胃癌の診断、予後診断及び治療のためのマイクロｒｎａに基づいた方法及び組成物

专利摘要:
胃癌関連疾患の診断、予後診断及び／又は治療のための方法及び組成物を開示する。 なし
公开号:JP2011516032A
申请号:JP2010548899
申请日:2009-02-27
公开日:2011-05-26
发明作者:クロース，カーロ・エム；ベッキオネ，アンドレア；ペトロッカ，ファビオ
申请人:ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 関連出願への相互参照
[00001]本出願は、２００８年２月２８日に出願の米国仮出願番号６１／０６７，４４５の権益を主張し、その全ての開示は参照により本明細書に明確に組み入れられる。]
[0002] 連邦政府支援の研究に関する宣言
[00002]本発明は、ＮＣＩ助成金番号ＣＡ７６２５９及びＣＡ８１３４のもと、政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。]
[0003] 本発明の産業上の利用可能性
[00003]本発明は一般的には分子生物学の分野に関する。本発明のある側面は、胃癌関連障害の診断法、治療法及び予後診断法における応用を含む。]
背景技術

[0004] [00004]このセクションで開示された背景技術が合法的に先行技術を構成すると認められるものはない。
[00005]胃癌の発生は１９４０年代から１９８０年代にかけて西欧諸国においては低下しているが、世界的には重要な公衆衛生問題として残っており、世界的には二番目に多く診断される悪性腫瘍であり、毎年全ての癌関連死の１２％の原因となっている(Uemura et al., 2001)。胃腫瘍の９５％以上は、組織学的に腸型（intestinal type）あるいはびまん型（diffuse type）に分類される腺癌である(Lauren P, 1965)。腸腫瘍の進展は、多数の逐次的ステップを介した進行により特徴付けられている。中でも、二つのイベントが胃腫瘍発生で特徴的である：Ｅ２Ｆ１の上方調節(Suzuki et al., 1999）及びＴＧＦＥ耐性の発生(Ju et al., 2003; Park et al., 1994)。]
[0005] [00006]Ｅ２Ｆ１は、Ｇ１／Ｓ移行を促進する細胞周期の主レギュレーターであり、染色体ＤＮＡ複製に関与する多様な遺伝子をトランス活性化し（transactivate）、それ自身のプロモーターを含む(DeGregori, 2002)。Ｅ２Ｆ１の過剰発現は、それ自体が発癌イベントであり、細胞を形質転換する素因となる一方(Pierce et al., 1999)、決定的閾値を超えて生じた場合、強力なアポトーシスシグナルでもある(Lazzerini Denchi et al., 2005)。]
[0006] [00007]一方、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）は、胃腸管細胞を増殖、分化又はアポトーシスに導く、上皮及び間質性コンパートメント間クロストークの複雑なシステム、いわゆる形態形成プログラムで主たる役割を果たしているサイトカインである(van den Brink and Offerhaus, 2007)。]
先行技術

[0007] Uemura, N., Okamoto, S., Yamamoto, S., Matsumura, N., Yamaguchi, S., Yamakido, M., Taniyama, K., Sasaki, N., and Schlemper, R. J. (2001). Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. N Engl J Med 345, 784-789.
Lauren P (1965) The two histological main types of gastric carcinoma: Diffuse and so-called intestinal-type carcinoma. An attempt at a histo-clnical classification. Acta Pathol Microbiol Scand 64: 31-49.
Suzuki, T., Yasui, W., Yokozaki, H., Naka, K., Ishikawa, T., and Tahara, E. (1999). Expression of the E2F family in human gastrointestinal carcinomas. Int J Cancer 81, 535-538.
Ju, H. R., Jung, U., Sonn, C. H., Yoon, S. R., Jeon, J. H., Yang, Y., Lee, K. N., and Choi, I. (2003). Aberrant signaling of TGF-beta1 by the mutant Smad4 in gastric cancer cells. Cancer Lett 196, 197-206.
Park, K., Kim, S. J., Bang, Y. J., Park, J. G., Kim, N. K., Roberts, A. B., and Sporn, M. B. (1994). Genetic changes in the transforming growth factor beta (TGF-beta) type II receptor gene in human gastric cancer cells: correlation with sensitivity to growth inhibition by TGF-beta. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 8772-8776.
DeGregori, J. (2002). The genetics of the E2F family of transcription factors: shared functions and unique roles. Biochim Biophys Acta 1602, 131-150.
Pierce, A. M., Schneider-Broussard, R., Gimenez-Conti, I. B., Russell, J. L., Conti, C. J., and Johnson, D. G. (1999). E2F1 has both oncogenic and tumor-suppressive properties in a transgenic model. Mol Cell Biol 19, 6408-6414.
Lazzerini Denchi, E., and Helin, K. (2005). E2F1 is crucial for E2F-dependent apoptosis.EMBO Rep 6, 661-668.
van den Brink, G. R., and Offerhaus, G. J. (2007). The morphogenetic code and colon cancer development. Cancer Cell 11, 109-117.]
発明が解決しようとする課題

[0008] [00008]これらの疾患を治療するための療法についてのかなりの研究にもかかわらず、現在でも効果的に診断する及び治療するのが困難であり、患者で観察された死亡率は、本疾患の診断、治療及び予防の改善が必要とされていることを示している。]
課題を解決するための手段

[0009] [00009]第一の側面において、対象が胃関連障害を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する、胃癌及び／又は関連障害を有する対象の予後を決定する、及び／又はこうした障害を有する対象を治療する方法が本明細書において提供され、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照サンプル中の対応するバイオマーカーと比較した、該試験サンプル中の該バイオマーカーのレベルの変化は、該対象が該障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す。]
[0010] [00010]ある態様において、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも低い。
[00011]ある態様において、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い。]
[0011] [00012]ある態様において、差次的に発現される該少なくとも一つのバイオマーカーは、図１３−表１に列挙された群より選択される。
[00013]ある態様において、該障害は慢性胃炎を含み、そして少なくとも一つのバイオマーカーは、上方調節されているｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１５５から成る群より選択される。] 図１３
[0012] [00014]ある態様において、該障害は慢性胃炎を含み、そして少なくとも一つのバイオマーカーは下方調節されているｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−２６ｂから成る群より選択される。]
[0013] [00015]ある態様において、差次的に発現される該少なくとも一つのバイオマーカーは、図１４−表２に列挙された群より選択される。
[00016]ある態様において、該障害は胃腺癌を含み、そして少なくとも一つのバイオマーカーは、上方調節されているｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１７−５−ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３２０及びｍｉＲ−９９ｂから成る群より選択される。] 図１４
[0014] [00017]ある態様において、該障害は胃腺癌を含み、そして少なくとも一つのバイオマーカーは、下方調節されているｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３３９及びｍｉＲ−１３０ｂから成る群より選択される。]
[0015] [00018]ある態様において、該差次的に発現される少なくとも一つのバイオマーカーは、図１６−表３に列挙された群：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ及びｍｉＲ−１０６ａから選択される。] 図１６
[0016] [00019]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーはｍｉＲ−１６０ｂ−２５クラスター：ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５を含む。
[00020]別の側面において、図１８−表６に列挙された遺伝子：ＰＨＬＰＰＬ、ＧＭ６３２、ＡＬＸ４、ＰＬＥＫＨＭｌ、ＪＯＳＤ１、ＺＦＰＭ２、ＧＡＴＡＤ２Ｂ、ＺＮＦ２３８、ＡＴＸＮ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＫＬＦ１２、ＵＢＥ２Ｗ、ＯＳＢＰＬ５、ＳＮＦ１ＬＫ、ＰＣＡＦ、ＰＡＰＯＬＡ、及びＣＦＬ２の一つ以上の発現の変調における、ｍｉＲ−１６０ｂ−２５クラスター：ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５を含む少なくとも一つのバイオマーカーの使用が本明細書において提供される。] 図１８
[0017] [00021]別の側面において、Ｅ２Ｆ１発現を調節することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に提供され、Ｅ２Ｆ１の発現を変調するのに十分な、ｍｉＲ−１０６ｂ及び／又はｍｉＲ−９３又はそれらの機能的変異体の有効量を投与することを含む。]
[0018] [00022]別の側面において、Ｅ２Ｆ１発現を調節するための、それを必要とする対象におけるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の使用が本明細書に提供される。
[00023]別の側面において、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１）及び／又はＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍ）の発現を妨害するＴＧＦＥ腫瘍抑制経路を変調する方法が本明細書に提供され、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上を上方調節することを含む。]
[0019] [00024]別の側面において、胃癌での、Ｅ２Ｆ１転写後調節及びＴＧＦＥ抵抗性の発生の変調におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの使用が本明細書に提供される。
[00025]別の側面において、Ｅ２Ｆ１発現を制御することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に提供され、該対象においてｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３のレベルを変調することを含む。]
[0020] [00026]別の側面において、Ｍｃｍ７と並行してｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節するための、それを必要とする対象におけるＥ２Ｆ１の使用が、本明細書に提供される。
[00027]別の側面において、Ｅ２Ｆ１タンパク質合成の速度を制御し、その過剰な蓄積を防止することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に提供され、該対象におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターのレベルを変調することを含む。]
[0021] [00028]別の側面において、ＴＧＦＥ誘発細胞周期停止を害するための、それを必要とする対象におけるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の使用が本明細書に提供される。
[00029]別の側面において、転写後レベルでｐ２１の発現を阻害することにより、ＴＧＦＯ誘発細胞周期停止を妨害するための、それを必要とする対象におけるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の使用が、本明細書に提供される。]
[0022] [00030]別の側面において、ＴＧＦＯ誘発アポトーシスの開始を妨げることにおける、それを必要とする対象でのｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協同したｍｉＲ−２５の使用が、本明細書に提供される。]
[0023] [00031]別の側面において、アポトーシスからの胃癌細胞の保護を妨げるため、それを必要とする対象においてｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの発現を変調するための方法が本明細書に提供される。]
[0024] [00032]別の側面において、胃癌において特有のマイクロＲＮＡ発現シグネチャーが本明細書に提供され、腫瘍マイクロＲＮＡプロセッシングを調節する一つ以上のバイオマーカーの発現の変化を含む。]
[0025] [00033]別の側面において、胃癌における標的ｍＲＮＡの転写産物量及び／又はタンパク質発現に影響を及ぼす方法が本明細書に提供され、それを必要とする対象において一つ以上のマイクロＲＮＡを調節解除することを含む。]
[0026] [00034]ある態様において、該方法はさらに、癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制することを含む。
[00035]ある態様において、癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害するため、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上の発現を変化させることをさらに含む。]
[0027] [00036]別の側面において、ヒト胃癌で生じるマイクロＲＮＡ機能の変化を同定するための、マイクロＲＮＡ及びタンパク質コードＲＮＡの両方の大規模遺伝子発現プロファイリングの使用が、本明細書に提供される。]
[0028] [00037]胃癌を有する対象の予後を決定することを含む請求項１の方法は、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで：ｉ）該バイオマーカーは、こうした癌の予後不良に関連し；そしてｉｉ）対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの変化は、予後不良を示す。]
[0029] [00038]ある態様において、該方法は対象が胃癌を有するか、又は発症するリスクがあるかどうかを診断することをさらに含み、１）対象から得られた試験サンプルからのＲＮＡを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供し；２）該標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；及び、３）該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルと対照サンプルから生成されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することを含み、ここで、少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化は、該対象がこうした癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。]
[0030] [00039]ある態様において、該少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルは、対照サンプルから発生されたシグナルと比較して下方調節されており、及び／又は該少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルは、対照サンプルから発生されたシグナルと比較して上方調節されている。]
[0031] [00040]ある態様において、表１３、表１４及び表１６に列挙された群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーのシグナルの変化は、該対象が予後不良のこうした癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。]
[0032] [00041]別の側面において、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上を含む、胃障害又は疾患のバイオマーカーが本明細書に提供される。
[00042]別の側面において、胃癌細胞中のｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上の発現を変調することを含む、胃癌細胞中でタンパク質発現を調節するための方法が本明細書に提供される。]
[0033] [00043]別の側面において、胃癌細胞中のＥ２Ｆ１、ＣＤＫＮｌＡ（ｐ２１Ｗａｆ１Ｃｉｐ１）及びＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍ）の一つ以上の発現を変調するための組成物が本明細書に提供され、該組成物は、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５、又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む。]
[0034] [00044]別の側面において、Ｅ２Ｆ１及びｐ２１／ＷＡＦｌタンパク質レベルの一つ以上を調節することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に提供され、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５又はそれらの機能的変異体の一つ以上を使用することを含む。]
[0035] [00045]別の側面において、胃癌細胞におけるｐ２１／ＷＡＦｌ及び／又はＥ２Ｆ１タンパク質レベルを、それを必要とする対象において増加させるために有用なアンチセンスｍｉＲ−１０６ｂを含む組成物が、本明細書に提供される。]
[0036] [00046]別の側面において、対照細胞と比較して、少なくとも一つのバイオマーカーが対象の癌細胞で下方調節又は上方調節されている胃癌を有する対象において、胃癌を治療する方法が本明細書に提供され、１）該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが下方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー、又は単離された変異体又はそれらの生物学的に活性な断片の有効量を該対象に投与すること；又は２）該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが上方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含む。]
[0037] [00047]別の側面において、対象の胃癌を治療する方法が本明細書に提供され：１）対照細胞と比較して、胃癌細胞中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を決定すること：そして２）ｉ）もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも少ないならば、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーの有効量を該対象に投与することにより；又はｉｉ）もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも多いならば、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより、胃癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量を変化させること；を含む。]
[0038] [00048]別の側面において、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー及び薬学的に許容できる担体を含む、胃癌を治療するための医薬組成物が本明細書に提供される。
[00049]ある態様において、該少なくとも一つの単離されたバイオマーカーは、対照細胞と比較して胃癌細胞中で下方調節されているバイオマーカーに対応する。]
[0039] [00050]ある態様において、該医薬組成物は少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害化合物及び薬学的に許容できる担体を含む。
