• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:
    本發明提供一種高度表現REIC/Dkk-3蛋白質之腺病毒載體。一種用以使REIC/Dkk-3 DNA表現之DNA構建物，其自5'末端側連接有(i)CMV啟動子；(ii)REIC/Dkk-3 DNA；(iii)polyA附加序列；以及(iv)以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase，端粒酶逆轉錄酶)促進子、SV40促進子及CMV促進子之順序連接而成之促進子。
    公开号:TW201303018A
    申请号:TW101118828
    申请日:2012-05-25
    公开日:2013-01-16
    发明作者:Hiromi Kumon；Nam-Ho Huh；Masakiyo Sakaguchi；Masami Watanabe
    申请人:Univ Okayama Nat Univ Corp；Momotaro Gene Inc；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    REIC表現腺病毒載體
    本發明係關於一種包含啟動子、促進子等而高度表現REIC/Dkk-3蛋白質之腺病毒載體。
    自先前以來，為了提高基因表現效率，現開發有CMV(Cytomegaoviyns，巨細胞病毒)啟動子或CAG啟動子(雞β-肌動蛋白啟動子/巨細胞病毒前早期強化子)等各種基因表現啟動子(專利文獻1~4)。然而，於生物技術領域，即便使用該等先前技術，根據細胞之種類或基因之種類，亦經常產生如下問題：幾乎不引起基因表現，或表現蛋白質量極少。又，該問題於將基因表現用於診斷或治療之醫療發展中成為較大障礙。
    另一方面，作為與細胞之不朽化相關之基因，已知有REIC/Dkk-3基因，且報告有於癌細胞中該基因之表現受到抑制之情況，並且亦報告有將REIC/Dkk-3基因用於癌治療之情況(專利文獻5)。 先前技術文獻 專利文獻
    專利文獻1 日本專利公報第2814433號公報
    專利文獻2 日本專利公報第2814434號公報
    專利文獻3 美國專利第5168062號說明書
    專利文獻4 美國專利第5385839號說明書
    專利文獻5 國際公開第WO01/038523號說明書
    本發明之目的在於提供一種高度表現REIC/Dkk-3蛋白質之腺病毒載體。
    本發明等人對將REIC/Dkk-3基因用於癌之基因治療的情況進行了研究。發現藉由將REIC/Dkk-3基因組入表現載體中，並投予至活體內，會於癌治療方面發揮一定效果。本發明者等人考慮到藉由使REIC/Dkk-3基因於活體內更加高度表現，可能進一步提高癌之治療效果，而對使REIC/Dkk-3基因更加高度表現之方法進行了努力研究。
    本發明者嘗試開發出於利用啟動子之基因表現系統中可以更高效率使基因表現之新系統，利用各種基因之啟動子或促進子之組合來比較、研究啟動子活性。
    結果發現：使用CMV啟動子作為啟動子，將REIC/Dkk-3 DNA連接於CMV(cytomegarovirus)啟動子之下游，並於該DNA之下游連接polyA序列，進而於其下游連接以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase，端粒酶逆轉錄酶)促進子、SV40(Simian vacuolating virus 40，猴病毒40)促進子及CMV促進子之順序連接而成之促進子，將所獲得之構建物插入腺病毒載體中，並將該腺病毒載體投予至活體內，藉此於活體內，REIC/Dkk-3基因顯著高度表現，而發揮顯著優異之癌治療效果，從而完成本發明。
    即，本發明如下所述。
    [1]一種用來使REIC/Dkk-3 DNA表現之DNA構建物，其自5'末端側連接有(i)CMV啟動子；(ii)以下之REIC/Dkk-3 DNA：(a)包含序列編號1所表示之鹼基序列之DNA、(b)於嚴格條件下與包含序列編號1所表示之鹼基序列之互補鹼基序列的DNA雜交而獲得，且編碼具有誘導癌細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性之蛋白質的DNA、(c)包含自序列編號1所表示之鹼基序列中之第1號鹼基至第117號~第234號中之任一號鹼基為止之鹼基序列的多核苷酸、或(d)於嚴格條件下與包含自序列編號1所表示之鹼基序列中之第1號鹼基至第117號~第234號中之任一號鹼基之鹼基序列之互補鹼基序列的多核苷酸雜而獲得，且編碼具有誘導癌細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性之多肽的多核苷酸；(iii)polyA附加序列；以及(iv)以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)促進子、SV40促進子及CMV促進子之順序連接而成之促進子。
    [2]如[1]之DNA構建物，其中polyA附加序列為源自牛生長激素基因之聚腺苷酸附加序列(BGA polyA)。
    [3]如[1]或[2]之DNA構建物，其包含序列編號6所示之將(ii)REIC/Dkk-3 DNA、(iii)polyA附加序列及(iv)以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)促進子、SV40促進子及CMV促進子之順序連接而成之促進子連接而成的鹼基序列。
    [4]一種腺病毒載體，其包含如[1]或[2]之DNA構建物。
    [5]一種癌細胞死亡誘導劑，其包含如[4]之腺病毒載體。
