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    本發明係提供一種藉由評估細胞或組織樣本中切絲蛋白之表現量，來測定該樣本之細胞老化狀態的方法。偵測切絲蛋白之表現量亦可用於篩選出用以調節標的細胞中老化狀態的有效化合物或組成物。
    公开号:TW201303298A
    申请号:TW100130568
    申请日:2011-08-25
    公开日:2013-01-16
    发明作者:Yi-Jang Lee；Cheng-Han Tsai
    申请人:Univ Nat Yang Ming；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    一種評估細胞老化的方法
    本發明係關於一種檢測細胞老化之方法，更特別地，係關於一種藉由評估細胞或組織樣本中切絲蛋白之表現量，來測定該樣本之細胞老化狀態的方法。本發明亦關於一種用於篩選出用以調節標的細胞中老化狀態的有效化合物或組成物之方法。
    自古人類總夢想著追求青春永駐、長生不老之道，近年來隨著醫學及生物科技的發展與進步，不但可藉由前端的醫學技術來對抗疾病，許多訴求能抗老的產品也陸續地研發問世，近年來抗老化的風潮慢慢地向全球蔓延開來，以日本為例，高達七成以上民眾具有抗老化意識，而台灣民眾對於抗老化的關心也持續升高，此股抗老化趨勢將帶動抗老化相關產品市場銷售，預期全球市場也將持續擴張。
    以我國市場為例，台灣的抗老化市場規模，近十年之內有了17倍之多的成長幅度，從2001年的200億，2002年的257億，到了2006年則倍增為412億，預估未來10年的營業額，更可能攀升至4，000億台幣。顯示台灣在美容保健等抗老化產品其消費能力相當驚人，且不受景氣循環之影響。因此，有必要研發一個高通量方法，在已知人工藥物或自然產品中快速、有效率地篩選出抗老化劑。
    當人類細胞處於在組織培養環境中，會顯示有限的增生能力，在達到老化階段(即不分裂)之前，通常只能分裂40至60次。人類細胞在組織培養中之有限增生能力，被認為是由於許多環境與遺傳機制所造成，此現象並廣泛地運用在研究人類老化現象上。
    觀察細胞老化(Cellular senescence)現象，並在細胞層次上作為研究老化之模式已有超過30年以上的歷史。Leonard Hayflick曾經以分離自人類肺與皮膚之類纖維母細胞(fibroblast like cells)進行研究發現，當這些細胞經過系列培養時，會進行數回合的係胞分裂，但是在培養物到達老化階段時，細胞則不能夠再進行分裂。在細胞喪失分裂能力的同時，也觀察到其在外表、形狀、型態學上發生改變，例如細胞明顯地擴大，並且在細胞與細胞之間的空隙變大。
    先前技術中，已知有將老化相關-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)活性分析使用在測定細胞培養過程中的細胞老化狀況。此方法之原理係基於發現到，老化會引起溶酶體內的β-半乳糖苷酶(lysosomal β-galactosidase)表現量增加。在非老化之細胞中，溶酶體β-半乳糖苷酶(一種水解酶)在最佳pH值為4.0至4.5時，可從醣蛋白(glycoproteins)裂解出半乳糖(galactose)。溶酶體β-半乳糖苷酶活性可以在大部分哺乳類動物細胞內偵測到，藉由細胞化學分析，β-半乳糖苷酶在pH值為4.0時，可裂解X-gal而形成藍色沉澱物。然而，在老化過程中，溶酶體中的β-半乳糖苷酶蛋白質含量增高，而且溶酶體之整體外觀亦相對變大。而在老化細胞中所增加之β-半乳糖苷酶，可使能夠在pH值為6.0之次最佳條件下，偵測到β-半乳糖苷酶活性(Kurz et al.,2000,J. Cell Sci. 113: 3613-3622)。