[00051]別の側面において、抗胃癌剤を同定する方法が本明細書に提供され、細胞に試験剤を与えること、そして胃癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの増加は、該試験剤が抗胃癌剤であることを示す。]
[0040] [00052]別の側面において、抗胃癌剤を同定する方法が本明細書に提供され、細胞に試験剤を与えること、そして胃癌細胞中の増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較して、該細胞中のバイオマーカーのレベルの減少は、該試験剤が抗胃癌剤であることを示す。]
[0041] [00053]別の側面において、胃癌関連疾患を予防する、診断する及び／又は治療するための療法の有効性を評価する方法が本明細書に提供され：ｉ）その有効性が評価されている療法を動物に供すること；そしてｉｉ）表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを評価することにより、該疾患を治療する又は予防することについて試験されている治療の有効性のレベルを決定すること；を含む。]
[0042] [00054]該候補療法剤が、医薬組成物、栄養補助食品組成物及びホメオパシー組成物の一つ以上を含む、前記請求項の方法。
[00055]ある態様において、評価されている療法は、ヒト対象での使用のためである。]
[0043] [00056]別の側面において、製品が本明細書に提供され：表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、胃癌関連疾患のためのマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む。]
[0044] [00057]別の側面において、胃癌関連疾患を治療する療法剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットが本明細書に提供され、該キットは：表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのバイオマーカーを発現している細胞を含む。]
[0045] [00058]ある態様において、該バイオマーカーの存在は、少なくとも一つのバイオマーカーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される。
[00059]別の側面において、個体における該疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、胃癌関連疾患応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用が本明細書に提供され、該剤は、表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。]
[0046] [00060]別の側面において、胃癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定することを、それを必要とする個体で行う方法が本明細書において提供され：少なくとも胃癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含み、該剤は、表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。]
[0047] [00061]別の側面において、個体における胃癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、少なくとも胃癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤の使用が、本明細書に提供され、該剤は、表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。]
[0048] [00062]別の側面において、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上のアンチセンス阻害剤を含む組成物が、本明細書に提供される。
[00063]別の側面において、胃障害を治療することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に提供され、該組成物の療法的有効量を対象に投与することを含む。]
[0049] [00064]ある態様において、該組成物は予防的に投与される。
[00065]ある態様において、該組成物の投与は、胃癌の一つ以上の症状の発症を遅延させる。]
[0050] [00066]ある態様において、該組成物の投与は、胃癌の発生を抑制する。
[00067]ある態様において、該組成物の投与は、腫瘍の増殖を抑制する。
[00068]別の側面において、生物学的サンプル中の胃癌の存在を検出する方法が本明細書に提供され：ｉ）胃癌を含有すると疑われる生物学的サンプルを、それらのためのマーカーに暴露すること；そしてｉｉ）もしあれば、該サンプル中の該マーカーの存在又は不存在を検出すること；を含む。]
[0051] [00069]ある態様において、該マーカーは検出可能な標識を含む。
[00070]ある態様において、該方法は、該対象からの生物学的サンプル中の該マーカーの量と、正常対象からの対応する生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較することをさらに含む。]
[0052] [00071]ある態様において、該方法は、異なる時点で対象から複数の生物学的サンプルを集めること、及び各生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較して、時間とともに該対象において該マーカーの量が増加している又は減少しているかどうかを決定することをさらに含む。]
[0053] [00072]別の側面において、対象の胃癌を治療するための方法が本明細書に提供され、該方法は、胃癌レセプターアゴニストを含む。
[00073]ある態様において、該レセプターアゴニストは、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上のアンチセンス阻害剤である。]
[0054] [00074]別の側面において、胃癌の治療のための薬剤を製造するための、表１３、１４及び１６に示したｍｉＲ、それらから派生する配列、こうしたｍｉＲの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択される核酸分子を含む使用が、本明細書に提供される。]
[0055] [00075]ある態様において、該薬剤は、表１３、１４及び１６に列挙されたｍｉＲ、こうしたｍｉＲから派生する配列、こうしたｍｉＲの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択された配列を提示する核酸分子を含む。]
[0056] [00076]別の側面において、胃癌細胞の分化を誘発するために有効な療法剤又は療法剤の組み合わせを同定するためのインビトロの方法が本明細書に提供され、該方法は：ｉ）胃腫瘍に由来する細胞を培養すること、ｉｉ）該細胞株の培養培地に少なくとも一つの化合物を添加すること、ｉｉｉ）段階（ｉ）及び（ｉｉ）間の少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルの漸進的変化を分析すること、及びｉｖ）段階（ｉ）及び（ｉｉ）間のｍｉＲの発現レベルの変化を誘発する化合物又は化合物の組み合わせを同定する；段階を含む。]
[0057] [00077]ある態様において、段階（ｉｉｉ）は、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルの分析を含む。
[00078]ある態様において、段階（ｉｖ）は、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルを変調する化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。]
[0058] [00079]ある態様において、段階（ｉｖ）は、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルを減少させる化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。
[00080]ある態様において、該化合物は癌の治療のための療法剤である。]
[0059] [00081]本発明の種々の目的及び利点は、付随する図面を照らし合わせて読むことにより、好ましい態様の以下の詳細な説明から、当業者には明らかになるであろう。
[00082]本特許又は出願ファイルは一枚以上のカラーで仕上げられた図及び／又は一つ以上の写真を含む。カラーの図及び／又は写真を含むこの特許又は特許出願印刷物のコピーは、依頼及び必要な料金の支払い後、本特許庁により提供されるであろう。]
図面の簡単な説明

[0060] [00083]図１Ａ−１Ｅ：慢性胃炎及び胃腺癌におけるｍｉＲＮＡ発現の変化。ｍｉＲＮＡはＳＡＭ分析（ＦＤＲ＝０％、ｑ＝０）によると、慢性胃炎（図１Ａ）あるいは胃腺癌（図１Ｂ）に有意に関連する。赤及び緑色は、それぞれ上方調節及び下方調節を示す。正常胃粘膜、慢性胃炎及び胃腺癌の代表的な組織学的特徴が示されている：ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。
図１Ａ−１Ｅ：慢性胃炎及び胃腺癌におけるｍｉＲＮＡ発現の変化。ｍｉＲＮＡはＳＡＭ分析（ＦＤＲ＝０％、ｑ＝０）によると、慢性胃炎（図１Ａ）あるいは胃腺癌（図１Ｂ）に有意に関連する。赤及び緑色は、それぞれ上方調節及び下方調節を示す。正常胃粘膜、慢性胃炎及び胃腺癌の代表的な組織学的特徴が示されている：ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。
図１Ａ−１Ｅ：慢性胃炎及び胃腺癌におけるｍｉＲＮＡ発現の変化。ｍｉＲＮＡはＳＡＭ分析（ＦＤＲ＝０％、ｑ＝０）によると、慢性胃炎（図１Ａ）あるいは胃腺癌（図１Ｂ）に有意に関連する。赤及び緑色は、それぞれ上方調節及び下方調節を示す。正常胃粘膜、慢性胃炎及び胃腺癌の代表的な組織学的特徴が示されている：ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。
図１Ａ−１Ｅ：慢性胃炎及び胃腺癌におけるｍｉＲＮＡ発現の変化。図１Ｃ：Ｍｃｍ７のイントロン１３中に存在するｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターゲノム座位の略図。この遺伝子の一次転写産物は、プライマーの二つの異なった組（＃１及び＃２）を使用してＳｎｕ−１６細胞から逆転写し、増幅し及び配列決定した独特の分子内に融合された、三つすべてのｍｉＲＮＡを含む。
図１Ａ−１Ｅ：慢性胃炎及び胃腺癌におけるｍｉＲＮＡ発現の変化。ＲＮＡｉによるドローシャの下方調節（図１Ｄ）はこの転写体の劇的な蓄積を誘導して（図１Ｅ）活性な一次ｍｉＲＮＡの存在を裏付けているので、この分子はＭｃｍ７転写の単なる副産物ではない。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。このクラスターは、それぞれ第１３番染色体及びＸ染色体に位置する、ｍｉＲ−１７−９２及びｍｉＲ−１０６ａ−９２クラスターと高度の相同性を共有する。色は、同じファミリーのｍｉＲＮＡを規定する。
図１Ａ−１Ｅ：慢性胃炎及び胃腺癌におけるｍｉＲＮＡ発現の変化。ＲＮＡｉによるドローシャの下方調節（図１Ｄ）はこの転写体の劇的な蓄積を誘導して（図１Ｅ）活性な一次ｍｉＲＮＡの存在を裏付けているので、この分子はＭｃｍ７転写の単なる副産物ではない。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。このクラスターは、それぞれ第１３番染色体及びＸ染色体に位置する、ｍｉＲ−１７−９２及びｍｉＲ−１０６ａ−９２クラスターと高度の相同性を共有する。色は、同じファミリーのｍｉＲＮＡを規定する。
[00084]図２Ａ−２Ｇ：Ｅ２Ｆ１はｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節する。図２Ａ：１２時間のノコダゾール処理、そして続いての新鮮培地への放出により有糸分裂が同期化されたＡＧＳ細胞のＦＡＣＳ解析。
図２Ａ−２Ｇ：Ｅ２Ｆ１はｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節する。細胞を異なる時点で採取し、ウエスタンブロットによりＥ２Ｆ１タンパク質含有量（図２Ｂ）及びｑＲＴ−ＰＣＲによりＭｃｍ７、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５前駆体ＲＮＡレベル（図２Ｃ）について分析した。各分析は、３重に実行した。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。ＡＧＳ細胞は９０％コンフルエンスで播種し、０．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、３６時間飢餓状態にした。細胞は次ぎに、２５のＭ．Ｏ．Ｉ．でアデノＧＦＰあるいはアデノＥ２Ｆｌウイルスに感染させ、さらに２１時間インキュベートした；この時点では、細胞は形態学、トリパンブルー染色及びサブディプロイドＤＮＡ含量の分析により決定されるアポトーシスの徴候は示さなかった（データは示していない）。
図２Ａ−２Ｇ：Ｅ２Ｆ１はｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節する。細胞を異なる時点で採取し、ウエスタンブロットによりＥ２Ｆ１タンパク質含有量（図２Ｂ）及びｑＲＴ−ＰＣＲによりＭｃｍ７、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５前駆体ＲＮＡレベル（図２Ｃ）について分析した。各分析は、３重に実行した。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。ＡＧＳ細胞は９０％コンフルエンスで播種し、０．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、３６時間飢餓状態にした。細胞は次ぎに、２５のＭ．Ｏ．Ｉ．でアデノＧＦＰあるいはアデノＥ２Ｆｌウイルスに感染させ、さらに２１時間インキュベートした；この時点では、細胞は形態学、トリパンブルー染色及びサブディプロイドＤＮＡ含量の分析により決定されるアポトーシスの徴候は示さなかった（データは示していない）。
図２Ａ−２Ｇ：Ｅ２Ｆ１はｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節する。
図２Ａ−２Ｇ：Ｅ２Ｆ１はｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節する。ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５前駆体は、上記ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。Ｓｎｕ１６細胞を、Ｅ２Ｆ１に対するｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）でトランスフェクトし、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体（図２Ｅ）及び成熟（図２Ｆ）種の発現を、上記ｑＲＴ−ＰＣＲにより７２時間後に決定した。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。
図２Ａ−２Ｇ：Ｅ２Ｆ１はｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節する。ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５前駆体は、上記ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。Ｓｎｕ１６細胞を、Ｅ２Ｆ１に対するｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）でトランスフェクトし、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体（図２Ｅ）及び成熟（図２Ｆ）種の発現を、上記ｑＲＴ−ＰＣＲにより７２時間後に決定した。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。
図２Ａ−２Ｇ：Ｅ２Ｆ１はｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節する。図２Ｇ：図９に示したものと同一の胃原発性腫瘍中のＥ２Ｆ１タンパク質の発現。赤丸はｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、対応する腫瘍中のＭｃｍ７及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体ＲＮＡの過剰発現を示す。
[00085]図３Ａ−３Ｆ：Ｅ２Ｆ１は、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の標的である。図３Ａ：ステムループｑＲＴ−ＰＣＲにより決定された、ヒト胃癌細胞株及び正常粘膜における成熟ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の内因性発現；バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。Ｓｎｕ−１細胞は胃神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）に由来すると考えられており、一方、ＲＦ１及びＲＦ４８細胞は胃のＢ細胞リンパ腫からである。すべての他の細胞株は胃腺癌からである。
図３Ａ−３Ｆ：Ｅ２Ｆ１は、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の標的である。図３Ｂ：ＡＳＯトランスフェクションによるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の阻害又は（図３Ｃ）オリゴヌクレオチドトランスフェクションによる同一ｍｉＲＮＡの過剰発現、又は（図３Ｄ）レンチウイルス形質導入、４８時間後のＳｎｕ−１６細胞のウエスタンブロット。スクランブルＲＮＡ又はＬＮＡオリゴヌクレオチドを、陰性対照として使用した。タンパク質発現を定量し、ＧＡＰＤＨで正規化した。類似の結果がＡＧＳ及びＭＫＮ−７４細胞において得られた（データは示していない）。
図３Ａ−３Ｆ：Ｅ２Ｆ１は、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の標的である。図３Ｂ：ＡＳＯトランスフェクションによるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の阻害又は（図３Ｃ）オリゴヌクレオチドトランスフェクションによる同一ｍｉＲＮＡの過剰発現、又は（図３Ｄ）レンチウイルス形質導入、４８時間後のＳｎｕ−１６細胞のウエスタンブロット。スクランブルＲＮＡ又はＬＮＡオリゴヌクレオチドを、陰性対照として使用した。タンパク質発現を定量し、ＧＡＰＤＨで正規化した。類似の結果がＡＧＳ及びＭＫＮ−７４細胞において得られた（データは示していない）。
図３Ａ−３Ｆ：Ｅ２Ｆ１は、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の標的である。図３Ｂ：ＡＳＯトランスフェクションによるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の阻害又は（図３Ｃ）オリゴヌクレオチドトランスフェクションによる同一ｍｉＲＮＡの過剰発現、又は（図３Ｄ）レンチウイルス形質導入、４８時間後のＳｎｕ−１６細胞のウエスタンブロット。スクランブルＲＮＡ又はＬＮＡオリゴヌクレオチドを、陰性対照として使用した。タンパク質発現を定量し、ＧＡＰＤＨで正規化した。類似の結果がＡＧＳ及びＭＫＮ−７４細胞において得られた（データは示していない）。
図３Ａ−３Ｆ：Ｅ２Ｆ１は、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の標的である。（図３Ｅ）ｐＧＬ３−Ｅ２Ｆｌ−３’ＵＴＲ及びｍｉＲ−１０６ｂ又はｍｉＲ−９３オリゴヌクレオチドで共トランスフェクトされた細胞において減少したルシフェラーゼ活性を示しているルシフェラーゼアッセイ。ｍｉＲＮＡシード領域（seed region）と相補的な、三つの推定ｍｉＲ−１０６ｂ／ｍｉＲ−９３結合部位中の最初の三つの塩基の欠失は、この効果を取り消した（ＭＵＴ）。バーは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性＋／−ＳＤで正規化されたホタルルシフェラーゼ活性を示す。各レポータープラスミドは少なくとも２回トランスフェクトし（異なった日に）、そして各サンプルは３重にアッセイした。
図３Ａ−３Ｆ：Ｅ２Ｆ１は、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の標的である。図３Ｆ：図３Ｃに示したものと同一の細胞におけるＥ２Ｆ１ｍＲＮＡ下方制御を示しているｑＲＴ−ＰＣＲ分析。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。
[00086]図４Ａ−４Ｅ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３はｐ２１タンパク質発現を抑圧する。図４Ａ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３のＡＳＯ（図４Ａ）又は模倣体（図４ＢＡ）によるトランスフェクション、又は同一ｍｉＲＮＡのレンチウイルス形質導入（図４Ｃ）後に、０．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で増殖させたＳｎｕ−１６細胞におけるＰ２１発現。
図４Ａ−４Ｅ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３はｐ２１タンパク質発現を抑圧する。図４Ａ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３のＡＳＯ（図４Ａ）又は模倣体（図４ＢＡ）によるトランスフェクション、又は同一ｍｉＲＮＡのレンチウイルス形質導入（図４Ｃ）後に、０．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で増殖させたＳｎｕ−１６細胞におけるＰ２１発現。
図４Ａ−４Ｅ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３はｐ２１タンパク質発現を抑圧する。図４Ａ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３のＡＳＯ（図４Ａ）又は模倣体（図４ＢＡ）によるトランスフェクション、又は同一ｍｉＲＮＡのレンチウイルス形質導入（図４Ｃ）後に、０．５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で増殖させたＳｎｕ−１６細胞におけるＰ２１発現。
