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    在此提供專一於登革病毒之單株抗體，以及其抗原結合片段與功能性變體。同時揭露其用於治療或診斷登革病毒感染之用途。
    公开号:TW201303014A
    申请号:TW100125171
    申请日:2011-07-15
    公开日:2013-01-16
    发明作者:Han-Chung Wu；Pi-Chun Li；mei-ying Liao；Chien-Yu Chiu
    申请人:Academia Sinica；
    IPC主号:Y02A50-00
    专利说明:
    抗登革病毒抗體
    本發明係關於一種單株抗體，特別是關於一種抗登革病毒之單株抗體。
    登革熱(Dengue fever)，由登革病毒感染所造成，是一種經由節肢動物感染人類的重要疾病，在熱帶及亞熱帶地區已造成傳播性的公共衛生問題。全球每年大約有5000萬~1億個登革熱(dengue fever,DF)病例，以及50萬個出血性登革熱(dengue hemorrhagic fever,DHF)，約有2千5百萬的人口具有感染登革熱的風險(Farrar et al.,2007;Halstead,2007;Normile,2007)。登革病毒感染後其症狀可能由輕微的發熱、頭痛及關節痛等至嚴重的出血性登革熱(DHF)/及具致命威脅性(Kalayanarooj et al.,1997)的登革休克症候群(dengue shock syndrome，DSS)。
    登革病毒(Dengue virus,DENV)具有四種基因及抗原相關之病毒血清型，分別是DENV-1、-2、-3及-4。登革病毒係為黃病毒科(family Flaviviridae)，黃病毒屬(genus Flavivirus)，具有大約11 kb的正股(positive-sense) RNA。黃病毒合成一聚合蛋白(polyprotein)，係被宿主及病毒蛋白酶加工進而產生三種結構蛋白，即殼體蛋白(C)、前驅膜/膜(prM/M)及套膜蛋白(E)，以及七種非結構蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B及NS5)(Rice et al.,1985)。殼體蛋白(C)是一個11 kDa的小蛋白，帶有高度正電性，其為組裝核殼(nucleocapsid)及病毒粒子(viral particle)成熟時所需(Kuhn et al.,2002)。NS1是一種45 kDa的醣蛋白，其可轉移到內質網(ER)內腔並由細胞釋出(Schlesinger et al.,1990)，其具有幫助病毒RNA複製的功能(Lindenbach and Rice,1997,1999)。NS1蛋白在溶液中形成穩定的寡聚物(二聚體及六聚體)(Flamand et al.,1999;Winkler et al.,1989)。套膜蛋白(E)是一種53 kDa的醣蛋白，對於病毒入侵、與細胞受體之結合及中和性抗體的誘發都相當重要(Kuhn et al.,2002;Pierson et al.,2008;Pokidysheva et al.,2006;Roehrig,2003)。套膜蛋白(E)係為登革病毒的外部表面，且由90個套膜蛋白二聚體所組成(Kuhn et al.,2002;Zhang et al.,2003)。
    套膜蛋白(E)單體包含三個結構性及功能性的區域(Crill and Roehrig,2001;Modis et al.,2003,2005;Rey et al.,1995;Roehrig,2003)。套膜蛋白區域I(E protein domain I,E-DI)是一種中央β-摺疊結構(β-barrel)。套膜蛋白區域II(E protein domain II,E-DII)形成兩個類長指狀結構且包含黃病毒保留融合環(flavivirus conserved fusion loop)。套膜蛋白區域III(E-DIII)具有一個類免疫球蛋白摺疊(immuglobulin-like fold)且被認為可在病毒與宿主細胞受體間交互作用(Mukhopadhyay et al.,2005)。其生物特徵及對老鼠MAbs的抗原決定位專一性顯示出黃病毒套膜蛋白的抗原結構。可辨認包括在E-DI中之抗原決定位的抗體，係同時具備病毒專一性及交叉反應，主要是非中和性抗原決定位。與E-DII有反應的抗體係具有廣泛交互作用，但對於中和性則較弱。E-DIII能誘導出具有血清型專一性、高度保護性的中和抗體及交互作用的抗體(Crill and Chang,2004;Crill and Roehrig,2001;Gromowski et al.,2008;Roehrig et al.,1998;Sukupolvi-Petty et al.,2007)。
    在對抗登革病毒方面，抗體扮演了一種重要角色。然而，抗體也跟登革病毒感染的嚴重臨床表現的發展有關。抗體依賴性增強(Antibody-dependent enhancement,ADE)描述在交叉反應性抗E免疫球蛋白(anti-E immunoglobulins)表現非中和性或次中和性濃度時，有助於病毒感染的效能增加(Halstead and O'Rourke,1977)。抗體-病毒複合體貼附於循環單核細胞(circulating monocyte)的Fc受體，藉此顯示出登革病毒在具Fc受體的細胞中可複製出至較高效價(Halstead,1988;Littaua et al.,1990)。其整體結果導致可能形成更嚴重的疾病。更進一步，抗NS1抗體(anti-NS1 antibody)被報載可對抗登革病毒感染(Falgout et al.,1990;Qu et al.,1993)。同時，其顯示出抗NS1抗體可結合於表皮細胞且可與部份自體抗原產生交叉反應，誘導出細胞激素(cytokine)、趨化素(chemokine)的表現，且造成細胞凋亡(apoptosis)(Lin et al.,2005;Lin et al.,2002)。此些文獻顯示該些抗套膜(E)及NS1蛋白的抗體，同時也與登革病毒疾病的致病過程有關。因此，急需發展一種可安全且有效對抗登革病毒的疫苗或治療藥物。
    在一方面，本發明揭露一些抗登革病毒單株抗體，即DB2-3,DB3-4,DB5-2,DB6-1,DB7-3,DB8-1,DB9-1,DB11-3,DB12-3,DB13-19,DB16-1,DB19-4,DB20-6,DB21-6,DB22-4,DB23-3,DB24-2,DB25-2,DB27-3,DB28-4,DB29-1,DB31-4,DB32-6,DB33-3,DB34-1,DB36-2,DB37-1,DB38-1,DB39-2,DB40-2,DB41-2及DB42-3，以及抗原結合片段(例如F(ab')2,Fab或Fv)，及其功能性變體(例如，人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體)。在一實施例中，上述單株抗體其中之一之功能性變體包含(i)一重鏈變異區(VH)，其包含該單株抗體之所有互補決定區(complementarity determining regions,CDRs)，及(ii)一輕鏈變異區(VL)，其包括該單株抗體之所有互補決定區(CDRs)。在另一實施例中，一種功能性變體包括與一單株抗體相同的重鏈變異區(VH)及輕鏈變異區(VL)。
