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    本發明係關於醫藥調配物領域。更特定言之，其係有關纖維母細胞生長因子18(FGF-18)化合物之凍乾調配物及產生此等調配物之方法。本發明之凍乾調配物在儲存適當期間下穩定。在復原之後，其可用於治療軟骨病症，諸如骨關節炎或軟骨損傷。
    公开号:TW201302217A
    申请号:TW101120864
    申请日:2012-06-11
    公开日:2013-01-16
    发明作者:Rio Alessandra Del；Alessandra Cerreti
    申请人:Ares Trading Sa；
    IPC主号:A61K38-00
    专利说明:
    FGF-18之凍乾調配物
    本發明係關於醫藥調配物領域。更特定言之，其係有關纖維母細胞生長因子18(FGF-18)蛋白質之凍乾調配物及產生此等調配物之方法。本發明之凍乾調配物在室溫下儲存適當期間下穩定。
    纖維母細胞生長因子18(FGF-18)為纖維母細胞生長因子(FGF)蛋白質家族之成員，與FGF-8及FGF-17密切相關。FGF家族之成員之特徵在於肝素(heparin)結合域。已鑒別FGF-18之該種推定肝素結合域。假定受體介導之信號傳導係在結合與細胞表面硫酸肝素蛋白聚糖複合之FGF配體後起始。
    已顯示FGF-18為一種軟骨細胞及成骨細胞增生劑(Ellsworth等人，2002,Osteoarthritis and Cartilage,10：308-320；Shimoaka等人，2002,J.Bio.Chem.277(9)：7493-7500)。已提議FGF-18單獨(WO2008/023063)或與玻尿酸(hyaluronic acid)組合(WO2004/032849)用於治療軟骨病症，諸如骨關節炎及軟骨損傷。
    從該領域中已知包含FGF多肽之醫藥組合物。WO00/21548揭示包含重組FGF與醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑組合之醫藥組合物。適用於可注射溶液之載劑或稀釋劑之實例包括水或等張生理鹽水溶液。
    WO2008/121563係關於以單位劑量可注射形式製備之包含FGF-21化合物以及醫藥學上可接受之載劑的醫藥調配物。適合載劑可能尤其為糖、緩衝劑及/或界面活性劑。
    WO92/01442揭示一種凍乾組合物，其包含FGF、醫藥學上可接受之增積劑及i)纖維素之鹼金屬鹽或ii)聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯與半胱胺酸之組合。i)及ii)之組分使FGF組合物穩定。
    WO01/39788描述包含FGF-18化合物以及細胞毒素與醫藥學上可接受之載劑(例如磷酸鹽緩衝生理鹽水)之混合物的醫藥組合物。
    WO2008/023063揭示包含FGF-18化合物以及至少一種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或其類似物之調配物。舉例而言，其揭示包含FGF-18於諸如生理鹽水、右旋糖溶液、血清白蛋白及林格氏溶液(Ringer’s solution)之媒劑中之注射調配物。
    當製備包含生物活性蛋白質之醫藥組合物時，該組合物必須以使蛋白質之活性得以維持適當時期之方式調配。蛋白質之活性/穩定性之損失可由特別歸因於變性、聚集或氧化之蛋白質化學或物理不穩定性所致。因此，所得產物可為醫藥學上不可接受。儘管已知使用賦形劑會增加既定蛋白質之穩定性，但此等賦形劑之穩定效應高度依賴於賦形劑之性質及生物活性蛋白質自身之性質。
    仍然需要含有FGF-18作為活性成分之其他調配物，其中該等調配物於適當時期中穩定且適用於注射，較佳關節內注射。該等調配物可適用於在治療患者中之軟骨病症，諸如骨關節炎或軟骨損傷時投予。
    本發明之目標為提供含有FGF-18蛋白質之新穎調配物。更特定言之，該調配物為含有FGF-18之穩定凍乾調配物。本發明亦提供製備本發明之凍乾調配物之方法。本文所述之凍乾調配物在復原之後可適用於在治療軟骨病症時投予。
    在第一方面中，本發明提供包含以下各物或由以下各物組成之穩定凍乾調配物：FGF-18、緩衝劑、泊洛沙姆(poloxamer)界面活性劑及作為穩定劑之糖。在一較佳具體實例中，緩衝劑為磷酸鹽緩衝劑，泊洛沙姆界面活性劑為泊洛沙姆188，且穩定劑為蔗糖。在另一較佳具體實例中，緩衝劑使pH值保持在6至8或約6至8，且更特定言之在7.2或約7.2。在另一較佳具體實例中，泊洛沙姆界面活性劑之濃度為或約為0.1至0.4 mg/小瓶。較佳地，FGF-18係選自由以下組成之群組：1)包含人類FGF-18之成熟形式或由該成熟形式組成之多肽，該成熟形式對應於包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)組成之序列，2)包含人類FGF-18之截短形式或由該截短形式組成之多肽，該截短形式包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基196(Lys)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基196(Lys)組成，及3)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成之多肽。更佳地，FGF-18為trFGF-18，如下文所定義。
