骨密度を増加させるための医薬組成物の製造

专利摘要:
本発明は、治療すべき対象においてＣＡＲＴ（コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物）由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的にもたらすことにより骨密度を増加させるための医薬組成物の製造のための、ヒトＣＡＲＴの生物活性を有するＣＡＲＴ由来ペプチドの使用に関する。適切には、徐放製剤からの長期にわたる該ＣＡＲＴ由来ペプチドの徐放により、該ＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的にもたらす。
公开号:JP2011515363A
申请号:JP2011500199
申请日:2009-03-17
公开日:2011-05-19
发明作者:ヘリツツ，ヨハネス・ペトルス・レオナルドス；ホツセン，ヤン・アルベルト
申请人:ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン；
IPC主号:A61K38-00

专利说明:

[0001] 本発明は、骨密度（ＢＭＤ）を増加させるための医薬組成物の製造に関する。]
背景技術

[0002] 骨密度の減少は例えば骨粗鬆症において生じる。骨粗鬆症は、確立され十分に定義づけされた疾患であり、欧州、日本および米国において７５００万人以上を冒しており、欧州および米国だけでも毎年２３０万人以上の骨折を引き起こしている。]
[0003] 低い骨密度および骨組織の微小構造の劣化は骨脆弱性の増加を招く。骨密度の減少は加齢と共に生じ、骨折率は年齢と共に著しく増加して、有意な罹患率および相当な死亡率を招く。]
[0004] 骨粗鬆症は骨折を引き起こすだけでなく、高齢者において命を脅かしうる二次的合併症のために人を寝たきりにする。骨粗鬆症は背部痛および身長の短縮をも引き起こすため、該疾患およびそれに伴う骨折の予防は高齢者における健康、生活の質および自立性を維持するために不可欠である。]
[0005] 骨粗鬆症は、女性において、男性の３倍多く見られる。これは１つには、女性が、より低い最大骨量を有するからであり、また、１つには、閉経時に生じるホルモン変化によるものである。エストロゲンは成人期の骨量の維持における重要な機能を有し、通常は５０歳前後で、レベルが低下するにつれて骨減少が生じる。また、女性は男性より長生きであり、したがって、骨量における、より大きな減少を示す。]
[0006] 骨粗鬆症自体は特異的症状を有さない。その主な帰結は骨折のリスクの増大である。骨粗鬆症性骨折は、健常者が通常は骨折しない状況で生じる骨折である。典型的な脆弱性骨折は脊柱、臀部および腰部において生じる。また、加齢に伴う落下のリスクの増大も骨折を招きうる。]
[0007] 種々の薬物、例えば、乳癌の治療において使用されるものは骨減少を引き起こすことが公知である。骨密度は、無活動、例えば、就床安静によっても減少しうる。これらの場合の骨減少は、しばしば、可逆的である。]
[0008] 骨密度を増加させるための新規療法、特に、骨粗鬆症および可逆的骨減少（例えば、薬物使用または無活動により生じるもの）の治療における使用のための骨密度を増加させるための新規療法を提供することが、本発明の目的である。]
[0009] コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物（ＣＡＲＴ）は、中枢（視床下部、下垂体）、末梢および腸神経系において発現されるペプチド／神経伝達物質である。また、ＣＡＲＴは膵臓（内分泌細胞）、胃腸管（Ｇ細胞）および卵巣においても発現される。ＣＡＲＴは、摂食、薬物報酬（ｄｒｕｇ ｒｅｗａｒｄ）、ストレスおよび心血管機能に関与していると考えられている。]
[0010] ＣＡＲＴは更に、骨吸収において或る役割を果たしていることが、Ｅｌｅｆｔｅｒｉｏｕら（Ｎａｔｕｒｅ ４３４：５１４−５２０（２００５））に記載されている。彼らは、レプチンを欠くマウス（（ｏｂ／ｏｂ）マウス）またはその受容体を欠くマウス（（ｄｂ／ｄｂ）マウス）を分析する際にＣＡＲＴを特定した。これらの突然変異マウスは、表現型異常、例えば、肥満および不妊であること、ならびに低い交感神経緊張および高い骨量を有することにより特徴づけられた。ＣＡＲＴは主として視床下部で発現されるが、発現は、下垂体、膵臓および副腎においても観察されている。視床下部ニューロンにおける発現はレプチン注射により増強され、ｏｂ／ｏｂマウスにおいては存在しない。ＣＡＲＴノックアウトマウスは明白な表現型異常を有さないが、主として、低い骨量により特徴づけられる（〜５０％減少したＢＶ／ＴＶ（骨体積／組織体積））。]