図４Ａ−４Ｅ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３はｐ２１タンパク質発現を抑圧する。図４Ｄ：ｍｉＲ−１０６ｂあるいはｍｉＲ−９３オリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＳｎｕ−１６細胞中のｐ２１ ｍＲＮＡレベルに有意な差がないことを示しているｑＲＴ−ＰＣＲ結果。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。
図４Ａ−４Ｅ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３はｐ２１タンパク質発現を抑圧する。図４Ｅ：ｐＧＬ３−ｐ２１−３’ＵＴＲ及びｍｉＲ−１０６ｂ又はｍｉＲ−９３オリゴヌクレオチドで共トランスフェクトされた細胞において減少したルシフェラーゼ活性を示しているレポーターアッセイ。ｍｉＲＮＡシード領域と相補的な、ｍｉＲ−１０６ｂ／ｍｉＲ−９３予測結合部位の最初の３塩基の欠失は、この効果を取り消した（ＭＵＴ）。バーは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性＋／−ＳＤで正規化されたホタルルシフェラーゼ活性を示す。各レポータープラスミドは少なくとも２回トランスフェクトし（異なった日に）、そして各サンプルは３重にアッセイした。
[00087]図５Ａ−５Ｄ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の過剰発現は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を妨げる。図５Ａ：１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦＥに対するＳｎｕ−１６細胞の生理応答：刺激の初期段階（１６時間）において、細胞はＧｌ／Ｓ細胞周期停止を行うが、一方、サブディプロイド（subdiploid）ＤＮＡ含量により決定されるアポトーシスは未だ限定されている。アポトーシスを行っている細胞の数は、続いての時間において次第に増加する。
図５Ａ−５Ｄ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の過剰発現は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を妨げる。図５Ｂ：ＴＧＦＥ刺激１６時間後の、Ｅ２Ｆ１タンパク質（図５Ｃ）及びＭｃｍ７、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ２５前駆体の下方調節。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。
図５Ａ−５Ｄ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の過剰発現は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を妨げる。図５Ｂ：ＴＧＦＥ刺激１６時間後の、Ｅ２Ｆ１タンパク質（図５Ｃ）及びＭｃｍ７、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ２５前駆体の下方調節。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。
図５Ａ−５Ｄ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の過剰発現は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を妨げる。図５Ｄ：Ｓｎｕ−１６細胞を、示されたオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、１２時間後、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦＥで処理した。上のパネル：ｐ２１タンパク質発現。下のパネル：ＦＡＣＳ解析、対応のない（unpaired）ｔ検定を使用する、偽及びｍｉＲＮＡトランスフェクト細胞間のＧｌ／Ｓ分画の比較。
図５Ａ−５Ｄ：ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の過剰発現は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を妨げる。図５Ｄ：Ｓｎｕ−１６細胞を、示されたオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、１２時間後、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦＥで処理した。上のパネル：ｐ２１タンパク質発現。下のパネル：ＦＡＣＳ解析、対応のない（unpaired）ｔ検定を使用する、偽及びｍｉＲＮＡトランスフェクト細胞間のＧｌ／Ｓ分画の比較。
[00088]図６Ａ−６Ｆ：内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３発現の抑制は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を増強する。図６Ａ：ＡＳＯトランスフェクションにより内因性ｍｉＲＮＡを抑制後、ＴＧＦＥで処理されたＳｎｕ−１６細胞における細胞周期の分析。ｐ値は、ＡＳＯトランスフェクト細胞と偽トランスフェクト細胞中のＧｌ分画を比較して計算した（対応のないt検定）。
図６Ａ−６Ｆ：内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３発現の抑制は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を増強する。（図６Ｂ）０．１〜５．０ｎｇ／ｍｌの範囲の、ＴＧＦＰの段階的用量で処理されたＳｎｕ−１６の用量応答曲線。ＦＡＣＳ解析により決定されるように、ＡＳＯトランスフェクションによる内因性ｍｉＲ−１０６ｂ又はｍｉＲ−９３の抑制は、さもなくば抵抗性であるＴＧＦＰ用量である（０．１〜０．３ｎｇ／ｍｌ）に対してＳｎｕ−１６細胞の感受性を回復する。＊はＰ＜０．０００１を示す。
図６Ａ−６Ｆ：内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３発現の抑制は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を増強する。それぞれウエスタンブロット及びｑＲＴ−ＰＣＲによる、ｐ２１タンパク質（図６Ｃ）及び（図６Ｄ）ｐ２１ｍＲＮＡ発現の分析。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の抑制により誘発されるｐ２１タンパク質上方調節の程度は、ＴＧＦＰの存在により非常に増強され、おそらくｐ２１ ｍＲＮＡの増加した転写により支えられている。
図６Ａ−６Ｆ：内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３発現の抑制は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を増強する。それぞれウエスタンブロット及びｑＲＴ−ＰＣＲによる、ｐ２１タンパク質（図６Ｃ）及び（図６Ｄ）ｐ２１ｍＲＮＡ発現の分析。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の抑制により誘発されるｐ２１タンパク質上方調節の程度は、ＴＧＦＰの存在により非常に増強され、おそらくｐ２１ ｍＲＮＡの増加した転写により支えられている。
図６Ａ−６Ｆ：内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３発現の抑制は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を増強する。（図６Ｅ）Ｓｎｕ−１６細胞を、ｐ２１に対するｓｉＲＮＡ単独、又はｍｉＲ−１０６ｂあるいはｍｉＲ−９３模倣体と組み合わせてトランスフェクトし、そして１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦＰで１６時間処理した。ｐ２１サイレンシング後、ｍｉＲ−１０６ｂは細胞周期に対するその効果のすべてを失ったが、ｍｉＲ−９３は残余効果を未だに維持していた。ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３間のこの異なった応答は、統計的に有意であった（Ｐ＝０．０２７２）。
図６Ａ−６Ｆ：内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３発現の抑制は、ＴＧＦＥ−依存性Ｇｌ／Ｓ細胞周期停止を増強する。（図６Ｆ）ＴＧＦＰ刺激によるＧｌ／Ｓチェックポイントに関与する種々のタンパク質のウエスタンブロットによる発現の分析。
[00089]図７Ａ−７Ｇ：ｍｉＲ−２５は、ｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクトされたＳｎｕ−１６細胞のＴＧＦＰ誘発アポトーシスの発生を妨げることにおいて（ＣＣＫ−８生存率アッセイ）、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協力する。
図７Ａ−７Ｇ：ｍｉＲ−２５は、ｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクトされたＳｎｕ−１６細胞のＴＧＦＰ誘発アポトーシスの発生を妨げることにおいて（ＣＣＫ−８生存率アッセイ）、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協力する。＊は、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５及び／又はｍｉＲ−１０６ｂ−２５でのトランスフェクション、続いての１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦＰで４８時間の処理による、生存細胞数の有意差を示す（Ｐ＜０．００１）。
図７Ａ−７Ｇ：ｍｉＲ−２５は、ｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクトされたＳｎｕ−１６細胞のＴＧＦＰ誘発アポトーシスの発生を妨げることにおいて（ＣＣＫ−８生存率アッセイ）、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協力する。（図７Ｂ）逆に、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の阻害は、ＴＧＦＰに対する応答を協力的に増大させる：三つのＡＳＯの混合物のトランスフェクションで統計的有意性（Ｐ＜０．００１）に達した。
図７Ａ−７Ｇ：ｍｉＲ−２５は、ｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクトされたＳｎｕ−１６細胞のＴＧＦＰ誘発アポトーシスの発生を妨げることにおいて（ＣＣＫ−８生存率アッセイ）、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協力する。（図７Ｃ）生存率の有意な喪失は、サブディプロイドＤＮＡ含量の分析により確認した。
図７Ａ−７Ｇ：ｍｉＲ−２５は、ｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクトされたＳｎｕ−１６細胞のＴＧＦＰ誘発アポトーシスの発生を妨げることにおいて（ＣＣＫ−８生存率アッセイ）、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協力する。（図７Ｄ）ｍｉＲＮＡ模倣体あるいはＡＳＯでのトランスフェクション後、又は同一のｍｉＲＮＡのレンチウイルス形質導入後４８時間でのＳｎｕ−１６細胞のＢｉｍタンパク質発現。Ｂｉｍ発現に対する同じ効果がＡＧＳ及びＭＫＮ−７４細胞で得られた（データは示していない）。
図７Ａ−７Ｇ：ｍｉＲ−２５は、ｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクトされたＳｎｕ−１６細胞のＴＧＦＰ誘発アポトーシスの発生を妨げることにおいて（ＣＣＫ−８生存率アッセイ）、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協力する。（図７Ｅ）ｐＧＬ３−Ｂｉｍ−３’ＵＴＲ及びｍｉＲ−２５で共トランスフェクトされた細胞において減少したルシフェラーゼ活性を示しているルシフェラーゼアッセイ。ｍｉＲＮＡシード領域と相補的な、ｍｉＲ−２５予測結合部位の最初の３塩基の欠失は、この効果を取り消した（ＭＵＴ）。バーは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性＋／−ＳＤで正規化されたホタルルシフェラーゼ活性を示す。各レポータープラスミドは少なくとも２回トランスフェクトし（異なった日に）、そして各サンプルは３重にアッセイした。
図７Ａ−７Ｇ：ｍｉＲ−２５は、ｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクトされたＳｎｕ−１６細胞のＴＧＦＰ誘発アポトーシスの発生を妨げることにおいて（ＣＣＫ−８生存率アッセイ）、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協力する。（図７Ｆ）ｍｉＲ−２５オリゴヌクレオチドでトランスフェクトしたＳｎｕ−１６細胞におけるＢｉｍ ｍＲＮＡ（二つの主なアイソフォームＢｉｍ ＥＬ及びＢｉｍ Ｌを認識するTaqManプローブ）において相違がないことを示しているｑＲＴ−ＰＣＲ分析。バーはＵ６＋／−ＳＤで正規化されたＲＮＡ発現を示す。
図７Ａ−７Ｇ：ｍｉＲ−２５は、ｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクトされたＳｎｕ−１６細胞のＴＧＦＰ誘発アポトーシスの発生を妨げることにおいて（ＣＣＫ−８生存率アッセイ）、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協力する。（図７Ｇ）ｍｉＲ−２５オリゴヌクレオチド、ｓｉ−Ｂｉｍ、両方又はスクランブルオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、その後１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦＥＯで２４時間処理したＳｎｕ−１６細胞中のサブディプロイドＤＮＡ含量のＦＡＣＳ分析。上記のように統計分析。
[00090]図８：Ｅ２Ｆｌ／ｍｉＲ−１０６ｂ−２５／ｐ２１経路。モデルは．本明細書に記載されたｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の作用機構を要約している。
[00091]図９Ａ−９Ｄ：胃癌におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの発現。図９Ａ：２９３Ｔ／１７細胞は、示されたように、１００ｎＭのｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド(Ambion)でトランスフェクトし、ステムループｑＲＴ−ＰＣＲによりｍｉＲＮＡ発現についてアッセイした。ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５プライマーは高い特異性を示し、一方、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−９２プライマーは、それぞれｍｉＲ−１０６ａ及びｍｉＲ−２５と交差ハイブリダイズした。結果はＵ６で正規化し、同一のスケールに変換した。
図９Ａ−９Ｄ：胃癌におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの発現。１０の胃原発性腫瘍及び１０の非腫瘍対照の組における成熟（図９Ｂ）及び前駆体（図９Ｃ）ｍｉＲＮＡの発現はｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。バーは、同じ患者からの腫瘍及び非腫瘍組織間の相対的変化倍率＋／−ＳＤを示す。各サンプルは３重に分析し、各々ＲＮＵ４９（成熟ｍｉＲＮＡｓ）又はＣＡＰＮ２（前駆体 ｍｉＲＮＡ及びＭｃｍ７）で正規化した：これらの遺伝子は、試験されたこれらのサンプルの１２の異なった標準化物の中で最も少ない生存率（＜０．４Ｃｔ値）を示した。
図９Ａ−９Ｄ：胃癌におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの発現。１０の胃原発性腫瘍及び１０の非腫瘍対照の組における成熟（図９Ｂ）及び前駆体（図９Ｃ）ｍｉＲＮＡの発現はｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。バーは、同じ患者からの腫瘍及び非腫瘍組織間の相対的変化倍率＋／−ＳＤを示す。各サンプルは３重に分析し、各々ＲＮＵ４９（成熟ｍｉＲＮＡｓ）又はＣＡＰＮ２（前駆体 ｍｉＲＮＡ及びＭｃｍ７）で正規化した：これらの遺伝子は、試験されたこれらのサンプルの１２の異なった標準化物の中で最も少ない生存率（＜０．４Ｃｔ値）を示した。
図９Ａ−９Ｄ：胃癌におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの発現。（図９）Ｓｎｕ−１６細胞に、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５又はｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターを運んでいるレンチウイルスベクターを形質導入し、７２時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲにより成熟ｍｉＲＮＡレベルを測定した。バーは、Ｕ６＋／−ＳＤで正規化され、同一のスケールに変換されたＲＮＡ発現を示す。＞９０％の導入効率を蛍光顕微鏡法により確認した。類似の結果がＡＧＳ細胞においても得られた（データは示していない）。
[00092]図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。それぞれｍｉＲＮＡ ＡＳＯ又は模倣体でトランスフェクトしたＳｎｕ−１６（図１０Ａ、図１０Ｃ）及びＡＧＳ（図１０Ｂ、図１０Ｄ）細胞のＦＡＣＳ分析及び増殖曲線。
図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。それぞれｍｉＲＮＡ ＡＳＯ又は模倣体でトランスフェクトしたＳｎｕ−１６（図１０Ａ、図１０Ｃ）及びＡＧＳ（図１０Ｂ、図１０Ｄ）細胞のＦＡＣＳ分析及び増殖曲線。
図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。それぞれｍｉＲＮＡ ＡＳＯ又は模倣体でトランスフェクトしたＳｎｕ−１６（図１０Ａ、図１０Ｃ）及びＡＧＳ（図１０Ｂ、図１０Ｄ）細胞のＦＡＣＳ分析及び増殖曲線。
図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。それぞれｍｉＲＮＡ ＡＳＯ又は模倣体でトランスフェクトしたＳｎｕ−１６（図１０Ａ、図１０Ｃ）及びＡＧＳ（図１０Ｂ、図１０Ｄ）細胞のＦＡＣＳ分析及び増殖曲線。
図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。（図１０Ｅ）ＣＭＶプロモーター制御下のｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５又はｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体を運んでいる蛍光レンチウイルスベクターで安定的に形質導入されたＡＧＳ細胞の増殖曲線。＞９５％の感染効率は、蛍光顕微鏡法により決定した。
図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。（図１０Ｆ）コロニー形成アッセイ：ＡＧＳ細胞を、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５又はｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体又はスクランブル配列をコードするpRetroSuper-Puro構築物でトランスフェクトし、１４日間、２ｕｇ／ｍｌピューロマイシン中で増殖させた。これらすべての条件による効率的ｍｉＲＮＡ発現及びプロセッシングはノーザンブロット及びステムループｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした（データは示していない）。
図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。（図１０Ｆ）コロニー形成アッセイ：ＡＧＳ細胞を、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５又はｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体又はスクランブル配列をコードするpRetroSuper-Puro構築物でトランスフェクトし、１４日間、２ｕｇ／ｍｌピューロマイシン中で増殖させた。これらすべての条件による効率的ｍｉＲＮＡ発現及びプロセッシングはノーザンブロット及びステムループｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした（データは示していない）。
図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。（図１０Ｆ）コロニー形成アッセイ：ＡＧＳ細胞を、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５又はｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体又はスクランブル配列をコードするpRetroSuper-Puro構築物でトランスフェクトし、１４日間、２ｕｇ／ｍｌピューロマイシン中で増殖させた。これらすべての条件による効率的ｍｉＲＮＡ発現及びプロセッシングはノーザンブロット及びステムループｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした（データは示していない）。
図１０Ａ〜ｌ０Ｇ：高い／低いｍｉＲ−１０６ｂ−２５（基本条件）を有する細胞の増殖研究。（図１０Ｇ）ＲＮＡｉによりｐ２１あるいはＥ２Ｆ１が選択的にサイレンシングされているＳｎｕ−１６細胞の増殖曲線及び（Ｈ）ＦＡＣＳ解析。ｐ２１発現の抑制は、細胞周期に影響を及ぼしたが、ｍｉＲ−９３とは区別できなかった。
（図１０Ｇ）ＲＮＡｉによりｐ２１あるいはＥ２Ｆ１が選択的にサイレンシングされているＳｎｕ−１６細胞の増殖曲線及び（Ｈ）ＦＡＣＳ解析。ｐ２１発現の抑制は、細胞周期に影響を及ぼしたが、ｍｉＲ−９３とは区別できなかった。