    在第二方面中，本發明提供一種製造FGF-18之穩定凍乾調配物之方法，其包含以下步驟：1)形成FGF-18與緩衝劑、界面活性劑及穩定劑之混合物，及2)使該混合物經受凍乾，其中該緩衝劑為磷酸鹽緩衝劑，該穩定劑為糖，諸如蔗糖，且該界面活性劑為泊洛沙姆界面活性劑，諸如泊洛沙姆188。在一較佳具體實例中，緩衝劑使pH值保持在6至8或約6至8，且更特定言之在7.2或約7.2。較佳地，FGF-18係選自由以下組成之群組：1)包含人類FGF-18之成熟形式或由該成熟形式組成之多肽，該成熟形式對應於包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)組成之序列，2)包含人類FGF-18之截短形式或由該截短形式組成之多肽，該截短形式包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基196(Lys)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基196(Lys)組成，及3)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成之多肽。更佳地，FGF-18為trFGF-18，如下文所定義。
    在第三方面中，本發明提供一種供醫藥學或獸醫學使用之製品，其包含：1)包含穩定凍乾調配物之第一容器，該凍乾調配物包含FGF-18、緩衝劑、界面活性劑及穩定劑，及2)包含復原溶劑之第二容器，其中該緩衝劑為磷酸鹽緩衝劑，該穩定劑為糖，諸如蔗糖，該界面活性劑為泊洛沙姆界面活性劑，諸如泊洛沙姆188，且該復原溶劑為水或生理鹽水溶液(例如0.9% w/v注射用氯化鈉)。較佳地，FGF-18係選自由以下組成之群組：1)包含人類FGF-18之成熟形式或由該成熟形式組成之多肽，該成熟形式對應於包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)組成之序列，2)包含人類FGF-18之截短形式或由該截短形式組成之多肽，該截短形式包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基196(Lys)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基196(Lys)組成，及3)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成之多肽。更佳地，FGF-18為trFGF-18，如下文所定義。 定義
    - 如本文所用之術語「FGF-18蛋白質」或「FGF-18」意欲為維持人類FGF-18蛋白質之至少一種生物活性之蛋白質。FGF-18可為天然的，呈其成熟形式或其截短形式。人類FGF-18蛋白質之生物活性特別包括骨母細胞活性(參見WO98/16644)或軟骨形成(參見WO2008/023063)增加。
    天然或野生型人類FGF-18為一種由關節軟骨之軟骨細胞表現之蛋白質。人類FGF-18最初稱為zFGF-5且完全描述於WO98/16644中。SEQ ID NO：1對應於天然人類FGF-18之胺基酸序列，具有由胺基酸殘基1(Met)至27(Ala)組成之信號肽。人類FGF-18之成熟形式對應於自SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)之胺基酸序列(180個胺基酸)。FGF-18對FGFR4及FGFR3及FGFR2之「IIIc」剪接變異體具有特異性(Ellsworth等人，2002,Osteoarthritis and Cartilage,10：308-320)。FGF-18之成熟形式之平均質量為21.04 kDa。
    本發明中之FGF-18可藉由諸如由申請案WO2006/063362教示之重組方法產生。視表現系統及條件而定，本發明中之FGF-18在重組宿主細胞中表現，具有起始甲硫胺酸(Met殘基)或具有用於達成分泌之信號序列。當在原核宿主中，諸如在大腸桿菌中表現時，FGF-18在其序列之N端中含有另一Met殘基。舉例而言，當在大腸桿菌中表現時，人類FGF-18之胺基酸序列以N端中之Met殘基(位置1)起始，隨後為SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)。