    在另一方面，本發明揭露一種治療登革病毒感染的方法，藉由對一需要治療登革病毒感染之個體施予一有效劑量之任何前述抗體。在此使用的用語「治療」係指一組成物的應用或施用，該組成物包括一或多個活性成分，其針對罹患登革病毒感染、具有登革病毒感染症狀或具有登革病毒感染風險的個體，具有治癒、醫治、減緩、紓解、改變、改善、改良，或影響其感染、感染症狀或易感染體質的目的。在此使用的用語「一有效劑量」係指對該個體提供醫療效果所需之各活性成分，可單獨或與其他一個或多個活性成分組合施用。有效劑量可隨該領域熟習此技藝者之認知而改變，其取決於給藥途徑、賦形劑選擇及其他活性成分的共同使用。
    在又一方面，本發明揭露一種在一樣本中檢測登革病毒抗原存在的方法。該樣本可以是一來自可能受登革病毒感染患者之血清樣本，亦可以是一組織培養樣本。此方法包括至少下列步驟：提供一可能包含一登革病毒抗原之樣本，使該樣本與任何前述抗體接觸，及確認該抗體是否結合於該樣本中之一抗原，該抗體與該抗原的結合表示該樣本中存在有一登革病毒抗原。
    在本發明的保護範圍中亦包括(i)一種用於治療登革病毒感染的醫藥組成物，該醫藥組成物包括一或多個前述抗登革病毒抗體，以及(ii)將任何前述抗登革病毒抗體用於製造或治療登革病毒感染的藥物之用途。
    本發明之一或多種實施例的細節將詳述如下之實施說明中。本發明之其它特徵或優點，將透過以下圖式及實施例之詳細說明及專利範圍而更為清楚。
    本申請案主張美國臨時申請案No. 61/364,845(申請日：2010年7月16日)之優先權，其內容之全體皆引用作為本說明書的揭示內容。
    在此所述的單離抗登革病毒抗體，包括如表1所列之抗體，即DB2-3,DB3-4,DB5-2,DB6-1,DB7-3,DB8-1,DB9-1,DB11-3,DB12-3,DB13-19,DB16-1,DB19-4,DB20-6,DB21-6,DB22-4,DB23-3,DB24-2,DB25-2,DB27-3,DB28-4,DB29-1,DB31-4,DB32-6,DB33-3,DB34-1,DB36-2,DB37-1,DB38-1,DB39-2,DB40-2,DB41-2及DB42-3，及其抗原結合片段及經過基因工程之功能性變體。
    在此所使用的用語「單離抗體」係指一種實質上與自然存在分子不同之抗體，即自然存在分子係由包含該抗體配製物之頂多20%乾重之所組成。抗體純度可由任何適當方法測量得到，例如：色層管柱層析法(column chromatography)、聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis)及高效液相層析法(HPLC)。
    表1所列之任何單株抗體可經由習知方法所製得，例如：融合瘤技術、重組技術或化學合成。可參閱例如Harlow and Lane,(1988) Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；以及以下實施例。
    單株抗體的抗原結合片段(例如F(ab')2,Fab或Fv)，可以經由習知技術所製得。例如，F(ab')2片段可藉由胃蛋白酶(pepsin)切除一抗體分子所製得，且Fab片段可經由還原F(ab')2之雙硫鍵所製得。
    一單株抗體之功能性變體係指一抗體，其包含該單株抗體之相同的抗原結合殘基(例如CDRs的專一決定殘基(specific-determining residues)；參閱Almagro,J. Mol. Recognit. 17:132-143;2004)，且因此具有相同的抗原專一性。一功能性變體可包括一重鏈變異區(VH)，其至少70%(例如75%,80%,85%,90%或95%)相似於其親代單株抗體，以及一輕鏈變異區(VL)，其至少70%(例如75%,80%,85%,90%或95%)相似於其親代單株抗體。另外，功能性變體可包括一含有CDRs之重鏈變異區(VH)，各CDRs至少80%(例如85%,90%或95%)之序列相同於該單株抗體中對應的CDRs，以及一含有輕鏈變異區(VL)之CDRs，其至少80%(例如85%,90%或95%)之序列相同於該單株抗體中對應的CDRs。在一實施例中，功能性變體包括與其親代單株抗體相同的重鏈變異區(VH)及輕鏈變異區(VL)。互補決定區(CDRs)及其專一決定殘基可由其重鏈變異區(VH)及輕鏈變異區(VL)之胺基酸序列而決定。參閱網路資料bioinf.org.uk/abs及Almagro,J. Mol. Recognit. 17:132-143;2004。在此所述的功能性變體之結合專一性，可由該領域之習知方法所測定，例如ELISA或西方墨點法。
    例如，一單離抗體可包括DB32-6(SEQ ID NO:1)之重鏈變異區(VH)的胺基酸序列，以及DB32-6(SEQ ID NO:5)之輕鏈變異區(VL)的胺基酸序列。在另一實施例中，一單離抗體可包括DB32-6之重鏈CDR1,CDR2及CDR3序列(分別為SEQ ID NOs: 2,3,及4)，及DB32-6之輕鏈CDR1,CDR2及CDR3序列(分別為SEQ ID NOs: 6,7,及8)。
    在此所使用的用語，兩胺基酸序列之「同源百分比(percent homology)」，是利用Karlin及Altschul之演算法(參閱Proc,Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268,1990)如Karlin及Altschul所述修正(參閱Proc, Natl. Acad. Sci. USA 5873-5877,1993)。此演算法同時配合NBLAST及XBLAST程式，參閱Altschul et al.,J. Mol. Biol. 215:403-410,1990。BLAST蛋白質檢索是以XBLAST程式進行，score=50，wordlength=3，以得到與參考胜肽同源的胺基酸序列。為得到間隙排比以用於比對目的，故利用Altschul et al所述的Gapped BLAST(參閱Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,1997)。當使用BLAST及Gapped BLAST程式，則利用各程式的預設參數(例如XBLAST及NBLAST)。參閱ncbi.nlm.nih.gov之網路資料。
    前述功能性變體可以是一種人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或是衍生自表1所列單株抗體之任何區域抗體(domain antibody,dAb；參閱Ward,et. Al.,1989,Nature,341:544-546)。
    人源化抗體包括一種人類免疫球蛋白(例如受者抗體)，其負責抗原結合之區域/殘基(即CDRs，特別是其中的專一決定殘基)被取代為該些來自非人類免疫球蛋白(即供者抗體)之殘基。在某些情況下，在受者抗體中的架構區域中的一或多個殘基亦被取代為該些來自供者抗體的殘基。人源化抗體亦可包含非來自受者抗體及供者抗體的殘基。該些殘基可包括進一步重新定義或改善抗體之表現。該些抗體可經由該領域習知技藝予以人源化，例如重組技術。