[0011] ＣＡＲＴ発現はＭｃ４Ｒ−／−マウスにおいても分析されている。Ｄｅｏｋ Ａｈｎら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７（７）：３１９６−３２０２（２００６））は、Ｍｃｒ４の対立遺伝子を欠くヒトまたはマウスが、骨吸収パラメーターにおける減少、高い骨量ならびにＣＡＲＴ血清レベルおよび／または視床下部発現における増加を示すことを開示した。また、ＣＡＲＴシグナリングが骨吸収の減少を引き起こすことが記載されている。]
先行技術

[0012] Ｅｌｅｆｔｅｒｉｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ ４３４：５１４−５２０（２００５）
Ｄｅｏｋ Ａｈｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７（７）：３１９６−３２０２（２００６）]
[0013] 発明の概括
本発明につながった研究において、驚くべきことに、徐放系を用いるｒＣＡＲＴ５５−１０２ペプチドでのマウスの処理がＢＭＤおよび他の関連骨パラメーターの確固たる増加をもたらすことが見出された。ラットおよびマウスのようなげっ歯類は骨粗鬆症に関する十分に受け入れられている動物モデルであり、したがって、それらにおいて得られた結果はヒトの場合の推測に用いられうる。]
[0014] 前記文献における研究は全て、ＣＡＲＴの視床下部ＣＡＲＴ発現における内因性増加に関するものである。本発明において、血清における外因性ＣＡＲＴの末梢性増加が骨密度の増加をもたらすことが示された。これは前記文献からは予想できなかったであろう。]
[0015] したがって、本発明は、骨量疾患の治療または予防および骨折修復のために骨密度を増加させるための医薬組成物の製造のための、ヒトＣＡＲＴ（コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物）の生物活性を有するＣＡＲＴ由来ペプチドの使用であって、該治療が、治療すべき対象において該ＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的にもたらすことを含む、使用に関する。]
[0016] 詳細な説明
本発明は、治療すべき対象においてＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的に誘導することにより骨密度および／または骨量を増加させるための医薬組成物の製造のための、ＣＡＲＴ由来ペプチドの使用を提供する。]
[0017] ＣＡＲＴは、哺乳動物における摂食行動および体重調節の潜在的メディエーターとして大いに注目されている神経ペプチドである。ヒトＣＡＲＴ遺伝子は、肥満に関する感受性遺伝子座であることが既に示されている遺伝子座である染色体５ｇ１３−１４に位置づけられている。]
[0018] ＣＡＲＴは種の間で進化的に非常に良く保存されており（ラットとヒトとの間で９５％のアミノ酸同一性）、該ペプチドのアミノ末端領域においては１００％の同一性を有する。この領域は全ての生物活性ＣＡＲＴペプチドに存在し、あらゆる種において厳密に保存されている６個のシステイン残基を含有する。ジスルフィド結合の破壊は生物活性の喪失をもたらす。]
[0019] ラットの完全長プレプロＣＡＲＴは１２９アミノ酸よりなる。完全長ヒトＣＡＲＴは１１６アミノ酸を含む。シグナルペプチド（残基１−２７）の非存在下では、ラットプロＣＡＲＴは１０２残基（長形態）または８９残基（短形態）を有する。現在までに、以下のような多数の生物活性ＣＡＲＴペプチドが記載されている：げっ歯類におけるＣＡＲＴ５５−１０２およびＣＡＲＴ６２−１０２ならびにヒトにおけるＣＡＲＴ４２−８９およびＣＡＲＴ４９−８９。]
[0020] ＣＡＲＴ前駆体の最も広範に研究されている産物はｒＣＡＲＴ５５−１０２であり、これは一般にＣＡＲＴと称される。ｒＣＡＲＴ５５−１０２の生物活性は、例えば運動活性、摂食および不安プレパルス（ｐｒｅ−ｐｕｌｓｅ）抑制を含む種々の生物学的モデルに関して記載されている。より短い形態も生物活性を保有することが示されているが、詳細には記載されていない。図１には、ヒト、マウスおよびラットのタンパク質配列アライメントならびにＣＡＲＴの構造が示されている。] 図１