    - 如本文所用之術語FGF-18之「截短形式」係指包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至196(Lys)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至196(Lys)組成之蛋白質。較佳地，FGF-18蛋白質之截短形式為稱為「trFGF-18」之多肽(170個胺基酸)，其以Met殘基(在N端中)起始，隨後為野生型人類FGF-18之胺基酸殘基28(Glu)-196(Lys)。trFGF-18之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：2中(SEQ ID NO：2之胺基酸殘基2至170對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28至196)。trFGF-18為在大腸桿菌中產生之人類FGF-18的重組截短形式(參見WO2006/063362)。已顯示trFGF-18會顯示與成熟人類FGF-18類似之活性，例如其使軟骨細胞增殖及軟骨沈積增加，從而導致修復及重建多種軟骨組織(參見WO2008/023063)。trFGF-18之平均質量為19.83 kDa。
    - 如本文所用之術語「穩定性」係指本發明之調配物中之FGF-18的物理、化學及構形穩定性(且包括生物效能之維持)。蛋白質調配物之不穩定性可由蛋白質分子之化學降解或聚集以形成高級聚合物(higher order polymers)、去糖基化、糖基化修飾、氧化或會降低本發明之FGF-18蛋白質之至少一種生物活性的任何其他結構修飾引起。
    - 如本文所用之術語「穩定」溶液或調配物為一種溶液或調配物：其中該溶液或調配物中之蛋白質之降解、修飾、聚集、生物活性損失的程度及其類似性質受可接受地控制且不隨時間不可接受地增加。較佳地，在室溫下歷經至少12個月之時期，調配物保留FGF-18活性之至少80%以上。當在室溫下儲存時，本發明之包含FGF-18之穩定化調配物的存放期較佳為至少約12個月、18個月、更佳至少20個月、還要更佳約24個月。監測本發明之FGF-18調配物之穩定性的方法可在該項領域中獲得，且包括本文揭示之實施例中所述之方法。
    - 如本文所用之術語「緩衝液」係指已知安全用於供醫藥學或獸醫學使用之調配物中且具有維持或控制調配物之pH值在調配物所要之pH值範圍內之效應的化合物溶液。控制pH值在中等酸性pH值至中等鹼性pH值下之可接受之緩衝劑包括(但不限於)磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、精胺酸、TRIS及組胺酸組胺酸緩衝劑。「TRIS」係指2-胺基-2-羥甲基-1,3,-丙二醇及其任何藥理學上可接受之鹽。根據本發明，較佳緩衝劑為磷酸鹽緩衝劑。
    - 如本文所用之術語「界面活性劑」係指可特別用於增加疏水性、油性物質之水溶性或另外增加疏水性不同之兩種物質之混溶性的可溶性化合物。為此，此等聚合物通常用於工業應用、化妝品及醫藥中。其亦用作藥物傳遞應用之模型系統，特別以改進藥物之吸收或其向目標組織之傳遞。熟知界面活性劑包括聚山梨醇酯(聚氧化乙烯衍生物；吐溫(Tween))以及泊洛沙姆(亦即基於氧化乙烯及氧化丙烯之共聚物，亦稱為Pluronics®)。根據本發明，較佳界面活性劑為泊洛沙姆界面活性劑且甚至更佳為泊洛沙姆188(Pluronic® F68)。
    - 如本文所用之術語「穩定劑(stabilizing agent/stabilizer)」或「等張劑」為生理可耐受且賦予調配物適合穩定性/張力之化合物。其特別防止穿過與調配物接觸之細胞膜之水的淨流動。在凍乾過程期間，穩定劑亦有效作為低溫保護劑。諸如甘油之化合物通常用於此等目的。其他適合穩定性劑包括(但不限於)胺基酸或蛋白質(例如甘胺酸或白蛋白)、鹽(例如氯化鈉)及糖(例如右旋糖、甘露糖醇、蔗糖及乳糖)。根據本發明，較佳穩定劑為糖，甚至更佳為蔗糖。
    - 如本文所用之術語「小瓶」或「容器」廣泛係指適於容納呈凍乾形式之FGF-18調配物之儲集囊。類似地，其將容納復原溶劑。可用於本發明中之小瓶之實例包括注射器、安瓿、藥筒、或適於經由注射，較佳經由關節內注射向患者傳遞FGF-18調配物之其他此儲集囊。或者，容納FGF-18調配物之小瓶及容納復原溶劑之小瓶可呈現為雙室系統(例如注射器或藥筒)之2個區室。適於包裝用於關節內投予之產品之小瓶為該項技術中所熟知且認識。
    - 如本文所用之術語「溶劑」係指水性或非水性液體溶劑。對溶劑之選擇特別視藥物化合物在該溶劑中之溶解性及投予模式而定。水性溶劑可僅由水組成，或可由水加一或多種可混溶溶劑組成，且可含有溶解之溶質，諸如糖、緩衝劑、鹽或其他賦形劑。更常用之非水性溶劑為短鏈有機醇，諸如甲醇、乙醇、丙醇；短鏈酮，諸如丙酮；及多元醇，諸如甘油。根據本發明，較佳溶劑為水性溶劑，諸如水或生理鹽水溶劑。
    - 如本文所用之術語「軟骨病症」涵蓋由歸因於創傷性損傷或軟骨病之損傷所致之病症。可藉由投予本文所述之FGF-18調配物治療之軟骨病症之實例包括(但不限於)關節炎(諸如骨關節炎或類風濕性關節炎)及軟骨損傷。
    - 術語「骨關節炎」用於意謂關節炎之最常見形式。其可由軟骨破壞引起。少量軟骨可斷開且引起骨之間關節之疼痛及腫脹。隨時間流逝，軟骨可能完全磨損，且骨將相互摩擦。骨關節炎可影響任何關節但通常涉及手及重量承載關節，諸如髖、膝、足及脊柱。在一較佳實例中，骨關節炎可為膝骨關節炎或髖骨關節炎。熟習該項技術者完全瞭解用於該領域中之骨關節炎分類，特定言之OARSI評估系統(參見例如Custers等人，2007)。骨關節炎為一種可藉由投予本發明之FGF-18調配物治療之較佳軟骨病症。
    - 如本文所用之術語「軟骨損傷」為特別由創傷所致之軟骨病症或軟骨損傷。軟骨損傷可由於創傷性機械破壞，特別進一步由於事故或手術而發生。此定義內亦考慮關節組織之運動相關損傷或運動相關磨損。