    嵌合抗體是一種利用衍生自不同物種之片段所組成的分子，諸如該些具有衍生自鼠科動物之可變區域及人類免疫球蛋白之恆定區(constant region)。此種抗體可經由習知技藝，例如參閱Morrison et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851;Neuberger et al.(1984) Nature 312,604；及Takeda et al.(1984) Nature 314:452.所製得。
    單鏈抗體可經由重組技術而製得，例如連結編碼有VH鏈的核苷酸序列以及及編碼有VL鏈的核苷酸序列。較佳地，在兩個可變區域間利用一靈活的連結子予以連結。
    在此所述的任何抗登革病毒抗體，可被用於治療登革病毒感染。在進行此種治療時，可將一抗登革病毒抗體與一藥學上可接受載體混合，可單一地或是與一抗病毒成分混合，以形成一醫藥組成物。「可接受(acceptable)」意指該載體必需可與該組成物中的活性成分共存(較佳地，可穩定該活性成分)且不會對受治療的該個體產生毒性。適當的載體包括維晶纖維素(microcrystalline cellulose)、甘露醇(mannitol)、葡萄糖(glucose)、去脂奶粉(defatted milk powder)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)及澱粉(starch)，或其組合。
    上述醫藥組成物可經由習知給藥途徑施用至一需治療的個體(即罹患或具有登革病毒感染之人類患者)，習知給藥途徑包括例如：口服、非口服、吸入、局部、直腸、鼻部、頰部、陰道或透過植入型藥盒進行給藥。在此所述的「非口服」包括：皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑液內、胸骨內、鞘內、病灶內、頭蓋骨內之注射或注入技術。
    一種無菌的可注射組成物，例如一種無菌的可注射水性或油性懸浮液，可依據該領域之習知技藝製得，包括使用分散劑或潤濕劑(例如Tween 80)及懸浮劑。該無菌可注射物可以是一種在無毒性非口服可接受稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如1,3-丁二醇(1,3-butanediol)。可接受的載劑及溶劑可為甘露醇、水、林格氏液(Ringer’s solution)、等張生理食鹽水。此外，無菌、非揮發性油一般可用於作為一溶劑或懸浮媒介物(例如合成的單-或二酸甘油酯)。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，可用於製備可注射物，如天然藥學上可接受油類，諸如橄欖油或蓖麻油，特別是以聚氧乙烯的形式。該些油性溶液或懸浮液可包括一長鏈醇類稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose)或相似的分散劑。其它一般使用的介面活性劑諸如Tweens或Spans或其他相似的乳化劑或生物可接受促進劑，其一般使用於製造藥學上可接受固態、液態或其他的劑型。
    此外，上述醫藥組成物可透過可注射型長效路徑施用於一個體，諸如使用1、3或6個月長效型注射或生物可分解物質及方法。
    在此所述的抗登革病毒抗體可被使用作為一診斷藥劑，透過習知方法例如ELISA或西方墨點法，以確認一個體是否受到登革病毒感染。
    在未進一步揭露細節，據信該領域熟習此技藝人士可根據上述說明，使用本發明至其完整內容。以下特定實施例，據此，僅為例示說明，而非用以限制本發明以其他形式實施。所有公開引用文獻在此併入作為參考。 對抗登革病毒第2型之單株抗體的生產及特徵化(1)　材料及方法
    BHK-21細胞在37℃,5% CO2之環境下培養於MEM培養基(Minimal Essential Medium,Gibco-BRL,Grand Island,NY)，其中添加有10%熱去活化胎牛血清(heat-inactivated fetal bovine serum,FBS,Gibco)及100 U/ml盤尼西林(penicillin)、100 μg/ml鏈黴素(streptomycin)、0.25 μg/ml兩性黴素B(amphotericin B)(Antibiotic -Antimycotic,Gibco)。Aedes albopictus C6/36細胞在28℃之環境下培養於MM(Mitsuhashi and Maramorosch)昆蟲培養基(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)/DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,Gibco)，其中添加有10%熱去活化胎牛血清及100 U/ml盤尼西林(penicillin)、100 μg/ml鏈黴素、0.25 μg/ml兩性黴素B。四種登革病毒(DENVs)，DENV-1 Hawaii,DENV-2 New Guinea C及16681,DENV-3 H87及DENV-4 H241，係由Dr. Duane J. Gubler(Centers for Disease Control and Prevention,Fort Collins,U.S.A.)所提供。
    感染DENV-2的病患係來自在南台灣的高雄之疫情爆發(2002)之病患，如先前文獻所述(Wang et al.,2006)。登革主動監控系統(active physician-based dengue surveillance system)已建立於北台灣的國立台灣大學附設醫院(NTUH)。DHF 及DF的診斷係根據WHO的案例定義(WHO,1997)。經告知同意，取得急性(在發病後第1-7天)及康復期(在發病後第8天至4個月)之血液樣本。所有樣本以800×g、4℃離心10分鐘，並保存於-80℃以供使用。確認的登革血清及血漿樣本係以下列四種方法的至少兩種進行檢測：(i)對於急性期樣本以血清型專一反轉錄PCR(serotype-specific reverese transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)進行檢測，(ii)將病毒自樣本分離後培養於mosquito C6/36細胞，(iii)登革專一IgM(dengue-specific IgM)測試(iv)在康復期血清樣本中進行血球凝集-抑制檢測(Lanciotti et al.,1992)觀察其具有增加四倍效價的抗登革病毒抗體。取經過檢測(以購得之ELISA套組(PanBio,Queensland,Australia))抗登革病毒抗體為陰性之一健康正常人的血清樣本(Vaughn et al.,1998;Vaughn et al.,1999)，將其作為參考以建立截取值(cutoff values)。
