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    本發明提供抗馬鼻炎病毒(特定言之馬鼻炎A與B病毒)之免疫原性組合物，及其使用方法及製法。於替代實施例中，該等免疫原性組合物亦含有其他馬病原體。
    公开号:TW201300537A
    申请号:TW101108504
    申请日:2012-03-13
    公开日:2013-01-01
    发明作者:菲利浦 韋恩 海斯；克莉絲汀娜Ｊ 海納斯；羅倫特 維爾；曼德茲 安德斯 迪茲
    申请人:百靈佳殷格翰家畜藥品公司；
    IPC主号:C12N7-00
    专利说明:
    馬鼻炎疫苗
    本申請案參考2011年3月14日申請之美國臨時申請案第61/452,390號及2011年7月21日申請之美國臨時申請案第62/510,226號，此兩者之全部內容均以引用的方式併入本文中。
    馬病毒性呼吸感染通常與馬的運動有關聯且報導全球每年有呼吸爆發。馬流感2(AE2-H3N8)、馬皰疹病毒1與4型(EHV1/4)及馬鼻炎A與B病毒(分別為ERAV與ERBV)係於呼吸爆發期間自上呼吸道所分離之最為重要的病毒。
    特定言之，已報導ERAV存於馬之急性發熱性呼吸疾病中(Li等人，J.Clin.Microbiol.35：937-943；1997，以引用的方式併入)。類似地，Ontario最新的研究發現ERBV與ERAV會高度流行於馬群體中(Diaz-Mendez等人，The Canadian Journal of Veterinary Research 74：271-278；2010，以引用的方式併入)。ERAV感染之臨床徵兆具非特定性且難以與包括馬流感及皰疹病毒感染之其他呼吸病毒感染區分。已於馬呼吸爆發中確定該病毒之非細胞病變株系(Li等人，J.Clin.Microbiol.35：937-943；1997)而令其之確診具挑戰性。此外，為單鏈RNA病毒之ERAV及ERBV可能發生突變，從而使免疫系統保護動物對抗由特定ERAV/ERBV株系引起之疾病的能力不明。
    仍需求適用於預防呼吸疾病或降低減輕與該等疾病相關聯之臨床症狀(包括與馬鼻炎A與B病毒相關聯之彼等)之發病率或嚴重度之方法及藥物。
    發明人已確定含有不活化或活減毒ERAV之一或多種株系之免疫原性組合物可在培養時生長至極高效價而獲得可在投與給例如馬時誘發高效價抗ERAV之血清抗體(例如，獲得為至少1：112，及較佳地，為至少1：200、1：500，1：750或1：1000之血清效價)之疫苗，該一或多種株系在活及活化及未減毒時具毒性(即，故意曝露於該病毒時之血清陰性馬中至少50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%顯示可觀測之呼吸疾病，特定言之鼻及/或眼分泌)。此外，該等株系於培養時生長良好且極度有效地達到例如至為至少106 TCID50/mL，更佳至少107 TCID50/mL、108 TCID50/mL或甚至109 TCID50/mL之效價。類似地，亦發現包含不活化ERBV之一或多種株系之組合物在培養時生長良好，極度有效地達到為至少106 TCID50/mL，更佳107 TCID50/mL、108 TCID50/mL或甚至109 TCID50/mL之效價，繼而在免疫接種後於動物中誘發高效價血清抗體(例如，獲得為至少1：120及較佳至少1：200、1：500、1：750或1：1000之血清效價)，該一或多種株系在活及活化然無減毒時亦具毒性(如以上針對ERAV所界定)。此兩種ERAV及ERBV組合物及其組合可在藉由該等組合物免疫及隨後攻毒之動物(如馬)中減低疾病的持續時間、嚴重度及發病率。
    因此，本發明提供一種包含不活化或活減毒ERAV或ERBV之一或多種株系之免疫原性組合物，其中該ERAV株系或該ERBV株系在不活化或減毒之前致使曝露於該株系之血清陰性馬中至少50%引起可偵測呼吸疾病，或於細胞培養物中生長至106 TCID50/mL或更高，或者，在以106 TCID50或更高劑量使用作為馬之疫苗時獲得為至少1：112之血清效價。
    於某些實施例中，該株系在活著及未減毒時致使曝露於該株系時之血清陰性馬中至少50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%引發可偵測呼吸疾病(例如，可偵測眼及/或鼻分泌)。
    該株系可在細胞培養物中生長至為至少106 TCID50/mL，更佳107 TCID50/mL、108 TCID50/mL或甚至109 TCID50/mL之效價。投與包含該株系之免疫原性組合物獲得為至少1：120及較佳至少1：200、1：500、1：750或1：1000之血清效價。
    於本發明之免疫原性組合物中，ERAV或ERBV之一或多種株系較佳包括ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)及/或ERBV株系07-103042(ATCC寄存編號PTA-11829)。此外，本發明之免疫原性組合物包含至少一種含有其逆轉錄本與SEQ ID NO：2具有95%以上之同一性或編碼與SEQ ID NO：3具有95%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列之ERAV株系，其中該ERAV株系在未不活化時具有感染活性並於宿主細胞中進行複製。本發明之免疫原性組合物亦可包含所含有基因組序列之逆轉錄本具有含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之ERAV株系。
    本發明之免疫原性組合物亦可包含含有其逆轉錄本與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組序列之逆轉錄本具有95%以上之同一性或編碼具有與經具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組編碼之該聚合蛋白質具有95%以上之同一性之胺基酸序列之該聚合蛋白質之基因組序列之ERBV株系，其中該ERBV株系在未不活化時活化感染並在宿主細胞中進行複製。該ERBV株系亦可包含為具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組序列或編碼具有經具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組編碼之聚合蛋白質之該胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列。
    於一特定實施例中，本發明之免疫原性組合物包含馬鼻炎A病毒(ERAV)及馬鼻炎B病毒(ERBV)，其中該ERAV株系為ERAV/ON/05及該ERBV株系具有ATCC寄存編號PTA-11829。
    此外，本發明進一步包括含有不活化或活減毒病毒或源自馬中引發疾病之ERAV或ERBV除外之病毒之抗原之多價免疫原性組合物。特定言之，本發明提供包含除了不活化或活減毒ERAV及/或ERBV之外之馬皰疹病毒(EHV)之至少一種抗原或一種不活化或活減獨株系之免疫原性組合物，於特定實施例中，該EHV係選自由EHV-1與EHV-4及其組合組成之群，更明確言之，該馬皰疹病毒係選自由EHV-1、EHV-4、以ATCC寄存編號PTA-9525與PTA-9526寄存之株系及其組合組成之群。
    本發明進一步提供包含除了ERAV及/或ERBV之該不活化或活減毒株系之外之馬流感病毒之至少一種不活化或活減毒株系或至少一種抗原之免疫原性組合物。於特定實施例中，該馬流感病毒係選自由支系1病毒、支系2病毒、流感A/South Africa/2003、流感A/馬-2/Ohio/03、流感A/馬-2/New Market/2/93、流感A/馬-2/Kentucky/95、流感A/馬-2/Richmond/1/2007、以ATCC寄存編號PTA-9522、PTA-9523及PTA-9524寄存之株系及其組合組成之群。該等免疫原性組合物可包含除了不活化或活減毒ERAV及/或ERBV之外之馬皰疹病毒之至少一種抗原或一種不活化或活減毒株系及馬流感病毒之至少一種抗原或一種不活化或活減毒株系。
    本發明之免疫原性組合物可包含除了不活化或活減毒ERAV及/或ERBV之外之至少一種選自由以下所組成之群之不活化或活減毒病毒或一或多種選自由以下組成之群之株系之至少一種抗原：西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒及破傷風類毒素及其組合。或者，除了不活化或活減毒ERAV及/或ERBV之外，該免疫原性組合物包含東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒及破傷風類毒素之一或多種不活化或活減毒株系或株系之抗原。於特定實施例中，該西尼羅病毒為選自由馬源性(Horse Origin)2005，以ATCC寄存編號PTA-9409寄存；NAEE159，以美國農業部分離株寄存編號405330寄存；NY2002Nassau；NY2002Clinton；NY2002Queens；GA20021；GA20022；TX20021；TX20022；IN2002；NY2003Albany；NY2003Suffolk；NY2003Chatauqua；CO20031；CO20032；TX2003；TX2003Harris4；TX2003Harris6；TX2003Harris7；TX2003Harris10；AZ2004；及TX2004Harris4；及其組合組成之群之該等株系中之一者。於含有西部馬腦脊髓炎病毒之免疫原性組合物中，該株系可為以ATCC寄存編號PTA-9410寄存之株系。於含有委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒之組合物中，該株系可為以ATCC寄存編號PTA-9411寄存之株系。於含有東部馬腦脊髓炎病毒之免疫原性組合物中，該株系可為以ATCC寄存編號PTA-9412寄存之株系。而且，於含有馬皰疹病毒之免疫原性組合物中，該株系可選自由以ATCC寄存編號PTA-9525或PTA-9526寄存之株系及其組合組成之群。
    於特定實施例中，免疫原性組合物中該等株系中之一或多者係以每劑量約102.0TCID50/mL至約1010.0TCID50/mL含量存在。該組合物可進一步包含適宜之醫藥載劑，諸如稀釋劑、佐劑、抗微生物劑、防腐劑、滅活劑或其組合。於特定實施例中，該免疫原性組合物包含佐劑(明確言之是指HRA-5)。
    本發明進一步提供適用於在動物或動物獸群中降低馬鼻炎A病毒或馬鼻炎B病毒相關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕馬鼻炎A病毒或馬鼻炎B病毒相關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之方法，包括投與含有不活化或活減毒ERAV或ERBV之一或多種株系之免疫原性組合物之步驟，其中該ERAV株系或該ERBV株系在不活化或減毒之前致使曝露於該株系之血清陰性馬中至少50%引發可偵測呼吸疾病，或在細胞培養物中生長至106 TCID50/mL或更高，或者，在以106 TCID50或更高劑量使用作為馬之疫苗時獲得為至少1：112之血清效價。特定言之，ERAV或ERBV之該等一或多種株系較佳包括ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)及/或ERBV株系07-103042(ATCC寄存編號PTA-11829)。此外，該ERAV株系可包含其逆轉錄本與SEQ ID NO：2具有95%以上之同一性或編碼與SEQ ID NO：3具有95%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，其中該ERAV株系在未不活化或減毒之前活化感染並於宿主細胞中進行複製，或該ERAV株系所含有基因組序列之逆轉錄本具有含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質。此外，或者選擇性地，該ERBV株系可包含其逆轉錄本與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組序列之逆轉錄本具有95%以上之同一性或編碼具有與經具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組編碼之聚合蛋白質具有95%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，其中該ERBV株系在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製。該ERBV株系亦可包含為具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組序列或編碼具有經具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組編碼之聚合蛋白質之該胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列。
    除了提供適用於在動物或動物獸群中降低ERAV或ERBV所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕ERAV或ERBV相關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之方法，本發明之該等方法可進一步藉由投與本發明之免疫原性組合物降低選自由下列組成之群之該等病原體中之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕選自由下列組成之群之該等病原體之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度：西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒及動物或動物獸群之破傷風桿菌。本發明之該等方法亦包括藉由投與本發明之免疫原性組合物在動物或動物獸群中降低ERAV或ERBV所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕ERAV或ERBV所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度以及降低選自由下列組成之群之該等病原體之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕選自由下列組成之群之病原體之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之方法：東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬皰疹病毒及動物或動物獸群之破傷風桿菌。
    本發明亦提供用於降低ERAV及/或ERBV以及選自由下列組成之群之該等病原體之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕ERAV及/或ERBV以及選自由下列組成之群之該等病原體之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之方法：西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬皰疹病毒、馬流感病毒及動物或動物獸群之破傷風桿菌，該方法包括投與本發明之免疫原性組合物之步驟。
    關於本發明之該等方法，在動物獸群中由該等病原體中之一或多者所引起之臨床症狀之發病率相較未接受免疫原性組合物之獸群降低約10%至50%。本發明(特定言之實施例)之該等方法提供抗免疫原性組合物所存有之該等病原體中之一或多者之免疫持續至少12個月。於本發明之該等方法中，該免疫原性組合物係投與給馬科(較佳是指馬)。投藥方案可包括以一或多個劑量投與該免疫原性組合物。適用於本發明之該等方法之該等劑量可以0.5 mL至2.5 mL劑型調配。較佳地，本發明之該等方法係投與就用於4個月大或更大之小馬或馬中而言具安全性之免疫原性組合物。
    本發明亦提供用於產製含有不活化馬鼻炎A病毒(ERAV)或馬鼻炎B病毒(ERBV)之一或多種株系之免疫原性組合物之方法，如下列：a)以ERAV或ERBV感染易感性細胞系；b)使該已感染細胞系於生長介質中生長直到達到細胞病變效應(CPE)；c)收穫該介質；d)過濾該介質獲得經過濾之介質；以及e)將該經過濾之介質與滅活劑接觸獲得不活化ERAV或ERBV。
    發明人已確定含有不活化ERAV之一或多種株系之免疫原性組合物可在培養時生長至極高效價而獲得可在投與給例如馬時誘發高效價抗ERAV之血清抗體(例如，獲得為至少1：112，及較佳地，為至少1：200、1：500，1：750或1：1000之血清效價)之疫苗，該一或多種株系在活及活化時具毒性(即，故意曝露於該病毒時之血清陰性馬中至少50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%顯示可觀測之呼吸疾病，特定言之鼻及/或眼分泌)。此外，該等株系於培養時生長良好且極度有效地達到例如至為至少106 TCID50/mL，更佳107 TCID50/mL、108 TCID50/mL或甚至109 TCID50/mL之效價。類似地，亦發現包含不活化ERBV之一或多種株系之組合物在培養時生長良好，極度有效地達到為至少106 TCID50/mL，更佳107 TCID50/mL、108 TCID50/mL或甚至109 TCID50/mL之效價，繼而在免疫接種後於動物中誘發高效價血清抗體(例如，獲得為至少1：120及較佳至少1：200、1：500、1：750或1：1000之血清效價)，該一或多種株系在活及活化然無減毒時亦具毒性(如以上針對ERAV所界定)。此兩種ERAV及ERBV組合物及其組合可在藉由該等組合物免疫及隨後攻毒之動物(如馬)中減低疾病的持續時間、嚴重度及發病率。
    於一實施例中，所提供為一種含有不活化ERAV及/或ERBV之一或多種株系之免疫原性組合物。或者，該等株系可藉由例行方式減毒及為用於疫苗組合物中之活減毒病毒。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並在宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，在病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有經逆轉錄之情況下具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於特定實施例中，該ERAV株系為具有ATCC寄存編號PTA-11828之ERAV/ON/05，於2011年4月14日寄存在美國典型培養物保藏所(American Type Culture Collection)，其以引用的方式併入本文中。
    於一些實施例中，該ERBV為株系07-103042，具有ATCC寄存編號：PTA-11829，於2011年4月14日寄存在美國典型培養物保藏所，其以引用的方式併入本文中。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之該聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    於一實施例中，所提供為一種含有不活化(或者，選擇性地，活的減毒)ERAV及ERBV之免疫原性組合物。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    於一實施例中，與ERAV及/或ERBV之不活化或活減毒之一或多種株系一起地，本文所提供之免疫原性組合物進一步包含馬皰疹病毒(EHV)之至少一種抗原或一種額外不活化或活減毒株系。於一些實施例中，該等組合物包含EHV之至少一種抗原。於一些實施例中，該EHV係選自由EHV-1、EHV-4、以ATCC寄存編號PTA-9525與PTA-9526寄存之株系及其組合組成之群。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或其編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    於一實施例中，與ERAV及/或ERBV之不活化(或減毒)之一或多種株系一起地，本文所提供之免疫原性組合物進一步包含馬流感病毒(EIV)之至少一種抗原或一種額外不活化或減毒株系。於一些實施例中，該等組合物包含EIV之至少一種抗原。於一些實施例中，該EIV係選自由支系1病毒、支系2病毒、流感A/South Africa/2003、流感A/馬-2/Ohio/03、流感A/馬-2/New Market/2/93、流感A/馬-2/Kentucky/95、流感A/馬-2/Richmond/1/2007及其組合組成之群。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或其編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    於一實施例中，與ERAV及/或ERBV之不活化(或活的減毒)之一或多種株系一起地，本文所提供之免疫原性組合物包含馬流感病毒之至少一種抗原或一種額外不活化或活減毒株系及馬皰疹病毒之至少一種抗原或一種額外不活化或活減毒株系。於一些實施例中，該等組合物包含EHV之至少一種抗原及EIV之至少一種抗原。於一些實施例中，該EHV為EHV-1或EHV-4或其組合及該EIV係選自由支系1病毒、支系2病毒、流感A/South Africa/2003、流感A/馬-2/Ohio/03、流感A/馬-2/New Market/2/93、流感A/馬-2/Kentucky/95、流感A/馬-2/Richmond/1/2007及其組合組成之群。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    於一實施例中，與ERAV及/或ERBV之不活化(或活的減毒)之一或多種株系一起地，本文所提供之免疫原性組合物進一步包含一或多種選自由馬流感病毒、馬皰疹病毒、西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒及委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒及/或破傷風類毒素及其組合組成之群之額外株系之至少一種抗原或不活化病毒。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    於一實施例中，與ERAV及/或ERBV之不活化(或活的減毒)之一或多種株系一起地，本文所提供之免疫原性組合物進一步包含選自由西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒及委內瑞拉馬腦脊髓炎及/或破傷風類毒素及其組合組成之群之株系之至少一種額外不活化或活減毒病毒。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    於一實施例中，所提供為一種製備本發明之免疫原性組合物之方法。該方法大致上包括將不活化或活減毒ERAV及/或ERBV與醫藥可接受載劑組合之步驟。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該方法進一步包括添加一或多種額外馬病毒抗原或不活化或活減毒馬病毒之步驟。於另一實施例中，該方法進一步包括添加適宜佐劑至組合物之步驟。
