 新穎歐洲型ｐｒｒｓｖ株
专利摘要:
本發明係關於含有PRRSV之新PRRSV歐洲型株的經改良修飾之活PRRS疫苗，及該等疫苗之使用及製造方法。 公开号:TW201300538A 申请号:TW101105138 申请日:2012-02-16 公开日:2013-01-01 发明作者:金 柏賈德；傑洛米 克洛爾；莎拉Ｍ 雷頓；佛客 歐林格；法蘭克斯 賽維爾 歐斐隆；史帝芬 皮斯齊；麥可 丹尼斯 彭科斯基；麥可Ｂ 魯夫；菲利浦 阿特力；艾瑞克 馬丁 瓦格恩 申请人:百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司； IPC主号:A61K39-00
专利说明:
新穎歐洲型PRRSV株 本發明係關於一種歐洲型豬生殖與呼吸症候群病毒(European Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus；PRRSV)之活減毒株、產生該等病毒株之方法、基於該等病毒株之疫苗及用於產生該等疫苗之方法以及其用於治療豬之用途。 豬生殖與呼吸症候群(PRRS)被許多人視為目前影響全世界養豬業之最重要的疾病。1987年，該症候群首先在美國描述為「神秘豬疾病」且迅速傳遍全球。其引起生殖力嚴重降低，致使因繼發性感染引起之死亡率增加，且導致飼料轉化率及平均日增重降低。不幸的是，已證明難以控制引起PRRS之病毒。 PRRS病毒(PRRSV)為一種歸類於動脈炎病毒科(family Arteriviridae)之包膜單股RNA病毒(Cavanaugh,1997)。其引起廣泛的豬疾病，該豬疾病首先於1987年在美國描述為「神秘豬疾病」(Hill,1990)。該疾病在所有年齡組之豬中均表現為呼吸疾病，引起一些較年輕豬死亡以及繁殖適齡母豬產生嚴重的生殖問題。 PRRSV可經由感染豬與易感染豬之間的直接接觸傳播且常常如此。在極短距離內亦可能藉由空氣或經由精液傳播。一旦感染，病毒可在成年豬血液中保留約兩週，且在感染豬中保留1至2個月或更長時間。感染公豬可將病毒排在精液中，長達100天以上。此長期病毒血症顯著提高傳播可能性。此外，PRRS病毒可在妊娠期最後第三期期間穿過胎盤，感染子宮內之仔豬且引起死胎或產下弱仔豬。 所有類型及規模之畜群，包括健康狀態良好或一般或來自室內或室外單元之畜群，均可感染PRRS病毒。感染畜群可能遭遇嚴重的生殖力降低，以及斷乳後肺炎程度提高且生長緩慢。生殖期通常持續兩至三個月；然而，斷乳後問題通常變成地方病。生殖疾病之特徵為在妊娠後期影響大母豬與小母豬的流產爆發。在妊娠約109天及112天過早產下小豬。死胎及產下之弱仔豬數目增加且引起斷乳前死亡率顯著增加。 傳統上已在養殖場，特別是連續流動養殖場中見到呼吸期。然而，亦可在肥育畜中見到作為豬呼吸疾病綜合症(porcine respiratory disease complex；PRDC)之一部分的由PRRS病毒引起之呼吸問題。生長速率會降低，不能出售之豬的百分比增加，且斷乳後死亡率升高。診斷結果指示存在與PRRS病毒相關聯之高程度肺炎以及一般視為次級感染原之多種其他微生物。細菌分離株可尤其包括豬鏈球菌(Streptococcus suis)、豬嗜血桿菌(Haemophilus suis)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)及多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)。通常涉及之病毒劑包括豬流感病毒及豬呼吸道冠狀病毒。患病豬很少對高程度之藥物治療起反應，且全進/全出系統已無法控制該疾病。 PRRSV病毒以兩種稱為「美國」型與「歐洲」型之基因型存在，該等基因型共享約50%序列同源性(Dea S等人(2000).Arch Virol 145：659-88)。此兩種基因型亦可以其免疫性質而加以區分。有關各種分離株之大部分定序資訊係基於結構蛋白質，亦即僅佔病毒基因組約4%之包膜蛋白GP5，而關於非結構蛋白質(nsp)所知甚少。PRRSV之分離及疫苗之製造已在多個公開案中描述(WO 92/21375、WO 93/06211、WO 93/03760、WO 93/07898、WO 96/36356、EP 0 676 467、EP 0 732 340、EP 0 835 930)。 疫苗接種為減輕PRRS負荷之關鍵方法，因為自PRRS感染恢復之豬將發展免疫反應，此免疫反應在正常情況下將保護豬免遭相同病毒株再次感染。然而，PRRS病毒具有變化之能力(藉由突變或重組)；因此，可能出現新的病毒株。在該等狀況下，病毒株之間的交叉保護可能不存在，且在先前已感染之農場中可能觀察到新的爆發。因此，對其他疫苗存在持續需要。 本發明係關於歐洲基因型之經改良修飾之活PRRS疫苗，及可用於製造該等疫苗之新PRRSV株。詳言之，本發明提供經改良之PRRS病毒株，其已根據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)之規定寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(the European Collection of Cell Cultures，ECACC)寄存編號ECACC 11012501及ECACC 11012502(各自於2011年1月25日寄存)下，或上述病毒株之一之任何後代或子代。 在特定實施例中，本發明描述一種歐洲型豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)，其為寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)寄存編號ECACC 11012501或寄存編號ECACC 11012502下之病毒株。 PRRSV之特徵在於藉由在細胞培養物中繼代至少36次來使該病毒減毒，使得當將經修飾之病毒投與易感染PRRSV之豬或其他哺乳動物時，其無法引起PRRSV疾病之臨床徵象，但能夠誘導使哺乳動物對PRRSV之病原性形式免疫的免疫反應。 亦涵蓋一種製備寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)寄存編號ECACC 11012502下之活減毒PRRSV或自寄存在寄存編號ECACC 11012501下之親本株減毒之PRRSV的方法，其包含使MA 104生長之歐洲型PRRSV適應非MA 104哺乳動物細胞。 本發明之另一態樣涵蓋一種用於保護豬免遭PRRSV感染之疫苗，其包含寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)寄存編號ECACC 11012502下之活減毒PRRSV或自寄存在寄存編號ECACC 11012501下之親本株減毒的PRRSV及醫藥學上可接受之載劑。該種疫苗宜進一步包含一或多種非PRRSV減毒或不活化病原體或其抗原性物質。舉例而言，非PRRSV病原體可選自假狂犬病毒(Pseudorabies virus)、豬流感病毒(Porcine influenza virus)、豬細小病毒(Porcine parvovirus)、傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、豬丹毒桿菌(Erysipelo rhusiopathiae)、支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、豬霍亂沙氏桿菌(Salmonella cholerasuis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬肺炎黴漿菌及胸膜肺炎放線桿菌。 在其他實施例中，疫苗可進一步包含一或多種選自由以下組成之群的其他歐洲型PRRSV株：寄存在寄存編號萊利斯塔病毒株(Lelystad virus strain)(萊利斯塔劑(CDI-NL-2.91))下之PRRSV株，或其他病毒株，諸如寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387、CNCM寄存編號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下之病毒株，或實際上可為美國型株，諸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC寄存編號VR-2332、ATCC寄存編號VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402。 預期疫苗可包含適於皮內或肌肉內應用之載劑。在一些實施例中，疫苗呈冷凍乾燥形式。在特定實施例中，疫苗包含至少約107個病毒粒子。 本發明之另一態樣係關於一種製備用於對抗PRRS之活減毒疫苗之方法，其包含將寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)寄存編號ECACC 11012502下之活減毒PRRSV病毒或自寄存在寄存編號ECACC 11012501下之親本株減毒的PRRSV與醫藥學上可接受之載劑混合。在該等方法中，活減毒PRRSV較佳可進一步包含一或多種選自由寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387及CNCM寄存編號I-1388下之PRRSV株組成之群的其他歐洲型PRRSV株。 在一些實施例中，活減毒PRRSV可進一步包含佐劑。 亦涵蓋一種使豬對豬生殖與呼吸症候群(PRRS)免疫之方法，該方法包含向豬投與包括活的豬生殖與呼吸症候群病毒與藥理學相容之載劑混合之疫苗組合物的步驟，該病毒包含PRRS 94881病毒，其在細胞培養物中繼代至少36次以修飾該病毒，以使得當經修飾之病毒投與易感染PRRS之豬或其他哺乳動物時，其無法引起PRRS疾病之臨床徵象，但能夠誘導使哺乳動物對PRRS之病原性形式免疫的免疫反應。 在一些實施例中，進行該方法，其中豬在疫苗接種後無肺病變。在其他實施例中，相比於接種Porcilis疫苗，豬在疫苗接種後肺病變較少。 本發明之另一態樣係關於一種具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10中所述之序列具有至少95%同源性之核苷酸序列的PRRS病毒。 亦涵蓋一種PRRS病毒，其包含至少一個編碼與SEQ ID NO：2至9或SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：18中所述之任何序列具有至少98%一致性之蛋白質之ORF。 亦涵蓋一種PRRS病毒，其具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之片段之核苷酸序列，其中該片段編碼選自由以下組成之群之ORF：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。 本發明進一步係關於一種用於接種豬科動物之次單位疫苗，其中該疫苗包含一或多種選自由編碼選自由以下組成之群之ORF的核苷酸組成之群之核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。 本發明之另一態樣係關於一種用於接種豬科動物之次單位疫苗，其中該疫苗包含一或多種選自由以下組成之群之核苷酸：SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；及SEQ ID NO：34。 亦涵蓋一種組合物，其包含一或多種選自由具有以下序列之蛋白質組成之群之蛋白質：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。 亦涵蓋一種經分離核酸，其包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34。 本發明進一步係關於一種重組表現載體及/或包含該等表現載體之疫苗，其中該等載體包含編碼一或多種選自由以下組成之群之PRRSV ORF的核酸序列可操作地連接於啟動子：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。在該等實施例中，編碼ORF之核酸可較佳係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；及SEQ ID NO：34。 本發明提供治療豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)感染或降低其嚴重程度之方法，以及預防PRRSV感染之方法。一般而言，該方法用於治療豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)感染或降低其嚴重程度或發病率。「治療或降低嚴重程度或發病率」係指降低通常與感染相關之臨床徵象、症狀及/或病理性徵象之嚴重程度，直至且包括預防任何該等徵象或症狀。「病理性徵象」係指在顯微鏡下或在屍檢期間發現之感染跡象(例如肺病變)。 該方法一般包括向規定年齡或年齡範圍之豬投與治療量之PRRSV抗原的步驟。舉例而言，在本發明之一個態樣中，一治療量之PRRSV抗原可投與約三週齡或更小之仔豬，且不同治療量之抗原可投與約3週齡與4週齡之間的豬。類似地，更為不同之治療量可投與約四週齡與十六週齡之間(或此範圍內之任何年齡，例如五週至六週齡、九週至十五週齡、七週至十週齡等)的豬或超過十六週齡之豬，諸如成年大母豬。 在特定實施例中，本發明係關於一種減毒之非典型PRRSV株及相應經改良修飾之活疫苗，該等疫苗賦予對此新發現之典型PRRSV株之有效免疫力。「有效免疫力」係指疫苗預防可引起疾病之實質性臨床徵象之豬PRRSV感染，包括非典型PRRSV感染之能力。應瞭解，經免疫接種之豬可能對PRRSV呈血清反應陽性或不對PRRSV呈血清反應陽性，但豬未顯示任何實質性臨床症狀。 在較佳形式中，本發明之疫苗包括毒性已減弱之活歐洲型PRRS活病毒。所得減毒病毒已顯示在經過攻毒之對照宿主動物研究中無毒性且賦予有效免疫力。歐洲型PRRS之此特定病毒株毒性不如其他強，且因此，作為疫苗候選者，其為有吸引力之選擇。PRRSV 94881親本株未在懷孕大母豬中引起嚴重的非典型PRRS疾病，亦未在幼豬中引起嚴重肺病變。此病毒株最初在North Rhine Westphalia(Germany)自患有嚴重呼吸病症之三週齡仔豬分離。隨後該病毒株經由在MA 104細胞中連續繼代進行減毒。該減毒株於2011年1月25日寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)(Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 0JG,Great Britain)且給予寄存編號11012502。此減毒病毒為一種較佳之種原病毒(Master Seed Virus，MSV)，其隨後繼代且開發為一種有效的PRRSV疫苗。該命名為94881之毒性親本株亦根據布達佩斯條約於2011年1月25日寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)(Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 0JG,Great Britain)且給予寄存編號11012501。 在某些例示性實施例中，經修飾之活病毒疫苗經由肌肉內注射對豬以1 ml之劑量進行測試且對大母豬以2 ml之劑量進行測試，且顯示有效產生保護性免疫力。 使用經典病毒學方法實現病毒繼代以使其減毒。特定言之，親本分離株PRRS 94881經由在MA 104細胞中連續繼代以在初始分離後達成108代之最大繼代來進行活體外減毒。簡言之，該物質在T-25 cm2或T-75 cm2燒瓶中以每週約1至2代繼代，總共繼代108代。將具有約12-30 mL補充有6%胎牛血清(FBS)之最低必需培養基(MEM)的匯合MA 104細胞培養物用100至300 μl該病毒接種。培養物在濕潤腔室培育箱中於37℃及4-6% CO2下培育3-7天。一旦培養物達到>25%細胞病變效應(CPE)，則藉由抽取上清液收穫燒瓶。一部分上清液轉送至新的燒瓶內且將2 mL收穫物等分儲存在-60℃至-80℃下。 此項技術中熟習標準技術使用者將能夠確定寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒病毒的基本核酸序列。因此，本發明進一步涵蓋寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒PRRSV 94481所特有之核酸序列。較佳地，本發明進一步涵蓋與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10之序列共享至少95%序列同源性的PRRS病毒核酸序列，因為該等病毒可能在動物以含有該等同源序列之減毒病毒進行疫苗接種後有效賦予其免疫力。SEQ ID NO：1中所示之序列為減毒PRRS 94881 MSV之全長序列且具有14843 bp之全長序列。此序列之ORF 1至7已註釋如下： SEQ ID NO：10中所示之序列為親本PRRSV 94881株第5代之全長序列且具有14843 bp之全長序列。此序列之ORF 1至7已註釋如下： 伴隨此新減毒歐洲型PRRS病毒株之分離，可產生含有反映目前此領域中發現之毒性PRRS株之最近PRRS株的改良PRRS疫苗。詳言之，新減毒歐洲型PRRS病毒可用以製備經修飾之活疫苗(MLV)。經修飾之活疫苗的特徵在於其含有可在豬中複製，但不引起PRRS臨床疾病之活病毒。此外，在投與時，其在豬中誘導免疫反應，該免疫反應一般引起顯著程度的對後續病原性PRRS病毒感染之防護。顯示該等特徵之病毒通常稱為減毒病毒。此外，本發明提供PRRSV 94881之親本株與減毒株兩者之ORF序列的詳情。因此，預期熟習此項技術者可在次單位疫苗中採用本文所示之任一或多種ORF之序列。 如上所述，一般而言，可藉由在可感染病毒之適合宿主細胞中重複繼代，直至病毒顯示所需性質，自病原性病毒分離株產生減毒病毒(WO 92/21375、WO 93/06211、WO93/03760、WO 93/07898、WO 96/36356、EP 0 676 467、EP 0 732 340、EP 0 835 930)。或者，其可經由使用感染性純系，通常使用病毒基因組之全長互補DNA轉錄物進行重新遺傳工程改造而產生(WO 98/18933、EP 1 018 557、WO 03/062407、Nielsen等人，J Virol 2003,77：3702-371 1)。在一較佳實施例中，本發明係關於一種含有歐洲基因型94481之減毒PRRS病毒的MLV，該病毒自寄存在ECACC寄存編號11012501下之親本病毒減毒。較佳MLV含有寄存在ECACC寄存編號11012502下之本發明減毒病毒。 在另一態樣中，本發明涵蓋於2011年1月25日寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)(Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 0JG,Great Britain)寄存編號ECACC 11012502(MLV之減毒株)及11012501(親本株)下之PPRS病毒之子代或後代的製備與分離。因此，本發明延及經由以相同或相異形式繁殖或繁育，來源於寄存株之PRRS病毒株，尤其具有寄存株之基本特徵的後代。在持續繁殖後，該等病毒株可獲得突變，大部分突變不會顯著改變此等病毒株之性質。 本發明之病毒株亦可進一步修飾以賦予該等病毒株其他所需性質。此可藉由經典繁殖及選擇技術，如在適合宿主細胞中持續繁殖以擴展減毒表型來達成。或者，病毒株可藉由適合基因工程改造技術，使此等病毒株之基因組之核酸序列定向突變來進行遺傳修飾。PRRSV之基因組已獲得完全或部分定序(Conzelmann等人，1993；Meulenberg等人，1993a；Murtaugh等人，1995)，且除RNA依賴性RNA聚合酶(ORF 1a及1b)外，亦編碼六種結構蛋白質，其中四種稱為GP2(ORF2)、GP3(ORF3)、GP4(ORF4)及GP5(ORF5)之包膜醣蛋白、一種非糖基化膜蛋白M(ORF6)及核衣殼蛋白N(ORF7)(Meulenberg等人，1995,1996；van Nieuwstadt等人，1996)。歐洲型及美國型PRRSV株之免疫學表徵及核苷酸定序已鑑別出PRRSV株內位於結構病毒蛋白質中之次要抗原差異(Nelson等人，1993；Wensvoort等人，1992；Murtaugh等人，1995)。已將本發明之PRRS 94881 MSV與歐洲參考病毒株萊利斯塔病毒(LV)相比較，揭示8種不同病毒基因中在85.40%至95.09%範圍內之核苷酸同源性及兩種病毒株之間86.39%至97.27%之胺基酸一致性。可鑑別出相比於LV，94881 MSV之ORF 1a中存在兩個缺失。舉例而言，94881 MSV之ORF1a與萊利斯塔病毒具有85.40%核苷酸同源性，使得胺基酸一致性為86.39%；94881 MSV之ORF1b與萊利斯塔病毒具有92.12%核苷酸同源性，使得胺基酸一致性為97.27%；94881 MSV之ORF2與萊利斯塔病毒具有91.07%核苷酸同源性，使得胺基酸一致性為90.76%；94881 MSV之ORF3與萊利斯塔病毒具有90.98%核苷酸同源性，使得胺基酸一致性為89.43%；94881 MSV之ORF4與萊利斯塔病毒具有90.58%核苷酸同源性，使得胺基酸一致性為87.43%；94881 MSV之ORF5與萊利斯塔病毒具有90.43%核苷酸同源性，使得胺基酸一致性為88.56%；94881 MSV之ORF6與萊利斯塔病毒具有95.02%核苷酸同源性，使得胺基酸一致性為97.11%；94881 MSV之ORF7與萊利斯塔病毒具有95.09%核苷酸同源性，使得胺基酸一致性為92.97%。 實際上，本發明之PRRS 94881病毒可製成嵌合病毒，其中ECACC寄存編號11012502下之PRRS病毒或實際上寄存在ECACC寄存編號11012501下之親本株的骨架經修飾以用來自不同PRRS病毒株之相應ORF置換ORF 1a、ORF 1b、ORF 2、ORF 3、ORF 4、ORF 5、ORF 6或ORF 7中一或多者之內源性序列。舉例而言，不同PRRS病毒株可為不同的歐洲型株，諸如萊利斯塔病毒株(萊利斯塔劑(CDI-NL-2.91))，或其他株，諸如寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387、CNCM寄存編號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下之株，或實際上可為美國型株，諸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC寄存編號VR-2332、ATCC寄存編號VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402。 用於製備經修飾之序列的重組技術為熟習此項技術者所熟知，且通常採用構築病毒基因組之全長互補DNA複本(感染性純系)，接著可藉由DNA重組及操縱方法(如定點突變誘發等)進行修飾。以此方式，可修飾例如病毒蛋白質之抗原性位點或酶促性質。文獻中已報導歐洲及北美基因型之PRRS病毒株之感染性純系。 適於本發明疫苗之本發明PRRS病毒株可藉由此項技術中已知之方法生長及收穫，例如藉由在如猿細胞株MA-104、Vero細胞或豬肺泡巨噬細胞之適合宿主細胞中繁殖。PRRSV優先在肺泡肺巨噬細胞中生長(Wensvoort等人，1991)。諸如CL2621及自猴腎細胞株MA-104選殖之其他細胞株的幾個細胞株(Benfield等人，1992；Collins等人，1992；Kim等人，1993)亦容易受病毒感染。 因此，包含寄存在ECACC寄存編號11012501、11012501、寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387及CNCM寄存編號I-1388下之任一PRRSV株PRRS病毒的疫苗以及此等株或其後代之任何組合為本發明之較佳實施例。在特定實施例中，PRRS病毒94881以如下方法生長，其中病毒與宿主細胞在同一天一起並行接種至生物反應器中，如圖9中所示。產生PRRS病毒94881之方法的其他特徵可如與本文同時申請為美國臨時申請案之名稱為「A Commercial scale process for production of PRRSV」的申請案第61/444,071號(其與本申請案同時申請)中所述。雖然此為一種生長PRRSV 94881之方法，但應瞭解該病毒可根據熟習此項技術者已知之任何習知方法繁殖。 較佳地，本發明之疫苗為經修飾之活疫苗，其包含一或多種此等活株於適合載劑中，但不活化病毒亦可用以製備死疫苗(KV)。MLV通常調配成允許每一劑量投與101至107個病毒粒子，較佳每一劑量103至105個粒子，更佳為每一劑量104至105個粒子(4.0-5.0 log10 TCID50)。KV可基於每一劑量103至1010個病毒粒子之不活化前力價調配。疫苗可包含醫藥學上可接受之載劑，例如生理鹽溶液。 豬可經由口鼻途徑感染PRRSV。肺中之病毒由肺的肺泡巨噬細胞吸收且在此等細胞中在9小時內完成PRRSV複製。PRRSV在12小時內自肺行進至肺淋巴結，且在3天內行進至周圍淋巴結、骨髓及脾。在此等部位，僅少許細胞對病毒抗原呈染色陽性。病毒在血液中存在至少21天之時間且通常時間長得多。7天後，在血液中發現PRRSV抗體。PRRS感染之豬中病毒與抗體之組合存在表明儘管存在抗體，但病毒感染可持續長時間，不過程度較低。在至少7週期間，肺中之肺泡細胞群體不同於正常SPF肺。 本發明之疫苗可以活病毒之冷凍乾燥製劑形式提供，其用溶劑復原，以產生注射用溶液。溶劑可例如為水、生理鹽水或緩衝液或輔助溶劑。溶劑可含有佐劑。復原疫苗接著可注射至豬中，例如以肌肉內或皮內注射液形式注射至頸中。對於肌肉內注射，可應用2 ml體積，對於皮內注射，其通常為0.2 ml。因此，在另一態樣中，本發明為一種疫苗產品，其在各別容器中包含病毒之冷凍乾燥組合物及復原用溶劑，且視情況進一步含有包含使用說明書之活頁或標籤。 本發明之疫苗不僅可包含一或多種上述株，而且亦可包括對PRRS或其他豬病毒性或細菌性疾病(如豬環狀病毒或經典豬瘟病毒)具有活性之其他組分。因此，本發明進一步係關於所述疫苗，其特徵在於其含有至少一種對非PRRS之豬疾病具有活性之其他抗原。舉例而言，該等其他抗原可包括豬肺炎黴漿菌、PCV2、SIV、副豬嗜血桿菌、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌、豬放線桿菌、鉤端螺旋體屬(Leptospira sp.)細小病毒及其類似物。此外，疫苗可包含某些醫藥學上或獸醫學上可接受之佐劑。本發明提供新型疫苗組合物，尤其包含PRRSV 94881之PRRS病毒疫苗，其進一步包含增強疫苗功效之佐劑，使得在投與佐劑與疫苗之組合時，見到優於投與單獨疫苗之臨床反應/結果。舉例而言，本發明之疫苗組合物可包含PRRSV 94881病毒疫苗及選自由以下組成之群之佐劑：MCP-1、α-生育酚(例如α-生育酚乙酸酯，其一例示性型式以Diluvac Forte®出售)、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus sonmus)部分、卡波莫(carbopol)及其組合。