    [6]一種腫瘤細胞增殖抑制劑，其包含如[4]之腺病毒載體。
    [7]一種癌治療藥，其包含如[4]之腺病毒載體。
    自5'末端側連接有(i)CMV啟動子、(ii)REIC/Dkk-3 DNA、(iii)polyA附加序列、及(iv)以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)促進子、SV40促進子及CMV促進子之順序連接而成之促進子的用來使REIC/Dkk-3 DNA表現之DNA構建物，於活體內高度表現REIC/Dkk-3 DNA，與包含於CMV啟動子或CAG啟動子之下游連接REIC/Dkk-3 DNA且不具有上述促進子之DNA構建物的腺病毒載體相比，顯示出更高之表現，可選擇性地誘導癌細胞死亡，抑制腫瘤增殖。因此，本發明之上述腺病毒載體可較佳地用於使用REIC/Dkk-3 DNA的癌之基因治療。
    本說明書包括作為本申請案之優先權之基礎的日本專利申請2011-117321號之說明書及/或圖式所記載之內容。
    以下，對本發明進行詳細說明。
    本發明係包含REIC/Dkk-3 DNA而可用於REIC蛋白質之表現的DNA構建物(DNA construct)，且係進而包含該DNA構建物之重組腺病毒載體。將本發明之DNA構建物之結構示於圖1。
    REIC/Dkk-3 DNA之鹼基序列表示於序列編號1中。又，REIC/Dkk-3 DNA編碼之REIC/Dkk-3蛋白質之胺基酸序列表示於序列編號2中。於本發明中，亦將REIC/Dkk-3稱為REIC。
    又，本發明之DNA構建物所含有之REIC/Dkk-3之DNA係如下者：於嚴格條件下與具有序列編號1所示之鹼基序列之互補鹼基序列之DNA進行雜交而獲得的DNA；於使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(美國國立生物學資訊中心之鹼基局部對準檢索工具))等(例如，使用預設值即初期設定之參數)進行計算時，與序列編號1所示之鹼基序列具有至少85%以上，較佳為90%以上，進而較佳為95%以上，尤佳為97%以上之序列同源性之DNA；或於編碼包含對於由上述DNA編碼之蛋白質之胺基酸序列有1個或複數個或數個(1~10個，較佳為1~5個，進而較佳為1個或2個)胺基酸經取代、缺失及/或附加之胺基酸序列之蛋白質的DNA等中，編碼具有癌細胞之誘導細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性之蛋白質的DNA。此處，所謂「嚴格條件」例如為「1 XSSC、0.1% SDS、37℃」左右之條件，更嚴格之條件為「0.5 XSSC、0.1% SDS、42℃」左右之條件，進而嚴格之條件為「0.2 XSSC、0.1% SDS、65℃」左右之條件。如上所述，雜交之條件越嚴格，越可期待單離出與探針序列具有高同源性之DNA。其中，上述SSC、SDS及溫度之條件之組合為例示，可藉由適當組合探針濃度、探針長度、雜交之反應時間等，而實現所需之嚴格度。對於從業者而言，「嚴格條件」可適宜決定雜交出序列同源性較高之DNA的條件。進而，本發明之DNA構建物所含有之REIC/Dkk-3之DNA係編碼序列編號2所示之蛋白質的DNA。
    進而，本發明之DNA構建物所含有之REIC/Dkk-3 DNA係包含該DNA之鹼基序列之一部分鹼基序列的核苷酸片段，且亦包含編碼具有誘導癌細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性之肽的核苷酸。此種核苷酸片段可藉由於適當部位切斷全長REIC/Dkk-3 DNA，並測定是否具有誘導癌細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性而容易地獲得。作為此種核苷酸片段，例如包括：包含自序列編號1所示之REIC/Dkk-3 DNA之鹼基序列中之第1號鹼基至第117號~第234號中之任一號鹼基為止之鹼基序列的多核苷酸；以及於嚴格條件下與包含自序列編號1所示之REIC/Dkk-3 DNA之鹼基序列中之第1號鹼基至第117號~第234號中之任一號鹼基為止之鹼基序列之互補鹼基序列的多核苷酸進行雜交而獲得，且編碼具有誘導癌細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性之多肽的多核苷酸。作為包含自序列編號1所示之REIC/Dkk-3 DNA之鹼基序列中之第1號鹼基至第117號~第234號中之任一號鹼基為止的鹼基序列之多核苷酸，可列舉包含自第1號之鹼基至第117號之鹼基的多核苷酸(序列編號3)或包含自第1號至第234號之鹼基的多核苷酸(序列編號4)。該等多核苷酸所編碼之多肽具有誘導癌細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性係揭示於例如日本專利特開2009-114103號公報中。
    REIC/Dkk-3 DNA可基於序列編號1之序列資訊而自人類細胞、人類組織等獲得。又，亦可依據WO01/038523號公報之記載而獲得。