    本發明之主要目標為包含以下各物或由以下各物組成之穩定凍乾調配物：FGF-18蛋白質、緩衝劑、泊洛沙姆界面活性劑及作為穩定劑之糖。在一較佳具體實例中，緩衝劑為磷酸鹽緩衝劑，泊洛沙姆界面活性劑為泊洛沙姆188，且穩定劑為蔗糖。較佳地，FGF-18蛋白質係選自由以下組成之群組：1)包含人類FGF-18之成熟形式或由該成熟形式組成之多肽，該成熟形式對應於包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基207(Ala)組成之序列，2)包含人類FGF-18之截短形式或由該截短形式組成之多肽，該截短形式包含SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基196(Lys)或由SEQ ID NO：1之殘基28(Glu)至殘基196(Lys)組成，及3)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成之多肽。更佳地，FGF-18為trFGF-18。
    本發明中之FGF-18之濃度較佳為或約為20至300 mcg/小瓶、較佳為或約為20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300 mcg/小瓶、甚至更佳為或約為20、30、60、100、200或300 mcg/小瓶。FGF-18可過量添加5%以防止可在調配期間發生之蛋白質損失。舉例而言，對於FGF-18濃度30 mcg/小瓶，化合物可以31.5 mcg/小瓶之量添加。
    較佳地，歷經至少12個月之時期(在首次使用之前)，本發明之調配物保留在凍乾及/或包裝時之FGF-18生物活性的至少80%。FGF-18活性可如下列章節「實施例」中所述加以量測。
    本發明之較佳緩衝劑為磷酸鹽緩衝劑，且使pH值保持在包含於6與8之間、較佳在包含於7與7.5之間、且甚至更佳在7.2或約7.2。
    總溶液中之緩衝劑濃度較佳為或約為5至500 mM。在一較佳具體實例中，緩衝劑之濃度為或約為10至100 mM。較佳地，緩衝劑之濃度為或約為10 mM。
    本發明中之穩定劑較佳為糖。較佳糖為蔗糖。較佳地，穩定劑之濃度為或約為0.5至250 mg/小瓶、更佳為或約為1至100 mg/小瓶、更特定言之為或約為15至60 mg/小瓶、甚至最佳為或約為30 mg/小瓶。
    本發明之界面活性劑較佳為泊洛沙姆界面活性劑，且特定言之為泊洛沙姆188(亦即Pluronic® F68)。較佳地，界面活性劑之濃度為或約為0.01至10 mg/小瓶、更佳為或約為0.05至約5 mg/小瓶、更特定言之為或約為0.1至約1 mg/小瓶、甚至最佳為或約為0.1、0.2或0.4 mg/小瓶，且特定言之為或約為0.2 mg/小瓶。
    在一較佳具體實例中，本發明中之穩定凍乾調配物包含以下各物或由以下各物組成：為或約為20、30、60、100、200或300 mcg/小瓶之FGF-18；10 mM磷酸鹽緩衝劑(pH 7.2)；30 mg/小瓶之蔗糖及0.2 mg/小瓶之泊洛沙姆188。當包括過量5%時，本發明之凍乾調配物包含為或約為21、31.5、63、105、210或315 mcg/小瓶之FGF-18。
    在另一具體實例中，本發明係有關一種穩定凍乾調配物，其包含：1)濃度比自1：95000或約1：95000至1：6000或約1：6000，較佳為或約為1：92000、1：61000、1：31000、1：18450、1：9200或1：6100之FGF-18：蔗糖，2)濃度比自1：25或約1：25至6：10或約6：10，較佳為或約為1：25、5：83、5：42、1：5、2：5或6：10之FGF-18：泊洛沙姆188，3)莫耳比自1：10500或約1：10500至1：700或約1：700，較佳為或約為1：10500、1：7000、1：3500、1：2100、1：1050或1：700之FGF-18：磷酸鹽緩衝劑(pH 7.2)，其中FGF-18蛋白質較佳選自由以下組成之群組：1)包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-207(Ala)或由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-207(Ala)組成之多肽，2)包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-196(Lys)或由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-196(Lys)組成之多肽，或3)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成之多肽。更佳地，FGF-18蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-207(Ala)或由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-207(Ala)組成。