在一些實施例中，包含PRRS 94881病毒疫苗之病毒疫苗可為重組次單位疫苗或者可為活減毒病毒疫苗。所存在之一例示性活疫苗為Ingelvac®PRRS MLV，且PRRS 94881可以類似於Ingelvac®PRRS MLV之方式調配。 除上述外，本發明之免疫原性組合物亦可含有其他成分，只要該等其他成分不干擾佐劑或基本病毒疫苗即可。該等其他成分包括例如黏合劑、著色劑、乾燥劑、消毒劑、濕潤劑、穩定劑、賦形劑、黏著劑、塑化劑、增黏劑、增稠劑、貼附材料、軟膏基質、角蛋白脫除劑、鹼性物質、吸附促進劑、脂肪酸、脂肪酸酯、高級醇、界面活性劑、水及緩衝劑。較佳其他成分包括緩衝劑、軟膏基質、脂肪酸、消毒劑、鹼性物質或界面活性劑。 本發明中所用之佐劑之含量或量可變化且可藉由考慮例如所用PRRS病毒疫苗之性質及劑型來確定。佐劑可包含例如1至100重量%。本發明之基於PRRSV 94881之組合物藉由單獨或在各種其他成分存在下將佐劑組分與病毒疫苗組分混合在一起來產生。組合物可使病毒疫苗與佐劑作為一種調配物呈現，或者佐劑與疫苗呈現於可同時或依序投與之不同調配物中。 因此，本發明免疫原性組合物之佐劑組分可在投與生物體時與病毒疫苗分開投與。或者，本發明之佐劑可連同病毒疫苗一起以單一疫苗組合物形式投與。病毒疫苗可為任何病毒疫苗。更特定實施例涵蓋使用包含PRRSV 94881之PRRS病毒疫苗。此外，該種疫苗可與諸如Ingelvac® PRRS MLV及/或Porcilis®之其他疫苗組合。此僅為一種例示性PRRS病毒組合疫苗且其他此類疫苗組合可容易地製備。 本文所述之免疫原性組合物尤其有利於誘導產生對PRRS病毒之抗體反應。投與疫苗較佳減輕一或多種臨床症狀之嚴重程度，諸如與PRRSV感染有關之肺病變、厭食症、皮膚變色、昏睡、呼吸徵象、乾癟仔豬、咳嗽、腹瀉及其組合。 因此，相比於由單獨投與PRRS病毒疫苗獲得之結果，組合物尤其增強患病動物中之臨床結果。在特定實施例中，增強之臨床結果為與未接收免疫原性組合物與該佐劑組合之動物相比，肺病變百分比降低至少50%。在其他實施例中，增強之臨床結果為與未接收免疫原性組合物與該佐劑組合之動物相比，動物之病毒血症降低至少45%。 因此，在一個態樣中，本發明係關於一種改良疫苗，更特定言之改良PRRS病毒疫苗，其中改良包含將選自由MCP-1、睡眠嗜血桿菌部分、卡波莫及其組合組成之群之佐劑與病毒疫苗混合。本發明之疫苗組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑。 本發明之疫苗組合物可藉由調配技術中已知之任何方法調配成例如液體製劑、懸浮液、軟膏、散劑、洗劑、油包水乳液、水包油乳液、乳液、乳膏、泥罨劑、貼片及凝膠，且較佳用作藥劑。因此，根據本發明之另一態樣，提供一種包含以上疫苗組合物之醫藥組合物。本發明之疫苗組合物在經皮投與時可顯著誘導抗體產生。因此，在本發明之另一較佳實施例中，疫苗組合物可以經皮製劑形式提供。 此外，如上所述，本發明中之病毒及佐劑可以單一疫苗組合物形式一起或以佐劑製劑與疫苗之抗原性PRRS病毒組分分開且不同之形式投與生物體，其中佐劑以使生物體中回應於PRRS病毒疫苗所產生抗體之量與單獨投與PRRS病毒疫苗相比可顯著增加的方式起作用。 當佐劑及PRRS病毒疫苗投與生物體時，動物之臨床結果增強。佐劑之有效量及PRRS病毒疫苗之免疫有效量可由一般技術者考慮例如抗原性物質之類型及性質、生物體物種、年齡、體重、疾病嚴重程度、疾病類型、投藥時間及投藥方法且此外使用生物體中針對抗原性物質所產生抗體之量作為指數來容易地確定。 PRRS病毒疫苗、佐劑或其組合可藉由根據例如動物病狀及疾病性質而選擇之任何適合方法投與生物體。該等方法之實例包括腹膜內投與、經皮投與(例如皮下注射、肌肉內注射、皮內注射及貼片)、經鼻投與、經口投與、經黏膜投與(例如直腸投與、陰道投與及角膜投與)。其中肌肉內投與較佳。 PRRSV MLV之一例示性治療劑量為約兩毫升(2 mL)。熟習此項技術者將認識到，劑量可基於個別個體之品種、體型及其他身體因素以及PRRSV MLV之特定調配物及投藥途徑而變化。較佳地，PRRSV MLV以單一劑量投與；然而，其他劑量可為適用的。此外，熟習此項技術者經由本發明將認識到，劑量及給藥次數受個別豬之年齡及身體情況以及此行業所共同之其他考慮因素及投與PRRSV MLV之特定條件影響。 在某些其他實施例中，疫苗可為包含兩種或兩種以上PRRS病毒之多價疫苗，其中至少一種PRRS病毒為寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒94881病毒。其他PRRS病毒可為一或多種選自由以下組成之群之病毒：PRRSV株萊利斯塔病毒(萊利斯塔劑(CDI-NL-2.91))，或其他株，諸如寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387、CNCM寄存編號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下之株，或實際上可為美國型株，諸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC寄存編號VR-2332、ATCC寄存編號VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402。 基於PRRS病毒之疫苗可用以接種仔豬與大母豬。在本發明之一個態樣中，特定劑量方案係基於豬之年齡及選用於投與之抗原進行選擇。此將使任何年齡之豬接收最有效之劑量。在一較佳方法中，將治療量之PRRSV 94881 MLV投與約兩週±5日齡之豬或仔豬。所選量將視豬之年齡而變化。或者，不同治療量之該種MLV投與約3週齡以上之豬或仔豬，且此量亦隨接收該種投藥之豬長大或年齡變大而變化。因此，約四週齡、六週齡、八週齡、十週齡、十二週齡、十四週齡、十六週齡之豬、小母豬或大母豬均將接收不同量。待使用之治療劑量在此領域中將最佳化，且通常在臨床研究中確定，其中基於針對易感染豬中毒性異源性PRRSV攻毒的防護確定最小免疫劑量。較佳地，根據本文所述之方法產生之PRRSV MLV經由肌肉內投藥投與；然而，可使用此項技術中熟知且使用之其他投藥方法，諸如皮內、鼻內、視網膜內、經口、皮下及其類似方法。 熟習此項技術者將認識到疫苗接種方法可包含確定針對PRRSV對豬進行疫苗接種的適當時序及劑量。該等方法一般包含確定至少一個選自由豬之年齡、健康狀態、先天性免疫程度及主動免疫程度組成之群之變數及調整標準劑量濃度以適於此等變數的步驟。一般而言，先天性免疫程度及主動免疫程度將藉由參考由來自類似年齡及健康狀態之豬群的平均程度構成之標準來確定。在一尤其較佳方法中，所有變數均在確定最佳劑量濃度及投藥時間選擇之前加以考慮。 在較佳實施例中，本發明亦係關於編碼寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒94881病毒及寄存在ECACC寄存編號11012501下之親本毒性94881病毒之特定開放閱讀框架的經分離核酸。舉例而言，寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒94881病毒之完整核苷酸序列具有SEQ ID NO：1之序列，其分別編碼SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9之ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7蛋白質序列。寄存在ECACC寄存編號11012501下之親本毒性94881病毒之完整核苷酸序列具有SEQ ID NO：10之序列，其分別編碼SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7蛋白質序列。 PRRSV 94881疫苗可以任何習知方式投與且在一些較佳方法中投藥為肌肉內投藥。較佳地，所投與之PRRSV疫苗在單次劑量後如同Ingelvac®一樣，提供治療PRRSV感染或降低其嚴重程度或發病率的益處，然而，若選擇其他抗原或組合或多價疫苗，則應瞭解其可以在初始投藥後可包括一或多個增強劑量的其習知方式投與。熟習此項技術者將能夠基於所選PRRSV疫苗及抗原所投與之動物之年齡範圍確定適當給藥量。 在下文呈現之特定實例中，豬及大母豬用能夠在仔豬中可再現性產生呼吸疾病之新歐洲來源PRRSV株攻毒。歷史上，歐洲來源PRRSV株已不能在仔豬模型中再現呼吸疾病，且因此呼吸攻毒模型依賴於用非歐洲型株感染。因為高遺傳多樣性，所以在歐洲對基於歐洲型株之新疫苗存在需求。在其他實例中，動物用在小母豬/大母豬攻毒模型中引起生殖衰竭之病毒株攻毒。已發現基於寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒94881病毒或由此株或寄存在ECACC寄存編號11012501下之親本株製備之任何病毒的MLV疫苗之功效可使用多種攻毒模型展示，因為此株在其他PRRS病毒誘導之呼吸或生殖衰竭模型中亦有效。 實例 實例1：PRRSV呼吸攻毒模型之描述 如上所述，歷史上，歐洲來源PRRSV株無法在仔豬模型中再現呼吸疾病。因為高遺傳多樣性，所以在歐洲對基於歐洲型株之新疫苗存在需求，且利用毒性歐洲來源PRRSV株之優良可再現呼吸攻毒模型為進行研究所必需。在以下實例中，本發明者展示用低繼代歐洲型攻毒株(第4代)攻毒豬可靠地產生呼吸症狀。 在此研究中，三組12隻動物在分配時為三週齡且在攻毒時為約10週齡：第1組：對照組第2組：攻毒組(SD 35)第3組：用Porcilis®PRRSV(SD 0)接種，並接著攻毒(SD 35)。 該研究進行56天之時間，在攻毒後10天量測來自各組之6隻動物的屍檢；所有剩餘動物之屍檢均在攻毒後21天。每日研究參數包括：直腸溫度、呼吸及其他臨床徵象。其他研究參數包括：體重、死亡率、病毒血症、血清轉變、肺之病理學及組織學檢查。 在研究第-7天，豬群分配至各組。在研究第0天，第3組接種Porcilis®PRRSV。在研究第35天，用歐洲型攻毒株攻毒第2組及第3組。在第45天，對來自各組之6隻動物實施安樂死。剩餘動物在第56天實施安樂死。 圖1A展示每隻動物及每週呈平均評分形式之咳嗽量測結果。可見在單獨攻毒(第2組)與Porcilis組(第3組)中攻毒後咳嗽增加。圖1B展示自呼吸困難、咳嗽、鼻與眼睛排出物及行為獲得之總臨床評分。此等資料展示在攻毒及Porcilis組中攻毒後總臨床評分整體增加。在攻毒之前及之後監測動物之直腸溫度，且展示在攻毒及Porcilis組中攻毒後直腸溫度增加(SD>35，組1-2 p0.001；組1-3 p0.001)(圖2)。 平均日體重之量測(圖3)展示在攻毒後直至第一次及直至第二次屍檢，攻毒(SD35-44 p0.001及SD35-56 p0.01)及Porcilis接種組(SD35-44 p0.05及SD35-56 p0.05)中ADW顯著較低。 使用PCR(圖4)及ELISA分析(圖5)監測病毒血症。PCR展示在第1組中：所有來自對照組之動物均保持陰性。在第2組中：所有動物在攻毒後均為PRRSV陽性；在第3組中：所有動物在疫苗接種後均為PRRSV陽性。ELISA顯示：在第1組中：所有動物均保持陰性；在第2組中：所有動物在攻毒後均為PRRSV AB陽性；在第3組中：所有動物在疫苗接種後均為PRRSV AB陽性。 亦對肺進行宏觀檢查(圖6)，其中評估肺的棕褐色斑點區域及變硬區域：與對照組相比，在攻毒及Porcilis組中可觀察到明顯宏觀變化(組1-2 p0.001；組1-3 p0.05)。在組織病理學檢查中，資料亦展示疫苗接種功效(圖7A至7C)。與對照組相比，平均肺病變評分在攻毒及Porcilis組中顯著較高(組1-2 p0.001；組1-3 p0.001)。感染後10天微觀病變較強。 總之，在攻毒對照及Porcilis接種組中攻毒後總臨床評分及直腸溫度增加。與陰性對照組相比，攻毒對照及Porcilis組中體重顯著(p<0.05)較低。所有來自Porcilis組之動物在疫苗接種後PRRS病毒及抗體均呈陽性。所有來自攻毒對照之動物在攻毒後PRRS病毒及抗體均呈陽性。肺之宏觀及組織學分析展示與陰性對照組相比，攻毒對照及Porcilis組中宏觀及微觀肺病變嚴重。 因此，此研究證實，與陰性對照組相比，所用歐洲型攻毒株誘發明顯(p<0.05)疾病：發熱、咳嗽、體重減輕及嚴重的宏觀及微觀肺病變。 此外，歐洲型攻毒株已成功證明，在豬攻毒模型中產生一致且可再現之PRRSV特異性呼吸疾病，因此適用作未來功效研究中之攻毒病毒。在此研究之參數內，Porcilis PRRS顯示缺乏針對歐洲型攻毒株之功效。 實例2：評估易感染2週齡仔豬中用異源性歐洲型PRRS分離株攻毒後減毒PRRS病毒94881之最小免疫劑量。 進行疫苗接種-攻毒研究以評估在三種不同力價水準下向約14日齡之豬生殖與呼吸症候群(PRRS)易感染仔豬投與的豬生殖與呼吸症候群疫苗歐洲來源分離株94881修飾活病毒(PRRS 94881 MLV)之最小免疫劑量(MID)，以提供在用異源性歐洲型PRRS分離株攻毒後肺病變之相關減少。各疫苗接種組(第1-3組)以及攻毒對照組(第4組)中包括15隻仔豬。陰性對照組(第5組)中包括10隻仔豬。 監測疫苗組及攻毒對照組之多個參數，包括：攻毒後病毒血症、疫苗接種後臨床評定、PRRS血清學、疫苗接種後病毒血症、攻毒後臨床觀察、平均日增重(ADWG)、直腸溫度及肺中之PRRS病毒偵測。未受攻毒之陰性對照組(第5組)亦包括在此研究中以藉由證明在整個研究持續期間未破壞生物安全性來達成研究驗證之目的。 攻毒對照組及陰性對照組在直至攻毒之日(D28)均為PRRS陰性，且陰性對照組在研究剩餘時間(D38)保持PRRS陰性，因此驗證該研究。 攻毒在疫苗接種後4週進行。此時，僅低力價疫苗組中2隻動物、中等力價疫苗組中1隻動物及高力價疫苗組中3隻動物之血清呈PRRS qPCR陽性。 攻毒對照組顯示攻毒後PRRS所特有之顯著肺病變。攻毒後，低、中等及高力價疫苗組分別具有0.13%、0.55%及0.40%之中值總肺病變評分，而攻毒對照組具有33.40%之中值總肺病變評分。三個疫苗力價組之中值總肺病變評分顯著低於攻毒對照組(p<0.0001)。疫苗力價組之間總肺病變評分無統計差異(p0.1484)。陰性對照組具有0.00%之中值總肺病變評分。 在攻毒後時期之研究第31、35及38天，三個疫苗力價組的病毒血症顯著少於攻毒對照組(p 0.0093)。除D35，高力價疫苗組顯示病毒血症顯著低於中等力價疫苗組(p=0.0442)之外，攻毒後病毒血症在疫苗力價組之間無統計差異。陰性對照仔豬在D31、D35及D38為病毒血症陰性。 臨床上，在攻毒後時期期間，第29天-第38天，三個疫苗力價組中咳嗽嚴重程度(p0.0082)及頻率(p0.0268)不如攻毒對照組中嚴重。攻毒後，攻毒對照組中之發熱比三個疫苗力價組顯著。三個疫苗力價組之ADWG顯著高於攻毒對照組(p0.0027)。 基於接收毒性異源性歐洲來源PRRS攻毒後與攻毒對照相比，所有三個力價水準之總體肺病變的相關降低，如此研究中所確定之PRRS 94881 MLV之MID與1×102.77 TCID50/mL之低力價疫苗水準相關聯。當檢查二次參數時，所有三個疫苗力價水準均與功效相關聯且力價組之間未顯示明顯差別。 研究之一般設計： 此為在70隻在第0天(D0)為14-16日齡之斷乳PRRS易感染仔豬中進行的盲法隨機化設計研究。處理組之描述展示於下表2.1中： 83隻仔豬符合研究入選準則，其中首批70隻在D-3藉由生物統計學家隨機分配至五組之一。仔豬以每組15隻分配至第1-4組，且10隻分配至第5組。所有83隻仔豬均呈PRRS血清陰性。 自D-1至D26觀察仔豬之疫苗接種後臨床評定，且觀察結果記錄在臨床評定記錄表格上。 血清學：在D0、D7、D14、D21、D28自仔豬收集靜脈全血。記錄樣品收集。血液樣品短暫離心且自各管收穫血清，分離且轉移至適當標記之管。一組血清樣品保持在2-8℃下且另一組血清樣品保持在-70±10℃下。測試在第0、7、14、21、28及38天收集且保持在2-8℃下之該組血清樣品的PRRS抗體。結果報導為陰性(ELISA S/P比率<0.4)或陽性(ELISA S/P比率0.4)。 PRRS病毒血症：藉由qPCR(附錄1，附件7)測試在第0、7、14、21、28、31、35及38天收集且保持在-70±10℃下之該組血清樣品的PRRSv RNA。結果報導為n.d.(未偵測)、陽性(偵測到歐洲型PRRSv，但不可定量，GE/mL(基因組當量)=<3.3 log)或報導值(log GE/mL)。出於統計目的，「未偵測」分配以0 log GE/mL之值，且「陽性」值分配以3.0 log GE/mL之值。 平均日增重(ADWG)：每隻豬在校準天平上稱重且記錄個別體重。測定D0至D28及D28至D38之平均日增重。 攻毒後臨床觀察：由研究調查者或被指定者觀察仔豬D27至D38之疾病臨床徵象且記錄在臨床觀察記錄表格上。觀察結果包括基於臨床觀察評分系統之呼吸、行為及咳嗽，如下表2.2中所示。 每隻仔豬之每日總臨床觀察評分藉由將其每日呼吸、行為及咳嗽評分求和來確定。 自D27至D38收集直腸溫度。 總肺病變評分：對在D38之前死亡之所有仔豬以及在D38實施安樂死之剩餘仔豬進行屍檢。檢查每組肺的任何總體肺病理學及確定每一肺葉之病理學%。若注意到其他器官之病理學，則亦加以描述及記錄。 PRRSV之肺qPCR：對於各組肺，保留來自左及右頂葉、左及右心葉、左及右隔葉及中葉之兩個樣品。對於一組肺樣品，所有來自左側之三個樣品組合在一個容器中；而所有三個來自右側之樣品及中間肺葉樣品組合在另一容器中。每一容器填充足夠量之10%甲醛溶液。對於其他組之肺樣品，所有來自左側之三個肺樣品組合在一個Whirlpak®中；而所有三個來自右側之樣品及中間肺葉樣品組合在另一Whirlpak®中。 冷凍肺組織樣品保持在-70±10℃下，直至進一步分析。對於每隻仔豬，將所有左肺樣品均質化且以單一組合樣品形式測試；且將所有右肺組織及中間肺葉樣品均質化且以單一組合樣品形式測試。對於左及右肺樣品，結果報導為n.d.(未偵測)、陽性(偵測到歐洲型PRRSv，但不可定量，GE/mL(基因組當量)=<3.3 log)或測試值(log GE/mL)。為達成分析每隻仔豬之目的，記錄下左及右肺樣品qPCR結果之平均值。出於統計目的，「未偵測」分配以0 log GE/mL之值，且「陽性」值分配以3.0 log GE/mL之值。 結果 攻毒後總肺病變評分：總肺病變評分之組最小值、最大值、中值、95%信賴區間、Q範圍及平均值的概述顯示，低、中等及高力價疫苗組分別具有0.13%、0.55%及0.40%之中值總肺病變評分；而攻毒對照組具有33.40%之中值總肺病變評分。三個疫苗力價組之中值總肺病變評分顯著低於攻毒對照組(p<0.0001)。疫苗力價組之間總肺病變評分無統計差異(p0.1484)。陰性對照組具有0.00%之中值總肺病變評分。 對於動物之一(高力價疫苗組)，注意到具有大量纖維素膿性胸膜炎之組織學輕度化膿性間質性肺炎。除了散佈之嗜中性白血球，氣管及肺泡相對不顯著。肺組織之豬肺炎黴漿菌、PCV2、PRRSv及SIV抗原呈IHC陰性。肺病變與一般與細菌劑有關之漿膜炎一致(附錄12；登記號2009030254)。分離來自肺組織之若干純細菌培養物且鑑別為支氣管敗血性博德氏桿菌及凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negative Staphylococcus)。雖然自肺組織分離出兩種類型的細菌，但此仔豬未自第3組總肺病變評分分析中移除。 10隻陰性對照仔豬中2隻顯示極微小的肺病變(第1767號，0.55%；第1789號，0.61%)。認為此等病變無關緊要且並不指示PRRS。10隻陰性對照仔豬中2隻顯示極微小的肺病變(第1767號，0.55%；第1789號，0.61%)。認為此等病變無關緊要且並不指示PRRS。 攻毒後PRRS病毒血症：將攻毒後PRRS病毒血症個別結果(D31-D38)製成表格，且發現三個疫苗力價組及攻毒對照組中所有仔豬在攻毒後均具有病毒血症。在攻毒後所有三個時間點，三個疫苗力價組之病毒血症顯著少於攻毒對照組(p0.0093)。除D35，高力價疫苗組顯示平均病毒血症低於中等力價疫苗組(p=0.0442)之外，攻毒後病毒血症在疫苗力價組之間無統計差異。陰性對照仔豬在D31、D35及D38為病毒血症陰性。曲線下面積(AUC)表示病毒負荷之量及持續時間且為檢查病毒血症之優良評定工具。亦在三個疫苗力價組與攻毒對照組之間偵測到D28至D38(p0.0162)與D31至D38(p<0.0001)之AUC的顯著差異。在疫苗力價組之間未偵測到兩個時間間隔之AUC的差異(p0.3669)。 亦概述病毒血症陽性仔豬D31至D28之群頻率且展示於表2.3中。因為所有疫苗及攻毒對照仔豬在攻毒後均呈病毒血症陽性，所以在每一時間點各組之病毒血症陽性仔豬頻率為100%。因此，對攻毒後病毒血症頻率不進行分析。 肺qPCR結果：攻毒後個別肺病毒分離結果的組間差異如qPCR陽性肺樣品測試結果之頻率(p值)所概述。所有三個疫苗力價組及攻毒對照組中來自仔豬之肺組織在攻毒後對PRRSv均呈qPCR陽性。疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到顯著差異(p=1.0000)。因為所有疫苗力價仔豬對PRRSv均呈qPCR陽性，所以在疫苗力價組之間不進行測試。 雖然在疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到qPCR陽性肺組織之頻率的差異，但肺組織中病毒負荷之差異明顯。實際上，低、中等及高力價疫苗組分別具有6.88、6.80及6.81 log10 GE/mL之中值肺qPCR值；而攻毒對照組具有8.13 log10 GE/mL之中值肺qPCR值。疫苗力價組與攻毒對照組之間的差異顯著(p0.0001)。反之，在疫苗力價組之間未偵測到中值肺qPCR值的差異(p0.7379)。 攻毒後臨床觀察評分：如所有五組之中值最大臨床評分為0(評分0代表正常呼吸或正常行為)所證明，攻毒後異常呼吸及行為不嚴重。此外，在疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到異常呼吸與行為兩者之顯著差異(p0.0996)。 在所有三個疫苗力價組及攻毒對照組中注意到咳嗽，但在攻毒對照組中較嚴重。對於三個疫苗力價組，每組具有代表輕柔或間歇咳嗽之最大咳嗽評分1及中值最大咳嗽評分0。反之，攻毒對照組具有代表劇烈或嚴重反覆咳嗽之最大咳嗽評分2及中值最大咳嗽評分1。三個疫苗力價組之咳嗽嚴重程度顯著輕於攻毒對照組(p0.0082)。在陰性對照組中未注意到咳嗽。 所有三個疫苗力價組具有最大總評分1及中值最大評分0。反之，攻毒對照組具有最大總評分4及中值最大評分1。三個疫苗組之最大總臨床評分顯著低於攻毒對照組(p0.0047)。此外，陰性對照組具有最大總臨床評分0及中值最大總臨床評分0。 所有組中D29至D38至少一天之異常呼吸或行為頻率均較低。實際上，D29至D38，低及中等疫苗力價組中未注意到異常呼吸。高力價疫苗組中15隻仔豬有1隻(7%)具有異常呼吸且攻毒對照組中14隻仔豬有3隻(21%)具有異常呼吸。在任何疫苗力價組中均未注意到異常行為；而14隻攻毒對照仔豬中2隻(14%)顯示攻毒後至少一天有異常行為。在疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到攻毒後至少一天異常呼吸或行為之頻率的顯著差異(p0.0996)。陰性對照組中未注意到異常呼吸或行為。 攻毒對照組中之咳嗽頻率遠高於三個疫苗力價組。實際上，低、中等及高力價疫苗組之攻毒後至少一天咳嗽之頻率分別為14%、13%及27%。反之，攻毒對照組之攻毒後至少一天咳嗽之頻率為71%。三個疫苗力價組之咳嗽頻率顯著低於攻毒對照組(p0.0268)。 如總臨床評分>0所表示，攻毒對照組中攻毒後任何臨床徵象之頻率高於三個疫苗力價組。類似於咳嗽頻率，低、中等及高力價疫苗組之攻毒後至少一天之任何臨床徵象頻率分別為14%、13%及33%；而攻毒對照組中79%之仔豬在攻毒後具有至少一個臨床徵象。三個疫苗力價組在攻毒後之任何臨床徵象頻率顯著低於攻毒對照組(p0.0253)。在此同一時期內，在陰性對照組中未注意到臨床徵象。 所有組中D29至D38之異常呼吸或行為的平均評分均較低。實際上，低及中等疫苗力價組之平均呼吸評分為0.00(正常)，高力價疫苗之平均呼吸評分為0.01，且攻毒對照組之平均呼吸評分為0.03。所有三個疫苗力價組之平均行為評分為0.00；而攻毒對照組之平均行為評分為0.01。此外，在疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到平均呼吸及行為評分之顯著差異(p0.0996)。陰性對照組之呼吸及行為平均評分為0.00。 攻毒對照組之平均咳嗽評分高於三個疫苗力價組。實際上，低、中等及高力價疫苗組之平均咳嗽評分分別為0.01、0.01及0.04。反之，攻毒對照組之平均咳嗽評分為0.28。三個疫苗力價組之平均咳嗽評分顯著低於攻毒對照組(p0.0077)。 攻毒對照組中之平均總評分高於三個疫苗力價組。類似於平均咳嗽評分，低、中等及高力價疫苗組之攻毒後平均總評分分別為0.01、0.01及0.04；而攻毒對照組之平均總評分為0.32。三個疫苗力價組之平均總評分顯著低於攻毒對照組(p0.0025)。 攻毒後直腸溫度：D29至D38之間低、中等及高力價疫苗組之最大組平均直腸溫度分別為40.20℃(D33)、40.33℃(D35)及40.20℃(D37)。D29與D38之間攻毒對照組及陰性對照組之最大組平均直腸溫度分別為40.51℃(D33)及39.95℃(D33)。 在D29(39.47℃對39.90℃)、D31(39.85℃對40.20℃)、D35(39.80℃對40.22℃)及D38(39.86℃對40.32℃)，低力價疫苗組之直腸溫度顯著低於攻毒對照組(p0.0317)；而在D30，低力價疫苗之直腸溫度顯著高於攻毒對照組(40.08℃對39.58℃；p=0.0003)。在D32-D34及D36-D37，在低力價疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到顯著差異(p0.0545)。 在D31(39.62℃對40.20℃)、D33(40.15℃對40.51℃)及D38(39.58℃對40.32℃)，中等力價疫苗組之直腸溫度顯著低於攻毒對照組(p0.0227)。在D29-D30、D32及D34-D37，在中等力價疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到顯著差異(p0.0580)。 在D33(40.12℃對40.51℃)、D35(39.79℃對40.22℃)及D38(39.55℃對40.32℃)，高力價疫苗組之直腸溫度顯著低於攻毒對照組(p0.0147)；而在D32，高力價疫苗組之直腸溫度顯著高於攻毒對照組(40.31℃對39.90℃；p=0.0063)。在D29-D31、D34及D36-D37，在高力價疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到顯著差異(p0.0708)。 攻毒後三個疫苗力價組中之發熱頻率與攻毒對照組相比較低。