    端粒(telomere)與端粒酶活性分析(telomerase assay)為另一種用來測定細胞老化之方法。染色體末端即為端粒，其作用在於保護染色體，避免自我融合成環狀或與其他DNA結合。當進行細胞分裂、複製DNA時，端粒會被剪斷以進行複製過程。研究人員利用細胞內端粒之長度來決定細胞年齡，以及該細胞還能複製多少次。1985年科學家首度發現端粒酶，為一種反轉錄酶(reverse transcriptase)，主要由蛋白催化次單元(TERT)與模板RNA次單元(TR)所組成。此酵素利用其本身的RNA作為模板，將核苷酸增加至染色體末端，以使端粒延伸、重建至原先之長度。偵測人類端粒酶之催化次單元(hTERT)之表現，可提供一種用於分析端粒酶對其自然受質-端粒之作用活性的方法。
    本發明則提供一種藉由偵測標的細胞中切絲蛋白表現量分析細胞老化之方法。切絲蛋白為一種分子量為約19 kD之蛋白質，其可與肌動蛋白絲(actin filaments)結合，並促進彼等與細胞移動、發育、極性或胞質分裂相關的動力學(Bamburg et al.,1999,Trends Cell Biol 9: 364-70)。哺乳動物中所表現之切絲蛋白可分為非肌肉切絲蛋白(nonmuscle cofilin,n-cofilin)、肌肉切絲蛋白(muscle cofilin,m-cofilin)與ADF。切絲蛋白表現缺失會導致細胞停滯在G2/M階段，產生多核的細胞，以及造成不可逆的細胞死亡(Bellenchi et al.,2007,Genes Dev 21: 2347-57)。然而，並無相關文獻曾經揭露，標的細胞中內生性切絲蛋白表現量與其細胞老化情況之關連。
    本發明係基於發現，細胞老化與切絲蛋白表現量成正比。切絲蛋白為一種廣布存在於細胞內的肌動蛋白-結合蛋白，並負責肌動蛋白細胞骨架之形成。因此，切絲蛋白表現量顯著增加，可反映出細胞或組織中的老化狀態。
    於一方面，本發明提供一種篩選抗老化劑之方法，包含：(a)將標的細胞進行培養五至七代(細胞仍保持年輕，亦即其細胞分裂時間約24小時，PDL(population doubling level)約為1)，並偵測年輕細胞中切絲蛋白表現量以做為參考值；(b)在年輕細胞中以一種候選抗老化劑處理，隨後將細胞進行培養至少經過13代(此時細胞被認為是老化的細胞，亦即其細胞分裂時間約將近或超過一週，PDL約為0.1)；(c)偵測在經過抗老化劑處理之細胞中的切絲蛋白表現量；(d)將於經處理細胞中所偵測到之切絲蛋白表現量與步驟(a)取得之參考值進行比較；及(e)評估該候選抗老化劑對於減少或抑制切絲蛋白表現量之效用，以決定該候選抗老化劑是否能抑制經過處理之細胞的老化狀態。
    於本發明之一具體實施例，老化細胞中的切絲蛋白表現量較年輕細胞多出3倍，較佳地係多出3-10倍，且更佳地係多出3--5倍。
    於本發明之另一具體實施例，係經由西方墨點法(Western blotting analysis)分析決定切絲蛋白之表現量。於本發明之另一具體實施例，係藉由組織免疫染色法(immunohistochemical staining method)比較年輕與老化細胞中切絲蛋白表現量之差異。
    於本發明之又另一具體實施例，該篩選方法包含再次確認的步驟，其係使用β-半乳糖苷酶活性分析檢查標的細胞內之老化狀態。
    另一方面，本發明係關於一種調節細胞老化之方法，其包含藉由調控切絲蛋白之表現量，來控制細胞老化的狀態。
    於本發明之一具體實施例，係將年輕細胞中之切絲蛋白基因過度表現，以誘發或促進細胞老化。於本發明之另一具體實施例，係將切絲蛋白基因過度表現載體(over-expression vector)轉染至標的細胞內，以增加切絲蛋白之表現量。
    於本發明之另一具體實施例，係於較老之細胞中減少或抑制切絲蛋白的表現，以暫停或減緩老化現象。於本發明之另一具體實施例，係利用干擾RNA(siRNA)抑制切絲蛋白基因表現，來減緩細胞衰老狀態的進行。