[00093]図１１：ＴＧＦＥ存在下におけるＭＫＮ−７４細胞生存率アッセイ。ＭＫＮ−７４細胞を、示したＬＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトして内因性ｍｉＲＮＡ発現をサイレンシングし、続いてＴＧＦＥで９６時間処理した。細胞生存率は、ＣＣＫ−８アッセイにより決定した。
[00094]図１２：ｍｉＲ−２５を過剰発現している細胞のアネキシンＶアッセイ。図７Ｇに示した結果は、アネキシンＶ染色により確認した。
[00094]図１２：ｍｉＲ−２５を過剰発現している細胞のアネキシンＶアッセイ。図７Ｇに示した結果は、アネキシンＶ染色により確認した。
[00094]図１２：ｍｉＲ−２５を過剰発現している細胞のアネキシンＶアッセイ。図７Ｇに示した結果は、アネキシンＶ染色により確認した。
[00094]図１２：ｍｉＲ−２５を過剰発現している細胞のアネキシンＶアッセイ。図７Ｇに示した結果は、アネキシンＶ染色により確認した。
[00095]図１３：表１：慢性胃炎対正常胃粘膜において差次的に発現されたｍｉＲＮＡ。
[00096]図１４−表２：胃腺癌対非腫瘍胃粘膜において差次的に発現されたｍｉＲＮＡ。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00097]図１５−表３：ヒト胃癌細胞株におけるマイクロＲＮＡ発現。
[00098]図１６−表４：ｑＲＴ−ＰＣＲによる、対にしたヒト原発性腫瘍対非腫瘍対照におけるマイクロアレイデータの検証。
[00099]図１７：表５：１０対の胃原発性腫瘍及び非腫瘍対照におけるＭｃｍ７ ｍＲＮＡ及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現。
[000100]図１８：表６：同一３’ＵＴＲ上に推定ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５結合部位を有するヒト遺伝子。] 図１０Ａ 図１０Ｂ 図１０Ｃ 図１０Ｄ 図１０Ｅ 図１０Ｆ-１ 図１０Ｆ-２ 図１０Ｆ-３ 図１０Ｇ 図１０Ｈ
[0061] 好ましい態様の詳細な説明
[000101]本開示を通して、種々の刊行物、特許及び公開された特許明細書は引用を特定することにより参照される。これらの刊行物、特許及び公開された特許明細書の開示は、本発明が関与する分野の状態をより完全に記述するために、本開示に引用文献として組み入れられる。]
[0062] [000102]Ｅ２Ｆ１活性及びＴＧＦＥへの抵抗性の調節解除は、胃癌の顕著な特徴である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ヒト悪性腫瘍でしばしば誤調節されている、短鎖非コードＲＮＡである。]
[0063] [000103]ここに我々は、ヒト胃腫瘍のサブセット中の上方調節されたｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターが、その宿主遺伝子Ｍｃｍ７と並行してＥ２Ｆ１により活性化されていることを示す。順に、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３はＥ２Ｆ１発現を調節し、ｍｉＲＮＡ依存性ネガティブフィードバックループを確立している。さらに、これらのｍｉＲＮＡの上方調節は、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）及びＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍ）の発現を妨害している、ＴＧＦＥ腫瘍抑制経路を害する。一緒にすると、これらの結果は、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターが、Ｅ２Ｆ１転写後調節に関与することを示し、胃癌におけるＴＧＦＥ抵抗性の発生に鍵となる役割を果たすことができる。]
[0064] [000104]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡ翻訳を抑制するか、又はその分解を誘発して、全ヒト遺伝子のおよそ３０％の発現を調節することができる、短鎖非コードＲＮＡである。これらの遺伝子は、ヒト悪性腫瘍において異常に発現されており、それらの生物学的重要性をますます明らかなものにしている。胃癌は、毎年、全癌関連死の１２％の原因となっており、この疾患の発症の基礎をなす分子機構のより深い理解に基づいたより良い治療が必要とされている。]
[0065] [000105]ここに、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの過剰発現が、Ｇ１／Ｓチェックポイントを破壊し及びＴＧＦＥ依存性アポトーシスに対する抵抗性を付与する、ＴＧＦＥエフェクターｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１及びＢｉｍのような重要な癌関連遺伝子の調節解除を導くことが示される。]
[0066] [000106]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が胃腫瘍発生に関与できることも示される。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を抑制するか、又はその分解を誘発して、ヒト遺伝子の３０％までの発現を調節すると考えられている、非タンパク質コード遺伝子である(Lewis et al.2005)。細胞分化及び生物体発生における重要な役割(Kloosterman and Plasterk, 2006)のほかにも、ｍｉＲＮＡはヒト癌においてしばしば誤調節されており(Lu et al., 2005; Volinia et al., 2006)、そしてそれらは強力な癌遺伝子かあるいは腫瘍抑制遺伝子として働き得る(Esquela-Kersher et al. 2006)。]
[0067] [000107]ここに、Ｅ２Ｆ１が、Ｍｃｍ７遺伝子に含まれるイントロン性ｍｉＲＮＡのクラスター、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５を調節し、胃原発性腫瘍においてそれらの蓄積を誘発することが示される。逆に、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３はＥ２Ｆ１発現を制御し、Ｅ２Ｆ１自己活性化そして、おそらくアポトーシスを防止することにおいて重要であることができる、ネガティブフィードバックループを確立している。]
[0068] [000108]一方、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５過剰発現が、それぞれＴＧＦＥ依存性細胞周期停止及びアポトーシスの二つの最も重要な下流エフェクター、ｐ２１及びＢｉｍの合成を妨げる、ＴＧＦＥに対する胃癌細胞の減少した応答を引き起こしていることを発見した。]
[0069] [000109]これらのｍｉＲＮＡは、癌細胞におけるＴＧＦＥ抵抗性の発生に寄与しており、胃癌治療の新規の治療標的であると発明者は現在考えている。
[000110]本発明は以下の実施例でさらに説明され、特に記載しない限り、すべての部分及びパーセンテージは重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、例示のためにのみ与えられていることを理解すべきである。上記の議論及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確かめることができ、そしてそれらの精神及び範囲から離れることなく、多様な使用及び条件に適合させるために本発明の多様な変形及び修正を行うことができる。本明細書で言及された、特許及び非特許文献を含む全ての出版物は、本明細書において特別に援用される。]
[0070] [000111]実施例１
[000112]ヒト胃癌におけるｍｉＲＮＡ発現の調節解除
[000113]ほとんどの胃腺癌は、慢性炎症性バックグラウンドとの関連において生じ、しばしば、ヘリコバクターピロリ（ＨＰ）感染に関連する(Uemura et al., 2001)。それにもかかわらず、Ｔｈ１免疫応答が胃の萎縮症及び腸上皮化生のような前癌病変部の発生に決定的であるようであるが、ＨＰ発癌性の原因となる分子機構には不明の点が多い(Houghton et al., 2002; Fox et al., 2000)。]
[0071] [000114]胃腫瘍発生に関与する可能性があるｍｉＲＮＡの探索において、特別注文のｍｉＲＮＡマイクロアレイを使用し、腸型の２０の胃原発性腫瘍（各々が同一患者からの隣接する非腫瘍胃組織と対になっている）及び６の胃癌細胞株の広範囲のｍｉＲＮＡ発現を分析した。炎症及び／又は前癌病変部に関連した特異的変化を同定するため、最初に、慢性胃炎の組織学的兆候を有する非腫瘍組織（ｎ＝１３）と他の正常粘膜（ｎ＝７）を比較した。対応のないマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）により、７のｍｉＲＮＡが慢性炎症と関連しており、癌の素因である(Costinean et al., 2006）及び免疫応答の調節に主な役割を果たす(Rodriguez et al., 2007; Thai et al., 2007) ことが知られているｍｉＲ−１５５が含まれていた（図１Ａ、図１３−表１）。] 図１３ 図１Ａ
[0072] [000115]次に、胃原発性腫瘍及び癌細胞株のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを試験した：対応のあるＳＡＭにより、非腫瘍対照と比較して原発性腫瘍においては総計で１４のｍｉＲＮＡが２倍又はそれ以上の中央値の過剰発現を示した（図１Ｂ、図１４−表２）。これらの内、発現されなかったｍｉＲ−２２３を除き、発現の観点から全ての胃癌細胞株において、１４の内の１３が８０パーセンタイル以上に位置付けられた（図１５−表３）。５つのｍｉＲＮＡのみが癌において下方調節された（図１Ｂ、図１４−表２）。試験されたｍｉＲＮＡの１０の内の９についてはステムループｑＲＴ−ＰＣＲによりマイクロアレイデータを確認した（図１６−表４）。誤調節されたｍｉＲＮＡの内、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２５及びｍｉＲ−１７−５ｐは、それぞれ４．５、４．２、３．７及び３．７の中央値変化倍率を有し、腫瘍中で最も高い過剰発現を示した。] 図１４ 図１６
[0073] [000116]腫瘍発生の最も早期の段階は、ｍｉＲ−２１(Meng et al., 2006)及びｍｉＲ−１７−５ｐ(He et al., 2005)のような既知の発癌特性を有するｍｉＲＮＡを伴うので、これらの結果は、ｍｉＲＮＡ発現パターンの特異的な改変がヒト胃癌に特徴的であることを示している。]
[0074] [000117]ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターは胃癌において過剰発現されている
[000118]過剰発現されたｍｉＲＮＡの中で、ｍｉＲ−２５が、特に有用であり、胃腫瘍発生において役割を果たしている魅力的な候補であることが発見された。実際、これは原発性胃腫瘍において３番目に最も強く上方制御されており（中央値の変化倍率：３．７；１．０〜２６．８の範囲）、そして全てのヒト胃癌細胞株で最も高く発現されたｍｉＲＮＡに位置付けられている（９７パーセンタイル以上）。ｍｉＲ−１０６ｂ（中央値変化倍率：２．０；１．０〜６．５の範囲）及びｍｉＲ−９３（中央値変化倍率：２．３；１．０〜７．７の範囲）も原発性腫瘍において上方制御されており、そして全ての胃癌細胞株において高く発現されている（それぞれ８２及び８９パーセンタイル以上）。]
[0075] [000119]これら３つのｍｉＲＮＡ（以後ｍｉＲ−１０６ｂ−２５）は、染色体７ｑ２２上のＭｃｍ７のイントロン１３にクラスター化しており、Ｍｃｍ７一次ＲＮＡ転写産物との関連で活発に共転写される（Kim et al., 2007、及び図１Ｃ〜Ｅ)。いくつかの研究は、胃腫瘍におけるこの領域の増幅を報告している(Weiss et al., 2004; Peng et al., 2003; Takada et al., 2005)。しかしながら我々は、我々のサンプルにおいて、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５座位の何の増幅も検出できず（データは示していない）、胃癌におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５過剰発現に他の機構が寄与しなければならないことを示唆している。] 図１０Ａ 図１０Ｂ 図１０Ｃ 図１０Ｄ 図１０Ｅ 図１０Ｆ-１ 図１０Ｆ-２ 図１０Ｆ-３ 図１０Ｇ 図１０Ｈ
[0076] [000120]Ｍｃｍ７は、Ｇ１／Ｓ期移行で中心的役割を果たし、染色体ＤＮＡの複製フォークの正しい組み立てを組織化し、そして各細胞周期で二回以上ではなく一回のみ全ゲノムが複製されることを確実にしている(Blow and Hodgson, 2002)。Ｍｃｍ７の過剰発現は、前立腺及び子宮内膜癌における予後不良に関係してきているので(Ren et al., 2006; Li et al., 2005)、我々は、Ｍｃｍ７発癌性を、少なくとも一部は、含まれているｍｉＲＮＡの過剰発現に結び付けることができるということを仮定した。さらに、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターは、ｍｉＲ−１７−９２クラスターと高度に相同性を共有し（図１Ｃ）、そのことは発癌に役割を有しているようである(He et al., 2005;O’Donnell et al., 2005; Dews et al., 2006)。] 図１Ｃ
[0077] [000121]我々は次ぎに、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターを調べた。我々はステムループｑＲＴ−ＰＣＲの特異性を最初に決定した。ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５のためのプライマーは高度に特異的であるが、一方、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−９２プローブは、それぞれｍｉＲ−１０６ａ及びｍｉＲ−２５と交差ハイブリダイズした（図９Ａ）。次ぎに、同一患者からの非腫瘍胃粘膜と対になった１０の胃原発性腫瘍の独立した組における、成熟ｍｉＲＮＡ種の発現をアッセイするために、ステムループｑＲＴ−ＰＣＲを使用した。] 図９Ａ
[0078] [000122]成熟ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５は、それぞれ、これらの腫瘍の６／１０、６／１０及び５／１０において過剰発現されたけれども、それらの発現レベルに相互相関はなかった（図９Ｂ）。] 図９Ｂ
[0079] [000123]慣用的ｑＲＴ−ＰＣＲにより、同一の腫瘍中のｍｉＲＮＡ前駆体レベルを試験し（図９Ｃ）、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５前駆体種が腫瘍中で一致して発現されていることを発見した［ｒ（１０６ｂ／９３）＝０．９３；ｒ（１０６ｂ／２５）＝０．７８；ｒ（９３／２５）＝０．８８、図１７−表５］。] 図１７ 図９Ｃ
[0080] [000124]ｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体を過剰発現している５腫瘍の内、３腫瘍は成熟ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５も高レベルで発現していたが、一方、残りの腫瘍は各成熟ｍｉＲＮＡの不定発現を示し、個々のｍｉＲＮＡを制御している転写後調節の追加のレベルを示している。]
[0081] [000125]Ｍｃｍ７ｍＲＮＡは、５／１０腫瘍においても過剰発現されており、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５前駆体レベルとのほとんど完全な相関（それぞれ、ｒ＝０．９８、０．９２、０．７２、図９Ｃ及び図１７−表５）を示している。] 図１７ 図９Ｃ
[0082] [000126]これらのデータは、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体が、Ｍｃｍ７ｍＲＮＡと並行して胃原発性腫瘍のサブセットにおいて特異的に過剰発現されていることを示す。ｍｉＲ−１０６ｂ−２５独立プロモーターの可能性を排除することができないけれども、我々の結果は、胃腫瘍におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５転写が、宿主遺伝子Ｍｃｍ７により駆動されていることを示している。さらに、最近他のｍｉＲＮＡについて提案されたように（Thomson et al., 2006)、転写後機構も成熟ｍｉＲ−１０６ｂ−２５のレベルの決定に主要な役割を果たしている。]
[0083] [000127]ネガティブフィードバックループはＥ２Ｆ１及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を制御する
[000128]Ｅ２Ｆ１は、Ｍｃｍ７(Suzuki et al., 1998; Arata et al., 2000)を含む染色体ＤＮＡ複製に関与する、多様な遺伝子をトランス活性化する転写因子である(Johnson and DeGregori, 2006)。発明者は現在、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５転写が同様 にＥ２Ｆ１により調節されるであろうと考えている。このことを試験するため、我々は最初に、Ｅ２Ｆ１タンパク質レベルの内因性変動が、Ｍｃｍ７及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現の同様の変化に一致するかどうかを決定した。興味深いことに、１２時間のノコダゾール処理により有糸分裂が停止されているＡＧＳ胃癌細胞は、Ｅ２Ｆ１タンパク質を発現せず、そして対数増殖期細胞と比較して、Ｍｃｍ７転写体（２倍）及び、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５前駆体（それぞれ４．０、５．２及び１２．０倍）の減少を示した。細胞を解放すると、Ｇ１期に再び入り、Ｅ２Ｆ１発現はＭｃｍ７、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５前駆体ＲＮＡ再蓄積と並行していた（図２Ａ〜Ｃ）。] 図１０Ａ 図１０Ｂ 図１０Ｃ 図１０Ｄ 図１０Ｅ 図１０Ｆ-１ 図１０Ｆ-２ 図１０Ｆ-３ 図１０Ｇ 図１０Ｈ
[0084] [000129]このプロセスは、Ｅ２Ｆ１発現と直接的に関連しており、なぜなら、アデノウイルス形質導入によるその特異的過剰発現（図２Ｄ）又はＲＮＡ干渉によるサイレンシング（図２Ｅ）も、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体レベルの一致した変化を誘導するからである。その上、Ｅ２Ｆ１の機能喪失は、７２時間後に成熟ｍｉＲＮＡの発現に影響を与える（図２Ｆ）。] 図２Ｄ 図２Ｅ 図２Ｆ
[0085] [000130]インビボでのデータをさらに検証するため、ウエスタンブロットにより１０の原発性胃腫瘍におけるＥ２Ｆ１タンパク質発現を分析し、Ｅ２Ｆ１タンパク質とＭｃｍ７／ｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体発現間に正の相関を見出した（図２Ｇ）。実際、Ｅ２Ｆ１を過剰発現している５腫瘍の内の４が、Ｍｃｍ７及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体のより高いレベルを示した（図９Ｃ）。これらの内、３腫瘍は成熟ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５も過剰発現した（図９Ｂ）。しかしながら、１腫瘍は、Ｅ２Ｆ１の検出可能なレベルなしに、Ｍｃｍ７及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体上方調節を示し、他の転写因子も、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５の調節に関与することを示している。] 図２Ｇ 図９Ｂ 図９Ｃ
[0086] [000131]これらの結果は、Ｅ２Ｆ１がＭｃｍ７と並行してｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節することを示し、胃癌におけるこれらのｍｉＲＮＡの過剰発現は、少なくとも一部は、Ｅ２Ｆ１上方調節によるものであることを示している。]
[0087] [000132]最近、ｍｉＲ−１７−５ｐが、Ｅ２Ｆ１の新規転写後調節因子として提案された（O’ Donnell et al., 2005）。ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３配列間の類似性を考え、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３がＥ２Ｆ１発現の調節に関与することができる可能性を調べた。なぜなら、これらのｍｉＲＮＡは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析された１２の胃癌細胞株の一団において散在的に発現されており（図３Ａ）、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５に拮抗するための機能の喪失アプローチを採用した。ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３に対するＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクションは、Ｓｎｕ−１６細胞においてＥ２Ｆ１タンパク質の蓄積を誘発し、これらのｍｉＲＮＡの内因性レベルがその発現を制御していることを示している（図３Ｂ）。] 図３Ａ 図３Ｂ
[0088] [000133]また、オリゴヌクレオチドトランスフェクションあるいはレンチウイルス形質導入によるこれらのｍｉＲＮＡの過剰発現（図９Ｄ）は、Ｓｎｕ−１６及びＡＧＳ胃癌細胞株においてＥ２Ｆ１タンパク質レベルを明瞭に減少させ（図３Ｃ及び図３Ｄ）、そしてＥ２Ｆ１ ３’ＵＴＲを含有するレポーターベクターの発現を抑制した。レポーターベクター中の推定ｍｉＲＮＡ結合部位の突然変異はこの効果を取り消し、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３がＥ２Ｆ１ ３’ＵＴＲと直接的に相互作用することを示している（図３Ｅ）。しかしながら、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３トランスフェクションによりＥ２Ｆ１ｍＲＮＡは２倍減少し、恐らく部分的ｍＲＮＡ分解又はＥ２Ｆ１転写活性化因子の下方変調のためであろう（図３Ｆ）。] 図３Ｃ 図３Ｄ 図３Ｅ 図３Ｆ 図９Ｄ