發熱頻率整體較低且在疫苗力價組之間類似。 平均日增重(ADWG)：低、中等及高力價疫苗組之D0至D28最小平方平均ADWG分別為0.4、0.3及0.4公斤/天。攻毒對照組在此同一時期內之最小平方平均ADWG為0.3公斤/天。D0至D28，低力價疫苗組之最小平方平均ADWG顯著高於攻毒對照組(p=0.0292)；而在疫苗力價組與攻毒對照組之間(p0.1262)或在疫苗力價組之間(p0.1293)未偵測到最小平方平均ADWG之顯著差異。在此同一時期內，陰性對照組之平均ADWG為0.5公斤/天。 低、中等及高力價疫苗組之D28至D38最小平方平均ADWG分別為0.5、0.5及0.4公斤/天。攻毒對照組在此同一時期內之最小平方平均ADWG為0.3公斤/天。攻毒後三個疫苗力價組增重顯著超過攻毒對照組(p0.0027)。在此同一時期內，陰性對照組之平均ADWG為0.6公斤/天。 疫苗接種後臨床評定：在低力價疫苗組中，注意到一隻仔豬(1735)自D0至D10變瘦。此外，注意到一隻仔豬自D6開始變瘦，持續16天，顯示咳嗽2天及抑鬱9天，且出於健康欠佳之動物福利原因，在D21實施安樂死。仔豬1727之總肺病變評分為10.8%。因為此值在攻毒前測定，所以其未包括在攻毒後總肺病變分析內。此外，注意到肺之腹側前方區域中紅色/紫色變硬區域，肝臟為蒼白色且腎之腎盂中具有多個紅色/紫色區域。病理學家注意到肝臟中中央小葉之脂肪浸潤，此一般在負能量平衡及隨之脂肪分解之情況下可看到。肝、腎及肺切片中未觀察到其他病變。藉由PCR，肺組織呈歐洲型PRRS陽性。對於常規細菌培養，未偵測到生長。 在中等力價疫苗組中，在處理之前D0，自研究排除1隻仔豬，因為其健康欠佳，且用另一仔豬替換。2隻仔豬分別顯示咳嗽1天及三天，始於D12。注意到4隻仔豬在D2、D3或D2與D3變瘦。 在高力價疫苗組中，1隻仔豬(1728)自D7至D26顯示一隻腿跛行或一隻腿跛行及腫脹。自疫苗接種後18天開始，注意到1隻仔豬變瘦，持續6天，且顯示咳嗽1天且被毛粗糙4天。注意到另一仔豬在D2變瘦。2隻仔豬分別顯示咳嗽2天及1天，始於D9。1隻仔豬顯示腹瀉1天(D14)。 在攻毒對照組中，6隻仔豬顯示週期性咳嗽，累計1至6天，以第一隻仔豬在D7開始且以三隻仔豬在D21結束。注意到2隻仔豬變瘦，分別持續2天及11天，此等仔豬中之一者始於D1。此兩隻仔豬中之第二隻仔豬亦顯示抑鬱且被毛粗糙4天，腿虛弱1天，且發現在D15死亡。在此仔豬屍檢時，注意到無肺病變(肺病變評分為0%)，胃中無飼料，且無腹部脂肪，並診斷饑餓為死亡原因。因為此肺病變評分在攻毒前測定，所以其未包括在攻毒後肺病變分析內。 概述D1至D26至少一天之任何異常臨床評定的組測試結果(p值)。在疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到顯著差異(p0.0502)；在疫苗力價組之間亦未偵測到顯著差異(p0.3898)。陰性對照組中無仔豬顯示D1至D26之異常臨床評定。 PRRS血清學：概述個別仔豬PRRS ELISA血清學結果。陰性對照組中仔豬在整個研究期間保持PRRS血清陰性。在3個疫苗力價組中至疫苗接種後14天可觀察到血清轉變；而攻毒對照組保持PRRS血清陰性，直至攻毒後。攻毒後10天(D38)，低及高力價疫苗組及攻毒對照組中之所有仔豬均為PRRS血清陽性；而中等力價疫苗組中15隻仔豬中之14隻為PRRS血清陽性。 針對組間差異，測定PRRS ELISA陽性血清學測試結果(p值)。在D14、D21及D28，三個疫苗力價組之PRRS ELISA陽性仔豬頻率顯著高於攻毒對照組(p<0.0001)。在D38，在三個疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到顯著差異(p=1.0000或未進行測試)，在三個疫苗力價組之間在任何時間點亦未偵測到顯著差異(p=1.0000或未進行測試)。 疫苗接種後PRRS病毒血症：測定疫苗接種後之個別PRRS病毒血癥結果。出於統計目的，「未偵測」結果分配以0 log GE/mL之值，且「陽性」值分配以3.0 log GE/mL之值。所有組在D0均為PRRS病毒血症陰性。評估組病毒血症(qPCR)-疫苗接種後D7至D28力價(log GE/mL)資料。三個疫苗力價組中之仔豬在D7達到峰值平均病毒血症，接著在攻毒(SD28)之前所有三個組之力價水準緩慢下降。反之，攻毒對照組及陰性對照組在研究之攻毒前階段期間保持病毒血症陰性。根據D7、D14、D21及D28 qPCR結果之組測試結果(p值)，可見D7-D28，所有三個疫苗力價組之中值qPCR值顯著高於攻毒對照組(p0.0159)。中等疫苗力價組之qPCR中值顯著高於低力價疫苗組(p=0.0193)；另外，攻毒前在疫苗組之間未偵測到qPCR中值之差異(p0.0594)。 疫苗接種後4週，在三個疫苗力價組中病毒血症頻率較低。 以下結論可基於此等研究結果得出：˙ 在研究期間生物安全性未受到任何破壞及證實仔豬易感染PRRS，證實該研究之驗證及其說明適用性；˙ 實質性PRRS臨床疾病在攻毒對照組中明顯，因此驗證此攻毒模型為足以評估PRRS疫苗功效及更特定言之PRRS 94881 MLV之MID的實驗室工具；˙ PRRS 94881 MLV之所有三個劑量均引起肺病變顯著減少，以及攻毒後病毒血症、肺組織中病毒負荷、咳嗽、總臨床觀察評分、發熱及ADWG顯著減少；˙ 基於接收毒性異源性歐洲來源PRRS攻毒後與攻毒對照相比，所有三個力價水準之總體肺病變的相關降低，如此研究中所確定之PRRS 94881 MLV之MID與1×102.77 TCID50/mL之低力價疫苗水準相關聯。 結果之進一步描述 每天進行臨床觀察。使用PRRSV歐洲型特異性引子，對來自血液、口腔、糞便及鼻拭子以及肺灌洗液之樣品進行定量RT-PCR。 根據此等研究，資料顯示除了幾隻豬跛行外，仔豬均顯示正常健康。事後剖析，屍檢時無異常，除了1-2隻動物顯示腹股溝淋巴結輕微增大以外。重要的是，可見在疫苗接種組中未觀察到肺病變。 圖8顯示相較於用含有寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒PRRS病毒株之組合物進行疫苗接種的組，警哨組中病毒血症動物之百分比。此圖顯示該疫苗株自疫苗接種動物傳播至警哨。在如定量RT-PCR所偵測之PRRS病毒血症峰值(SD21)時，警哨感染豬(平均病毒負荷為3.347 GE/ml)中之病毒負荷比疫苗接種動物(平均病毒負荷為4.014 GE/ml)低78.47%。在PRRS未處理大母豬與其疫苗接種後代混雜之房間內，8隻大母豬中僅3隻大母豬藉由RT-PCR測試為血液中呈PRRSV陽性，因此證實PRRS MLV疫苗暴露於未處理成年動物有限且低效。此研究中，疫苗病毒94881 MLV主要在糞便中排出。實際上，在糞便中，可在疫苗接種後1天至21天偵測到病毒。疫苗接種後5天，幾乎30%之疫苗接種動物在糞便中排出病毒。鼻之分泌物中未偵測到PRRS病毒，且僅少數動物中PRRS病毒經由口腔分泌物偵測(疫苗接種後5天，56隻取樣動物中2隻)。 實例3：使用Porcilis® PRRS作為實例用於測試疫苗功效之例示性材料與方法 此研究中使用選定數目、例如14隻來自證實為PRRSV陰性畜群(經病毒學及血清學測試)之健康懷孕大母豬。大母豬面臨第一次或第二次分娩，且在懷孕第94天時在疫苗接種/攻毒感染時證實其懷孕。大母豬分成3個處理組。在懷孕第94天，經由肌肉內投與，第一組用2 ml含有至少104.0TCID50之PorcilisTM PRRS的商業劑量處理。攻毒對照組(第2組)經鼻內接收含104.72 TCID50病原性歐洲型野外分離株(第4代)之2 ml細胞培養基的劑量。在授精前7天，第3組經肌肉內用2 ml含有107.6TCID50 PRRS MLV之劑量接種，該PRRS MLV含有於2011年1月25日寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒PRRS病毒株，且在懷孕第94天，用歐洲野外分離株(第4代)攻毒(鼻內含104.72 TCID50之2 ml細胞培養基)。 監測來自第1組之動物，直至產仔後第5天。監測來自第2組及第3組之動物，直至產仔後第28天。 動物期：在疫苗接種前1週，使所有大母豬均適應動物實驗室。研究者每日觀察大母豬及仔豬之整體健康狀態。死亡或實施安樂死之每隻動物均經受死後檢查及後續實驗室分析。 藉由超音波檢查證實懷孕。在研究第0、7、14天及產仔時自大母豬獲得血清以進行PCR及ELISA研究。與流產相關之任何材料均經受實驗室研究。 對所有死產仔豬進行常規宏觀病理學研究。自死產仔豬及其母親收集來自所有肺葉之肺組織樣品。用於PCR測試之樣品儲存在-70℃下。在出生之日收集2 ml來自各仔豬之哺乳前血液。製備血清且等分試樣儲存在-70℃下。血清用於測試病毒血症以評估經胎盤感染。第1組之所有存活至第5天之仔豬在5日齡時實施安樂死。 臨床及生殖效能參數：以下準則為可研究之例示性標準(優先順序)：分別為每窩活產仔豬之數目、每窩死產仔豬之數目、每窩乾癟胎豬之數目及存活至5日齡或28日齡之仔豬之數目。使用哺乳前血清測定生來患有病毒血症之仔豬之數目。研究來自大母豬及/或仔豬之PCR陽性血液及組織樣品之頻率以評估感染之流行病學及過程。 野外樣品：此研究中所研究之野外樣品取自常規PRRSV診斷法且由來自不同歐洲國家之血液、血清及各種器官材料(主要為肺及淋巴結)組成。樣品儲存在-20℃下最長3天，接著製備RNA，隨後殘餘材料轉移至-70℃供長期儲存。RNA及RT-PCR產物儲存在-20℃下。 細胞培養：MA104細胞(純系CL2621)生長於補充有10% FCS及抗生素之MEM(Dulbecco,Germany)中。 使用Wensvoort等人(Wensvoort,G.等人，Vet.Quat.1991,13：121-130)描述且有如下修改之方法收穫豬肺泡巨噬細胞：各肺葉輸注50-100 ml PBS，且隨後按摩3至5分鐘。接著自肺葉中收回流體且通過紗網過濾器(gaze filter)。重複此程序，直至灌洗液清澈。彙集灌洗液在室溫下在500 g下離心15分鐘。集結粒在PBS中洗滌且含1×107個細胞之50% RPMI 1640(Biochrom)、40% FCS及10% DMSO之等分試樣冷凍在-196℃下。為進一步使用，PAM在補充有10% FCS及抗生素之RPMI 1640培養基中培養。 在細胞培養物中製備器官材料供病毒分離：約0.5 cm3組織材料轉移至含有1個鋼製均質化球之管中之1.8 ml無菌PBS中。管攪動10分鐘，直至器官材料均質化。細胞碎片藉由在450 g及室溫下離心2分鐘來集結。使上清液通過0.45 μm孔無菌過濾器且儲存在-70℃下。使用24孔微量滴定盤，使用30 μl之等分試樣接種一個半匯合細胞培養物單層。 RNA分離：根據製造商之建議，用RNeasy Mini套組自器官材料萃取RNA且使用QTAamp病毒RNA Mini套組(均為Qiagen)自血清、血漿、細胞培養物上清液及疫苗溶液萃取RNA，各製備分別使用約100 mg器官材料及140 μl流體材料。如製造商所建議，RNA最終在65 μl緩衝液中溶離。 病毒之噬斑純化：之前在10 cm細胞培養皿中接種48小時之Ma104細胞匯合單層用自10-1按十倍稀釋至10-4之各別病毒感染。細胞與病毒稀釋液一起培育1小時，接著移除且細胞用30 ml含有5%甲基纖維素之Ma104培養基(Sigma)覆蓋。5至7天後挑選噬斑且轉移至24孔盤中之Ma104單層中。來自此等盤之病毒在約50% CPE時收穫且經受進一步分析。 免疫螢光分析：使用冰冷丙酮：甲醇(1：1)在-20℃下將細胞固定15分鐘，接著風乾。在PBS中再水合後，細胞與在PBS中按1：1000稀釋之PRRSV特異性單株抗體SDOW17(Rural Technologies Inc.,USA)一起培育1小時。用PBS洗滌3次後，細胞再與山羊抗小鼠FITC結合之二次抗體(Dianova,Hamburg,Germany)(PBS中1：150)一起培育1小時。用PBS最後洗滌3次後，細胞用甘油：PBS溶液(1：1)覆蓋且經受免疫螢光顯微法。 診斷nRT-PCR：可進行診斷性RT-nPCR以檢查樣品中PRRSV-歐洲型病毒之存在。 例示性診斷性RT-nPCR可用Titan One Tube套組(Roche Molecular Biochemicals)如下進行：[5 μl總RNA製劑、1*RT-PCR緩衝液、0.4 mM dNTP、20 pmol引子PLS及PLR、5 mM二硫蘇糖醇、1 mM MgCl2、2.5-5 U RNasin(Promega Ltd)、1-2.5 U酶混合物，用經DEPC處理之蒸餾水調整至25 μl最終體積]。所用常規循環條件可為：45℃ 1小時，94℃ 2分鐘，及30次94℃ 30秒、58℃ 45秒及68℃ 45秒循環，最終為68℃下5分鐘之延長步驟。巢式PCR反應用Qiagen Taq(Qiagen AG)如下進行：[1 μl RT-PCR產物、1*PCR緩衝液、10 μl Q-溶液、3.5 mM MgCl2、0.3 mM dNTP、各20 pmol EU-7-n-s及EU-7-n-as引子、2.5 U Taq聚合酶，用蒸餾水調整至50 μl最終體積]。循環條件如下：7次94℃ 1分鐘、58℃ 1分鐘及72℃ 1分鐘循環，接著30次94℃ 1分鐘及70℃ 1.5分鐘循環(無黏接步驟)，最終為70℃下5分鐘之延長步驟。 核苷酸定序：可對巢式PCR產物進行核苷酸定序，該等產物用含有M13標籤之引子，直接自PCR反應或自藉由瓊脂糖凝膠切除且經JETsorb凝膠萃取套組(Genomed)純化之PCR產物產生。定序使用自動定序儀LI-COR DNA Analyzer GENE READIR 4200®(LI-COR Inc.,Lincoln,Nebr.,USA)進行。核苷酸及所推斷出之胺基酸序列可用AlignIR® 1.1版(LI-COR Inc.,Lincoln,Nebr.,USA)及DNASIS.RTM.2.6套裝軟體(Hitachi Software Genetic Systems Inc.,San Francisco,USA)分析。 實例4：測定全長基因組序列PRRSV 94881 本實例展示減毒94881株及其親本株94881第5代之全長基因組核苷酸序列的測定。此等序列未顯示任何指示同源性病毒內含物存在之不明核苷酸位置。比較94881種原病毒與歐洲參考病毒株萊利斯塔病毒(LV)揭示，8種不同病毒基因中之核苷酸同源性在85.40%至95.09%之範圍內，且兩種病毒株之間的胺基酸一致性在86.39%至97.27%之範圍內。相比於LV，可鑑別出94881 MSV之ORF 1a中有兩處缺失。94881種原病毒與其親本株第5代之間的比較展示兩者之間有26個核苷酸交換，導致總數14個胺基酸交換。 對於94881種原病毒之全長基因組序列測定，進行總數1個逆轉錄、17個外部PCR及58個內部PCR，產生40個PCR產物，其用於定序。在94881第5代之情況下，亦進行1個逆轉錄、17個外部PCR及67個內部PCR，產生40個PCR產物，亦用於定序。 重疊序列比對分析產生各自包含完整開放閱讀框架(ORF)1a至7之兩種病毒分離株之14843個核苷酸的全長序列。此外，可分別測定5'-非轉譯區(5'NTR)之177個核苷酸及3'-非轉譯區(3'NTR)之43個核苷酸。與歐洲PRRSV參考病毒分離株萊利斯塔(LV)(GenBank寄存編號M96262)相比，無法確定5'NTR之44個核苷酸及3'NTR之83個核苷酸，因為彼等區域用於引子黏接區域。 兩種病毒株之定序反應產生清晰核苷酸序列，無任何擺動或有關混合序列之任何其他指示。轉譯成胺基酸後，可獲得無任何可疑胺基酸之清晰胺基酸序列，供94881 MSV與LV及與親本株94881第5代之序列比較。在94881 MSV與萊利斯塔病毒之間對核苷酸序列進行比對及比較，且展示在核苷酸及胺基酸層面上存在實質性差異。亦在94881 MSV與其親本株第5代之間進行比對。 與LV之序列比較得出8種不同病毒基因中之核苷酸同源性為85.40%至95.09%，且兩種病毒株之間的胺基酸一致性為86.39%至97.27%。相比於LV，可鑑別出94881 MSV之ORF 1a中有兩處缺失。138個核苷酸之一處缺失位於LV之位置2154至2292，且導致缺失46個胺基酸。在位置2686至2688，缺失另一三重體，導致缺失胺基酸苯丙胺酸。LV與兩種94881株之間的所有核苷酸同源性及胺基酸一致性之所有排列均展示於表4.1中。 性及一致性計算，缺失評定為偏差。LV之相應病毒基因之長度為7191個核苷酸，且相應聚合蛋白質之長度為2396個胺基酸，基因同源性及胺基酸一致性之計算分別指7191個核苷酸及2396個胺基酸之數目。***=萊利斯塔病毒與94881 MSV之間僅比較44個核苷酸。位於下游之剩餘83個核苷酸尚未確定。 94881種原病毒及94881親本株第5代之全長核苷酸序列的序列比較揭示兩者之間有總數26個核苷酸交換。核苷酸交換分佈如下：15個在ORF 1a中，4個在ORF 1b中，2個在ORF 2中，ORF 3中無，1個在ORF 4中，3個在ORF 5中，1個在ORF 6中且ORF 7中無。此等核苷酸交換產生總數14個胺基酸交換，其分佈如下：8個在聚合蛋白質1a中，1個在聚合蛋白質1b中，1個在醣蛋白2中，醣蛋白3中無，1個在醣蛋白4中，2個在醣蛋白5中及1個在基質蛋白中。兩種病毒株均顯示與萊利斯塔病毒相比，ORF 1a中有相同缺失。所有核苷酸交換及所得胺基酸交換(包括在病毒基因及相應蛋白質中之位置)之排列詳細展示於表4.2中。 實例5-寄存病毒及MSV之培養 如上所述，親本(低代數)94881寄存於歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)寄存編號ECACC 11012501下，94881種原病毒(MSV)寄存於歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)寄存編號ECACC 11012502下。本實例中提供親本病毒及MSV之生長及培養條件。 親本94881：其為PRRSV 1型基因型病毒，因此其為歐洲基因型PRRSV。該病毒具有豬宿主。寄存在11012501下之親本病毒以5.81 Log10 TCID50/mL之力價寄存。病毒繁殖之宿主細胞為MA 104細胞。此等細胞在具有3.7 g/L碳酸氫鈉且含有6%經照射胎牛血清之最低必需培養基(MEM)中於37±1℃下培養。細胞塗鋪於T-燒瓶(75 cm2)中，塗鋪密度為2×104個至2×105個細胞/平方公分，且繼代前培養3至7天直至100%匯合。為使病毒生長，將病毒以0.001-0.01之MOI添加至T-燒瓶中之細胞中。感染之細胞通常在細胞塗鋪後1-3天達到約80-100%之匯合度。感染後感染之細胞在37±1℃下培養3-10天，並接著收穫病毒。當單層細胞在感染後3-10天顯示約80-100%細胞病變效應(CPE)時進行收穫。收穫感染之MA104組織培養物(用過之培養基+來自具有80-100% CPE之培養物的PRRSV)的上清液且含有已繁殖之病毒。此上清液在使用前可儲存在-70℃/-80℃下若干個月。藉由Spearman及Kaerber計算評定病毒之TCID50以確定樣品之log10 TCID50/mL。 疫苗(高代數)94881種原病毒(MSV)：其為PRRSV 1型基因型病毒，因此其為歐洲基因型PRRSV。該病毒具有豬宿主。寄存於11012502下之MSV以6.43 Log10 TCID50/mL之力價寄存。MSV繁殖所用之宿主細胞為MA 104細胞。此等細胞在具有1.4 g/L碳酸氫鈉且含有10%經照射胎牛血清之最低必需培養基(MEM)中於36±2℃下培養。細胞塗鋪於T-燒瓶(75-150 cm2)或850 cm2滾瓶中，塗鋪密度為1×104個至1×105個細胞/平方公分，且繼代前培養3至7天直至100%匯合。為使病毒生長，將病毒以0.001-0.01之MOI添加至T-燒瓶或滾瓶中之細胞中。感染之細胞通常在細胞塗鋪後1-3天達到約80-100%之匯合度。感染後感染之細胞在36±2℃下培養3-14天，並接著收穫病毒。當單層細胞在感染後3-14天顯示約80-100%細胞病變效應(CPE)時進行收穫。收穫感染之MA104組織培養物(用過之培養基+來自具有80-100% CPE之培養物的PRRSV)的上清液且含有已繁殖之病毒。此上清液在使用前可儲存在2-8℃下5-10天，-70℃下若干個月。藉由Reed及Muench計算評定MSV之TCID50以確定樣品之log10 TCID50/mL。 實例6：PRRS 94881 MLV小母豬MID研究 概述 此項疫苗接種-攻毒研究之目標為評估豬生殖與呼吸症候群疫苗歐洲來源分離株94881修飾活病毒代碼19T1.U_(PRRS 94881 MLV)在小母豬中之最小免疫劑量(MID)。在繁育前約28天(第0天；D0)，將兩種不同力價水準投與PRRS血清陰性小母豬，在妊娠約90天(D118)，用PRRSv之異源性歐洲型分離株攻毒小母豬，且評估小母豬中活產仔豬之總數或活產仔豬及20日齡斷乳仔豬之百分比以確定MID。在第118天(D118)攻毒時，攻毒對照組由8隻懷孕小母豬組成(第1組，安慰劑)，低力價組由8隻懷孕小母豬組成(第2組，每劑1×102.43 TCID50)，高力價組由8隻懷孕小母豬組成(第3組，每劑1×103.90 TCID50)，且陰性對照組由5隻懷孕小母豬組成(第4組，安慰劑，未受攻毒)。 與攻毒對照組相比，低力價組與高力價組均引起產仔時每窩活仔豬之百分比較高(P 0.0455)及斷乳時每窩活仔豬之百分比及數目較高(P 0.0203)。 關於支持性功效參數，與攻毒對照組相比，高劑量組引起產仔時每隻小母豬之健康仔豬的百分比及數目較高(P 0.0211)，虛弱及乾癟胎豬之百分比及數目較低(P 0.0090)，qPCR陽性小母豬之百分比較低及D125、DOF0及DOF+13攻毒後小母豬中之病毒負荷較低(P 0.0155)，每隻小母豬qPCR陽性仔豬之百分比較低及DOF 0仔豬病毒負荷較低(P 0.0030)，每隻小母豬具有臨床疾病之仔豬之百分比較低(P<0.0001)，及DOF+20仔豬體重及ADWG較高(P<0.0013)。 與攻毒對照組相比，低劑量組引起產仔時每隻小母豬之健康仔豬的百分比較高(P=0.0138)，乾癟胎豬之百分比及數目較低(P 0.0190)，qPCR陽性小母豬之百分比較低及D125、D132、DOF 0及DOF+13攻毒後小母豬中之病毒負荷較低(P 0.0290)，DOF 0每隻小母豬qPCR陽性仔豬之百分比較低(P=0.0381)，每隻小母豬具有臨床疾病之仔豬之百分比較低(P<0.0001)，及DOF+20仔豬體重及ADWG較高(P<0.0028)。 總之，達到研究目標且來自此研究之資料確定小母豬中PRRS 94881 MLV之MID為1×102.43 TCID50/2 mL。此外，此研究確定小母豬中之免疫力持續時間(DOI)為約4個月。 研究之目標/目的 此疫苗接種-攻毒研究之目標為評估豬生殖與呼吸症候群疫苗歐洲來源分離株94881修飾活病毒代碼19T1.U_(PRRS 94881 MLV)之最小免疫劑量(MID)，其以兩種不同力價水準(第2組，低力價；第3組，高力價)在繁育前投與PRRS血清陰性小母豬，以使在妊娠約90天時用豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSv)之異源性歐洲型分離株攻毒小母豬後，活產仔豬及21日齡斷乳仔豬之百分比較高。滿足此目標之主要準則為一或兩個疫苗組必須證明與攻毒對照組(第1組)相比，活產仔豬及20日齡(DOF+20)斷乳仔豬之百分比或數目相應較高。 在疫苗組與攻毒對照組之間分析的其他參數包括疫苗接種後小母豬臨床評定、小母豬PRRS血清學、小母豬病毒血症、小母豬臨床觀察、仔豬病毒血症、每窩總仔豬、每窩健康活仔豬、每窩虛弱活仔豬、每窩乾屍、每窩死胎、每窩擠壓/死亡仔豬、仔豬臨床觀察及仔豬平均日增重(ADWG)。此等參數作為支持性參數分析且不用作滿足研究目標之主要參數。 事件時程 研究設計 盲法準則 研究調查者及被指定者對分配至第1-4組之小母豬不知情。為維持研究調查者及被指定者不知情，非資料收集者在D0向所分配小母豬投與IVP及CP。實驗室工作人員在進行其各別任務時對每隻小母豬接收之處理不知情。 材料 研究性獸醫產品(IVP)及對照產品(CP) 攻毒材料 額外處理 D8至D21，將MatrixTM(6.8 mL；Alternogest；Intervet/Schering Plough Animal Health)投與各小母豬飼料中以使動情週期同步。 在分娩時投與催產素(VetTek)以幫助小母豬產仔，而非引發產仔。產仔時，所有活仔豬經肌肉內在右大腿接收1.0 mL鐵注射液(Phoenix或Durvet)，以防止出生後不久發生缺鐵性貧血。另外，所有活仔豬均接收慶大黴素(gentamicin)(SparHawk Laboratories Inc)作為出生後不久之腹瀉預防措施。所有處理均記錄在生物與醫藥處理記錄表格(Biological & Pharmaceutical Treatment Record form)上。 處理 給藥合理性判斷 各IVP以2.0 mL劑量投與所分配之小母豬以評估PRRS 94881 MLV之MID。2.0 mL劑量之CP投與分配至第1組及第4組之小母豬。 給藥方案 在D0，藉由非研究資料收集者，使用無菌3.0 mL Luer-lock注射器及無菌18g×1吋(2.54 cm)針將各IVP或CP經肌肉內投與各相應小母豬之右頸區。給藥方案展示於下表6.8中。 研究工作人員之方法及防範措施 投與IVP、CP及攻毒材料之工作人員遵循安全性守則且穿上如針對特別研究場所概述之個人防護裝置。 動物資訊 研究動物之詳情 入選/排除準則 所有參加此研究之小母豬均為PRRS ELISA陰性之未生育小母豬，且在疫苗接種時如觀察結果所確定為健康的。 入選後小母豬之移除 五(5)隻第1組小母豬(第5、15、34、35及52號)、兩(2)隻第2組小母豬(第77及94號)、三(3)隻第3組小母豬(第2、25及30號)及一(1)隻第4組小母豬(第20號)未顯示動情期，且因此不生育。此等小母豬在D47自研究移除。 兩(2)隻第1組小母豬(第109及110號)、九(9)隻第2組小母豬(第56、59、60、69、73、75、76、78及103號)、四(4)隻第3組小母豬(第22、28、51及53號)及一(1)隻第4組小母豬(第21號)在D89因跛行、未懷孕或生育延遲而自研究移除。 研究方案說明，若第1-3組每組超過16隻懷孕小母豬在攻毒之前仍在研究中，則隨機選擇額外的小母豬自研究中移除；因此第1-3組每組留下16隻懷孕小母豬。基於統計學家隨機化，或由非研究人員選擇，將五(5)隻第1組小母豬(第3、8、39、90及101號)、一(1)隻第2組小母豬(第70號)及五(5)隻第3組小母豬(第42、80、86、91及105號)於D104自研究移除，將第1-3組之組規模減少至16隻小母豬。 由於空間限制，研究調查者要求第4組之規模自八(8)隻減少至五(5)隻。統計學家隨機選擇三(3)隻小母豬(第10、24及29號)自研究中移除，於D109移除。 動物管理及圈養 動物圈養 D-1至研究結束，低IVP力價小母豬圈養在VRI-Cambridge之Building CB中之房間1及2中，且高IVP力價小母豬圈養在房間3及4中。D-1至D85，分配至攻毒對照組及陰性對照組之小母豬圈養在VRI-Risdal之單個房間中。