    在另一具體實例中，本發明係有關一種穩定凍乾調配物，其包含：1)莫耳比自1：90000或約1：90000至1：5000或約1：5000，較佳為或約為1：87000、1：58000、1：29000、1：17400、1：8700或1：5800之FGF-18：蔗糖，2)莫耳比自5：120或約5：120至5：8或約5：8，較佳為或約為5：118、5：79、10：79、10：47、5：12或5：8之FGF-18：泊洛沙姆188，3)莫耳比自1：10000或約1：10000至1：700或約1：700，較佳為或約為1：10000、1：6600、1：3300、1：2000、1：1000或1：700之FGF-18：磷酸鹽緩衝劑(pH 7.2)，其中FGF-18蛋白質較佳選自由以下組成之群組：1)包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-207(Ala)或由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-207(Ala)組成之多肽，2)包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-196(Lys)或由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-196(Lys)組成之多肽，或3)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成之多肽。更佳地，FGF-18蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-196(Lys)或由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28(Glu)-196(Lys)組成。甚至更特定言之，FGF-18蛋白質包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成。在一特定具體實例中，FGF-18蛋白質為trFGF-18。
    本發明更提供一種製造任何上述FGF-18穩定凍乾調配物之方法，其中該方法包含以下步驟：1)形成FGF-18與緩衝劑、泊洛沙姆界面活性劑及作為穩定劑之糖之混合物，及2)使該混合物經受凍乾。
    使用習知程序進行步驟1及2。舉例而言，為製備適合穩定調配物，將既定量之FGF-18(諸如trFGF-18)與保持pH值在7.2或約7.2之磷酸鹽緩衝劑、泊洛沙姆188及蔗糖混合。此等化合物之各者(亦即FGF-18、緩衝劑、界面活性劑及穩定劑)可根據上述濃度、pH值及/或比率使用。凍乾所得混合物且接著分配入小瓶中。此過程之變化將由一般技藝人士所認識。
    本發明亦提供一種供醫藥學或獸醫學使用之製品，其包含：1)包含任何上述穩定凍乾調配物之第一容器，該調配物包含以下各物或由以下各物組成：FGF-18、緩衝劑、泊洛沙姆界面活性劑、作為穩定劑之糖，及2)包含復原溶劑之第二容器。
    舉例而言，第一容器包含穩定凍乾調配物，其包含以下各物或由以下各物組成：既定量之FGF-18(諸如trFGF-18)、保持pH值在7.2或約7.2之磷酸鹽緩衝劑、泊洛沙姆188及蔗糖，且第二容器包含生理鹽水溶液(0.9% w/v注射用氯化鈉)。此等化合物之各者(亦即FGF-18、緩衝劑、界面活性劑及穩定劑)可根據上述濃度、pH值及/或比率使用。較佳地，容納FGF-18調配物之容器及容納復原溶劑之容器對應於雙室系統(例如注射器或藥筒)之兩個區室。
    亦描述提供用以於溶劑(第二容器)中復原凍乾FGF-18調配物(第一容器)之說明的包裝材料。
    本發明之凍乾調配物可保存至少約12個月至約24個月。在較佳儲存條件下，在首次使用之前，調配物在室溫下(在25℃或約25℃下)避強光保存(較佳在黑暗中)。
    本發明之穩定凍乾調配物在使用之前，亦即在注射之前需要較佳在無菌條件下用諸如水或生理鹽水溶液(例如0.9% w/v注射用氯化鈉)之溶劑復原。在復原之後，欲注射之體積為較佳0.5 mL至5 mL、更佳0.5、1或2 mL。FGF-18調配物應較佳在復原1小時內投予。
    本發明提供適於醫藥學或獸醫學使用之FGF-18穩定凍乾調配物，特定言之供單次使用。
    在復原之後，本發明之包含FGF-18之穩定凍乾調配物可用於投予以改良軟骨修復或治療軟骨病症，諸如骨關節炎或軟骨損傷。
    在復原之後，此等穩定凍乾調配物適用於注射及替代性傳遞系統中。在一特別較佳具體實例中，本發明之調配物用於關節內注射。在復原之後，其可藉由直接注射入關節之滑液中或直接進入缺損(defect)中來投予。在本發明之一較佳具體實例中，關節內投予係在選自髖關節、膝關節、肘關節、腕關節、踝關節、脊柱關節、足關節、指關節、趾關節、手關節、肩關節、肋骨關節、肩胛骨關節、股關節、脛骨關節、踵關節之關節中及沿脊柱之骨點進行。在另一較佳具體實例中，關節內投予係在髖關節或膝關節中進行。
    本發明之FGF-18調配物具有改良之穩定性，且可易於在室溫下(在25℃或約25℃下)或在2-8℃下(參見下列實施例)，較佳在室溫下儲存。實際上，發明者已發現包含FGF-18(例如trFGF-18)、10 mM磷酸鹽緩衝劑(pH 7.2)、30 mg/小瓶之蔗糖及0.2 mg/小瓶之泊洛沙姆188的凍乾調配物隨時間穩定，特別當在室溫下儲存時。該等調配物使活性成分(亦即FGF-18)之損失最小。亦已發現該等調配物對氧化及形成蛋白質聚集物更具抗性。