    於一實施例中，所提供為一種用於在動物或動物獸群中降低ERAV或ERBV所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕ERAV或ERBV所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之方法，該方法包括投與本文所揭示之免疫原性組合物給需要之動物。於一些實施例中，該動物為馬。
    該等前述實施例可進一步包括述於下文之以下特徵中之一或多者。
    於一實施例中，所提供為一種包含不活化(或者，選擇性地，活的減毒)ERAV及/或ERBV之至少一種株系及進一步包含病原性西尼羅病毒(WNV)或WNV之不活化或活減毒株系之許多或所有相關之抗原組份及蛋白質之組合物。
    於一實施例中，所提供為一種疫苗組合物，其包含與一或多種免疫有效量之抗原組份或選自由西尼羅病毒(WNV)、委內瑞拉馬腦脊髓炎(VEE)、東部馬腦脊髓炎(EEE)、西部馬腦脊髓炎(WEE)、破傷風類毒素(T)、包括1與4型之馬皰疹病毒(EHV)、馬流感病毒(EIV)及其組合組成之群之一或多種不活化或活減毒株系組合之不活化(或者活的減毒)ERAV及/或ERBV之一或多種株系，以及醫藥可接受載劑。較佳地，該等實施例欲包括諸如卡波姆(carbomer)之佐劑及醫藥可接受載劑。於其他實施例中，該佐劑為HRA-5、卡波姆或礦物油。
    於一些實施例中，該等組合物亦包含與以下不活化或活減毒病毒株系或抗原及株系與抗原之組合組合之不活化或活減毒ERAV及/或ERBV：西尼羅病毒；東部馬腦脊髓炎；西部馬腦脊髓炎；委內瑞拉馬腦脊髓炎；破傷風類毒素；東部馬腦脊髓炎與西部馬腦脊髓炎；東部馬腦脊髓炎與委內瑞拉馬腦脊髓炎；東部馬腦脊髓炎與破傷風類毒素；東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎及委內瑞拉馬腦脊髓炎；東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎及破傷風類毒素；東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎及破傷風類毒素；西部馬腦脊髓炎與委內瑞拉馬腦脊髓炎；西部馬腦脊髓炎與破傷風類毒素；西部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎及破傷風類毒素；委內瑞拉馬腦脊髓炎與破傷風類毒素；及東部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎及破傷風類毒素，或抗原或其抗原組份。該等特定組合中之一較佳組合包括與西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎及破傷風類毒素之不活化病毒之抗原或抗原組份組合之ERAV及/或ERBV。另一較佳組合包括與東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎及破傷風類毒素之抗原或抗原組份組合之ERAV及/或ERBV。較佳之ERAV包括ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)、含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列，含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列之ERAV株系，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。該ERAV株系亦可含有其經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。較佳之ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829，或其含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及在未不活化時活化感染並於宿主細胞中進行複製，及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列之株系，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於此各特定組合中，可使用佐劑或佐劑之組合，諸如HRA-5、卡波姆或與卡波(carbopol)。東部馬腦脊髓炎之NJO株系、西部馬腦脊髓炎株系之弗萊明(Fleming)株系及委內瑞拉馬腦脊髓炎株系之TC-83株系為該等疫苗組份之所有代表性株系。
    本發明之其他較佳實施例包括使用以上所列特定組合疫苗之各者及添加馬源性皰疹病毒(較佳是指1型、4型(EHV1及/或EHV4))之抗原或不活化或減毒病毒或其組合製得之免疫原性組合物。
    包括包含EHV1及/或EHV4之彼等之以上所列特定組合疫苗或免疫原性組合物之各者之更多其他變化可藉由添加馬源性流感病毒(EIV)之抗原或不活化或減毒病毒製得。併有馬流感病毒之較佳實施例包括不活化或活減毒：ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒及破傷風類毒素之各者之至少一種不活化或活減毒株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、破傷風類毒素及東部馬腦脊髓炎之各者之至少一種不活化或活減毒株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、破傷風類毒素、東部馬腦脊髓炎及西部馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、破傷風類毒素、東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎及委內瑞拉馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒及東部馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒及西部馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒及委內瑞拉馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、東部馬腦脊髓炎及西部馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、東部馬腦脊髓炎及委內瑞拉馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、西部馬腦脊髓炎及委內瑞拉馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、西部馬腦脊髓炎及破傷風類毒素之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎及破傷風類毒素之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎及破傷風類毒素之各者之至少一種株系；及ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎、東部馬腦脊髓炎及破傷風類毒素之各者之至少一種株系，其中該等前述株系為不活化或活減毒的。各特定實施例中可存有馬流感病毒之一或多種不活化或活減毒株系。馬流感病毒之較佳株系包括流感A/馬-2/Ohio/03、流感A/馬-2/New Market/2/93、流感A/馬-2/Kentucky/95及其組合。於以上所列之所有組合中，最好使用馬流感病毒之至少兩種不活化或活減毒株系及又更佳使用馬流感病毒之至少3種株系。
    併有馬皰疹病毒之較佳實施例包括：ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、破傷風類毒素及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、破傷風類毒素、東部馬腦脊髓炎及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、破傷風類毒素、東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、破傷風類毒素、東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒及東部馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、西部馬腦脊髓炎及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎之各者之至少一種株系，及ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、東部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、西部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、西部馬腦脊髓炎、破傷風類毒素及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎、破傷風類毒素及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎、破傷風類毒素及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系；及ERAV及/或ERBV及WNV、馬流感病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎、東部馬腦脊髓炎、破傷風類毒素及馬皰疹病毒之各者之至少一種株系，其中該等前述株系為不活化或活減毒的。於以上所列之所有組合中，最好使用不活化或活減毒馬流感病毒之至少兩種株系及又更佳使用不活化或活減毒馬流感病毒之至少3種株系。另外，於以上所有組合中，馬皰疹病毒之「至少一種」株系較佳係選自由不活化EHV-1及EHV-4組成之群。於一些較佳形式中，免疫原性組合物中同時包含不活化或活減毒株系EHV-1及EHV-4。於其他較佳形式中，僅含EHV-1。於一較佳組合中，該不活化或活減毒ERAV株系為ERAV/ON/05、含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列，含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性及在其未不活化時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列之ERAV株系，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。該ERAV株系亦可含有其經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於其他較佳實施例中，ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11828，或含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11828之該ERBV株系之該基因組之逆轉錄本的核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11828之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之株系，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    本文所揭示之免疫原性組合物可以任何免疫有效劑量投與。於一較佳實施例中，該免疫原性組合物係以單劑量投與。較佳地，該劑量具有介於約0.5 mL與約2.5 mL之間，更佳介於約0.6 mL與約2.0 mL之間，又更佳介於約0.7 mL與約1.75 mL之間，又更佳介於約0.8 mL與約1.5 mL之間，又更佳介於約0.9 mL與約1.25 mL之間之總體積，且約1.0 mL之單劑量為最佳。
    於另一實施例中，該免疫原性組合物係以在第二(追加)劑量投與之前投與第一劑量來投與。較佳地，該第二劑量係在第一劑量至少約15天後投與。更佳地，該第二劑量係在第一劑量約15天與約28天之間後投與。又更佳地，該第二劑量係在第一劑量至少約17天後投與。又更佳地，該第二劑量係在第一劑量約17天與約25天之間後投與。甚至更佳地，該第二劑量係在第一劑量至少約19天後投與。又更佳地，該第二劑量係在第一劑量約19天與約23天之間後投與。最佳地，該第二劑量係在第一劑量至少約21天後投與。於一較佳實施中，免疫原性組合物之該等第一及第二劑量之量相同。較佳地，各劑量之較佳量為以上所特定，且針對該等第一及第二劑量而言約1 mL之劑量為最佳。除了該等第一及第二劑量療程之外，一替代實施例包括其他增補劑量。例如，可於該等實施例中投與第三、第四或第五劑量。較佳地，隨後之第三、第四及第五劑量療程係以如該第一劑量之相同量投與，該等劑量間之時間框與以上述及之該等第一及第二劑量間之時序一致，然而，該時序亦可改變。
    於一實施例中，該免疫原性組合物係以3劑量方式投與。於一些實施例中，此3劑量係以3週時間間隔方式投與。
    於包括ERAV(較佳是指ERAV/ON/05)之一實施例中，免疫原性組合物中ERAV之量為至少約102.0TCID50/劑量。更佳地，ERAV之該量係介於約102.0TCID50/劑量至約1010.0TCID50/劑量之間。又更佳地，ERAV之該量為至少約102.5TCID50/劑量。甚至更佳地，ERAV之該量係介於約102.5TCID50/劑量至約109.5TCID50/劑量之間。又更佳地，ERAV之該量為至少約103.0TCID50/劑量。甚至更佳地，ERAV之該量係介於約103.0TCID50/劑量至約109.0TCID50/劑量之間。又更佳地，ERAV之該量為至少約103.5TCID50/劑量。甚至更佳地，ERAV之該量係介於約103.5TCID50/劑量至約109.0TCID50/劑量之間。又更佳地，ERAV之該量係介於約106.5TCID50/劑量至約108.5TCID50/劑量之間。更佳地，ERAV之該量係介於約107.0TCID50/劑量與約109.0TCID50/劑量之間。不活化或減毒ERAV或任何其他不活化或減毒疫苗之該等TCID50值一般係指最終疫苗中之病毒含量，然該含量等同於針對其病毒不活化之前之疫苗組合物算得之病毒含量。較佳地，本發明之該免疫原性組合物以至少1：112、1：300、1：500、1：700，1：900、1：1000，或1：1500之效價刺激血清中和抗體對ERAV。
    於包括ERBV(較佳是指具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系)之一實施例中，ERBV之量為至少約102.0TCID50/劑量。更佳地，ERBV之該量係介於約102.0TCID50/劑量至約1010.0TCID50/劑量之間。又更佳地，ERBV之該量為至少約102.5TCID50/劑量。甚至更佳地，ERBV之該量係介於約102.5TCID50/劑量至約109.5TCID50/劑量之間。又更佳地，ERBV之該量為至少約103.0TCID50/劑量。甚至更佳地，ERBV之該量係介於約103.0TCID50/劑量至約109.0TCID50/劑量之間。又更佳地，ERBV之該量為至少約103.5TCID50/劑量。甚至更佳地，ERBV之該量係介於約103.5TCID50/劑量至約109.0TCID50/劑量之間。又更佳地，ERBV之該量係介於約106.5TCID50/劑量至約108.5TCID50/劑量之間。更佳地，ERBV之該量係介於約107.0TCID50/劑量與約109.0TCID50/劑量之間。不活化ERBV或任何其他不活化疫苗之該等TCID50值一般係指最終疫苗中之病毒含量，該含量然等同於針對其病毒不活化之前之疫苗組合物算得之病毒含量。較佳地，本發明之該免疫原性組合物以至少1：4或更高之效價刺激血清中和抗體對ERBV。於一些實施例中，該效價為至少1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14，或1：15或更高。於一些實施例中，該效價為至少1：64、1：256，或1：512或更高。於一些實施例中，該效價為至少1：1024或更高。於一些實施例中，該效價為至少1：2048、1：1536、1：3072、1：4096、1：6144、1：8192、1：12288，或1：32769或更高。於一些實施例中，該效價不超過1：300、1：1050、1：32000、1：70000，或1：140000。
    於一實施例中，在含有一或多種額外馬抗原之本發明一實施例之各劑量中，任何劑量中東部馬腦脊髓炎或委內瑞拉馬腦脊髓炎之量較佳為至少約105.5TCID50/劑量。甚至更佳地，該劑量係介於約105.5TCID50/劑量與約109.5TCID50/劑量之間。又更佳地，該劑量為至少約106.0TCID50/劑量。又更佳地，該劑量係介於約106.0TCID50/劑量與約109.0TCID50/劑量之間。甚至更佳地，該劑量為至少約106.5TCID50/劑量。又更佳地，該劑量係介於約106.5TCID50/劑量與約109.5TCID50/劑量之間。甚至更佳地，該劑量為至少約107.0TCID50/劑量。最佳地，該劑量係介於約106.7TCID50與約109.2TCID50/劑量之間。
    於含有不活化或已殺滅之WNV或抗原之一實施例中，WNV或抗原之量為至少約102.0TCID50/劑量。更佳地，該WNV或抗原係介於約102.0TCID50/劑量至約1010.0TCID50/劑量之間。又更佳地，該WNV或抗原為至少約102.5TCID50/劑量。甚至更佳地，該WNV或抗原係介於約102.5TCID50/劑量至約109.5TCID50/劑量之間。又更佳地，該WNV或抗原為至少約103.0TCID50/劑量。甚至更佳地，該WNV或抗原係介於約103.0TCID50/劑量至約109.0TCID50/劑量之間。又更佳地，該WNV或抗原為至少約103.5TCID50/劑量。甚至更佳地，該WNV或抗原係介於約103.5TCID50/劑量至約109.0TCID50/劑量之間。最佳地，該WNV或抗原係介於約107.0TCID50/劑量與約109.0TCID50/劑量之間。不活化WNV疫苗或任何其他不活化疫苗之該等TCID50值一般係指最終疫苗中之抗原含量，該含量然等同於針對其抗原不活化之前之疫苗組合物算得之抗原含量。較佳地，本發明之該免疫原性組合物以至少1：4或更高之效價刺激血清中和抗體對WNV。於一些實施例中，該效價為至少1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14，或1：15或更高。於一些實施例中，該效價不超過1：300、1：1050、1：32000、1：70000，或1：140000。於一較佳實施例中，在含有額外馬抗原之本發明一實施例之各劑量中，任何劑量中東部馬腦脊髓炎或委內瑞拉馬腦脊髓炎之量較佳為至少約105.5TCID50/劑量。甚至更佳地，該劑量係介於約105.5TCID50/劑量與約109.5TCID50/劑量之間。又更佳地，該劑量為至少約106.0TCID50/劑量。又更佳地，該劑量係介於約106.0TCID50/劑量與約109.0TCID50/劑量之間。甚至更佳地，該劑量為至少約106.5TCID50/劑量。又更佳地，該劑量係介於約106.5TCID50/劑量與約109.5TCID50/劑量之間。甚至更佳地，該劑量為至少約107.0TCID50/劑量。最佳地，該劑量係介於約106.7TCID50劑量與約109.2TCID50/劑量之間。