坐在D85，攻毒對照組及陰性對照組中剩餘小母豬移至VRI-Cambridge。研究之其餘時間，十六(16)隻攻毒對照小母豬圈養在Building CB房間5-8中，且八(8)隻陰性對照小母豬圈養在Building CA房間12中。自D85起，各房間佈局一致，其中有兩列，每列4個產仔籠。每籠容納一隻小母豬及其子代。每籠尺寸為約5呎×7呎，地板升高，側面為金屬桿面板且地板為塑膠網。相鄰籠之間無近距離的接觸。每籠之地板每日沖洗至少一次，以移除排泄物及廢物。每個房間具有獨立的加熱及通風，防止房間之間空氣交叉污染。在用於此研究之前，每個房間均進行清潔及消毒。動物服務人員在進入每個房間之前淋浴且穿上乾淨衣服。 此研究中需要隔離處理組，因為科學界熟知PRRSv容易經由各種機制(包括氣溶膠化)在豬之間傳播。其包括無毒性活PRRS疫苗，因為此等生物產品包括模擬毒性野生型PRRS之特徵而無引起疾病能力之減毒病毒粒子。適當方法宜為確保維持生物安全性且疫苗接種動物未意外地交叉污染未疫苗接種之PRRSv未處理陰性對照動物。 實驗室中之每個房間均具有風扇及加熱器以促進充分的空氣循環及加熱。每個房間之通風系統獨立而相同，因此房間之間空氣不共享。固體飼料儲存於袋中，無害蟲。水可自位於動物實驗室之井隨意獲取。小母豬進食適於其體型、年齡及情況之商業上製備之未加入藥物的妊娠或哺乳期食物(Heart of Iowa Cooperative,Roland,IA)。 如研究調查者所確定，在開始研究之前，小母豬處於良好健康及營養狀態中。研究期間，觀察到兩隻小母豬輕度跛行且觀察到一隻小母豬左頸區腫脹。研究調查者認為所有此等情況均為密閉圈養之小母豬組中通常存在的非特異性情況。研究調查者確定在此研究期間任何動物均不需要伴隨處理。 所有分配至第1-3組之小母豬及其小豬在實施安樂死後藉由商業焚化進行處置。分配至第4組之小母豬在實施安樂死後藉由煉油(rendering)進行處置。第4組仔豬未實施安樂死及處置，而是分配給另一BIVI計劃。無來自參加此研究之動物的食品進入人類食物鏈。 功效評定 為評定PRRS 94881 MLV之MID，在D118攻毒低力價組(第2組)及高力價組(第3組)，且評估攻毒後之生殖效能及斷乳仔豬。滿足此目標之主要準則為一或兩個疫苗組必須證明與攻毒對照組(第1組)相比，活產仔豬及20日齡(DOF+20)斷乳仔豬之百分比或數目在統計學上較高。 在疫苗組與攻毒對照組之間為證明功效而分析的其他參數包括疫苗接種後小母豬臨床評定、小母豬PRRS血清學、小母豬病毒血症、攻毒後小母豬臨床觀察、產仔時仔豬病毒血症、每窩仔豬總數、每窩健康活仔豬、每窩虛弱活仔豬、每窩乾屍、每窩死胎、每窩擠壓/死亡仔豬、仔豬臨床觀察及仔豬ADWG。 有效測試之準則 任何分析中均不包括陰性對照組(第4組)。研究中包括陰性對照組以證明源小母豬在其他三組受攻毒時為PRRS陰性。此外，陰性對照組必須保持PRRS陰性，直至研究結束，以排除可能引入野外PRRSv或來自攻毒組之意外交叉污染。 購買前及D0血清樣品均要求為PRRS抗體陰性。自第1及4組收集之血清樣品必須不含PRRS抗體，直至攻毒之日，且自第4組收集之血清樣品必須不含PRRS抗體，直至研究結束，以使研究有效。 主要結果參數 統計學評估之主要功效變數為每隻小母豬之出生時活仔豬(平均數目或百分比)及DOF+20每窩活仔豬(平均數目及百分比)。 9.2.1每隻小母豬之出生時活仔豬之百分比 研究期間記錄每隻小母豬之產仔資料。每隻小母豬之產仔日(DOF)定義為第一隻仔豬出生之日。在產仔時，每隻仔豬歸類為下表6.10中所列出之五個類別之一。出生時活仔豬定義為出生時觀察評級為健康活仔豬、虛弱活仔豬或擠壓/死亡仔豬(因擠壓引起之死亡在如下所述之屍檢時證實)的任何仔豬。藉由研究調查者或被指定者進行觀察且記錄在每窩產仔進展記錄表格上。 DOF+20時之每窩活仔豬 如下表6.11中概述，DOF+1至DOF+20，觀察仔豬之疾病臨床徵象。藉由研究調查者或被指定者進行觀察且記錄在臨床觀察記錄表格上。 每日總臨床觀察評分藉由統計學家使用SAS程式將呼吸、行為及咳嗽評分求和來確定。DOF+20時之臨床評分為0至8之任何仔豬評為DOF+20活。 支持性參數 在疫苗組與攻毒對照組之間分析的其他參數包括疫苗接種後小母豬臨床評定、小母豬PRRS血清學、小母豬病毒血症、小母豬臨床觀察、仔豬病毒血症、每窩總仔豬、每窩健康活仔豬、每窩虛弱活仔豬、每窩乾屍、每窩死胎、每窩擠壓/死亡仔豬、仔豬臨床觀察及仔豬平均日增重(ADWG)。 小母豬每日評定 藉由研究調查者或被指定者，在疫苗接種後，在D-1至D21，每日觀察所有小母豬一次，且在D22至115，一週觀察至少三次，以進行每日評定。觀察結果記錄在每日評定記錄表格上。 小母豬PRRS血清學 在購買之前及在D0、D7、D14、D21、D56、D84、D118、D125、D132、DOF 0、DOF+7、DOF+13及DOF+20，自小母豬收集靜脈全血。在產仔/流產結束後即刻自產仔/流產(DOF 0)之小母豬收集血液，或至產仔/流產後8小時收集。 簡言之，自每隻小母豬收集約10 mL血液至適當尺寸之血清分離管(SST)中。樣品收集記錄在樣品收集記錄表格上。讓SST中之血液在室溫下凝結。工作日收集之血液樣品於收集當天傳遞至BIVI-Ames。週末收集之血液樣品於收集當天由VRI工作人員處理。VRI之血清樣品保存在2-8℃下。在BIVI-Ames或VRI，血液樣品短暫離心且收穫血清，分離且轉移至適當管中。每個管標記上小母豬之ID號、研究號、收集日期、研究天數及樣品類型。VRI之血清樣品在最早適宜之時間傳遞至BIVI-Ames。每次裝運包括完成之樣品傳遞記錄表格。在BIVI-Ames，一組血清樣品保存在2-8℃下且其他組之血清樣品保存在-70±10℃下。 藉由BIVI-Ames測試該組保存在2-8℃下之小母豬血清樣品的PRRS抗體。結果報導為陰性(ELISA S/P比率<0.4)或陽性(ELISA S/P比率0.4)。 攻毒後小母豬臨床觀察 在D116至DOF+20，觀察小母豬之疾病臨床徵象。藉由研究調查者或被指定者進行觀察。基於上表6.11中概述之臨床觀察評分系統，每天觀察小母豬之呼吸、行為及咳嗽。 仔豬PRRS病毒血症 在DOF 0、DOF+7、DOF+13及DOF+20，或當發現仔豬死亡時，自仔豬收集靜脈全血。較佳自新生仔豬收集哺乳前血液，但不強制執行。若無法收集哺乳前血液，可收集產仔12小時以內之圍產期血液。非第一次吸奶之前收集之樣品標記為「圍產期」且與哺乳前樣品分開。 簡言之，自每隻活仔豬收集約2.0至2.5 mL血液至適當尺寸之血清分離管(SST)中。在臨實施安樂死前於DOF+20自每隻仔豬收集最少5.0 mL血液。自每個乾屍或死胎收集血液，或若血液無法自死胎收集，則收集胸部或腹部流體。樣品收集記錄在樣品收集記錄表格上。 仔豬平均日增重 藉由研究調查者或被指定者，於DOF 0及DOF+20或發現仔豬死亡當天對個別仔豬稱重。DOF 0之個別體重記錄在每窩產仔進展記錄表格上，且DOF 0後之體重記錄在體重記錄表格上。 肺組織中之PRRS病毒定量 在分娩時死亡或在DOF+20之前垂死之所有仔豬均由研究調查者進行屍檢。屍檢結果及診斷記錄在屍檢報告表格上。自每隻屍檢仔豬收集兩個肺樣品。一個樣品置放於單獨Whirlpak®容器中，且另一樣品置放於填充有足夠體積之10%福馬林(formalin)之適當容器中。樣品收集記錄在屍檢報告表格上。 Whirlpaks®及福馬林容器適當標記有動物編號、研究編號、取樣日期、研究天數、樣品類型及樣品來自左側、右側抑或兩側。Whirlpaks®中之樣品儲存在-70±10℃下且10%福馬林中之樣品儲存在室溫下，直至傳遞至BIVI-Ames。每個樣品之傳遞均包括完成之試樣傳遞記錄表格。在BIVI-Ames，Whirlpaks®中之樣品儲存在-70±10℃，直至自BIVI-Ames裝運至Germany，且在BIVI-Ames，福馬林固定之樣品儲存在室溫下。 研究結束後，Whirlpaks®中之冷凍組織樣品如上所述裝運及測試。 福馬林固定之組織樣品在收集一週內提交給ISU VDL以包埋於石蠟塊中。石蠟塊中之組織返回至BIVI，且目前由BIVI-Ames保存在室溫下供未來可能測試。研究贊助人及監測者在研究報告完成後將決定此等樣品保留抑或棄去。 不良事件 此研究期間未報導有歸因於IVP之不良事件。關於不良事件之更多資訊，請參見部分12.6疫苗接種後小母豬評定。 統計學方法 實驗單元 在此研究中處理組必須圈養在各別房間以避免活PRRSv疫苗傳播至未疫苗接種組。因此，房間為實驗單元。然而，出於此分析之目的，忽略由混雜「房間」及「處理」影響所產生之可能偏離，且小母豬及其相應同窩仔畜作為實驗單元進行分析。 隨機化 在D0之前，來自107隻測試合格小母豬之池之九十四(94)隻PRRS血清陰性小母豬分配至四組之一。第1-3組各由28隻小母豬組成。第4組由10隻小母豬組成。對於第1組，在裝運之前，第45號及第55號因健康原因而被農場管理者排除，且分別替換為兩隻其他小母豬第15號及第18號。對於第3組，在裝運之前，第44號因健康原因而被農場管理者排除，且替換為另一小母豬第25號。 由於攻毒時的空間限制，第1-3組限於每組16隻小母豬，且第5組限於5-8隻小母豬。對於第1-3組，在D85，每組隨機選擇16隻小母豬保留在研究中。因為D85時第4組由8隻小母豬組成，所以此組不藉由隨機化進一步減少。之後，研究調查者要求第4組自8隻小母豬減少至5隻小母豬。對於第4組，在D109，隨機選擇5隻小母豬保留在研究中。 所有隨機化程序均由生物統計學家進行。 分析 統計分析及資料概述由Dr.rer.hort.Martin Vanselow,Biometrie & Statistik,Zum Siemenshop 21,30539 Hannover,Germany,+49(0)511 606 777 650,m.vanselow@t-online.de進行。 統計分析之主要目標為比較兩個PRRS 94881 MLV疫苗組(第2組及第3組)與未疫苗接種之攻毒對照組(第1組)。所有資料均輸入SAS中以進行管理及評估。資料自研究贊助人以經驗證之SAS資料集形式接收。排除日期前，分析之各別參數考慮自研究退出之情況。所有資料均基於變數類型加以描述性概述(數目、最小值、最大值、平均值、中值、標準偏差、四分位數間距或頻率分佈、信賴區間)。統計分析使用SAS軟體版本8.2(SAS,2001,Cary,North Carolina,USA：SAS Institute Inc.)進行。 研究之統計學評估的變數： 主要變數 產仔/流產時(DOF+0)活仔豬之比例20日齡(DOF+20)活仔豬之比例 支持性變數 疫苗接種後小母豬臨床評估小母豬PRRS血清學小母豬病毒血症小母豬臨床觀察仔豬病毒血症生殖效能仔豬臨床觀察仔豬平均日增重(ADWG) 待測試之假設及作出之設想： 自統計測試排除未攻毒之陰性對照組(第4組)。將低力價組及高力價組(分別為第2組及第3組)與攻毒對照組(第1組)進行比較。組間的所有測試均設計為關於差異之雙側檢驗。在所有測試之情況下，僅在P0.05時，差異視為統計上顯著。若與攻毒對照組相比，一或兩個疫苗組之活產仔豬之百分比或數目及DOF+20斷乳仔豬之百分比或數目顯著較高，則證明功效。 關於資料操縱及評估之詳情： 疫苗接種後小母豬之臨床評定 產生在研究第1天與第21天之間及研究第1天與第113天之間具有至少一個陽性發現結果之動物的頻率表。藉由費希爾精確檢驗(Fisher's exact test)測試攻毒對照組與疫苗組之間的差異。 攻毒後小母豬之臨床觀察 產生在研究第116天與DOF+20之間具有至少一個陽性發現結果之動物的頻率表。藉由費希爾精確檢驗測試攻毒對照組與疫苗組之間的差異。 小母豬之血清學 產生研究第7、14、21、56、84、118、125、132天(產仔前)及DOF+0、DOF+7、DOF+13及DOF+20時「陽性」ELISA結果之頻率表。藉由費希爾精確檢驗測試攻毒對照組與疫苗組之間的差異。 小母豬之病毒血症 分別評估每個研究日(產仔前研究第7、14、21、56、84、118、125、132及DOF+0、DOF+7、DOF+13及DOF+20)之病毒血症資料。為定性評估qPCR資料，分析結果『未偵測』(『n.d.』)及『陰性』歸類為『陰性』，且分析結果『陽性』及量測值歸類為『陽性』。為定量評估，『未偵測』(『n.d.』)及『陰性』替換為0.0之log10 GE/mL值，且『陽性』替換為3.0。定量PCR資料(PRRS病毒負荷[log10 GE/mL])用於在攻毒對照組(第1組)與處理組2及3之間使用魏氏-曼-惠特尼檢驗(Wilcoxon Mann-Whitney test)進行比較。產生『陽性』qPCR結果之頻率表。藉由費希爾精確檢驗測試攻毒對照組與疫苗組之間的差異。 生殖效能 確定DOF+20時每隻小母豬總數、活、健康、虛弱、死產、死亡及活仔豬之絕對頻率且作為單一值用於組間比較。相對於產仔時之仔豬總數，計算每隻小母豬活、健康、虛弱、死產及死亡仔豬之相對頻率且作為單一值用於組間比較。相對於產仔時活仔豬之數目，減去死亡及擠壓仔豬之數目，計算DOF+20時每窩活仔豬之百分比。藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗測試攻毒對照組與疫苗組之間的差異。 仔豬之病毒血症 分別評估每個研究日(DOF+0、DOF+7、DOF+13及DOF+20)之病毒血症資料。為定性評估qPCR資料，分析結果『未偵測』(『n.d.』)及『陰性』歸類為『陰性』，且分析結果『陽性』及量測值歸類為『陽性』。計算每窩『陽性』仔豬之百分比且作為單一值用於藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗進行之組間比較。為定量評估，『未偵測』(『n.d.』)及『陰性』替換為0.0之log10 GE/mL值，且『陽性』替換為3.0。計算每窩中值qPCR值且作為單一值用於藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗進行之組間比較。對於概要統計，使用個別qPCR資料。僅描述性評估肺樣品中之病毒負荷。 仔豬之體重及平均日增重 計算DOF+0與DOF+20之間時間段之個別平均日增重(ADWG)。處理組之間的差異藉由變異數分析(ANOVA)及後續t檢驗進行測試。該等組之最小平方平均值及具有95%信賴區間之最小平方平均值之間的差異自ANOVA得出。以DOF+0之體重為共變數，重複DOF+20及ADWG之分析。每隻小母豬之仔豬的體重資料描述性概述。 仔豬之臨床觀察 計算在研究天數DOF+1與DOF+20之間每窩具有至少一個陽性發現結果之仔豬之百分比且作為單一值用於藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗進行之組間比較。採取完全隨機設計結構，分析資料。 結果 小母豬生殖效能 攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之產仔時每窩活仔豬(健康+虛弱+擠壓/死亡)之平均百分比分別為54.4%、75.1%、72.3%及93.0%。與攻毒對照組相比，低力價組及高力價組之產仔時每窩活仔豬之百分比顯著較高(P 0.0455)。攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之產仔時每窩活仔豬之平均數目分別為6.5、8.3、8.6及10.8。在組之間未偵測到產仔時每窩活仔豬之數目的顯著差異(P0.1039)。 攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之每窩健康活仔豬之平均百分比分別為41.4%、65.8%、67.9%及93.0%。與攻毒對照組相比，低力價組及高力價組之產仔時每窩健康活仔豬之百分比顯著較高(P 0.0138)。攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之產仔時每窩健康活仔豬之平均數目分別為4.9、7.2、8.1及10.8。與攻毒對照組相比，高力價組之產仔時每窩健康活仔豬之數目顯著較高(P=0.0211)，而低力價組則未偵測到差異(P=0.0640)。 攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之產仔時每窩虛弱活仔豬之平均百分比分別為7.4%、7.1%、0.4%及0.0%。攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之產仔時每窩虛弱活仔豬之平均數目分別為0.9、0.8、0.1及0.0。與攻毒對照組相比，高力價組之產仔時每窩虛弱活仔豬之百分比及數目顯著較低(P 0.0090)。相反，在低力價組與攻毒對照組之間未偵測到產仔時虛弱活仔豬之百分比或數目的差異(P0.8569)。 攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之產仔時每窩乾屍之平均百分比分別為28.1%、14.1%、8.7%及0.0%。攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之產仔時每窩乾屍之平均數目分別為3.1、1.6、0.9及0.0。與攻毒對照組相比，低力價組與高力價組之產仔時每窩乾屍之百分比及數目均顯著較低(P 0.0190)。 在兩個疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到產仔時每窩死產或死亡/擠壓仔豬之百分比或數目的顯著差異(P0.1681)。 組中DOF時之生殖效能結果(每窩仔豬%及每窩仔豬數目)的概述展示於下表6.12及6.13中。 DOF+20活仔豬 此等評分突出斷乳時(20日齡)活仔豬之數目。組中DOF+20時每窩活仔豬之百分比及數目的概述展示於上表6.12及6.13中。 攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之斷乳時(DOF+20)每窩活仔豬之平均百分比分別為43.6%、73.8%、83.8%及100.0%。攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之斷乳時每窩活仔豬之平均數目分別為2.9、6.2、6.9及10.8。與攻毒對照組相比，低力價組與高力價組之斷乳時(DOF+20)每窩活仔豬之百分比及數目均顯著較高(P 0.0203)。 小母豬qPCR病毒血症 D0時，所有小母豬之PRRSv RNA均呈qPCR陰性。所有攻毒對照及陰性對照小母豬保持PRRSv RNA呈qPCR陰性，直至且包括攻毒之日(D118)。陰性對照組在研究其餘時間均保持qPCR陰性，其中小母豬第108號除外，其在DOF+7時為『陽性』。藉由qPCR測試，小母豬第108號在其他時間點PRRSv RNA呈陰性。 疫苗接種後，在D7，分別50%及36%之低力價及高力價小母豬對PRRSv RNA呈qPCR陽性(P 0.0007)。D14至D56，僅4%低力價小母豬保持qPCR陽性，而在此觀察期期間，至多4%高力價小母豬間斷地為qPCR陽性。D14至D56，在疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到對PRRSv RNA為qPCR陽性之小母豬之百分比的差異(P=1.0000或未進行測試)。D84及D118(攻毒之日)時，所有疫苗接種之小母豬對PRRSv RNA均為qPCR陰性。 攻毒後，在第125天、DOF 0及DOF+13時，與攻毒對照組相比，低力價及高力價組中對PRRSv RNA為qPCR陽性之小母豬之百分比在統計學上較低(P 0.0155)。D132時，低力價組中對PRRSv RNA為qPCR陽性之小母豬之百分比顯著較低(P=0.0290)；而在高力價組與攻毒對照組之間未偵測到統計差異(P=0.1556)。DOF+7及DOF+20時，在疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到對PRRSv RNA為qPCR陽性之小母豬之百分比的顯著差異(P0.1719)。 組中D7至DOF+20時對PRRSv RNA為qPCR陽性之小母豬之百分比的概述展示於下表6.14及6.15中。 D7時，與攻毒對照組相比，兩個疫苗組之中值病毒負荷均顯著較高(P 0.0007)。D14至D56，在疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到病毒負荷之差異(P=1.0000)。D84及D118(攻毒之日)時，所有疫苗接種之小母豬之病毒負荷均為0。 攻毒後，在D125、DOF 0及DOF+13，與攻毒對照組相比，低力價組及高力價組之中值病毒負荷統計學較低(P 0.0155)。D132時，低力價組之中值病毒負荷顯著較低(P=0.0230)；而在高力價組與攻毒對照組之間未偵測到統計差異(分別為0.94及1.97 log10 GE/mL；P=0.1144)。DOF+7及DOF+20時，在疫苗組與攻毒對照組之間未偵測病毒負荷之顯著差異(P0.1719)。 組中D7至DOF+20時之平均小母豬qPCR GE/mL結果之概述展示於下表6.16及6.17中。 攻毒後小母豬臨床觀察評分 在D116至DOF+20，分別25%、25%、38%及60%之攻毒對照、低力價、高力價及陰性對照小母豬顯示D116至DOF+20中至少一天之臨床疾病。D116至DOF+20時，在疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到對臨床疾病為陽性之小母豬之頻率的顯著差異(P0.7043)。 組中D116至DOF+20中至少一天對臨床疾病為陽性(臨床觀察評分>0)之小母豬之百分比的概述展示於下表6.18中。 小母豬PRRS ELISA血清學 所有小母豬在D0及D7時均為PRRS血清陰性。所有攻毒對照及陰性對照小母豬保持PRRS血清陰性直至且包括攻毒之日(D118)；而陰性對照組在研究其餘時間保持PRRS血清陰性(DOF+20)。 在D14，分別18%及21%之低力價及高力價小母豬為PRRS血清陽性。與攻毒對照組相比，高力價組D14時之PRRS血清陽性小母豬之百分比顯著較高(P=0.0232)，而低力價組則未偵測到差異(P=0.0515)。D56時，低力價組及高力價組之此等百分比分別達到組中65%及60%之高點(P<0.0001)。在攻毒之日(D118)，56%及50%之低力價及高力價小母豬為PRRS血清陽性(P 0.0024)。D125時，分別6%、88%及100%之攻毒對照、低力價及高力價小母豬為PRRS血清陽性；且疫苗組與攻毒對照組之間的差異顯著(P<0.0001)。D125後，所有剩餘攻毒對照、低力價及高力價小母豬在研究其餘時間均為PRRS血清陽性(未進行測試)。 組中D14至DOF+20時之PRRS ELISA血清學結果的概述展示於下表6.19及6.20中。 疫苗接種後小母豬評定 在任一組中均未偵測到D1至21之異常評定，且未進行測試。在D1至D113，分別4%、4%、0%及10%之攻毒對照、低力價、高力價及陰性對照小母豬顯示D1至D113中至少一天之異常評定。在D1至D113，在疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到異常評定之顯著差異(P=1.0000)。 個別地，第109號(攻毒對照組)在D85顯示右後腿跛行，第12號(低力價組)在D78至D89顯示左頸區腫脹，且第21號(陰性對照組)在D81至D83顯示跛行。 組中顯示D1至D21及D1至D113中至少一天之異常評定的小母豬之百分比之概述展示於下表6.21中。 仔豬臨床觀察評分 攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組中每窩DOF+1至DOF+20中之至少一天對臨床疾病為陽性(臨床觀察評分>0)之仔豬之平均百分比分別為91.6%、32.5%、33.4%及3.2%。與攻毒對照組相比，低及高力價組中每窩DOF+1至DOF+20中之至少一天對臨床疾病為陽性之仔豬之百分比顯著較低(p 0.0001)。 組中每窩DOF+1至DOF+20中至少一天對臨床疾病為陽性(臨床觀察評分>0)之仔豬之百分比的概述展示於下表6.22中。 仔豬血清/體液qPCR結果 DOF 0時，分別86.3%、58.1%、55.0%及0%之攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組每窩仔豬平均值對PRRSv RNA呈qPCR陽性。DOF 0時，與攻毒對照組相比，低力價及高力價組中每窩對PRRSv RNA呈qPCR陽性之仔豬百分比在統計學上較低(P 0.0381)。DOF+7時，與攻毒對照組相比，低力價及高力價組中每窩對PRRSv RNA呈qPCR陽性之仔豬百分比再次顯著較低(P 0.0293)。DOF+13時，僅低力價組之每窩qPCR陽性仔豬百分比顯著較低(P=0.0216)；而未偵測到高力價組與攻毒對照組之每窩qPCR陽性仔豬百分比的顯著差異(P=0.0860)。DOF+20時，未偵測到組間顯著差異(P0.0614)。 組中每隻小母豬之血清/體液qPCR PRRSv陽性仔豬之百分比的概述展示於下表6.23中。 DOF 0時，與攻毒對照組相比，高力價組之中值qPCR結果顯著較低(P=0.0030)；而在低力價組與攻毒對照組之間未偵測到差異(P=0.0620)。DOF+7、DOF+13及DOF+20時，與攻毒對照組相比，兩個疫苗組之中值qPCR值均顯著較低(p 0.0122)。 組中每隻小母豬之仔豬血清/體液qPCR GE/mL結果之概述展示於下表6.24中。 仔豬ADWG DOF 0時，在組之間未偵測到LS平均體重之差異(P0.2972)。DOF+20時，在將或不將DOF 0體重因子化為分析中之共變數的情況下，與攻毒對照組相比，兩個疫苗組之最小平方平均體重均較高(P<0.0028)。 攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之DOF 0至DOF+20時之平均ADWG分別為0.1公斤/天、0.2公斤/天、0.2公斤/天及0.2公斤/天。在將或不將DOF 0體重因子化為分析中之共變數的情況下，與攻毒對照組相比，兩個疫苗組之ADWG均顯著較高(P<0.0028)。 組中DOF 0及DOF+20仔豬體重及DOF 0至DOF+20 ADWG(公斤/天)之概述展示於下表6.25及6.26中。 仔豬屍檢觀察及診斷 除8隻胎豬外，產仔時列為死胎、乾屍或擠壓之胎豬在屍檢時證實為分類正確。雖然兩隻攻毒對照胎豬列為死胎(40-S1、66-S1)，但屍檢結果揭示肺膨脹，指示其在出生時為活的。雖然兩隻攻毒對照胎豬列為擠壓(1-C1、79-C2)，但屍檢結果顯示兩隻胎豬之肺未膨脹，指示其未呼吸。雖然一隻低力價胎豬列為死胎(85-S2)，但屍檢結果揭示肺膨脹，指示該仔豬在出生時為活的。雖然三隻高力價仔豬列為擠壓(36-C1、36-C2、65-C1)，但屍檢結果揭示兩隻胎豬之肺未膨脹，指示其未呼吸。由於產仔時未正確列出之胎豬數目低，所以小母豬效能分析無變動。 一隻攻毒對照仔豬102-428在收集血液後死亡，此經屍檢證實。 仔豬肺qPCR結果 在屍檢之胎豬及死亡仔豬中，攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之平均肺qPCR結果分別為4.68、4.09、3.55及0.0 log10 GE/mL。