    上述DNA構建物於REIC/Dkk-3 DNA之上游連接有CMV(cytomegarovirus)啟動子，且於REIC/Dkk-3 DNA之下游連接有聚腺苷酸附加序列(聚腺苷酸化序列、polyA)。聚腺苷酸附加序列(聚腺苷酸化序列、polyA)之來源並無限定，可列舉源自生長激素基因之聚腺苷酸附加序列，例如源自牛生長激素基因之聚腺苷酸附加序列(BGA polyA)(含於序列編號5所示之鹼基序列中(第13號鹼基以後之序列))或源自人類生長激素基因之聚腺苷酸附加序列、源自SV40病毒之聚腺苷酸附加序列、源自人類或兔之β血球蛋白基因之聚腺苷酸附加序列等。藉由使聚腺苷酸附加序列包含於DNA構建物中，會增大轉錄效率。進而，於該聚腺苷酸附加序列之下游連接有以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)促進子、SV40促進子及CMV(cytomegarovirus)促進子之順序連接而成者(3×enh)(將序列示於圖2之「3×enh」部分，圖2之序列表示於序列編號6中)。即，上述DNA構建物係自5'末端側連接有(i)CMV啟動子、(ii)REIC/Dkk-3 DNA、(iii)polyA附加序列以及(iv)以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)促進子、SV40促進子及CMV促進子之順序連接而成之促進子者。
    上述各元件必須進行進行功能性連接。此處，所謂進行功能性連接，係指以各元件發揮其功能，增強欲表現之基因之表現的方式進行連接。
    上述表現用盒例如可藉由如下方式獲得：將REIC/Dkk-3 DNA插入市售之於CMV啟動子之下游包含外源基因插入部位，進而於其下游包含BGA polyA序列之pShuttle載體(Clonetech公司)中，進而於BGA polyA序列之下游依序連接hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)促進子、SV40促進子及CMV促進子。
    將本發明之包含REIC/Dkk-3 DNA之DNA構建物之除CMV啟動子以外之部分之結構示於圖2，並將序列示於序列編號6。圖2中，於REIC/Dkk-3 DNA與3×enh之間含有BGA polyA序列。本發明之包含REIC/Dkk-3 DNA之DNA構建物於序列編號4所示之序列之上游(5'側)具有CMV啟動子。
    本發明之上述DNA構建物係導入至腺病毒載體中而使用。本發明亦含有包含用來使上述REIC/Dkk-3 DNA表現之DNA構建物的腺病毒載體。將包含本發明之DNA構建物之載體系統稱為SGE(Super Gene Expression，超級基因表現)系統，例如將含有包含REIC/Dkk-3 DNA及CMV啟動子之DNA構建物的腺病毒載體稱為Ad-SGE-CMV-REIC。包含上述DNA構建物之腺病毒載體係藉由於腺病毒載體中導入上述DNA構建物，製作重組腺病毒而獲得。向腺病毒之DNA構建物之導入例如可藉由將包含上述本發明之DNA構建物之pShuttle載體中的DNA構建物導入至腺病毒中而進行。
    作為腺病毒載體之特徵，可列舉如下方面：(1)可基因導入至多種細胞中；(2)即便對於增殖停止期之細胞，亦可效率良好地進行基因導入；(3)可藉由離心進行濃縮而獲得高效價(10~11 PFU/ml以上)之病毒；(4)適於直接基因導入至活體內(in vivo)之組織細胞中。
    作為基因治療用之腺病毒，雖開發有使E1/E3區域缺失之第1代腺病毒載體(Miyake,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,1320,1996)；除E1/E3區域以外，亦使E2或E4區域缺失之第2代腺病毒載體(Lieber,A.,et al.,J.Virol.,70,8944,1996；Mizuguchi,H.& Kay,M.A.,Hum.Gene Ther.,10,2013,1999)；使腺病毒基因組幾乎完全缺失之(GUTLESS)第3代腺病毒載體(Steinwaerder,D.S.,et al.,J.Virol.,73,9303,1999)；導入本發明之基因時並無特別限定，可使用任一種腺病毒載體。
    將包含本發明之含有REIC/Dkk-3 DNA之DNA構建物的重組腺病毒載體投予人類或其他哺乳動物之被試驗體，藉此將癌治療用基因傳遞至被試驗體之癌細胞中，於癌細胞中表現基因，選擇性地誘導癌細胞之細胞死亡，及/或抑制腫瘤細胞增殖，而發揮癌治療效果。本發明係含有包含此種腺病毒載體之癌治療用病毒製劑。作為成為治療對象之癌，並無限定，例如可列舉：腦/神經腫瘤、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤/白血病、結腸癌、胰腺癌、肛門/直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、腎上腺癌、腎癌、腎盂輸尿管癌、膀胱癌、攝護腺癌、尿道癌、陰莖癌、睾丸癌、骨/骨肉瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、間皮瘤等。本發明之腺病毒載體亦可用於原發性癌之治療，亦可用於轉移性癌之治療。進而，亦包括將上述腺病毒載體投予至被試驗體體內而治療癌之方法。
    本發明之腺病毒載體可藉由可於基因治療領域中使用之方法，例如靜脈內投予或動脈動脈內投予等血管內投予、經口投予、腹腔內投予、氣管內投予、支氣管內投予、皮下投予、經皮投予等而投予。尤其是本發明之腺病毒載體因向特定之組織、細胞之指向性較大，可有效地將目標基因向特定之組織、細胞進行傳遞，因此即便藉由血管內投予，亦可有效地進行診斷、治療。
    腺病毒載體投予治療上之有效量即可。對於基因治療領域之業者而言，治療上之有效量可容易地決定。進而，投予量可根據實驗者之病情之嚴重程度、性別、年齡、體重、習慣等而適當改變。例如將腺病毒載體以0.5×1011~2.0×1012病毒基因組(viral genome)/kg體重，較佳為1.0×1011~1.0×1012病毒基因組/kg體重，進而較佳為1.0×1011~5.0×1011病毒基因組/kg體重之量進行投予即可。病毒基因組表示腺病毒之基因組之分子數(病毒粒子數)，亦稱為粒子(particle粒子)。於製劑領域中，包含通常使用之載體、稀釋劑、賦形劑。例如作為錠劑用之載體、賦形劑，可使用乳糖、硬脂酸鎂等。作為注射用之水性液，可使用生理鹽水、葡萄糖或含其他補助藥之等張液等，亦可與適當之溶解助劑，例如醇、丙二醇等多元醇、非離子界面活性劑等併用。作為油性液，可使用芝麻油、大豆油等，亦可併用苯甲酸苄酯、苄醇等作為溶解助劑。
