜肽片段在較靠N末側的所希望的糖鏈加成胜肽的N末側的多胜肽之第2多胜肽片段，‧包括含有比含有糖鏈多胜肽片段在較靠C末側的所希望的糖鏈加成胜肽的C末側的多胜肽之第1多胜肽片段，‧可以存在時，在含有糖鏈多胜肽片段與第2多胜肽片段之間的多胜肽片段，‧可以存在時，在含有糖鏈多胜肽片段與第1多胜肽片段之間的多胜肽片段；在此，第1多胜肽片段的N末端是設計成為半胱胺酸，(2)使用含有編碼具有以下構造的多胜肽的核苷酸序列的表現載體：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met-第1多胜肽片段(C末側)[在此，n是表示0至10的整數，Cys表示半胱胺酸，W表示任意的1，2或3個胺基酸，Z表示任意的0，1或2個胺基酸，His表示組胺酸，Met表示甲硫胺酸；又，第1多胜肽片段的N末端為半胱胺酸]並由大腸菌表現，而取得具有前述構造的多胜肽的步驟；(3)將在步驟(2)所得的多胜肽與CNBr反應，而獲得以下之多胜肽片段的步驟；(A)N末端為半胱胺酸的第1多胜肽片段(B)具有以下的構造的第3多胜肽片段：(N末側)第2多胜肽片段-Cys-W-(His)n-Z-Met'(C末側)(在此，Met’表示Met的衍生物)(4)將前述第3多胜肽片段與下述式(I)表示的化合物反應： [式中，X是硫原子或氧原子，R1及R2是脫離基]繼而，在有機溶媒中，與下述式(II)表示的化合物反應： [式中，Y是氧原子，硫原子，或NH基，R3是氫原子，醯基，或烷氧羰基]，藉以獲得具有以下的構造的C末側被修飾的第2多胜肽片段的步驟：(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-NH-C(=Y)NHR3(C末側)(5)任意地在前述(4)的步驟中所得的C末側被修飾的第2多胜肽片段，再與下述式表示的硫醇基反應：R4-SH[式中，R4是由有取代或無取代的苄基，有取代或無取代的芳基，及有取代或無取代的烷基所成之群中所選擇的任一個基]並將C末側的-NH-C(=Y)NHR3基與硫醇基交換，藉以獲得具有以下的構造的C末側被修飾的第2多胜肽片段的步驟：(N末側)第2多胜肽片段-C(=O)-SR4(C末側)(6)將以化學的方法合成而另外調製的‧前述含有糖鏈多胜肽片段，‧可以存在時，在含有糖鏈多胜肽片段與第2多胜肽片段之間的前述多胜肽片段，‧可以存在時，在含有糖鏈多胜肽片段與第1多胜肽片段之間的前述多胜肽片段，及在步驟(3)所得的N末端為半胱胺酸之第1多胜肽片段，及在步驟(4)或(5)所得的C末側被修飾的第2多胜肽片段以能得到所希望的糖鏈加成多胜肽的順序，以連接法鍵結的步驟。
    [14] 如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其中，前述式(I)表示的化合物中的X是硫原子。
    [15] 如申請專利範圍第13項或第14項所述之製造方法，其中，前述式(I)表示的化合物中的R1是-O-C6芳基。
    [16] 如申請專利範圍第13項至第15項中任一項所述之製造方法，其中，前述式(I)表示的化合物中的R2是鹵原子或有取代或無取代的-S-C6-10芳基。
    [17] 如申請專利範圍第13項至第16項中任一項所述之製造方法，其中，前述式(II)表示的化合物中的Y是=NH。
    [18] 如申請專利範圍第13項至第17項中任一項所述之製造方法，其中，前述式(II)表示的化合物中的R3是乙醯基。
    [19] 如申請專利範圍第13項至第18項中任一項所述之製造方法，其中，W是1個胺基酸，且為由Val，Ile，Leu，Trp所成之群中所選擇的任一個胺基酸。
    [20] 如申請專利範圍第13項至第19項中任一項所述之製造方法，其中，n是6至10的整數。
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    BR112014007174A2|2017-04-04|
    AU2012317742A1|2014-04-17|
    KR20140091678A|2014-07-22|
    EP2762485A4|2015-06-24|
    CA2849752C|2020-06-23|
    WO2013047372A1|2013-04-04|
    CA2849752A1|2013-04-04|
    KR101942608B1|2019-01-25|
    RU2014115769A|2015-10-27|
    TWI549963B|2016-09-21|
    EP2762485B1|2018-08-01|
    AU2012317742B2|2016-10-13|
    IN2014CN02854A|2015-07-03|
    US20140377807A1|2014-12-25|
    CN104080796A|2014-10-01|
    SG10201602024YA|2016-04-28|
    SG11201400936QA|2014-10-30|
    JPWO2013047372A1|2015-03-26|
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    法律状态:
    优先权:
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    JP2011210007||2011-09-26||
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