不對此等資料進行統計分析。 組中肺PRRSv qPCR結果(log10 GE/mL)之概述展示於下表6.27中。 討論/結論 為達成研究目標，D0時，四組PRRS易感染小母豬包括在研究設計中：接收對照產品之攻毒對照組(第1組)；接收1×102.43 TCID50 PRRS 94881 MLV之低力價疫苗組(IVP第1號，第2組)；接收1×103.90 TCID50 PRRS 94881 MLV之高力價疫苗組(IVP第2號，第3組)；及亦接收對照產品之陰性對照組(第4組)。各處理在配種前約28天(D0)經肌肉內以2.0 mL劑量投與。 為確定PRRS 94881 MLV之最小免疫劑量，兩個疫苗力價組及攻毒對照組在D118(妊娠約90天)時用異源性歐洲型PRRSv分離株(分離株190136)攻毒，且攻毒後評估出生時(產仔之日，DOF)每窩活仔豬之百分比及數目以及21日齡(DOF+21)每窩活仔豬之百分比及數目。 研究之驗證(陰性對照組4) 為確保源小母豬無PRRSv且研究期間在處理組及對照組中未發生外來PRRSv暴露或交叉污染，研究設計中包括陰性對照組(第4組)。陰性對照小母豬在整個研究中對PRRS抗體呈陰性。此外，此組小母豬及其子代在所有測試時間點亦對PRRSv病毒血症呈陰性(qPCR)，DOF+7時第108號除外。小母豬第108號在DOF+7時為「陽性」，而在所有其他時間點為qPCR陰性，且其仔豬亦對PRRSv RNA呈陰性。認為此結果為由樣品污染引起而非PRRSv感染引起之誤差。此等結果證明陰性對照組在研究期間保持免遭PRRS感染且驗證此試驗之結果。 PRRSv生殖攻毒模型之驗證(攻毒對照組1) 需要一種涉及誘發足夠且可再現PRRS臨床疾病之毒性歐洲來源PRRSv株的攻毒模型以在實驗室環境下充分評估PRRS疫苗功效。用歐洲型PRRS分離株190136接種(1×106.30 TCID50/6 mL)後，攻毒對照組顯示每窩僅54.4%出生時活仔豬(陰性對照組為93.0%)、每窩分別17.5%及28.1%之死胎及乾屍(陰性對照組分別為7.0%及0.0%)、每窩91.6%顯示DOF+1至DOF+20中至少一天之臨床疾病的仔豬(陰性對照組為每窩3.2%仔豬)、每窩2.9隻20日齡活仔豬之平均值(陰性對照組之平均值為10.8)及每窩86.3%出生時病毒血症仔豬(陰性對照組為0%)。此等結果突出在小母豬及其子代之未疫苗接種之攻毒對照組中誘發嚴重的PRRS特異性臨床疾病，因此驗證此攻毒模型為足以評估PRRS疫苗功效及更特定言之PRRS 94881 MLV之MID的臨床實驗工具。 確定小母豬中PRRS 94881 MLV之最小免疫劑量(低及高力價疫苗劑量；第2-3組) 小母豬中PRRS 94881 MLV之MID的確定係基於接收最低力價疫苗，引起與攻毒對照組相比，在攻毒後出生時每窩活仔豬之百分比或數目較高及20日齡每窩活仔豬之百分比或數目較高的疫苗組。 產仔時每窩活仔豬(百分比或數目)被選為確定PRRS 94881 MLV之MID的兩個關鍵準則之一。第一關鍵準則係基於懷孕小母豬及大母豬中之PRRSv感染通常導致死胎及乾屍且產仔時活仔豬之數目較低的事實。出生時每窩活仔豬定義為產仔時健康活仔豬、虛弱活仔豬及擠壓-死亡仔豬之總和。列為擠壓或死亡之仔豬包括在「活」類別內，因為屍檢研究結果證實此等仔豬在出生時為活的且此後不久因外傷而死亡。低力價組及高力價組均顯示與攻毒對照組相比，產仔時每窩活仔豬之百分比顯著較高(P 0.0455)，因此符合疫苗功效之此準則。雖然在低及高力價疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到產仔時每窩活仔豬之平均數目的顯著差異(P0.1857)，但低力價及高力價組顯示相對於攻毒對照組(每窩平均6.5隻仔豬)，產仔時每窩活仔豬之平均數目顯著較高(分別為每窩平均8.3隻及8.6隻仔豬)，因此進一步證明及支持攻毒後在此等動物中觀察到有益的疫苗治療作用。 20日齡每窩活仔豬(百分比或數目)為確定PRRS 94881 MLV之MID的第二準則，因為小母豬PRRS免疫力將影響仔豬之子宮內感染及病毒自小母豬至活仔豬之流動。子宮內感染PRRS且出生時存活之仔豬或產仔後經由自小母豬流出而感染上毒性PRRS之仔豬通常在斷乳之前由PRRS引起死亡。在此研究中，攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組分別顯示每窩43.6%、73.8%、83.8%及100%之20日齡活仔豬(P 0.0203)。同樣，攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組每窩20日齡活仔豬之平均數目分別為2.9、6.2、6.9及10.8隻(P 0.0063)。兩個疫苗組之斷乳時活仔豬的百分比及數目均較高(P 0.0203)，因此符合研究目標之此準則。 產仔資料之進一步分析揭示支持PRRSv攻毒後疫苗功效之更多資訊，尤其關於高力價組。高力價組顯示與攻毒對照組相比，出生時健康仔豬之百分比及平均數目在統計學上較高(P 0.0211)；同時顯示虛弱及乾癟胎豬之百分比及平均數目顯著較低(P 0.0090)。此等資料證明高疫苗劑量誘導針對毒性及異源性PRRSv攻毒株之保護性免疫力。低力價組亦顯示產仔時疫苗功效，如每窩健康活仔豬之百分比較高(P=0.0138)及乾癟胎豬之百分比及平均數目顯著較低(P 0.0190)所證明。相反，在組之間未偵測到產仔時死產或擠壓/死亡胎豬之百分比或數目的差異(P0.1681)。 攻毒後7天(D125)，與攻毒對照組相比，藉由qPCR測試，低力價組及高力價組中對PRRSv RNA呈陽性之小母豬的百分比顯著較低，以及兩組之病毒負荷顯著較低(P 0.0001)。此等資料進一步證明兩種疫苗劑量在小母豬中誘導足以以在攻毒後顯著降低病毒複製之免疫力。同樣，低及高力價組在DOF 0及DOF+13時qPCR陽性小母豬之百分比顯著較低，以及在此等研究天數兩組之病毒負荷較低(P 0.0155)。低力價組在D132時qPCR陽性小母豬之百分比顯著較低且病毒負荷較低(P 0.0290)；而在高力價組與攻毒對照組之間未偵測到同組參數的統計學差異(P0.1144)。在疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到DOF+7及DOF+20時qPCR陽性小母豬之百分比或病毒負荷的統計學差異(P0.1719)。 通常PRRSv不在小母豬及大母豬中誘發除流產以外的臨床疾病。在此研究中，分別25%、25%、38%及60%之攻毒對照、低力價、高力價及陰性對照小母豬顯示攻毒後至少一天之臨床疾病(得到臨床觀察評分>0)。在疫苗組與攻毒對照組之間未偵測到D116至DOF+20中至少一天具有臨床疾病之小母豬之百分比的顯著差異(P0.7043)。顯示某種形式之臨床疾病的小母豬在臨產時顯示而非在攻毒後即刻顯示。顯示臨床疾病之陰性對照小母豬之百分比很高(60%)及此研究中所有組之臨床疾病均主要在靠近產仔時才注意到的事實證明臨床疾病並非PRRS疾病的結果，而是與分娩有關之生理變化的結果。 研究中之所有小母豬在D0時均為PRRS ELISA血清陰性，因此證實測試動物進入研究之入選準則。同樣，所有小母豬在D7時均為PRRS ELISA血清陰性。疫苗接種小母豬在D14時開始顯示PRRS ELISA血清陽性結果，且低及高劑量組顯示在D56時其最高血清轉變率分別為65%及60%(P<0.0001)。相反，攻毒對照組保持PRRS ELISA血清陰性，直至攻毒後7天(D125)。自D132至研究結束，所有低力價、高力價及攻毒對照小母豬均為PRRS ELISA血清陽性。兩個疫苗組之疫苗接種後病毒血症陽性小母豬之百分比在D7時達到最高值，如低及高力價組分別為50%及36%所證明(P 0.0007)。低力價組及高力價組之病毒血症在D14時分別迅速下降至4%(28隻中1隻，第64號)及0%(28隻中0隻)(P=1.0000或未進行測試)。D21時，低力價組(28隻中1隻，第56號)及高力價組(28隻中1隻，第91號)中病毒血症保持在4%。D56時，26隻低力價小母豬中1隻(4%，第89號)及25隻高力價小母豬中1隻(4%，第66號)為病毒血症陽性。所有小母豬在D84及D118時均為病毒血症陰性。 在兩個疫苗力價組與攻毒對照組之間未偵測到每組疫苗接種後D1至D113中至少一天具有異常臨床評定之小母豬百分比的顯著差異(P=1.0000)。個別地，僅三隻小母豬顯示在此時間範圍期間顯示任何異常評定。兩隻小母豬顯示跛行(一隻攻毒對照小母豬及一隻陰性對照小母豬)且一隻低力價小母豬顯示左頸區腫脹。因為疫苗投與右頸區，所以未注意到與此疫苗相關之不良事件。 DOF時之仔豬PRRS病毒血癥結果令人進一步瞭解到小母豬中防止仔豬交叉胎盤感染之保護水準。DOF時，低力價組及高力價組中分別平均每隻小母豬58.1%及55.0%仔豬為qPCR陽性。相反，攻毒對照組中平均每隻小母豬86.3%仔豬為血清/體液中呈qPCR陽性，此顯著高於兩個疫苗組(P 0.0381)。當檢查DOF 0時之仔豬病毒負荷時，與攻毒對照仔豬相比，高力價仔豬之病毒負荷顯著較低(P=0.0030)；而在低力價與攻毒對照仔豬之間未偵測到病毒負荷之差異(P=0.0620)。每隻小母豬對病毒血症呈陽性之仔豬的百分比顯著減少(P0.05)指示在用任一劑量之歐洲型PRRS 94881 MLV免疫接種的情況下毒性PRRSv自疫苗接種小母豬至後代之垂直傳播減少。此外，高力價組DOF時每隻小母豬之中值qPCR仔豬值為3.00 log10 GE/mL；而攻毒對照組之每隻小母豬血清/體液中之中值qPCR仔豬值為6.40 log10 GE/mL(P=0.0030)。在低劑量組與攻毒對照組之間未偵測到DOF時仔豬病毒負荷之顯著差異(P=0.0620)。此資料進一步證明高劑量PRRS 94881 MLV投與小母豬及大母豬時之功效。 低力價及高力價組顯示每窩DOF+1至DOF+20中至少一天具有臨床疾病(臨床觀察評分>0)之仔豬平均值分別為32.5%及33.4%。此等結果顯著低於攻毒對照組，攻毒對照組顯示每窩相同參數之仔豬平均值為91.6%(P 0.0001)，進一步證明兩種劑量之疫苗功效。 在組之間未偵測到DOF 0時仔豬平均體重之顯著差異(P0.2972)；而兩個疫苗組之DOF+20體重及DOF 0至DOF+20 ADWG顯著較高(P 0.0028)。再次，此等結果證明兩種劑量PRRS 94881 MLV之功效。 屍檢結果證實產仔時幾乎所有胎豬之分類均正確。由於與產仔時正確分類之胎豬的整體數目相比，列為擠壓而實際上為死胎及列為死胎而實際上產仔時擠壓之胎豬的數目極少，所以在分析小母豬效能資料之前其不變動。一隻攻毒對照仔豬在血液收集後死亡。因為與攻毒對照組中龐大整體數目之仔豬相比，此情況僅涉及一隻仔豬，所以不自分析移除此仔豬。 分別自攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之141、79、75及4隻死亡胎豬/仔豬收集肺樣品。確定攻毒對照組、低力價組、高力價組及陰性對照組之平均qPCR肺值分別為4.68、4.10、3.55及0.00 log10 GE/mL。不對此等資料進行分析，因為未對在20日齡時存活之仔豬進行屍檢，但此等結果突出當小母豬用毒性PRRSv攻毒時，用PRRS 94881 MLV進行疫苗接種之小母豬使仔豬肺中之病毒負荷降低。 總之，此研究之結果證明與攻毒對照組相比，兩個疫苗組之產仔時每窩活仔豬之百分比顯著較高(P 0.0455)及斷乳時每窩仔豬之百分比及數目較高(P 0.0203)。因此，達到研究目標且來自此研究之資料確定小母豬中PRRS 94881 MLV之MID為1×102.43 TCID50/2 mL。此等結果在疫苗接種後118天獲得，此外，其確定小母豬中免疫力之持續時間(DOI)為約4個月。 當檢查支持性資料時，高劑量之PRRS 94881 MLV(1×103.90 TCID50/2 mL)引起產仔時每隻小母豬之健康仔豬之百分比及數目較高(P 0.0211)，虛弱及乾癟胎豬之百分比及數目較低(P 0.0090)，D125、DOF 0及DOF+13時qPCR陽性小母豬之百分比較低及攻毒後小母豬中之病毒負荷較低(P 0.0155)，DOF 0時每隻小母豬qPCR陽性仔豬之百分比較低及仔豬病毒負荷較低(P 0.0030)，每隻小母豬具有臨床疾病之仔豬之百分比較低(P<0.0001)，及DOF+20時之仔豬體重及ADWG較高(P<0.0013)。 低劑量組引起產仔時每隻小母豬之健康仔豬的百分比較高(P=0.0138)，乾癟胎豬之百分比及數目較低(P 0.0190)，qPCR陽性小母豬之百分比較低及D125、D132、DOF 0及DOF+13時攻毒後小母豬中之病毒負荷較低(P 0.0290)，DOF 0時每隻小母豬qPCR陽性仔豬之百分比較低(P=0.0381)，每隻小母豬具有臨床疾病之仔豬之百分比較低(P<0.0001)，及DOF+20時之仔豬體重及ADWG較高(P<0.0028)。 實例7 評估易感染仔豬中在疫苗接種後兩週用異源性歐洲型PRRS分離株攻毒後之PRRS 94881 MLV免疫力產生 此疫苗接種-攻毒研究之目標為評定在候選疫苗豬生殖與呼吸症候群歐洲來源分離株94881修飾活病毒(PRRS 94881 MLV)投與14±3日齡易感染仔豬後兩週之免疫力產生(OOI)。滿足疫苗接種後2週之OOI的主要功效準則為疫苗接種組(第1組)是否證明與未疫苗接種之攻毒對照組(第2組)相比攻毒後肺病變有顯著差異(p0.05)。二次參數包括疫苗接種後臨床評定、攻毒後臨床觀察、直腸溫度、平均日增重、血清樣品中PRRS抗體及病毒血症之評定及屍檢時收集之肺樣品中PRRS病毒之定量。 仔豬隨機分配至第1組(含有1×103.82 TCID50/mL之PRRS 94881 MLV-疫苗且受攻毒；n=20)、第2組(安慰劑疫苗且受攻毒；n=20)或第3組(安慰劑疫苗且未受攻毒；n=10)。仔豬圈養在地板升高之塑膠圍欄中(n=5隻/圍欄)。各處理組圈養在不同房間以避免PRRSv經由機械途徑，包括氣溶膠化傳播。 所有分配給此研究之動物均完成該研究。此研究期間未報導有不良事件。PRRS 94881 MLV接種豬及攻毒對照之D24平均肺病變評分分別為27.4%及54.8%。PRRS 94881 MLV接種豬之平均肺病變評分顯著低於攻毒對照(p=0.0002)，且因此符合主要功效變數且OOI確定為單次疫苗接種後2週。D14、D17及D21時具有陽性PRRS-抗體力價之PRRS 94881 MLV接種豬之比例顯著高於攻毒對照(p 0.0012)。攻毒後PRRS 94881 MLV接種豬D17-D24時之病毒血症平均AUC顯著低於攻毒對照(分別為50.72及54.61 log10 GE/mL；p=0.0039)。與攻毒對照豬之45%相比，PRRS 94881 MLV接種豬顯示攻毒後無昏睡徵象(0%)(p=0.0012)。在研究之攻毒後階段期間(SD14-SD24)PRRS 94881 MLV接種豬之增重高於攻毒對照(分別為0.3及0.1 kg；p=0.0003)。 疫苗接種動物中攻毒後肺病變、臨床徵象、血液及肺中病毒複製之顯著(p0.05)減少以及生長效能之改良證明當在疫苗接種後2週進行攻毒時疫苗對毒性PRRSv之功效。因此，證明用PRRS 94881 MLV接種後至少2週之免疫力產生。 研究之目標/目的 此疫苗接種-攻毒研究之目標為評定在候選疫苗豬生殖與呼吸症候群歐洲來源分離株94881修飾活病毒(PRRS 94881 MLV)投與14±3日齡易感染仔豬後兩週之免疫力產生(OOI)。滿足疫苗接種後2週之OOI之主要功效準則為疫苗接種組(第1組)是否證明與未疫苗接種之攻毒對照組(第2組)相比攻毒後減少之肺病變有顯著差異(p0.05)。 在疫苗組與攻毒對照組之間分析的二次功效參數包括疫苗接種後臨床評定、PRRS血清學、攻毒後PRRS病毒血症、攻毒後臨床觀察、平均日增重(ADWG)、直腸溫度及肺PRRSv定量。 研究中包括未疫苗接種或攻毒之陰性對照組(第3組)以證明在整個試驗期期間源畜群無PRRSv感染且在此試驗期間未破壞生物安全性。 事件時程 研究設計 盲法準則 研究調查者及被指定者在研究之整個存活期期間對分配之處理組不知情。為維持此不知情，未參與豬評定(亦即臨床評定、臨床觀察或屍檢)之個體在D0執行隨機化且投與分配之IVP及CP處理。BIVI實驗室工作人員在進行其各別任務時對每隻豬接收之處理不知情。 材料 研究性獸醫產品(IVP)及對照產品(CP) 攻毒材料 處理 給藥合理性判斷 IVP以1.0 mL劑量投與所分配之豬以評估疫苗接種後2週PRRS 94881 MLV之OOI。CP作為安慰劑疫苗以1.0 mL劑量投與第2組及第3組。 給藥方案 D0時，藉由非研究資料收集者，使用無菌3.0 mL Luer-lock注射器及無菌20g×1吋(2.54 cm)或18g×¾吋(1.91 cm)針將IVP或CP經肌肉內投與所分配之豬的右頸區。給藥方案展示於下表7.6中。 動物資訊 研究動物之詳情 入選/排除準則 所有參加此研究之仔豬均為PRRS ELISA陰性，且在疫苗接種時如觀察結果所確定為健康的。 入選後之移除準則 不自研究移除豬。 動物管理及圈養 動物圈養 在整個研究期間仔豬圈養在Veterinary Resources,Inc.(VRI)(Cambridge,IA)。第1組、第2組及第3組圈養在相同但獨立之房間以確保生物安全性。仔豬圈養在每個房間內之多個圍欄(5隻仔豬/圍欄)中。第1組圈養在房間5中之4個圍欄中，第2組圈養在房間6中之4個圍欄中，且第3組圈養在房間4中之2個圍欄中。圍欄由升高台上之塑膠桶及塑膠條縫地板組成。每個圍欄含有塑膠6孔餵料器及噴管飲水器。每個隔離室均與其他隔離室一樣構築，且均符合生物危害水準2(BL2)，經hepafilter過濾，在恆溫器調節之溫度控制下機械通風。 此研究中需要隔離處理組，因為科學界熟知PRRSv容易經由各種機制(包括氣溶膠化)在豬之間傳播。其包括無毒性活PRRS疫苗，因為此等生物產品包括模擬毒性野生型PRRS之特徵而無引起疾病能力之減毒病毒粒子。適當方法宜為確保維持生物安全性且疫苗接種動物未意外地交叉污染未疫苗接種之PRRSv未處理陰性對照動物。藉由測試實驗室工作人員採取適當措施，以在每個房間用於研究之前充分清潔及消毒。 實驗室中之每個房間均具有風扇及加熱器以促進充分的空氣循環及加熱。每個房間之通風系統獨立而相同，因此房間之間空氣不共享。 固體飼料儲存於袋中，無害蟲。水隨意獲取。根據該地區之可接受畜牧業慣例，仔豬隨意進食適於其體型、年齡及情況之加入藥物硫姆林(tiamulin)(35公克/噸)及氯四環素(chlortetracycline)(400公克/噸)的商業食物(Lean Metrics Infant,Purina Mills,St.Louis,MO)。 如研究調查者所確定，在開始研究之前，小母豬處於良好健康及營養狀態中。 在研究期間，觀察到所選動物身體狀況有輕度下降，毛髮外觀粗糙，關節腫脹及有不同程度之跛行。研究調查者認為所有此等情況均為密閉圈養之豬組中通常存在的非特異性情況。亦在攻毒後所選豬中注意到咳嗽、打噴嚏、呼吸迅速、呼吸困難及輕度至中度昏睡，且認為其為與肺炎相關之典型臨床徵象，不過病因學上不具特異性。研究調查者確定在此研究期間任何動物均不需要伴隨處理。 所有分配給此研究之豬均在D24時實施安樂死及屍檢後藉由商業焚化處置。無來自參加此研究之動物的食品進入人類食物鏈。 功效評定 為評定疫苗接種後2週PRRS 94881 MLV之OOI，第1組及第2組在D14受到攻毒且評估攻毒後肺病變。若第1組(最小免疫劑量之PRRS 94881 MLV)證明與攻毒對照組(第2組)相比，攻毒後肺病變顯著降低(p0.05)，則實現疫苗接種後2週之OOI。 在疫苗組與攻毒對照組之間分析的二次功效參數包括疫苗接種後臨床評定、攻毒後臨床觀察、直腸溫度、體重及平均日增重(ADWG)、血清樣品中PRRS抗體及病毒血症之評定及屍檢時收集之肺樣品中PRRS病毒之定量。 研究中包括未受攻毒之陰性對照組(第3組)以證明在整個研究期間源畜群無PRRS感染且維持生物安全性。 有效測試之準則 購買前及D0血清樣品均要求為PRRS抗體陰性。 自第2組及第3組收集之血清樣品必須無PRRS抗體，直至攻毒之日，且自第3組收集之血清樣品必須無PRRS抗體，直至研究結束，以使研究有效。 主要結果參數 統計學評估之主要功效變數為研究D24時之總肺病變評分。 總肺病變評分： 在收集及記錄資料及樣品後第24天，所有研究之豬根據VRI SOP PRC1027(附錄1，附件8)實施安樂死。每隻豬均根據VRI SOP PRC 1028屍檢。藉由被指定者暴露胸腔且移出肺。研究調查者檢查每組肺，描述注意到之任何宏觀病理學，且確定各肺葉之病理學%。觀察結果及資料記錄在屍檢報告記錄表格上。藉由使用EP規則，測定每隻豬之總肺病變評分。 支持性參數 在第1組與第2組之間分析的其他參數包括疫苗接種後臨床評定、PRRS血清學、疫苗接種後病毒血症、攻毒後臨床觀察、ADWG、直腸溫度及攻毒後肺病毒定量。此等參數作為支持性參數分析且不用作滿足研究目標之主要參數。 臨床評定 藉由研究調查者或被指定者在表7.1中概述之日觀察所有豬之疫苗接種後臨床評定。觀察結果記錄在臨床評定記錄表格上。 PRRS血清學 在表3中概述之日收集靜脈全血。簡言之，自每隻仔豬收集約2-5 mL血液至適當尺寸之血清分離管(SST)中。樣品收集記錄在樣品收集記錄表格上。讓SST中之血液在室溫下凝結。血液樣品於收集當天傳遞至BIVI-Ames且完成樣品傳遞記錄表格。血液樣品藉由BIVI-Ames短暫離心，且收穫血清，分離且轉移至適當管中。每個管標記上小母豬之ID號、研究編號、收集日期、研究天數及樣品類型。在BIVI-Ames，一組血清樣品保存在2-8℃下且其他組之血清樣品保存在-70±10℃下。 藉由BIVI-Ames測試在第0、7、14、17、21及24天收集且保存在2-8℃下之血清樣品的PRRS抗體。結果報導為陰性(ELISA S/P比率<0.4)或陽性(ELISA S/P比率0.4)。 PRRS病毒血症 其他組之血清樣品在第0、7、14、17、21及24天收集且在BIVI-Ames保存在-70±10℃下，直至研究之存活期結束。 裝運包括完成之樣品傳遞記錄表格。bioScreen藉由qPCR測試血清樣品之PRRSv RNA。結果報導為基因組當量/毫升(log GE/mL)。 攻毒後臨床觀察 在表7.1中概述之日觀察仔豬之疾病臨床徵象。藉由研究調查者或被指定者進行觀察且記錄在臨床觀察記錄表格上。基於下表7.8中概述之臨床觀察評分系統，每天觀察仔豬之呼吸、行為及咳嗽。 平均日增重(ADWG) 在表3中概述之日收集個別體重。研究調查者或被指定者在校準天平上稱重每隻豬。結果以kg報導於體重記錄表格上。測定D0至D14及D14至D24之平均日增重。 直腸溫度 直腸溫度藉由研究調查者或被指定者在表6.1中概述之日收集。直腸溫度以℃記錄在臨床觀察記錄表格上。 肺組織中之PRRS病毒定量 對於各組肺，保留來自左及右頂葉、左及右心葉、左及右隔葉及中葉之兩個樣品。每個肺樣品為約1吋(2.54 cm)×1吋(2.54 cm)。對於一組肺樣品，所有來自左側之三個樣品組合在一個容器中；而所有三個來自右側之樣品及中間肺葉樣品組合在另一容器中。每一容器填充足夠量之10%甲醛溶液。對於其他組之肺樣品，所有來自左側之三個肺樣品組合在一個Whirlpak®中；而所有三個來自右側之樣品及中間肺葉樣品組合在另一Whirlpak®中。所有容器及Whirlpaks®均適當標記有動物編號、研究編號、收集日期、研究天數、樣品類型及樣品來自左側抑或右側。Whirlpaks®中之肺樣品儲存於乾冰上，直至運送至BIVI-Ames，而福馬林中之樣品儲存在室溫下。樣品收集記錄在屍檢報告記錄表格上。福馬林固定之肺組織樣品及Whirlpak®肺樣品轉移至BIVI-Ames。每次裝運均包括完成之樣品傳遞記錄表格。 裝運包括完成之樣品傳遞記錄表格。bioScreen藉由qPCR測試肺樣品之PRRSv RNA(附錄1，附件7)。左肺組織進行均質化且測試。右肺組織及中間肺葉樣品進行均質化且測試。對於左及右肺樣品，結果報導為基因組當量/毫升(log GE/mL)。 不良事件 此研究期間未報導有不良事件。 統計學方法 實驗單元 此研究中處理組必須圈養在各別房間以避免PRRSv傳播至未疫苗接種組。因此，房間為實驗單元。然而，出於此分析之目的，忽略由混雜「房間」及「處理」影響所產生之可能偏離，且仔豬用作實驗單元。 隨機化 五十(50)隻仔豬按體重分區(n=5隻仔豬/區塊)。使用Excel中之隨機數函數對每隻豬分配一個隨機數。在每個體重區塊內，豬以分配之隨機數的上升數字次序排列。接著以此數字次序分配處理組給豬：兩個最低隨機數分配給第1組，隨後2個數字分配給第2組且最高數字分配給第3組。第1組及第2組各含有20隻豬且第3組含有10隻豬。 分析 統計分析及資料概述由Dr.rer.hort.Martin Vanselow,Biometrie & Statistik,Zum Siemenshop 21,30539 Hannover,Germany,+49(0)511 606 777 650,m.vanselow@t-online.de進行。 採取完全隨機設計結構，分析資料。統計分析使用SAS軟體版本8.2(SAS,Cary,USA/North Carolina,SAS Institute Inc.)進行。所有關於差異之測試均設計為α=5%之雙側檢驗。 總肺病變評分： 屍檢之日(D24)之總肺病變評分量測為根據起草之專題論文豬地方流行性肺炎疫苗(不活化)中推薦之加權公式計算的肺受累百分比。此公式考慮七個肺葉各自之相對重量。所評定之具有典型病變之肺葉區域百分比乘以每個肺葉之各別因子，得到總的加權肺病變評分。各別肺葉之因子呈現於表7.9中。 使用魏氏-曼-惠特尼檢驗比較處理組之差異。 疫苗接種後臨床評估 產生在D1與D12之間具有至少一個陽性發現結果之動物的頻率表。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗測試。 PRRS血清學 產生陽性ELISA結果之頻率表。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗測試。 PRRS病毒血症 分別評估研究每一天之病毒血症資料。另外，分析D14與D24之間(AUC D14-D24)及D17與D24之間(AUC D17-D24)病毒負荷的個別反應曲線下面積。 定量PCR資料(PRRS病毒負荷[log10 GE/mL])用於藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗在處理組之間進行比較。在計算之前，分析結果『未偵測』替換為0.0之log10 GE/mL值，且『陽性』替換為3.0。使用魏氏-曼-惠特尼檢驗測試處理組之差異。 攻毒後臨床觀察 產生在D15與D24之間具有至少一個陽性發現結果之動物的頻率表。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗測試。 D15至D24每隻動物之呼吸、行為、咳嗽及所有三者加在一起(總)的最大評分及平均評分用於統計學評估。藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗測試處理組之間的差異。 體重及平均日增重 計算D0與D14之間及D14與D24之間的時間段之個別日增重。對於研究每一天及每個時間段，計算描述性統計學。處理組之間的差異使用變異數分析及後續t檢驗測試。