    較佳地，在存於本發明之組合物中之情況下，西部馬腦脊髓炎抗原之量為至少約106.2PFU/mL。甚至更佳地，該量係介於約106.2PFU/mL與約1010.2PFU/mL之間。又更佳地，該量為至少約106.7PFU/mL。甚至更佳地，該量係介於約106.5PFU/mL與約109.7PFU/mL之間。又更佳地，該量為至少約107.2PFU/mL。甚至更佳地，該量係介於約107.2PFU/mL與約109.2PFU/mL之間。又更佳地，該量為至少約107.7PFU/mL，且介於約106.5 PFU/劑量與約109.0PFU/mL之間為最佳。
    於另一較佳實施例中，假若存於本發明之組合物中，則破傷風類毒素之量為至少約3 CPU，更佳地，介於約3 CPU與約20 CPU之間，又更佳地，為至少約4 CPU，及最佳地，為至少約5 CPU然不超過約20 CPU。
    於一替代實施例中，在存有馬流感病毒之一或多種株系之情況下，組合物中馬流感之量為至少約105.0 TCID50/mL含量。更佳地，該馬流感之量係介於約105.0 TCID50/mL至約109.0 TCID50/mL之間，及更佳地，為至少約106.0 TCID50/mL含量。又更佳地，該量係介於約106.0 TCID50/mL至約108.0 TCID50/mL之間，及更佳地，該量為至少約106.5 TCID50/mL。又更佳地，該量係介於約106.5 TCID50/mL至約107.5 TCID50/mL之間，且最佳之量係介於約106.7 TCID50/mL至約107.3 TCID50/mL之間。
    於含有馬皰疹病毒之一實施例中，各劑量中馬皰疹病毒之量為至少約106.0 TCID50/mL。更佳地，馬皰疹病毒以介於約106.0 TCID50/mL至約109.5 TCID50/mL之間之量，及更佳約107.0 TCID50/mL之量存於組合物中。又更佳地，馬皰疹病毒以介於約107.5 TCID50/mL至約109.0 TCID50/mL之量，及更佳約108.0 TCID50/mL之量存在。又更佳地，馬皰疹病毒以介於約108.0 TCID50/mL至約109.0 TCID50/mL之量，及更佳約108.50 TCID50/mL之量存在。
    於又一較佳實施例中，提供一種含有ERAV及/或ERBV之年代及流行病流行株系之疫苗組合物。較佳地，該組合物含有ERAV/ON/05及/或具有ATCC寄存編號：PTA-11829之ERBV株系。於特定實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含核苷酸序列SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有其經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組之送轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。此種組合物大致上增進該組合物之療效。
    本發明另外提供一種在動物(較佳而言，馬)中降低與ERAV及/或ERBV感染相關之臨床徵兆之發生率及/或嚴重度之方法。該等方法一般而言包括投與含有ERAV及/或ERBV之不活化或活減毒株系及醫藥可接受載劑之疫苗組合物之步驟。於特定實施例中，該ERAV為ERAV/ON/05，或該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有其經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些較佳實施例中，將佐劑(特定言之HRA-5)添加至該組合物，及於其他較佳形式中，並未提供佐劑。
    於另一較佳實施例中，該方法包括投與含有與免疫有效量之抗原組份或源自其他馬病原體之不活化株系組合之ERAV及/或ERBV之一或多種不活化或活減毒株系之疫苗組合物。較佳地，該ERAV株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)及該ERBV株系具有ATCC寄存編號：PTA-11829。於此等特定實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有含SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或活減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有其經逆轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。
    於該方法之一些實施例中，與ERAV及/或ERBV株系組合之病原體係選自由EHV及EIV之抗原或不活化或減毒株系及其組合組成之群。於一些實施例中，該等病原體為抗原。於一些實施例中，該EHV為EHV-1或EHV-4或其組合。於其他實施例中，該EIV係選自由支系1病毒、支系2病毒、流感A/South Africa/2003、流感A/馬-2/Ohio/03、流感A/馬-2/New Market/2/93、流感A/馬-2/Kentucky/95、流感A/馬-2/Richmond/1/2007及其組合組成之群。
    又於該方法之其他實施例中，與ERAV及/或ERBV株系組合之病原體係選自由WNV、東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎及委內瑞拉馬腦脊髓炎及破傷風類毒素之抗原或不活化或減毒株系及其組合組成之群，及更佳地，為以上所述之該等組合。於另一較佳實施例中，本發明之疫苗係與適宜之佐劑及/或醫藥可接受載劑組合。
    本發明提供用於在獸群中降低與ERAV及/或ERBV感染相關之臨床症狀之發生率及/或嚴重度之方法。較佳地，接受本發明之免疫原性組合物之動物之臨床症狀之嚴重度及/或發生率相較於未接受此種投藥之動物在兩群組(接受該組合物之動物及未接受該組合物之動物)均以ERAV及/或ERBV攻毒或曝露感染ERAV及/或ERBV之情況下降低至少10%。更佳地，發生率或嚴重度降低至少20%，甚至更佳地，降低至少30%，又更佳地，降低至少40%，甚至更佳地，降低至少50%，又更佳地，降低至少60%，甚至更佳地，降低至少70%，又更佳地，降低至少80%，甚至更佳地，降低至少90%，又更佳地，降低至少95%，及最佳地，降低至少100%，其中接受本發明之該組合物之該等動物未顯示臨床症狀，或選擇性地顯示嚴重度降低之臨床症狀。適宜地，本發明亦提供免遭病原體之異源性株系(相對用於組合物中之株系)影響之保護。
    本發明進一步提供一種藉由投與根據本文所述本發明之組合物刺激血清中和或血清血球凝集抗體對選自由ERAV、ERBV、WNV、WEE、VEE、EEE、EHV、EIV及其組合組成之群之病原體之方法。於特定實施例中，該ERAV為ERAV/ON/05，或該ERAV株系含有其逆轉錄本具有含SEQ ID NO：1之5'UTR之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV株系含有其逆轉錄本具有與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERAV蛋白質，或其編碼具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERAV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。於一些實施例中，該ERAV株系含有其經轉錄時具有核苷酸序列SEQ ID NO：2或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質之基因組序列。於一些實施例中，該ERBV為具有ATCC寄存編號：PTA-11829之株系。於一些實施例中，該ERBV株系含有其逆轉錄本具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組之逆轉錄本之核苷酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之核苷酸序列及其在未不活化或減毒時活化感染並於宿主細胞中進行複製及/或編碼功能性ERBV蛋白質，或其編碼具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該株系之聚合蛋白質之胺基酸序列具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質之基因組序列，該聚合蛋白質包括功能性ERBV蛋白質(即，於病毒感染及複製時具活性)。較佳地，本發明之該等組合物以至少1：112、1：120、1：300、1：500、1：1000，或1：1024或更高之效價刺激血清中和抗體對ERAV及/或ERBV。
    本發明之免疫原性組合物使得抗疫苗中所存所有株系之免疫持續時間延長。較佳地，抗ERAV及/或ERBV之免疫持續時間為至少1個月，更佳地，該免疫持續時間為至少2個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少3個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少4至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少6至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少7至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少8至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少9至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少10至24個月，及最佳地，該免疫持續時間為至少12至24個月。
    本發明之免疫原性組合物亦使得抗疫苗中所存所有抗原之免疫持續時間延長。較佳地，抗西尼羅之免疫持續時間為至少1個月，更佳地，該免疫持續時間為至少2個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少3個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少4至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少6至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少7至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少8至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少9至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少10至24個月，及最佳地，該免疫持續時間為至少12至24個月。
    較佳地，抗EIV之免疫持續時間為至少1個月，更佳地，該免疫持續時間為至少2個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少3個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少4至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少6至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少7至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少8至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少9至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少10至24個月，及最佳地，該免疫持續時間為至少12至24個月。
    較佳地，抗EHV之免疫持續時間為至少1個月，更佳地，該免疫持續時間為至少2個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少3個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少4至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少6至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少7至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少8至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少9至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少10至24個月，及最佳地，該免疫持續時間為至少12至24個月。
    較佳地，抗西部馬腦脊髓炎之免疫持續時間為至少1個月，更佳地，該免疫持續時間為至少2個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少3個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少4至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少6至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少7至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少8至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少9至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少10至24個月，及最佳地，該免疫持續時間為至少12至24個月。
    較佳地，抗東部馬腦脊髓炎之免疫持續時間為至少1個月，更佳地，該免疫持續時間為至少2個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少3個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少4至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少6至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少7至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少8至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少9至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少10至24個月，及最佳地，該免疫持續時間為至少12至24個月。
    較佳地，抗委內瑞拉馬腦脊髓炎之免疫持續時間為至少1個月，更佳地，該免疫持續時間為至少2個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少3個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少4至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少6至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少7至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少8至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少9至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少10至24個月，及最佳地，該免疫持續時間為至少12至24個月。
    較佳地，抗破傷風類毒素之免疫持續時間為至少1個月，更佳地，該免疫持續時間為至少2個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少3個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少4至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少6至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少7至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少8至24個月，甚至更佳地，該免疫持續時間為至少9至24個月，又更佳地，該免疫持續時間為至少10至24個月，及最佳地，該免疫持續時間為至少12至24個月。
    較佳地，至少12個月之免疫持續時間進一步有關於形成本發明之免疫原性組合物之抗原之任何組合。
    於含有本文所揭示之不活化(或者活減毒)ERAV及/或ERBV之一實施例中，該免疫原性組合物改善感染性ERAV及/或ERBV之散佈，而防止該病毒擴散至其他易感性動物。於一些實施例中，該等組合物防止該病毒散佈。
    於含有如上所述EIV及/或EHV抗原之一實施例中，該免疫原性組合物改善感染性EIV或EHV之散佈而防止該病毒擴散至其他易感性動物。
    於一實施例中，根據本文所述本發明之組合物克服來自被動獲得之母源免疫之干擾並刺激主動免疫及降低經疫苗接種對抗EIV之動物中EIV感染之臨床徵兆之發生率或嚴重度。
    於本發明之一實施例中，含有皆述於本文中之ERAV及/或ERBV、VEE、WEE、EEE、破傷風、WNV、馬鼻肺炎及馬流感之免疫原性組合物展現依據本發明之投藥後之抗ERAV、ERBV、VEE、WEE、EEE、破傷風、WNV、馬鼻肺炎及馬流感之療效。較佳地，此種組合物進一步包含佐劑(較佳言之HRA-5、礦物油及/或卡波姆)及醫藥可接受載劑。在較佳形式中，組合物以單1 mL劑量投與。於一些實施例中，組合物係以兩劑量或較佳三劑量投與，且各劑量間隔1、2、3及4週。
    包含ERAV(特定言之ERAV/ON/05(ATCC寄存編號：PTA-11828))及如前述之其他株系及/或ERBV(特定言之具有ATCC寄存編號：PTA-11829之ERBV株系)或亦如前述之其他株系之述於本文之免疫原性組合物之各者可如所述投與以致其降低與ERAV及/或ERBV相關之臨床症狀(諸如發熱、體溫升高、肺音增強、淋巴腺病、鼻分泌、眼分泌、咽炎、腿之水腫、咳嗽，及就ERAV而言，母馬流產發生率增加)之發病率或減輕與ERAV及/或ERBV相關之臨床症狀之嚴重度。於一些態樣中，該等組合物減少鼻或眼分泌之量或時間長度或呈現該等症狀之時間長度。於一些態樣中，接種該等組合物之動物在曝露於ERAV及/或ERBV 1週或更長時間後未顯示ERAV及/或ERBV感染之臨床症狀。於其他態樣中，接種該等組合物之動物在曝露於ERAV及/或ERBV時未顯示ERAV及/或ERBV感染之臨床症狀。ERAV及/或ERBV之臨床症狀可諸如根據實例2之表3，實例4之表14或實例5之表17進行評分。
    本文所述免疫原性組合物之各者含有EIV抗原或不活化EIV且可如所述投與以致其降低與馬流感病毒相關之臨床症狀之發病率或減輕與馬流感病毒相關之臨床症狀之嚴重度。
    本發明亦提供一種用於降低與馬皰疹病毒相關之臨床症狀之發病率或減輕與馬皰疹病毒相關之臨床症狀之嚴重度之方法，包括將含有EHV抗原或不活化或減毒EHV之上述免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明亦提供一種用於降低與西尼羅病毒相關之臨床症狀之發生率之方法，包括如本文所述將含有WNV抗原或不活化或減毒WNV之免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明亦提供一種用於降低與馬流感病毒相關之臨床症狀之發生率之方法，包括將含有EIV抗原或不活化或減毒EIV之上述免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明進一步提供一種用於降低與馬皰疹病毒相關之臨床症狀之發生率之方法，包括將含有EHV抗原或不活化或減毒EHV之上述免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明提供一種在獸群中降低病毒感染之發生率之方法，包括將上述免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟，其中，相較於未接受該免疫原性組合物之獸群，感染發生率降低約10%至約50%。於一實施例中，本文所提供之該等組合物使得ERAV感染降低10%至50%。於其他實施例中，本文所提供之該等組合物使得ERBV感染降低10%至50%。