[0021] 本発明の実施形態においては、コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物（ＣＡＲＴ）由来ペプチドは完全長コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物（ＣＡＲＴ）自体、特に、それぞれ１２９および１１６アミノ酸のラット、マウスまたはヒト形態である。完全長ＣＡＲＴは、組換え的に（Ｔｈｉｍ Ｌ．ら，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ ４２８：２６３−２６８（１９９８）；Ｃｏｕｃｅｒｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３２：１８５−１９３（２００３））、またはペプチド合成（Ｃｏｕｃｅｒｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３２：１８５−１９３（２００３）；Ｄｏｄｓｏｎら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，１６ｔｈ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｊｕｎｅ ２６−Ｊｕｌｙ １，１９９９，Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９９，１３６−１３７（２０００））により得られうる。]
[0022] 本出願においては、ＣＡＲＴなる語は、特に示さない限り、広義に用いられる。すなわち、それは、完全長ＣＡＲＴ、およびその変異体、例えば断片、類似体、誘導体または修飾体を含む。変異体は、例えば、１以上のアミノ酸が１以上の他のアミノ酸により置換されている又は１以上のアミノ酸が修飾されている若しくは欠失しているＣＡＲＴ由来ペプチドまたはタンパク質である。変異ＣＡＲＴの生物活性を変化させないと考えられる適当なアミノ酸置換は、例えば、Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３に記載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換または進化において頻繁に生じている置換としては、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌが挙げられる。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感度なタンパク質比較のための及び相同ポリペプチド間の機能的類似性を決定するための方法を開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７，１４３５−１４４１，１９８５）。]
[0023] あるいは、ＣＡＲＴ由来ペプチドは、完全長ヒトＣＡＲＴの、またはヒトＣＡＲＴの生物活性を有するラットもしくはマウスＣＡＲＴの断片、類似体または誘導体である。断片、類似体または誘導体がヒトＣＡＲＴの生物活性を尚も保有するかどうかを決定するために、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）の刺激に対する該断片、類似体または誘導体の効果を下垂体由来細胞系ＡｔＴ２０もしくはＧＨ３において（Ｌａｋａｔｏｓら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８４：１９８−２０２（２００５））、またはウシ顆粒膜細胞（Ｓｅｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２２（１２）：２６５５−２６７６（２００８））において試験することが可能である。]
[0024] ヒトＣＡＲＴの生物活性を尚も有するためには、ＣＡＲＴ由来ペプチドでの処理は少なくとも、ＣＡＲＴ由来ペプチドの非存在下のビヒクルと比較して、それらの３つの細胞系のそれぞれにおいて、１０μＭの濃度においてＰ−ＥＲＫ１／２の１．２倍の増加、好ましくは、１．５倍の増加、より好ましくは、０．１μＭの濃度においてＰ−ＥＲＫ１／２活性の２倍の増加を招くべきである。]