    藉由以下之實施例對本發明進行具體說明，但本發明不受該等實施例之限定。 實施例1 pShuttle-REIC-TSC質體之製作
    製作包含人類REIC/Dkk-3基因作為外源基因(插入基因)之本發明之DNA構建物。所使用之DNA構建物係將編碼REIC/Dkk-3蛋白質之DNA插入至市售之pShuttle質體載體(Clontech)之Xba1-Kpn1之插入部，進而將3個促進子(hTERT促進子、SV40促進子及CMV促進子)(將該等稱為TSC)以BGH poly A加上3個促進子之形式插入至該編碼REIC/Dkk-3蛋白質之DNA之下游之Kpn1-EcoR1的插入部位而構建的構建物(圖1)。將插入有編碼REIC之DNA的構建物之鹼基序列(除CMV啟動子之序列以外)(序列編號6)示於圖2。又，將上述構建物所含有之包含BGH poly A與3個促進子之區域的鹼基序列示於序列編號7。圖2之鹼基序列中之(1)及(2)之框所包圍之部分分別表示編碼REIC/Dkk-3蛋白質之DNA及3個促進子(3xenh)。將包含上述構建物之pShuttle質體載體稱為pShuttle-REIC-TSC質體。 實施例2 Ad-SGE-CMV-REIC之製作
    進而，製作包含上述構建物之重組腺病毒載體。
    製作係使用Adeno-X(商標)表現系統1(Expression System 1)(TaKaRa Code.Z1513N)及質體提取試劑盒(Plasmid Midi kit)(QIAGEN Code.12143)。
    將包含圖1所示之構建物之重組腺病毒載體稱為Ad-SGE-CMV-REIC。 1. Adeno-X質體之製作
    利用限制酶PI-SceI,I-CeuI消化pShuttle-REIC-TSC質體，獲得目標基因特異性之表現盒。連接於Adeno-X Viral DNA上，利用SwaI消化連接產物。利用連接產物使電勝任細胞(electro competent cell)DH10B轉形，於添加安比西林之LB瓊脂培養基中進行培養。拾取所獲得之菌落，利用Adeno-X System PCR Screening Priner Set進行擴增，並利用電泳確認擴增帶。具有目標基因表現盒之Adeno-X質體DNA獲得287 bp之擴增帶，確認所選擇之菌落#1、2、4、5、7為目標之質體(圖3)。針對所選擇之菌落#4，使用構建於選殖位點SwaI之上游及下游之引子，進行定序。由解析結果確認：該重組質體於正向插入目標基因，且於連接操作中沒有多餘之鹼基之插入或缺失。
    針對選擇之純系#4，於大腸菌中進行轉型，並於包含安比西林之LB培養基中進行振盪培養。次日，利用DNA純化試劑盒，自培養菌體純化質體DNA。利用限制酶XhoI、PacI消化一部分，利用瓊脂糖凝膠電泳而檢測出所期待片段大小之電泳帶(圖4)(XhoI消化：0.6 kbp、1.4 kbp、2.6 kbp、8 kbp、9 kbp、14.5 kbp PacI消化：2.9 kbp、33.3 kbp)
    確認如下情況：由此擴大製備之純系為目標重組質體。 2.重組腺病毒之製作 (i)1次病毒之製作
    利用含有1/10體積之FBS、最終濃度2 mML-麩胺酸及1/100體積之青黴素、鏈黴素溶液的DMEM培養基，於1塊6 cm膠原塗覆培養皿中，培養293細胞直至100%融合，並使用TransIT-293，轉染利用限制酶PacI進行消化之AdenoX-REIC-TSC質體5 μg。於24小時後交換培養基，於第13天確認細胞變性後，回收細胞。使細胞顆粒均勻懸浮於培養基中，並重複冷凍融解3次，將其離心上清液作為各1次病毒液。 (ii)2次病毒之製作
    使於6 cm膠原塗覆培養皿中培養至70%~100%融合之293細胞感染1次病毒液。病毒感染時，係使用含有1/20體積之FBS、最終濃度2 mML-麩胺酸及1/100體積之青黴素、鏈黴素溶液的DMEM培養基。確認293細胞變性後，回收細胞，反覆進行冷凍融解3次，將其離心上清液作為2次病毒。 (iii)3次病毒之製作
    使於T-75膠原塗覆燒瓶中培養至70%~100%融合之293細胞感染2次病毒。確認293細胞完全變性後，回收每個培養液之細胞，進行超音波處理後，將離心上清液作為3次病毒。以1 mL/vial進行分注，利用乾冰進行急速冷凍，其後保管於-80℃下。 3.純化重組腺病毒之製備方法 (i)擴大製備
    於多層型細胞培養燒瓶中培養293細胞直至融合。使用Adeno-X(商標)-Rapid Titer Kit確認效價，於最佳條件下感染293細胞。確認293細胞完全變性後，回收細胞，將冷凍融解液之離心上清液作為病毒液。 (ii)利用氯化銫密度梯度離心法之純化
    利用超離心試管，使氯化銫溶液及上述(i)中獲得之病毒液重層，於4℃、25,000 rpm下離心2小時。回收所形成之病毒帶，進而添加氯化銫溶液，於4℃、35,000 rpm下超離心分離3小時，回收所形成之病毒帶。利用透析盒，於含有10%甘油之PBS(-)中，透析利用2次之超離心回收之病毒液。以0.5 mL分注透析回收液，並於-80℃下冷凍保存。 4.純化重組腺病毒之品質檢查 (i)效價測定(TCID50法)
    利用培養基將純化病毒液稀釋1×106倍。於塗覆膠原蛋白之96孔培養板上，以每次3倍共11階段進行稀釋，添加等量之293細胞懸浮液50 μL，進行培養。對照組係僅添加298細胞懸浮液與培養基進行培養。於第14天，藉由顯微鏡下之肉眼觀察而判定細胞變性之終點，使用以下所示之Kaber之式計算50%細胞變性終點(TCID50)(表1)。藉由本方法算出之TCID50之值與pfu一致，因而設為1 TCID50=1 pfu。