    本發明亦提供一種降低與馬流感病毒相關之臨床症狀之發生率之方法，包括將上述免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟，其中，臨床症狀降低相較於未接受該免疫原性組合物之動物，於臨床症狀上降低至少10%。
    本發明提供一種在獸群中降低ERAV或ERBV之臨床症狀之發生率及嚴重度之方法，其中該等臨床症狀係選自由發熱、體溫升高、肺音增強、淋巴腺病、鼻分泌、眼分泌、咽炎、咳嗽、腿之水腫，及就ERAV而言，母馬流產發生率增加組成之群。
    本發明提供一種在獸群中降低EHV之臨床症狀之發生率及嚴重度之方法，其中該等臨床症狀係選自由呼吸疾病、流產、生殖併發症、神經疾病、中樞神經系統疾病及其組合組成之群。
    本發明提供一種用於降低與馬皰疹病毒相關之臨床症狀之發病率或減輕與馬皰疹病毒相關之臨床症狀之嚴重度之方法，包括將含有EHV抗原或不活化或減毒EHV之本文所揭示免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明提供一種用於在獸群中降低與馬流感病毒相關之臨床症狀之發病率或減輕與馬流感病毒相關之臨床症狀之嚴重度之方法，包括將含有EIV抗原或不活化或減毒EIV之本文所揭示免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明提供一種用於在獸群中降低與西尼羅病毒相關之臨床症狀之發病率或減輕與西尼羅病毒相關之臨床症狀之嚴重度之方法，包括將含有WNV抗原或不活化或減毒WNV之本文所揭示免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明提供一種用於在獸群中降低與東部馬腦脊髓炎相關之臨床症狀之發病率或減輕與東部馬腦脊髓炎相關之臨床症狀之嚴重度之方法，包括將含有EEE病毒抗原或不活化或減毒EEE病毒之本文所揭示免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明進一步提供一種用於在獸群中降低與西部馬腦脊髓炎相關之臨床症狀之發病率或減輕與西部馬腦脊髓炎相關之臨床症狀之嚴重度之方法，包括將含有WEE病毒抗原或不活化或減毒WEE病毒之本文所揭示免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    本發明進一步提供一種用於在獸群中降低與委內瑞拉馬腦脊髓炎相關之臨床症狀之發病率或減輕與委內瑞拉馬腦脊髓炎相關之臨床症狀之嚴重度之方法，包括將含有VEE病毒抗原或不活化減毒VEE病毒之本文所揭示免疫原性組合物中之任何一者投與給動物之步驟。
    前述實施例可以組合療法或作為與其他免疫原性藥劑及疫苗組合之免疫接種時間表之一部分使用。於一實施例中，本文所提供之該等組合物係以與WO 2010/025469中所述之免疫原性藥劑及疫苗組合使用，該案之全文係以引用的方式併入本文中。
    本發明亦提供一種製備以上及此處所述之免疫原性組合物中之任何一者之方法，包括將不活化或活減毒ERAV或ERBV與適宜醫藥載劑組合之步驟。於較佳形式中，該方法進一步包括添加一或多種馬抗原或不活化或減毒病毒之步驟。馬抗原及病毒之一較佳群係選自由西尼羅病毒、西部馬腦脊髓炎、東部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎、EHV及EIV及破傷風類毒素及其組合組成之群。於一些較佳形式中，本文所述之該等方法可進一步包括過濾步驟，其中該最終產物係呈較高純度之形式。
    「約」係指特定量之±10%。
    本文所用「動物」包括包括狗之馴養動物及包括馬科(及明確言之是指馬)之家畜動物。於一些實施例中，該術語亦指人。
    本文所用「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、皂苷(例如：Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL))、非代謝性油、礦物及/或植物(plant)/蔬菜(vegetable)及/或動物油、聚合物、卡波姆、表面活性劑、天然有機化合物、植物提取物、碳水化合物、膽固醇、脂質、油包水乳液、水包油乳液、水/油/水乳液、HRA-3(丙烯酸醣交聯聚合物)、含棉籽油(CSO)之HRA-3或較佳地，HRA-5(丙烯酸聚醇交聯聚合物。該乳液可特定言之基於輕液體石蠟油(歐洲藥典模式)；類異戊二烯油，諸如鯊烷(squalane)或鯊烯(squalene)；藉由烯烴(特定言之異丁烯或癸烯)寡聚所獲得之油；含直鏈烷基之酸或醇之酯，更特定言之植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇之酯，特定言之異硬脂酸酯。該油與乳化劑組合使用形成乳液。該等乳化劑較佳為非離子表面活性劑，特定言之山梨醇酐之酯、二縮甘露醇之酯(例如脫水甘露醇油酸酯)、二醇之酯、聚甘油之酯、丙二醇之酯及視需要經乙氧基化之油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯，及聚環氧丙烷-聚環氧乙烷共聚物嵌段(特定言之普洛尼克(Pluronic)產物，尤其係L121)。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.)John Wiley and Sons,NY,pp51-94(1995)及Todd等人，Vaccine 15：564-570(1997)。於一較佳實施例中，該佐劑的濃度為最終產物之約0.01至約50體積%，較佳約2體積%至30體積%，更佳約5體積%至約25體積%，又更佳約7體積%至約22體積%，及更佳約10體積%至約20體積%。
    如文中所用，「醫藥可接受載劑」或「醫藥載劑」包括任何及所有賦形劑、溶劑、生長介質、分散介質、塗料、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、滅活劑、抗微生物劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑等。該等成分包括安全及適宜用於獸用應用之彼等。於一些較佳實施例(及尤其係指包括凍乾免疫原性組合物之彼等)中，適用於本發明之穩定劑包括適用於凍乾或冷凍-乾燥之穩定劑。
    「稀釋劑」可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可尤其包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼鹽。
    於一較佳實施例中，製得本發明之免疫原性組合物，其包含防腐劑及穩定劑；及更佳地，製得本發明之免疫原性組合物，其包含兩性黴素、甲醛、健大黴素、EDTA、甘油及其組合。
    「免疫原性或免疫組合物」係指含有在對所關注的組合物或疫苗產生細胞及/或抗體介導免疫反應之宿主中引起免疫反應之至少一種抗原之物質組合物。通常地，「免疫反應」包括(但不限於)以下效果中之一或多者：產生或活化抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞及/或γ-δ T細胞，其明確言之與包含於所關注的組合物或疫苗中之一或多種抗原有關。較佳地，該宿主顯示治療性或預防性免疫反應中之任何一種反應，因此可增強針對新感染之抗性及/或降低疾病之臨床嚴重度。藉由減輕或缺乏通常由經感染之宿主展現之臨床徵兆，恢復時間變快及/或持續時間或經感染之宿主之組織或體液或排泄物之細菌效價減小證實該預防。
    本文所用術語「需要該投藥」或「需要該投藥治療」意指投藥/治療關聯於接受根據本發明之免疫原性組合物之該等動物之健康之增強或改善或任何有關接受根據本發明之免疫原性組合物之該等動物之健康之其他正向藥用效果，諸如降低病毒感染或疾病之發病率或嚴重度。
    「馬鼻炎A病毒(ERAV)」係指小核醣核酸病毒科(family Picornaviridae)中之口蹄疫病毒(Aphthovirus)，且在過去稱為馬鼻病毒1。用於本文中之「ERAV」包括不活化形式。於一實施例中，該ERAV為具有2011年4月14日依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)以ATCC(美國典型培養物保藏所，P.O.Box 1549 Manassas,VA 20108 USA)寄存之寄存編號PTA-11829之株系ERAV/ON/05，且其係由馬之鼻擦拭棒之兔-腎臟-13(RK-13)細胞培養物(Ontario Canada，2005年)回收。該ERAV/ON/05在經逆轉錄及定序時於其5'UTR區中具有SEQ ID NO：1。
    ERAV/ON/05之逆轉錄基因組序列為SEQ ID NO：2。
    由ERAV/ON/05之基因組序列編碼之聚合蛋白質為SEQ ID NO：3。
    適用於本發明之該等免疫原性組合物之該等ERAV株系具有與SEQ ID NO：1具有85%、90%、95%、98%、99%以上或100%序列同一性之逆轉錄5'UTR核苷酸序列。於一些實施例中，該等ERAV株系具有在逆轉錄為DNA時與SEQ ID NO：2之同一性超過85%、90%、95%、98%、99%或100%或具有與SEQ ID NO：2之聚合蛋白質編碼序列之同一性超過97%、98%、99%或100%之聚合蛋白質編碼序列之基因組序列。於一些實施例中，該ERAV具有包含與SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3中之VP1序列具有95%、96%、97%、98%、99%以上或100%之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質。又於其他實施例中，該ERAV具有L蛋白質、VP2、VP3、VP4、VP0、2A、2B、2C、3A、3B、3C或3D，其具有與SEQ ID NO：3中所見之該蛋白質具有80%以上、90%以上、99%以上或100%之同一性之胺基酸序列。所有該等ERAV株系在未不活化或減毒時均具感染性且可於宿主細胞中進行複製。
    「馬鼻炎B病毒(ERBV)」係指小核醣核酸病毒科中之馬鼻病毒(Erbovirus)，且在以前稱為馬鼻病毒2。本文所用「ERBV」包括不活化形式。於一實施例中，該ERBV為以ATCC寄存之株系，其係自馬之鼻擦拭棒之兔-腎臟-13(RK-13)細胞培養物回收(Ontario Canada)(ATCC寄存編號：PTA-11828)，在2011年4月14日於布達佩斯條約下以ATCC(美國典型培養物保藏所，P.O.Box 1549 Manassas,VA 20108 USA)寄存。適用於本發明之該等免疫原性組合物之該等ERBV株系具有在逆轉錄為DNA時與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組序列之逆轉錄本同一性超過85%、90%、95%、98%、99%或100%，或具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之聚合蛋白質編碼序列同一性超過97%、98%、99%，或100%之聚合蛋白質編碼序列之基因組序列。於一些實施例中，適用於本發明之該等ERBV株系具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之聚合蛋白質序列具有95%、96%、97%、98%、99%以上或100%之同一性之胺基酸序列之聚合蛋白質。又於其他實施例中，該ERBV具有L蛋白質、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A(Vpg)、3B、3Cpro、3Dpol，其具有與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系中所見之該蛋白質具有80%以上、90%以上、99%以上，或100%之同一性之胺基酸序列。所有該等ERBV株系在未不活化或減毒時具感染性且可於宿主細胞中進行複製。
    術語「西尼羅病毒」抗原意指(但不限於)存於動物中時具免疫原性之WNV病毒粒子之組份，及最特定言之是指蛋白質組份，諸如在存於動物中時誘發體液或細胞免疫反應之WNV之膜套或非結構蛋白質。該等抗原可包括DNA、蛋白質亞單位、改性活病毒及不活化病毒。於本發明之較佳形式中，該(等)WNV抗原包括不活化或殺滅，及甚至更佳為北美優勢種之WNV株系。
    術語「北美西尼羅病毒(株系)」係指(但不限於)北美洲已發現的任何西尼羅病毒株系。較佳地，北美西尼羅病毒株系具有與NY99株系(GenBank寄存編號AF196835或NCBI參考序列NC_00942.1)至少97%，更佳地，至少98%，又更佳地，至少98.5%，更佳地，至少99%，甚至更佳地，至少99.2%，及最佳至少99.4%之序列同一性。WN02為可稱為北美優勢種西尼羅病毒株系之WNV株系之一代表性實例。明確言之，北美優勢種株系為具有至少一個核苷酸變化而導致源自WN99分離株之胺基酸發生改變之彼等。假若株系為北美優勢種，株系NY99(GenBank寄存編號AF196835)充當判定用之參考株系。此外，該等株系可具有一或多處沉默胺基酸變化。於一些實施例中，該核苷酸變化導致株系之膜套蛋白質中之胺基酸發生改變，及更佳地，該核苷酸變化致使胺基酸自纈胺酸變為丙胺酸。較佳地，該胺基酸變化造成於中間宿主(亦即蚊子)中進行複製之能力更強。更佳地，北美優勢種株系包括分別於位置1442及2466(較北美株系言之，例如NY 99)之U至C突變及C至U突變中之任何一者(及較佳兩者)。又更佳地，北美優勢種株系進一步包括編碼E蛋白質之核苷酸序列之突變及編碼NS5蛋白質之序列中之位置9352處之C至U突變(同樣較北美株系言之，例如NY 99)。該等較佳突變示於Phylogenetic Analysis of North American West Nile Virus Isolates,2001-2004：Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype,C.Todd Davis等人，Virology 342，第252至265頁(2005年)，其教示及內容以引用的方式併入本文中。為達本發明目的之西尼羅病毒株系並不受限於馬及馬西尼羅病毒株系，然包括(但不限於)源自鳥、驢、豬、人、哺乳動物及馬之該等西尼羅病毒株系。
    為技藝界悉知之「序列同一性」係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個聚核苷酸序列(亦即，參考序列與欲與該參考序列比較之所給序列)之間之關係。依據序列串之間之匹配度來判定已理想比對該等序列以獲得最高序列相似度之後，將所給序列與參考序列作比較判定序列同一性。進行該比對時，逐個位置地確定序列同一性，例如，該等序列於特定位置「具同一性」，假若於該位置之處，核苷酸或胺基酸殘基相同。該等同一性位置之總數然後藉由除以參考序列中核苷酸或殘基之總數獲得序列同一性%。序列同一性可輕易地藉由已知方法算得，包括(但不限於)述於Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.編輯，Oxford University Press,New York(1988),Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編輯，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin,A.M.與Griffin,H.G.編輯，Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.與Devereux,J.編輯，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.與Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48：1073(1988)(其教示以引用的方式併入本文)中之彼等。判定序列同一性之較佳方法係設計成提供所測試之該等序列之間之最大化匹配。判定序列同一性之方法係以判定所給序列間序列同一性之公開可取之電腦程式進行編碼。該等程式之實例包括(但不限於)GCG套裝程式(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research,12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215：403-410(1990)。該BLASTX程式可公開取自NCBI及其他來源(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215：403-410(1990)，其教示以引用的方式併入本文中)。該等程式利用預設空位加權來理想比對序列使得該等所給及參考序列之間之序列同一性之程度最高。作為一示例，具有與參考核苷酸序列具有例如至少85%，較佳90%，極更佳95%之「序列同一性」之核苷酸序列之聚核苷酸，希望所給聚核苷酸之核苷酸序列等同於該參考序列，除了該所給聚核苷酸序列可包括該參考核苷酸序列之每100個核苷酸中至多15個，較佳至多10個，極更佳至多5個點突變。換言之，於具有相對參考核苷酸序列具有至少85%，較佳90%，極更佳95%之同一性之核苷酸序列之聚核苷酸中，該參考序列中該等核苷酸之至多15%，較佳10%，極更佳5%可缺失或由另一核苷酸置換，或佔該參考序列中總核苷酸高至多15%，較佳10%，極更佳5%之許多核苷酸可插入該參考序列中。該參考序列之該等突變可發生在該參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或在介於該等末端位置之間之任何位置，其不是個別地穿插於該參考序列之核苷酸中就是穿插於該參考序列中之一或多個鄰接群。類似地，具有與參考胺基酸序列具有例如至少85%，較佳90%，極更佳95%之序列同一性之所給胺基酸序列之多肽，希望該多肽之所給胺基酸序列等同於該參考序列，除了該所給多肽序列可包括該參考胺基酸序列之每100個胺基酸中至多15個，較佳至多10個，極更佳至多5個胺基酸變化。換言之，為了獲得與參考胺基酸序列具有至少85%，較佳90%，極更佳95%之序列同一性之所給多肽序列，參考序列中該等胺基酸殘基之至多15%，較佳至多10%，極更佳至多5%可缺失或由另一胺基酸置換，或佔該參考序列中總胺基酸殘基數至多15%，較佳至多10%，極更佳至多5%之許多胺基酸可插入至該參考序列中。該參考序列之該等變化可發生在該參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或在介於該等末端位置之間之任何位置，其不是個別地穿插於該參考序列之殘基中就是穿插於該參考序列中之一或多個鄰接群。較佳地，不同的殘基位置因保守性胺基酸置換而不同。然而，關於判定序列同一性時之匹配，並不包括保守性置換。於本揭示內容中，應明瞭SEQ ID NO：1(5' UTR)及SEQ ID NO：2為分別源於5' UTR及ERAV/ON/05之全基因組之逆轉錄本之DNA序列。同樣地，SEQ ID NO：3係指與由ERAV/ON/05之基因組序列編碼之聚合蛋白質對應之胺基酸序列。因此，相較SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之所給ERAV株系之同一性%意指源於逆轉錄及定序之對應DNA序列。
    「TCID50」係指在以病毒接種之培養物中感染50%細胞之組織培養物感染劑量。
    為達本發明之目的，術語「株系」及「分離株」具有相同的含義且可互換使用。
    ERAV與ERBV之「臨床徵兆」或「臨床症狀」包括(但不限於)發熱、體溫升高、肺音增強、淋巴腺病、鼻分泌、眼分泌，與咳嗽，及咽炎。然而，其他徵兆或症狀包括貧血、厭食、頭及頸之淋巴腺病、腿之水腫、嗜睡，及疼痛。另外，ERAV及/或ERBV感染之臨床徵兆可包括與馬皰疹病毒及馬流感病毒關聯之彼等。於一實施例中，ERAV之臨床徵兆包括咳嗽、咽炎、發熱、體溫升高、下顎下淋巴結尺寸增加、鼻分泌，及眼分泌。於某些實施例中，ERAV之臨床徵兆包括母馬流產發生率增加。於另一實施例中，欲藉由本文所揭示之免疫原性組合物消除之該等臨床徵兆為呼吸感染之彼等，諸如由ERAV、ERBV、EIV、EHV-1及EHV-4中之一或多者引起之彼等。
    就本發明之目的而言，西尼羅病毒之「臨床徵兆」或「臨床症狀」包括(但不限於)與腦炎、病毒血症(viremia)、厭食、憂鬱、發熱、無力、步態異常、後肢麻痺、視覺損傷、共濟失調、無目標性漫遊、痙攣、吞咽無力、昏迷、後部虛弱、麻痺、協調不良，憂鬱及相關行為、顫動、痙攣、肢划船、神經問題、中樞神經系統膨大，死亡及其組合相關之症狀或損害。經感染之動物所展現之該等臨床徵兆根據感染之嚴重度而不同。
    就本發明之目的而言，馬皰疹病毒之「臨床徵兆」或「臨床症狀」包括(但不限於)流產、神經缺陷、呼吸疾病、生殖系統缺陷及損傷，及與中樞神經系統相關之症狀。另外，EHV1之臨床症狀包括(但不限於)受EHV1感染之小馬之現象，顯示呼吸併發症，使得該病毒傳輸至獸群之老長成員，接著顯示生殖缺陷(包括流產)及通常顯示於中樞神經系統中之神經缺陷。
    就本發明之目的而言，東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎及委內瑞拉馬腦脊髓炎之「臨床徵兆」或「臨床症狀」為習知通常與腦脊髓炎相關之該等症狀，包括(但不限於)發熱、諸如對聲音敏感之神經性徵兆、興奮週期，及不寧、腦損傷、睡意、垂耳、旋轉病、步態異常、麻痺、食欲喪失、憂鬱，壓頭、協調缺陷、長期殘廢、腦損傷、死亡及其組合。本文所用「安全性」係指疫苗接種之後經疫苗接種之動物中無不利後果，包括(但不限於)疫苗病毒對毒性及臨床顯著副作用之潛力反轉，諸如疫苗投與部位之處之持續性全身疾病或不可接受之發炎。