    於本文所用之術語“細胞老化”與“細胞衰老”是可互換的，意指細胞增生能力與壽命之逐漸衰退。每一個細胞都被計畫好具有特定分裂次數，最後停止增生，細胞經由細胞凋亡(apoptosis)機制死亡而進入靜止狀態。於本說明書及申請專利範圍之敘述中，“細胞仍保持年輕”係定義為，該等細胞之細胞分裂時間約為24小時，亦即PDL(population doubling level)約為1；而“被認為老化的細胞”則定義為，其細胞分裂時間約將近或超過一週(亦即PDL約為0.1)。
    以下說明中將詳細列述本發明之一或多項具體實施例。本發明的其他特徵與優點，將從下列圖式及數項具體實施例之詳細描述，亦從附屬之申請專利範圍顯而易見。
    以下所例舉說明之特別實施例僅僅為說明，而不限於所揭露以外的任何其他形式。即使沒有更詳細闡述，相信對於熟知該技藝之人士可基於本說明書，利用本發明至最充分之程度。所有於本說明書中所引用之公開文獻，皆引其完整內容以引用之方式納入本文。在以下所提出之任何機制，並不以任何方式限制本發明之申請專利範圍。
    下列實施例中，係進行獨立實驗以分析對照組與實驗組間之統計數據差異。使用Student’s t test計算統計數據差異。顯著差異定義為p<0.05。
    實施例1：老化WI-38細胞中切絲蛋白cofilin表現量較高，與X-gal染色及形態上之改變結果一致
    細胞培養
    人類二倍體纖維母細胞-WI-38細胞株係購自美國菌種保存中心(ATCC)，並將其培養於補充以10%胎牛血清、2 mM L-麩胺酸鹽與50 U/ml青黴素之最低必需培養基(Minimum Essential Medium,MEM)(Sigma-Aldrich,Inc.,St. Louis,MO)培養。DMEM之pH值調至7.4。以ATCC公式：PDL(細胞分裂次數，population doublings level)=3.32 x log(收取時之存活細胞總數/播種時之細胞總數)，計算細胞群倍加數(population doublings,PD)。細胞放置在37℃，潮濕培養箱(含有5% CO2與95%空氣)中生長，細胞生長至八成鋪滿時即進行繼代。
    老化相關-β-半乳糖苷酶活性分析
    將未經繼代之細胞置於12孔盤，以多西環素(doxycycline)處理，並培養至多7天。去除培養液，以1X PBS清洗細胞兩次。之後，將細胞以現配之固定液(2%甲醛與0.2%戊二醛溶於1X PBS)固定五分鐘。經固定後，細胞以1X PBS清洗兩次，再以染色液(1 mg/ml X-gal,40 mM檸檬酸/磷酸鈉溶液,5 mM鐵氰化鉀,5 mM亞鐵氰化鉀,150 mM NaCl,2 mM MgCl2，pH 6)進行染色。在37℃培養箱中染色持續16小時，染色後將細胞以1X PBS清洗、浸漬。老化細胞中之藍色區域以光纖為基礎的光譜分析系統(optic-fiber-based spectroscopic system)定量，並以反向位相差顯微鏡(CK-40 Olympus Co,Japan)觀察。相片係由數位相機(Canon,PowerShot A620)架至顯微鏡上進行拍攝得。
    如第1A圖顯示，老化之WI-38細胞顯示在細胞核周圍具有藍色，老化之WI-38細胞型態上增大並較為扁平，而年輕、正處於增生之WI-38細胞則比較小，呈紡錘狀。
    間接免疫螢光染色分析
    將WI-38細胞(1x104)生長於四孔的培養玻片(Nalge Nunc International Corp.,Naperville,IL)上，加入或不加入多西環素培養48小時。將細胞以含有4%三聚甲醛之磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)，在室溫下固定15分鐘，以0.5% Triton X-100處理5分鐘使細胞通透化。將固定好之細胞與抗-切絲蛋白(C-20)或抗-p27kipl抗體反應1小時，以偵測蛋白p27kipl之表現。隨後以PBS清洗玻片，加入接有螢光染劑玫紅之二級抗體(rhodamine-conjugated secondary antibody)反應45分鐘。反應之後將玻片再次清洗，並與10 g/ml之4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染劑靜置培育，以進行細胞核染色。最後，將玻片以含有2% DABCO(Kodak,Rochester,NY)之90%甘油密封，並使用螢光顯微鏡(Leica DM IRB, Wetzlar,Germany)觀察。