[0025] あるいは、ＣＡＲＴ由来ペプチドの生物活性は、実施例３およびＳｅｎら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４８（９）：４４００−４４１０（２００７））に記載されているとおり、ウシ顆粒膜細胞においてＦＳＨ誘導性１７β−エストラジオール（Ｅ２）産生を抑制するその能力に関して試験されうる。ＣＡＲＴ由来ペプチドでの処理は少なくとも、１μＭのＣＡＲＴ由来ペプチドの濃度においてＦＳＨ誘導性１７β−エストラジオール産生の１．２倍の減少、好ましくは１．５倍の減少、より好ましくは２倍の減少、より一層好ましくは３倍の減少を招くべきである。最も好ましくは、ＣＡＲＴ由来ペプチドでの処理は、ビヒクルと比較して、１ｎＭの濃度においてＥ２産生における１．５倍の減少を招く。]
[0026] 本発明のＣＡＲＴ活性が維持されているという最終的な証拠は、実施例１に記載されている実験を繰返すことにより得られうる。]
[0027] ラットＣＡＲＴ断片は、望ましくは、少なくともアミノ酸５５−１０２、６１−１０２または６２−１０２を含む。ヒトＣＡＲＴ断片は、望ましくは、少なくともアミノ酸４２−８９、４８−８９および４９−８９を含む。そのようなＣＡＲＴ断片のアミノ酸配列は以下のとおりである。]
[0028] ラットＣＡＲＴ断片５５−１０２]
[0029] ]
[0030] ラットＣＡＲＴ断片６１−１０２]
[0031] ]
[0032] ラットＣＡＲＴ断片６２−１０２]
[0033] ]
[0034] ヒトＣＡＲＴ断片４２−８９]
[0035] ]
[0036] ヒトＣＡＲＴ断片４８−８９]
[0037] ]
[0038] ヒトＣＡＲＴ断片４９−８９]
[0039] ]
[0040] また、本発明の一部は、前記に挙げたペプチド配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を示すＣＡＲＴ由来ペプチドの使用である。本明細書中で用いる配列同一性の割合はＣＡＲＴ由来ペプチドと参照配列との間の同一アミノ酸の数である。適当な参照配列はＲｅｆＳｅｑペプチド：ＮＰ ００４２８２．１（ヒト）、ＮＰ ００１０７４９６２．１（マウスイソ型２）、ＮＰ ０３８７６０．３（マウスイソ型１）、ＮＰ ０５８８０６．１（ラット）である。これらの配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）からの、対応する特徴および書誌的アノテーションを有するヌクレオチドおよびタンパク質配列の公開データベースであるＲｅｆＳｅｑデータベースにおいて見出されうる。]
[0041] ＣＡＲＴ変異体の形態の代替的ＣＡＲＴ由来ペプチドは置換、修飾および／または欠失アミノ酸を有する。修飾は、好ましくは、ラットＣＡＲＴにおけるシステイン残基６８−８６、７４−９４および８８−１０１間ならびにヒトＣＡＲＴにおけるシステイン残基５５−７３、６１−８１および７５−８８間のジスルフィド結合が無傷のまま維持されＣＡＲＴの生物活性を妨げないような修飾である（図１を参照されたい）。] 図１
[0042] 本発明による骨密度の増加は、好ましくは、骨粗鬆症（女性における閉経後骨粗鬆症ならびに男性における特発性および原発性性機能低下性骨粗鬆症を含む）、グルココルチコイド誘導性骨粗鬆症、薬物誘導性骨減少（例えば、アロマターゼインヒビターおよびＧｎＲＨ受容体モジュレーターの使用の結果としての又は神経性食欲不振症の結果としてのエストロゲン欠損症誘導性骨減少を含む）、非活動または不動誘導性骨減少、歯周炎誘導性骨減少、骨折（すなわち、骨折治癒）、閉経後女性における背部痛、骨形成不全症の治療または予防のためである。]
[0043] 本発明による治療は、適切には、治療すべき対象においてＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的にもたらすことにより、特に、長期にわたるその徐放により行われる。]
[0044] ＣＡＲＴ由来ペプチドの徐放は、該ペプチドを徐放製剤中に含有させることにより達成されうる。ヒトにおける使用のためのそのような徐放製剤は当技術分野で公知であり、例えば、生分解性高分子マトリックスに基づくものである（Ｃｈａｎ ＹＰら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．４（４）：４４１−５１（２００７）；Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３６７（２）：３３０−５（２００８））。]