    提供下列實施例以進一步說明本發明之調配物及組合物之製備。本發明之範疇不應解釋為僅由下列實施例組成。
    序列描述：
    SEQ ID NO.1：天然人類FGF-18之胺基酸序列。
    SEQ ID NO.2：重組截短FGF-18(trFGF-18)之胺基酸序列。 實施例
    材料
    本實施例之重組截短FGF-18(trFGF-18)已根據申請案WO2006/063362中所述之技術，藉由在大腸桿菌中表現加以製備。在下列實施例中，trFGF-18及FGF-18可互換使用。
    用於實施例中之其他物質如下：
    - 蔗糖(1.07653，Merck；分子量：342.30 g/Mol)
    - 磷酸二氫鈉單水合物(1.06345，Merck)
    - 磷酸氫二鈉二水合物(1.06586，Merck)
    - 泊洛沙姆188(Lutrol F 68 DAC，USP/NF，Basf；分子量：8400 g/Mol)
    - 注射用水，
    - 生理鹽水溶液(0.9% w/v注射用氯化鈉)
    - 單株抗體抗FGF-18純系#F5A2，用於蛋白質含量(由RBM提供)
    - BAF3-FGFR3C細胞(Washington University)
    - 基於Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640之選擇性培養基(Invitrogen)。
    - ATPlite 1步發光分析系統(Perkin Elmer)
    - 肝素H3149(Sigma)
    設備
    - AMICON ULTRA-4 10,000截斷(UFC 8012024，Amicon)
    - Biacore 2000(Biacore)
    - CO2培育箱(Heraeus)
    - 管柱TSK2000SWx1，7.8×300 mm，5 μ(TosoHaas，代碼08540)
    - 保護管柱TSKG2000(Hichrom，代碼8543)
    - HPLC系統(Waters)
    - 光度計(Perkin Elmer)
    - 膜過濾器0.22 μm(Durapore型GWVP，Millipore)
    - Stabileo軟體(1.1版；Microsoft® Excel Visual Basic®套件)
    - GraphPad軟體(Prism)
    - 不銹鋼固持器22 mL及220 mL容量(Sartorius)
    - Zorbax 300SB-C18(150×4.6cm)管柱
    - DIN2R(3 ml)玻璃小瓶(Nuova OMPI)
    - 經塗佈之橡膠塞(S2F452，D777-1，B2-40，West Pharmaceutical)
    - 橡膠塞(代碼1779，W1816灰色，Pharma-Gummi)
    方法
    關於調配物之不同分析
    標準方法用於：- SE-HPLC，- RP-HPLC，- 殘留水分，- pH，- 重量莫耳滲透濃度(僅時間0)，- SDS-PAGE/SS，及- 肽圖譜分析/UPLC(氧化形式)。
    蛋白質合量
    藉由Biacore對不同調配物中之蛋白質(亦即trFGF-18)進行定量。藉由在25℃下在5 μL/min下流經先前用單株抗體抗FGF-18純系F5A2塗佈之感測器表面來測試含有trFGF-18之樣品(25 μL)(在10 mg/mL BSA存在下適當稀釋)，隨後使用5 μL 10 mM甘胺酸(pH 2.0)作為再生緩衝液。在各分析作業階段中操作在125直至2,000 ng/mL之範圍內之參照標準(IRS FGF-18第051230號)。結果以共振單位(RU)形式收集且根據使用對數轉換資料進行二次演算法擬合之標準曲線外推各樣品之FGF-18含量。
    生物分析
    藉由使用用FGF受體3c(FGFR3c)穩定轉染之BaF3細胞株進行試管內生物分析將FGF-18之生物活性量測為增殖活性。表現FGFR3c之BaF3細胞在FGF-18刺激下增殖。
    在存在r-hIL-3作為生長因子下在基於RPMI 1640之選擇性培養基中培養BaF3/FGFR3c細胞。為特異性測試FGF-18之增殖效應，需要使細胞喪失IL-3。因此，在37℃、5% CO2下在不存在r-hIL-3下培養細胞26小時，隨後進行分析。
    標準品及樣品於分析介質中在0.002 U/mL直至177.5 U/mL之濃度範圍內經5倍連續稀釋。喪失IL-3之BAF3/FGFR3c細胞(20,000個細胞/孔)在37℃、5% CO2下在1 μg/mL肝素及10%新生小牛血清存在下與FGF-18一起培育，且接著在48小時之後藉由「ATPlite 1步」發光分析(一種基於螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)之ATP監測系統)評估細胞增殖。