    對於肌動蛋白絲(F-actin)與球狀肌動蛋白(G-actin)之螢光染色分析，係分別使用A12397螢光素-共軛之鬼筆環肽，及玫紅-共軛之DNaseI進行染色。亦經由與年輕細胞相比，偵測老化細胞之球狀肌動蛋白進入到細胞核中。
    第1B圖顯示，年輕與老化之WI-38中，細胞骨架(F-與G-肌動蛋白)的間接免疫螢光染色分析結果。經由DAPI染色可觀察到細胞核，每次實驗中顯微鏡下所觀察之區域為隨機選取三次，結果為一致的。利用A12397螢光素-共軛之鬼筆環肽染色顯示，相較於年輕細胞，在老化細胞中細胞內細胞骨架、肌動蛋白表現量顯著增多。
    西方墨點法
    收集細胞溶解產物，並以如先前所敘述之方法分別進行電泳(SDS-PAGE)與西方墨點法分析。轉漬上蛋白質之膜以包括抗-切絲蛋白(C-20)、抗-磷酸-特異性(ser3)切絲蛋白(Millipore Inc.,Billerica,MA)、抗-p27kip1、抗-p21cip1(BD Transduction Laboratories,San Diego,CA)、抗-p53(Santa Cruz Inc.,Santa Cruz,CA)與抗-p16INK4抗體(Santa Cruz Inc.,Santa Cruz,CA)等抗體進行探測。以ECL化學發光試劑(Amersham Bioscience,Buckinghamshire,UK)偵測具有免疫反應性之蛋白質位置，並藉由在X光片(Kodak,Rochester,NY)上進行曝光而顯像。
    在第2圖可以很清楚看見，切絲蛋白與其他老化相關之蛋白，例如p53、p21cip1、p27kip1與p16INK4，會在老化之WI-38細胞中大量表現。
    實施例2：在老化小鼠的肝、腎與肺組織中偵測到較高之切絲蛋白表現
    於採樣自老化小鼠(80週齡)與年輕小鼠(6週齡)之腦、肝、腎與肺臟的組織中，評估老化狀態與切絲蛋白表現量之間的關聯性。將採集之組織以石蠟(Paraffin)包埋，用以於免疫組織化學分析中觀察切絲蛋白的表現量。而X-gal的染色，則是利用冷凍切片(Cryosection embeded)的方式包埋，並如實施例1中所述進行老化相關-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)分析。此外，亦同樣在採樣自老化小鼠之組織中偵測，已知與老化相關之指標蛋白p53，用以進一步確認切絲蛋白表現量與其SA-β-gal生物標記蛋白增加的表現型之間的關聯性。
    以下更詳盡說明免疫組織化學法，將從小鼠不同部位採集得之組織以PBS沖洗，然後加入4%三聚甲醛在4℃下輕微地搖晃一個晚上進行固定。固定好之樣本包埋在最適切片溫度溶液(optimal cutting temperature solution,OCT)中，並儲存在-80℃。從包埋在OCT之組織取得五個微米(μm)組織切片。關於免疫組織化學法染色分析，係將組織切片以4%三聚甲醛，於室溫下固定10分鐘，隨後使用5%過氧化氫(H2O2)與山羊血清進行封阻。將組織切片與抗-切絲蛋白抗體(1:50,GeneTex Inc. Irvine,CA)，或抗-p53抗體(1:50,GeneTex Inc. Irvine,CA)在37℃下反應1.5小時。之後，將切片與辣根過氧化酶(HRP)-共軛之次級抗體(1:400,Sigma-Aldrich,Inc.,St. Louis,MO)，在37℃下反應1小時。最後，將3',3'-二胺基聯苯胺(DAKO Inc.,Glostrup,Denmark)加至組織切片，直到呈現棕色，再加入蘇木精與伊紅(hematoxylin and eosin,H&E)染色。全部照片以光學顯微鏡(Olympus America Inc. Center Valley,PA)拍攝。