    如本文所提及，「降低臨床徵兆之發生率及/或嚴重度」或「降低臨床症狀之發生率及/或嚴重度」意指較野生型感染言之，群組中經感染之動物的數量減少、顯示感染之臨床徵兆之動物的數量減少或清零，或呈現於動物中之任何臨床徵兆之嚴重度減輕。例如，該等臨床徵兆包括病毒血症、發熱、抗體反應、眼分泌、鼻分泌，及組織病理。較佳地，較未接受可令其經感染之疫苗接種之動物言之，其等於接受本發明組合物之動物中減少至少10%。更佳地，臨床徵兆於接受本發明組合物之動物中減少至少20%，更佳至少30%，極更佳至少40%，及特佳至少50%。
    如本文所用，「免疫持續時間」係指動物產生免疫反應使得該動物相對具免疫性防止感染病毒及/或受益於如本文所述之臨床徵兆之發生率及/或嚴重度降低之最少的天數。
    術語「不活化」及「不活化病毒」係指已加熱或進行化學處理以不活化、殺滅，或以其他方式改質病毒以實質上消除其有毒特性同時維持其免疫原性之先前有毒病毒。於一較佳實施例中，本文所揭示之不活化病毒係經由滅活劑處理而不活化。適宜之滅活劑包括β-丙內酯、二乙烯亞胺、戊二醛及甲醛。於一些實施例中，該滅活劑為甲醛。
    當用於本文中時，術語「疫苗」及「免疫原性組合物」意欲可互換使用。
    任何一或多種西尼羅病毒株系或分離株可依據本發明予以使用。於一較佳實施例中，該分離株係選自以下中之一或多者：New York(北美東北部)分離株(WN-NY 99)源自馬，1999、New York(北美東北部)分離株(WN-NY 99)源自烏鴉，1999、美國農業部分離株292206(USDA 2004)，源自驢、美國農業部分離株405330(USDA 2005)，源自馬、北美分離株(WN-Texas-2002/2003)、德州沿岸東南部(Southeast Texas Coastal)分離株2002、墨西哥(Mexico)(Tabasco)分離株2003，及其組合，及於一更佳實施例中，該分離株係選自以下中之一或多者：美國農業部分離株292206(USDA 2004)，源自驢、美國農業部分離株405330(USDA 2005)，源自馬、北美分離株(WN-Texas-2002/2003)、德州沿岸東南部分離株2002、墨西哥(Tabasco)分離株2003，及其組合。於一最佳實施例中，該分離株為美國農業部分離株405330(USDA 2005)源自馬，為單獨形式或與以上所列之一或多種分離株組合形式。於另一較佳實施例中，包括為北美西尼羅病毒分離株之一部分之該等分離株。於又一較佳實施例中，包括北美優勢種西尼羅病毒分離株。除了列於以上之該等之外，特定之分離株包括(但不限於)WN02及具有至少1處，較佳至少2處，極更佳至少3處核苷酸變化導致自該等WN NY99分離株至少一處胺基酸發生變化之分離株，及最佳為具有膜套蛋白質之位置159處自纈胺酸至丙胺酸之胺基酸變化之株系。最佳之北美優勢種株系包括(但不限於)：NY2002Nassau、NY2002Clinton、NY2002Queens、GA20021、GA20022、TX20021、TX20022、IN2002、NY2003Albany、NY2003Suffolk、NY2003Chatauqua、CO20031、CO20032、TX2003、TX2003Harris4、TX2003Harris6、TX2003Harris7、TX2003Harris10、AZ2004及TX2004Harris4，及其組合。適用於本發明之疫苗或免疫原性組合物中之西尼羅病毒之株系可為任何株系或分離株。於一較佳實施例中，所使用之北美優勢種西尼羅病毒株系為E-159(源自馬)或E-159(源自驢)中任何一者。此種北美優勢種WNV株系之一代表性株系包括依據布達佩斯條約之規定於2008年8月14日寄存於位在10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110-2209之ATCC之馬源性2005株系(ATCC寄存編號：PTA-9409)。適用於本發明之疫苗或免疫原性組合物中之馬流感株系可為任何株系或分離株。代表性株系包括Equi-2/Ohio/03(以ATCC寄存編號：PTA-9522寄存)、Equi-2/Kentucky/95(以ATCC寄存編號：PTA-9523寄存)及Equi-2/New Market/2/93(以ATCC寄存編號：PTA-9524寄存)。代表性株系ATCC寄存編號PTA-9522、PTA-9523及PTA-9524中之各者係依據布達佩斯條約之規定於2008年9月23日寄存於位在10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110-2209之ATCC。
    適用於本發明之疫苗或免疫原性組合物中之馬皰疹病毒(「EHV」)株系可為任何株系或分離株。代表性株系包括EHV亞型1(以ATCC寄存編號：PTA-9525寄存)及EHV亞型4(以ATCC寄存編號：PTA-9526寄存)。代表性株系ATCC寄存編號PTA-9525與PTA-9526各者係依據布達佩斯條約之規定於2008年9月23日寄存於位在10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110-2209之ATCC。
    適用於本發明之疫苗或免疫原性組合物中之西部馬腦脊髓炎株系可為任何株系或分離株。一代表性株系包括依據布達佩斯條約之規定於2008年8月14日寄存於位在10801University Boulevard,Manassas,VA,20110-2209之ATCC之弗萊明株系(ATCC寄存編號：PTA-9410)。
    適用於本發明之疫苗或免疫原性組合物中之委內瑞拉馬腦脊髓炎株系可為任何株系或分離株。一代表性株系包括依據布達佩斯條約之規定於2008年8月14日寄存於位在10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110-2209之ATCC之TC-83株系(ATCC寄存編號：PTA-9411)。
    適用於本發明之疫苗或免疫原性組合物之東部馬腦脊髓炎株系可為任何株系或分離株。一代表性株系包括依據布達佩斯條約之規定於2008年8月14日寄存於位在10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110-2209之ATCC之NJO株系(ATCC寄存編號：PTA-9412)。
    適用於本發明之疫苗或免疫原性組合物中之破傷風類毒素株系可為任何株系或分離株。一代表性株系為取自破傷風桿菌(Clostridium tetani)之主種子(獲自實驗室公共健康研究所之Massachusetts部門(The Massachusetts Department of Public Health Institute of Laboratories)，Boston,Massachusetts)之株系。
    本文所揭示之疫苗或免疫原性組合物可安全投與任何年齡之ERAV或ERBV易感性物種(特定言之馬科)。於一較佳實施例中，本發明可安全投與12個月大或更大的小馬，更佳地，其可安全投與10個月大或更大的小馬，更佳地，其可安全投與8個月大或更大的小馬，更佳地，其可安全投與6個月大或更大的小馬，更佳地，其可安全投與4個月大或更大的小馬，更佳地，其可安全投與2個月大或更大的小馬，更佳地，其可安全投與1個月大或更大的小馬，甚至更佳地，其可安全投與1天大與1個月大之間之小馬，及最佳地，其可安全投與1天大或更大的小馬。
    本文所揭示之該等組合物可以任何習知方式投與。投與方法之實例包括實現免疫系統之細胞接收免疫原性組合物之任何方法，包括口服、經皮/皮內、靜脈內、皮下、肌肉內、眼內、腹膜內、直腸內、陰道內、鼻內、胃內、氣管內、肺內或其任何組合。於一較佳實施例中，該疫苗係非經腸投與，較佳鼻內、皮下，或肌肉內投與，及於最佳實施例中，該疫苗係肌肉內投與。
    於一實施例中，所提供為一種製備方法及含有揭示於本文中之ERAV及/或ERBV之免疫原性組合物。於一實施例中，該方法包括：a)以ERAV或ERBV感染易感性細胞系；b)使該等已感染細胞系於生長介質中生長直到達到細胞病變效應(CPE)；c)收穫該介質；d)過濾該介質而獲得經過濾之介質；以及e)將該經過濾之介質與滅活劑接觸獲得不活化ERAV或ERBV。
    於一實施例中，該方法包括提供株系ERAV/ON/05或具有ATCC寄存編號：PTA-11829之ERBV株系。該等株系係用以感染具有有利於疫苗產製之適宜生長及分泌特性之易感性細胞系。一較佳易感性細胞系為諸如Vero76或E-Vero細胞系之Vero細胞系。
    適宜之生長介質包括E199。該介質可補充L-麩胺醯胺酸溶液及諸如硫酸健大黴素溶液之抗生素。於一些實施例中，該生長介質為補充L-麩胺醯胺酸溶液(至高2 mM)及硫酸健大黴素溶液(至高30 μg/mL)之E199。於一些實施例中，在細胞病變效應CPE達到75%或更大時，收穫病毒流體。收集所收穫之介質且諸如透過額定5.0微米孔徑之聚丙烯過濾筒過濾。以化學方式諸如藉以0.1至0.2%甲醛溶液處理一段例如48小時至72小時之適宜時間使得該等株系不活化並濃縮所得的流體。於一些實施例中，接著添加防腐劑及佐劑。適宜之防腐劑包括兩性黴素B、硫酸健大黴素及甲醛中之一或多者。於其他實施例中，該佐劑為HRA-5。又於其他實施例中，該佐劑為含棉籽油(CSO)之HRA-3。
    於一實施例中及依據本文所揭示之該等方法，所提供為一種依據本文所揭示方法製得之含有ERAV/ON/05及/或具有ATCC寄存編號：PTA-11829之ERBV株系及兩性黴素B、硫酸健大黴素、甲醛及HRA-5之免疫原性組合物。 實例
    下文陳述以下實例來說明本發明之特定實施例。該等實例僅具例示性且應明瞭不會限制本發明之範圍或基本原理。 實例1
    該實例例示根據本發明之馬鼻炎A病毒組合物之一實施例。 材料及方法
    於取自馬之鼻擦拭棒之兔-腎臟-13(RK-13)細胞培養物(Ontario Canada)回收馬鼻炎A病毒株系ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)。將該病毒於E-Vero細胞上繼代一次以製得高預效價主儲液，然後利用細胞培養基稀釋獲得該主種子病毒(Master Seed Virus)。主細胞儲液為已生長並使用補充L-麩胺醯胺酸溶液(至高2 mM)及硫酸健大黴素溶液(至高30 μg/mL)之E199維持之E-Vero細胞系。依據以下一般步驟製得不活化ERAV/ON/05。
    於室溫(18至26℃)解凍冷凍主細胞儲液且用以接種一系列之經預殺菌之T-25 cm2至T-150 cm2燒瓶或經預殺菌之850 cm2或1050 cm2 PETG轉瓶。經解凍之細胞係以0.15至0.40 mL/cm2之流率懸浮於生長介質中。於36至38℃下培養細胞至多7天。藉由冷凍儲液栽種之培養物可再饋送介質以移除殘餘的二甲亞碸(DMSO)、移除過多的碎屑、刺激尚未達到匯合之培養物生長，或維持匯合培養物之活力。細胞係藉由傾倒廢介質及對各容器添加1至10 mL(取決於容器之尺寸)之25%胰蛋白酶-EDTA溶液而繼代。輕輕攪動該等容器直到該等細胞自表面脫落為止。藉以生長介質沖洗自該等容器移走該等細胞並收集在一起。細胞培養物繼代之範圍為1至20次。
    在接種之前，自為至少90%匯合率之細胞傾倒出細胞生長介質。利用20至50 mL病毒感染介質(補充L-麩胺醯胺酸溶液(至高2 mM)及硫酸健大黴素溶液(至高30 μg/mL)之E199)沖洗細胞片材，然後，以0.15至0.40 mL/cm2之流率再饋送病毒感染介質。然後，於為0.0005至0.005之感染倍率(MOI)下接種該等容器。在36至38℃於0.2至0.4 rpm下培養轉瓶培養物歷時2至5天。
    於生長期間，針對微觀CEP及宏觀總污染檢驗培養物。殺菌之後棄置不適宜之培養物。
    在CPE達到75%或更大時收穫病毒流體。使該等轉瓶渦旋以移去鬆散的細胞，然後將流體收集於無菌2至20 L玻璃、塑膠或PETG瓶，20 L無菌聚丙烯容器或適用於淨化之2至200 L無菌不鏽鋼槽內。所收集之流體可在淨化之前於2至8℃下靜置至多7天。
    僅收穫自顯示明顯感染病毒之單層培養物之流體。棄置指示污染之瓶。所收集之淨化流體之一樣本係在TCID50滴定不活化之前收集。具有106.2 TCID50/mL或更大效價之流體可用於製備最終產物。可摻合多批次獲得最小效價。
    所收穫之批次係藉由使用額定5.0微米孔徑之聚丙烯過濾筒過濾淨化。淨化後之收穫批次可於2至8℃下儲存至多7天。然後，利用甲醛溶液、USP(0.1至0.2體積%)使淨化流體不活化、轉移至第二容器，然後伴隨振盪於室溫(18-26℃)下保持最短48至72小時。取不活化流體之樣本於濃縮之前用於不活化確保試驗。濃縮之前將不活化批次材料保持於2至8℃下。淨化不活化病毒流體係藉由使用截留分子量評定不超過10,000道耳頓MW之切向流超過濾膜筒以5×至50×之因數濃縮。
    可往該疫苗調配物添加許多適宜之佐劑，最佳為HRA-5。其他佐劑包括含棉籽油(CSO)之HRA-3。可採用典型的處理步驟，諸如該佐劑及/或該等所收穫病毒抗原與其他成分之混合、摻合、微流化，及乳化。
    該產物然後經收集成為最終調配物。於一例示性實施例之分批式方法中，將所需量之佐劑及MEME稀釋劑組合於無菌容器中且利用氫氧化鈉將pH調整至約6.3至6.7。於恆定混合期間，一次一種地添加ERAV、硫酸健大黴素、甲醛及兩性黴素B。利用氫氧化鈉或鹽酸將pH調整至6.8至7.0且於2至8℃下使該系列液混合歷時最短18小時。然後將完成的分批系列轉移至適宜之儲存容器並儲存於2至8℃。兩性黴素B可以佔稀釋劑體積至高2.5 μg/mL之濃度添加作為防腐劑。硫酸健大黴素係以佔稀釋劑體積至高30 μg/mL之濃度添加作為防腐劑。甲醛係以佔稀釋劑體積0.1%之濃度添加作為防腐劑。佐劑(諸如HRA-5)係以佔最終系列體積10% v/v之濃度添加。
    該疫苗係經典型的皮下注射提供，若需要，則追加疫苗注射。 實例2
    進行該研究以獲得馬鼻炎A病毒疫苗保護馬免於馬鼻炎A病毒攻毒之療效評價。 材料及方法
    依據實例1製備高劑量A-9(107.5 TCID50/mL)及低劑量A-10(107.0 TCID50/mL)ERAV疫苗。

    V-05安慰劑1 mL調配物係如A-9及A-10疫苗之方式製得然不含ERAV/ON/05抗原。
    將總計44匹馬隨機分成由15匹馬V-05安慰劑對照組、14匹馬A-10低劑量組及15匹馬A-9高劑量組組成之3組治療組中之一組。以輔佐HRA-5之1 mL劑量產品疫苗接種馬總計3次投藥，且投藥之間之時間間隔為21天。隨後，在第三次疫苗接種21天後，在4分鐘內以107.0 TCID50/mL霧化鼻炎A劑量藉由鼻內噴霧方式對該等馬攻毒。針對每天體溫、鼻滲出液、眼分泌物徵兆之臨床徵兆評價馬。每週採集用於血清中和(SN)之血液。 攻毒病毒
    於E-Vero細胞之組織培養物中產生攻毒病毒。於攻毒當天，該攻毒病毒之效價判定為1×106.9 TCID50/mL。於攻毒當天清晨利用組織培養基1：10地稀釋攻毒病毒達成為1×105.9 TCID50/mL之效價。 鼻內攻毒之方法
    在以50 μg/kg體重之劑量攻毒之前，對各匹馬靜脈內投與Sedivet®(鹽酸羅米非啶(romifidine hydrochloride))、鎮靜劑及鎮痛藥。然後，利用約106.2 TCID50之馬鼻炎A病毒對各匹馬進行攻毒。依據以下方法將由噴霧器產生之如氣霧劑般之攻毒病毒送至馬AeroMask(Trudell Medical International,Ontario,Canada)中而進行鼻內投與。
    將4毫升之105.9 TCID50/mL攻毒病毒置於AeroMask裝置中之噴霧杯中。自空氣壓縮機至噴霧器之進口埠配置耐壓軟管。然後將出口管插入附接於要被攻毒之馬之頭部之Aero Mask及將約10 psi之氣壓施加至該進口埠保持3分鐘。該時段期間，將約2毫升之攻毒病毒流體直接霧化進入待攻毒之馬之鼻孔內。 血清中和
    該研究中採用標準微量滴定血清中和測試。 鼻滲出液評價
    在收集鼻咽擦拭棒之前觀察所有鼻滲出液。於攻毒當天及攻毒後10天，檢驗44匹疫苗接種及對照馬中各匹馬之鼻通道及嘴套並利用列於下文之分級及評分說明予以分級。
    基於藉由以下分級之各者所顯示疾病之嚴重度規定等級評分為0至6： 眼評價
    每天於鼻滲出物評價之時間評價眼分泌物。眼分泌物評分記錄為0=正常；1=輕度至中度眼分泌物，及2=重度眼分泌物。 鼻咽病毒分離
    於各觀察測試日，藉由附接至11英寸長無菌塑膠吸移管之無菌WECK-CELTM手術套管茅(surgical spear)(Edward Weck and Company,Inc.,Research Triangle Park,N.C.27709)深度擦拭各匹疫苗接種及對照馬之各個鼻通道。收集時，立刻將兩個手術套管茅中之各者置於含有4 mL激冷傳輸介質(補充健大黴素、L-麩胺醯胺酸、2×Pen/Strep、2×兩性黴素B之E-199)之單管中。
    為了分離病毒，將該等管混合，以無菌方式移走該等擦拭棒，然後以1500 rpm離心該介質歷時10至15分鐘以移去顆粒。在接種於組織培養細胞之前透過0.2 μL針筒過濾器過濾該介質。於過濾之後，將4至6%之無菌85%蔗糖溶液添加至用於冷凍於-80℃之各樣本使得所有樣本欲同時進行測試。
    為了分離病毒，將該等管混合，以無菌方式移走該等擦拭棒，然後以1500 rpm離心該介質歷時10至15分鐘以移去顆粒。在接種於組織培養物細胞之前透過0.2 μL針筒過濾器過濾該介質。1 mL淨化輸送介質係用以接種生長於已無菌移去生長介質之24孔組織培養板中之E-Vero細胞之2 cm2兩天大單層。接種之後，於37℃在含有5% CO2氣氛之增濕培養箱中允許接種物吸附於細胞單層上1小時。於吸附期之後，再對各孔添加1 mL之再饋送介質(含7%胎牛血清(FBS)、2 mM L-麩胺醯胺酸、健大黴素2×Pen-Strep及2×兩性黴素B之E-199)。在添加再饋送介質之後，接著，於37℃在CO2培養箱中培養該等板。對於ERAV攻毒病毒之典型細胞病變效應(CPE)之徵兆，以顯微鏡方式檢驗各測試及對照組織培養孔7天。7天觀察期結束時為陰性之孔係繼代培養至新鮮細胞上且再觀察7天。 統計評價方法
    將源自所有經A-9或A-10中之任一者接種之馬之數據組合進行統計評價。使用克拉斯卡-瓦立斯(Kruskal-Wallis)與哈吉斯-雷曼(Hodges-Lehmann)測試(SAS的NPAR1WAY程式，SAS研究所，Cary NC)評價疫苗接種對疾病持續時間(鼻得分值>0之天數)之影響。疾病之嚴重度係藉由比較疫苗接種馬與對照馬之間之最大疾病狀況來評價。根據結果分佈將鼻得分值分為1.5及>1.5兩部分。估算預防分率(PF)及95%信賴區間(CI)。一如呈現或未呈現之情況評價眼得分值及評價該預防分率及95%信賴區間(SAS的FREQ程式)。適於獲得連續數據之重複量測分析係用以評估疫苗接種對體溫及血清中和效價(SAS的MIXED程式)之效果。使用費雪精確測試在各時間點評價病毒隨時間為陽性及血塊黃層隨時間為陽性之馬之比率(Freq程式)。藉由在各時間點依據威爾克森秩和檢驗評估鼻及眼得分值(NPAR1WAY程式)。 結果與結論自鼻擦拭棒(病毒剝離)及血塊黃層(病毒血症)之病毒分離
    第2至7天之經疫苗接種之組中之為病毒陽性之動物之比例相較於對照組明顯較低(P<0.05)(下表4及圖1)。
    表4.隨時間為陽性之鼻擦拭棒病毒之比例(*P<0.05對對照組，每天進行費雪精確測試)
    在第4至7天，相較於對照組，經接種之群組中極少血塊黃層為陽性之動物(下表5及圖2)。
    血清中和
    各攻毒日之平均體溫值(利用校準之GSA電子溫度計探針測得之直腸溫度)總是介於正常體溫參數內。攻毒之後，觀察到起因於疫苗接種之SN效價顯著增加(亦參見圖3)。 鼻及眼評價
    經疫苗接種之組中鼻得分值之平均等級在第4至10天及第12至13天相較於對照組較低(下表7及圖4)。經疫苗接種之組中眼得分值之平均等級在第7天相較於對照組較低(亦參見圖5)。
    疾病持續時間：鼻滲出液評價

    攻毒之後觀察到對照組中鼻分泌持續時間極長(表8，亦參見圖4)。經疫苗接種之組顯示鼻分泌持續時間明顯縮短。對照組經歷最短8天之鼻分泌對11位接種者(38%)之1天或更短。2/3之接種者具有相較對照組中為8天之最短時間更短的鼻分泌持續時間。即使在其間馬具有正常天數，持續時間仍自第一次至最後一次異常性觀察計。經疫苗接種之組中動物患病具有呼吸疾病之臨床徵兆(鼻得分值>0)之天數相較於對照組明顯較短(偏移7天)。
    表10：最大鼻得分值-得分值之兩種分佈之間之顯著差異(克拉斯卡-瓦立斯檢驗，P=0.0157)。
    疫苗接種亦減輕鼻分泌之嚴重度(攻毒後任何一天之得分值均為最大)。於兩組之間比較最大鼻得分值(表10)。對照組中馬之最小鼻得分值為1.5。因此，對於疾病嚴重度之評價，將結果分為得分值1.5與>1.5兩部分(表11)。預防分率為48%，且信賴區間下限大於0。最大鼻得分值之總體分佈因免疫接種而顯著減少(克拉斯卡-瓦立斯檢驗，P=0.0157)。 眼評價
    由於針對眼得分值(0或2)僅報告兩種值，因此，結果係分為存在或不存在於個體中兩部分。然後使用預防分率來評價疫苗接種對存在眼徵兆之影響。該疫苗明顯減輕起因於ERAV感染之眼分泌之嚴重度。隨時間之平均眼得分值亦示於圖5中。