    Kaber之式TCID50=(第1列之稀釋率)×(系列稀釋倍率)Σ-05
    其中Σ=各稀釋階段之(變性孔數)/(樣品數)之總和
    (ii)結構確認
    使於膠原塗覆24孔板中培養至70%~100%融合的293細胞感染1 μL之利用PBS 10倍稀釋純化病毒液而成之病毒液。確認細胞完全變性後，回收細胞，提取製備總DNA，利用限制酶XhoI進行消化，進行瓊脂糖凝膠電泳。對所期待之片段大小0.6 kbp、1.44 kbp、2.46 kbp、6.1 kbp、8 kbp、14.5 kbp進行檢測，確認插入有目標大小之DNA片段(圖5)。 (iii)RCA(Replication Competent Adenovirus，複製型腺病毒)檢查(PCR法)
    使於24孔板中培養至70%~100%融合的HeLa細胞感染1 μL之利用PBS 10倍稀釋純化病毒液而成之病毒液，3天後回收細胞並製備總DNA。以提取DNA作為模板，使用ElA基因檢測引子正義：5'-ATGAGACATATTATCTGCCAC-3(序列編號8)及反義：5'-GTAAGTCAATCCCTTCCTGCAC-3')(序列編號9)進行PCR。其結果為，利用本引子所擴增之240 bp之El基因之帶於任一病毒樣本中均未檢測到，因此判斷為未混入RCA(圖6)。 實施例3 使用Ad-SGE-CMV-REIC之細胞中之REIC蛋白質的表現
    利用10 MOI(multiplicity of infection，感染倍數)，於無血清培養基中，對實施例2中所製作之重組腺病毒載體Ad-SGE-CMV-REIC及具有於REIC/Dkk-3 DNA之上游僅插入CMV啟動子而不具有3×enh之構建物的重組腺病毒載體(Ad-CMV-REIC)進行2小時處理而轉染至PC3細胞或HeLa細胞中，12小時後藉由西方墨點檢測到細胞內之人類REIC蛋白質之表現。
    將結果示於圖7。如圖所示，使用有Ad-SGE-CMV-REIC之情形與使用有Ad-CMV-REIC之情形相比，REIC基因之表現顯著獲得增強。
    該結果顯示：使用有Ad-SGE-CMV-REIC之情形與先前使用有Ad-CMV-REIC之情形相比，可於人類之癌治療中，期待相同投予量(viral particle)下之治療效果(抗腫瘤效果)之增大，進而可藉由減少腺病毒載體之投予量，而期持與先前相同之效果下之副作用之減輕。 實施例4 利用Ad-SGE-CMV-REIC之誘導細胞死亡
    為了調查活體外(in vitro)之誘導細胞死亡，而於平底6孔板上接種細胞並培養24小時。利用50 MOI(multiplicity of infection)，於無血清培養基中對Ad-SGE-CMV-REIC、Ad-CMV-REIC及具有於REIC/Dkk-3 DNA之上游僅插入具有使CMV促進子與雞β-肌動蛋白啟動子連接而成之結構的CAG啟動子而不具有3×enh之構建物的重組腺病毒載體(Ad-CAG-REIC)進行2小時處理而轉染至細胞中，其後更換為新鮮完全培養基。使用包含LacZ基因之腺病毒載體(Ad-LacZ)作為對照。培養48小時後，以2 μg/ml之濃度添加Hoechst33342儲備溶液(stock solution)，並於光暗條件下培養細胞10分鐘。Hoecht33342為嵌入染色試劑，可調查染色質之總量與染色質之凝結程度(Belloc F et al.,Cytometry 1994；17：59-65、Maciorowski Z et al.,Cytometry 1998；32：44-50)。使用螢光顯微鏡，鑑定具有高度凝結並解偶之核之發現細胞死亡之細胞。對於發現細胞死亡之細胞，於顯微鏡下於3~5個不同視野中進行計數。
    為了於活體外(in vivo)檢測發現細胞死亡之細胞，而使用In situ Cell Detection Kit，Fluorescein(Roche)進行TUNEL(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated UTP end labeling，末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法)分析。即，切割腫瘤組織，放入OCT化合物中，並於液氮中進行急速冷凍。使用甲醇，於室溫下固定冷凍切片(10 μm)樣本30分鐘並清洗，使之浸透包含0.1% Triton X-100之PBS，並利用TUNEL反應混合液進行染色。
    將使用有各自之重組腺病毒之各細胞之細胞死亡誘導率(%)示於圖8。如圖所示，使用Ad-SGE-CMV-REIC之情形與使用其他重組腺病毒的情形相比，獲得顯著較高之細胞死亡誘導率(%)。 實施例5 Ad-SGE-CMV-REIC之腫瘤增殖抑制效果(其1)
    BALB/C小鼠、雌性(6~8週齡)、1群4隻，於開始治療7天前(Day[-7])，將2×105個RENCA細胞(源自小鼠腎癌之細胞)皮下注入至右大腿部。於第0天(Day 0)，於各小鼠體內發現腫瘤，於第0天(Day 0)，將包含5×109個病毒粒子(viral particle)/100 μL(Ad-SGE-CMV-REIC、Ad-CMV-REIC或Ad-CAG-REIC)之PBS注入腫瘤內。使用包含LacZ基因之腺病毒載體(Ad-LacZ)作為對照。又，作為陰性對照，注射相同量之PBS。2週1次測定腫瘤之大小。腫瘤體積係藉由利用實驗而導出之式(1/2×(w1×w2×w2)：w1表示腫瘤之最大直徑，w2表示腫瘤之最小直徑)而計算。