該等組之最小平方平均值及具有95%信賴區間之最小平方平均值之間的差異由變異數分析計算。 直腸溫度 處理組之間關於初始溫度資料的差異使用變異數分析及後續t檢驗測試。該等組之最小平方平均值及具有95%信賴區間之最小平方平均值之間的差異由變異數分析計算。 肺組織中之PRRS病毒定量 來自D24時收集之肺的定量PCR資料(PRRS病毒負荷[log10 GE/mL])用於藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗在處理組之間進行比較。左肺及右肺qPCR結果之平均值(log10 GE/mL)用於評估。在計算之前，分析結果『未偵測』替換為0.0之log10 GE/mL值，且『陽性』替換為3.0。 產生陽性qPCR結果之頻率表。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗測試。 結果 總肺病變評分 組中總肺病變評分及相關p值之概述展示於下表7.10中。 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照之平均仔豬D24總肺病變評分分別為27.368%及54.841%。PRRS接種豬之病變評分顯著低於攻毒對照之平均病變評分(p=0.0002)。 PRRS病毒血症 藉由qPCR資料在血清中偵測到之PRRSv RNA之概述展示於下表7.11中。 D0時，在任何仔豬之血清中均未偵測到PRRSv RNA。PRRS 94881 MLV接種豬在D7及D14時之平均值分別為3.17及3.30 log10 GE/mL。在此兩天值顯著高於攻毒對照(p<0.0001)，因為攻毒對照直至D17才偵測到PRRSv RNA。該天，PRRS 94881 MLV接種仔豬及攻毒對照之平均值分別為6.78及8.00 log10 GE/mL。攻毒對照之D17值顯著高於PRRS 94881 MLV接種仔豬(p<0.0001)。D21及D24時，與攻毒對照在D21及D24之平均值為7.88及7.34 log10 GE/mL相比，PRRS 94881 MLV接種豬在相同日之平均值分別為7.51及7.26 log10 GE/mL。D21或24時，PRRS 94881 MLV接種豬之間無顯著差異(p0.0565)。在此研究期間在來自任何陰性對照豬之血清中未偵測到PRRSv RNA。 在PRRS 94881 MLV接種豬與攻毒對照豬之間AUC 14-24無差異(分別為65.84及66.61；p=0.4945)。D17-D24 PRRS 94881 MLV接種豬之AUC顯著低於攻毒對照(分別為50.72及54.61；p=0.0039)。 肺組織中之PRRS病毒定量 來自D24屍檢時收集之肺組織的個別PRRSv qPCR結果呈現於附錄1表30中。藉由qPCR資料在肺組織中偵測到之PRRSv RNA之概述展示於下文呈現之表7.12中，且屍檢時具有陽性qPCR之動物之頻率的概述展示於下表7.13中。 在PRRS 94881 MLV接種組之所有仔豬及攻毒對照組之所有仔豬的肺組織中均偵測到PRRSv RNA。此等組之間無差異。在任何陰性對照仔豬之肺樣品中均未偵測到PRRSv RNA。 攻毒後臨床觀察 攻毒後時期內(D15-D24)具有至少一個陽性臨床評定評分之仔豬之頻率展示於下表7.14中。 在PRRS 94881 MLV接種組(10%)及攻毒對照組(30%)中觀察到異常呼吸，然而，此等值無顯著差異(p=0.2351)。 僅僅在攻毒對照組(45%)中觀察到異常行為，而在PRRS 94881 MLV接種組(0%)中未觀察到。PRRS 94881 MLV接種組之異常行為發生率顯著低於攻毒對照組(p=0.0012)。 在PRRS 94881 MLV接種組(30%)與攻毒對照組(55%)中均觀察到咳嗽。此等值無顯著差異(p=0.2003)。 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組的總臨床評分>0之仔豬之百分比分別為30%及65%。此等值無顯著差異(p=0.0562)。 在攻毒後任何時候均未在陰性對照組中觀察到臨床徵象。 組中攻毒後時期(D15至D24)之最大臨床觀察評分之概述展示於下表7.15中。 投與攻毒後，在PRRS 94881 MLV接種組與攻毒對照組中均觀察到異常呼吸，最大評分分別為1(喘息/呼吸迅速)及2(呼吸困難)。此等呼吸評分之間無顯著差異(p=0.1872)。兩組之中值最大呼吸評分為0。 在攻毒後時間內在PRRS 94881 MLV接種組中未觀察到異常行為(最大評分=0)。相比之下，攻毒對照組之最大行為評分為1(輕度至中度昏睡；p=0.0012)，不過此組之中值評分為0。PRRS 94881 MLV接種組之最大評分顯著低於攻毒對照組之評分(p=0.0012)。兩組之中值最大行為評分均為0。 攻毒後在PRRS 94881 MLV接種組與攻毒對照組中均觀察到咳嗽。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之最大評分分別為1(輕柔或間歇咳嗽)及2(劇烈或嚴重反覆咳嗽)，且中值評分分別為0及1。此等組之間無顯著差異(p=0.1129)。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之中值最大咳嗽評分分別為0及1。 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之最大總評分分別為1及4，且中值總評分分別為0及1。PRRS 94881 MLV接種組之最大評分顯著低於攻毒對照組之評分(p=0.0072)。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之中值總評分分別為0及1。 在此研究期間在未受攻毒之陰性對照組中D15至D24未觀察到臨床徵象。此組各參數之最大評分為0。 組中攻毒後時期(D15至D24)之平均臨床觀察評分之概述展示於下表7.16中。 平均臨床觀察評分遵循類似於最大臨床評分之模式，其中僅在PRRS 94881 MLV接種組與攻毒對照組之間觀察到平均行為評分(p=0.0012)及平均總評分(p=0.0103)有顯著差異。 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之平均呼吸評分分別為0.02及0.07。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之平均行為評分分別為0.00及0.12。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之平均咳嗽評分分別為0.07及0.17。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之平均總評分分別為0.08及0.35。 在此研究期間在未受攻毒之陰性對照組中在D15至D24未觀察到臨床徵象。此組各參數之平均評分為0。 體重及平均日增重 D0、D14及D24時之體重以及D0至D14及D14至D24之ADWG的概述展示於下表7.17中。 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組D0時之平均體重分別為4.1及4.2 kg。D14時，PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之平均體重分別為7.6及7.4 kg。D24時，PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之平均體重分別為10.3及8.9 kg。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之疫苗接種期(D0至D14)之平均日增重分別為0.25及0.23 kg/d。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之攻毒期(D14至D24)之ADWG分別為0.26及0.15 kg/d。陰性對照組D0-D14及D14-D24之ADWG分別為0.23及0.34 kg/d。 陰性對照仔豬在D0、D14及D28時之平均體重分別為4.1、7.2及10.6 kg。 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之體重及ADWG之LS平均值及統計分析的概述展示於下表7.18中。 PRRS 94881 MLV接種仔豬及攻毒對照組之第0天LS平均體重分別為4.14及4.17 kg。差值為-0.03 kg，無顯著差異(p=0.8743)。D14時，PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之LS平均體重分別為7.64及7.39 kg。差值為0.25 kg，亦無顯著差異(p=0.4297)。D24時，PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之LS平均體重分別為10.26及8.87。該天之差值為1.39 kg，且疫苗接種組體重顯著高於攻毒對照組(p=0.0063)。 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之疫苗接種期(D0至D14)之LS平均ADWG分別為0.25及0.23 kg/d。此等值無顯著差異(p=0.1889)。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之攻毒後時期內(D14至D24)之LS平均ADWG分別為0.26及0.15。PRRS 94881 MLV接種組之ADWG顯著高於攻毒對照組之ADWG(p=0.0003)。 直腸溫度 直腸溫度之概述展示於下表7.19及7.20中。PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之直腸溫度之LS平均值及統計分析的概述展示於下表7.21及7.22中。 在攻毒前一天，PRRS 94881 MLV接種仔豬之平均及LS平均直腸溫度為39.77℃，且在攻毒後在39.69℃(D15)至40.68℃(D16)之範圍內。在攻毒前一天，攻毒對照之平均及LS平均直腸溫度為39.39℃，且在攻毒後在39.77℃(D16)至40.61℃(D20)之範圍內。在投與攻毒之前(D13及D14)及在攻毒後D16時，攻毒對照之最小平方平均直腸溫度顯著低於PPRS 94881 MLV接種仔豬(p<0.0001)。此研究中PRRS 94881 MLV接種豬與攻毒對照之間直腸溫度無其他顯著差異(p0.0528)。陰性對照組之平均及LS平均直腸溫度在整個研究期間保持39.68℃。 疫苗接種後臨床評定 D1至D12具有至少一個陽性評定之仔豬之百分比的概述展示於下表7.23中。 在疫苗接種期D-1至D12期間PRRS 94881 MLV接種組或陰性對照組中無仔豬具有任何臨床評定發現結果。觀察到攻毒對照組中仔豬110在右前腿後面具有潰瘍，始於D9。在PRRS 94881 MLV接種仔豬與攻毒對照之間此參數無顯著差異(p=1.0000)。 PRRS血清學 具有陽性PRRS抗體力價之仔豬之頻率的概述展示於下表7.24中。 所有處理組中之所有仔豬在D0及D7時均為PRRS抗體陰性。至D14時，85% PRRS 94881 MLV接種豬具有陽性PRRS抗體力價。D17時，此數值增至95%，且D21及D24時均為100%。攻毒對照組中無豬發展陽性PRRS抗體力價，直至D21(投與攻毒後7天)，此時55%豬具有陽性力價。至D24時，此值增至95%。D14、D17及D21時，PRRS 94881 MLV接種豬之具有陽性PRRS抗體力價之豬的比例顯著高於攻毒對照組(p 0.0012)。在此研究期間陰性對照組中無豬發展PRRS抗體力價。 討論/結論 為達成研究目標，D0時，研究設計中包括三個組：接收1×103.82 TCID50 PRRS 94881 MLV之疫苗組(第1組)；接收對照產品之攻毒對照組(第2組)及亦接收對照產品之陰性對照組(第3組)。 二十(20)隻健康、PRRS易感染且血清陰性仔豬在約14日齡用1 ml PRRS 94881 MLV經肌肉內接種。30隻(20隻仔豬-攻毒對照組及10隻仔豬-陰性對照組)PRRS易感染且血清陰性仔豬在約14日齡用1 ml對照產品經肌肉內接種。 為確定是否達成PRRS 94881 MLV之2週免疫力產生，疫苗組及攻毒對照組在疫苗接種後14天用異源性歐洲型PRRSv分離株(分離株205817)攻毒且評估攻毒後肺病變之相關降低。 研究之驗證(陰性對照組3) 為確保源仔豬無PRRSv且研究期間在處理組及對照組中未發生外來PRRSv暴露或交叉污染，研究設計中包括陰性對照組(第3組)。在整個研究期間，陰性對照組中之仔豬為PRRSv陰性(病毒血症；qPCR)以及PRRS抗體陰性，因此驗證此試驗。 攻毒模型之驗證(攻毒對照組2) 需要誘發足夠PRRS臨床疾病之攻毒模型來充分評估實驗室環境下之PRRS疫苗免疫力產生。藉由早先描述之方法用歐洲型PRRS分離株205817接種後，攻毒對照組顯示D19、D20、D23及D24時之平均直腸溫度40.50℃(同日陰性對照組39.68℃)，與陰性對照組之D14至D24平均ADWG為0.34公斤/天相比，平均ADWG為0.15公斤/天，異常行為、咳嗽及中值肺病變評分為55.2%(0.00%；陰性對照組)。此等結果突出即使攻毒病毒力價略低於目標劑量，在攻毒對照組中亦能誘發嚴重的PRRS特異性臨床疾病，因此驗證此攻毒模型為足以評估PRRS疫苗功效及更特定言之PRRS 94881 MLV之OOI的臨床實驗工具。 確定PRRS 94881 MLV(第1組)之兩週免疫力產生 疫苗接種後2週之PRRS 94881 MLV之免疫力產生(OOI)的確定係基於疫苗組顯示與攻毒對照組相比，攻毒後肺病變顯著(p0.05)降低。 肺病變被選為確定2週OOI之主要參數，因為在豬中之PRRS呼吸攻毒模型內評估新疫苗時，此參數提供功效之最臨床相關且令人信服之證據。肺病變發展為豬中PRRS呼吸疾病之標誌之一。肺病變通常伴有後續顯現繼發性PRRSv疾病特徵，諸如臨床徵象、發熱、降低之ADWG等。 PRRS 94881 MLV接種組顯示攻毒後總體肺病變顯著減少，如與顯示中值總肺病變評分為55.2%之攻毒對照組相比，中值總肺病變評分為27.6%(p=0.0002)所證明。因此，基於攻毒後肺病變顯著減少之主要參數，確定在1×103.82 TCID50之劑量下PRRS 94881 MLV之2週OOI。此結果由略低於每一劑1×104.5 TCID50之最小免疫劑量的疫苗劑量達成。 攻毒後病毒血症被選為最重要的二次參數，因為其代表在暴露後宿主動物內發生之病毒複製程度及持久性。病毒血症顯著(p0.05)降低符合誘發足夠免疫力以在宿主內限制PRRS發病機制之PRRS疫苗。在攻毒後3天(D17)，PRRS 94881 MLV接種組與攻毒對照組相比中值病毒血症(qPCR)顯著減少(6.72 GE/mL對8.18 GE/mL；p 0.0001)。為在組之間進一步評估攻毒後病毒血症，計算攻毒後特定持續時間內病毒負荷之量，表示為「曲線下面積」或AUC。PRRS 94881 MLV接種組D17至D24之中值AUC值為每天49.52 GE/mL；而攻毒對照組之中值AUC值為每天54.35 GE/mL。與攻毒對照組相比，疫苗組之D17至D24中值AUC值顯著較低(p=0.0039)。無論在攻毒後3天抑或在攻毒後過程中檢查病毒血症，在用毒性異源性歐洲型PRRS株攻毒之前2週投與的PRRS 94881 MLV均在攻毒接種後降低病毒血症。 結合攻毒後PRRS病毒血症減少，根據PRRS疫苗免疫力觀點，肺組織中病毒負荷顯著(p0.05)降低亦具有重大意義。肺組織中病毒負荷降低可能與宿主內病毒穩定性、複製及持久性降低相關且繼而可使PRRSv至其他豬之流動減少。此研究中，來自PRRS 94881 MLV接種組之肺組織在攻毒後10天(D24)的中值肺qPCR結果為7.46 log10 GE/mL，而攻毒對照組之中值肺qPCR結果為7.88 log10 GE/mL。疫苗組與攻毒對照組之間的差異顯著(p=0.0101)，因此進一步支持2週之OOI。 仔豬中攻毒後臨床徵象之嚴重程度及頻率明顯降低亦支持PRRS疫苗功效及PRRS 94881 MLV之2週OOI之確定。在攻毒後任一組中均未注意到足夠嚴重程度及頻率之異常呼吸且未偵測到差異(p0.1394)。相反，咳嗽之嚴重程度及頻率在組之間大致相等，且未偵測到差異(p0.0835)。在組之間偵測到攻毒後異常行為(昏睡)之嚴重程度及頻率有差異。分別20隻中0隻(0%)及20隻中9隻(45%)之PRRS 94881 MLV接種及攻毒對照仔豬顯示攻毒後至少一天之異常行為(p=0.0012)。同樣，與攻毒對照組相比，PRRS 94881 MLV接種組顯示攻毒後最大異常臨床評分及平均異常臨床較低(p=0.0012)。當分析D15至D24之最大評分及平均評分時，組之間總臨床評分(呼吸、行為及咳嗽評分之總和)有顯著差異。由於異常行為評分對總評分有影響，所以與攻毒對照組相比，PRRS 94881 MLV接種組之最大總評分顯著較低且平均總評分較低(p 0.0103)。組之間異常行為之嚴重程度及頻率的差異進一步支持疫苗接種後2週之OOI。 攻毒前，PRRS 94881 MLV接種組與攻毒對照組相比，D13時(分別為39.77℃對39.39℃；p<0.0001)及D14時(分別為39.76℃對39.37℃；p<0.0001)平均直腸溫度略高。雖然攻毒前在組之間偵測到顯著(p0.05)差異，但此等差異非生物學上相關。攻毒後，在組之間偵測到平均直腸溫度顯著(p0.05)差異之唯一一天為D16(攻毒後2天)。D16時，疫苗接種及攻毒對照組之平均直腸溫度分別為40.68℃及39.77℃，且組之間的差異顯著(p<0.0001)。攻毒後4-5天平均直腸溫度升高至40℃以上且保持在40℃以上，直至兩組之研究結束。 攻毒對照組中由PRRS引起之顯著異常行為、病毒血症、肺病變及肺組織中病毒負荷的存在導致組之間攻毒後ADWG之差異顯著(p0.05)。在此研究中，疫苗接種及攻毒對照組之D14至D24平均ADWG分別為0.3公斤/天及0.1公斤/天，且組之間的差異顯著(p=0.0003)。組之間攻毒後ADWG之顯著(p0.05)差異進一步支持疫苗接種後2週之OOI的確立。 此研究中檢查之疫苗接種後參數 在D0時接種後，在仔豬中未觀察到與PRRS 94881 MLV接種或對照產品相關之異常臨床評定。一隻攻毒對照仔豬顯示右前腿後面有潰瘍，始於D9，其似乎與投與對照產品無關聯。 所有仔豬在D0時均為PRRS ELISA血清學陰性，因此證實所有仔豬在進入研究時符合PRRS陰性之入選準則。接收PRRS 94881 MLV之大部分仔豬在D14時發生PRRS血清轉變，且所有PRRS接種仔豬在攻毒後7天(D21)為血清陽性。相反，攻毒對照保持血清陰性直至攻毒後7天，此時此組開始顯示PRRS血清轉變。陰性對照組在整個研究期間保持PRRS血清陰性。 在疫苗接種後7及14天，PRRS 94881 MLV接種組顯示平均qPCR結果分別為3.17及3.30 log10 GE/mL。此等結果突出在疫苗接種後2週內，1×103.82 TCID50劑量之PRRS 94881 MLV誘發通常為在疫苗接種後2週建立保護性免疫力所需的MLV充分複製。相反，D0至D14時攻毒對照組及陰性對照組為PRRSv病毒血症陰性。 結論 攻毒後肺病變、臨床徵象、血液及肺中病毒複製顯著(p0.05)減少以及生長效能改良支持在約14日齡仔豬中用單一劑量PRRS 94881 MLV以1×103.82 TCID50/mL接種後2週OOI之確立。 實例8評估兩週齡易感染豬中在疫苗接種後26週用異源性歐洲型PRRS分離株攻毒後PRRS 94881 MLV之免疫力持續時間 此疫苗接種-攻毒研究之目標為評估在候選疫苗豬生殖與呼吸症候群歐洲來源分離株94881修飾活病毒(PRRS 94881 MLV)投與14±3日齡PRRS血清陰性豬後26週之免疫力持續時間(DOI)。滿足疫苗接種後26週之DOI的主要功效準則為與攻毒對照組(第2組)相比，PRRS 94881 MLV接種組(第1組)中攻毒後肺病變評分(總體或組織學)顯著減少(p0.05)。 在第0天(D0)，22隻分配至疫苗接種組之豬經肌肉內接收1.0 mL IM PRRS 94881 MLV(1×104.27 TCID50)(第1組)，22隻分配至攻毒對照組之豬接收1.0 mL IM對照產品(無PRRS 94881 MLV之安慰劑匹配產品，第2組)，且12隻分配至陰性對照組之豬亦接收1.0 mL IM對照產品(第3組)。第1組及第2組在D179(攻毒後第0天{DPC 0})用歐洲型PRRSV毒性株攻毒且攻毒後10天監測豬之臨床徵象、平均日增重及病毒血症。豬在D189(DPC 10)進行屍檢且測定總體及組織學肺病變及肺病毒負荷。 PRRS 94881 MLV接種豬及攻毒對照在D189(DPC 10)時之中值總體肺病變評分分別為0.1%及13.8%(p<0.0001)。PRRS 94881 MLV接種豬及攻毒對照在DPC 10時之中值組織學肺病變評分分別為6.0及19.5(p<0.0001)。與攻毒對照相比，PRRS 94881 MLV接種豬在攻毒後3、7及10天具有顯著較低之血清病毒負荷(p 0.0001)。PRRS 94881 MLV接種豬(分別為每天15.54及8.88 log10 GE/mL)在DPC 0至DPC 10及DPC 3至DPC 10之病毒血症攻毒後曲線下面積(AUC)分析亦顯著低於攻毒對照組(分別為每天44.77及36.43 log10 GE/mL，p<0.0001)。PRRS 94881 MLV接種豬及攻毒對照的屍檢時收集之肺組織之中值qPCR值分別為3.69及6.25 log10 GE/mL(p<0.0001)。攻毒後臨床徵象無顯著差異(p0.4878)。 與攻毒對照相比，PRRS 94881 MLV接種豬之總體及組織學肺病變、屍檢時收集之肺組織中之病毒負荷及攻毒後病毒血症的顯著減少(p0.05)支持在疫苗接種後26週攻毒時疫苗對毒性PRRSv之功效。此研究之結果確定在2週齡用PRRS 94881 MLV接種之豬中接種後26週之免疫力持續時間。此等結果用1×104.27 TCID50/mL之疫苗劑量達成，此疫苗劑量略低於此研究性獸醫產品之最小免疫劑量(1×104.5 TCID50/mL)。 研究之目標/目的 此疫苗接種-攻毒研究之目標為評估豬生殖與呼吸症候群歐洲來源分離株94881修飾活病毒代碼19S1.U(PRRS 94881 MLV)投與14±3日齡之PRRS血清陰性豬以對抗異源性歐洲型PRRS分離株在疫苗接種後26週之毒性攻毒的免疫力持續時間(DOI)。滿足疫苗接種後26週之DOI的主要功效準則為與攻毒對照組(第2組)相比，PRRS 94881 MLV接種組(第1組)中攻毒後肺病變評分(總體或組織學)顯著減少(p0.05)。 二次功效參數包括疫苗接種後及攻毒後病毒血症、疫苗接種後臨床評定、PRRS血清學、攻毒後臨床觀察、平均日增重(ADWG)、直腸溫度及肺PRRSv定量。攻毒後病毒血症視為最重要的二次參數，因為其為客觀且可定量之參數。接著認為直腸溫度及臨床觀察在DOI界定過程中為支持性參數。最後，生長效能、血清學及肺中病毒偵測用作在滿足研究目標方面支持主要參數之支持性參數。 事件時程 研究設計 此為在56隻在第0天(D0)14±3三日齡之斷乳PRRS血清陰性豬中進行的盲法疫苗接種-攻毒功效研究。研究之概述提供於表8.2中。 盲法準則 研究調查者及被指定者在研究之整個存活期期間對分配之處理組不知情。為維持此不知情，BIVI監測者進行隨機化且未參與豬評定(亦即臨床評定、臨床觀察或屍檢)之個體在D0時投與分配之IVP及CP處理。BIVI實驗室工作人員在進行其各別任務時對每隻豬接收之處理不知情。 材料 研究性獸醫產品(IVP)及對照產品(CP) 攻毒材料 處理 給藥合理性判斷 IVP以1.0 mL劑量投與所分配之豬以評估疫苗接種後26週之PRRS 94881 MLV之DOI。CP作為安慰劑疫苗以1.0 mL劑量投與第2組及第3組。 給藥方案 D0時，藉由非研究資料收集者，使用無菌3.0 mL Luer-lock注射器及無菌20 g×1吋(2.54 cm)針將IVP或CP經肌肉內投與分配豬之右頸區。給藥方案展示於下表8.6中。 伴隨處理 由於發現若干隻豬在研究初期在細菌性感染後死亡，所以調查者及研究監測者一致同意向所有研究動物投與以下額外的伴隨處理(部分15.10)：第20天：Mu-Se®(維生素E/硒，Intervet/Schering Plough Animal Health(USA))，0.1 mL經肌肉內投與右大腿中第21天：EXCEDE®(頭孢噻呋(Ceftiofur),Pfizer Animal Health,USA)，0.5 mL投與左大腿中第35天：EXCEDE®(頭孢噻呋，Pfizer Animal Health,USA)，1.0 mL投與右大腿中第42天：EXCEDE®(頭孢噻呋，Pfizer Animal Health,USA)，1.0 mL投與左大腿中第47天：BAYTRIL 100®(恩諾沙星(Enrofloxacin),Bayer Animal Health,USA)，1.5 mL皮下投與左頸中 投與維生素E/硒以預防桑椹心臟病，且投與抗生素處理以治療/預防細菌性感染。 動物資訊 動物研究之詳情 入選/排除準則 所有參加此研究之豬均為PRRS ELISA陰性(ELISA S/P比率<0.4)且在疫苗接種時(D0)如藉由觀察結果確定為健康的。 入選後之移除準則 無豬自研究移除。在投與攻毒前發現三隻豬死亡。關於此三隻豬之進一步結果呈現於部分12.8中。 動物管理及圈養 在整個研究期間豬圈養在Veterinary Resources,Inc.(VRI)(Cambridge,IA)。豬圈養在每個房間內之多個圍欄(11或12隻豬/圍欄)中，其中疫苗接種(第1組)及對照動物(第2組及第3組)圈養在相同但獨立之房間中以確保生物安全性。PRRS 94881 MLV豬圈養在房間CB8中，直至D78，接著圈養在CC1中，直至D105，接著研究其餘時間圈養在CC3中。在整個研究中，攻毒對照豬均圈養在房間CC2中。陰性對照豬圈養在房間CB6中，直至D73，接著研究其餘時間圈養在CB7中。動物圍欄用塑膠條縫地板升高，具有使用期適當之餵料器及噴管杯式飲水器。每個隔離室均與其他隔離室一樣構築，且均符合生物危害水準2(BL2)，經hepafilter過濾，在恆溫器調節之溫度控制下機械通風。 此研究中需要隔離處理組，因為科學界熟知PRRSv容易經由各種機制(包括氣溶膠化)在豬之間傳播。其包括無毒性活PRRS疫苗，因為此等生物產品包括模擬毒性野生型PRRS之特徵而無引起疾病能力之減毒病毒粒子。適當方法宜為確保維持生物安全性且疫苗接種動物未意外地交叉污染未疫苗接種之PRRSv未處理陰性對照動物。 藉由測試實驗室工作人員採取適當措施，以在每個房間用於研究之前充分清潔及消毒。 實驗室中之每個房間均具有風扇及加熱器以促進充分的空氣循環及加熱。每個房間之通風系統獨立而相同，因此房間之間空氣不共享。 飼料儲存於袋中，無害蟲。飼料及水隨意獲得。自到達起，豬進食Lean Metrics嬰兒期加藥飼料(Purina Mills LLC,St.Louis,MO)，至D5時，其換成Lean Metrics年長期加藥飼料(Purina Mills LLC,St.Louis,MO)。