    該研究之數據證實肌肉內劑量之不活化疫苗之投與可免疫動物而偵測到高含量的抗體，此等預防眼疾病且減輕鼻分泌之嚴重度並縮短鼻分泌之持續時間。疫苗在ERAV攻毒之後有效地預防任何眼分泌。鼻分泌於攻毒後持續相對極長的一段時間，然眼分泌達到最高繼而快速消除。因此，該疫苗顯示有效改善鼻分泌維持一段極長的時間(連續9至10天)，然該疫苗顯著減少眼分泌物維持其間眼徵兆最為嚴重之1天。此外，於病毒剝離達到最高之連續6天內，疫苗接種顯著減少鼻病毒剝離，及於攻毒期間病毒血症達到最高之4天內，病毒血症亦明顯減輕。
    不論在注射部位或藉由全身性疾病之徵兆表現，未觀察到令人無法接受之不利反應。該疫苗就投與給馬鼻炎A易感性物種(特定言之馬科)而言具安全性且耐受性良好。該研究因而證實3×1 mL肌肉內注射該實例之ERAV組合物顯著減少由ERAV毒性攻毒引起之呼吸疾病之嚴重度及持續時間。 實例3
    該實例例示基於本文所揭示之馬鼻炎A病毒株系進行之定序及分析研究。 細胞及病毒
    兔-腎臟-13(RK-13)細胞(繼代100至160)係生長於含2至5%胎牛血清(FBS)(Sigma)之杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbbeco's modified eagles medium)營養混合物F12 HAM(DMEM F12)(Sigma-Aldrich Canada Ltd.Oakville,Ontario)中。在CO2(5%)培養箱中於37℃下進行細胞生長及病毒繁殖。ERAV分離株ERAV/ON/05係於RK-13細胞中繁殖且將等分試樣儲存於-70℃用於隨後的操作。以90%匯合率接種RK-13單層及在觀察到細胞病變效應(CPE)之前提取RNA。 病毒滴定及斑純化
    RK-13細胞係生長於3 cm圓盤上，使用含2%胎牛血清之DMEM F12。細胞係以90%匯合率受感染且於37℃下培養該等板歷時72小時。在24小時之後，更換培養基並添加0.7%瓊脂糖層。每24小時進行斑之計數及記錄。在第72小時，移去該瓊脂糖層繼而利用結晶紫染色該等斑並計數。
    對於斑純化，利用ERAV/ON/05感染RK-13細胞，進行吸附歷時45分鐘然後移去接種物且更換為0.7%瓊脂糖層。每12小時檢驗該等板且將該等斑分為小、中及大。選取各尺寸之5塊斑，挖入300 μL DMEM F12中，然後冷凍於-70℃。各斑尺寸之病毒係於RK-13細胞中繁殖及自該等小及大斑提取RNA以針對5'UTR進行基因組定序。 病毒生長動力學
    為了研究該株系之生長特性，利用ERAV/ON/05感染RK-13細胞且於不同時間收集上清液樣本進行滴定。RK-13細胞係生長於3 cm個別圓盤上且在90%匯合率時感染。於37℃培養該等盤且在0小時開始每4小時採集上清液樣本歷時28小時。採用斑形成單位(PFU)技術依據前文所述進行所有樣本之滴定。 免疫螢光
    RK-13細胞係生長於玻璃組織培養室/玻片(Miles Scientific,Inc.,Naperville,Illinois)上，且以ERAV/ON/05接種。在感染28小時後，移去細胞培養基且將細胞固定於丙酮中。將該等玻片保持於4℃直到處理為止。源自實驗上感染之馬之漿液係使用作為ERAV抗體之來源。 Rna提取及定序
    自經感染之細胞單層提取RNA。感染18至20小時後利用1 mL TRIzol(Invitrogen)處理細胞且依據製造商建議進行提取。將RNA丸粒於30 μL之不含核糖核酸酶之水中洗提並保持於-70℃供稍候使用。遵照製造商建議使用superscript lI(Invitrogen)合成第一股cDNA。使用正義及反義引子組實現50 μL PCR反應。對於基因組定序，採用引子行進方法，且基於GenBank之8種可用ERAV序列設計引子。PCR條件為：於94℃下4分鐘，接著進行30個循環：於94℃下30秒、於55℃下30秒及於72℃下30秒，且於72℃下進行最終擴展歷時10分鐘。
    利用製造商所推薦之5' RACE及3' RACE套組(Invitrogen)完成5'及3'端之定序。需要若干種巢式PCR以擴增該5' UTR端。 序列分析
    病毒之初步鑑別係藉由使用基於GenBank之其他可用序列設計之引子將結構蛋白VP1部分定序完成。
    所有引子係基於Gene Runner version 3.05(Hastings Software Inc.)設計。由圭爾夫大學(University of Guelph)之實驗室服務部設定並實施定序反應。
    利用EditSeq與SeqMan DNASTAR Lasergene 8(DNASTAR Inc.,Madison,WI,USA)組裝並編排所有序列。將定序結果輸入BLAST軟體[National Center for Biotechnology Information,Bethesda,MD(NCBI)]且相較於類似之有關GenBank之輸入。ClustalW2[European Bioinformatics institute,Dublin,Ireland(EBI)]係用於多重序列比對及初步建構種系發生樹。最終的種系發生樹係藉由利用極大複合似然法(Maximum Composite Likelihood method)以MEGA 4.0建立及依據拔靴法(bootstrapping)藉由1000次複製評價可靠性。基於SimPlot Version 3.5.1(Baltimore,MD,USA)繪示核苷酸序列之分析。為了審查ERAV分離株之間之病毒重組概率，吾人以SimPlot(Version 3.5.1)進行Bootscan分析，從而相較有關GenBank之所有報導可用之ERAV之基因組序列。基於GenBank以寄存編號：DQ272578與NC003982所報導之序列預測聚合蛋白質切割部位。 結果 初始特徵化
    將病毒之病毒蛋白質(VP1)擴增，部分定序且相較於GenBank之可用序列(寄存編號：NC003982、DQ272577、DQ272128、DQ272127、DQ268580、DQ272578、L43052)。該初始比較之結果證實相對馬鼻炎A病毒VP1之最大同一性為95%。 病毒效價
    ERAV分離株最初係繁殖於細胞培養物中並藉由斑形成單位方法進行滴定。在最初滴定時，所獲得的儲存病毒效價為5×107 PFU。隨後的實驗顯示初始冷凍3年之後之病毒效價無顯著變化。對於動物實驗，採用具有該初始效價之儲存病毒。 生長動力學
    所有上清液樣本係採用PFU技術進行滴定及結果係輸入至展開表以建構生長曲線。如其他小核醣核酸病毒中所見，該Ontario分離株顯示在感染4小時後效價增加，感染12小時後達到平線區。 免疫螢光
    於免疫螢光顯微鏡下觀察經感染之RK-13細胞。相較於模擬感染細胞之陰性訊號，於ERAV感染之細胞之細胞質中偵測到亮綠色螢光訊號。 斑純化
    小及大斑上5' UTR中之426個核苷酸片段之定序顯示在核苷酸層次上不存有斑尺寸差異。然而，對於RK-13細胞培養物，形態特徵明顯不同。 全基因組定序
    ERAV分離株之基因組定序導致7839個核苷酸長度具有47%之GC含量，包括多聚(A)尾。鑑定出於5' UTR上由18、21及18個核苷酸分隔開之4個相同的重複單元(CTGTAGCGTCAGTAAAACGC SEQ ID NO：13)。該ERAV 5' UTR係由具有54% GC含量之940個核苷酸組成。具有6747個核苷酸(2248個胺基酸)之單聚合蛋白質組成具有46.8% GC含量之病毒基因組。於具有AUG起始密碼子之核苷酸940上偵測到蛋白質之起始合成及於具有UAA終止密碼子之核苷酸7686上偵測到結束。最有趣地，在起始密碼子之後鑑定出第二個AUG序列。亦鑑定隨後的AUGAUG序列在聚合蛋白質起始密碼子下游之58-核苷酸。利用聚合蛋白質之Blastx(NCBI)對該分離株之聚合蛋白質分析顯示相對所報導之其他ERAV之96%核苷酸同一性，然而，在比對Ontario分離株之全長基因組序列且利用ClustalW2(EBI)及Blastx(NCBI)相較於其他之情況下，僅能觀察到為80%之最大同一性。胺基酸組成顯示蛋白質(結構及非結構)組織及沿著整個基因組之長度相同。該等比較係利用PERV-1及PERV報導之基因組序列(寄存編號DQ272578及NC003982)作成。
    3' UTR係由具有24.3% GC含量及聚A尾之110-核苷酸組成。所有可用ERAV之5' UTR之比對證實範圍自73%至81%之較低同一性百分率。類似地，藉由相同方法分析3' UTR及同一性百分率為75%至81%。有趣地，鑑定該5' UTR中不同的插入(1-核苷酸，2-核苷酸，及13-核苷酸)及兩個微小的缺失(2-核苷酸，及3-核苷酸)(圖4)。整個基因組中未觀察到其他重要變化。 Simplot基因組分析
    SimPlot分析顯示相較於ERAV/ON/05時所有ERAV分離株之相似性(百分率)相當。然而，確定主要的差異位於核苷酸1500(59%相似性)及核苷酸4700(65%相似性)。然而，該分析顯示沿著基因組之相似性係介於70%至82%之間。為了進一步審查基因組之主要發散度，進行掃描(Bootscan)來鑑定可能的重組部位。該等分析證實Ontario分離株尚不具有與其他ERAV分離株之預測重組位置。然而，自該分析移去該Ontario分離株時，其他ERAV分離株之間之可能重組在過去可能早已發生。 討論
    ERAV並非例行探查，且在馬呼吸道疾病爆發期間自臨床案例回收。因此，臨床案例之ERAV分離係附帶發生且於大多數例子中具挑戰性。就該等原因而言，該等病毒之回收及定序速率可能極小。
    在以往的幾年間，馬鼻炎病毒係分類於小核醣核酸病毒科，但無法清楚歸類至特定屬。在1996年，Li與同事(Li F,Browning GF,Studdert MJ及Crabb BS.Equine rhinovirus 1 is more closely related to foot-and-mouth disease virus than to other picornaviruses.Proc Natl Acad Sci U S A.1996 6；93：990-995)基於種系發生特性及核苷酸定序而證實ERAV與口蹄疫病毒(FMDV)密切相關。與其發現及其他(Wutz G,AuerH,Nowotny N,GrosseB,SkernT及Kuechler E.Equine rhinovirus serotypes 1 and 2：relationship to each other and to aphthoviruses and cardioviruses.J Gen Virol 1996,77：1719-1730)一致地，已發現該ERAV分離株係與分離株L43052、DQ272578及NC003982密切相關。
    該ERAV/ON/05分離株產生7839個核苷酸，包括5' UTR、聚合蛋白質、3' UTR及聚-A尾。相較於過去所報導之ERAV分離株，該ERAV/ON/05為迄今所報導之最為完整的ERAV序列中之一者。其他序列中之大多數缺乏自5' UTR或為個別病毒蛋白質之部分序列之一些資訊。自5' UTR之資訊顯示存有在過去已報導於其他ERAV中且通常所見於FMDV上之3個重複單元。已提出該等重複單元可需求於5' UTR中所見二級結構(內部核糖體進入位點(IRES))之形成。該同一性分析顯示ERAV/ON/05分離株的聚合蛋白質載有高度保守之核苷酸序列。關於RNA病毒，該ERAV因缺乏聚合酶校對而趨於發生恆定突變。此點可指示，即使該RNA病毒已受到自然演畫及恆定複製，然因即便已報導過其第一基因組序列而仍尚未引入明顯基因組變化。顯而易見，編碼於聚合蛋白質中之結構及非結構蛋白質表示基因組中最為保守之區域。
    有趣地，細胞培養時之病毒複製速率快速且有效率。偵測到1個完全病毒複製週期短於4小時，在12小時內達到平線區。該等特徵為小核醣核酸病毒之典型特徵且可反映活體內的病毒活性。該等特徵可解釋一些馬呼吸病毒感染之臨床徵兆之嚴重度及速率。如其他病毒(諸如脊髓灰質炎病毒及FMDV)中所觀察到，5' UTR中小缺失及/插入之存在與細胞培養物中斑尺寸有差異相關，且活體內毒性過度。吾人發現該ERAV/ON/05分離株在感染RK-13細胞時產生不同的斑尺寸。為了審查及關聯該ERAV/ON/05分離株中該5' UTR中之該等插入及缺失，吾人將自斑尺寸不同之斑純化病毒之該區域定序，且發現在核苷酸層次上沒有差異。該發現可指示斑尺寸差異可歸因於RK-13細胞之生長及複製特徵且可能與吾人於該區域中所發現之該等序列之存在或不存在無關。 實例4
    該實例顯示設計成開發用於審查ERAV/ON/05之臨床特徵之可靠ERAV感染模式之研究之結果。 材料及方法
    於第一階段利用ERAV/ON/05感染矮種小馬以調整感染劑量及樣本取集技術。設計第二前導研究來比較受感染及對照組動物，及主控樣本取集技術。由於動物處理及計時取樣限制，該主要感染研究係以兩個階段進行。第一次感染1年後，根據其對ERAV之效價選擇4隻在先前經感染之矮種小馬用於再感染研究。選擇具有對ERAV之中間及高效價之動物，再曝露於Ontario分離株。 實驗動物
    選擇總計12隻懷孕矮種馬並飼養其小馬進行實驗ERAV感染。所有馬及小馬係以分開的群組遠離主要穀倉之方式進行飼養且安置生物安全量測裝置以避免病毒性呼吸道感染。有規則地採集所有小馬之血樣且週期性地檢驗對ERAV之效價。飼養該等小馬直到牠們年滿12個月大。期間未對該等動物進行抗任何呼吸道病毒之疫苗接種及實施一般方法以確保健康存活條件。依據獸群管理計劃書對所有動物進行除蟲。有規則地進行動物社會化及處理。訓練矮種馬以實現肺功能測試(PFT)。一旦制約該等動物進行實驗，以群組方式將其輸送至隔離裝置且在病毒感染之前適應至少1週。 分離裝置
    所有感染試驗均係在圭爾夫大學病理學部之動物隔離裝置進行。該隔離裝置包括配備可控溫度、濕度、氣流及照明之個別馬廄。研究者及照護人員限制進入馬廄。 選擇標準
    常常觸摸所有小馬，且週期性地檢查健康狀態。根據健康狀態及血清參數，選擇欲包括於該等實驗之動物。此時，所有矮種馬對馬鼻炎A病毒(ERAV)、馬鼻炎B病毒(ERBV)、馬皰疹病毒1與4型(EHV1/4)及馬流感2病毒(AE2)仍保持血清陰性。即使在出生時偵測到AE2抗體效價，前5個月觀測到穩定減小及在6個月大的時候無法藉由單向輻射溶血試驗(SRH)偵測到。對於ERAV實驗感染試驗，選擇一隻矮種馬待用。隨後，選擇2隻其他矮種馬進行第二前導研究，然後，選擇為8隻矮種馬(4隻經過感染及4隻用於對照)之群組進行主感染研究。自該第一次感染試驗起1年後，選擇對ERAV具有中間及高效價之4隻矮種馬進行再感染試驗。 接種物
    於馬病毒呼吸爆發期間(Ontario 2005)自馬回收之ERAV分離株(ERAV/ON/05)係在兔腎臟-13細胞(RK-13)中進行繁殖及將等分試樣儲存於-70℃以供病毒特徵化及動物病毒感染實驗之用。
    簡言之，對於接種物製備，令分離株繁殖於RK-13細胞中。利用500 μL ERAV/ON/05感染含90%匯合單層之30 mL圓盤並於37℃在CO2(5%)存在下培養歷時24至36小時。自培養箱中移出所有盤且冷凍/解凍4次致使細胞破裂及病毒自完整細胞釋放。將所有盤的上清液收集於一燒瓶內且於6000 RPMS下離心15分鐘以淨化並棄置細胞碎片。將淨化上清液試樣等分於10 mL瓶中，在動物病毒感染實驗中用為接種物。另外，分離出少量1 mL-等分試樣且保留用於病毒滴定。採用斑形成單位方法(PFU)滴定該病毒。 動物模式
    由於實驗試劑(ERAV)之性質、動物尺寸、可獲取性及處理性，選擇矮種馬作為動物模式。 感染方案
    介於8與12個月大之間之矮種馬係選擇、訓練並用於感染實驗中。由於欲採集大量樣本，將該等實驗分成5部分(2個前導研究，2個主感染實驗，及1個再感染實驗)。於前導研究期間，將設備、動物處理裝置、接種物劑量、投藥途徑及樣本採集最優化。再感染研究係在初始感染試驗1年之後進行。將經再感染之群組中之矮種馬曝露於該第一次感染期間所用相同劑量之該病毒株系。僅自該群組收集臨床檢查、用於效價評估之血液取樣及用於病毒分離之鼻咽擦拭棒。 面罩及噴霧化
    就病毒感染而言，小尺寸之馬AeroMaskTM係與橡膠密封件配置於鼻孔端。根據矮種馬的頭調整尺寸然不會改變呼吸窗。該面罩配有吸入連接器及用於病毒噴霧之單向「T」閥。使用習知的6 mL噴霧杯遞送接種物。使用PM14壓縮機(Precision Medical Inc.Northampton,PA)以為9 LPM(升/分鐘)之氣流進行噴霧。該流動速率及遞送杯可持續遞送大於或小於5微米之可吸入顆粒。利用15 mL(總體積)接種物或安慰劑中之任何一者對各矮種馬噴霧持續45分鐘(每15分鐘停5分鐘)。感染後收集每匹矮種馬之鼻咽擦拭棒以確保遞送時接種物具活力。依據該計劃書將1年後進行再感染之矮種馬曝露於病毒。 臨床試驗
    所有矮種馬基於常規基礎自出生進行臨床評估。在該等前導及感染研究之前，每天評估所有矮種馬及於試驗實驗期間頭10天每天評估2次及自感染後之第11天至第21天每天評估1次。臨床試驗包括：體溫(temp)(攝氏度)、心跳速率(hr)、呼吸速率(rr)、毛細管再充填(ref)、胃腸道蠕動(gi)、肺音(ls)、鼻分泌(nd)、眼分泌(od)[存在或不存在及特徵]、淋巴結(ln)[尺寸及特徵]、步行，及一般身體狀況。在每天約相同時間對各矮種馬進行身體檢查，從對照組動物開始接著移至經感染之組。各動物檢查每次耗時約10分鐘且將所有個別資料記錄於日檢查表。 肺功能測試(PFT)
    如先前由Hare及同事(Hare JE,Viel L.Pulmonary eosinophilia associated with increased airway responsiveness in young racing horses.J Vet Intern Med 1998；12(3)：163-70)所述進行PFT。在感染之前(第0天)及在感染後第1、7、14及21天針對所有對照組及經感染之矮種馬進行該測試。簡言之，於測試當天，清晨對矮種馬停止餵食及如前文所述經適度鎮靜目的用於內視鏡檢查程序。以橡膠面罩貼適地戴於該矮種馬的嘴。將呼吸速度描記器#4(Gould Electronics,Biltholven,The Netherlands)連接至該面罩，並連接至轉換流動及壓力訊號進入記錄於電腦之呼吸環之轉換器組(Pulmonary Mechanics Analyzer,Buxco Electronics Inc,Sharon,CT,USA)。於呼吸速度描記器水準量測流動及依據經由食道管置於胸中部之食道球(10 cm長)評估胸膜壓力。將總體積為3 ml之空氣導入該球。胸膜壓力及大氣壓力(以鼻孔水準測得)之間之壓力差視為經肺壓力(△Ppl)。 支氣管激發測試
    進行支氣管激發攻毒作為PFT測試之一部分。為了測定ERAV/ON/05感染後呼吸道之過度敏感反應，將對照用及經感染之動物曝露於經由具有為9 LPM之氣流之PM14壓縮機(Precision Medical Inc.Northampton,PA)霧化之持續增加之組織胺劑量(倍增劑量)。肺部生理參數最初係藉由投與0.9%生理鹽水溶液(基線)，接著增加組織胺劑量來評價。在各次投藥(2分鐘)之後記錄數據歷時3分鐘且在後來分析呼吸生理學。組織胺劑量始於0.5 mg/ml且逐漸增加達最大值32 mg/ml。動態順服性(Cdyn)及△Ppl係用作中斷組織胺噴霧之參數。當於組織胺投藥期間Cdyn減少三分之二或△Ppl加倍時，暫停噴霧。在後來繪示並計算組織胺觸發劑量。於該等程序中，適度地鎮靜及以物理方式限制所有矮種馬。 取樣技術血液採集
    自右或左頸靜脈中之任一者採集血樣。依據樣本採集計畫表自各矮種馬採集約10 ml血液於紅色頂端管(血清)。另外，亦採集3至5 ml血液用於CBC(全血計數)及分析。在清晨時間採集所有樣本且於當天予以處理。
    在室溫下保持用於血清分離之血樣歷時至少30分鐘然後在桌面式離心機上以3000 rpm進行離心。在自採集時間開始之6小時內分離血清且將等分試樣貼上標籤然後冷凍於-70℃以供稍後分析(針對ERAV、ERBV、AE2及EHV1/4之抗體)。於當天內處理用於CBC及分析之血樣。 鼻咽擦拭
    在感染試驗之前及在第0、1、3、5、7、10、12、14、17及21天收集鼻咽擦拭棒用於病毒分離。藉由抽動嘴套限制各矮種馬及將30 cm長的擦拭棒(Kalayjian Industries,Inc.Signal Hill,California)通入右或左鼻孔中之任何一個鼻孔直到其達到咽為止。藉由旋轉該擦拭棒歷時約5至10秒進行擦拭。小心移去該擦拭棒，然後，切下該等尖端於含有3 ml病毒輸送介質(VTM)之瓶中。振盪含有該等擦拭棒之該等瓶並保持於冰上直到處理為止。為了釋放附著於該等擦拭棒之病毒顆粒及細胞，渦流化該等瓶歷時約20秒且將該介質轉移至1.5 mL Eppendorf管並冷凍於-70℃用於稍後的分析。 尿液及糞便取樣
    嘗試針對經ERAV/ON/05感染前及後之尿液及糞便樣本進行病毒分離。在臨床檢查及/或馬廄清潔之後的清晨藉由在動物排尿時握持收集杯來收集尿液。在無法用手收集樣本之情況下，將該等動物佩戴圍繞生殖器的塑膠收集袋。在動物排尿之後移走該袋及保留10 mL試樣用於病毒分離。自馬廄地面上之新鮮糞便徒手收集糞便樣本。將約5 mL糞便收集於收集杯中且添加10 mL無菌鹽水以溶解該樣本。在處理之前，將尿液及糞便樣本保持於冰上。 上及下消化道內視鏡檢查法
    如前文所述(Hare等人，1998)進行支氣管鏡檢查及BAL。推送140 cm長與0.8 mm OD之無菌彈性纖維內視鏡(Olympus,Corp.,Tokyo,Japan)通過右或左鼻孔進入鼻腔至喉水準。此刻，評價上呼吸道器官構象。接著，推送支氣管鏡進入氣管及記錄炎症及/或黏液存在或不存在及其特徵。將資料記錄於日評估表上及圖像記錄所有該等內視鏡用於稍後的分析。 咽及氣管刷拭活檢