    將結果示於圖9。如圖所示，於Ad-SGE-CMV-REIC治療群中，與其他4群相比，顯示出顯著較小之腫瘤體積，且與其他4群相比，發現最強之腫瘤增殖抑制效果。
    進而，於各治療群中，將於第14天(Day 14)取出皮下腫瘤之代表性之2隻小鼠之腫瘤照片示於圖10。由圖10亦得知：於Ad-SGE-CMV-REIC治療群中，與其他4群相比，顯示出顯著低之腫瘤體積。 實施例6 Ad-SGE-CMV-REIC之腫瘤增殖抑制效果(其2)
    BALB/C小鼠、雌性(6~8週齡)、1群4~5隻，於開始治療7天前(Day[-7])，將2×105個RENCA細胞(源自小鼠腎癌之細胞)皮下注入至右大腿部。於第0日天(Day 0)，於各小鼠中發現腫瘤，於第0天(Day 0)，將包含1×109個病毒粒子(viral particle)/100 μL(Ad-SGE-CMV-REIC、Ad-CMV-REIC或Ad-CAG-REIC)之PBS注入至腫瘤內。使用包含LacZ基因之腺病毒載體(Ad-LacZ)作為對照。又，作為陰性對照，注射相同量之PBS。2週1次測定腫瘤之大小。腫瘤體積係藉由利用實驗而導出之式(1/2×(w1×w2×w2)：w1表示腫瘤之最大直徑，w2表示腫瘤之最小直徑)而計算。
    將結果示於圖11。如圖所示，於Ad-SGE-CMV-REIC治療群中，與其他4群相比，顯示出顯著低之腫瘤體積，且與其他4群相比，發現最強之腫瘤增殖抑制效果。 產業上之可利用性
    本發明之含有包含REIC/Dkk-3 DNA之DNA構建物的腺病毒載體可用作癌治療藥。 序列表自由內容 序列編號8及9 引子
    將本說明書引用之全部的出版物、專利及專利申請直接作為參考而引入本說明書中。
    圖1係表示本發明之REIC/Dkk-3 DNA表現用構建物之結構的圖。
    圖2係表示本發明之REIC/Dkk-3 DNA表現用構建物之鹼基序列的圖。
    圖3係表示確認插入包含所製作之本發明之構建物之腺病毒載體之結果的圖。
    圖4係表示確認包含所製作之本發明之構建物之腺病毒載體之結構之結果的圖。
    圖5係表示確認包含經純化之本發明之構建物之腺病毒載體之結構之結果的圖。
    圖6係表示包含所製作之包含本發明之構建物之腺病毒載體之RCA(Replication Competent Adenovirus，腺病毒複製能力)檢查結果的圖。
    圖7係表示使用各種載體之情形時之REIC-Dkk-3基因表現之強度的圖。
    圖8係表示使用各種載體之情形時之誘導細胞死亡之程度的圖。
    圖9係表示使用各種載體之情形時之腫瘤增殖抑制效果的圖(其1)。
    圖10係表示使用各種載體之情形時之顯示出腫瘤增殖抑制效果之治療後之腫瘤的圖。
    圖11係表示使用各種載體之情形時之腫瘤增殖抑制效果的圖(其2)。
    <110> 1.國立學校法人岡山大學
    2.日商桃太郎源股份有限公司
    <120> REIC表現腺病毒載體
    <130> PH-5259-PCT
    <140> 101118828
    <141> 2012-05-25
    <150> JP 2011-117321
    <151> 2011-05-25
    <160> 9
    <170> PatentIn第3.5版
    <210> 1
    <211> 1053
    <212> DNA
    <213> 智人
    <220>
    <221> CDS
    <222> (1)..(1053)
    <400> 1
    <210> 2
    <211> 350
    <212> PRT
    <213> 智人
    <400> 2
    <210> 3
    <211> 117
    <212> DNA
    <213> 智人
    <400> 3
    <210> 4
    <211> 234
    <212> DNA
    <213> 智人
    <400> 4
    <210> 5
    <211> 262
    <212> DNA
    <213> 人工
    <220>
    <223> 合成
    <400> 5
    <210> 6
    <211> 2355
    <212> DNA
    <213> 人工
    <220>
    <223> 合成
    <400> 6
    <210> 7
    <211> 1285
    <212> DNA
    <213> 人工
    <220>
    <223> 合成
    <400> 7
    <210> 8
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工
    <220>
    <223> 引子
    <400> 8
    <210> 9
    <211> 22
    <212> DNA
    <213> 人工
    <220>
    <223> 引子
    <400> 9
    权利要求:
    Claims (7)
    [1] 一種用以使REIC/Dkk-3 DNA表現之DNA構建物，其自5'末端側連接有(i)CMV啟動子；(ii)以下之REIC/Dkk-3 DNA：(a)包含序列編號1所表示之鹼基序列之DNA、(b)於嚴格條件下與包含序列編號1所表示之鹼基序列之互補鹼基序列之DNA雜交而獲得，且編碼具有誘導癌細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性之蛋白質的DNA、(c)包含自序列編號1所表示之鹼基序列中之第1號鹼基至第117號鹼基~第234號鹼基中之任一號鹼基為止之鹼基序列的多核苷酸、或(d)於嚴格條件下與包含自序列編號1所表示之鹼基序列中之第1號鹼基至第117號鹼基~第234號鹼基中之任一號鹼基為止之鹼基序列之互補鹼基序列的多核苷酸雜交而獲得，且編碼具有誘導癌細胞死亡活性及/或抑制腫瘤細胞增殖活性之多肽的多核苷酸；(iii)polyA附加序列；以及(iv)以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)促進子、SV40促進子及CMV促進子之順序連接而成之促進子。