    應用延伸劑量-反應曲線模型量測樣品效能。使用此模型，標準及樣品之整個劑量-反應曲線根據S形劑量-反應曲線，以報導cps(亦即每秒計數)值相對於FGF-18濃度對數之可變斜率(4PL)演算法擬合。對於各值，EC50由GraphPad軟體自動計算。基於參照製劑之EC50與未知樣品之EC50之間的比率(效能比)計算樣品效能。FGF-18之效能表示為U/mL。
    實施例1：trFGF-18凍乾調配物
    FGF-18凍乾調配物之組成提供於下表1中。

    如下製造凍乾調配物：將蔗糖及泊洛沙姆188溶解於磷酸鹽緩衝液中。接著，添加所需量之藥物物質(trFGF-18)，檢查pH值且使溶液達到最終體積。溶液接著在維持過濾比約20 cc/cm2或約50 cc/cm2之氮氣壓力下經0.22 μm膜(Durapore®)過濾。
    接著在無菌條件下將最終溶液手動填充入玻璃小瓶(0.5 mL/小瓶)中且根據下列循環凍乾：
    凍乾調配物準備在任何時間用諸如注射用水或生理鹽水溶液之溶劑復原。
    實施例2：FGF-18調配物之初步穩定性研究
    實施例2.1：使用加速穩定性條件(在2-8℃、25℃及40℃下)以鑒別欲進一步研究之凍乾預調配物(資料未示)。
    已製備各種初步凍乾調配物以鑒別最佳候選調配物。在此初步研究之框架中，已評估各種緩衝劑，包括磷酸鹽及組胺酸緩衝劑。亦已測試各種濃度之蔗糖及泊洛沙姆188。測試預候選調配物之純度(藉由SE-HPLC及RP-HPLC)、蛋白質含量(藉由Biacore)、生物活性(試管內生物分析)、殘留水分、pH值及重量莫耳滲透濃度。亦藉由SDS-PAGE/SS(純度)及肽圖譜分析/UPLC(氧化形式)產生支持性穩定性資料。
    實施例2.2(初步調配物之穩定性資料；資料未示)：藉由SE-HPLC收集之初步凍乾調配物歷經3-4周儲存的穩定性資料指示在pH 7.2下之磷酸鹽緩衝劑將較佳，因為相較於在pH 6下之組胺酸緩衝劑，觀測到純度高得多(亦即單體%較高)(參見表2)。蔗糖之量(15 mcg/小瓶對30 mcg/小瓶)亦在使FGF-18對抗聚集得以穩定方面起作用，其中在30 mcg/小瓶之蔗糖下觀測到單體回收率普遍較高(在25℃及5℃下儲存)。此外，在過濾步驟之後(在凍乾過程之前)觀測到蛋白質回收率隨界面活性劑(亦即泊洛沙姆188)增加而增高，其中最佳結果在0.2 mg/小瓶下(圖1)。
    基於此預調配階段之結果，製備6個凍乾調配物供進一步研究(來自表1之調配物1-6；亦稱為候選調配物)。
    實施例3：FGF-18凍乾調配物之穩定性研究
    已收集關於表1之候選凍乾調配物之2周至24個月穩定性資料。
    實施例3.1(根據SE-HPLC之純度)：藉由Stabileo對藉由SE-HPLC產生之穩定性資料進行之統計評估的結果概述於表3中：在不同溫度下儲存(在40℃下直至6個月及在25℃下直至24個月)後未偵測到任何凍乾候選調配物有顯著純度(單體含量)損失。
    實施例3.2(根據SDS-PAGE/SS之純度)：藉由SDS-PAGE產生之結果確認在所有測試溫度下儲存(在40℃下至少6個月及在25℃下直至18個月)後任何凍乾調配物之純度皆普遍高於99%。結果提供於表4中。
    實施例3.3(根據RP-HPLC之純度)：藉由Stabileo對藉由RP-HPLC產生之穩定性資料進行之統計評估的結果概述於表5中：在不同溫度下儲存(在40℃下直至6個月及在25℃下直至18個月)後未偵測到任何凍乾候選調配物有顯著純度(主峰%)損失。因此，根據本發明調配FGF-18不會導致純度相較於起始物質(純)FGF-18有任何損失。注意到當起始物質(在調配之前)不完全純淨時(雜質不完全藉由RP-HPLC解析)，調配之前的峰不在100%，但例如在77.5%(對於FD-30)及87.4%(對於FD-300)且T=0時之峰例如在76.8%(對於FD-30)及87.7%(對於FD-300)。
    實施例3.4(蛋白質含量分析)：藉由Bioacore量測之蛋白質濃度之結果概述於表6及7中。在經0.22 μm膜過濾後未偵測到較大損失，亦即觀測到幾乎完全蛋白質回收率(參見表6中之「AF」欄)。在用1 mL WFI復原凍乾產物後(參見表6中之「T0」欄)，獲得較低回收率，此可解釋為蛋白質吸附於玻璃小瓶上(在復原後，蛋白質溶液接著暴露於較大表面)。
    就穩定性觀點來看，在所有測試溫度下，對於所有強度，藉由Biacore皆未偵測到蛋白質含量損失，如表7中所示(在40℃下直至6個月及在25℃下直至24個月)。
    實施例3.5(生物活性)：所有凍乾候選物在儲存後之生物活性的結果(用表示U/容器)提供於表8中。舉例而言，在儲存後觀測之較高強度(300 mcg/小瓶之trFGF-18)的生物活性在25℃與40℃兩者下隨時間均穩定。以最低強濃度FD-20觀測到更大變化性。因為藉由任何其他測試未偵測到產物穩定性有變化，所以以FD-20觀測到之此降低必須在25℃下儲存39、52、78及104周之後加以確認。
    實施例3.6(氧化形式)：在儲存後偵測之所有強度之氧化形式的程度概述於表9中：在可經受氧化之Met殘基中，結果指示對於所有強度及在任何評估溫度下，Met 1更易受氧化。
    實施例3.7(殘留水分)：在儲存後所有強度皆未發生殘留水分顯著增加；在整個穩定性研究中普遍量測到殘留水分值低於1%或約為1%(參見表10)(在40℃下直至6個月及在25℃下直至24個月)。