[0045] もう１つの製剤は、例えば、インプラントまたは膣リングである。インプラントおよび膣リングは当業者に公知であり、例えば、Ｐｏｗｅｒ Ｊら，Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ．１８（３）：ＣＤ００１３２６（２００７）；Ｄｅ Ｌｅｅｄｅ ＬＧら，Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ ３４（６）：５８９−６０２（１９８６）；およびＲｅｄｄｙ ＫＶら，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １２８：１１７−１２６（２００４）に記載されている。]
[0046] 本明細書中で用いる「長期」は、１〜３ヶ月、好ましくは３〜６ヶ月、より好ましくは６〜１２ヶ月、より一層好ましくは１２〜２４ヶ月を含む。]
[0047] 骨密度の増加を達成するためには、ＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルを、治療すべき対象において、ＣＡＲＴの内因性血清レベルと比較して少なくとも１．３倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、そして５倍まで増加させる。１つの実施形態においては、ＣＡＲＴの血清レベルは３０〜６５０ｐｇ／ｍｌである。]
[0048] ＣＡＲＴの血清レベルを連続的に上昇させた場合に骨密度に対する治療効果が得られることが本発明において判明した。これは、血清におけるＣＡＲＴ由来ペプチドの連続的放出により、またはＣＡＲＴ由来ペプチドの消失を回避もしくは抑制することにより達成されうる。]
[0049] 本明細書中で用いる「骨密度（ＢＭＤ）の増加」は、ＤＥＸＡスキャンにより測定した場合、プラセボ治療対象と比較して１．０５倍、好ましくは１．３倍、より好ましくは１．５倍、より一層好ましくは２倍のＢＭＤ値の増加を含む。二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ）は骨密度（ＢＭＤ）の測定手段であり、最も広く使用されており最も詳細に研究されている骨密度測定技術である。]
[0050] 本発明の使用のためのＣＡＲＴ由来ペプチドは、典型的には、徐放製剤、特に徐放インプラントの形態で投与されうる。この形態では、毎月、数ヶ月ごと、または１もしくは２年ごとに、僅か１用量が要求されるに過ぎない。]
[0051] 本発明は更に、コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物（ＣＡＲＴ）由来ペプチドと適当な賦形剤とを含む医薬組成物に関する。該医薬組成物は、好ましくは、徐放製剤である。徐放製剤を製造する場合、徐放マトリックス、例えば生分解性高分子マトリックスおよび場合によっては通常の添加物の使用が想定される。一般に、ＣＡＲＴ由来ペプチドの機能を妨げない任意の医薬上許容される添加物が本発明において使用されうる。]
[0052] 本発明のもう１つの態様における本発明は、ＣＡＲＴ由来ペプチドを含有するインプラントを提供する。もう１つの実施形態においては、本発明は、ＣＡＲＴ由来ペプチドを含有する膣リングに関する。該インプラントおよび膣リングは、適切には、徐放マトリックス中に含有されたＣＡＲＴ由来ペプチドを含む。]
[0053] 本発明は更に、治療すべき対象においてＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的にもたらすことを含む、骨密度を増加させるための方法に関する。本発明はまた、骨粗鬆症（女性における閉経後骨粗鬆症ならびに男性における特発性および原発性性機能低下性骨粗鬆症を含む）、グルココルチコイド誘導性骨粗鬆症、薬物誘導性骨減少（例えば、アロマターゼインヒビターおよびＧｎＲＨ受容体モジュレーターの使用の結果としての又は神経性食欲不振症の結果としてのエストロゲン欠損症誘導性骨減少を含む）、非活動または不動誘導性骨減少、歯周炎誘導性骨減少、骨折（すなわち、骨折治癒）、閉経後女性における背部痛、骨形成不全症の治療または予防のための方法に関する。]
図面の簡単な説明

[0054] ヒト、マウスおよびラットＣＡＲＴのタンパク質アライメント。＊はマウス、ラットおよびヒトＣＡＲＴ配列の間の相同性を示す。ヒトＣＡＲＴ４２−８９が太字で示されている。
対照マウスおよびｒＣＡＲＴ５５−１０２徐放ペレットが移植されたマウスからのＴ＝０、２８および６０日における遠位大腿の柱状（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）骨密度（ＢＭＤ）データ（＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