[0089] [000134]ｍｉＲ−１７−５ｐが、実際にＥ２Ｆ１転写を活性化し、ｍｉＲ−１７−５ｐ標的でもあるＡＩＢ−１タンパク質を抑制することにより、Ｅ２Ｆ１発現を二次的に抑制できることが議論されてきた(Hossain et al., 2006)。ｍｉＲＮＡが同一経路内の異なった標的に作用することは非常に道理にあっているが、我々はＡＧＳ及びＳｎｕ−１６細胞におけるＡＩＢ−１タンパク質レベルを分析し、ｍｉＲ−１０６ｂあるいはｍｉＲ−９３でトランスフェクトした細胞中では、それぞれ、非常にわずかな減少か、又は少しも相違しておらず、ＡＩＢ−１はｍｉＲ−１０６ｂの真に低親和性標的であり、部分的にのみＥ２Ｆ１下方制御に寄与することができることを示している（図３Ｃ）。] 図３Ｃ
[0090] [000135]これらの結果を一緒にすると、Ｅ２Ｆ１はｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節するが、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の標的でもあり、胃癌細胞におけるネガティブフィードバックループを確立していることを示す。Ｅ２Ｆ１は、ポジティブフィードバックループを介してそれ自身のプロモーターを自己活性化することが知られており、これらのｍｉＲＮＡは、相同体ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａについて最近提案されたように(Sylvestre et al., 2007; Woodset al., 2007)、Ｅ２Ｆ１タンパク質合成の速度を調節することができ、その過剰な蓄積を防止している。]
[0091] [000136]ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３はＴＧＦＥ誘発細胞周期停止を害する
[000137]これらの結果は、細胞が有糸分裂を示し、そしてＧ１期に再び入ると、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５転写が迅速に誘導されることを示している。これに基づいて、理想的にはＥ２Ｆ１と協同して、Ｇ０／Ｇ１関連活性を抑制することにおけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５の可能な役割が仮定された。それ故、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎデータベースを調べ、Ｅ２Ｆ１により負に制御されることが知られている遺伝子を探し、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の推定標的としてＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）を同定した。ヒト癌において高頻度に機能不全に陥るこの遺伝子は、細胞周期の鍵となる阻害因子である（Mattioli et al, 2007）。興味深いことに、Ｓｎｕ−１６細胞において内因的に発現されたｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３が、ｐ２１を転写後に調節することが確認された。実際、ＡＳＯによるそれらの阻害は、ｐ２１タンパク質の発現を増強した（図４Ａ）。逆に、オリゴヌクレオチドトランスフェクション（図４Ｂ）あるいはレンチウイルス形質導入（図４Ｃ）により達成されたｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の上方調節は、ｐ２１ｍＲＮＡレベルの有意な変化なしに、ｐ２１タンパク質発現を抑制した（図４Ｄ）。さらに、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３模倣体は、ｐ２１ ３’ＵＴＲを含有するレポーターベクターの発現を阻害したが、一方、推定ｍｉＲＮＡ結合部位の突然変異はこの効果を抑止した（図４Ｅ）。] 図４Ａ 図４Ｂ 図４Ｃ 図４Ｄ 図４Ｅ
[0092] [000138]細胞周期の調節におけるｐ２１の重要性を考慮し、胃癌細胞の増殖を調節することにおけるｍｉＲ１０６ｂ−２５の役割を追求することが決定された。予期せぬことに、ＡＳＯトランスフェクションにより誘発されたｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及び／又はｍｉＲ−２５機能の喪失は、Ｓｎｕ−１６細胞の細胞周期及び増殖に有意な変化をもたらさなかった（図１０Ａ及び図１０Ｃ）。同様に、オリゴヌクレオチドトランスフェクションあるいはレンチウイルス形質導入による三つのｍｉＲＮＡの過剰発現は、ＡＧＳ細胞の増殖速度及びコロニー形成効率を有意に改変しなかったが、ｍｉＲ−９３過剰発現による限定されているがしかし再現性のある細胞周期摂動が注目された（Ｓ期の細胞が＋８％、図１０Ｂ、１０Ｄ及び１０Ｅ）。] 図１０Ａ 図１０Ｂ 図１０Ｃ
[0093] [000139]ＧＴＬ−１６及びＭＫＮ−７４胃癌細胞株を使用して類似の結果が得られており（データは示していない）、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５機能が、インビトロでの胃癌細胞の生存及び増殖に必須ではないことを示している。しかしながら、ＲＮＡｉによるｐ２１あるいはＥ２Ｆ１の特異的サイレンシングは、同様に増殖には有意な変化を生み出さず（図１０Ｇ及び１０Ｈ）、これらの癌細胞株はｐ２１基礎レベルに応答せず、そしてＥ２Ｆ１発現の喪失をうまく埋め合わせることが確認される。] 図１０Ｇ
[0094] [000140]次ぎに、ＴＧＦＯ存在下でのｍｉＲ−１０６ｂ−２５の役割を追求した：このサイトカインはｐ２１及び他の抗増殖性分子の発現を誘導することにより、時宜を得た協調的な細胞周期停止及び消化管における成熟細胞のアポトーシスを確かにし、上皮細胞の生理学的回転を制御している(van den Brink and Offerhaus, 2007)。この極めて重要な腫瘍抑制経路の機能障害は、胃癌の顕著な特徴である(Ju et al., 2003; Park et al., 1994)。しかしながら、数少ない胃癌細胞株の中でも、Ｓｎｕ−１６細胞はそれでもインビトロで比較的高用量のＴＧＦＯに応答して、Ｇ１／Ｓ停止及び続けての広範なアポトーシスを起こしている（Ohgushi et al., 2005 及び図５Ａ）。それにもかかわらず、細胞の生存は２４時間後に減少しており、このことはＴＧＦＯに付随する早期の分子変化を研究するための窓を開けている。] 図５Ａ
[0095] [000141]興味深いことに、ＴＧＦＯによる刺激は、細胞が生理学的にＧ１／Ｓ停止を起こしている１６時間後に、Ｅ２Ｆ１タンパク質、Ｍｃｍ７ｍＲＮＡ及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体の著しい下方調節を誘発し、これらのｍｉＲＮＡの下方変調が、ＴＧＦＯに対する生理学的応答の一部であることを示唆している（図５Ｂ及び５Ｃ）。このプロセスの重要性を確立するため、ＴＧＦＯ存在下、Ｓｎｕ−１６細胞にｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及び／又はｍｉＲ−２５模倣体を導入することにより、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５下方調節に対抗させた。とりわけ、ｍｉＲ−９３の過剰発現はＴＧＦＯ誘発細胞周期停止を完全に抑止し、一方、ｍｉＲ−１０６ｂはそれを部分的に減少させ（Ｐ＜０．０００２）、これらのｍｉＲＮＡにより誘発されたｐ２１の下方調節の程度と一致する（図５Ｄ）。] 図５Ｂ
[0096] [000142]逆に、ＡＳＯにより内因性ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の発現を拮抗させると、ＴＧＦＯ依存性細胞周期停止を起こしているＳｎｕ−１６細胞の数が有意に増加し（Ｐ＜０．００１３）、さもなければこれらの細胞が抵抗性である、ＴＧＦＯの最適以下での投与量に対する感受性を回復した（Ｐ＜０．０００１）（図６ａ及び６Ｂ）。]
[0097] [000143]従って、ＴＧＦＯ存在下、内因性ｍｉＲ１０６ｂ及びｍｉＲ−９３を抑制することにより達成されたｐ２１上方調節の程度は（図６Ｃ）、基礎的条件の２倍であり（図４Ａ）、おそらく活性なｐ２１ｍＲＮＡの転写により支えられているのであろう（図６Ｄ）。] 図４Ａ 図６Ｃ 図６Ｄ
[0098] [000144]ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の機能の獲得／欠失に関連する表現型を誘導することにおけるｐ２１の役割を確立するため、ＴＧＦＰで処理したＳｎｕ−１６細胞において、ＲＮＡｉ（ｓｉ−ｐ２１）によりｐ２１を特異的にサイレンシングした。このことは、細胞周期分布に対するｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３過剰発現の効果をほぼ完全に再現し（図５Ｄ）、一方、ｓｉ−ｐ２１とｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３のコトランスフェクションは、ＴＧＦＯ誘発細胞周期停止に対するこれらのｍｉＲＮＡの効果を劇的に減少させ、この生物学的状況において、ｐ２１が一次標的であることを示唆している（図６Ｅ）。しかしながら、ｍｉＲ−９３によるＴＧＦＯ依存性細胞周期停止に対する小さいけれども統計学的に有意な効果が、ｐ２１の不存在下でそれでも観察可能であり（Ｐ＝０．０２７２）、他の直接的又は間接的標的がｐ２１と協同していることを暗示している。Ｇ１／Ｓチェックポイントに関与する遺伝子についての発現の分析から、ｐ２７がｍｉＲ−９３の可能な間接的標的である（図６Ｆ）。] 図６Ｅ 図６Ｆ
[0099] [000145]これらのデータは、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３が、転写後レベルでｐ２１の発現を主として抑制してＴＧＦＯ誘発細胞周期停止を妨げていることを示している。しかしながら、ｐ２１非依存性経路も、細胞周期制御に対するｍｉＲ−９３の完全な効果を送達することに関与することができる。]
[0100] [000146]ｍｉＲ−２５は、ＴＧＦＯ誘発アポトーシスの開始を防止することにおいてｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協同する
[000147]これらの結果は、ＴＧＦＰ刺激の初期段階に細胞周期停止を変調することにおけるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の役割を示している。最終的にはアポトーシスをもたらす、ＴＧＦＰへの長期の暴露でのｍｉＲ−１０６ｂ−２５機能を分析した（Ohgushi et al., 2005、及び図５Ｂ）。] 図５Ｂ
[0101] [000148]テトラゾリウム還元アッセイにより、ＴＧＦＰで２４〜４８時間刺激したＳｎｕ−１６細胞の生存率を試験した。これらの細胞へのｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及び／又はｍｉＲ−２５模倣体の導入はＴＧＦＰに対する著しい抵抗性を誘発した（図７Ａ）。逆に、ＡＳＯトランスフェクションは、三つすべてのｍｉＲＮＡが同時に抑制された場合、統計的有意性（Ｐ＝０．００３）に達する細胞数の負の傾向を誘発した（図７Ｂ）。三つのｍｉＲＮＡのサイレンシングでサブディプロイド細胞数の有意な増加を示す（Ｐ＜０．００１）ＦＡＣＳ分析により、この結果が確認された。さらに、このアッセイのより高い感度は、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３又はｍｉＲ−２５の個々の抑制による、サブディプロイド細胞のパーセンテージのより小さいけれども有意な変化（Ｐ＜０．００１）の検出を可能にする（図７Ｃ）。最後に、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５のサイレンシングは、さもなくば抵抗性のＭＫＮ−７４細胞において、ＴＧＦＥへの感受性を部分的に回復した（図１１）。一緒にすると、これらの結果は、内因性ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５が、一つ以上の標的仲介ＴＧＦＥ依存的アポトーシスの発現を変調することにおいて協同するモデルと一致する。] 図１１ 図７Ａ 図７Ｂ 図７Ｃ
[0102] [000149]アポトーシスのエフェクターを探すためにTargetScanデータベースを検索し、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の推定結合部位を同時に含む１８のヒト遺伝子の内、唯一の有力な候補としてＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍ）が同定された（図１８−表６）。Ｂｉｍは、Ｂｏｘ及びＢａｄのようなアポトーシス促進性分子を活性化することにより、及びＢｃｌ２及びＢｉｌｌのような抗アポトーシス分子に拮抗することにより、さまざまな組織においてアポトーシスを決定的に調節する、単ＢＨ３タンパク質である（Gross et al., 1999）。Ｂｉｍ及びそのパートナータンパク質の細胞内濃度の微妙なバランスが、アポトーシスを適切に調節するために極めて重要である。Ｂｉｍはハプロ不全であり、単一アレルの不活性化でさえ、他のアレルの喪失なしに、マウスにおいて腫瘍のＭｙｃ誘発発生を促進する（Egle et al., 2004）。特に、ＢｉｍはＴＧＦＥ経路の最も下流のアポトーシスエフェクターであり、その下方変調はＳｎｕ−１６細胞においてＴＧＦＥ依存性アポトーシスを抑止する（Ohgushi et al., 2005）。] 図１８
[0103] [000150]ＢｉｍがｍｉＲ−１０６ｂ−２５の直接標的であったかどうかを決定した。Ｓｎｕ−１６細胞はＢｉｍの三つの主なアイソフォーム、即ち、Ｂｉｍ ＥＬ、Ｂｉｍ Ｌ及びＢｉｍ Ｓを発現する。興味深いことに、ＡＳＯにより内因性ｍｉＲ−２５に拮抗することは、Ｓｎｕ−１６細胞において三つすべてのアイソフォームの蓄積を誘発し、一方、オリゴヌクレオチドトランスフェクションあるいはレンチウイルス形質導入によるｍｉＲ−２５過剰発現はこれらの発現を減少させた。これに反して、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３は、三つの試験された胃癌細胞株の内の三つにおいて、Ｂｉｍ発現に影響を及ぼさなかった（図７Ｄ）。] 図７Ｄ
[0104] [000151]他の組織でのＢｉｍ発現を調節することにおいて、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３がｍｉＲ−２５と協同することはまだ可能であるが、これは胃癌において、三つのｍｉＲＮＡの各々によりアポトーシスの複数のエフェクターが抑制されているモデルを支持する。]
[0105] [000152]これらのアポトーシスエフェクターの一つとしてＢｉｍに焦点を当て、その３’ＵＴＲ上のｍｉＲ−２５予測結合部位が標的認識、及び引き続いての翻訳の阻害を仲介することを、ルシフェラーゼアッセイにより決定した（図７Ｅ）。さらに、Ｂｉｍ ＥＬびＢｉｍ ＬｍＲＮＡレベルは、Ｓｎｕ−１６細胞においてｍｉＲ−２５過剰発現によっても変化せず、転写後調節機構を示している（図７Ｆ）。] 図７Ｅ 図７Ｆ
[0106] [000153]ｍｉＲ−２５特異的抗アポトーシス機能に関連したＢｉｍ下方制御の重要性を確立するため、三つの主なアイソフォームに対するｓｉＲＮＡを使用してＳｎｕ−１６細胞中のＢｉｍタンパク質を抑制し（ｓｉ−Ｂｉｍ、図７Ｄ）、そして引き続いて、これらの細胞をＴＧＦＥで２４時間処理した。特に、ｓｉ−Ｂｉｍ及びｍｉＲ−２５によりもたらされるアポトーシスからの保護は、サブディプロイドＤＮＡ含量及びアネキシンＶ染色により決定されるように、非常に類似していた。さらに、Ｂｉｍ及びｍｉＲ−２５のコトランスフェクションは、有意な相加効果を有しておらず（Ｐ＝０．６３２８）、Ｂｉｍ下方調節が、ｍｉＲ−２５過剰発現細胞におけるＴＧＦＥ誘発アポトーシスに対する抵抗性の主たる機構であることを示唆している（図７Ｇ及び図１２）。] 図７Ｄ 図７Ｇ
[0107] [000154]Ｅ２Ｆ１により活性化され、そしてヒト胃腺癌において上方制御されているｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターが、細胞周期停止及びアポトーシスの両方に影響するＴＧＦＥに対する胃癌細胞の生理学的応答を変化させることが示された（図８）。] 図８
[0108] [000155］これらの発見は、ＴＧＦＥ腫瘍抑制経路の機能障害が胃腫瘍の発生決定的段階であるという胃癌モデルに特に関係している。
[000156]考察
[000157]胃癌発生の異なった段階において、ｍｉＲＮＡ発現の全ゲノム分析を実行した。胃腫瘍の大部分は慢性炎症性バックグラウンドを起源としており（Uemura et al., 2001）、前腫瘍及び腫瘍特異的変化間を区別する特定の関係性を考察した。]
[0109] [000158]最初に、これまで無視されてきた、ヒト腫瘍中のｍｉＲＮＡクラスターの特異的過剰発現を同定した。我々は胃癌に焦点を合わせたけれども、癌の他のタイプにおけるｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の過剰発現は一般的であるが、いまだ過小評価されているイベントである。]
[0110] [000159]実際、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現は、細胞増殖の基礎的機構に関与するＥ２Ｆ１及びＭｃｍ７の発現に密接に関連している。例えば、Ｍｃｍ７は前立腺癌において高頻度に過剰発現されており(Ren et al., 2006）、実際、癌のこのタイプの大規模ｍｉＲＮＡ研究においてｍｉＲ−２５上方調節が以前に記述されている(Volinia et al., 2006)。さらに、ステムループｑＲＴ−ＰＣＲプローブが、ｍｉＲ−２５と交差ハイブリダイズし、ほとんどのヒト腫瘍において過剰発現されているｍｉＲ−９２の発現のアッセイで普通に使用されることが示されている(Volinia et al., 2006)。しかしながら、ほとんど同一の配列と仮定すると、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５及びｍｉＲ−１７−９２が、類似の（同一でなくとも）機能を発揮することにおいて協同することも非常にありそうであり、実際、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ及びｍｉＲ−２０ａが同様にｐ２１発現を阻害し、一方、ｍｉＲ−９２はＢｉｍ発現を抑制する(F.P. 及び A. V.,未発表データ）。さらに、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５及びｍｉＲ−１７−９２の両方がＥ２Ｆ１により調節されている。けれども、これらのクラスターはいくつかの相違も示す。例えば、ｍｉＲ−１０６ｂはｍｉＲ−１７−５ｐに似ているが、３ヌクレオチド短い：３’末端中の特異的配列がｍｉＲＮＡの細胞内局在性を規定し得ることが報告されている（Hwang et al., 2007）。さらに、ｍｉＲ−１９ファミリーは、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターに示されていない（図２Ａ）。] 図２Ａ
[0111] [000160]一方、ｍｉＲ−９３はｍｉＲ−３７２及びｍｉＲ−３７３と同一のファミリーに属している：これらのｍｉＲＮＡは、精巣性胚細胞腫瘍中で過剰発現され、そこでそれらはＬＡＴＳ２発現を害し、細胞を高ｐ２１レベルに対して非感受性にしている（Voorhoeve et al., 2006）。]
[0112] [000161]本明細書で示したように、ｍｉＲ−９３は同一経路内で作用し、直接的にｐ２１発現を標的としている。それ故、ｍｉＲＮＡのこのファミリーは、細胞周期の制御のための極めて重要なハブの調節に関与していると現在信じられており、そして癌に特定の関連性を有することができる。]
[0113] [000162]さらに、ｍｉＲ−９３はｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４及びｍｉＲ−２９５と高い配列相同性を共有する：これらのｍｉＲＮＡは多能性ＥＳ細胞において特異的に発現され、そしてそれらは分化によりサイレンシングされるか、又は下方調節される（Houbaviy et al., 2003）。理論に縛られるわけではないが、本発明者は、これらのｍｉＲＮＡはｐ２１の調節に同様に関与することができることを本明細書において考えている。]
[0114] [000163]本発明者は、ｍｉＲＮＡが異なった機構を介して、細胞周期の調節に役割を果たしていることを示した。Ｅ２Ｆ１の場合、ｍｉＲＮＡは調節性、重複フィードバックループとの関連において主として作用するように思われる。実際、別々のｍｉＲＮＡクラスター上に位置するｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａは、Ｅ２Ｆ１によって制御され、おそらくその翻訳を阻害することにおいて協同している。]
[0115] [000164]同時に、我々は、これらのｍｉＲＮＡがｐ２１発現の調節及びＴＧＦＥに対する早期応答に関与していることを発見した。本発明者は、これらがｐ２１に収束する他の腫瘍抑制経路をも調節すると考えている。突然変異、欠失、過剰メチル化、ユビキチン化又は誤った局在化によるｐ２１機能の喪失は頻繁なイベントであり、そしてヒト胃癌における負の予後因子である（Mattioli et al., 2007）。しかしながら、ｐ２１調節におけるｍｉＲＮＡの役割は、従来探索されたことがない。研究された胃原発性腫瘍の８０％は検出可能レベルでｐ２１タンパク質を発現しないので、ｍｉＲＮＡ及びｐ２１タンパク質発現間の逆の相関を確立することができなかった。しかしながら、原発性腫瘍におけるｐ２１ｍＲＮＡレベルは、しばしば正常組織に匹敵し、胃癌におけるｐ２１下方調節の高頻度の原因としての翻訳後調節を示している（F.P及びA.V.、未発表データ）。]
[0116] [000165]興味深いことに、ｐ２１発現の誘導は、ＴＧＦＥ刺激の初期段階においてｍｉＲ−１０６ｂ／ｍｉＲ−９３関連応答を惹起するための必要条件であるようである。逆に、ＲＮＡｉによるｐ２１のサイレンシングは、細胞周期に対するこれらのｍｉＲＮＡの効果を劇的に減少させた。コンピューターによる方法により各ｍｉＲＮＡについて数百の異なった標的が予測されるけれども、「一次ｍｉＲＮＡ標的」が特異的生物学的機能に重要であろうという証拠が増加している。例えば、ｍｉＲ−１０ｂは乳癌細胞の細胞運動性及び侵襲性を増強し、このｍｉＲＮＡについて百を超える標的が予測されるけれども、この表現型はその標的ＨＯＸＤ１０の構成的発現で完全に元に戻る（Ma and Weinberg, 2007）。もちろん、これらの観察は、単一のｍｉＲＮＡによる複数の標的の並行した調節が特異的機能を発揮するために必要であるという他の状況を排除するものではない。さらに、複数のｍｉＲＮＡが、同一の機能を発揮することにおいて協同することができる。]