    為了評定上及下呼吸到中之病毒複製，在第0、1、3、5、7、10、14及21天自受感染及對照用之動物之咽、氣管中部及龍骨突取得刷拭活檢。於內視鏡檢查期間，推送200 cm防護型(保護套筒)細胞刷(Hobbs Medical Inc.Connecticut)通過活檢通道位於預定樣本部位然後收集樣本。將該等刷縮回於該保護套筒內並移去離開該支氣管鏡。為了自該刷移去取樣組織，將該刷放入600 μL VTM中並渦流化歷時10至20秒。將所有樣本保持於冰上並運輸至實驗室以供進一步分析用(病毒分離)。 支氣管肺泡灌洗術(BAL)
    簡言之，利用羅米非啶(0.04 mg/kg,IV)適度地鎮靜所有矮種馬及推送一無菌0.8 mm OD支氣管鏡(Olympus,Corp.,Tokyo,Japan)通過右或左鼻孔進入氣管至龍骨突水準。隨著該支氣管鏡之推送，投與0.2%溫利多卡因(lidocaine)溶液以減輕咳嗽及呼吸窘迫。一旦咳嗽反射減輕，將該支氣管鏡推送並擠入於近端支氣管中。通過被分成兩等分試樣之活檢通道投與總計250 mL溫無菌鹽水溶液。利用60 cc針筒藉由人工吸力通過該活檢通道取回BAL流體並放置於冰上。過濾該流體且製得用於病毒分離、細胞計數及細胞離心玻片之等分試樣。 臨床樣本培養
    將所收集之樣本轉移於冰上並冷凍於-70℃以在稍後用於細胞培養物的接種。
    RK-13細胞(繼代100至160)生長於含2至5%胎牛血清(Sigma)之杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbbeco's modified eagles medium)營養混合物F12 HAM(DMEM F12)(Sigma-Aldrich Canada Ltd.Oakville,Ontario)中。於37℃在CO2(5%)培養箱中進行細胞生長及分離。RK-13細胞單層係生長於6孔板上至90%匯合率然後以自感染試樣收集之臨床樣本感染。簡言之，自該等孔之各者移去該生長介質之90%且將200 μL之待測試試件添加至該單層。將該等板放置於搖盪器平台上1小時且在經過該時間之後添加3 mL介質。培養該等板並每24小時針對細胞病變效應(CPE)進行檢查。假若偵測到CPE，自該孔移去上清液且冷凍以供稍後分析之用。將病毒分離測試之結果記錄於展開表。檢查該等板持續最多7天及假若CPE沒有發展，則使用來自第一代之200 μL上清液嘗試第二代。在第二代之後，假若沒有偵測到CPE，則將該樣本歸類為陰性。保留陽性及陰性樣本之上清液，其欲藉由逆轉錄酶聚合酶鏈反應RT-PCR證實。 統計分析
    將病毒分離之結果及所有臨床得分值(表7)輸入展開表。
    病毒分離結果按陽性或陰性加以歸類及在群組之間比較該等結果。為了確定病毒分離相關之部位(於經感染之組中)之間是否存有統計差異，於每天及各部位採用精確條件邏輯回歸。該同一測試係用以確定根據分離日之群組之間是否存有統計差異。總結臨床得分值及分析總得分值並在各組之間進行比較。
    利用廣義線性混合模型分析所有臨床參數。該模型所包涵之因素為：矮種馬，處理法，及時間以及其相互作用。由於動物係隨著時間進行量測，因此，採用AKAIKE資訊準則(AIC)來判定自回歸之錯誤結構。藉由綜合殘差分析評定ANOVA之假設。進行Shapro-Wilk檢驗、克默果夫-史密諾夫(Kolmogorov-Smirnov)測試、克蘭默-洪密斜斯(Cramer-von Mises)測試，及Anderson-Darling測試以評定總體正規性。以殘差對預測值及說明性變數(矮種馬，處理法及時間)繪圖，尋找顯示離群點、不等變異或其他問題之圖樣。假若殘差分析顯示需要進行數據轉換或將數據表示為百分比，則分析係以logit或log標度實現。假若全面f檢驗具顯著性，則應用處理時返回至基線之鄧恩(Dunnetts)測試或各時間點處理法及部位之間之塔基(tukey)測試。
    血清反應定義為以抗體含量程度自基線(第0天)至樣本取集之時間點(第7、14或21天)之任一時間點增加4倍。
    基於SAS 9.1.3(SAS institute Inc.,2004,Cary,NC)進行統計分析。統計顯著性係設為P<0.05。 結果
    該研究設計成令矮種馬持續再現ERAV臨床疾病及研究其之活體內特性。前導研究證實霧化ERAV/ON/05可致使健康矮種馬(10至12個月大)罹患臨床呼吸疾病。對再感染之動物除外之所有矮種馬誘發輕度免疫抑制來模擬壓力事件(例如，銷售活動，欄位再定位，疫苗接種計劃等)下之自然條件。主感染研究之結果證實該等前導研究期間所觀察到的該等結果。經感染之群組(n=4)中之矮種馬發展與體溫升高、淋巴腺病、肺音增強、氣管黏液增加，及鼻分泌增加一致之呼吸臨床疾病(圖7至8)。該等臨床徵兆不需要極其過度地進行額外之動物照護或支持性治療。群組之間之呼吸速率或心跳速率兩者之差異均不明顯。對於對照組動物(n=4)，未觀察到由經感染之群組所發展之該等臨床徵兆，該等對照組動物在該等試驗範圍內保持健康狀態。僅可自經感染之群組中之矮種馬回收致病原劑(ERAV)持續最多7天(表8)。再感染之群組(n=4)中之矮種馬沒有發展臨床呼吸徵兆且在該等試驗過程中保持健康狀態。該等試驗期間所收集數據之統計分析證實經感染及對照用動物之間有顯著差異。
    BAL支氣管肺泡灌洗術
    對於任何一組既未記錄憂鬱症也未記錄食慾喪失。同樣地，於感染試驗期間，所有群組的補充水分、排尿、排糞，及胃腸運動維持不變。再感染及對照用動物之間於臨床得分值及病毒分離測試上不存有差異，因為基於再感染之動物沒有觀察到臨床疾病且無法自該群組回收病毒。 臨床發現
    在該等實驗之前，認為所有矮種馬處於健康狀態。相較於對照組及再感染之動物，經感染之動物中ERAV/ON/05曝露誘發臨床呼吸疾病。身體檢查可偵測之主臨床徵兆為發熱、鼻分泌，及淋巴腺病。內視鏡檢查亦顯示經感染之動物之氣管中部及氣管下端中存有大量的黏液及充血。 直腸溫度
    在病毒或安慰劑曝露之前，發現在群組之間日直腸溫度差異不明顯。當經感染之動物相較對照組及再感染組時顯示處理效果顯著(p=0.002)。在不同時間點比較3組群組之體溫，經感染之群組相較對照組及再感染之動物而言極其不同(p=0.028)。僅對於經感染之動物，在感染24小時後偵測到體溫增加，及在相較於相同時間點時之對照用動物之情況下，顯示自第2.5天至第6天差異顯著(p=<0.005)。在第4天選擇與為38.45℃之平均體溫(SE=0.15)(p=0.001)之體溫增加值且再接連持續2天(圖8)。在不同時間點比較對照用及再感染之群組之體溫時發現不存有統計上的差異。對照用及再感染之群組中之動物於該等群組範圍內比較基線與個別時間點(第1、7、14及21天)情況下其體溫沒有明顯改變。 淋巴結
    每天檢查下顎下及咽後淋巴結且歸類為未觸及、觸及與增大。僅針對經感染及再感染之動物記錄淋巴結之可觸性或增大。在所有經感染之矮種馬中，下顎下區域在第2天對觸診具感受性及在大多數情況下持續最多2週。經感染之動物中下顎下淋巴結尺寸為3至5 cm長乘以2至3 cm厚，及針對總得分值之分析展現群組之間存有統計學差異(p=<.0001)(圖7)。有趣地，該等咽後淋巴結於所有經感染之動物中並非持續可觸及，然據記錄1隻矮種馬之尺寸變化明顯。該淋巴腺病顯示不受食物或水之消耗量干擾及對觸診之感受性隨著時間的進展明顯變小。對於具有大致為長小於1 cm及厚0.5 cm之平均尺寸之再感染之動物中之3隻動物，可觸及下顎下淋巴結。在所有該等感染實驗之觸診時，對照組動物不具有可偵測之淋巴結變化。 心跳及呼吸速率
    任何時間點治療組之間呼吸速率(RR)及心跳速率(HR)平均值無明顯差異(P=0.1)。一般而言，RR及HR係於正常生理參數範圍內然小的變化量僅與處理及樣本取集有關。在第0天判定所有群組中之最高RR平均值及在第21天記錄所有群組中之最低平均值。 內視鏡檢查法
    在內視鏡檢查時，經感染之動物在第1天具有量增加之可偵測氣管黏液，該量增加持續最多至第21天。對照用或再感染之動物兩者皆不具有在所有該等實驗之內視鏡檢查下可偵測之黏液分泌。
    該黏液之特性為自第1天的透明及漿液性變為第7至21天之黏液樣。黏液區塊係自氣管上端持續分佈至龍突骨之分歧。所有該等實驗中在所有經感染之動物及一些對照組動物中觀察到局部氣管充血。所有經感染之動物之龍突骨具鈍性及在一些實例中充血始於第3天。針對經感染之動物至第7天對內視鏡檢查的感受性顯著增強且於BAL期間觀察到支氣管收縮。針對所有經感染之矮種馬鼻分泌自輕度變為中度然該等對照用及再感染之群組中不存有此情況。在針對經感染之動物於感染後之36至48小時期間開始歷時約8天之臨床檢查中觀察到漿液性鼻分泌。然而，該分泌並非反映內視鏡檢查期間所觀察到的黏液(特性及體積)映。不一致地於經感染之動物中觀察到輕度眼分泌。 血清學
    藉噴霧以ERAV/ON/05或安慰劑感染總計12隻矮種馬(10至12個月大)。所有矮種馬對ERAV、ERBV、AE2及EHV1/4為血清陰性及在該感染實驗之前處於健康狀態。曝露於ERAV/ON/05之後所有經感染之動物(100%)血清轉化(4倍地增加)至ERAV，藉由血清中和測試(VN)測得(圖9)。在經感染之動物中觀察到日處理相互作用顯著(P=<0.0001)。在基線及第7天觀察到經感染及再感染之動物之間存有統計學差異(P=<0.001)。在第7、14及21天對ERAV之效價相較回至基線之情況下，再感染之群組中未觀察到統計學差異。
    抗ERAV之抗體效價於經感染之動物中自第7天顯著增加及大多數情況下至第14天達到最高並維持至第21天(P=<0.001)。相比之下，所有對照組動物仍保留對ERAV之血清陰性及藉由VN測試確定不存有可偵測之變化。所有群組中之動物於該等實驗期間沒有顯示抗體含量程度增加或血清轉化成任何其他呼吸道病毒(ERBV、AE2及EHV1/4)(圖9)。再感染之群組中之動物(n=4)不具有基線及感染後第21天之間之對ERAV之抗體效價之顯著差異。然而，在3匹矮種馬中偵測到對ERAV之抗體含量程度變化極小及該群組之1匹矮種馬中增加4倍(圖9)。 病毒分離
    就感染之前對所有矮種馬之病毒分離(馬呼吸道病毒)而言，鼻咽擦拭、喉部刷拭、氣管刷拭、BAL，糞便及尿液樣本均顯示陰性(表8)。於RK-13細胞培養自完成噴霧化之後之經感染及對照用之動物之鼻咽所獲得之擦拭棒及僅僅在所有經感染之動物之第一代回收ERAV。使用靶向VP1基因之引子之RT-PCR證實兩組群組之陽性及陰性診斷。
    感染及再感染試驗之病毒分離結果總結於表8。在相較該等群組之病毒分離之情況下，確定經感染、對照用及再感染之動物之間差異明顯(P=<0.05)。僅僅在特定的日子及呼吸道之特定區域自經感染之群組之該等動物回收ERAV(表8)。沒有自該等實驗期間所採集之樣本回收其他病毒。在整個研究之病毒分離測試中，該對照組中之所有矮種馬為陰性。在第7天最先偵測到日處理對經感染之動物之相互作用及在第14及21天持續(P=<0.05)。
    病毒回收之部位自第1、3及5天之氣管下端變為第1、3、5及7天之氣管中部及上端。在第1天，自經感染之群組之所有該等矮種馬之咽及龍突骨及該群組之3匹矮種馬之氣管中部及BAL分離出ERAV。嘗試自所有群組之糞便回收病毒係全都不成功的。僅在極少的情況下實現尿液及血漿之病毒分離(表8)。在自臨床樣本持續回收ERAV時，病毒回收量自第1天至第7天逐漸減少。該持續病毒回收與對ERAV之抗體效價增加及臨床徵兆得分值減小相關(圖7及9)。 肺功能測試(PFT)
    基於對組織胺激發之生理及臨床反應評定氣管之過動性。繪示源自經感染及對照用之動物之數據並算得觸發組織胺劑量。有趣地，兩群組(經感染及對照用之群組)之矮種馬在第0天對低劑量之組織胺(組織胺<6 mg)作出反應。總體上，該觸發組織胺劑量不會增加超過13 mg。隨著與腹部提昇及呼吸困難相關之過度通氣觀察到臨床組織胺反應(劑量依賴性)。於PFT中偵測到生理反應，在相較鹽水及組織胺投與之情況下，肺動態順服性(Cdyn)降低35%或經肺壓力(△Ppl)加倍。經感染之群組中之矮種馬顯示組織胺觸發劑量自第0天至第1天之減少量極小。然而，此點在該等群組之間差異不明顯。在第21天偵測到經感染之群組與對照組之間差異明顯(P=0.02)。 BAL液差異細胞計數
    差異細胞計數係在藉由BAL液等分試樣製成之細胞離心玻片上進行。發現在感染試驗之前不同處理群組中之馬中該等細胞計數無明顯差異。根據所有該等實驗中之巨噬細胞及上皮細胞百分率偵測不存有日處理效應。經感染之群組中在感染後的第7天觀察到嗜中性粒細胞的數量顯著增加(P=<0.05)。針對對照用或再感染之動物在將基線與第7、14及21天作比較之情況下該等數量差異不明顯。經感染之動物中在感染後的第7天淋巴細胞、嗜酸性粒細胞及肥大細胞之平均百分率按比例減小且偵測到統計學差異(P=<0.05)。通常在經感染及對照用之動物之玻片上觀察到纖毛上皮細胞，然而，未偵測到顯著的差異，除了第7天在該等經感染之動物之一者上具有高計數。一般而言，在經感染之矮種馬中偵測到存有上皮細胞及散見巨細胞之非腐化膿性炎症。有趣地，對於再感染之動物之該等樣本，並未觀察到細胞檢驗相關之重大變化。
    該研究證實經感染之矮種馬之ERAV/ON/05誘發臨床呼吸疾病。血清學證實該等試驗中不存有其他呼吸道病毒。該疾病之特徵為發熱、鼻分泌、肺音增強，及下顎下淋巴結尺寸增加。另外，以內視鏡在呼吸道下端偵測到大量的黏液，其持續至第21天。自呼吸道下及上端分離病毒至第7天，對應出現可偵測馬鼻炎A病毒(ERAV)抗體。再感染之動物均沒有發展臨床疾病及該群組中只有1匹矮種馬具有4倍增量之對ERAV之抗體效價。具有先存在之ERAV抗體之矮種馬在曝露於該病毒時沒有發展臨床疾病。 實例5
    該實例例示根據本發明之馬鼻炎B病毒組合物之一實施例。 材料及方法
    馬鼻炎B病毒株系07-10342(ATCC寄存編號PTA-11829)係自Ontario Canada馬之鼻擦拭棒之兔腎臟-13(RK-13)細胞培養物回收。遵照實例1中針對ERAV/ON/05所述之一般程序製得不活化07-10342。
    製備如下之含有單單ERBV或與ERAV組合之組合物。
    來自疫苗組1、2及3之各組之8匹馬連同8匹對照組馬以有106.6 TCID50攻毒劑量一起進行攻毒。疾病狀態係以表10中指示之鼻分泌及結膜炎得分值為基礎。疫苗接種對疾病之持續時間、嚴重度及發病率之效果示於表17至22中。
    經疫苗接種之群組顯示鼻分泌之持續時間明顯縮短(表18)，包括一些實例中未顯示輕度呼吸疾病之徵兆。
    相較於對照組，經疫苗接種之群組中動物患病具有呼吸疾病之臨床症狀(鼻得分值>0)之天數大大縮短。
    利用ERBV之免疫接種亦減輕疾病之嚴重度，且疫苗接種組相較對照組更低的百分率證實整個研究中呼吸疾病之輕度及中度臨床徵兆(表20)。
    發現利用ERBV之免疫接種使得疾病之發病率顯著降低，經疫苗接種之群組1、2及3分別降低了37.5%、25%及12.5%(表21及22)。
    疫苗接種亦減少病毒剝離離開鼻孔，指示經疫苗接種之馬中臨床疾病減輕以及證實疫苗防止感染性疾病傳播給其他潛在易感性馬之有效性(表22)。
    結果與討論
    發現不活化ERBV疫苗可免疫動物而偵測到高含量程度的抗體。對於經ERBV攻毒之經免疫動物，該等疫苗減少疾病持續時間、嚴重度，及發病率。疫苗接種亦減少感染性病毒剝離離開罹病的馬。沒有觀察到不論在注射部位還是表現為全身性疾病之徵兆之令人無法接受的不良反應。該等疫苗安全且就投與馬鼻炎B易感性物種(特定言之馬科)而言耐受性良好。 實例6
    該實例例示適用於釋放效價檢驗之天竺鼠(guinea pig)模型。
    將疫苗5(A/B-1)及疫苗6(A/B-2)各自投與給天竺鼠(每種疫苗對5隻天竺鼠，每次肌肉內疫苗接種0.5 mL)。3週後投與追加疫苗接種。19天後，對該等天竺鼠抽血且利用血清中和測試針對ERAV及ERBV分析血液。
    實例7
    該實例例示在免疫接種2種劑量之馬鼻炎A/鼻肺炎/流感殺滅病毒疫苗之後對鼻炎病毒A之攻毒評價及在免疫接種鼻炎A/鼻肺炎/流感殺滅病毒疫苗之後對馬鼻炎A呼吸道感染之預防。 目標
    該疫苗接種攻毒研究之目標係證實在依據馬鼻炎A/鼻肺炎/流感殺滅病毒疫苗之製法概述所製得之實驗性疫苗中馬鼻炎A部分之效能。用以評價疫苗接種之效能之可變主要結果為由馬鼻炎A病毒引起之呼吸疾病減輕。 材料及方法
    用於該研究中之疫苗為馬鼻炎A/鼻肺炎/流感疫苗，為殺滅病毒疫苗，由Hennessy Research Associates,LLC(HRA,Shawnee,Kansas)，USDA公司，執照編號597及Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc.(BIVI,St.Joseph,Missouri)，USDA公司，執照編號124製造。 A.馬鼻炎A病毒
    原馬鼻炎病毒A株系(ERhA V)係以分離株編號04-54188獲自圭爾夫大學之動物健康實驗室及以進口許可證編號106930在2008年9月9日接受。該病毒於E-Vero細胞繼代一次以製得高效價之預主儲液然後利用細胞培養基稀釋而製得主種子病毒(MSV)。該MSV表示為ERhA V(04-54188)、MSV、批次091508A-經稀釋、24Sept08，及在2010年6月18日由USDA核准用於公司597。
    用於該研究所評價疫苗中之馬鼻炎A病毒抗原為基於APHIS核准E-Vero細胞之第20代製得之MSV+5病毒。生長之後，過濾病毒流體，進行福馬林不活化，然後依據產品代號A522.20之製法之概述進行濃縮。在不活化之後針對殘餘活病毒檢測該等不活化病毒流體。結果顯示良好。不活化病毒流體係用以調配抗原納入水準為107.5 TCID50/mL之疫苗。 1.實驗疫苗鼻炎組合批次122110
    實驗疫苗鼻炎組合批次122110係基於預先不活化效價進行調配。
    最終調配疫苗每1 mL劑量含有以下成分： B.實驗用馬 1.實驗用馬之描述
    四十(40)匹購自Steve Waagen,Bottineau,North Dakota之6至8個月大的曳雜交馬在抵達Equine Resources,LLC,Butler,Mo.時即刻微晶片化且根據針對鼻炎A效價1：4進行預篩選之後之隨機數值產生器指派給IVP(Investigational Veterinary Product)或對照產品(CP)。
    整個研究中，馬係養在具有常見飼餵槽、飲水槽及乾草架之單個大馬廄裏。攻毒時，各動物係由實驗室人員指派2位數「馬廄代號」，連接至穿戴於整個攻毒後時期之籠頭，及用以在每天取得臨床徵兆及樣本時鑑別馬。在各觀察日期間，將馬關入系留欄內且隨機藉由個別限制槽實施。表25總結研究設計： 2.疫苗接種/攻毒及取樣時間表
    在2011年1月28日及2011年2月18日，以1 mL劑量體積肌肉內投與實驗疫苗鼻炎組合批次122110給20匹馬(疫苗接種組，IVP)之各者。20匹馬(對照組，CP)接受1 mL劑量之輔助MEM-E(實驗產品005)，其含有該批次122110疫苗(佐劑、健大黴素、兩性黴素B及甲醛)中所用之賦形劑然不含抗原。所有馬係藉由在2011年3月15日研究第46天(追加疫苗接種25天後)時經鼻內霧化毒性馬鼻炎A病毒予以攻毒。表26顯示事件時間表。
    3.馬之鼻內攻毒接種 a.攻毒病毒
    該攻毒病毒馬鼻炎A批次112108A產生於E-Vero細胞之組織培養物中。在攻毒當天測得該攻毒病毒之效價為1×107.3 TCID50/mL。 b.鼻內攻毒方法
    Sedivet®(鹽酸羅米非啶)、鎮靜劑及鎮痛藥係在攻毒之前以劑量50 μg/kg體重靜脈內投與給各匹馬。該攻毒病毒係按以下方法作為噴霧器所產生之氣霧劑進入馬AeroMask(Trudell Medical International,Ontario,Canada)而鼻內投與：將4毫升之107.3 TCID50/mL攻毒病毒置於AeroMask裝置中之噴霧杯。自空氣壓縮機至噴霧器之進口埠配置耐壓軟管。然後將出口管插入連接至進行攻毒之馬的頭之該AeroMask中且對該進口埠施加約10 psi之空氣壓力持續3分鐘。於該時間段，直接霧化約2毫升之攻毒病毒流體進入待攻毒之該等馬之鼻孔。攻毒病毒係未經稀釋投與給馬，實現2 mL劑量中為1×107.6 TCID50之攻毒含量。 C.攻毒前及後之評價參數 1.鼻滲出液評價
    所有鼻滲出液觀察均在採集鼻咽擦拭棒之前進行。在攻毒當天(D46)及攻毒後之21天內，檢查40匹免疫接種及對照用之馬中之各者之鼻通道及嘴套並利用列於下文之分級及評分說明予以分級。
    基於藉由以下分級之各者所顯示疾病之嚴重度規定等級評分為0至6： 2.眼分泌
    每天在評價鼻滲出液的時間評價眼分泌。眼分泌得分值記錄為0=正常；1=輕度至中度眼分泌及2=重度眼分泌。 3.體溫
    在攻毒當天及攻毒21天後藉由經校準之電子溫度計(GSA Electronics)探針針對40匹疫苗接種及對照用之馬之各者記錄日直腸溫度。該等日直腸溫度係以華氏溫度(℉)記錄。 4.鼻咽病毒分離
    於各觀察測試日，藉由附接至11英寸長無菌塑膠吸移管之無菌WECK-CEL®手術套管茅(surgical spear)(Edward Weck and Company,Inc.,Research Triangle Park,N.C.27709)深度擦拭各匹疫苗接種及對照馬之各個鼻通道。收集時，立刻將兩個手術套管茅中之各者置於含有4 mL激冷傳輸介質(補充健大黴素、L-麩胺醯胺酸、2×Pen/Strep、2×兩性黴素B之E-199)之單管中。
    為了分離病毒，將該等管混合，以無菌方式移走該等擦拭棒，然後以1500 rpm離心該介質歷時10至15分鐘以移去顆粒。在接種於組織培養細胞之前透過0.2 μ針筒過濾器過濾該介質。於過濾之後，將4至6%之無菌85%蔗糖溶液添加至用於冷凍於-80℃之各樣本使得所有樣本欲同時進行測試。