ｒＣＡＲＴ５５−１０２徐放ペレットを有するマウスまたはｒＣＡＲＴ５５−１０２ペプチドの毎日の注射で処理されたマウスのＴ＝３０日における遠位大腿の柱状骨密度。
ウシ顆粒膜細胞におけるＦＳＨ誘導性１７β−エストラジオール（Ｅ２）産生のラットＣＡＲＴ５５−１０２誘導性抑制。]
[0055] 以下の実施例において本発明を更に例示するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。]
[0056] 実施例]
[0057] マウスにおける骨密度増加
徐放ＣＡＲＴ治療によるマウスにおける骨密度増加
この実験においては、３つの異なる濃度のＣＡＲＴペプチドでマウスを処理した。該実験は、１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雌マウスにおいて行い、４つの実験群（１群当たりｎ＝５）よりなるものであった。最初のマウス群にプラセボ徐放ペレット（ＳＸ−９９９、６０日間の徐放ペレット、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，Ｆｌｏｒｉｄａ）を投与した。残りの３つの群を、２０μｇ、５０μｇまたは１００μｇ（２×５０μｇ）ラットＣＡＲＴ ５５−１０２ペプチド（ｒＣＡＲＴ）（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）を含有するＳＸ−９９９徐放ペレットで処理した。マウスを注射麻酔薬（Ｈｙｐｎｏｒｍ（ＶｅｔａＰｈａｒｍａ，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ）／Ｄｏｒｍｉｃｕｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｉｊｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））で鎮静させ、該ペレットを頚部に皮下移植した。]
[0058] 骨構造および密度をインビボマイクロＣＴ測定（Ｓｋｙｓｃａｎ１０７６マイクロ−ＣＴスキャナー，Ｓｋｙｓｃａｎ，Ｋｏｎｔｉｃｈ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により遠位大腿骨においてＴ＝０に測定した。スキャン（走査）は９μｍの分解能で行った。柱状骨分析を、大腿骨の遠位成長板の１５０μｍ近位の２ｍｍのスライス上で行った。第２８日および第６０日にインビボマイクロ−ＣＴ測定を繰返した。Ｔ＝０、Ｔ＝２８およびＴ＝６０日におけるプラセボ群のＢＭＤ値を１００％に設定し、２０μｇ、５０μｇおよび１００μｇ（２×５０μｇ）ＣＡＲＴ処理群のＢＭＤ値をプラセボ群に対して相対的に計算した。値は個々のデータの平均＋ＳＤとして表されている。統計分析のために、標準的なスチューデントＴ検定（両側）において、処理群を対応時点のプラセボ群と比較した。Ｐ＜０．０５が有意とみなされた。]
[0059] 結果を図２に示す。結果は、１００μｇ ＣＡＲＴ群においてはプラセボ群と比較して２８日後の柱状骨密度（ＢＭＤ）における５０〜６０％の増加を示した。６０日後、ＢＭＤは１００μｇ ＣＡＲＴ群では更に増加し、５０μｇ ＣＡＲＴ群でも有意に増加した。ＢＭＤは１００μｇおよび５０μｇ群においてそれぞれ８０％および４０〜５０％増加した。] 図２
[0060] これらのデータは、徐放インプラント運搬による２８日間にわたるＣＡＲＴペプチドの連続的放出が、柱状ＢＭＤを５０％増加させるのに十分なものであることを示している。これは骨粗鬆症の治療または予防における末梢投与ＣＡＲＴペプチドの可能性を示している。]
[0061] ＣＡＲＴ徐放製剤と毎日のＣＡＲＴ注射との比較
この実験においては、徐放製剤により骨密度を改善するためのＣＡＲＴペプチドの有効性をＣＡＲＴの毎日の注射と比較した。該実験は、１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雌マウスにおいて行い、４つの実験群（１群当たりｎ＝５）よりなるものであった。最初のマウス群において、２つのプラセボ徐放ペレット（ＳＸ−９９９、６０日間の徐放ペレット、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，Ｆｌｏｒｉｄａ）を頚部に皮下移植した。第２の群において、５０μｇラットＣＡＲＴ ５５−１０２（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）をそれぞれ含有する２つのＳＸ−９９９徐放ペレットを頚部に皮下移植した。残りの２つの群には、ビヒクル（０．９％ ＮａＣｌ）、または０．９％ ＮａＣｌ中の２μｇのラットＣＡＲＴ５５−１０２ペプチドを毎日、皮下注射した。]