    依據先前文獻所述步驟(Wu et al.,2003)製得抗登革病毒第二型單株抗體(Anti-DENV-2 MAbs)。雌性，第4-6週齡之BALB/c小鼠係以純化DENV-2作為抗原進行免疫接種。經過四次免疫接種後取其血清並測試其對於抗DENV-2之免疫反應。選出最適合的小鼠進行最後增強。取已免疫小鼠的脾臟細胞，將其與小鼠骨髓瘤細胞NS-1在50% (v/v)PEG-1500(polyethylene glycol-1500,Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)進行融合。將混合物以10 ml無血清DMEM(serum-free DMEM)稀釋，以400g離心5分鐘。將融合細胞培養於DMEM培養基(添加有15% FBS,HAT培養基及融合瘤選殖因子(Roche))之96孔盤中。在進行2個星期的融合後，將培養基上清液以ELISA篩出可結合於受DENV-2感染之C6/36細胞，但不會結合於未受感染之細胞，以當作陽性選植株(positive clone)。挑選後的細胞株經限數稀釋法(limiting dilution)進行次選殖。將融合瘤細胞利用購買的分型套組(isotyping kit)(Southern Biotech,Birmingham,AL)，利用ELISA進行分型。腹水產生於注射過pristine(pristane-primed)的BALB/C小鼠中。利用標準蛋白質G-Sepharose 4B gel(Amershan Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)，依據其使用說明，對該些單株抗體進行親和性純化。
    將96孔盤中的C6/36單層細胞，以0.5的病毒感染劑量(multiplicity of infection,MOI)，感染DENV-1至-4(DENV-1 Hawaii,DENV-2 16681,DENV-3 H87,及DENV-4 H241)。將1 μg/ml的單株抗體溶於含1% (w/v) BSA(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)之PBS中，三重複加入盤內使抗體於室溫下與病毒反應1小時。以含有0.1% (v/v) Tween-20 (PBST0.1)的PBS清洗三次。二級抗體(Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG,Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)溶於1%(w/v) BSA之PBS以1:2,000之比例稀釋後加入盤中於室溫下作用1小時。將培養盤加入過氧化酶的受質o-phenylenediamine dihydrochloride(OPD;Sigma)，並以3N HCl終止反應。以光度計測量其490 nm吸光值。
    將BHK-21細胞以1:1甲醇/丙酮(methanol/acetone)於-20℃下固定10分鐘。再將細胞置於含有1% BSA之PBS中室溫作用1小時。以含有0.1% Tween-20的PBS清洗兩次後，加入抗登革病毒的一級抗體(DB MAbs)或控制組抗體(正常老鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)以1:250的比例稀釋於室溫下作用1小時。經過三次清洗後，加入二級抗體FITC-接合山羊抗鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories))以1:250及DAPI以1:2,000稀釋，並在室溫下作用1小時。經過三次清洗後以螢光顯微鏡拍照紀錄DB單株抗體或控制組抗體對於感染DENV-2或未感染(mock)的BHK-21細胞之結合情形。
    DEN V-2(PL046) E的表現質體係取自Dr. Y.-L. Lin(Yu et al.,2006)，並製備以表現E-DI-II及E-DIII。將對應E-DI-II之DNA片段，以下列引子對進行PCR擴增：正向：5’-GATGCTAGCATGCGTTGCATAG GAATA-3’(NheI的位置以粗體標記；SEQ ID NO:9)及反向：5’-GATCTCGAGTCCTTTGAGCTGTAGTTT-3’(Xho的位置以粗體標記；SEQ ID NO:10).設計適當的引子對以構築E-DIII，正向：5’-GATGCTAGCATGAAAGGAATGTCATAC-3’(NheI的位置以粗體標記；SEQ ID NO:11)以及反向：5’-GATCTCGAGTTGGCCGATAGAACT-3’(Xho的位置以粗體標記；SEQ ID NO:12)。該些引子對被設計用於選殖入pET21a載體(Merck,Darmstadt,Germany)。重組E-DI-II，包含套膜蛋白第1-295個胺基酸，在其C端標記以六個組胺酸(hexahistidine)用於親和性純化(affinity purification)。重組E-DIII，包含套膜蛋白第295-400個胺基酸，亦標記以六個組胺酸。將表現質體轉殖入大腸桿菌Escherichia coli strain BL21(DE3)。將20 ml的菌液培養於含有50 μg/ml青黴素(ampicillin)之LB培養液中，直至OD600吸光值=0.6，並以1 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)在37℃下誘導4小時。取得菌沉澱物以超音波震盪。重組蛋白質E-DI-II及E-DIII以12% SDS-PAGE進行分析，並以考馬斯藍(coomassie blue)染色或進行西方墨點分析。
    在病毒感染後取細胞並以RIPA緩衝液(10 mM Tris,pH 7.5,150 mM NaCl,5 mM EDTA,0.1%十二烷基磺酸鈉[SDS],1% Triton X-100,1%去氧膽酸鈉及proteinase inhibitor cocktail tablet,Roche)打破細胞。將細胞溶解物或表現蛋白以12,000g的轉速在4℃下離心20分鐘，並取其上清液。取等量的全細胞萃取物與樣本緩衝液(Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA)混合。蛋白質樣本以SDS-PAGE分離，並轉至硝化纖維膜(Hybond-C Super;Amersham,Little Chalfont,UK)。配製5%脫脂牛奶(Becton Dickinson and Co.,Franklin Lakes,NY)於PBS中，以阻斷非專一性抗體結合位，並加入一級抗體DB MAbs(腹水於1:250至1:5,000稀釋液)，於室溫下反應1小時。清洗後加入1:10,000稀釋比例之二級抗體HRP-接合抗鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，於室溫下反應1小時。經清洗後利用ECL試劑(enhanced chemiluminescence reagents,Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)檢測其訊號。