    實驗結果顯示於第3圖，於80週齡小鼠之肝、腎與肺臟組織切片，顯現出明顯的X-gal染色訊號。相對應地，相較於年輕小鼠，老化小鼠之肝、腎與肺臟組織，經由免疫組織染色所呈現之切絲蛋白訊號較高。實驗結果推測，活體組織中切絲蛋白表現量增加與老化過程具有高度關連性。
    免疫沉澱-西方墨點法分析
    大致而言，將組織切下並剁碎，並以TRIzol試劑(Invitrogen)進行蛋白質萃取。將等量(500μg)之來自不同組織的蛋白萃取物與抗-切絲蛋白抗體於4℃下反應2小時，接著與蛋白質-A/G PLUS-瓊脂糖(Santa Cruz Inc.,Santa Cruz,CA)進行混合過夜。然後免疫複合物以溶解緩衝液清洗四次，並離心(1,000 x g)回收沉澱物。將清洗過的免疫複合物與2X樣本緩衝液(sample buffer)混合，之後於十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠進(SDS-PAGE)行電泳分析。接著，將凝膠電轉移至聚二氟乙烯膜濾膜(PVDF membrane)，再同樣以抗-切絲蛋白抗體偵測。取十分之一未進行免疫沉澱的細胞溶解產物，使用抗-GAPDH抗體進行西方墨點法，做為入量對照組(input control)。
    如第4圖之結果所示，與年輕小鼠比較，來自老化小鼠之肝、腎與肺組織具有較高的切絲蛋白表現量。
    實施例3：藉由切絲蛋白表現量建立抗老化劑之篩選平台
    本實驗係使用SK-II PiteraTM(為一種已知用於化妝品配方且已上市的抗老化產品)來評估本發明平台用以篩選抗老化劑的效能。將人類纖維母細胞(WI-38細胞)培養13至15代，達到老化狀態。其培養條件如先前實施例1所敘述者。
    將老化之人類纖維母細胞(1 x 104個)生長在四孔培養玻片(Nalge Nunc International Corp.,Naperville,IL)上，以不同比例的PiteraTM(0、5、10及20%,v/v)處理48小時後，再將其進行如實施例1所敘述之老化相關-β-半乳糖甘酶活性分析，及西方墨點法分析。
    如第5圖所示，老化之人類纖維母細胞細胞在細胞核周圍顯示出藍色，隨著所加入之抗老化劑SK-II PiteraTM劑量越高，藍色區塊則越趨減弱、變小(參見第5A圖)。第5B圖則顯示其定量分析之結果。
    於第6圖中，係經由西方墨點法分析顯示切絲蛋白cofilin-1在不同實驗條件下的總體表現量。結果，在老化之人類二倍體纖維母細胞中，與老化相關的cofilin-1蛋白具有較高表現量，但隨著所加入之抗老化劑SK-II PiteraTM劑量越高，cofilin-1蛋白的表現量也隨之下降。因此，藉由在加入候選抗老化化合物或組成分，之細胞或組織中偵測切絲蛋白之表現量，可決定該化合物或組成分對於抗老化之功效。亦即，於處理過之標的細胞或組織中，切絲蛋白之表現量的改變，可使用做為抗老化劑之篩選平台。
    實施例4.　藉由調節切絲蛋白之表現量調控細胞的老化狀態
    藉由增加cofilin表現量誘導年輕WI-38細胞(7次繼代之WI-38)發生老化現象
    藉由pAS2載體過度表現切絲蛋白(CFL)基因
    將2.5 x 106個人類293T胚胎腎臟細胞待生長至七成鋪滿後，以慢病毒質體pAS2-cofilin及包含CMV-△R8.91與pMDG之病毒組裝質體進行共同轉染。質體pAS2-cofilin帶有一人類切絲蛋白之編碼區域(coding region)，可藉由巨細胞病毒驅動子(CMV promoter)驅動其表現。經過轉染16小時後，去除培養上清液並置換成含有1%牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)的新鮮培養液。將含有病毒顆粒的培養液，分別在培養後24及36小時收集兩次，以超高速(110,000 xg)離心兩個小時，沉澱物回溶在不含血清之培養液中。於感染標的細胞時，將含有病毒之培養液與8 μg/ml之凝聚胺(polybrene)(Sigma-Aldrich,Inc.,St. Louis,MO)混合，並加入標的細胞中培養24小時。將含有病毒之培養液置換成新鮮培養液，經24-48小時後再進行分析。