[0117] [000166]これは、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターが胃癌細胞をアポトーシスから保護する事例である。こうした効果は、異なったアポトーシス促進性分子の発現を抑制することにおいて協同する三つのｍｉＲＮＡ間で分配されている。我々は、ｍｉＲ−２５の鍵となる標的として、ＴＧＦＥ経路の最も下流のアポトーシスエフェクター、Ｂｉｍ（Ohgushi et al., 2005）を同定した。これは胃癌モデルと特に関連性を有する。実際、ＴＧＦＥは、胃恒常性維持の主な調節因子の一つであり、アポトーシスを介した上皮細胞の生理学的回転の調節において必須である（van den Brink and Offerhaus, 2007）。ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３アポトーシス促進性標的の同一性は不明瞭なまま残っているが、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及び／又はｍｉＲ−２５過剰発現及び阻害にそれぞれ関連する抗アポトーシス及びアポトーシス促進性応答は明瞭に検出できる；これらの特性は、細胞周期停止が撤回される場合、ＴＧＦＥ刺激の後期段階で出現し、アポトーシスがＴＧＦＥへの胃細胞の応答を特徴付ける優位なプロセスとなる。サブディプロイドＤＮＡ含量の分析により容易に検出できる、単一ｍｉＲＮＡの阻害で観察された小さいがしかし有意な変化は、三つのＡＳＯが一緒に送達された場合に生物学的一貫性を獲得し、これらのクラスター化ｍｉＲＮＡ間の協同的関係を裏付けている。]
[0118] [000167]テトラゾリウム還元アッセイ及びサブディプロイドＤＮＡ含量の分析の両方により、単一ＡＳＯでトランスフェクトしたＴＧＦＥ刺激細胞において反対の傾向が観察されたけれども、テトラゾリウム還元アッセイにおいては統計的有意性には達していなかった。これは、より小さな相違を除外するこのアッセイに付随する５〜１０％の標準誤差のためである。これに反して、サブディプロイドＤＮＡ含量の分析における標準誤差は、我々が行って２％未満であった。]
[0119] [000168]原発性腫瘍におけるＢｉｍ発現を検討した場合、正常組織と比較して普遍的過剰発現が注目された（F.P.and A.V.未発表データ）。このことは、Ｂｉｍが異常増殖を防ぐための自己防御機構として、発癌ストレスにより誘導されることを示している先行研究と一致している。具体的には、ＢｉｍはＭｙｃトランスジェニックマウスにおいて過剰発現され、正常細胞の広範なアポトーシスを決定している。しかしながら、これらのマウスにおける腫瘍の発生は、不十分になる一つのＢｉｍアレルの喪失と一致する。さらに、Ｂｉｍは、発癌ストレスを受けていない健常組織と比較して、腫瘍においては確かに過剰発現されたままである（Egle et al., 2004）。それ故、それ未満ではＢｉｍが不十分にしか生じない閾値を規定するのは難しく、インビボでのｍｉＲ−２５上方調節の重要性を規定するための別の戦略が必要とされている。]
[0120] [000169]転写調節からタンパク質分解まで、癌においてＢｉｍ下方調節を導くいくつかの機構が記述されてきた（Yano et al., 2006; Tan et al., 2005）。これらの機構のすべてが明白にＢｉｍサイレンシングに寄与するが、我々は、胃癌におけるＢｉｍ転写後調節の新規機構としてｍｉＲ−２５干渉を提案する。]
[0121] [000170]ｍｉＲＮＡは単なる微調整分子であるのか、又はそれらは鍵となる遺伝子スイッチとして作用するのかどうかが、広範囲に論争されてきた。最近の研究は、特定の生物学的状況に依存して、両方の仮説がおそらく正しいことを示唆している。この視点から、癌におけるｍｉＲＮＡの療法的可能性は、特定のｍｉＲＮＡ依存性機能変化の発生と厳密に関連していてもよい。腫瘍関連ｍｉＲＮＡの作用機構を知ることは、ｍｉＲＮＡ依存性腫瘍の分子診断を確立することにおいて有用であり、ｍｉＲＮＡに基づいた療法に最終的に応答する患者の合理的選択を可能にする。]
[0122] [000171]実験手順
[000172]細胞培養及び処理：
[000173]全ての細胞株は、ＡＴＣＣから得、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞は１００ｎＭマイクロＲＮＡ前駆体(Ambion)、１００ｎＭ ｓｉ−ｐ２１(Santa Cruz)、１００ｎＭ ｓｉ−Ｂｉｍ（Cell Signaring）又は１００ｎＭ ＬＮＡマイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド(Exiqon)を使用し、リポフェクタミン２０００（Invitrogen)でトランスフェクトした。タンパク質可溶化液及び全ＲＮＡは示した時点に採取した。ｍｉＲＮＡプロセッシング及び発現はノーザンブロット及びステムループｑＲＴ−ＰＣＲにより検証した。すべての細胞株について、BLOCK-IT Fluorescent Oligo（Invitrogen）を使用してトランスフェクション効率（＞９５％）を確認した。]
[0123] [000174]同期化実験のためには、ＡＧＳ細胞を０．０３Ｐｇ／ｍｌノコダゾール含有１０％ＦＢＳＲＰＭＩ１６４０中で１２時間増殖させ、その後新鮮培地に放出する。細胞周期の進行を８時間までＦＡＣＳ分析により追跡し、その後、細胞は迅速に同期を失った。]
[0124] [000175]ＴＧＦＥ実験のため、６ウェルプレート中、５ｕｌリポフェクタミン２０００及び１００ｎＭ ｍｉＲＮＡ前駆体（Ambion）又はＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Exiqon）を使用し、２ｘ１０６Ｓｎｕ−１６細胞をOptimem（ＧＩＢＣＯ）及びＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＢＳ（Sigma）の１：１混合物中でトランスフェクトした。１２時間後、培地を１ｎｇ／ｍｌヒト組み換えＴＧＦＥ１（Sigma）含有ＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＢＳに交換した。生存細胞の数は、製造元の説明書の通りＷＳＴテトラゾリウム塩（CCK-8, Dojindo）を使用してアッセイした。すべての実験は３重に実施した。結果は平均±ＳＤで表されている。]
[0125] [000176]ｑＲＴ−ＰＣＲ：
[000177]成熟ｍｉＲＮＡ及び他のｍＲＮＡは、それぞれ、製造元の説明書（Applied Biosystems, FosterCity, CA）に従った単一チューブTaqman MicroRNA Assays及びGene Expression Assaysを使用してアッセイした。非鋳型対照及びＲＴマイナス対照を含む全てのＲＴ反応は、GeneAmp PCR 9700 Thermocycler（Applied Biosystems）中で実行した。ＲＮＡ濃度はNanoDrop（NanoDrop Technologies, Inc.）で決定した。サンプルは、示されているようにＲＮＵ４９又はＣＡＰＮ２（Applied Biosystems）で正規化した。遺伝子発現レベルは、ABIPrism 7900HTSequence 検出システム（Applied Biosystems）を使用して決定した。比較リアルタイムＰＣＲは３重に実施し、非鋳型対照を含んでいた。相対的発現は比較Ｃｔ法を使用して計算した。]
[0126] [000178]ルシフェラーゼアッセイ
[000179]ＭＫＮ−７４胃癌細胞は、６ウェルプレート中、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を使用し、１ｕｇのｐＧＬ３ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（補足実験手順参照されたい）、０．１ｕｇのｐｈＲＬＳＶ４０対照ベクトル（Promega）及び１００ｎＭマイクロＲＮＡ前駆体（Ambion）で共トランスフェクトした。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性は、トランスフェクション２４時間後、Dual Luciferase Assay（Promega）を使用することにより連続して測定した。各レポータープラスミドで、少なくとも２回トランスフェクトし（異なった日に）、及び各サンプルは３重にアッセイした。]
[0127] [000180]フローサイトメトリー
[000181]細胞周期分析のため、２ｘ１０６細胞を冷メタノール中で固定し、リボヌクレアーゼで処理し、そしてヨウ化プロピジウム（Sigma）で染色した。二重識別ゲートを使用するEPICS-XLスキャン（Beckman Coulter）により、細胞のＤＮＡ含量を分析した。全ての分析は３重に実施し、２０，０００ゲートイベント／サンプルを計数した。アポトーシス分析については、細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（BD Biopharmingen）及びＰＩ(Sigma)と暗所で１５分インキュベートし、１時間以内に分析した。]
[0128] [000182]統計分析
[000183]実験の結果は、平均±ＳＤで表されている。対応のないスチューデンｔ検定を、試験及び対照サンプルの値を比較するために使用した。Ｐ＜０．０５は有意差を示す。]
[0129] [000184]実施例ＩＩ
[000185]組織サンプル：
[000186]原発性胃腫瘍サンプルは、Department of Histopathology（Sant’Andrea Hospital, University of Rome “La Sapienza”, Italy）から得た。全てのサンプルは、患者のインフォームドコンセントを有し、組織学的に確認された。組織採取のためのプロトコルは、Sant’Andrea Hospital Bioethical Committee により承認された。各腫瘍は、同じ患者からの非腫瘍胃粘膜対照と対をなしている。]
[0130] [000187]マイクロアレイ：
[000188]マイクロアレイ分析は、記述されているように（Liu et al., 2004）実行した。簡単には、全ＲＮＡの５ｕｇを、二次発生ｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ（Ｖ２）上でのハイブリダイゼーションに使用した。これらのチップは、接触技術によりスポットされ、ポリマーマトリックスに共有結合で結合された、２５０のヒトｍｉＲＮＡのための遺伝子特異的４０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブを含有する。マイクロアレイは、６ＸＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ＿６０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４＿Ｈ２Ｏ＿８ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、３０％ホルムアミド中、２５℃で１８時間ハイブリダイズさせ、３７℃で４０分、０．７５ＸＴＮＴ（トリス／ＨＣｌ／ＮａＣｌ／トウィーン２０）で洗浄し、ストレプトアビジン−Alexa Fluor 647コンジュゲートによるビオチン含有転写体の直接的検出法を使用することにより処理した。処理したスライドは、６３５ｎｍに設定されたレーザー、固定されたＰＭＴ設定、及び１０ｍｍのスキャン分解能を有するマイクロアレイスキャナーを使用することによりスキャンした。アレイデータはGlobal Median 、重み付き局所回帰（Lowess）又はクオンタイル（Quantile）法を使用して正規化し、類似の結果を得た。本研究で公表されたデータは、クオンタイル正規化により導き出された。ｍｉＲＮＡの発現差異は、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）内のｔ検定法を使用することにより同定した。]
[0131] [000189]ウエスタンブロット：
[000190]免疫ブロットのための抗体は以下の通りであった：Ｅ２Ｆ１（Santa Cruz、マウスモノクローナル、１：５００）、ＡＩＢ−１（Cell Signalling、マウスモノクロナール、１：１０００）、ｐ２１（Cell Signalling、マウスモノクロナール、１：１０００）、ｐ２７（Santa Cruz、マウスモノクロナール、１：５００）、ＣＤＫ２（Cell Signalling、マウスモノクロナール、１：１０００）、ＣＤＫ４（Cell Signalling、マウスモノクロナール、１：１０００）、サイクリンＤ１（Cell Signalling、マウスモノクロナール、１：１０００）、サイクリンＥ（Santa Cruz、ウサギポリクロナール、１：５００）、ｐｌ５（Cell Signalling、ウサギポリクロナール、１：１０００）、Ｂｉｍ（Cell Signalling、ウサギポリクロナール、１：１０００）、ビンキュリン（Santa Cruz、マウスモノクロナール、１：５００）、ＧＡＰＤＨ（Calbiochem、マウスモノクロナール、１：３０００）。バンドはGelDocソフトウェア（Biorad）を使用して定量した。]
[0132] [000191]アデノウイルス及びレンチウイルス感染：
[000192]アデノＥ２Ｆ１は、G. Leoneより親切にも提供され、感染は記述されているように（Leone et al., 1998）実行した。ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２５及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５前駆体ｃＤＮＡは、２９３Ｔ／１７細胞ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、レポーターＧＦＰ及びｍｉＲＮＡの両方を同時に形質導入するように、ＣＭＶプロモーター下、Ｔｗｅｅｎと称される変異体第三世代レンチウイルスベクター、ｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＰＧＫ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ内にクローン化した。レンチウイルス上清調製及び感染は記述されているように（Bonci et al., 2003）実施した。レンチウイルス形質導入は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定されるように、ｍｉＲＮＡ発現に７１０倍の変化を生み出した。導入効率＞９０％は、蛍光顕微鏡法により検証した。]
[0133] [000193]ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｍｉＲＮＡ前駆体）：
[000194]マイクロＲＮＡ前駆体ｑＲＴ−ＰＣＲについては、TRIzol試薬（Invitrogen）で分離した全ＲＮＡは、ｃＤＮＡへの直接的ＤＮａｓｅ処理（Ambion）後、ThermoScriptキット（Invitrogen）を使用する逆転写により処理した。標的配列は、Power Syb-Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を使用するｑＰＣＲにより増幅した。サンプルはＵ６に対して正規化した。プライマー配列は要請があれば入手可能である。]
[0134] [000195]センサープラスミド：
[000196]Ｅ２Ｆ１、ｐ２１及びＢｉｍ３’ＵＴＲ含有推定ｍｉＲＮＡ結合部位は、ゲノムＤＮＡ（２９３Ｔ／１７細胞）からＰＣＲにより増幅し、ホタルルシフェラーゼの終止コドンのすぐ下流のＸｂａ−Ｉ部位を使用することにより、ｐＧＬ３制御ベクター（Promega）内に挿入した。ｍｉＲＮＡシード領域相補領域部位中の最初の３ヌクレオチドの欠失を、製造業者のプロトコルに従い、QuikChange部位特異的突然変異導入キット（Stratagene）を使用して突然変異体構築物に挿入した。プライマー配列は要請があれば入手可能である。]
[0135] [000197]それらの使用及び定義の例
[000198]本発明の実施は、特に示されない限り、当業者が習得している薬理学、化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の方法を用いるであろう。こうした技術は文献に十分に説明されている。例えば、Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)を参照されたい。]
[0136] [000199]そのようであるので、本明細書の定義はさらなる説明のために提供されており、限定と解釈してはならない。
[000200]本明細書で使用される冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語の一つ又は一つより多く（即ち、少なくとも一つ）を指す。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は一つの要素又は一つより多くの要素を意味する。]
[0137] [000201]「マーカー」及び「バイオマーカー」は、遺伝子及び／又はタンパク質又はそれらの機能的変異体であり、正常又は健康な組織又は細胞における発現レベルから変化した、組織又は細胞におけるその発現のレベルは、障害及び／又は疾患状態に関連する。]
[0138] [000202]マーカーの発現の「正常」レベルとは、障害及び／又は疾患状態に罹患していないヒト対象又は患者の細胞におけるマーカーの発現のレベルである。
[000203] マーカーの「過剰発現」又は「有意により高いレベルの発現」とは、発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差よりも大きく、及びある態様では、対照サンプル（例えば、マーカー関連障害及び／又は疾患状態を有していない健康な対象からのサンプル）中のマーカーの発現レベルの少なくとも２倍、他の態様では、３、４、５又は１０倍、及びある態様においては、いくつかの対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルである、試験サンプル中の発現レベルを指す。]
[0139] [000204]マーカーの「有意により低いレベルの発現」とは、対照サンプル（例えば、マーカー関連障害及び／又は疾患状態を有していない健康な対象からのサンプル）中のマーカーの発現レベルの少なくとも２分の１、及びある態様では、３、４、５又は１０分の１、及びある態様においては、いくつかの対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルである、試験サンプル中の発現レベルを指す。]
[0140] [000205]キットは、マーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも一つの試薬、例えば、プローブを含むいずれかの製品（例えば、パッケージ又は容器）である。該キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして、宣伝し、流通させ、又は販売することができる。]
[0141] [000206]「タンパク質」は、マーカータンパク質及びそれらの断片；変異体マーカータンパク質及びそれらの断片；マーカー又は変異体マーカータンパク質の少なくとも１５アミノ酸セグメントを含むペプチド及びポリペプチド；マーカー又は変異体マーカータンパク質、又はマーカー又は変異体マーカータンパク質の少なくとも１５アミノ酸セグメントを含む融合タンパク質を包含する。]
[0142] [000207] 本明細書に記載された組成物、キット及び方法は中でも以下の非制限的使用を有する：
１）対象が、障害及び／又は疾患状態を患っているかどうかを評価すること；
２）対象の障害及び／又は疾患状態のステージを評価すること；
３）対象の障害及び／又は疾患状態のグレードを評価すること；
４）対象の障害及び／又は疾患状態の性質を評価すること；
５）対象が障害及び／又は疾患状態を発生する可能性を評価すること；
６）対象の障害及び／又は疾患状態に関連する細胞の組織学的タイプを評価すること；
７）対象の障害及び／又は疾患状態を治療するために有用である抗体、抗体断片又は抗体誘導体を作製すること；
８）対象の細胞における障害及び／又は疾患状態の存在を評価すること；
９）対象の障害及び／又は疾患状態を抑制するための一つ以上の試験化合物の有効性を評価すること；
１０）対象の障害及び／又は疾患状態を抑制するための療法の有効性を評価すること；
１１）対象の障害及び／又は疾患状態の進行をモニターすること；
１２）対象の障害及び／又は疾患状態を抑制するための組成物又は療法を選択すること；
１３）障害及び／又は疾患状態を患った対象を治療すること；
１４）対象の障害及び／又は疾患状態を抑制すること；
１５）試験化合物が有害である可能性を評価すること；及び
１６）障害及び／又は疾患状態の発症のリスクを有する対象においてそれらを予防すること。]
[0143] [000208]スクリーニング法
[000209]動物モデルを作り出すことができ、対象の障害及び／又は疾患状態を治療する又は予防するために有用な療法剤のスクリーニングを可能にするであろう。従って、本方法は対象の障害及び／又は疾患状態を治療する又は予防するための療法剤を同定するために有用である。本方法は、本明細書に記載された方法により作製された動物モデルに候補剤を投与し、候補剤が投与されていない対照動物モデルと比較し、該動物モデルにおける少なくとも一つの応答を評価すること含む。もし、少なくとも一つの応答が症状を軽減し又は発症が遅延したならば、該候補剤は該疾患を治療する又は予防する剤である。]
[0144] [000210]該候補剤は、当該技術分野ですでに公知である薬理的剤であってもよく、又は何らかの薬理学的活性を有する以前には知られていなかった剤でもよい。該剤は、天然に生じたものでも又は実験室で設計されたものでもよい。それらは、微生物、動物又は植物から単離されたものでもよく、又は組換え的に産生された、又は適した化学合成法により合成されてもよい。それらは、小分子、核酸、タンパク質、ペプチド又はペプチド模倣物であることができる。ある態様において、候補剤は、５０以上及び約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基も含む。候補剤は、限定されるわけではないが：ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はそれらの組み合わせを含む生体分子の中でも発見されている。]
[0145] [000211]候補剤は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範囲の起源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、広範囲の有機化合物及び生体分子の無作為及び方向付けられた合成に、多数の手段が利用可能である。もしくは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、又は容易に産生される。加えて、天然に又は合成的に産生されたライブラリー及び化合物群は、慣用的な化学的、物理的及び生化学的手段を介して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを産生するために使用することができる。ある態様において、該候補剤は、非制限例として：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相又は液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法によるものを含む、コンビナトリアルライブラリー法分野における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることが可能である。]