    將ELISA盤塗佈50 μl/well的capture MAb(可辨識套膜蛋白的DB42-3)，以0.5 μg/ml的濃度於0.1 M碳酸氫鈉緩衝液(pH 8.6)中，於4℃下反應6小時。經PBS清洗兩次後，將孔盤與含有1%BSA的PBS阻斷非專一性抗體結合位，於4℃下隔夜反應，並以含有0.1%Tween-20的PBS清洗三次。於孔盤上加入5×106 plaque forming unit(PFU)/ml的病毒培養液於室溫下反應1小時。受DENV-2感染之患者或健康人類的血清樣本在不同稀釋比例1:100,1:400,1:1,600及1:3,200下加入盤內並於室溫反應1小時。在清洗三次後，加入1:10,000之比例稀釋的山葵過氧化酶接合抗人纇IgG(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-human IgG)或IgM(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)，於室溫下反應1小時，接著清洗五次。將孔盤以OPD(Sigma)呈色並以3 N HCl終止反應。以光度計測量其490 nm的吸光值。
    將八個3倍依序稀釋的MAbs(200 μg/ml至0.09 μg/ml)與等量的200 PFU之DENV-2混合，在4℃下反應1小時。MAbs在PRNT的最終濃度介於100至0.05 μg/ml之間。將100 μl的抗體-病毒混合液以二重複的方式，加入12孔盤的BHK-21細胞單層中。在吸收病毒2小時後，除去上清液，並將2 ml的1%(w/v)羧甲基纖維素(Sigma)於含有2%(v/v) FBS之MEM加入於感染細胞上。在37℃下反應5-7天，將形成於細胞單層上的病毒斑以1 ml 3.7%福馬林(Sigma)於室溫下進行固定1小時。將細胞以1%結晶紫染色以觀察該些病毒斑。病毒斑百分比的減少係以下式計算：抑制百分比(%Inhibition)=100-[(加入MAb之病毒斑數目/未加入MAb之病毒斑數目)×100]。
    飼養的ICR種小鼠係購自於國立台灣大學的動物中心。將純化的MAbs以10 μg/ml之劑量與1×104 PFU(25-fold LD50)之DENV-2於4℃下反應30分鐘。20 μl的反應混合物，以顱內注射的方式(intracranial(i.c.)injection)接種至2天大的乳鼠鼠腦中。每天觀察其存活率及包括癱瘓等發病症狀，連續進行21天。動物照護係依照中央研究院(Taipei,Taiwan)的規定進行。在感染後治療實驗中，小鼠係在感染病毒1天後以顱內注射方式注入5 μg的MAb。
    在先前文獻中已描述出血小鼠模式(Chen HC et al.,2007；及Yen et al.,2008)。C57BL/6小鼠係購自於Jackson Laboratory(Bar Harbor,Maine)以及飼養於國立台灣大學醫學院實驗動物中心。所有小鼠都飼養於無致病的柵欄設備中，並在4-5週齡時予以病毒感染。在接種之前，100 μg/ml的MAbs或PBS以2×108 pfu之DENV-2(16681)於4℃下反應30分鐘。將100 μl的混合液以皮下注射接種於小鼠上背部四個位置。在接種後第3天，將小鼠犧牲以觀察其出血情形的發展。
    利用TRIzol試劑(Invitrogen)萃取約1×107個融合瘤細胞之RNA，並以NucleoTrap mRNA Mini Kit(Macherey-Nagel GmbH & Co. KG.)分離出mRNA。純化後的mRNA以寡核甘酸(oligo dT)作為引子進行ThermoScript RT-PCR system(Invitrogen)，可變重鏈及輕鏈區域(VH及VL)係以不同的引子組進行PCR擴增所得到之cDNA產物(Dubel et al.,1994;Orlandi et al.,1989;Orum et al.,1993)。以pfu turbo DNA聚合酶(Merck)進行30循環的PCR，條件為：95℃進行30秒,55℃進行30秒，及68℃進行60秒。將PCR產物純化並利用TA kit(Promega,Madison,WI)將其插入pGEM-T Easy質體。再將完成後的質體進行定序以確認中和性MAbs的VH及VL序列已插入質體。利用Vector NTI(InforMax)之軟體進行序列分析。由該些序列中，藉由Kabat資料庫比對分析其架構區(FR)及互補決定區(CDR)，並利用ImMunoGeneTics資料庫進行序列比對(alignment)(Lefranc et al.,2009)。
    依據先前文獻內容進行噬菌體表現生物汰選技術。簡單而言，將ELISA盤塗佈以100 μg/ml之MAbs。加入100 μl稀釋的MAb至孔洞，於4℃下反應6小時。在清洗後，將噬菌體表現胜肽庫(New England BioLabs,Inc.)稀釋為4×1010 pfu後加入孔洞中並置於室溫下反應50分鐘。在清洗後，以100 μl 0.2 M glycine/HCl(pH2.2)將結合的噬菌體洗出，並以15 μl 1M Tris/HCl(pH9.1)進行中和。並在後續回合挑選時，將洗出的噬菌體在ER2738中放大。將噬菌體滴定於含有IPTG及X-Gal的LB培養基盤上。用於第二及第三回合生物汰選步驟與第一回合相同，加入2×1011 pfu的噬菌體進行生物挑選。ELISA盤塗佈以50 μl的50 μg/ml MAbs。在清洗後，放大的噬菌體稀釋5倍並加入盤中，於室溫下反應1小時。在清洗後，加入1:5000稀釋比例的HRP-接合抗-M13抗體(GE Healthcare)，於室溫下反應1小時。以OPD反應並以HCl中止反應。測量其490 nm的吸光值。
    使用重組表現載體pCBD2-2J-2-9-1以產生類病毒顆粒(virus-like particle,VLP)突變株。利用pCBD2-2J-2-9-1為模板進行定點突變(site-directed mutagenesis)，產生不同的VLP突變株。利用pfu ultra DNA聚合酶(MERCK)進行PCR反應，且將所有突變株定序確認。BHK-21細胞以不同的VLPs質體轉染。在轉染兩天後，將細胞以含有1% FBS之PBS清洗，並以3.7%福馬林進行固定，4℃下反應10分鐘。以含有1% FBS,0.1% saponin(Sigma-Aldrich)之PBS進行打洞，4℃下反應10分鐘。為進行染色，將細胞與MAbs於4℃反應30分鐘，DB32-6,DB25-2,3H5及混合MAbs(4G2,DB2-3,DB13-19,DB21-6及DB42-3)，濃度分別為0.1,1,1及1 μg/ml。在清洗兩次後，加入R-藻紅素(PE)-接合AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)稀釋至1:250，4℃下反應30分鐘，以流式細胞儀(flow cytometry)進行分析。依據先前描述的步驟確認是否有辨識反應。