    實施例3.8(pH值變化)：在任何測試溫度下儲存後，對於所有強度，未觀測到pH值有顯著變化(參見表11)(在40℃下直至6個月及在25℃下直至24個月)。
    實施例3.9(重量莫耳滲透濃度變化)：在任何測試溫度下儲存後，對於所有強度，未觀測到重量莫耳滲透濃度有顯著變化(參見表12)(在40℃下直至6個月及在25℃下直至24個月)。
    表
    表2：在儲存後凍乾預調配物(10 mcg/小瓶之FGF-18及0.2 mg/小瓶之F68)中之FGF-18單體的百分比(%)，藉由SE-HPLC分析







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    圖1：展示在凍乾過程之前界面活性劑(泊洛沙姆188)對FGF-18回收之效應。使用於pH 7.2磷酸鹽緩衝液中含有10 mg/ml(過量+5%)FGF-18之預調配物，同時改變界面活性劑之濃度(自0至0.2%)。評估各預調配物在過濾之前(BF)及在過濾之後(T=0)之蛋白質含量。
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    <223> 重組截短FGF-18(trFGF-18)
    <400> 2
    权利要求:
    Claims (15)
    [1] 一種穩定凍乾調配物，其包含FGF-18、緩衝劑、泊洛沙姆(poloxamer)界面活性劑及作為穩定劑之糖。
    [2] 如申請專利範圍第1項之穩定凍乾調配物，其中該緩衝劑為磷酸鹽緩衝劑且使pH值保持在6與8之間。
    [3] 如申請專利範圍第2項之穩定凍乾調配物，其中該磷酸鹽緩衝劑使pH值保持在7.2或約7.2。
    [4] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物，其中該緩衝劑之濃度為或約為5至100 mM。
    [5] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物，其中該泊洛沙姆界面活性劑為泊洛沙姆188。
    [6] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物，其中該泊洛沙姆界面活性劑之濃度為或約為0.1至0.4 mg/小瓶。
    [7] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物，其中該穩定劑為蔗糖。
    [8] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物，其中該穩定劑之濃度為或約為10至60 mg/小瓶。
    [9] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物，其中FGF-18之濃度為或約為20至300 mcg/小瓶。
    [10] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物，其中該調配物包含20、30、60、100、200或300 mcg/小瓶之FGF-18、使pH值保持在7.2或約7.2之10 mM磷酸鹽緩衝劑、30 mg/小瓶之蔗糖及0.2 mg/小瓶之泊洛沙姆188。
    [11] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定調配物，其中該調配物更包含過量5%之FGF-18。
    [12] 如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物，其中FGF-18係選自由以下組成之群：a.包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28-207或由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28-207組成之多肽，b.包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28-196或由SEQ ID NO：1之胺基酸殘基28-196組成之多肽，及c.包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成之多肽。
    [13] 一種產生如前述申請專利範圍中任一項之穩定凍乾調配物之方法，其包含以下步驟：a.形成FGF-18與該緩衝劑、該界面活性劑及該穩定劑之混合物，及b.使該混合物經受凍乾。
    [14] 一種製品，其包含含有如申請專利範圍第1至12項中任一項之穩定凍乾調配物之第一容器及含有復原溶劑之第二容器。
    [15] 如申請專利範圍第14項之製品，其中該包含穩定凍乾調配物之容器及該包含復原溶劑之容器為雙室系統之兩個區室。
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    EP11170437||2011-06-17||
    US201161499216P| true| 2011-06-21|2011-06-21||
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