    在測試當天，取1 mL之解凍澄清輸送介質用以接種生長於已無菌移去生長介質之24孔組織培養板之E-Vero細胞之2 cm2 2天大的單層。接種之後，於37℃在含有5% CO2氣氛之增濕培養箱中允許接種物吸附於細胞單層上至少1小時。於吸附期之後，再對各孔添加1 mL之再饋送介質(含2 mM L-麩胺醯胺酸、健大黴素2×Pen-Strep及2×兩性黴素B之E-199)。在添加再饋送介質之後，接著，於37℃在CO2培養箱中培養該等板。對於馬鼻炎A攻毒病毒之典型細胞病變效應(CPE)之徵兆，以顯微鏡方式檢驗各測試及對照組織培養孔7天。7天觀察期結束時為陰性之孔係繼代培養至新鮮細胞上且再觀察7天。 統計評價方法
    基於每日基礎將馬歸類於呼吸疾病狀態之範圍內。對疾病狀態之歸類包括鼻及眼評價之組合。所採用之演算法詳述於以下：
    使用哈吉斯-雷曼(精確)估算(NPAR1WAY程序，SAS，SAS研究所，Cary NC)評價疫苗接種對疾病持續時間(患有至少中度疾病之天數)之影響。
    疾病之嚴重度係藉由比較疫苗接種馬與安慰劑馬之間之最大疾病狀況評價。算得減輕分率及95%信賴區間(CI，不對稱標準誤差)(FREQ程序，SAS)。
    藉由適用於連續數據之重複量測分析(溫度及經log轉換之SN效價；ANOVA)分析直腸溫度及血清中和效價。假若效價報告<4則假設SN效價為0，及假若效價報告>709則假設SN效價為709。在分析之前，SN效價係經log轉換。採用費雪精確測試比較每天的血塊黃層及鼻擦拭棒結果。 結果
    在該研究的第62天有1匹馬(編號#39(IVP組))死亡。在密蘇裡大學獸醫學院(University of Missouri College of Veterinary Medicine)進行驗屍後，確診慢性-活動性擴散性嚴重壞死及氣腫性下黏膜食道炎、胃炎及具有病灶內球桿菌(coccobacilli)細菌菌落及植株材料之咽炎，以及肺部之擴散性嚴重纖維膿性胸膜肺炎。該死亡之最可能解釋暗示先前之黏膜破壞，諸如胃賁門中的黏膜潰瘍，其使植株材料於相連結締組織中萌芽(附隨之病理報告)。 A.持續時間
    以天數表示之疾病持續時間(中度或重度呼吸疾病之天數)之分佈總結於表27中。觀察到安慰劑組中之動物患有疾病之中值天數為14天。在經疫苗接種之群組中，患有疾病之中值天數為1天。相較於該等對照組，經疫苗接種之動物中疾病持續時間明顯較短(表28；P<0.0001)。
    嚴重度
    疾病嚴重度之持續時間總結於表29中。相較於安慰劑馬，經疫苗接種之馬中疾病之嚴重度明顯較低(表30；減輕分率=0.7550，95%CI=0.5518，0.9582)。個別結果出示於表31中。
    表31中，在該研究之第62天死亡之馬#39之該等值自第62至67天報告為0，然分析中僅考慮值>1，因此對結果沒有影響。就該馬而言持續時間為1天及最大得分值為3。

    B．直腸溫度
    統計分析之結果總結於表32中。疫苗日相互作用統計學上極其顯著。當天內將分析出示於表33(附錄)。在第3、4及5天，經疫苗接種之群組中之馬相較於安慰劑組中之彼等具有統計學上明顯較低的體溫。在第20天，經疫苗接種之群組中之馬相較於安慰劑組中之彼等具有明顯較高的體溫。然而，在任何時間，處理群組之間之任何差異不具有臨床意義，及只有1匹馬(#39)在任何攻讀研究日均具有大於102℉之直腸溫度。
    1.血清中和效價
    統計分析之結果總結於表32中。在第46及53天，經疫苗接種之群組中之馬相較於安慰劑組中之彼等具有明顯較高的效價。在第67天，經疫苗接種之群組中之馬相較於安慰劑組中之彼等具有明顯較低的效價。 討論
    進行該研究以證實與不活化馬皰疹病毒1及4型及馬流感病毒組合之不活化馬鼻炎A病毒疫苗之馬鼻炎A病毒組份之效能。疫苗接種係以2-劑量形式提供，及毒性馬鼻炎A病毒之攻毒係在追加疫苗接種25天後進行。評價經疫苗接種及經安慰劑處理之對照用之馬以評定疫苗接種對減少臨床呼吸疾病之嚴重度及持續時間之效果。每日評價臨床徵兆、鼻擦拭棒及血塊黃層以證實馬鼻炎A疾病及經攻毒之該等馬中存有該病毒。
    該攻毒研究之結果顯示攻毒之後之疫苗接種者中之呼吸疾病之嚴重度及持續時間均統計學上顯著及臨床上重大地減少。相較於經對照產品接種之馬，經IVP接種之馬中之呼吸疾病得分值之減輕分率分析證實，呼吸疾病之中度/重度徵兆減少75.5%(95%之信賴區間為96%至55%)。相較於對照馬，經接種之馬中之中度/重度疾病之持續時間亦顯著縮短11天(95%信賴區間，少14天至8天之疾病持續時間)。此外，疫苗接種顯著減少連續5天之病毒剝離高峰期間之鼻病毒剝離，及在攻毒期間病毒血症高峰之4天內病毒血症亦顯著減輕。重點在於，病毒係自對照組馬之血塊黃層樣本回收，相較於經接種之馬中總計8天有4天研究期間病毒血症，5天研究期間總計達54倍。 結論
    該研究之數據清楚地證實以21天之給藥時間間隔投與2×1 mL肌肉內劑量之馬鼻炎A/鼻肺炎/流感殺滅病毒疫苗(產品代號TBD，無執照)給馬，明顯減少由馬鼻炎A毒性攻毒引起之呼吸疾病之嚴重度及持續時間。
    該等研究結果說明該疫苗適用於免疫接種6個月大或更大的馬對抗由馬鼻炎A病毒引起之呼吸疾病。該等數據亦建立疫苗批次122110作為用於馬鼻炎A/鼻肺炎/流感病毒殺滅病毒及馬鼻炎A疫苗殺滅病毒(產品代號1522.21，無執照)之隨後系列之效價測試之可接受之參考疫苗。
    圖1為病毒陽性跨時間之比例之圖形表示。
    圖2為血塊黃層陽性跨時間之比例之圖形表示。
    圖3為血清中和效價跨時間之圖形表示。
    圖4為平均鼻得分值跨時間之圖形表示。
    圖5為平均眼得分值跨時間之圖形表示。
    圖6為馬鼻炎A病毒ERAV/ON/05之一些部分(5' UTR部份，SEQ ID NO：1)與ERAV/PERV-1(寄存編號：DQ272578)(SEQ ID NO：14)之ClustalW比對。ERAV/ON/05核苷酸插入以粗體顯示及缺失以陰影顯示。
    圖7為實例4對照、感染及再感染之群組之臨床總得分平均值之圖表。
    圖8為實例4對照、感染及再感染之群組之體溫平均值之圖表。
    圖9為顯示實例4對照、感染及再感染之群組中馬鼻炎A病毒(ERAV)及馬鼻炎B病毒(ERBV)之效價之表。該病毒中和試驗(VN)係用以量測血清樣本之抗體效價。
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    权利要求:
    Claims (53)
    [1] 一種包含不活化或活減毒馬鼻炎A病毒(ERAV)或馬鼻炎B病毒(ERBV)之一或多種株系之免疫原性組合物，a)其中該ERAV株系或該ERBV株系在不活化或減毒之前，會使曝露於該株系之血清陰性馬中至少50%引發可偵測之呼吸疾病；及/或b)於細胞培養物中生長至106 TCID50/mL或更高；及/或，c)在以106 TCID50或更高之劑量作為馬之疫苗使用時，獲得至少1：112之血清效價；及/或d)其中該ERAV株系所含有基因組序列之逆轉錄本與SEQ ID NO：2具有95%以上之同一性；及/或e)其中該ERAV所編碼聚合蛋白質之胺基酸序列與SEQ ID NO：3具有95%以上之同一性；及/或f)其中該ERBV株系所含有基因組序列之逆轉錄本與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組序列之該逆轉錄本具有95%以上之同一性；及/或g)其中該ERVB株系所編碼聚合蛋白質之胺基酸序列與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組所編碼之聚合蛋白質具有95%以上之同一性。
    [2] 如請求項1之免疫原性組合物，其中ERAV或ERBV之該等一或多種株系係不活化。
    [3] 如請求項1之免疫原性組合物，其中ERAV或ERBV之該等一或多種株系為活的減毒株系。
    [4] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該株系在不活化或減毒之前會使曝露於該株系時之血清陰性馬中100%引發可偵測之呼吸疾病。
    [5] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該株系係在不活化之前於細胞培養物中生長至至少108 TCID50/mL。
    [6] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該株系獲得至少1：1000之血清效價。
    [7] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中ERAV或ERBV之該等一或多種株系為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)或ERBV株系07-103042(ATCC寄存編號PTA-11829)。
    [8] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該ERAV株系所含有基因組序列具有之逆轉錄本與SEQ ID NO：2具有95%以上之同一性或所編碼聚合蛋白質之胺基酸序列與SEQ ID NO：3具有95%以上之同一性，其中該ERAV株系在不活化或減毒之前具有感染活性並於宿主細胞中進行複製。
    [9] 如請求項8之免疫原性組合物，其中該ERAV株系所含有基因組序列具有之逆轉錄本具有含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之聚合蛋白質。
    [10] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該ERBV株系所含有基因組序列具有之逆轉錄本與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組序列之逆轉錄本具有95%以上之同一性或所編碼聚合蛋白質之胺基酸序列與具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組所編碼聚合蛋白質具有95%以上之同一性，其中該ERBV株系在不活化或減毒之前具有感染活性並於宿主細胞中進行複製。
    [11] 如請求項10之免疫原性組合物，其中該ERBV株系含有之基因組序列為具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之基因組序列或所編碼聚合蛋白質之胺基酸序列係具有ATCC寄存編號PTA-11829之該ERBV株系之該基因組所編碼聚合蛋白質之胺基酸序列。
    [12] 如請求項1之免疫原性組合物，其包含ERAV與ERBV，其中該ERAV株系為ERAV/ON/05及該ERBV株系具有ATCC寄存編號PTA-11829。
    [13] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含馬皰疹病毒之至少一種抗原或一種不活化或活減毒株系。
    [14] 如請求項13之免疫原性組合物，其中該馬皰疹病毒選自由EHV-1及EHV-4及其組合組成之群。
    [15] 如請求項13之免疫原性組合物，其中該馬皰疹病毒選自由EHV-1、EHV-4、以ATCC寄存編號PTA-9525及PTA-9526寄存之株系及其組合組成之群。
    [16] 如請求項13之免疫原性組合物，其包含馬皰疹病毒之至少一種抗原。
    [17] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含馬流感病毒之至少一種抗原或一種不活化或活減毒株系。
    [18] 如請求項17之免疫原性組合物，其中該馬流感病毒選自由支系(Clade)1病毒、支系2病毒、流感A/South Africa/2003、流感A/馬-2/Ohio/03、流感A/馬-2/New Market/2/93、流感A/馬-2/Kentucky/95、流感A/馬-2/Richmond/1/2007、以ATCC寄存編號PTA-9522、PTA-9523及PTA-9524寄存之株系及其組合組成之群。
    [19] 如請求項17之免疫原性組合物，其包含馬流感病毒之至少一種抗原。
    [20] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含馬皰疹病毒之至少一種抗原或一種不活化或活減毒株系及馬流感病毒之至少一種抗原或一種不活化或活減毒株系。
    [21] 如請求項20之免疫原性組合物，其中該馬皰疹病毒為EHV-1或EHV-4或其組合。
    [22] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包含一或多種選自由西尼羅病毒(West Nile Virus)、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉(Venezuelan)馬腦脊髓炎病毒及破傷風類毒素及其組合組成之群之株系之至少一種抗原。
    [23] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含至少一種選自由西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒及破傷風類毒素及其組合組成之群之不活化或活減毒株系。
    [24] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含東部馬腦脊髓炎、西部馬腦脊髓炎、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒及破傷風類毒素之一或多種不活化或活減毒株系。
    [25] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬流感病毒、馬皰疹病毒及破傷風類毒素之一或多種不活化或活減毒株系。
    [26] 如請求項22之免疫原性組合物，其中該西尼羅病毒為選自由馬源性(Horse Origin)2005，以ATCC寄存編號PTA-9409寄存；NAEE159，以美國農業部分離株(United States Department of Agriculture Isolate)寄存編號405330寄存；NY2002Nassau；NY2002Clinton；NY2002Queens；GA20021；GA20022；TX20021；TX20022；IN2002；NY2003Albany；NY2003Suffolk；NY2003Chatauqua；CO20031；CO20032；TX2003；TX2003Harris4；TX2003Harris6；TX2003Harris7；TX2003Harris10；AZ2004；及TX2004Harris4；及其組合組成之群之該等株系中之一者。
    [27] 如請求項22之免疫原性組合物，其中該西部馬腦脊髓炎病毒為以ATCC寄存編號PTA-9410寄存之株系。
    [28] 如請求項22之免疫原性組合物，其中該委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒為以ATCC寄存編號PTA-9411寄存之株系。
    [29] 如請求項22之免疫原性組合物，其中該東部馬腦脊髓炎病毒為以ATCC寄存編號PTA-9412寄存之株系。
    [30] 如請求項24之免疫原性組合物，其中該馬皰疹病毒選自由以ATCC寄存編號PTA-9525或PTA-9526寄存之該等株系及其組合組成之群。
    [31] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該等株系中之任何一者係以每劑量約102.0TCID50/mL至1010.0TCID50/mL含量存在。
    [32] 如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包含適宜之醫藥載劑。
    [33] 如請求項32之免疫原性組合物，其中該適宜之醫藥載劑係選自由稀釋劑、佐劑、抗微生物劑、防腐劑、滅活劑及其組合組成之群。
    [34] 如請求項33之免疫原性組合物，其中該佐劑為HRA-5。
    [35] 一種如請求項1至34中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製造適用於在動物或動物獸群中降低ERAV或ERBV所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕ERAV或ERBV所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之藥物。
    [36] 一種如請求項1至34中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製造適用於在動物或動物獸群中降低ERAV及/或ERBV，及選自由下列組成之群之該等病原體之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕ERAV及/或ERBV，及選自由下列組成之群之該等病原體之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之藥物：西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒及破傷風桿菌(Clostridium tetani)。
    [37] 一種如請求項1至34中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製造適用於在動物或動物獸群中降低ERAV及/或ERBV，及選自由下列組成之群之該等病原體中之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕ERAV及/或ERBV，及選自由下列組成之群之該等病原體中之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之藥物：東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬皰疹病毒及破傷風桿菌。
    [38] 一種如請求項1至34中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製造適用於在動物或動物獸群中降低ERAV及/或ERBV及選自由下列組成之群之該等病原體中之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之發病率或減輕ERAV及/或ERBV及選自由下列組成之群之該等病原體中之一或多者所關聯或所引起之臨床症狀之嚴重度之藥物上：西尼羅病毒、東部馬腦脊髓炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬皰疹病毒、馬流感病毒及破傷風桿菌。
    [39] 如請求項35至38中任一項之用途，其中在動物獸群中由該等病原體中之一或多者引起之臨床症狀之發病率相較未接受該免疫原性組合物之獸群降低至少約10%至50%。
    [40] 如請求項35至38中任一項之用途，其中投與至少1劑量之該免疫原性組合物提供抗該等病原體中之一或多者之免疫力持續至少12個月。
    [41] 如請求項35至38中任一項之用途，其中該動物為馬。
    [42] 如請求項35至38中任一項之用途，其中該等株系中之任何一者係以每劑量約102.0TCID50/mL至1010.0TCID50/mL含量存在。
    [43] 如請求項35至38中任一項之用途，其中該免疫原性組合物進一步包含適宜之醫藥載劑。
    [44] 如請求項43之用途，其中該適宜之醫藥載劑選自由稀釋劑、佐劑、抗微生物劑、防腐劑、滅活劑及其組合組成之群。
    [45] 如請求項44之用途，其中該佐劑為HRA-5。
    [46] 如請求項35至38中任一項之用途，其中該免疫原性組合物係投與一或多個劑量。
    [47] 如請求項35至38中任一項之用途，其中該免疫原性組合物之一劑量係調配成0.5 mL至2.5 mL之劑型。
    [48] 如請求項35至38中任一項之用途，其中該免疫原性組合物可安全用於4個月大或更大之小馬或馬。
    [49] 一種產製包含不活化ERAV或ERBV之一或多種株系之免疫原性組合物之方法，該方法包括：a)以ERAV或ERBV感染易感性細胞系；b)使該已感染細胞系於生長介質中生長直到達到細胞病變效應(CPE)；c)收穫該介質；d)過濾該介質而獲得經過濾之介質；以及e)將該經過濾之介質與滅活劑接觸，獲得不活化ERAV或ERBV。
    [50] 如請求項51之方法，其進一步包括添加佐劑及一或多種防腐劑。
    [51] 如請求項50之方法，其包括以ERAV及ERBV感染細胞。
    [52] 如請求項50之方法，其中該ERAV為ERAV/ON/05(ATCC寄存編號PTA-11828)及該ERBV為株系07-103042C ATCC寄存編號：PTA-11829。
    [53] 一種免疫原性組合物，其包含ERAV/ON/05及/或具有ATCC寄存編號：PTA-11829之ERBV株系及兩性黴素B、硫酸健大黴素(gentamicin sulfate)、甲醛及HRA-5。
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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    US201161510226P| true| 2011-07-21|2011-07-21||
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