    如第7圖顯示，以西方墨點法分析偵測到，在年輕(少於7次繼代)之WI-38細胞中，切絲蛋白確實有被經由慢病毒(Lenti-virus)的轉染作用過度表現。比較X-gal染色分析之結果(如第8圖所示)，在年輕之WI-38細胞中使切絲蛋白基因過度表現，會誘發或促進細胞老化之現象。
    藉由減少cofilin表現量層次緩和老WI-38細胞(13次繼代之WI-38)老化現象
    利用干擾RNA(siRNA，靶定於切絲蛋白基因上之shRNA)抑制切絲蛋白(CFL)基因表現
    將2.5 x 106個人類293T胚胎腎臟細胞待生長至七成鋪滿後，以慢病毒質體pLKO.1-shCFL(clone ID: TRCN0000029713)及包含CMV-△R8.91與pMDG之病毒組裝質體進行共同轉染。質體pLKO.1-shCFL帶有一抑制人類切絲蛋白基因表現之髮夾RNA(shRNA)，該shRNA之序列可靶定至切絲蛋白mRNA上，並可抑制切絲蛋白1(cofilin1)的表現達98%以上。而shCFL之表現則係由位於pLKO.1載體上的U6驅動子(U6 promoter)所驅動。shRNA亦為一種siRNA，可透過分子生物的方法直接在細胞內變成siRNA。由經過轉染16小時後，去除培養上清液並置換成含有1%牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)的新鮮培養液。將含有病毒顆粒的培養液，分別在培養後24及36小時收集兩次，以超高速(110,000 xg)離心兩個小時，沉澱物回溶在不含血清之培養液中。於感染標的細胞時，將含有病毒之培養液與8 μg/ml之凝聚胺(polybrene)(Sigma-Aldrich,Inc.,St. Louis,MO)混合，並加入標的細胞中培養24小時。將含有病毒之培養液置換成新鮮培養液，經24-48小時後再進行分析。
    如第9圖所示，切絲蛋白之表現量減少可以暫止，或延緩WI-38細胞(WI-38 Y13)的老化現象。
    其他具體實施態樣
    本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。
    從上述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。
    第1圖(A)顯示年輕(培養5至7代)與老化之WI-38細胞(培養13至15代)在β-半乳糖甘酶活性與光學顯微鏡下所觀察到型態之差異。老化WI-38細胞顯示在細胞核周圍具有藍色。注意老化之WI-38細胞型態上增大並較為扁平，年輕、正處於增生之WI-38細胞比較小呈紡錘狀。
    第1圖(B)顯示年輕與老化之WI-38細胞中，細胞骨架(F-與G-actin)以間接免疫螢光染色分析。經由DAPI染色後可觀察到細胞核，每次實驗中顯微鏡下所觀察之區域為隨機選取，肌動蛋白絲(F-actin)與球狀肌動蛋白(G-actin)之螢光染色分析中，個別以A12397螢光素-共軛之鬼筆環肽，及玫紅-共軛之DNaseI進行染色。結果顯示與年輕細胞相比，較老細胞中其肌動蛋白之細胞骨架增加，球狀肌動蛋白則進入到細胞核中。(註：年輕細胞之球狀肌動蛋白分佈在細胞質)
    第2圖(A)為西方墨點法之圖示與其吸光值定量結果(B)，顯示在年輕(培養5至7代)與老化之WI-38細胞(培養13至15代)中，切絲蛋白、p-切絲蛋白、p53、p21、p27與p16蛋白表現量之多寡。
    第3圖顯示切絲蛋白(左圖)免疫組織化學染色分析與老化相關-β-半乳糖甘酶染色分析(右圖)，光學顯微鏡下觀察年輕(6週)與老化(80週)之小鼠中腦、肺、肝與腎臟組織切片。