    [2] 如請求項1之DNA構建物，其中polyA附加序列為源自牛生長激素基因之聚腺苷酸附加序列(BGA polyA)。
    [3] 如請求項1或2之DNA構建物，其包含序列編號6所示之將(ii)REIC/Dkk-3 DNA、(iii)polyA附加序列及(iv)以hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)促進子、SV40促進子及CMV促進子之順序連接而成之促進子連接而成的鹼基序列。
    [4] 一種腺病毒載體，其包含如請求項1或2之DNA構建物。
    [5] 一種癌細胞死亡誘導劑，其包含如請求項4之腺病毒載體。
    [6] 一種腫瘤細胞增殖抑制劑，其包含如請求項4之腺病毒載體。
    [7] 一種癌治療藥，其包含如請求項4之腺病毒載體。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    JP5006045B2|2012-08-22|テロメライシン−ｇｆｐ遺伝子含有組換えウイルス
    JP5662534B2|2015-01-28|ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子の部分断片及び該断片を含むがん治療薬
    WO2006098074A1|2006-09-21|前立腺癌細胞のアポトーシス誘発剤
    WO2013142380A1|2013-09-26|Oncovector nucleic acid molecules and methods of use
    US20140017668A1|2014-01-16|COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING AND QUANTIFYING CIRCULATING TUMOR CELLS |
    TWI545196B|2016-08-11|Ｒｅｉｃ表現腺病毒載體
    JP2009114103A|2009-05-28|抗癌剤耐性癌において抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤
    JP2020503390A|2020-01-30|治療用タンパク質の標的細胞特異的な産生のため、および標的細胞に関連する疾患、状態、または障害の治療のための、膜融合性脂質ナノ粒子、ならびにその作製および使用のための方法
    KR101478869B1|2015-01-06|마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제
    Qu et al.2014|Inhibitory effect of biosynthetic nanoscale peptide Melittin on hepatocellular carcinoma, driven by survivin promoter
    KR20190071623A|2019-06-24|Tert 프로모터 돌연변이에 특이적인 crispr 시스템 및 그의 이용
    JP2006519614A|2006-08-31|悪性かつ形質転換した哺乳動物細胞を選択的に殺すペプチド
    US20050079158A1|2005-04-14|Construct of anti-cancer recombinant adenovirus, method for preparing the same and use thereof
    JP5551593B2|2014-07-16|新規悪性中皮腫治療剤及び免疫賦活化剤
    US20050271622A1|2005-12-08|Construct of tumor-selective recombinant adenovirus, method for preparing the same and use thereof
    JP6153205B2|2017-06-28|Ｖａ遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを調製するための前駆体ベクター
    JP5733705B2|2015-06-10|特異的プロモーターの活性を上昇させるシステム及び該システムを保持したベクター
    CA2675342C|2013-12-17|A method for diagnosing disease using adenovirus harboring trans-splicing ribozyme by molecular imaging
    JP6913930B2|2021-08-04|扁平上皮癌に対する抗腫瘍剤
    RU2551784C1|2015-05-27|Универсальный промотор для экспрессии терапевтических генов в клетках млекопитающих