[0062] マウスを注射麻酔薬（Ｈｙｐｎｏｒｍ（ＶｅｔａＰｈａｒｍａ，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ）／Ｄｏｒｍｉｃｕｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｉｊｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））で鎮静させ、インビボマイクロＣＴ測定（Ｓｋｙｓｃａｎ１０７６マイクロ−ＣＴスキャナー，Ｓｋｙｓｃａｎ，Ｋｏｎｔｉｃｈ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により遠位大腿骨においてＴ＝０およびＴ＝３０日に骨密度を測定した。血清ＣＡＲＴレベルを測定するために、眼窩穿刺により血液を採取した。ＢＭＤ（ｇ／ｃｍ３）を個々のデータの平均＋ＳＤとして表した。統計分析を、スチューデントＴ検定（両側）を用いて行った。Ｐ＜０．０５が有意とみなされた。]
[0063] 結果を図３に示す。結果は、ＣＡＲＴ徐放ペレットで処理されたマウスが、３０日後に、プラセボペレット群と比較して柱状骨密度（ＢＭＤ）における５０％の増加を示したことを示している。２μｇのラットＣＡＲＴ５５−１０２の毎日の注射を受けた群はＢＭＤの増加を示さなかった。これらのデータは、徐放インプラント運搬による３０日間にわたるＣＡＲＴ血清レベルの連続的上昇が柱状ＢＭＤを有意に増加させることを示している。] 図３
[0064] ウシ顆粒膜細胞におけるＦＳＨ誘導性１７β−エストラジオール産生のＣＡＲＴ誘導性抑制
近くの食肉処理場において筋肉倍加（ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｓｃｌｅｄ）ウシからの卵巣を得、発情周期のランダムな段階における３〜５ｍｍの卵胞から顆粒膜細胞を集めた。抗生物質（１００ ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））、１０ｎｇ／ｍＬインスリン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｏｓｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、４ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、５μｇ／ｍＬアポ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）および１０−７Ｍアンドロステンジオン（Ｏｒｇ ６，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｏｓｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））で補足された培地（Ｍ５０５培地（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）内に卵胞を３７℃で配置した。卵胞を針で破裂させ、該細胞を細胞濾過器（７０μｍのナイロン，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳＡ）に通した。細胞を３４０×ｇで１０分間遠心分離し、培地に再懸濁させた。０、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１または１０−１２、ＭラットＣＡＲＴ５５−１０２（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）と組合された０、２０、１００または３００ｍ単位のＦＳＨ（Ｏｒｇ ３２４８９，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｏｓｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の存在下、加湿雰囲気（５％ ＣＯ２、９５％ 空気）中、細胞（１ウェル当たり１×１０５個の生細胞）を９６ウェルプレート内で３７℃で７時間培養した。培地を４８時間ごとに新しくした。７日後、１７β−エストラジオールＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、該培地において１７β−エストラジオールレベルを決定した。]