D64時，豬換成Lean Metrics Complete 85飼料(Purina Mills LLC,St.Louis,MO)，且D82時，其換成Lean Metrics Complete CE85,T40(Purina Mills LLC,St.Louis,MO)，研究其餘時間其均進食此飼料。在整個研究期間，根據該地區可接受之畜牧業慣例，所提供之飼料適於豬之體型、年齡及情況。 如研究調查者所確定，在開始研究之前，小母豬處於良好健康及營養狀態中。在研究期間，觀察到所選動物有其他情況，包括瘦弱、咳嗽、腫脹、毛皮粗糙、抑鬱、膿腫及體況不良。研究調查者認為所有此等情況均為分群圈養生長/成熟豬之特徵。認為此等情況為暫時或無關緊要的，且不加處理。 有效性評定 為評定疫苗接種後26週之PRRS 94881 MLV之DOI，PRRS 94881 MLV及攻毒對照組在D179(DPC 0)受攻毒，且10天後(DPC 10)評估攻毒後肺病變。若PRRS 94881 MLV組與攻毒對照組相比，攻毒後肺病變(總體或組織學)顯著降低(p0.05)，則達成疫苗接種後26週之DOI。 在疫苗組與攻毒對照組之間分析的二次功效參數包括疫苗接種後及攻毒後病毒血症、攻毒後臨床觀察、攻毒後直腸溫度、疫苗接種後臨床評定、平均日增重(ADWG)及PRRS血清學。攻毒後病毒血症視為最重要的二次參數，因為其為客觀且可定量之參數。接著認為直腸溫度及臨床觀察在DOI界定過程中為支持性參數。最後，生長效能、血清學及肺中病毒偵測用作在滿足研究目標方面支持主要參數之支持性參數。 有效測試之準則 要求所有豬在購買前篩檢時及D0時均為PRRS ELISA陰性(ELISA S/P比率<0.4)。要求攻毒對照豬為PRRS抗體陰性，直至攻毒，且要求陰性對照組在整個研究期間均為PRRS抗體陰性。 主要結果參數 主要功效結果變數為研究D189(DPC 10)時的肺病變(總體及組織學病變)。 總體肺病變評分： D189時，在收集及記錄樣品及資料後，遵循VRI SOP PRC1027(部分15.1)對所有剩餘研究豬實施安樂死。每隻豬根據VRI SOP PRC 1028(部分15.1)進行屍檢。藉由被指定者暴露每隻豬之胸腔且移出肺。研究調查者檢查每組肺，描述任何宏觀病理學，且確定各肺葉之病理學%。觀察結果及資料記錄在屍檢報告記錄表格上。 組織學肺病變評分 對於各組肺，保留來自左及右頂葉、左及右心葉、左及右隔葉及中葉之兩個樣品。每個肺樣品為約1吋(2.54 cm)×1吋(2.54 cm)。對於一組肺樣品，所有來自左側之三個樣品組合在一個容器中；而所有三個來自右側之樣品及中間肺葉樣品組合在另一容器中。每一容器填充足夠量之10%甲醛溶液。對於其他組之肺樣品，所有來自左側之三個肺樣品組合在一個Whirlpak®中；而所有三個來自右側之樣品及中間肺葉樣品組合在另一Whirlpak®中。所有容器及Whirlpaks®均適當標記有動物編號、研究編號、收集日期、研究天數、樣品類型及樣品來自左側抑或右側。福馬林中之肺樣品儲存在室溫下，而Whirlpaks®中之肺樣品儲存在乾冰上，直至運送至BIVI-Ames。樣品收集記錄在屍檢報告記錄表格上。福馬林固定之肺組織樣品及Whirlpak®肺樣品轉移至BIVI-Ames。每次裝運均包括完成之樣品傳遞記錄表格。 福馬林固定之肺組織樣品由BIVI-Ames保存在室溫下，直至由BIVI-Ames呈遞至愛荷華州立大學獸醫學診斷實驗室(Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory，ISU VDL)。肺樣品藉由ISU VDL工作人員根據ISU VDL程序在屍檢一週內處置及處理。每隻豬產生含有7個切片(所有7個肺葉各一片)之單一載片。每個H & E載片均用唯一標識代碼鑑別。ISU VDL提供含有研究編號、標識代碼及相關豬組織之電腦記錄。 每日一次，在讀取研究載片之組織病理學之日，ISU VDL病理學家(K.Schwartz)首先讀取EU PRRS陽性及陰性對照載片。之後，病理學家讀取H & E染色肺載片之肺細胞過度生長及增生、單核細胞之隔膜浸潤、壞死性碎片、發炎細胞之肺泡內積累及發炎細胞之血管周積累。結果記錄在Excel試算表中。肺組織病理學評分系統展示於下表8.8中。 完成所有載片之讀取後，載片返回至主辦代理人，且在完成最終報告後存檔於Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc.(St.Joseph,MO)。 二次參數 二次變數包括疫苗接種後及攻毒後病毒血症、攻毒後臨床觀察、攻毒後直腸溫度、平均日增重(ADWG)、肺PRRSv定量、疫苗接種後臨床評定及PRRS血清學。 血清PRRS qPCR 靜脈全血在購買前及第0、7、14、21、28、56、84、112、140、168、179(DPC 0)、182(DPC 3)、186(DPC 7)及189(DPC 10)天收集。簡言之，自每隻豬收集約2-5 mL血液至適當尺寸之血清分離管(SST)中。樣品收集記錄在樣品收集記錄表格上。讓SST中之血液在室溫下凝結。血液樣品於收集當天傳遞至BIVI-Ames且完成樣品傳遞記錄表格。血液樣品藉由BIVI-Ames短暫離心，且收穫血清，分離且轉移至適當管中。每個管標記上豬之ID號、研究編號、收集日期、研究天數及樣品類型。在BIVI-Ames，一組血清樣品保存在2-8℃下且其他組之血清樣品保存在-70±10℃下。 攻毒後臨床觀察 觀察D178(DPC-1)至D189(DPC 10)豬之疾病臨床徵象。藉由研究調查者或被指定者進行觀察且記錄在臨床觀察記錄表格上。基於下表8.9中概述之臨床觀察評分系統，每天觀察豬之呼吸、行為及咳嗽。 直腸溫度 藉由研究調查者或被指定者收集D178(DPC-1)至D189(DPC 10)之直腸溫度。直腸溫度以單位℃記錄在臨床觀察記錄表格上。 體重及平均日增重 D0、D179(DPC 0)及D188(DPC 9)時，收集個別體重。研究調查者或被指定者在校準天平上稱重每隻豬。結果以單位kg記錄在體重記錄表格上。測定D179(DPC 0)至D188(DPC 9)之平均日增重。 肺PRRS qPCR Whirlpaks®中之肺組織樣品在BIVI-Ames保存在-70±10℃下，直至裝運至部分9.3.1中所列之地址。裝運包括完成之樣品傳遞記錄表格。bioScreen藉由qPCR測試肺樣品之PRRSv RNA(部分15.1)。左肺組織進行均質化且測試。右肺組織及中間肺葉樣品進行均質化且測試。對於左及右肺樣品，結果報導為基因組當量/毫升(log10 GE/mL)。藉由統計學家，使用SAS程式，計算每隻豬之右及左GE/mL值之幾何平均力價。 疫苗接種後臨床評定 藉由研究調查者或被指定者觀察所有豬之疫苗接種後臨床評定。D-1至D21每日進行觀察，接著D22至D177一週觀察至少三次。觀察結果記錄在臨床評定記錄表格上。 PRRS血清學 藉由BIVI-Ames測試在購買前及第0、7、14、21、28、56、84、112、140、168、179(DPC 0)、182(DPC 3)、186(DPC 7)及189(DPC 10)天收集之血清樣品的PRRS抗體(部分15.1)。結果報導為陰性(ELISA S/P比率<0.4)或陽性(ELISA S/P比率0.4)。 不良事件 此研究中未注意到歸因於PRRS 94881 MLV之不良事件。 統計方法 實驗單元 此研究中處理組必須圈養在各別房間以避免PRRSv傳播至未疫苗接種組。因此，房間為實驗單元。然而，出於分析之目的，忽略由混雜「房間」及「處理」影響所產生之可能偏離，且豬用作統計單位。 隨機化 五十六(56)隻豬隨機分配至三組之一。由BIVI執行隨機化。在裝運時，挑出第140號及第143號(攻毒對照組)以及第168號(PRRS 94881 MLV組)。自符合入選準則之5隻額外豬之池，隨機選擇第178號替換第140號，隨機選擇第177號替換143，且隨機選擇第179號替換第168號。 分析 統計分析及資料概述由Dr.rer.hort.Martin Vanselow,Biometrie & Statistik,Zum Siemenshop 21,30539 Hannover,Germany,+49(0)511 606 777 650,m.vanselow@t-online.de進行。採取完全隨機設計結構，分析資料。統計分析使用SAS軟體版本8.2或更高版本(SAS,2001,Cary,USA/North Carolina,SAS Institute Inc.)進行。PRRS 94881 MLV豬179及攻毒對照豬124及161在攻毒之前死亡且自攻毒後分析中排除。所有有關差異之測試均設計為α=5%之雙側檢驗。統計學家之報告呈現於部分15.9中。 總體肺病變評分 使用展示於下表8.10中之因子乘以特定肺葉之病理學%，計算每隻豬之總體肺病變評分。使用SAS程式進行計算。 使用魏氏-曼-惠特尼檢驗比較處理組之差異。 組織學肺病變評分 對每個葉及動物，累加肺樣品之個別組織學評分。此總和評分除以每隻動物檢查之葉的數目。結果作為單一值用於處理組之間的比較。使用魏氏-曼-惠特尼檢驗測試處理組之差異。 肺PRRS qPCR 來自D189時收集之肺的定量PCR資料(PRRS病毒負荷[log10 GE/mL])用於藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗在處理組之間進行比較。左肺及右肺qPCR結果之平均值(log10 GE/mL)用於評估。在計算之前，分析結果『未偵測』替換為0.0之log10 GE/mL值，且『陽性』替換為3.0。 產生陽性qPCR結果之頻率表。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗進行測試。 血清PRRS qPCR 分別評估研究每一天之病毒血症資料。另外，分析D179與D189之間(AUC 0-10)及D182與D189之間(AUC 3-10)病毒負荷的個別反應曲線下面積。 定量PCR資料(PRRS病毒負荷[log10 GE/mL])用於藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗在處理組之間進行比較。在計算之前，分析結果『未偵測』替換為0.0之log10 GE/mL值，且『陽性』替換為3.0。使用魏氏-曼-惠特尼檢驗測試處理組之差異。 產生陽性qPCR結果之頻率表。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗進行測試。 攻毒後臨床觀察 產生在D180與D189之間具有至少一個陽性發現結果之動物的頻率表。總評分為呼吸評分+行為評分+咳嗽評分之總和。使用SAS程式進行計算。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗進行測試。 D180至D189每隻動物之呼吸、行為、咳嗽及所有三者加在一起(總)的最大評分及平均評分用於統計學評估。藉由魏氏-曼-惠特尼檢驗測試處理組之間的差異。 體重及平均日增重 計算D179至D188之時期內的個別日增重。對於研究每一天及該時期，計算描述性統計學。處理組之間的差異使用變異數分析及後續t檢驗進行測試。該等組之最小平方平均值及具有95%信賴區間之最小平方平均值之間的差異由變異數分析計算。 直腸溫度 處理組之間關於初始溫度資料的差異使用變異數分析及後續t檢驗進行測試。該等組之最小平方平均值及具有95%信賴區間之最小平方平均值之間的差異由變異數分析計算。 疫苗接種後臨床評定 產生在D1與D21之間具有至少一個陽性發現結果之動物的頻率表。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗進行測試。 PRRS血清學 產生每個時間點陽性ELISA結果之頻率表。處理組之間的差異藉由費希爾精確檢驗測試。 結果 總體肺病變評分 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照D189(DPC 10)時之中值總體肺病變評分分別為0.1%及13.8%。PRRS接種豬之中值總體肺病變評分顯著低於攻毒對照之中值總體肺病變評分(p<0.0001)。陰性對照組之中值總體肺病變評分為0.0%。 第123號(攻毒對照組)由於彌漫性胸膜炎及黏連而無法對D189時之肺病變進行評分。屍檢後，自此豬之肺組織中分離出奧斯陸莫拉菌(Moraxella osloensis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、豬葡萄球菌(Staphyloccous hyicus)及假單胞菌物種。 組中總體肺病變評分及相關p值之概述展示於下表8.11中。 組織學肺病變評分 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照之中值組織學肺病變評分分別為6.0及19.5。PRRS接種組之中值組織學肺病變評分顯著低於攻毒對照之中值組織學肺病變評分(p<0.0001)。陰性對照組之中值組織學肺病變評分為9.0。 組中組織學肺病變評分及相關p值之概述展示於下表8.12中。 肺PRRS qPCR PRRS 94881 MLV接種豬及攻毒對照之來自肺組織之中值qPCR肺值分別為3.69及6.25 log10 GE/mL。PRRS 94881 MLV接種豬之中值qPCR值顯著低於攻毒對照之中值qPCR值(p<0.0001)。在任何陰性對照豬之肺樣品中均未偵測到PRRSv RNA。 下表8.13中為組中肺qPCR值及測試結果(p值)之概述。 分別在90%及100%之PRRS 94881 MLV接種豬及攻毒對照豬之肺組織中偵測到PRRSv RNA。疫苗接種組與攻毒對照之間無統計學差異(p=0.4878)。 組中屍檢時來自豬之PRRS qPCR陽性肺組織之頻率的概述展示於下表8.14中。 血清PRRS qPCR D0時，在任何豬之血清中均未偵測到PRRSv RNA。疫苗接種後，PRRS 94881 MLV接種豬在D7、D14、D21、D28、D56、D84、D112、D140及D168時之平均值分別為3.00、0、0、3.00、0、0、0、0及0 log10 GE/mL。D7、D14、D21及D28時，值顯著高於攻毒對照(p 0.0013)，因為攻毒對照直至D182(DPC 3)時才偵測到PRRSv RNA。 D179(DPC 0)時，在任何豬之血清中均未偵測到PRRSv RNA。與攻毒對照在D182(DPC 3)、D186(DPC 7)及D189(DPC 10)時之中值分別為5.88、5.30及4.24 log10 GE/mL相比，攻毒後，PRRS 94881 MLV接種豬在同一天之中值分別為4.44、0及0 log10 GE/mL。在所有攻毒後之日，攻毒對照之中值均高於PRRS 94881 MLV組(p 0.0001)。 在此研究期間在來自任何陰性對照豬之血清中均未偵測到PRRSv RNA。 PRRS 94881 MLV接種豬在DPC 0至DPC 10及DPC 3至DPC 10之中值AUC值分別為每天15.54及8.88 log10 GE/mL。相比之下，攻毒對照在DPC 0至DPC 10及DPC 3至DPC 10之中值AUC值分別為每天44.77及36.43 log10 GE/mL。對於兩個時期，PRRS MLV組之中值均顯著低於攻毒對照之中值(p<0.0001)。 血清PRRS qPCR資料之概述展示於下表8.15及8.16中。 疫苗接種後，PRRS 94881 MLV組在D7、D14、D21及D28時之qPCR陽性豬之比例顯著高於攻毒對照組(p 0.0013)。在組之間未偵測到D56時之qPCR陽性豬之比例的顯著差異(p=0.1069)。 D182(DPC 3)時，PRRS 94881 MLV及攻毒對照組中之100%豬為qPCR陽性(未進行測試)。D186(DPC 7)及D189(DPC 10)時，PRRS MLV組之qPCR陽性豬之比例顯著低於攻毒對照組(<0.0001)。 組中qPCR陽性資料之比例之概述展示於下表8.17及8.18中。 攻毒後臨床觀察 與一隻攻毒對照豬(第149號)在D185(DPC 6)時顯示評分為「1」相比，攻毒後在任何PRRS 94881 MLV接種豬中均未觀察到異常呼吸。在組之間未偵測到顯示攻毒後至少一天異常呼吸之豬之百分比的差異(p=0.4878)。 攻毒後，在任何PRRS 94881 MLV接種豬或攻毒對照豬中均未觀察到異常行為及咳嗽。 PRRS 94881 MLV接種組及攻毒對照組之攻毒後至少一天總臨床評分>0之豬的百分比分別為0%及5%。此等值無顯著差異(p=0.4878)。 D179至D189在陰性對照組中未觀察到臨床徵象。 組中在攻毒後時期內具有至少一個陽性臨床觀察評分之豬之頻率的概述展示於下表8.19中。 組之間攻毒後最大呼吸評分或最大總評分無差異(p=0.4878)。 組中攻毒後時期(DPC 1至DPC 10)之最大臨床觀察評分之概述展示於下表8.20中。 平均臨床觀察評分遵循類似於具有陽性臨床評分之豬之百分比的模式。PRRS 94881 MLV接種組與攻毒對照組之間無顯著差異(p0.4878)。 組中攻毒後時期(DPC 1至DPC 10)之平均臨床觀察評分之概述展示於下表8.21中。 體重及平均日增重 組之間的差異不顯著(p=0.2389)。D179(DPC 0)時，PRRS 94881 MLV組及攻毒對照組之平均及LS平均體重分別為134.6及128.2 kg。差異不顯著不同(p=0.1090)。D188(DPC 9)時，PRRS 94881 MLV組及攻毒對照組之平均及LS平均體重分別為138.3及130.3 kg。D188時，疫苗接種組之體重顯著高於攻毒對照組之體重(p=0.0455)。 PRRS 94881 MLV組及攻毒對照組之攻毒時期(DPC 0至DPC 9)之LS平均ADWG分別為0.4及0.2 kg/d。此等值無顯著差異(p=0.1041)。 陰性對照豬在D0、D179及D188時之平均體重分別為2.7、117.2及120.0 kg。陰性對照組D179至D188之ADWG為0.5 kg/d。 組中D0、D179(DPC 0)及D188(DPC 9)時之平均體重及DPC 0至DPC 9之ADWG的概述展示於下表8.22中。PRRS 94881 MLV組及攻毒對照組之體重及ADWG之LS平均值及統計分析的概述展示於下表8.23中。 直腸溫度 在攻毒之日(D179)PRRS 94881 MLV組之平均直腸溫度為39.3℃，且攻毒後平均值在39.1℃(D189，DPC 10)至39.8℃(D181，DPC 2)之範圍內。在攻毒之日攻毒對照組之平均直腸溫度為39.1℃，且攻毒後平均值在39.1℃(D183，DPC 4)至39.9℃(D182，DPC 3)之範圍內。相同時間段內，陰性對照組之平均直腸溫度保持39.3℃。 組中直腸溫度之概述展示於下表8.24中。 與攻毒對照相比，PRRS 94881 MLV接種豬在DPC 0(p=0.0281)、DPC 2(p=0.0095)、DPC 4(p=0.0034)及DPC 5(p<0.0001)時之最小平方平均直腸溫度顯著較高。與攻毒對照相比，PRRS 94881 MLV接種豬在DPC 8(p=0.0183)及DPC 10(p=0.0001)時之最小平方平均直腸溫度顯著較低。攻毒後剩餘天數在組之間未偵測到顯著差異(p0.0642)。組中直腸溫度之LS平均值及統計分析之概述展示於下表8.25中。 21隻PRRS 94881 MLV接種豬中3隻(14%)及20隻攻毒對照中5隻(25%)在攻毒後至少一天直腸溫度40.5℃。在組之間未偵測到顯示攻毒後至少一天直腸溫度40.5℃之豬之比例的差異(p=0.4537)。組中攻毒後至少一天發熱(40.5℃)之豬之比例的概述展示於下表8.26中。 疫苗接種後臨床評定 22隻PRRS 94881 MLV豬中4隻(18%)、22隻攻毒對照豬中8隻(36%)及12隻陰性對照豬中2隻顯示D1至D21中至少一天之異常臨床評定。組之間此參數無顯著差異(p=0.3102)。 組中D1至D21中具有至少一個異常臨床評定之豬之百分比的概述展示於下表8.27中。 總體上，7隻PRRS 94881 MLV豬顯示D1至D177中至少一天之異常臨床評定。 豬121顯示D61至D146腹部隆起，D147至D167鞘膜腫脹，D168腹部隆起，D169-172鞘膜腫脹，及173至177腹部隆起。豬141在D4-D10消瘦，D4-D6抑鬱，及D5毛皮粗糙。豬144顯示在D26時咳嗽。豬146顯示在D82時胸骨腫脹。豬147在D84-D86腿虛弱且D84時發顫。豬154在D4-D6消瘦。豬179在D2-D5消瘦，顯示在D5時毛皮粗糙且發現在D6時死亡。攻毒對照組中13隻豬顯示D1至D177中至少一天有異常臨床評定：豬124顯示在D20時發顫及顫抖且發現在D21時死亡。豬134顯示D46-D68鞘膜腫脹，D69-D143腹部隆起，D144時臍疝，且D145至D177腹部隆起。豬137顯示D108-D143鞘膜腫脹。豬138顯示D115-D143鞘膜腫脹。豬148顯示D16-20跛行或腿腫脹及在D35時咳嗽。豬149在D5-D9及D12時消瘦，且顯示D12-D15毛皮粗糙。豬150在D4-D9及D13時消瘦，顯示D10-D12身體狀況不良，且在D11時抑鬱。豬161在D4-D9消瘦，顯示D9時毛皮粗糙及中樞神經系統徵象且發現在D10時死亡。豬167顯示D117-D143鞘膜腫脹。豬170在D4-D7消瘦，且顯示D7時抑鬱。豬172顯示D120-D143懸爪潰瘍或腫脹。豬177顯示在D19時抑鬱且D156-D159頸上腫脹。豬178顯示在D5、D17-20及D28-D36抑鬱，D15-D47腿跛行及/或腫脹，D16-D18消瘦，且D39-D47腿僵硬。陰性對照組中6隻豬顯示D1至D177中至少一天有異常臨床評定。豬120顯示D5-7及D12時咳嗽。豬126在D2-18消瘦，顯示D4-D5、D10及D17-D19時抑鬱，D5時毛皮粗糙，且D18-D22呼吸吃力。豬132顯示D49-D56膿腫。豬145顯示D37-D43及D46至D74時鞘膜腫脹，且D75-D83及D85至D87時鞘膜潰瘍。豬151顯示D78-D83及D85時跛行及/或腿腫脹。豬155顯示D69-D77膿腫。 在攻毒之前發生三起死亡。豬179(PRRS 94881 MLV，D6)：屍檢揭示最小病變(瘦弱，身體狀況不良)。實驗室測試顯示輕度巨噬細胞間質性肺炎。免疫組織化學為PRRS陰性。腸樣品自溶，但未顯示嚴重壞死或嚴重發炎之跡象。分離出平滑大腸桿菌(Smooth Escherichia coli)及腸球菌屬(Enterococcus spp)(部分15.9)。豬124(攻毒對照，D21)：屍檢時未鑑別出總體病變。實驗室測試顯示嚴重化膿性至膿肉芽腫性腦膜腦炎以及化膿性血管周炎。肺部及肝臟充血亦明顯。診斷為豬鏈球菌相關性腦膜腦炎。豬161(攻毒對照，D10)：屍檢揭示最小病變(瘦弱，身體狀況不良)。自肺組織分離出支氣管敗血性博德氏桿菌、α溶血性鏈球菌(Streptococcus alpha haemolytic)及耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)。 PRRS血清學 所有豬在D0及D7時均為PRRS ELISA陰性。至D14時，90% PRRS 94881 MLV接種豬具有陽性PRRS ELISA力價。在D21時，此數目增至95%，且在D28、D56、D84、D112、D140及D168時，此數目分別為100%、100%、100%、90%、100%及95%。在此研究之疫苗接種期期間，無攻毒對照豬發展PRRS抗體力價，且D14至D168，具有陽性PRRS抗體力價之PRRS 94881 MLV接種豬之百分比顯著高於攻毒對照(p<0.0001)。 在研究之攻毒期期間，DPC 0、DPC 3、DPC 7及DPC 10時具有陽性PRRS ELISA力價之PRRS 94881 MLV接種豬之百分比分別為95%、95%、100%及100%。相比之下，攻毒對照豬未發展PRRS抗體力價，直至DPC 7，此時30%具有力價。DPC 10時，此增至80%。在研究之整個攻毒期，PRRS 94881 MLV接種豬之具有陽性PRRS抗體力價之動物的百分比較高(p 0.0478)。 D112時除兩隻豬以外，陰性對照組中豬在整個研究期間均為PRRS ELISA血清陰性。第116號及第120號在D112時為PRRS ELISA血清陽性。 組中在攻毒之前具有陽性PRRS抗體力價之豬之百分比的概述展示於下表8.28中。來自研究之攻毒部分之資料展示於下表8.29中。 討論/結論 為達成研究目標，二十二(22)隻健康、PRRS易感染且血清陰性豬在約14日齡用1 ml PRRS 94881 MLV經肌肉內接種。三十四隻(22隻豬-攻毒對照組及12隻豬-陰性對照組)PRRS易感染且血清陰性豬在約14日齡用1 ml對照產品經肌肉內接種。 研究及攻毒模型之驗證 在整個研究期間陰性對照組中之豬保持PRRSv(病毒血症；qPCR)陰性。陰性對照組中之兩隻豬(第116號及第120號)在D112時具有陽性ELISA力價，而此組之所有其他ELISA結果均為陰性。認為總體上在此等豬中或在此組中未偵測到病毒血症；同樣，所有其他血清樣品均為ELISA陰性，認為此兩隻豬在D112時之結果可能由於不可賦值之實驗室誤差而為假陽性。因此，此為有效研究。與有效研究之建立無關，與0.0%之中值總體病變評分形成對比，陰性對照組在D189時之中值組織學肺病變評分為9.0。此等資料突出長時間圈養在正常養豬條件下之豬發展微小肺病變，該等肺病變無關緊要且與特定病原體無關。 在用歐洲型PRRS分離株205817藉由早先描述之方法接種後，攻毒對照組顯示DPC 0至DPC 9之平均ADWG為0.2公斤/天(陰性對照組之平均ADWG為0.5公斤/天)，中值總體肺病變評分為13.8%(陰性對照組為0.0%)，中值組織學肺病變評分為19.5(陰性對照組為9.0)及肺組織中偵測到之PRRSv RNA之中值為6.25 log10 GE/mL(陰性對照組之中值為0.0 log10 GE/mL)。此等結果突出在攻毒對照組中誘發PRRS特異性臨床疾病，因此驗證此攻毒模型為足以評估PRRS疫苗功效及更特定言之PRRS 94881 MLV之26週免疫力持續時間的臨床實驗工具。 確定PRRS 94881 MLV之26週免疫力持續時間 疫苗接種後26週之PRRS 94881 MLV之DOI的確定係基於疫苗組顯示與攻毒對照組相比，攻毒後肺病變(總體或組織學)顯著減少(p0.05)。 總體及組織學肺病變被選為確定26週DOI之主要參數，因為在豬中PRRS呼吸攻毒模型內評估新疫苗時，此參數提供功效之最臨床相關且令人信服之證據。肺病變發展為豬中PRRS呼吸疾病之標誌之一且可認為其為繼發性PRRSv疾病特徵(諸如臨床徵象、發熱、ADWG降低等)之所有後續表現的來源。 PRRS 94881 MLV組顯示攻毒後總體肺病變顯著減少，如與顯示中值總體肺病變評分為13.8%之攻毒對照組相比，中值總體肺病變評分為0.1%(p<0.0001)所證明。此外，PRRS 94881 MLV組顯示組織學肺病變評分顯著降低，如與中值組織學肺病變評分為19.5之攻毒對照組相比，PRRS 94881 MLV組之中值組織學肺病變評分為6.0(p<0.0001)所證明。因此，基於攻毒後肺病變顯著減少之主要參數，確定在1×104.27 TCID50之劑量下PRRS 94881 MLV之DOI為26週。