[0146] [000212]さらなるある態様において、ある種の薬理学的剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような方向付けられた又は無作為の化学修飾にかけることができ、構造類似体が生成される。]
[0147] [000213]対象の障害及び／又は疾患状態を治療するための療法剤を同定するためと同じ方法を、インビトロ研究から生じたリード化合物／剤を検証するためにも使用し得る。
[000214]該候補剤は、対象の一つ以上の障害及び／又は疾患状態応答経路を上方又は下方調節する剤であることができる。ある態様において、該候補剤は、こうした経路に影響するアンタゴニストであることができる。]
[0148] [000215]障害及び／又は疾患状態を治療するための方法
[000216]本明細書において障害及び／又は疾患状態応答を治療する、抑制する、寛解する又は逆行させるための方法が提供される。本明細書に記載された方法において、シグナル伝達カスケードを妨害する剤が、限定されるわけではないが、こうした合併症がまだ明白ではない、及びすでに少なくとも一つのこうした応答を有する対象のような、それを必要とする個体に投与される。]
[0149] [000217]前の例において、こうした治療は、こうした応答の発生を予防するため及び／又はそれらが生じる程度を軽減するために有用である。後の例において、こうした治療は、こうした応答の発生の程度を軽減する、それらのさらなる発生を予防する、又は該応答を逆行させるために有用である。]
[0150] [000218]ある態様において、該応答カスケードを妨害する剤は、こうした応答に特異的な抗体であることができる。
[000219]バイオマーカー（単数又は複数）の発現
[000220]マーカーの発現は、多くの方法で抑制することが可能であり、非制限例として、マーカー（単数又は複数）の転写、翻訳又は両方を抑制するため、疾患細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し得ることを含む。もしくは、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片をコードし、適切なプロモーター／調節因子領域と機能可能なように連結されたポリヌクレオチドを、該タンパク質の機能又は活性を抑制するであろう細胞内抗体を発生させるために細胞に提供し得る。マーカーの発現及び／又は機能は、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片で該疾患細胞を治療することによっても抑制することができる。本明細書に記載された方法を使用し、多様な分子（特に、細胞膜を通過可能な十分に小さい分子を含む）を、マーカーの発現を抑制する又はマーカータンパク質の機能を抑制する分子を同定するためにスクリーニングすることが可能である。そうのように同定された化合物を、対象の疾患細胞を抑制するために該対象に提供し得る。]
[0151] [000221]いずれのマーカー又はマーカーの組み合わせ、ならびに該マーカーと組み合わされたいずれのマーカーも、本明細書に記載された組成物、キット及び方法で使用することができる。一般に、疾患細胞中のマーカーの発現のレベル及び正常結腸系細胞中の同じマーカーの発現のレベル間の相違が可能な限り大きなマーカーを使用するのが望ましい。この相違はマーカーの発現を評価するための方法の検出限界ほど小さくすることができるけれども、相違は少なくとも評価法の標準誤差よりも大きく、及びある態様において、正常組織中の同一マーカーの発現のレベルよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、１００、５００、１０００倍またはそれ以上の相違が望ましい。]
[0152] [000222]ある種のマーカータンパク質が細胞を取り巻く細胞外空間に分泌されることが認められている。こうしたマーカータンパク質は、組織バイオプシサンプルよりもヒト対象からより容易に集めることができる体液サンプル中で検出することができるので、これらのマーカーが、組成物、キット及び方法のある態様において使用された。加えて、マーカータンパク質の検出のためのインビボ技術には、該タンパク質に対して方向付けられた標識抗体を対象内へ導入することが含まれる。例えば、該抗体を放射性マーカーで標識することができ、対象中でのその存在及び位置を標準イメージング技術により検出し得る。]
[0153] [000223]どの特定のタンパク質が分泌されたタンパク質であるかを決定するため、マーカータンパク質が、例えば、ヒト細胞株のような哺乳類細胞中で発現され、細胞外液を集め、細胞外液中のタンパク質の存在又は不存在を評価する（例えば、該タンパク質に特異的に結合する標識抗体を使用する）。]
[0154] [000224]こうした細胞を含んでいる対象のサンプルを、本明細書に記載された方法において使用できることが理解されるであろう。これらの態様において、該マーカーの発現のレベルは、サンプル中の量（例えば、絶対量又は濃度）を評価することにより評価し得る。該細胞サンプルは、もちろん、サンプル中のマーカー量を評価することに先立って、多様な採取後調製及び保存技術（例えば、核酸及び／又はタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離など）にかけることができる。]
[0155] [000225]該マーカーは、細胞から、例えば、呼吸器系、消化器系、血流及び／又は間質腔内へ排出することもできることも理解されるであろう。該排出マーカーは、例えば、痰、ＢＡＬ、血清、血漿、尿、便などを試験することにより試験し得る。]
[0156] [000226]本組成物、キット及び方法は、発現する細胞の表面上に提示された少なくとも一つの部分を有する、マーカータンパク質の発現を検出するために使用し得る。例えば、全細胞上のこうしたタンパク質を検出するために免疫学的方法を使用することができ、少なくとも一つの細胞外ドメインの存在を予測するために、コンピューター支援配列分析法を使用することができる（即ち、分泌されたタンパク質及び少なくとも一つの細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方を含む）。細胞の表面上に提示されている少なくとも一つのタンパク質を有するマーカータンパク質の発現は、細胞を溶解する必要なく検出することができる（例えば、該タンパク質の細胞表面ドメインに特異的に結合する標識抗体を使用して）。]
[0157] [000227]マーカーの発現は、転写された核酸又はタンパク質の発現を検出するための多種多様な方法のいずれかにより評価することができる。こうした方法の非制限例には、分泌された、細胞表面、細胞質又は核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能又は活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法及び核酸増幅法が含まれる。]
[0158] [000228]特定の態様において、マーカーの発現は、その正常翻訳後修飾を全て又は一部を受けたマーカータンパク質を含むマーカータンパク質又はそれらの断片と特異的に結合する、抗体（例えば、放射標識された、発色団標識された、フルオロフォア標識された又は酵素標識された抗体）、抗体誘導体（例えば、基質又はタンパク質リガンド対のタンパク質又はリガンドとコンジュゲートされた抗体）又は抗体断片（例えば、一本鎖抗体、単離された抗体高頻度可変ドメインなど）を使用して評価される。]
[0159] [000229]別の特定の態様において、マーカーの発現は、対象サンプル中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（即ち、転写されたポリヌクレオチド）を調製することにより、及びｍＲＮＡ／ｃＤＮＡとマーカー核酸又はそれらの断片と相補的である参照ポリヌクレオチドをハイブリダイズすることにより評価される。ｃＤＮＡは、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに先立って、多様なポリメラーゼ連鎖反応法のいずれかを使用して増幅されていてもよい；好ましくは、増幅されない。一つ以上のマーカーの発現も同様に、定量的ＰＣＲを使用して検出することが可能であり、マーカー（単数又は複数）の発現のレベルが評価される。もしくは、マーカーの突然変異又は変異体（一塩基多型性、欠失など）を検出する任意の多くの方法を対象におけるマーカーの出現を検出するために使用することができる。]
[0160] [000230]関連する態様において、サンプルから得られた転写されたポリヌクレオチドの混合物を、マーカー核酸の少なくとも一部（例えば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００、又はそれ以上のヌクレオチド残基）と相補的又は相同的ポリヌクレオチドが固定された支持体と接触させる。もし、相補的又は相同的ポリヌクレオチドが支持体上で別個に検出可能ならば（例えば、異なる発色団又はフルオロフォアを使用して、又は異なって選択された位置に固定されて検出可能）、複数のマーカーの発現のレベルを、単一支持体（例えば、選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ）を使用して同時に評価し得る。一つの核酸と別の核酸のハイブリダイゼーションを含んだマーカー発現の評価方法が使用された場合、ハイブリダイゼーションはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で実施されることが望ましい。]
[0161] [000231]ある態様において、バイオマーカーアッセイは、質量分析法又は表面プラズモン共鳴法を使用して実施される。多様な態様において、対象の障害及び／又は疾患状態に対して活性な剤を同定する方法は：
ａ）一つ以上のマーカー又はそれらの誘導体を含んでいる細胞のサンプルを提供すること；
ｂ）こうした細胞から抽出物を調製すること；
ｃ）該抽出物と、マーカー結合を含有する標識核酸プローブを混合すること；及び
ｄ）試験剤の存在又は不存在下でマーカー及び核酸プローブ間の複合体の形成を決定すること；
の一つ以上を含み得る。決定工程は、前記抽出物／核酸プローブ混合物を電気泳動移動度シフトアッセイにかけることを含み得る。]
[0162] [000232]ある態様において、該決定工程は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光に基づいたアッセイ及び超高スループットアッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）又は蛍光相関分光法（ＦＣＳ）アッセイから選択されるアッセイを含む。こうした態様において、ＳＰＲは金属誘電性表面での小さな屈折率変化に敏感であるので、ＳＰＲセンサーは生体分子相互作用の直接リアルタイム観察に有用である。ＳＰＲは、およそ２００ｎｍのＳＰＲセンサー／サンプルインターフェース内の１０５〜１０−６屈折率（ＲＩ）単位の変化に感受性である表面技術である。従って、ＳＰＲ分光法は、センシング層上に堆積された薄い有機フィルムの成長のモニタリングのために有用である。]
[0163] [000233]本組成物、キット及び方法は、一つ以上のマーカーの発現レベルの相違の検出に依存しているので、マーカーの発現のレベルは、少なくとも一つの正常細胞及び結腸癌におかされた細胞中での発現を評価するために使用される方法の最小検出限界よりも有意に大きいことが望まれる。]
[0164] [000234]一つ以上のマーカーを使用する追加の対象サンプルのルーチンスクリーニングにより、ある種のマーカーが、対象の特定の障害及び／又は疾患状態を含む、多様なタイプの細胞中で過剰発現されていることに気付くであろうことが理解される。]
[0165] [000235]加えて、非常に多くの対象サンプルがマーカーの発現について評価され、及びサンプルが得られた個々の対象の結果が関連付けられるので、ある種のマーカーの変化した発現が対象の障害及び／又は疾患状態と強く関連付けられること、及び他のマーカーの変化した発現が他の疾患と強く関連付けられることも確認されるであろう。本組成物、キット、及び方法はそれ故、対象の障害及び／又は疾患状態のステージ、グレード、組織学的型、及び性質の一つ以上を特徴付けるために有用である。]
[0166] [000236]本組成物、キット、及び方法が、対象の障害及び／又は疾患状態のステージ、グレード、組織学的型、及び性質の一つ以上を特徴付けるために使用される場合、マーカー又はマーカーのパネルは、対応するステージ、グレード、組織学的型、又は性質の障害及び／又は疾患状態を患っている少なくとも約２０％、及びある態様においては、少なくとも約４０％、６０％又は８０％、及び実質的にすべての対象において陽性結果が得られるように選択される。本発明のマーカー又はマーカーのパネルは、一般集団については約１０％より大きな陽性予測値が得られるように選択される（非制限例において、８０％より大きなアッセイ特異性と組み合わされる）。]
[0167] [000237]複数のマーカーが本組成物、キット及び方法で使用される場合、対象サンプル中の各マーカーの発現レベルは、単一反応混合物（即ち、各マーカーについて異なった蛍光プローブのような試薬を使用して）か、あるいは一つ以上のマーカーに対応する個々の反応混合物中で、同一タイプの非障害及び／又は非疾患サンプル中の複数のマーカーの各々の発現の正常レベルと比較し得る。一つの態様において、対応する正常レベルと比べ、サンプルにおける複数のマーカーの一つより多くの発現の有意に増加したレベルは、該対象が障害及び／又は疾患状態を患らっていることの指標である。複数のマーカーが使用される場合、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、２０、３０又は５０又はそれ以上の個々のマーカーを使用し得る；ある態様において、より少ないマーカーの使用が望ましいであろう。]
[0168] [000238]本組成物、キット及び方法の感度を最大にするため（即ち、対象サンプル中の系起源の細胞に起因する妨害による）、本明細書で使用されるマーカーは、限定された組織分布を有する、例えば、非系組織では通常発現されないマーカーであることが望ましい。]
[0169] [000239]本組成物、キット及び方法は、対象において障害及び／又は疾患状態を発症する増強されたリスクを有する対象及びその医学的アドバイザーに対して特に役に立つであろうことが認められる。障害及び／又は疾患を発症する増強されたリスクを有すると認められる対象には、例えば、こうした障害又は疾患の家族歴を持つ対象が含まれる。]
[0170] [000240]正常ヒト系組織中のマーカーの発現レベルは、多様な方法で評価し得る。一つの態様において、この発現の正常レベルは、正常と思われる系細胞の一部におけるマーカーの発現のレベルを評価することにより、及びこの発現の正常レベルを、異常であると疑われている系細胞の一部における発現のレベルと比較することにより評価される。もしくは、及び特に、さらなる情報が本明細書に記載されたルーチン検査の結果として入手可能であるので、該マーカーの正常発現についての集団平均値を使用することができる。他の態様において、マーカーの発現の「正常」レベルは、非罹患対象から得られた対象サンプル、対象に障害及び／又は疾患状態の発症が疑われる以前の患者サンプル、保存された対象サンプルなどのマーカーの発現を評価することにより決定することができる。]
[0171] [000241]本明細書において、サンプル（例えば、保存された組織サンプル又は対象から得られたサンプル）中の障害及び／又は疾患状態細胞の存在を評価するための組成物、キット及び方法も提供される。これらの組成物、キット及び方法は、上記のものと実質的に同一であるが、但し必要な場合、該組成物、キット及び方法は、対象サンプル以外のサンプルでの使用に適用される。例えば、使用されるべきサンプルがパラフィン処理された保存ヒト組織サンプルである場合、該サンプル中でのマーカー発現のレベルを評価するため、組成物中、キット中、又は方法において化合物の比を調節する必要があろう。]
[0172] [000242]キット及び試薬
[000243]該キットは、疾患細胞（例えば、対象サンプルのようなサンプル中の）の存在を評価するために有用である。該キットは、複数の試薬を含み、その各々は、マーカー核酸又はタンパク質と特異的に結合することが可能である。マーカータンパク質との結合に適した試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体断片などが含まれる。マーカー核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）との結合に適した試薬には、相補的核酸が含まれる。例えば、該核酸試薬は、支持体に固定化されたオリゴヌクレオチド（標識又は非標識）、支持体と結合されていない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマーの対、分子指標プローブなどを含むことができる。]
[0173] [000244]該キットは、本明細書に記載の方法を実行するために有用な追加の成分を場合により含んでいてもよい。例としては、該キットは、相補的核酸のアニーリングのため、抗体とそれが特異的に結合するタンパク質との結合のために適した液体（例えば、ＳＳＣ緩衝液）、一つ以上のサンプル区画、該方法の実施を記述している使用説明書、正常結腸システム細胞のサンプル、結腸癌関連疾患細胞のサンプルなどを含むことができる。]
[0174] [000245]抗体を産生する方法
[000246]対象が障害及び／又は疾患状態を患らっているかどうかを評価するために有用な抗体を産生する、単離されたハイブリドーマを作製する方法も本明細書において提供される。この方法において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが合成され又は単離される（例えば、それが発現される細胞からの精製により、又はインビボ又はインビトロでの、該タンパク質ペプチドをコードする核酸の転写及び翻訳により）。脊椎動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ又はヒツジのような哺乳類を、該タンパク質又はペプチドを使用して免疫化する。該脊椎動物が該タンパク質又はペプチドに対して強い免疫応答を示すように、少なくとも追加の一回、場合により（及び好ましくは）免疫化してもよい。免疫化された脊椎動物の脾臓細胞を単離し、多様な方法のいずれかを使用して、不死化細胞株と融合させてハイブリドーマを形成させる。このようにして形成されたハイブリドーマは、標準法を使用してスクリーニングし、該マーカータンパク質又はそれらの断片と特異的に結合する抗体を産生する、一つ以上のハイブリドーマを同定する。この方法により作製されたハイブリドーマ、及びこうしたハイブリドーマを使用して作製された抗体も本明細書で提供される。]
[0175] [000247]有効性評価の方法
[000248]疾患細胞を抑制するための試験化合物の効力を評価する方法も本明細書において提供される。上記のように、該マーカーの発現のレベルの相違は、対象細胞の異常状態と相関する。ある種のマーカーの、発現のレベルの変化はこうした細胞の異常状態により生じたようであるが、他のマーカーの、発現のレベルにおける変化が、これらの細胞の異常状態を誘導し、維持し及び促進することも同様に認められている。それ故、対象の障害及び／又は疾患状態を抑制する化合物は、一つ以上の該マーカーの発現のレベルを、そのマーカー発現の正常レベルにより近いレベル（即ち、正常細胞におけるマーカの発現レベル）への変化を起こすであろう。]
[0176] [000249]この方法は従って、試験化合物の存在下で維持された第一の細胞サンプルにおけるマーカーの発現、及び試験化合物の不存在下で維持された第二の結腸細胞サンプルにおけるマーカーの発現を比較することを含む。試験化合物の存在下におけるマーカーの有意に減少した発現は、試験化合物が関連疾患を抑制することの指標である。該細胞サンプルは例えば、対象から得られた正常細胞の単一サンプルの一部、対象から得られた正常細胞のプールされたサンプル、正常細胞株の細胞、対象から得られた関連疾患細胞の単一サンプルの一部、対象から得られた関連疾患細胞のプールされたサンプル、関連疾患細胞株の細胞などであることができる。]
[0177] [000250]一つの態様において、該サンプルは対象から得られた癌関連疾患細胞であり、多様な癌関連疾患を抑制することについて有効であると信じられている複数の化合物を、対象の癌関連疾患を最もよく抑制するであろう化合物を同定するために試験した。]
[0178] [000251]この方法は同様に、対象の関連疾患を抑制するための療法の効力を評価するために使用することができる。この方法において、対（一方は療法を受けさせ、他方は療法を受けさせなかった）のサンプル中の一つ以上のマーカーの発現のレベルを評価した。試験化合物の効力を評価する方法として、もし該療法がマーカーの発現の有意に低いレベルを誘導すれば、該療法は癌関連疾患を抑制について有効である。上記のように、選択された対象からのサンプルがこの方法で使用されるなら、該対象の癌関連疾患を抑制するために最も有効であるらしい療法を選択するため、代替療法をインビトロで評価することが可能である。]
[0179] [000252]上記のように、ヒト細胞の異常状態は、該マーカーの発現のレベルの変化と相関する。試験化合物が有害な可能性を評価する方法も提供される。この方法は、試験化合物の存在下又は不存在下で、ヒト細胞の分離した一定分量を維持することを含む。各一定分量中のマーカーの発現が比較される。試験化合物の存在下で維持された一定分量におけるマーカー発現の有意に高いレベル（試験化合物の不存在下で維持された一定分量と比べて）は、試験化合物が有害である可能性を有する指標である。多様な試験化合物の相対的有害可能性は、発現のレベルが増強された又は抑制されたマーカーの数を比較することにより、関連マーカーの発現レベルの増強又は抑制の程度を比較することにより、又は両方を比較することにより、評価し得る。多様な側面が、以下の副節により詳細に説明されている。]
[0180] [000253]単離されたタンパク質及び抗体
[000254]一つの側面は、単離されたマーカータンパク質及びそれらの生物学的に活性な部分、ならびに、マーカータンパク質又はそれらの断片に対して方向付けられた抗体を上昇させるための免疫原として使用するのに適したポリペプチド断片に関する。一つの態様において、天然のマーカータンパク質は、標準タンパク質精製技術を使用する、適切な精製スキームにより、細胞又は組織源から単離し得る。別の態様において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが、組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現の代わりに、こうしたタンパク質又はペプチドは、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。]