    第4圖為抽取蛋白之免疫沉澱-西方墨點法分析圖(Immunoprecipitation-immunoblotting assay)(A)，與其吸光值定量結果(B)：顯示在年輕(6週)與老化(80週)小鼠之肺、肝與腎臟細胞中，所含有切絲蛋白之表現量。
    第5圖為顯示在人類老化纖維母細胞中，以SK-II PiteraTM處理可減少生物性指標：老化相關-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)之活性。(A)隨機選定在年輕與老化纖維母細胞區域中，以SA-β-gal為生物性指標之染色區域。(B)不同環境下定量具有SA-β-gal活性而染色的細胞數。Y軸為顯示有SA-β-gal活性的細胞百分比。實驗數據經由三次獨立實驗並隨機計算一百個細胞，數值以平均±標準差表示，*:p<0.05與未處理老化纖維母細胞比較。
    第6圖係以西方墨點法分析顯示老化的人類二倍體纖維母細胞中，其表現量增加的老化相關切絲蛋白-1，以SK-II PiteraTM處理所造成切絲蛋白-1表現量減少之影響。經由計算密度得到定量結果。(CFL1量以GADPH標準化)。GAPDH：內部對照組。Y：年輕細胞，O：老化細胞
    第7圖為以西方墨點法分析(A)與其吸光值定量結果(B)，顯示在過度表現切絲蛋白基因(pAS2載體)之年輕WI-38細胞中，與抑制切絲蛋白基因表現(由siRNA)的老化WI-38細胞中之切絲蛋白表現量。
    第8圖顯示在未處理與過度表現切絲蛋白基因的年輕WI-38細胞中，X-gal染色分析結果(A)與其吸光值定量結果(B)。以經pAS3-EGFP轉染之細胞做為陰性對照組。
    第9圖顯示在未處理與抑制切絲蛋白基因表現的老化WI-38細胞中，X-gal染色分析結果(A)與其吸光值定量結果(B)。以經pAS3-EGFP轉染之細胞做為陰性對照組。
    权利要求:
    Claims (26)
    [1] 一種測定細胞或組織樣本中之細胞老化狀態之方法，其包含：(a)　偵測一得自標的哺乳動物之培養細胞或組織樣本中的切絲蛋白表現量；(b)　將於培養細胞或組織樣本中所偵測到之切絲蛋白表現量，與於培養五至七代的年輕細胞中所取得之切絲蛋白表現量參考值進行比較；及(c)　藉由評估步驟(a)中所偵測得之切絲蛋白表現量是否高於年輕細胞中者，而決定受測試細胞或組織的老化狀態。
    [2] 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該切絲蛋白之表現量係經由西方墨點法進行評估。
    [3] 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該切絲蛋白之表現量係經由組織免疫染色法進行評估。
    [4] 根據申請專利範圍第1項之方法，其中當受測試的細胞或組織中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3倍以上，即判定為處於老化狀態。
    [5] 根據申請專利範圍第1項之方法，其中當受測試的細胞或組織中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3-10倍，即判定為處於老化狀態。
    [6] 根據申請專利範圍第1項之方法，其中當受測試的細胞或組織中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3-5倍，即判定為處於老化狀態。
    [7] 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含係使用β-半乳糖苷酶活性分析檢查標的細胞內之老化狀態的再次確認步驟。