此結果由略低於目標最小免疫劑量1×104.5 TCID50/mL之疫苗劑量達成。雖然一隻攻毒對照豬(第123號)因為由細菌性感染引起之胸膜炎及黏連而無法對總體肺病變進行評分，但可對組織學肺病變進行評分。此豬自攻毒對照組之總體肺病變評分分析中剔除不影響此研究之結果。 攻毒後病毒血症被選為最重要的二次參數，因為其代表在暴露後宿主動物內發生之病毒複製程度及持久性。病毒血症顯著減少(p0.05)與誘發足夠免疫力以在宿主內限制PRRS發病機制之PRRS疫苗相對應。在攻毒後3、7及10天，PRRS 94881 MLV接種組顯示與攻毒對照組相比病毒血症(qPCR)顯著減少(p<0.0001)。為在組之間進一步評估攻毒後病毒血症，計算攻毒後特定持續時間內病毒負荷之量，表示為「曲線下面積」或AUC。PRRS 94881 MLV接種組在DPC 0至DPC 10之中值AUC值為每天15.54 log10 GE/mL；而攻毒對照組之中值AUC值為每天44.77 log10 GE/mL(p<0.0001)。此外，PRRS 94881 MLV接種組在DPC 3至DPC 10之中值AUC值為每天8.88 log10 GE/mL；而攻毒對照組此時期之中值AUC值為每天36.43 log10 GE/mL(p<0.0001)。無論在攻毒後特定時間點抑或在攻毒後時間內檢查病毒血症，在用毒性異源性歐洲型PRRS株攻毒之前26週投與的PRRS 94881 MLV在攻毒接種後均顯著(p0.05)降低病毒血症。 結合攻毒後PRRS病毒血症減少，根據PRRS疫苗免疫力觀點，肺組織中病毒負荷顯著(p0.05)降低亦具有重大意義。肺組織中病毒負荷降低可能與宿主內病毒穩定性、複製及持久性降低相關且繼而可使PRRSv至其他豬之流動減少。在此研究中，來自PRRS 94881 MLV組之肺組織在攻毒後10天(DPC 10)的中值肺qPCR結果為3.69 log10 GE/mL，而攻毒對照組之中值肺qPCR結果為6.25 log10 GE/mL。疫苗組與攻毒對照組之間的差異顯著(p<0.0001)，因此進一步支持26週之免疫力持續時間。 豬中攻毒後臨床徵象之嚴重程度及頻率明顯降低亦支持PRRS疫苗功效及PRRS 94881 MLV之DOI為26週的確定。僅僅一隻豬顯示攻毒後臨床徵象：豬149(攻毒對照)在D185時具有「1」之呼吸評分(喘息/呼吸迅速)。PRRS 94881 MLV接種組中無豬在此研究之攻毒後階段期間顯示臨床徵象，且在疫苗接種與攻毒對照組之間無統計學差異(p=0.4878或未進行測試)。在此研究中攻毒後臨床徵象評定DOI不夠有力。 組之間發熱在攻毒後發生變化。與攻毒對照豬相比，PRRS 94881 MLV接種豬顯示在兩天(DPC 8及DPC 10；p 0.0183)之LS平均直腸溫度顯著較低及在四天(DPC 0、DPC 2、DPC 4及DPC 5；p 0.0281)之LS平均直腸溫度較高。另外，攻毒後在組之間未偵測到顯著差異(p0.0642)。雖然攻毒後在組之間偵測到統計學差異，但此等差異並非具有生物學意義，因為所有組之平均直腸溫度保持39.9℃(攻毒對照組，D182)。在組之間未偵測到攻毒後至少一天發熱之豬之比例的差異(p=0.4537)。 攻毒對照組中由PRRS引起之顯著病毒血症、肺病變及病毒負荷的存在導致組之間DPC 9時之體重差異顯著(p0.05)。在此研究中，疫苗接種及攻毒對照組DPC 9之LS平均體重分別為138.3 kg及130.3 kg(p=0.0455)。疫苗接種及攻毒組在DPC 0至DPC 9之LS平均ADWG分別為0.4公斤/天及0.2公斤/天。此差異在統計學上不顯著(p=0.1041)。 此研究中檢查之疫苗接種後參數 在此研究之疫苗接種期期間，發現三隻豬死亡。發現豬179(PRRS 94881 MLV接種)在D6時死亡，與平滑大腸桿菌及腸球菌屬感染有關。發現豬161(攻毒對照組)在D10時死亡，與支氣管敗血性博德氏桿菌、α溶血鏈球菌及耳葡萄球菌感染有關。發現豬124(攻毒對照組)在D21時死亡，與引起腦膜腦炎之豬鏈球菌感染有關。為控制及防止任何更多的死亡，豬用可注射維生素及抗生素大規模處理。治療之後，未再發生死亡。因為兩個處理組中均發生死亡，所以可假定IVP自身並不與感染有關。更可能的是，到達研究實驗室之豬具有此等感染。此等豬之資料在可用時包括在內。來自此等豬之總體及組織學肺病變評分自肺病變分析中剔除，因為此等豬在投與攻毒之前死亡。在疫苗接種至攻毒之長時間內1隻PRRS 94881 MLV豬及2隻攻毒對照豬之損失不影響研究結果。 在D0時接種後，在豬中未觀察到與PRRS 94881 MLV接種或對照產品相關之異常臨床評定。PRRS 94881 MLV接種組中7隻豬在疫苗接種後具有異常評定；而13隻攻毒對照豬具有異常評定。除去此三隻因細菌性感染而死亡之豬，此等異常評定包括各時間點之消瘦、咳嗽、腫脹、毛皮粗糙、抑鬱、膿腫及身體狀況不良，其中無一者持續長時間。在作者看來，此等發現結果並不與任一實驗產品之投與相關，而是在分群圈養情況下長時間生長/成熟豬中典型之發現結果。 所有豬在D0時均為PRRS ELISA血清學陰性，因此證實所有豬在進入研究時均符合PRRS血清陰性之入選準則。接收PRRS 94881 MLV之大部分豬(90%)在D14時發生PRRS血清轉變，且所有PRRS接種豬在D28時為血清陽性。相反，攻毒對照豬保持血清陰性直至攻毒後7天，此時此組開始顯示PRRS血清轉變。如早先所報導，2隻陰性對照豬在D112時為PRRS ELISA血清陽性，認為此為偶然發現，可能係由於不可賦值之實驗室誤差。 在疫苗接種後7、14、21及28天，PRRS 94881 MLV接種組分別顯示3.00、0、0及3.00 log10 GE/mL之中值qPCR結果。此等結果突出在疫苗接種後4週內，1×104.27 TCID50劑量之PRRS 94881 MLV誘發通常為在疫苗接種後4週建立保護性免疫力所需的MLV充分複製。相反，攻毒對照組為PRRS病毒血症陰性，直至攻毒後三天。 結論 與攻毒對照組相比，PRRS 94881 MLV組之屍檢時總體及組織學肺病變、屍檢時肺組織中之病毒負荷及攻毒後病毒血症的顯著減少(p0.05)證明當在2週齡進行疫苗接種且在疫苗接種後26週攻毒時疫苗針對毒性PRRSv之功效。因此，此研究之結果證明用PRRS 94881 MLV接種後26週之免疫力持續時間。此等結果用1×104.27 TCID50/mL之疫苗劑量達成，此疫苗劑量略低於最小免疫劑量(1×104.5 TCID50/mL)。 PRRSV 94881減毒株及親本株之序列如下： SEQ ID NO：1：94881之PRRS種原病毒之全長核苷酸序列 SEQ ID NO：2：由SEQ ID NO：1中核苷酸178..7227之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 1a 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MKCSCKLGHFLTPHSCFWWLFLLCTGLSWSFVDGNDNSSTSQYIYNLTICELNGTEWLSGHFDWAVETFVLYPVATHIISLGFLTTSHFLDALGLGAVSATGFIGERYVLSSMYGVCAFAALVCFVIRAAKNCMACRYARTRFTNFIVDDRGRIHRWKSSIVVEKLGKAEVGGDLVNIKHVVLEGVKAQPLTRTSAEQWEA SEQ ID NO：17：由SEQ ID NO：10中核苷酸13902..14423之間的序列編碼的親本PRRSV株94881之ORF 6 MGSLDDFCNDPTAAQKLVLAFSITYTPIMIYALKVSRGRLLGLLHILIFLNCSFTFGYMTYVHFQSTNRVALTLGAVVALLWGVYSLTESWKFITSRCRLCCLGRRYILAPAHHVESAAGLHSIPASGNRAYAVRKPGLTSVNGTLVPGLRSLVLGGKRAVKRGVVNLVKYGR SEQ ID NO：18：由SEQ ID NO：10中核苷酸14413..14799之間的序列編碼的親本PRRSV株94881之ORF 7 MAGKNQSQKKRRNAAPMGKGQPVNQLCQLLGTMIKSQRQQSRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQAERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGKVSFQVEFMLFVAHTVRLIRVTSTSASQGAN SEQ ID NO：19：編碼減毒PRRSV 94881 ORF1A之核苷酸 SEQ ID NO：20：編碼減毒PRRSV 94881 ORFIB之核苷酸 SEQ ID NO：21：編碼減毒PRRSV 94881 ORF2之核苷酸 SEQ ID NO：22：編碼減毒PRRSV 94881 ORF3之核苷酸 SEQ ID NO：23：編碼減毒PRRSV 94881 ORF4之核苷酸 SEQ ID NO：24：編碼減毒PRRSV 94881 ORF5之核苷酸 SEQ ID NO：25：編碼減毒PRRSV 94881 ORF6之核苷酸 SEQ ID NO：26：編碼減毒PRRSV 94881 ORF7之核苷酸 SEQ ID NO：27：編碼親本PRRSV 94881 ORF1a之核苷酸 SEQ ID NO：28：編碼親本PRRSV 94881 ORF1b之核苷酸 SEQ ID NO：29：編碼親本PRRSV 94881 ORF2之核苷酸 SEQ ID NO：30：編碼親本PRRSV 94881 ORF3之核苷酸 SEQ ID NO：31：編碼親本PRRSV 94881 ORF4之核苷酸 SEQ ID NO：32：編碼親本PRRSV 94881 ORF5之核苷酸 SEQ ID NO：33：編碼親本PRRSV 94881 ORF6之核苷酸 SEQ ID NO：34：編碼親本PRRSV 94881 ORF7之核苷酸 圖1A：使用歐洲型攻毒病毒株之呼吸攻毒模型中咳嗽評分之臨床觀察結果。 圖1B：使用歐洲型攻毒病毒株之呼吸攻毒模型中總臨床評分之臨床觀察結果。 圖2：使用歐洲型攻毒病毒株之呼吸攻毒模型中之直腸溫度量測。 圖3：使用歐洲型攻毒病毒株之呼吸攻毒模型中之平均日增重量測。 圖4：使用歐洲型攻毒病毒株之呼吸攻毒模型中如經由定量PCR所指示之PRRS病毒血症。 圖5：使用歐洲型攻毒病毒株之呼吸攻毒模型中如藉由ELISA所指示之PRSS血清學。 圖6：使用歐洲型攻毒病毒株之呼吸攻毒模型中肺病變之宏觀檢驗。 圖7A-C：組織病理學量測。圖7A顯示平均宏觀肺病變；圖7B顯示對照動物組織病理學；圖7B顯示PRRS感染動物組織病理學。 圖8：顯示RT-PCT時間PCR結果，其描繪經歐洲型PRRS94881疫苗接種之動物中的病毒血症%。 圖9：大規模生產歐洲型PRRS 94881之並行方法。 <110> 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司<120> 新穎歐洲型PRRSV株<130> 10-0137 <140> 101105138 <141> 2012/02/16 <150> 61/444,074 <151> 2011/02/17 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14843 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 1<210> 2 <211> 2349 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO1中核苷酸178..7227之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 1a <400> 2 <210> 3 <211> 1463 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：1中核苷酸7209..11600之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 1B <400> 3<210> 4 <211> 249 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：1中核苷酸11611..12360之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 2 <400> 4 <210> 5 <211> 265 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：1中核苷酸12219..13016之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 3 <400> 5 <210> 6 <211> 183 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：1中核苷酸12761..13312之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 4 <400> 6 <210> 7 <211> 201 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：1中核苷酸13309..13914之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 5 <400> 7 <210> 8 <211> 173 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：1中核苷酸13902..14423之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 6 <400> 8 <210> 9 <211> 128 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：1中核苷酸14413..14799之間的序列編碼的94881 MSV之ORF 7 <400> 9 <210> 10 <211> 14843 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 10 <210> 11 <211> 2349 <212> PRT <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 11<210> 12 <211> 1463 <212> PRT <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 12<210> 13 <211> 249 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：10中核苷酸11611..12360之間的序列編碼的親本PRRSV株94881之ORF 2 <400> 13 <210> 14 <211> 265 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：10中核苷酸12219..13016之間的序列編碼的親本PRRSV株94881之ORF 3 <400> 14 <210>15 <211> 183 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：10中核苷酸12761..13312之間的序列編碼的親本PRRSV株94881之ORF 4 <400> 15 <210> 16 <211> 201 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 由SEQ ID NO：10中核苷酸13309..13914之間的序列編碼的親本PRRSV株94881之ORF 5 <400> 16 <210> 17 <211> 173 <212> PRT <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 17 <210> 18 <211> 128 <212> PRT <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 18 <210> 19 <211> 7050 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼減毒PRRSV 94881 ORF1A之核苷酸<400> 19<210> 20 <211> 4392 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼減毒PRRSV 94881 ORF1B之核苷酸<400> 20 <210> 21 <211> 750 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼減毒PRRSV 94881 ORF2之核苷酸<400> 21 <210> 22 <211> 798 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼減毒PRRSV 94881 ORF3之核苷酸<400> 22 <210> 23 <211> 552 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼減毒PRRSV 94881 ORF4之核苷酸<400> 23 <210> 24 <211> 606 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼減毒PRRSV 94881 ORF5之核苷酸<400> 24 <210> 25 <211> 522 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼減毒PRRSV 94881 ORF6之核苷酸<400> 25 <210> 26 <211> 431 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼減毒PRRSV 94881 ORF7之核苷酸<400> 26 <210> 27 <211> 7083 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 編碼親本PRRSV 94881 ORF1a之核苷酸<400> 27 <210> 28 <211> 4392 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 28 <210> 29 <211> 750 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 29 <210> 30 <211> 798 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 30 <210> 31 <211> 552 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 31 <210> 32 <211> 606 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 32 <210> 33 <211> 522 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒；編碼親本PRRSV 94881 ORF6之核苷酸<400> 33 <210> 34 <211> 387 <212> DNA <213> 豬生殖與呼吸症候群病毒<400> 34
权利要求:
Claims (26) [1] 一種歐洲型豬生殖與呼吸症候群病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus；PRRSV)，其為寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(European Collection of Cell Cultures；ECACC)寄存編號ECACC 11012501或寄存編號ECACC 11012502下之病毒株。 [2] 如請求項1之PRRSV，其中該病毒藉由在細胞培養物中繼代至少36次來減毒，以使得當該經修飾之病毒投與易感染PRRSV之豬或其他哺乳動物時，其無法引起PRRSV疾病之臨床徵象，但能夠誘導使該哺乳動物對PRRSV之病原形式免疫的免疫反應。 [3] 一種製備如請求項1之活減毒PRRSV之方法，其包含使MA 104生長之歐洲型PRRSV適應非MA 104哺乳動物細胞。 [4] 一種用於保護豬免遭PRRSV感染之疫苗，其包含如請求項1之活減毒PRRSV及醫藥學上可接受之載劑。 [5] 如請求項4之疫苗，其進一步包含一或多種非PRRSV減毒或不活化病原體或其抗原性物質。 [6] 如請求項5之疫苗，其中該非PRRSV病原體係選自假狂犬病毒(Pseudorabies virus)、豬流感病毒(Porcine influenza virus)、豬細小病毒(Porcine parvovirus)、傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、豬丹毒桿菌(Erysipelo rhusiopathiae)、支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、豬霍亂沙氏桿菌(Salmonella cholerasuis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)及胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。 [7] 如請求項4之疫苗，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的其他歐洲型PRRSV株：寄存在寄存編號萊利斯塔病毒株(Lelystad virus strain)(萊利斯塔劑(CDI-NL-2.91))下之PRRSV株，或其他病毒株，諸如寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387、CNCM寄存編號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下之病毒株，或實際上可為美國型株，諸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC寄存編號VR-2332、ATCC寄存編號VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402。 [8] 如請求項4之疫苗，其包含適於皮內或肌肉內應用之載劑。 [9] 如請求項4之疫苗，其呈冷凍乾燥形式。 [10] 如請求項4之疫苗，其中該疫苗包含至少約107個病毒粒子。 [11] 一種製備用於對抗PRRS之活減毒疫苗的方法，其包含混合如請求項1之活減毒PRRSV與醫藥學上可接受之載劑。 [12] 如請求項11之方法，其中該活減毒PRRSV進一步包含一或多種選自由以下組成之群的其他歐洲型PRRSV株：寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387及CNCM寄存編號I-1388下之PRRSV株。 [13] 如請求項11之方法，其中該活減毒PRRSV進一步包含佐劑。 [14] 一種疫苗之用途，其係用於製造用於使豬對豬生殖與呼吸症候群(PRRS)免疫之藥劑，其中該疫苗組合物包括活的豬生殖與呼吸症候群病毒與藥理學相容之載劑混合，該病毒包含在細胞培養物中繼代至少36次之PRRS 94881病毒以修飾該病毒，以使得當該經修飾之病毒投與易感染PRRS之豬或其他哺乳動物時，其無法引起PRRS疾病之臨床徵象，但能夠誘導使該哺乳動物對PRRS之病原性形式免疫的免疫反應。 [15] 如請求項14之用途，其中該豬在疫苗接種後未呈現肺病變。 [16] 如請求項14之用途，其中相較於用Porcilis疫苗接種，該豬在疫苗接種後呈現較少肺病變。 [17] 一種PRRS病毒，其具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10中所述之序列具有至少95%同源性之核苷酸序列。 [18] 一種PRRS病毒，其包含至少一個編碼與SEQ ID NO：2至9或SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：18中所述之任何序列具有至少98%一致性之蛋白質的ORF。 [19] 一種PRRS病毒，其具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之片段之核苷酸序列，其中該片段編碼選自由以下組成之群之ORF：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。 [20] 一種用於接種豬科動物之次單位疫苗，其中該疫苗包含一或多種選自由編碼選自由以下組成之群之ORF的核苷酸組成之群之核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。 [21] 一種用於接種豬科動物之次單位疫苗，其中該疫苗包含一或多種選自由以下組成之群之核苷酸：SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；及SEQ ID NO：34。 [22] 一種組合物，其包含一或多種選自由具有以下序列之蛋白質組成之群之蛋白質：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。 [23] 一種經分離核酸，其包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；及SEQ ID NO：34。 [24] 一種重組表現載體，其包含編碼一或多種選自由以下組成之群之PRRSV ORF之核酸序列可操作地連接於啟動子：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15 、 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。 [25] 如請求項24之重組表現載體，其中編碼該等ORF之該核酸係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；及SEQ ID NO：34。 [26] 一種疫苗，其包含如請求項24或25中任一項之重組表現載體。
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申请号 | 申请日 | 专利标题 US201161444074P| true| 2011-02-17|2011-02-17|| US61/444,074||2011-02-17|| 相关专利
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