    實施人源化DB32-6的構築及表現。兩個人類基因，GenBank accession DI084180及DI075739，與DB32-6 VH及VL分別相似94.7%及92.2%。人源化DB32-6 VH係由分別來自accession DI084180基因經修飾的FR1至FR4，以及DB32-6 VH之CDR1至CDR3所組成。人源化DB32-6 VL係由來自DI075739基因經修飾的FRs，以及DB32-6 VL之CDRs所組成。合成人源化DB32-6 VH及VL(GENEART,Germany)，並以pfu Turbo(EMD Bioscience)進行PCR放大。並將所得到VH選殖入修飾過具有信號胜肽及人類IgG1恆定區的表現載體pcDNA3.1(Invitrogen)。VL選殖入修飾過的表現載體pSecTag(Invitrogen)。VH及VL質體共轉染進入CHO-K1細胞並以G 418及嘌呤霉素(puromycin)進行篩選2-3週。轉染細胞在96孔盤中進行極限稀釋。在2週後，得到可在McCoy’s 5A培養基(Sigma-Aldrich)中產生人源化抗體之穩定株，並進行ELISA確認。利用CELLine AD 1000(INTEGRA Biosciences,Switzerland)套組，依據產品使用說明生產人源化抗體。
    DENV-2的E-DIII之鼠類及人源化DB32-6MAbs親和性分析，係以表面離子共振(surface plasmon resonance)(BIAcore X,Biacore,Inc)進行。純化的E-DIII(50 μg/ml)固定於CM5感測晶片(Biacore,Inc)上，注射流速10 μl/min。將MAbs在HBS-EP buffer(Biacore,Inc)中稀釋至4,2,1,0.5,0.25及0 nM。MAbs注射流速30 μl/min下進行3分鐘，並使其分離1.5分鐘。MAb注射之前以10 mM glycine HCl,0.2 M NaCl(pH3.0)清洗後再進行下一次的樣本注射。資料係以BIAevaluation軟體內的global fit 1:1程式進行結合分析。 (2)抗DENV-2的MAbs之生產及確認
    所有抗DENV-2的32種MAbs列於如下之表1，係在小鼠以DENV-2 strain 16681進行免疫反應後產生。
    MAbs(monoclonal antibodies),單株抗體；IFA(immunofluorescence assay)免疫螢光檢測；ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)酵素連結免疫吸附法；WB(Western blotting)西方墨點法；PRNT(plaque reduction neutralization test)溶菌斑中和試驗. Ig(immunoglobulin)免疫球蛋白；E(envelope protein),套膜蛋白；E-DI-II(envelope protein domain I-II)套膜蛋白區域I-II;E-DIII(envelope protein domain III)套膜蛋白區域III;NS1(nonstructural protein 1)非結構蛋白1;C(capsid protein)殼體蛋白.(+)對DENV具有陽性反應,A 490>0.2;(-)對DENV具有陰性反應,A 490<0.2. n.d.(not determined)未確定。
    免疫球蛋白(Ig)同型確認顯示出32種MAbs係由22 IgG1,5 IgG2a,2 IgG2b及3 IgM所組成(表1)。利用免疫螢光檢測及ELISA確認(表1)，29個IgG MAbs會與DENV-2-感染細胞發生反應，而不會與無感染細胞(mock)發生反應。利用ELISA及西方墨點法，檢測MAbs對於4種DENVs(DENV-1 Hawaii,DENV-2 16681,DENV-3 H87及DENV-4 H241)的專一性(表1)。基於使用非還原條件的西方墨點分析，17種MAbs會辨識套膜蛋白(53 kDa)，7種會辨識雙聚NS1蛋白(75 kDa)，2種會辨識殼體蛋白(11 kDa)。6種MAbs無法在西方墨點法中被確認。為確認該些MAbs之標的蛋白質，製備轉染以可表現DENV-2 C,prM,prM-E,E,NS1,NS2A,NS2B,NS2B-3,NS3,NS4A,NS4B及NS5之質體的BHK-21細胞。篩檢結果顯示出3種MAbs(DB21-6,DB22-4及DB36-2)可辨識套膜蛋白，及另外3種MAbs(DB5-2,DB11-3及DB31-4)可辨識殼體蛋白。32種MAbs的確認及其特徵摘錄如表1所示。 (3)　分析抗套膜蛋白之區域I-II或區域III的DENV-2 MAbs
    DENV的套膜蛋白(E protein)長度大約為500個胺基酸，N端400個胺基酸形成胞外區(ectodomain)(Modis et al.,2003)。套膜蛋白胞外區係由三個區域：E-DI、E-DII及E-DIII所組成。E-DI-II係為非連續且包括套膜蛋白之第1-295個胺基酸，E-DIII係為連續且包括套膜蛋白之第296-394個胺基酸(Modis et al.,2003)。EDI-II-flag(36 kDa)及EDIII-flag(17 kDa)融合蛋白係透過重組技術以E. coli生產。可被中和性抗體辨識的抗原決定位已在套膜蛋白之所有三個區域中確認(Goncalvez et al.,2004;Gromowski and Barrett,2007;Roehrig,2003;Sukupolvi-Petty et al.,2007)。
    為得知DENV套膜蛋白的抗原結構之特徵，在此構築及表現DENV-2之重組E-DI-II及E-DIII於E. coli表現系統中。所得之載體表現E-DI-II及E-DIII係為融合蛋白，在其C端具有Flag標記序列及hexahistidine標記。SDS-PAGE分析顯示E-DI-II為36 kDa，E-DIII為17 kDa。可藉由辨識Flag標記之抗體以及辨識DENV-2套膜蛋白之抗體而辨識。西方墨點分析及IFA結果顯示，17種MAbs辨識套膜蛋白(表1)，10種MAbs結合於重組套膜蛋白，其中8種MAbs結合於E-DI-II，2種MAbs(DB25-2及DB32-6)結合於DIII。4G2辨識廣泛黃病毒的E-DI-II，以及3H5辨識專一血清型DENV-2的E-DIII。兩者係用於作為正控制組。MAbs DB21-6及DB22-4無法經由西方墨點法確認，但IFA結果顯示E-DI-II可被辨識。然而，5種MAbs無法經由上述兩種檢測方法確認。全部10種MAbs(DB2-3,DB9-1,DB13-19,DB21-6,DB22-4,DB23-3,DB27-3,DB33-3,DB39-2及DB42-3)係以E-DI-II為標的，且2種MAbs(DB25-2及DB32-6)可辨識E-DIII(參表1)。 (4)　藉由capture ELISA檢測登革患者血清樣本