    WO2007018322A1|2007-02-15|Gene therapeutic agent of cancer comprising recombinant adeno-associated virus containing antisense cdnas of vegf-a, vegf-b and vegf-c and recombinant adeno-associated virus containing vegfr truncated soluble cdna
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    JP6014029B2|2016-10-25|
    EP2716756B1|2021-12-08|
    JPWO2012161352A1|2014-07-31|
    CN103562386A|2014-02-05|
    US9222107B2|2015-12-29|
    WO2012161352A1|2012-11-29|
    EP2716756A1|2014-04-09|
    TWI545196B|2016-08-11|
    EP2716756A4|2015-02-18|
    US20140147917A1|2014-05-29|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US5168062A|1985-01-30|1992-12-01|University Of Iowa Research Foundation|Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence|
    GB8613481D0|1986-06-04|1986-07-09|Diatech Ltd|Translation of mrna|
    JP2814434B2|1988-02-24|1998-10-22|株式会社東芝|医用画像処理装置|
    JP3813872B2|1999-11-19|2006-08-23|公文裕巳|細胞増殖抑制タンパク質、ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、並びにそれらを用いる細胞増殖抑制剤、癌診断薬、癌治療剤、および遺伝子治療用組成物|
    CN1296967A|1999-11-23|2001-05-30|上海博容基因开发有限公司|一种新的多肽——人耳聋相关基因14和编码这种多肽的多核苷酸|
    US7384744B2|2002-11-29|2008-06-10|Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg|Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products|
    DE10256083A1|2002-11-29|2004-08-12|Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg|Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen|
    WO2006098074A1|2005-03-15|2006-09-21|Hiromi Kumon|前立腺癌細胞のアポトーシス誘発剤|
    EP1931390B1|2005-10-05|2012-07-25|Bayhill Therapeutics, Inc.|Compositions and methods for treatment of autoimmune disease|
    CA2633087C|2005-12-12|2014-12-02|Canji, Inc.|Adenoviral expression vectors|
    KR20100038280A|2007-01-25|2010-04-14|앰프로틴 코포레이션|닭 베타 액틴 유전자 인트론-1의 용도|
    JP5279235B2|2007-11-05|2013-09-04|国立大学法人岡山大学|抗癌剤耐性癌において抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤|
    CN101993892A|2009-08-31|2011-03-30|长沙赢润生物技术有限公司|肿瘤细胞中靶向性表达shRNA的真核表达载体|
    KR101752941B1|2009-11-19|2017-07-03|고꾸리츠 다이가꾸 호우징 오까야마 다이가꾸|유전자 발현을 상승시키는 시스템 및 이 시스템을 유지한 벡터|
    JP2011117321A|2009-12-01|2011-06-16|Mitsubishi Electric Corp|密閉型圧縮|
    WO2012002582A1|2010-07-01|2012-01-05|国立大学法人岡山大学|REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド|CN106459930B|2014-05-28|2020-03-03|国立大学法人冈山大学|表达reic基因的条件复制型腺病毒|
    CN104450786A|2014-12-16|2015-03-25|南方医科大学|一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法|
    CN108367082A|2016-01-08|2018-08-03|桃太郎源株式会社|使用REIC/Dkk-3基因和检查点抑制剂的组合疗法|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2011117321||2011-05-25||
    [返回顶部]