[0181] [000255]「単離された」又は「精製された」タンパク質又はそれらの生物学的に活性な部分とは、タンパク質が由来する細胞又は組織源からの細胞材料又は他の夾雑タンパク質を含んでいないか、又は化学的に合成された場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含んでいない。用語「実質的に細胞材料を含んでいない」には、該タンパク質が単離された又は組換え的に産生された細胞の細胞性成分から分離されたタンパク質の調製物が含まれる。従って、実質的に細胞材料を含んでいないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量による）未満の異種タンパク質（本明細書において夾雑タンパク質とも称される）を有するタンパク質の調製試料が含まれる。]
[0182] [000256]タンパク質又はそれらの生物学的に活性な部分が組換え的に産生される場合、培養培地を実質的に含んでいないのも好ましい、即ち、培養培地は、タンパク質調製試料の約２０％、１０％、又は５％未満の量に相当する。タンパク質が化学合成により生成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含んでいないのが好ましく、即ち、それは、該タンパク質の合成に関与した化学的前駆体又は他の化学物質から分離されている。従って、こうしたタンパク質の調製試料は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の、化学的前駆体又は目的のポリペプチド以外の化合物しか含んでいない。]

权利要求:

請求項1
対象が胃関連障害を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する、胃癌及び／又は関連障害を有する対象の予後を決定する、及び／又はこうした障害を有する対象を治療する方法であって、ここで、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該バイオマーカーのレベルの変化は、該対象が該障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す、前記方法。
請求項2
該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも低い、請求項１に記載の方法。
請求項3
該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い、請求項１に記載の方法。
請求項4
差次的に発現される該少なくとも一つのバイオマーカーが、図１３−表１に列挙された群より選択される、請求項１に記載の方法。
請求項5
該障害が慢性胃炎を含み、そして少なくとも一つのバイオマーカーが、上方調節されているｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１５５から成る群より選択される、請求項４に記載の方法。
請求項6
該障害が慢性胃炎を含み、そして少なくとも一つのバイオマーカーが下方調節されているｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−２６ｂから成る群より選択される、請求項４に記載の方法。
請求項7
差次的に発現される該少なくとも一つのバイオマーカーが、図１４−表２に列挙された群より選択される、請求項１に記載の方法。
請求項8
該障害が胃腺癌を含み、そして少なくとも一つのバイオマーカーが、上方調節されているｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１７−５−ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３２０及びｍｉＲ−９９ｂから成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
請求項9
該障害が胃腺癌を含み、そして少なくとも一つのバイオマーカーが、下方調節されているｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３３９及びｍｉＲ−１３０ｂから成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
請求項10
差次的に発現される該少なくとも一つのバイオマーカーが、図１６−表３に列挙された群：ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ及びｍｉＲ−１０６ａより選択される、請求項１に記載の方法。
請求項11
該少なくとも一つのバイオマーカーがｍｉＲ−１６０ｂ−２５クラスター：ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５を含む、請求項１に記載の方法。
請求項12
図１８−表６に列挙された遺伝子：ＰＨＬＰＰＬ、ＧＭ６３２、ＡＬＸ４、ＰＬＥＫＨＭｌ、ＪＯＳＤ１、ＺＦＰＭ２、ＧＡＴＡＤ２Ｂ、ＺＮＦ２３８、ＡＴＸＮ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＫＬＦ１２、ＵＢＥ２Ｗ、ＯＳＢＰＬ５、ＳＮＦ１ＬＫ、ＰＣＡＦ、ＰＡＰＯＬＡ、及びＣＦＬ２の一つ以上の発現の変調における、ｍｉＲ−１６０ｂ−２５クラスター：ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５を含む少なくとも一つのバイオマーカーの使用。
請求項13
Ｅ２Ｆ１発現を、それを必要とする対象において、調節するための方法であって、Ｅ２Ｆ１の発現を変調するのに十分な、ｍｉＲ−１０６ｂ及び／又はｍｉＲ−９３又はそれらの機能的変異体の有効量を投与することを含む、前記方法。
請求項14
Ｅ２Ｆ１発現を、それを必要とする対象において調節するための、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の使用。
請求項15
ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１）及び／又はＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍ）の発現を妨害するＴＧＦＥ腫瘍抑制経路を変調する方法であって、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上を上方調節することを含む、前記方法。
請求項16
胃癌でのＥ２Ｆ１転写後調節及びＴＧＦＥ抵抗性の発生の変調におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの使用。
請求項17
Ｅ２Ｆ１発現を、それを必要とする対象において制御する方法であって、該対象においてｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３のレベルを変調することを含む、前記方法。
請求項18
Ｍｃｍ７と並行してｍｉＲ−１０６ｂ−２５発現を調節するための、それを必要とする対象におけるＥ２Ｆ１の使用。
請求項19
Ｅ２Ｆ１タンパク質合成の速度を制御し、それを必要とする対象において、その過剰な蓄積を防止する方法であって、該対象におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターのレベルを変調することを含む、前記方法。
請求項20
ＴＧＦＥ誘発細胞周期停止を害するための、それを必要とする対象におけるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の使用。
請求項21
転写後レベルでｐ２１の発現を阻害することにより、ＴＧＦＯ誘発細胞周期停止を妨害するための、それを必要とする対象におけるｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３の使用。
請求項22
ＴＧＦＯ誘発アポトーシスの開始を防げることにおける、それを必要とする対象でのｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−９３と協同したｍｉＲ−２５の使用。
請求項23
アポトーシスからの胃癌細胞の保護を妨げるため、それを必要とする対象においてｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの発現を変調するための方法。
請求項24
胃癌において特有のマイクロＲＮＡ発現シグネチャーであって、腫瘍マイクロＲＮＡプロセッシングを調節する一つ以上のバイオマーカーの発現の変化を含む、前記シグネチャー。
請求項25
胃癌における標的ｍＲＮＡの転写産物量及び／又はタンパク質発現に影響を及ぼす方法であって、それを必要とする対象において一つ以上のマイクロＲＮＡを調節解除することを含む、前記方法。
請求項26
癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制することを含む、前記請求項に記載の方法。
請求項27
癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害するため、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上の発現を変化させることを含む、前記請求項に記載の方法。
請求項28
ヒト胃癌で生じるマイクロＲＮＡ機能の変化を同定するための、マイクロＲＮＡ及びタンパク質コードＲＮＡ両方の大規模遺伝子発現プロファイリングの使用。
請求項29
胃癌を有する対象の予後を決定することを含む請求項１に記載の方法であって、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで：ｉ）該バイオマーカーが、こうした癌の予後不良に関連し；そしてｉｉ）対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの変化が、予後不良を示す、前記方法。
請求項30
対象が胃癌を有するか、又は発症するリスクがあるかどうかを診断することを含む請求項１に記載の方法であって、１）対象から得られた試験サンプルからのＲＮＡを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供し；２）該標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；及び３）該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルと対照サンプルから生成されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することを含み、ここで少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化が、該対象がこうした癌を有するか、又は発症するリスクがあることを示す、前記方法。
請求項31
該少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルが、対照サンプルから発生されたシグナルと比較して下方調節されており、及び／又は該少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルが、対照サンプルから発生されたシグナルと比較して上方調節されている、前記請求項に記載の方法。
請求項32
表１３、表１４及び表１６に列挙された群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーのシグナルの変化が、該対象が予後不良のこうした癌を有するか、又は発症するリスクがあることを示す、前記請求項に記載の方法。
請求項33
ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上を含む、胃障害又は疾患のバイオマーカー。
請求項34
胃癌細胞中で、タンパク質発現を調節するための方法であって、胃癌細胞中のｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上の発現を変調することを含む、前記方法。
請求項35
胃癌細胞中のＥ２Ｆ１、ＣＤＫＮｌＡ（ｐ２１Ｗａｆ１Ｃｉｐ１）及びＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍ）の一つ以上の発現を変調するための組成物であって、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む、前記組成物。
請求項36
Ｅ２Ｆ１及びｐ２１／ＷＡＦｌタンパク質レベルの一つ以上を、それを必要とする対象において調節する方法であって、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５又はそれらの機能的変異体の一つ以上を使用することを含む、前記方法。
請求項37
胃癌細胞におけるｐ２１／ＷＡＦｌ及び／又はＥ２Ｆ１タンパク質レベルを、それを必要とする対象において増加させるために有用なアンチセンスｍｉＲ−１０６ｂを含む組成物。
請求項38
胃癌を有する対象の胃癌を治療する方法であって、対照細胞と比較して、少なくとも一つのバイオマーカーが該対象の癌細胞では下方調節又は上方調節されており：１）該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが下方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー、又は単離された変異体又はそれらの生物学的に活性な断片の有効量を該対象に投与すること；又は２）該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが上方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
請求項39
対象の胃癌を治療する方法であって：１）対照細胞と比較して、胃癌細胞中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を決定すること；そして２）ｉ）もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも少ないならば、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーの有効量を該対象に投与することにより；又はｉｉ）もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも多いならば、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより、胃癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量を変化させること；を含む、前記方法。
請求項40
胃癌を治療するための医薬組成物であって、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー及び薬学的に許容できる担体を含む、前記医薬組成物。
請求項41
該少なくとも一つの単離されたバイオマーカーが、対照細胞と比較して胃癌細胞中で下方調節されているバイオマーカーに対応する、前記請求項に記載の医薬組成物。
請求項42
少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害化合物及び薬学的に許容できる担体を含む、前記請求項に記載の医薬組成物。
請求項43
抗胃癌剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を与えること、そして胃癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの増加は、該試験剤が抗胃癌剤であることを示す、前記方法。
請求項44
抗胃癌剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を与えること、そして胃癌細胞中の増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、対照細胞と比較して、該細胞中のバイオマーカーのレベルの減少は、該試験剤が抗胃癌剤であることを示す、前記方法。
請求項45
胃癌関連疾患を予防する、診断する及び／又は治療するための療法の有効性を評価する方法であって：ｉ）その有効性が評価されている療法を動物に供すること；そしてｉｉ）表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを評価することにより、該疾患を治療する又は予防することにおいて試験されている治療の有効性のレベルを決定することを含む、前記方法。
請求項46
該候補療法剤が、医薬組成物、栄養補助食品組成物及びホメオパシー組成物の一つ以上を含む、前記請求項に記載の方法。
請求項47
評価されている療法が、ヒト対象での使用のためである、前記請求項に記載の方法。
請求項48
製品であって、表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、胃癌関連疾患のためのマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む、前記製品。
請求項49
胃癌関連疾患を治療する療法剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのバイオマーカーを発現している細胞を含む、前記キット。
請求項50
該バイオマーカーの存在が、少なくとも一つのバイオマーカーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される、前記請求項に記載のキット。
請求項51
個体における該疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、胃癌関連疾患応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用であって、該剤が、表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記使用。
請求項52
胃癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定することを、それを必要とする個体で行う方法であって、少なくとも胃癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含み、該剤は、表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記方法。
請求項53
個体における胃癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、少なくとも胃癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤の使用であって、該剤は、表１３、１４及び１６の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記使用。
請求項54
ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上のアンチセンス阻害剤を含む組成物。
請求項55
胃障害を、それを必要とする対象において治療する方法であって、前記請求項の組成物の療法的有効量を対象に投与することを含む、前記方法。
請求項56
該組成物が予防的に投与される、前記請求項に記載の方法。
請求項57
該組成物の投与が、胃癌の一つ以上の症状の発症を遅延させる、前記請求項に記載の方法。
請求項58
該組成物の投与が、胃癌の発生を抑制する、前記請求項に記載の方法。
請求項59
該組成物の投与が、腫瘍の増殖を抑制する、前記請求項に記載の方法。
請求項60
生物学的サンプル中の胃癌の存在を検出する方法であって：ｉ）胃癌を含有すると疑われる生物学的サンプルを、それらのためのマーカーに暴露すること；そしてｉｉ）もしあれば、該サンプル中の該マーカーの存在又は不存在を検出すること；を含む、前記方法。
請求項61
該マーカーが検出可能な標識を含む、前記請求項に記載の方法。
請求項62
該対象からの生物学的サンプル中の該マーカーの量と、正常対象からの対応する生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較することをさらに含む、前記請求項に記載の方法。
請求項63
異なる時点で対象から複数の生物学的サンプルを集めること、及び各生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較して、時間とともに該対象において該マーカーの量が増加している又は減少しているかどうかを決定することをさらに含む、前記請求項に記載の方法。
請求項64
対象の胃癌を治療するための方法であって、胃癌レセプターアゴニストを含む、前記方法。
請求項65
該レセプターアゴニストが、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−２５の一つ以上のアンチセンス阻害剤である、前記請求項に記載の方法。
請求項66
胃癌の治療のための薬剤を製造するための、表１３、１４及び１６に示したｍｉＲ、それらから派生する配列、こうしたｍｉＲの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択される核酸分子を含む使用。
請求項67
該薬剤が、表１３、１４及び１６に列挙されたｍｉＲ、こうしたｍｉＲから派生する配列、こうしたｍｉＲの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択された配列を提示する核酸分子を含む、前記請求項に記載の使用。
請求項68
胃癌細胞の分化を誘発するために有効な療法剤又は療法剤の組み合わせを同定するためのインビトロの方法であって、ｉ）胃腫瘍に由来する細胞を培養すること、ｉｉ）該細胞株の培養培地に少なくとも一つの化合物を添加すること、ｉｉｉ）段階（ｉ）及び（ｉｉ）間の少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルの進展を分析すること、及びｉｖ）段階（ｉ）及び（ｉｉ）間のｍｉＲの発現レベルの変化を誘発する化合物又は化合物の組み合わせを同定する；段階を含む、インビトロ法。
請求項69
段階（ｉｉｉ）が、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルの分析を含む、前記請求項に記載の方法。
請求項70
段階（ｉｖ）が、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルを変調する化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む、前記請求項に記載の方法。
請求項71
段階（ｉｖ）が、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルを減少させる化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む、前記請求項に記載の方法。
請求項72
該化合物が、癌の治療のための療法剤である、前記請求項に記載の方法。