    MAb DB42-3會與DENV-1,-2,-3及-4產生交叉反應。該MAb可檢測取自受DENV-2感染之DHF及DF患者之血清樣本。利用正常人血清樣本於490 nm的平均吸光值(A 490)加上三倍標準差以用於確認截斷值(cutoff value)。抗套膜蛋白IgG captuere ELISA的敏感度，在急性及康復期的血清樣本中分別為90%(9/10)及100%(10/10)。在不同稀釋比例(1:100,1:400,1:1,600及1:3,200)之截斷值分別為0.35,0.14,0.08及0.06。抗套膜蛋白IgM captuere ELISA的敏感度，在急性及康復期的血清樣本中分別為50%(5/10) and 80%(8/10)。在不同稀釋比例(1:100,1:400,1:1,600及1:3,200)之截斷值分別為0.34,0.15,0.07及0.08。相對地，由健康的正常人取得之血清樣本經檢測為陰性。該些結果顯示MAb DB42-3可用於作為DENV感染的血清診斷。 (5)　體外( in vitro)的中和能力
    利用PRNT，評估純化的MAbs對於阻斷BHK-21細胞受DENV-2感染的能力。10種MAbs在介於0.14 μg/ml至33 μg/ml之50% PRNT(PRNT50)濃度間，其具有中和能力，反之，正常小鼠IgG(NMIgG)在對DENV達到濃度為100 μg/ml時，不具有中和能力(表1)。3H5，一種已知可強力中和DENV-2血清專一型MAb，在此作為正控制組。3H5的DENV-2 PRNT50濃度係為0.41 μg/ml，且可完全抑制病毒感染的濃度為11 μg/ml。
    DB32-6被發現是一種可抗E-DIII的DENV-2血清專一型MAb，PRNT50的濃度為0.14 μg/ml,此為最有效中和DENV-2感染之抗體。其在濃度為1.2 μg/ml時，可完全地抑制感染。DB32-6比3H5具有更強的中和活性。DB25-2被發現是一種可抗E-DIII的DENV-2血清專一型MAb，PRNT50濃度為1.2 μg/ml。DB2-3及DB23-3被發現是一種可抗E-DI-II的DENV-2血清專一型MAb，且PRNT50的濃度為分別為1.2 μg/ml及0.41 μg/ml(表1)。具有複合活性的MAb DB42-3可辨識E-DI-II，且被發現PRNT50的濃度為3.7 μg/ml。4種血清專一型MAbs:DB3-4,DB9-1,DB19-4及DB24-2 PRNT50的濃度為3.7 μg/ml可中和DENV-2感染(表1)。更進一步，4G2及DB13-19被發現為具有複合活性的MAbs，PRNT50分別為11 μg/ml及33 μg/ml(表1)。然而，DB21-6,DB22-4,DB27-3,DB33-3,DB37-1及DB39-2等MAbs，不具有或具有較低的對抗DENV-2之中和活性(PRNT50>33 μg/ml)(Table 1)。
    該些發現指出抗E-DIII的血清專一型-MAb DB32-6最具有中和DENV感染之潛力。某些血清專一型MAb，即抗E-DI-II的DB2-3及DB23-3，及抗E-DIII的DB25-2，也顯示出其強烈的中和活性。參表1。 (6) MAbs預防乳鼠因DENV-2所引發的致死性
    以ICR種之乳鼠(2天齡)(Meiklejohn et al.,1952;Sabin and Schlesinger,1945)，進行中和性MAbs之體內(in vivo)保護實驗。將小鼠以腦內接種的方式接種20 μl的DENV-2-MAb混合物，其包含DENV-2 1×104 plaque-forming units(25-fold LD50)及10 μg/ml的中和性MAb。每天觀察小鼠是否出現不正常的症狀，連續觀察21天。顯著地，處理以非中和性抗體NMIgG之組別在第6-9天乳鼠出現癱瘓、豎毛及低活力的現象。接著在第10-17天出現嚴重病徵，包括食慾缺乏、無力及死亡等現象。相對地，DB32-6保護了93%的小鼠免於因DENV-2而死亡。3H5,DB23-3,DB2-3及DB25-2之保護效果為分別具有75%,76%,72%及71%的存活率。DB42-3及DB13-19分別顯示了46%及28%的存活率。相較於NMIgG而言，中和性抗體展現出顯著延遲癱瘓及死亡的發生。
    為了評估具高度保護性的MAb DB32-6之醫療潛力，施予100 μg/ml或1 μg/ml經i.c.注射感染登革病毒之乳鼠，21天後其存活率分別為100%及89%。相比之下，3H5分別為82%及40%的存活率。DB32-6比習知強力中和性3H5更具有強烈中和性及保護能力。
    該些結果顯示該些中和性MAbs可被用於治療及抑制DENV-2感染。 (7)V H及V L序列分析
    為了進一步將該些MAbs發展於臨床用途，在此選殖並分析該些MAbs之VH及VL DNA序列。該些中和性MAbs之VH及VL之胺基酸序列係顯示如第1圖所示。序列分析顯示出6種MAbs係為獨特的。FR1至FR4及CDR1至CDR3的胺基酸序列已確認。最接近的參考基因係顯示如下表2。有趣的是DB2-3及DB23-3株共有VH1S137*01及JH4*01之基因片段，顯示出，藉由VH及JH基因片段編碼之CDR1/2重鏈環(heavy-chain loops)結合於DENV-2，其具有特殊的配搭性。然而，DB13-19,DB25-2,DB32-6及DB42-3基因片段皆不相同。該些資料顯示，結合親和性的較佳化可發生於藉由細胞的高突變性及體內篩選而達成。
    (8)　中和性抗原決定位之確認
    利用噬菌體表現技術確認前述中和性抗體的中和性抗原決定位，經過三次噬菌體表現生物汰選後，噬菌體效價增加至85倍(DB32-6)及331倍(DB25-2)(和第1次結果相比)。隨機挑選出第3次生物汰選中個別的噬菌體株。利用ELISA確認該些MAbs是否可專一地辨識所挑選的噬菌體株。在個別挑選的20個噬菌體株中，分別有17及18個噬菌體株可顯著結合至DB32-6及DB25-2。選出的噬菌體PC32-6及PC25-14係可單一地且劑量依賴地分別結合至DB32-6及DB25-2，且不會與控制組NMIgG結合。
    將17個對於DB32-6產生高度反應之噬菌體株進行擴增，且純化其噬菌體DNA進行定序。所有噬菌體株表現出12個胺基酸殘基(第2圖，左)。藉由DB32-6所挑出的噬菌體表現胜肽序列具有組胺酸(H)-離胺酸(K)-麩胺酸(E)-色胺酸(W)/酪胺酸(Y)-組胺酸(H)之保留序列(第2圖，左)。相似地，利用顯示7個胺基酸序列的噬菌體庫，藉由DB32-6所挑選出的17個免疫陽性噬菌體株，亦包含H-K-E-W/Y-H之保留序列(第2圖，左)。有趣地，藉由DB32-6及DB25-2挑選出的所有噬菌體表現胜肽分別包含離胺酸(K)及麩胺酸(E)(第2圖)。
    為了進一步確認中和性抗原決定位，發明人發展出不同專一剔除套膜蛋白抗原決定位之VLPs(E protein epitope-specific knock-out VLPs)，並篩選出無結合之VLP突變株(loss-of-binding VLP mutants)以確認最關鍵的辨認殘基。利用此方法，發現當DB32-6在E-DIII的A-股之K310變成丙胺酸(K310A)或麩醯胺酸(K310Q)時，抗體即失去與其VLP結合能力。相似地，當DB25-2在E-DIII的A-股之E311變成精胺酸(E311R)，抗體即失去與其VLP結合能力。兩個重要的辨識殘基K310及E311皆位於E-DIII的A-股。在此發現，如先前報告所述地，MAb 3H5可辨識殘基K305、E383及P384。