    [8] 一種抗老化劑之篩選方法，其包含：(a)　將標的細胞進行培養五至七代(細胞仍保持年輕)，並偵測年輕細胞中切絲蛋白表現量以做為參考值；(b)　在年輕細胞中以一種候選抗老化劑處理，隨後將細胞進行培養至少經過13代(此時細胞被認為是老化的細胞)；(c)　偵測在經過抗老化劑處理之細胞中的切絲蛋白表現量；(d)　將於經處理細胞中所偵測到之切絲蛋白表現量與步驟(a)取得之參考值進行比較；及(e)　評估該候選抗老化劑對於減少或抑制切絲蛋白表現量之效用，以決定該候選抗老化劑是否能抑制經過處理之細胞的老化狀態。
    [9] 根據申請專利範圍第8項之篩選方法，其中當經處理細胞中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3倍以上，判定為處於老化狀態。
    [10] 根據申請專利範圍第8項之篩選方法，其中當經處理細胞中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3-10倍，判定為處於老化狀態。
    [11] 根據申請專利範圍第8項之篩選方法，其中當經處理細胞中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3-5倍，判定為處於老化狀態。
    [12] 根據申請專利範圍第8項之篩選方法，其中該切絲蛋白之表現量係經由西方墨點法進行評估。
    [13] 根據申請專利範圍第8項之篩選方法，其中該切絲蛋白之表現量係經由組織免疫染色法進行評估。
    [14] 根據申請專利範圍第8項之篩選方法，其進一步包含係使用β-半乳糖苷酶活性分析檢查標的細胞內之老化狀態的再次確認步驟。
    [15] 一種細胞老化誘導劑之篩選方法，其包含：(a)　將標的細胞進行培養五至七代(細胞仍保持年輕)，並偵測年輕細胞中切絲蛋白表現量以做為參考值；(b)　在年輕細胞中以一種候選老化誘導劑處理；(c)　偵測在經過處理之細胞中的切絲蛋白表現量；(d)　相較於步驟(a)取得之參考值，評估該候選老化誘導劑對於促進較高切絲蛋白表現量之效用；及(e)　決定該候選老化誘導劑是否能誘發經過處理之細胞的老化狀態。
    [16] 根據申請專利範圍第15項之篩選方法，其中當經處理細胞中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3倍以上，判定為被誘導處於老化狀態。
    [17] 根據申請專利範圍第15項之篩選方法，其中當經處理細胞中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3-10倍，判定為被誘導處於老化狀態。
    [18] 根據申請專利範圍第15項之篩選方法，其中當經處理細胞中之切絲蛋白表現量較年輕細胞中之參考值高出3-5倍，判定為被誘導處於老化狀態。
    [19] 根據申請專利範圍第15項之篩選方法，其中該切絲蛋白之表現量係經由西方墨點法進行評估。
    [20] 根據申請專利範圍第15項之篩選方法，其中該切絲蛋白之表現量係經由組織免疫染色法進行評估。
    [21] 根據申請專利範圍第15項之篩選方法，其進一步包含係使用β-半乳糖苷酶活性分析檢查標的細胞內之老化狀態的再次確認步驟。
    [22] 一種調節細胞老化之方法，其包含藉由調控切絲蛋白之表現量，來控制細胞老化的狀態。
    [23] 根據申請專利範圍第22項之方法，其係將年輕細胞中之切絲蛋白基因過度表現，以誘發或促進細胞老化。
    [24] 根據申請專利範圍第23項之方法，其係將切絲蛋白基因過度表現載體(over-expression vector)轉染至標的細胞內，以增加切絲蛋白之表現量。
    [25] 根據申請專利範圍第22項之方法，其係於較老之細胞中減少或抑制切絲蛋白的表現，以暫停或減緩老化現象。
    [26] 根據申請專利範圍第25項之方法，其係利用干擾RNA(siRNA)抑制切絲蛋白基因表現，來減緩細胞衰老狀態的進行。
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