[0065] 結果を図４に示す。該結果は、１μＭ ＣＡＲＴペプチドがウシ顆粒膜細胞のＦＳＨ誘導性１７β−エストラジオール産生を１００ｍ単位のＦＳＨの存在下で１．５倍、そして３００ｍ単位のＦＳＨの存在下で３倍抑制しうることを示している。] 図４

权利要求:

請求項1
骨量疾患の治療または予防および骨折修復のために骨密度を増加させるための医薬組成物の製造のための、ヒトＣＡＲＴ（コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物）の生物活性を有するＣＡＲＴ由来ペプチドの使用であって、該治療または予防が、治療すべき対象において該ＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的にもたらすことを含む、使用。
請求項2
徐放製剤からの長期にわたる該ＣＡＲＴ由来ペプチドの徐放により該ＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的にもたらす、請求項１記載の使用。
請求項3
該徐放製剤が、インプラント、特に皮下インプラントの形態、または膣リングの形態である、請求項２記載の使用。
請求項4
該徐放製剤が生分解性高分子マトリックスの形態である、請求項２〜３のいずれか１項記載の使用。
請求項5
該ＣＡＲＴ由来ペプチドの消失を回避または抑制することにより該ＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を連続的にもたらす、請求項１または２記載の使用。
請求項6
該コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物（ＣＡＲＴ）由来ペプチドが、完全長コカインおよびアンフェタミン調節性転写産物、ラットＣＡＲＴ５５−１０２、ラットＣＡＲＴ６１−１０２、ラットＣＡＲＴ６２−１０２、ヒトＣＡＲＴ４２−８９、ヒトＣＡＲＴ４８−８９およびヒトＣＡＲＴ４９−８９よりなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
請求項7
骨密度の増加が、骨粗鬆症、薬物誘導性骨減少、非活動または不動誘導性骨減少、歯周炎誘導性骨減少、骨折、閉経後女性における背部痛、骨形成不全症の治療または予防、特に、女性における閉経後骨粗鬆症、男性における特発性および原発性性機能低下性骨粗鬆症ならびにグルココルチコイド誘導性骨粗鬆症の治療または予防のためである、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
請求項8
長期が、１〜３ヶ月、好ましくは３〜６ヶ月、より好ましくは６〜１２ヶ月、より一層好ましくは１２〜２４ヶ月を含む、請求項２〜７のいずれか１項記載の使用。
請求項9
該ＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルの上昇を、ＣＡＲＴの内因性血清レベルと比較して少なくとも１．３倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、そして５倍まで増加させる、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
請求項10
上昇した該ＣＡＲＴ由来ペプチドの血清レベルが３０〜６５０ｐｇ／ｍｌ血清である、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
請求項11
骨密度（ＢＭＤ）の増加が、二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ）により測定した場合、プラセボ治療対象と比較して１．０５倍、好ましくは１．３倍、より好ましくは１．５倍、より一層好ましくは２倍のＢＭＤ値の増加を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の使用。
請求項12
ヒトＣＡＲＴの生物活性を有するＣＡＲＴ由来ペプチドと適当な賦形剤とを徐放製剤中に含む、骨量疾患の治療または予防のために並びに骨折修復のために骨密度を増加させるための医薬組成物。
請求項13
女性における閉経後骨粗鬆症の治療のための、ヒトＣＡＲＴ４２−８９、ヒトＣＡＲＴ４８−８９およびヒトＣＡＲＴ４９−８９の１以上を含む、請求項１２記載の医薬組成物。