    發明人結合噬菌體表現、電腦結構分析及VLP突變試驗以確認中和性抗原決定位。值得注意地，即使鄰近殘基(K310及E311)能引發抗體產生不同程度的中和活性。本發明數據進一步確認位於E-DIII的A-股之抗原決定位對於誘發中和性抗體是相當重要的。 (9)　人源化DB32-6MAb的發展
    將DB32-6的CDRs接在人類IgG1骨架，以產生人源化DB32-6(hDB32-6)。在CHO-K1細胞中表現hDB32-6抗體，並純化其培養液。hDB32-6抗體保有鼠類DB32-6(mDB32-6)抗DENV-2的專一性。發明人建立了hDB32-6的穩定株。在挑選後，MAbs hDB32-6-30、hDB32-6-48及hDB32-6-51被發現具有高度結合活性。比較該些MAbs，發現hDB32-6-48具有最高的產量。MAbhDB32-6-48係為劑量依賴地抗DENV-2及E-DIII。其親和性經由表面離子共振(surface plasmon resonance)進行分析。鼠類DB32-6及hDB32-6-48，具相似的親和性(分別為0.12 nM及0.18 nM)能結合於DENV-2之E-DIII。其結果顯示出人源化DB32-6仍保持鼠類DB32-6對套膜蛋白的結合親和性。 (10) DB32-6保護小鼠對抗DENV-2-引發致死性及出血性
    利用兩種小鼠模式評估DB32-6是否可有效地保護小鼠對抗DENV-2的威脅。發明人建立一種乳鼠模式以確認mDB32-6及hDB32-6的保護能力。在乳鼠保護實驗中，10 μg/ml的mDB32-6及hDB32-6-48可保護小鼠對抗DENV-2的威脅並分別顯示96%及92%的存活率。給予小鼠1 μg/ml的mDB32-6、hDB32-6-48及3H5，其分別具有92%、77%及37%的存活率。
    為進一步評估MAbs的醫療效果，在感染病毒1天後給予5 μg的MAb。其結果顯示給予MAbs mDB32-6、hDB32-6-48及3H5的組別中，其存活率分別為96%、94%及56%。然而，在給予正常人類IgG(NHIgG)的控制組中，沒有任何小鼠存活。
    利用C57BL/6小鼠以評估DB32-6是否可中和DENV-2及避免出血現象的發生。在接種前將DENV-2 16681處理以PBS或各抗體。值得注意地，和預處理以PBS之病毒比較，其引發100%的小鼠發生嚴重出血現象，而預處理以mDB32-6及hDB32-6-48之病毒並無引發(0%)小鼠發生嚴重出血現象。預處理以NHIgG和3H5病毒分別引發80%和60%的小鼠發生輕度出血。嚴重出血發生於小鼠被PBS-和NHIgG-處理的病毒，及預處理以3H5病毒引發小鼠輕度出血感染。重要地，mDB32-6及hDB32-6-48完全地中和DENV所引發出血現象的能力。該些結果顯示人源化DB32-6具有出色的對抗DENV-2之中和能力，且可用於作為醫療抗體以預防及治療DENV-2感染。 其它實施例
    本說明書揭露之所有特徵可以任意組合方式結合。說明書中所揭露的每一特徵可取代為其他具有相同、等效或相似目的的特徵。據此，除非有其他明確闡述，在此所揭露之各個特徵僅為上位系列之等效或相似特徵之實施例。
    根據上述內容，該領域熟習此技藝人士可輕易地確認本發明之必要特徵，且未脫離本發明保護範圍及精神，可對本發明作不同變化及修飾以用於不同用途及條件。據此，其它實施例亦在本發明請求保護範圍中。 參考文獻
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    第1圖顯示出DB2-3,DB13-19,DB23-3,DB25-2,DB32-6及DB42-3之(A)重鏈變異區(VH)及(B)輕鏈變異區(VL)的胺基酸序列。
    第2圖顯示出選自DB32-6及DB25-2之噬菌體表現胜肽序列之比對結果。保留序列(consensus motif)以粗體表示。
    权利要求:
    Claims (15)
    [1] 一種專一性結合於登革病毒的單離抗體，該抗體包含：一包括SEQ ID NO:2之重鏈CDR1，一包括SEQ ID NO:3之重鏈CDR2，一包括SEQ ID NO:4之重鏈CDR3，一包括SEQ ID NO:6之輕鏈CDR1，一包括SEQ ID NO:7之輕鏈CDR2，及一包括SEQ ID NO:8之輕鏈CDR3。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之單離抗體，該抗體包含：一包括SEQ ID NO:1之重鏈可變區，及一包括SEQ ID NO:5之輕鏈可變區。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之單離抗體，其中該抗體係為一抗原結合片段。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之單離抗體，其中該抗體係為人源化。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之單離抗體，其中該抗體係為一嵌合抗體。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之單離抗體，其中該抗體係為一單鏈抗體。
    [7] 如申請專利範圍第3項所述之單離抗體，其中該抗原結合片段係為一F(ab')2、Fab或Fv。
    [8] 一種治療登革病毒感染的方法，該方法包括對一需要治療登革病毒感染之個體施予一有效劑量之如申請專利範圍第1項所述之抗體。
    [9] 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該抗體包含：一包括SEQ ID NO:1之重鏈可變區，及一包括SEQ ID NO:5之輕鏈可變區。
    [10] 如申請專利範圍第8項所述之單離抗體，其中該抗體係為人源化。
    [11] 一種在一樣本中檢測登革病毒抗原存在的方法，該方法包括：提供一可能包含一登革病毒抗原之樣本，使該樣本與如申請專利範圍第1項所述之抗體接觸，及確認該抗體是否結合於該樣本中之一抗原，其中該抗體與抗原的結合表示該樣本中存在有一登革病毒抗原。
    [12] 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該抗體包含：一包括SEQ ID NO:1之重鏈可變區，及一包括SEQ ID NO:5之輕鏈可變區。
    [13] 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該抗體係為人源化。
    [14] 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該樣本係為一來自可能受登革病毒感染之患者之組織樣本。
    [15] 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該樣本係為一來自可能受登革病毒感染之患者之血清樣本。
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    TWI448552B|2014-08-11|
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